MX2012000383A

MX2012000383A - Método para reducir la resistencia a terapias multidroga utilizando tripirofosfato de inositol.

Info

Publication number: MX2012000383A
Application number: MX2012000383A
Authority: MX
Inventors: Jean-Marie Lehn; Yves Claude Nicolau; Claudine Kieda
Original assignee: Normoxys Inc
Priority date: 2009-07-07
Filing date: 2010-07-07
Publication date: 2012-06-01
Also published as: RU2563127C2; US20160235771A1; WO2011005886A1; EP2451459A1; EP2451459B1; CN102573853A; CN103495170A; US20120003327A1; EP2451459A4; JP2012532879A; US20140199261A1; JP2015166393A; RU2012104022A

Abstract

El tripirofosfato de inositol (ITTP) causa la normalización de la vasculatura tumoral y es una terapia para el cáncer particularmente efectiva cuando se administra un segundo agente quimioterapéutico luego de la vascularización parcial. El ITTP, solo o en combinación, también trata los tipos de cáncer resistentes a terapias multidroga. El ITTP también se puede utilizar para reducir la cantidad de una segunda droga quimioterapéutica necesaria para obtener una actividad anticancerosa. Además, el ITTP intensifica la respuesta inmune y trata trastornos hiperproliferativos.

Description

MÉTODO PARA REDUCIR LA RESISTENCIA A TERAPIAS MULTIDROGA UTILIZANDO TRIPIROFOSFATO DE INOSITOL SOLICITUD RELACIONADA Esta solicitud reivindica el beneficio de la Solicitud Provisoria de los EEUU N° 61/223583, que fue presentada el 7 de Julio de 2009, cuyo contenido se incorpora en la presente a modo de referencia en su totalidad.

ANTECEDENTES El cáncer es una de las causas de muerte más importantes en el mundo desarrollado: tan solo en los Estados Unidos, provoca más de 500000 decesos por año. En el mismo período, a más de un millón de personas se les diagnostica cáncer en los EEUU, y en general, se estima que más de un tercio de la población desarrollará alguna forma de cáncer durante su vida. Los tumores sólidos son la causa de más de 85% de la mortalidad asociada al cáncer.

La angiogénesis ha sido asociada a diversos tipos de cánceres. Es controlada por un sistema altamente regulado en el que participan estimulantes e inhibidores. El control de la angiogénesis está alterado en determinados estados de enfermedad, y en muchos casos, el daño patológico asociado a las enfermedades está relacionado con una angiogénesis descontrolada. Se cree que la angiogénesis controlada y la angiogénesis descontrolada ocurren de manera similar. Las células endoteliales y los pericitos, rodeados por uncí membrana basal, forman vasos sanguíneos capilares. La angiogénesis comienza con la erosión de la membrana basal, que es provocada por las enzimas que son liberadas por las células endoteliales y los leucocitos. Posteriormente, las células endoteliales que rodean el lumen de los vasos sanguíneos sobresalen de la membrana basal . Las estimulantes de la angiogénesis inducen la migración de las células endoteliales a través de la membrana basal erosionada. Las células en migración forman un "brote" a partir del vaso sanguíneo progenitor, donde las células endoteliales experimentan mitosis y proliferan. Los brotes endoteliales se fusionan unos con otros para formar rizos capilares, con lo que se crea un nuevo vaso sanguíneo.

La angiogénesis desregulada persistente tiene lugar en numerosos estados de enfermedad, en las metástasis de diversos tumorales y en el crecimiento anormal que pueden experimentar las células endoteliales. Los diversos estados patológicos que se caracterizan por una angiogénesis desregulada han sido clasificados como enfermedades dependientes de la angiogénesis o asociadas a la angiogénesis .

La hipótesis de que el crecimiento de los tumores depende de la angiogénesis fue propuesta por primera vez en 1971. En términos simples, se propone que una vez que se ha iniciado el tumor, cada incremento en la población de células tumorales debe estar precedido por un incremento en los capilares nuevos que convergen en el tumor. El término "inicio de un tumor" hace referencia a una fase prevascular del crecimiento del tumor, que se caracteriza por la presencia de una población que no supera unos pocos millones de células tumorales, que ocupan un volumen de unos pocos milímetros, donde dichas células pueden sobrevivir merced a los microvasos que están presentes en el huésped. Para que el volumen del tumor pueda expandirse más allá de esta fase, es necesario que se induzcan nuevos vasos sanguíneos capilares. Por ejemplo, es imposible detectar las micrometástasis pulmonares en la fase prevascular en los ratones, excepto cuando se realiza un análisis de microscopía de alto poder en secciones histológicas.

La angiogénesis ha sido asociada a numerosos tipos de cánceres, lo que abarca los tumores sólidos y los tumores que se originan en la sangre. Los tumores a los que se ha asociado la angiogénesis incluyen, sin limitaciones, los rabdomiosarcomas , los retinoblastomas , los sarcomas de Ewing, los neuroblastomas y los osteosarcomas . La angiogénesis también está asociada a los tumores que se originan en la sangre, tales como las leucemias, es decir, cualquiera de las diversas enfermedades neoplásticas agudas o crónicas que afectan a la médula ósea y que se caracterizan por una proliferación ilimitada de leucocitos, que usualmente está acompañada por anemia, alteraciones en la coagulación y agrandamiento de los nodos linfáticos, del hígado y del bazo. Se cree que la angiogénesis participa en las anormalidades en la médula ósea que dan lugar a los tumores propios de la leucemia y de las enfermedades asociadas al mieloma múltiple.

Tal como se mencionó con anterioridad, hay diversas líneas de evidencia con las que podría fundamentarse la hipótesis de que la angiogénesis es esencial para el crecimiento y la persistencia de los tumores sólidos y de sus metástasis. Una vez que se estimula la angiogénesis, los tumores provocan una regulación positiva de la producción de diversos factores angiogénicos , que incluyen los factores de crecimiento de los fibroblastos (aFGF y bFGF) y el factor de crecimiento vascular endotelial/el factor que estimula la permeabilidad vascular (VEGF/VPF) .

La participación del VEGF en la regulación de la angiogénesis ha sido el objeto de investigaciones exhaustivas. Si bien el VEGF representa un paso crítico que limita la velocidad de la angiogénesis fisiológica, aparentemente también es importante en la angiogénesis patológica, tal como la que está asociada al crecimiento de los tumores. El VEGF también se conoce como el factor que estimula la permeabilidad vascular, a causa de su capacidad de inducir pérdidas en los vasos. Diversos tumores sólidos producen grandes cantidades del VEGF, el cual estimula la proliferación y la migración de las células endoteliales, con lo que se induce una neo- ascularización . Se ha demostrado que la expresión del VEGF afecta significativamente el pronóstico de diversos tipos de cánceres humanos. La tensión de oxígeno en el tumor cumple una función fundamental en la regulación de la expresión del gen del VEGF. La expresión del ARNm del VEGF es inducida por la exposición a una tensión de oxígeno reducida, bajo una variedad de circunstancias patofisiológicas .

Los tumores en crecimiento se caracterizan por la presencia de hipoxia, que a su vez induce la expresión del VEGF, por lo que también puede ser un factor para predecir el surgimiento de una enfermedad metastásica. También se reconoce que, a diferencia de los vasos sanguíneos normales, la vasculatura de los tumores presenta una organización, una estructura y una función anormales. Se ha establecido que los vasos en los tumores presentan pérdidas, y que el flujo de sangre en ellos es heterogéneo y frecuentemente está comprometido .

Debido a que es necesario que las células cancerosas tengan acceso a los vasos sanguíneos para que puedan desarrollarse y producir metástasis, se cree que la inhibición de la angiogénesis podría servir para tratar diversos cánceres y tumores. Sin embargo, las estrategias anti-angiogénicas que se han explorado hasta la fecha no han dado como resultado beneficios terapéuticos, debido a que tienen como consecuencia la selección de células cancerosas metastásicas altamente agresivas que son resistentes a las terapias multidroga. Se ha descubierto que, en algunos casos, los tratamientos anti-angiogénicos en los que se destruye la vascularización de los tumores provocan un incremento en la invasión metastásica.

Por lo tanto, se necesita una composición sustancialmente no tóxica y un método con los que pueda regularse la vasculatura en los tumores. También se necesita una terapia mejorada contra el cáncer.

SUMARIO DE LA INVENCION Sobre la base de los datos que se proveen en los ejemplos, puede concluirse que la normalización de los vasos sanguíneos combinada con la quimioterapia es un abordaje potencialmente beneficioso para tratar el cáncer. El tripirofosfato de inositol (ITPP) , un efector alostérico de la hemoglobina, incrementa la liberación de oxígeno, contrarresta los efectos de la hipoxia e inhibe la angiogénesis in vitro. En un modelo en eritrocitos de ratones, se estableció que el ITPP reduce las metástasis en los pulmones que son provocadas por la inyección intravenosa de células de melanoma de ratón. El ITPP, en combinación con los agentes quimioterapéuticos cisplatino y paclitaxel, inhibió el crecimiento de un melanoma primario y sus metástasis en los pulmones. En un modelo de adenocarcinoma pancreático en rata, el ITPP en combinación con gemcitabina provocó un incremento significativo en la tasa de supervivencia de los animales evaluados y presentó un efecto aditivo fuerte. El ITPP también potencia significativamente la infiltración de los macrófagos y las células asesinas naturales en los tumores.

En la presente invención se provee un método para tratar el cáncer, que comprende administrarle a un sujeto que lo necesita una cantidad eficaz para el uso terapéutico de ITPP; y administrarle al sujeto una cantidad eficaz para el uso terapéutico de un agente quimioterapéutico una vez que ha ocurrido una normalización parcial en la vasculatura del tumor .

En un aspecto, en la presente invención se provee una composición farmacéutica que comprende tripirofosfato de inositol (ITPP) y un agente quimioterapéutico que puede seleccionarse entre el paclitaxel, el cisplatino y la gemcitabina.

En otro aspecto, en la presente invención se provee un régimen de tratamiento para tratar el cáncer en un sujeto, que comprende administrar de manera simultánea o consecutiva una cantidad eficaz para el uso terapéutico de ITPP y un agente quimioterapéutico que puede seleccionarse entre el paclitaxel, el cisplatino y la gemcitabina.

En otro aspecto, en la presente invención se provee una composición farmacéutica que comprende ITPP y una cantidad sub-terapéutica de un agente quimioterapéutico.

En aun otro aspecto, en la presente invención se provee un régimen de tratamiento o un método para tratar el cáncer en un sujeto, que comprenden administrar de manera simultánea o consecutiva una cantidad eficaz para el uso terapéutico de ITPP y una cantidad sub-terapéutica de un agente quimioterapéutico .

En otro aspecto, en la presente invención se provee un método para tratar un cáncer que es resistente a uno o más agentes quimioterapéuticos , que comprende administrar una cantidad eficaz para el uso terapéutico de ITPP. En determinadas formas de realización, el cáncer es resistente al paclitaxel y/o al cisplatino.

En la presente invención también se provee un método para tratar una afección hiperproliferativa, que comprende administrarle a un sujeto que lo necesita una cantidad eficaz para el uso terapéutico de ITPP, donde la afección hiperproliferativa no es un cáncer ni se caracteriza por una angiogénesis indeseable.

En la presente invención también se provee un método para potenciar la respuesta inmune en un sujeto que lo necesita, que comprende administrarle al sujeto una cantidad eficaz para el uso terapéutico de ITPP, donde el sujeto no padece un cáncer o un tumor de otro tipo.

Además, en el contexto de la prevención, en la presente invención se provee el uso de las composiciones que se describen en la presente en la medicina, así como el uso de las composiciones que se describen en la presente en la manufactura de un medicamento para tratar una afección como las que se describen en la presente.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS En la figura 1 se ilustra el incremento selectivo de la presión de oxígeno en eritrocitos inducidos con ITPP, en un modelo de melanoma subcutáneo desarrollado. (A) Comparación entre un tumor sin tratar que fue implantado 14 días antes y el mismo tumor tratado con ITPP los días 12 y 13. Vale destacar el valor de la p02 24 horas después de la inyección del ITPP. (B) Duración del registro de la p02 en un tumor implantado por vía subcutánea antes y después de una inyección intraperitoneal de ITPP . Vale destacar el incremento en la presión de oxígeno 30 minutos después del tratamiento. (C) El ITPP no afecta la p02 en los músculos. La inyección intraperitoneal de ITPP da como resultado un incremento en la p02 en un tumor subcutáneo hipóxico (curva inferior) , pero no afecta la p02 en el músculo saludable (curva superior) . Se proveen los datos de un experimento representativo de un total de diez, que se llevaron a cabo con diez ratones por grupo.

En la figura 2 se ilustra que el suministro de oxígeno por los eritrocitos inducidos con ITPP inhibe las metástasis en los pulmones y revierte la cascada de genes que es inducida por la hipoxia en un modelo de melanoma experimental. Se proveen mediciones de las proteínas y la actividad enzimática en lisados pulmonares de ratones que padecen melanomas sin tratar (en gris) o tratados con ITPP (en negro) , en comparación con controles saludables (en blanco), el día 27 después de la inoculación del melanoma. (A) Cuantificación de las metástasis en los pulmones por medio de un ensayo con luciferasa. (B) Expresión del HIF-la. (B) Expresión del VEGF. (D) Expresión de la Tie-2. (E) Expresión de la HO-1. La determinación estimativa se llevó a cabo con un ELISA el día 19 después de la inyección de las células de melanoma. (F) Estimación del contenido de ARNm de LOX. Los datos son los valores medios, que se calcularon a partir de 8-10 ratones separados por grupo, en un experimento representativo de un total de cinco.

En la figura 3 se ilustra que el cronograma de tratamiento con el ITPP puede afectar la actividad anti-metastásica, la normalización de los vasos y la reducción del nivel de células resistentes a terapias multidroga en ratones con melanomas subcutáneos. (A) Efecto del momento del inicio y la duración del tratamiento con el ITPP antes de la aplicación de las drogas, los días 20 y 21. El ITPP reduce las metástasis si el tratamiento se inicia el día 7, y es menos eficiente más tarde. Adicionalmente, se observa un incremento en las metástasis cuando se realiza un tratamiento crónico. El análisis con luciferasa se llevó a cabo el día 25. Los datos son los valores medios, que se calcularon a partir de diez ratones separados por grupo, en un experimento representativo de un total de diez. (B) Efecto del tratamiento con el ITPP sobre la normalización de los vasos en los tumores, evaluado el día 20. Para el análisis, se empleó (a) un diagnóstico por imágenes basado en una resonancia magnética de la arquitectura de los vasos en tumores subcutáneos sin tratar, en comparación con una determinación que se realizó en ratones que fueron tratados con ITPP. Vale destacar la vasculatura bien organizada (que se señala con flechas) que se observó después del tratamiento con el ITPP (los días 9, 14, 18 y 19), en comparación con los vasos discontinuos y desorganizados (que se señalan con flechas) en los tumores sin tratar. Como alternativa, para el análisis se empleó (b) una inmunocoloración con anticuerpos anti-SMA en pericitos que estaban localizados alrededor de los vasos normalizados, en comparación con un control.

En la figura 4 se ilustra la quimiosensibilidad in vitro de células de melanoma de ratón que han sido sometidas a hipoxia y reoxigenación, en comparación con endotelio pulmonar normal de ratón. Se representa la anulación por la hipoxia de la sensibilidad de las células de melanoma (A) al paclitaxel y (B) al cisplatino. Se obtiene un efecto de reversión cuando se reoxigenan las células. (C) Evaluación de la sensibilidad al cisplatino de las células endoteliales .

En la figura 5 se ilustra que la oxigenación de los tumores y la normalización de los vasos dan como resultado una mejora en la quimioterapia del melanoma. (A) Con una combinación de ITPP, paclitaxel y cisplatino se reducen las metástasis, lo cual se determina sobre la base de la cronología de los tratamientos. Fue posible erradicar las metástasis en los pulmones cuando se aplicó nuevamente ITPP (los días 18 y 19) , antes de aplicar nuevamente las drogas (los días 20 y 21) . (a) = sin tratar; (b) = ITPP los días 7, 12 y 16; (c) = (b) más las drogas los días 7, 12 y 16; (d) = (c) más ITPP los días 18 y 19 más las drogas los días 20 y 21; (e) = ITPP los días 9 y 14; (f) = (e) más las drogas los días 9 y 14; (g) = (f) más ITPP los días 18 y 19 más las drogas los días 20 y 21; (h) = ITPP los días 11 y 16; (i) = (h) más las drogas los días 11 y 16; (j) = (i) más ITPP los días 18 y 19 más las drogas los días 20 y 21. La actividad de la luciferasa se analizó el día 25. Los datos son los valores medios, que se calcularon a partir de diez ratones separados por grupo, en un experimento representativo de un total de diez. (B) Efecto combinado de la normalización inducida por el ITPP sobre la actividad quimioterapéutica de las drogas. Se trataron dos grupos de ratones con ITPP los días 9 y 14 o los días 9, 14, 18 y 19. Los dos grupos de ratones que fueron tratados con ITPP recibieron paclitaxel y cisplatino los días 20 y 21. Los tumores fueron coloreados el día 25. (a) Inmunocoloración de los vasos con CD31 (al) en tumores sin tratar, en comparación con tumores provenientes de ratones que fueron tratados con ITPP o con las drogas (a2 y a3 , respectivamente) . La coloración con CD31+ corresponde a las áreas necróticas. (b) Coloración con hematoxilina y eosina de ratones que fueron tratados como se indica en (a) . Vale destacar la destrucción necrótica eficiente del tumor que se observó en presencia de los tratamientos (a3 y b3) . Se proveen los datos representativos de experimentos que se llevaron a cabo en diez ratones por grupo.

En la figura 6 se ilustra el efecto del tratamiento con ITPP sobre la supervivencia de ratas que presentaban tumores en el páncreas, en comparación con el efecto de un tratamiento con gemcitabina sola o con un placebo. En el grupo que fue tratado con ITPP, las ratas con tumores en el páncreas recibieron una dosis de 1,5 mg/kg por semana entre el día 14 y el día 49. En el grupo que fue tratado con gemcitabina, las ratas recibieron una dosis de 100 mg/kg los días 16, 18 y 20. Los animales en el grupo control no fueron tratados .

En la figura 7 se ilustra el efecto sobre la supervivencia de las ratas que padecen tumores pancreáticos que se obtiene usando mió-tripirofosfato de inositol de hexasodio (OXY111A) en combinación con gemcitabina, en comparación con el efecto de un tratamiento con gemcitabina o con un placebo. En el grupo que fue sometido al tratamiento combinado, las ratas con tumores pancreáticos recibieron una dosis de 1,5 mg/kg de ITPP, en combinación con una dosis de 25 mg/kg o 50 mg/kg de gemcitabina por semana, entre el día 14 y el día 49. En el grupo que fue tratado con gemcitabina, las ratas recibieron una dosis de 100 mg/kg los días 16, 18 y 20. Los animales en el grupo control no fueron tratados.

En la figura 8 se ilustra el efecto del tratamiento con ITPP sobre la supervivencia de ratones desnudos que habían sido sometidos a xenoinjertos de tumores pancreáticos humanos Panc-1, en comparación con el efecto de un tratamiento con gemcitabina sola o con un placebo. En el grupo que fue tratado con ITTP, los ratones recibieron una dosis de 2 mg/kg por semana entre el día 14 y el día 49. En el grupo que fue tratado con gemcitabina, las ratas recibieron una dosis de 100 mg/kg los días 16, 18 y 20. Los animales en el grupo control no fueron tratados .

En la figura 9 se ilustra el efecto sobre la supervivencia de ratones desnudos que habían sido sometidos a xenoinjertos de tumores pancreáticos humanos Panc-1 que se obtuvo usando ITPP en combinación con gemcitabina, en comparación con el efecto de un tratamiento con gemcitabina sola o con un placebo. En el grupo que fue sometido al tratamiento combinado, los ratones con tumores xenoinjertados recibieron 2 mg/kg de ITPP en combinación con 25 mg/kg o 50 mg/kg de gemcitabina por semana, entre el día 14 y el día 49. En el grupo que fue tratado con gemcitabina, las ratas recibieron una dosis de 100 mg/kg los días 16, 18 y 20. Los animales en el grupo control no fueron tratados.

En la figura 10 se ilustra el efecto del tratamiento con ITPP sobre la expresión del HIF-1 a, del VEGF, de la caspasa-3 y de la ß-actina en ratas con tumores pancreáticos, en comparación con el efecto de un tratamiento con gemcitabina sola o con un placebo.

En la figura 11 se ilustra el efecto del tratamiento con ITPP sobre la infiltración de macrofagos CD68 (del tipo M2) en tumores B16. Se inyectó 0XY111A por vía intraperitoneal los días 7, 8, 14, 15, 21, 22, 29 y 30. El análisis de los tumores B16 se llevó a cabo el día 31. (a) Tumores B16 sin tratar, (b) y (c) Coloración con CD68 de los tumores que fueron tratados con ITPP. Puede observarse la infiltración de los macrofagos CD68 (del tipo M2) en los tumores B16.

En la figura 12 se ilustra el efecto del tratamiento con ITPP sobre la infiltración de células asesinas naturales (NK) CD49b y sobre la presencia de células endoteliales (EC) CD31 en tumores B16. (a) - (c) Tumores B16 sin tratar, (d) - (f ) Tumores B16 tratados con ITPP. Con flechas verdes se señalan las células NK en infiltración. Con flechas rojas se señalan las paredes de los vasos.

En la figura 13 se ilustra el efecto del tratamiento con ITPP sobre la invasión de células NK en tumores de melanoma B16. Las células de los tumores B16 se marcaron con B16F10 DAPI. Las células NK se marcaron con anti-CD49bFITCl .

Las células endoteliales de los vasos se marcaron con anti-CD31TR1TC. (a) Tumores B16 sin tratar, (b) y (c) Tumores B16 tratados con ITPP.

DESCRIPCIÓN DETALLADA (1) COMPOSICIONES DE LA INVENCIÓN Las composiciones que son útiles de acuerdo con la presente invención incluyen ácidos y sales de tripirofosfato de inositol (ITPP) . En la presente, el ITPP se reconoce como un anión. El término "tripirofosfato de inositol", que como alternativa puede conocerse como tripirofosfato de hexafosfato de inositol, hace referencia a un hexafosfato de inositol que comprende tres anillos internos de pirofosfato . En la presente, la especie que hace las veces de contraparte del ITPP se conoce como contraión, y la combinación del ITPP y el contraión se conoce como ácido o sal. La invención no se limita a aquellos apareamientos que son puramente iónicos. Por el contrario, en la técnica se sabe que los iones apareados frecuentemente presentan una cierta cantidad de enlaces covalentes o coordinados entre ellos. Las composiciones con ácidos y las sales de ITPP de acuerdo con la invención pueden comprender un solo tipo de contraión. Como alternativa, pueden "contener contraiones mixtos, y opcionalmente pueden contener una mezcla de aniones, uno de los cuales es el ITPP. Opcionalmente, las composiciones pueden incluir éteres de corona, criptandos y otras especies que pueden quelar los contraiones o formar complejos con ellos. Asimismo, las composiciones opcionalmente pueden incluir macrociclos ácidos u otras especies que pueden formar complejos con el ITPP a través de enlaces de hidrógeno o de otras atracciones moleculares. Se describen métodos para preparar ácidos y sales de ITPP en la Patente de los EEUU N° 7084115, adjudicada a Nicolau et al., cuyo contenido completo se incorpora en la presente a modo de referencia.

Los contraiones cuyo uso se contempla en la invención incluyen, sin limitaciones, las especies catiónicas que comprenden hidrógeno, lo que abarca los protones y los iones correspondientes del deuterio y del tritio, los cationes inorgánicos monovalentes, que incluyen el litio, el sodio, el potasio, el rubidio, el cesio y el cobre (I) , los cationes inorgánicos divalentes, que incluyen el berilio, el magnesio, el calcio, el estroncio, el bario, el manganeso (II) , el cinc (II) , el cobre (II) y el hierro (II) , los cationes inorgánicos polivalentes, que incluyen el hierro (III) , las especies de nitrógeno cuaternario, que incluyen el amonio, el cicloheptil amonio, el ciclooctil amonio, el N5N-dimetilciclohexil amonio y otros cationes orgánicos de amonio, las especies de sulfonio, que incluyen el trietilsulfonio y otros compuestos orgánicos de sulfonio, los cationes orgánicos, que incluyen el piridinio, el piperidinio, el piperazinio, el quinuclidinio, el pirrolio, el tripiperazinio y otros cationes orgánicos, los cationes poliméricos, que incluyen los oligómeros, los polímeros, los péptidos, las proteínas, los ionómeros con carga positiva y otras especies macromoleculares con componentes de sulfonio, las especies organometálicas de nitrógeno cuaternario y/o cargadas en grupos adjuntos, los extremos de cadenas y/o los esqueletos de polímeros. Un ejemplo de una sal del ITPP es una sal de monocalcio de tetrasodio de ITPP o una mezcla de ITPP de sodio e ITPP de calcio que contiene 15-25% molar de calcio y 75-85% molar de sodio.

Un isómero preferido del ITPP que puede emplearse en la presente invención es el mioinositol, que es el cis-1, 2,3,5-trans-4 , 6 -ciclohexanohexilo . Sin embargo, la invención no se limita a este compuesto. Como consecuencia, en la invención se contempla la posibilidad de usar cualquier isómero de inositol en el ITPP, lo que abarca los tripirofosfatos de isómeros naturales del esciloinositol , del quiroinositol, del mucoinositol y del neoinositol, así como los isómeros del aloinositol, del epiinositol y del cis-inositol .

Se contempla la posibilidad de formar el ITPP in vivo a partir de una prodroga, por ejemplo, por medio de la escisión enzimática de un éster o el desplazamiento de un grupo saliente, por ejemplo, un grupo tolilsulfonilo .

El ITPP presenta propiedades anti-angiogénicas y anti-tumorales y es útil para controlar los acontecimientos, las afecciones o las sustancias relacionadas con la angiogénesis o la proliferación. Tal como se lo emplea en la presente, el término "control de un acontecimiento, una afección o una sustancia relacionada con la angiogénesis o la proliferación" hace referencia a cualquier cambio cualitativo o cuantitativo en cualquier tipo de factor, condición, actividad, indicador, sustancia química aislada o en una combinación, ARNm, receptor, marcador, mediador, proteína o actividad de transcripción, o en cualquier elemento semejante, que presenta una relación con la angiogénesis o la proliferación o del que se cree que puede presentar una relación con la angiogénesis o la proliferación, y que ocurre como resultado de la administración de una composición de acuerdo con la presente invención.

El ITPP también incrementa la p02 en el microambiente del tumor e inhibe las metástasis y la neo-angiogénesis neoplástica. Las células tumorales hipóxicas, que frecuentemente son más invasivas y resistentes a la apoptosis, tienden a ser resistentes a la quimioterapia convencional. Por lo tanto, en determinadas formas de realización, la eficacia del tratamiento con el agente quimioterapéutico se incrementa cuando se aplica un tratamiento combinado con ITPP. Adicionalmente , en algunos aspectos, el tratamiento con ITPP da como resultado la inducción de una "normalización" a nivel de los microvasos en los tumores, Más aun, el ITPP reduce la cantidad de bombas que expulsan las drogas de los tumores, por lo que, en determinadas formas de realización, es posible tratar un cáncer resistente a uno o más agentes quimioterapéuticos y/o incrementar la eficacia de los agentes quimioterapéuticos contra las células tumorales .

En la presente invención se proveen nuevas composiciones farmacéuticas que comprenden ITPP y un agente quimioterapéutico. Los agentes quimioterapéuticos apropiados para usar en el contexto de la presente invención incluyen la aminoglutetimida, la amsacrina, el anastrozol, la asparraginasa, el BCG, la bicalutamida, la bleomicina, la buserelina, el busulfán, la camptotecina, la capecitabina , el carboplatino, la carmustina, el clorambucil, el cisplatino, la cladribina, el clodronato, la colchicina, la ciclofosfamida, la ciproterona, la citarabina, la dacarbazina, la dactinomicin , la daunorrubíciñ , el dienestrol, el dietilstilbestrol, el docetaxel, la doxorrubicina, la epirrubicina, el estradiol, la estramustina, el etopósido, el exemestano, el filgrastim, la fludarabina, la fludrocortisona, el fluorouracilo, la fluoximesterona, la flutamida, la gemcitabina, la genisteína, la goserelina, la hidroxiurea, la idarrubicina, la ifosfamida, el imatinib, el interferón, el irinotecano, el letrozol, la leucovorina, la leuprolida, el levamisol, la lomustina, la mecloretamina, la medroxiprogesterona, el megestrol, el melfalán, la mercaptopurina, el mesna, el metotrexato, la mitomicina, el mitotano, la mitoxantrona, la nilutamida, el nocodazol, la octreótido, el oxaliplatino , el paclitaxel, el pamidronato, la pentostatina, la plicamicina, el porfímero, la procarbazina, el raltitrexed, el rituximab, la estreptozocina, la suramina, el tamoxifeno, la temozolomida, el tenipósido, la testosterona, la tioguanina, el tiotepa, el dicloruro de titanoceno, el topotecano, el trastuzumab, la tretinoina, la vinblastina, la vincristina, la vindesina y la vinorelbina.

En una forma de realización, el agente quimioterapéutico es un agente que está dirigido a los microtúbulos , tal como el paclitaxel. En otra forma de realización, el agente quimioterapéutico es un agente que se intercala en el ADN, tal como un agente basado en platino (por ejemplo, cisplatino) o la doxorrubicina . En otra forma de realización, el agente quimioterapéutico es un inhibidor metabólico de los nucleósidos, tal como la gemcitabina o la capecitabina .

En determinadas formas de realización, el agente quimioterapéutico de la composición puede estar presente en una dosis o una cantidad sub-terapéutica . El término "dosis o cantidad sub-terapéutica" hace referencia a una dosis o una cantidad de una sustancia con actividad farmacológica que es inferior a la dosis o la cantidad de la sustancia que sería necesario administrar para obtener un efecto terapéutico si dicha sustancia fuera administrada por separado. La dosis sub-terapéutica de una sustancia variará dependiendo del sujeto y la condición de enfermedad que se desea tratar, del peso y la edad del sujeto, de la severidad de la condición de enfermedad, del modo de administración y de factores semejantes, lo cual puede ser determinado fácilmente por aquellos versados en la técnica. En una forma de realización, la dosis o la cantidad sub-terapéutica del agente quimioterapéutico es inferior a 90% de la dosis completa aprobada para el agente quimioterapéutico, lo que puede hallarse en los lineamientos para el agente quimioterapéutico en cuestión que son provistos por la Administración de Alimentos y Drogas de los EEUU. En otras formas de realización, la dosis o la cantidad sub-terapéutica del agente quimioterapéutico es inferior a 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20% o incluso 10% de la dosis completa aprobada, tal como entre 20% y 90%, entre 30% y 80%, entre 40% y 70% o cualquier otro rango dentro de los valores que se proveen en la presente.

En la presente invención también se provee un conjunto de elementos para tratar el cáncer, que comprende ITPP y un agente quimioterapéutico . El conjunto de elementos puede comprender instrucciones para usar el ITPP y el agente quimioterapéutico de acuerdo con un régimen de tratamiento o un método de la invención, que puede ser como se describirá con mayor detalle más adelante. Los agentes quimioterapéuticos apropiados para un conjunto de elementos como el mencionado pueden incluir los que se mencionaron con anterioridad. En un conjunto de elementos de acuerdo con la invención, puede emplearse una dosis o una cantidad sub-terapéutica del agente quimioterapéutico.

En la presente invención también se contemplan los implantes o los dispositivos de otro tipo que comprenden compuestos o drogas de ITPP, o prodrogas de éste, donde la droga o la prodroga está formulada en un polímero biodegradable o no biodegradable con el que puede efectuarse una administración sostenida. Con los polímeros biodegradables , es posible liberar la droga de manera controlada a través de procesos físicos o mecánicos, sin que se degrade el polímero propiamente dicho. Los polímeros biodegradables están diseñados para que se hidrolicen o se solubilicen gradualmente a través de procesos naturales en el cuerpo, con lo que se posibilita la liberación gradual de las drogas o las prodrogas que están combinadas con ellos. Las drogas o las prodrogas pueden estar unidas a través de enlaces químicos o pueden estar incorporadas en los polímeros debido a un proceso de combinación. Aquellos versados en la técnica han de conocer los polímeros biodegradables o no biodegradables y los procesos con los cuales pueden incorporarse las drogas, con el propósito de obtener una liberación controlada. Pueden hallarse ejemplos de polímeros de este tipo en numerosas referencias, tales como Brem et al., J. Neurosurg. 74: pp. 441-446 (1991), que se incorpora a modo de referencia en su totalidad. Estos implantes o dispositivos pueden implantarse cerca del sitio donde se desea efectuar la administración, por ejemplo, en la localización de un tumor.

Las composiciones farmacéuticas de esta invención también pueden contener uno o más agentes farmacológicos valiosos para tratar una o más de las condiciones de enfermedad que se mencionaron con anterioridad, o pueden administrarse de manera simultánea o consecutiva con ellos.

Las formulaciones generalmente pueden prepararse y administrarse de acuerdo con textos de referencia, tales como Remington's Pharmaceutical Sciences, 17a edición. Por ejemplo, las composiciones que se describen en la presente pueden formularse de manera convencional, usando uno o más vehículos o excipientes fisiológicamente o farmacéuticamente aceptables. Las composiciones de la presente invención y sus sales y sus solvatos farmacéuticamente aceptables pueden formularse para administrarlas, por ejemplo, por inyección (tal como por vía subcutánea, intramuscular o intraperitoneal) , por inhalación, por insuflación (lo cual puede realizarse a través de la boca o la nariz) o por medio de una administración oral, bucal, sublingual, transdérmica, nasal, parenteral o rectal. En una forma de realización, una composición puede administrarse de manera local, en el sitio donde se encuentran las células blanco, es decir, en un tejido, un órgano o un fluido específico (por ejemplo, la sangre, el fluido cerebroespinal, etcétera) . Ha de comprenderse que, además de los ingredientes, particularmente los que se mencionaron con anterioridad, las formulaciones de la presente invención podrán incluir otros agentes de uso convencional en la técnica que sean apropiados para el tipo de formulación en cuestión. Por ejemplo, los agentes apropiados para la administración oral pueden incluir agentes saborizantes u otros agentes para incrementar la palatabilidad y la idoneidad para la deglución de la formulación.

Las formulaciones de la presente invención que son apropiadas para la administración oral pueden presentarse como unidades discretas, tales como cápsulas, pastillas o tabletas, cada una de las cuales puede contener una cantidad predeterminada del ingrediente activo, polvos o gránulos, soluciones o suspensiones en líquidos acuosos o no acuosos, emulsiones de aceite en agua o de agua en aceite, etcétera. Una tableta puede prepararse comprimiendo o moldeando el ingrediente activo, opcionalmente en combinación con uno o más ingredientes adicionales. Opcionalmente, las tabletas pueden recubrirse o marcarse, y pueden formularse para proveer una liberación lenta o controlada del ingrediente activo que contienen.

Las formulaciones apropiadas para la administración tópica en el interior de la boca incluyen las pildoras, que comprenden los ingredientes en una base saborizada, que usualmente contiene sacarosa y goma acacia o tragacanto, las pastillas, que comprenden el ingrediente activo en una base inerte, por ejemplo, gelatina, glicerina o sacarosa y goma acacia, y los lavados bucales, que comprenden el ingrediente que se desea administrar en un vehículo líquido apropiado.

Las formulaciones apropiadas para la administración tópica sobre la piel abarcan los ungüentos, las cremas, los geles y las pastas, que comprenden el ingrediente que se desea administrar en un vehículo farmacéuticamente aceptable. Otro sistema con el que puede realizarse una administración tópica es un parche transdérmico que contiene el ingrediente que se desea administrar.

Las formulaciones para la administración rectal abarcan los supositorios, que contienen una base apropiada que comprende, por ejemplo, manteca de cacao y/o un salicilato.

Las formulaciones apropiadas para la administración nasal, donde el vehículo es un sólido, incluyen un polvo grueso que tiene un tamaño de partícula, por ejemplo, en el rango de entre 20 y 500 micrones, que se administra por inhalación, es decir, a través de la cavidad nasal, para lo cual se coloca un recipiente que contiene el polvo mencionado cerca de la nariz. Las formulaciones apropiadas para la administración en forma de atomizaciones o gotas nasales, donde el vehículo es un líquido, incluyen las soluciones acuosas u oleosas del ingrediente activo.

Las formulaciones apropiadas para la administración vaginal abarcan los pesarios, los tampones, las cremas, los geles, las pastas, las espumas y las formulaciones atomizables que, además del ingrediente activo, contienen ingredientes conocidos en la técnica como apropiados para usarlos como vehículos .

Las formulaciones apropiadas para la administración por inhalación incluyen los polvillos, los polvos y las formulaciones atomizables que, además del ingrediente activo, contienen ingredientes conocidos en la técnica como apropiados para usarlos como vehículos .

Las formulaciones apropiadas para la administración parenteral incluyen las soluciones de inyección estériles, acuosas o no acuosas, que pueden contener antioxidantes, amortiguadores, bacteriostáticos y solutos que tornan la formulación isotónica con la sangre del receptor deseado, así como las suspensiones estériles, acuosas o no acuosas, que pueden incluir agentes de suspensión y agentes espesantes. Las formulaciones pueden proveerse en recipientes para una o múltiples dosis, por ejemplo, en ampollas o recipientes sellados, y pueden almacenarse bajo condiciones de secado por congelación (es decir, liofilizadas) , de manera tal que solamente sea necesario agregarles un vehículo líquido estéril, por ejemplo, agua para inyección, inmediatamente antes de usarlas. Las soluciones y las suspensiones de inyección extemporánea pueden prepararse a partir de polvos, gránulos o tabletas estériles de los tipos que se describieron con anterioridad.

Las formulaciones que se contemplan como parte de la presente invención incluyen las formulaciones en forma de nanopartículas , que pueden prepararse con los métodos que se describen en la Publicación de los EEUU N° 2004/0033267, que se incorpora en la presente a modo de referencia en su totalidad. En determinadas formas de realización, las partículas de los compuestos de la presente invención tienen un tamaño promedio eficaz menor que aproximadamente 2 microñes, menor que aproximadamente 1500 nm, menor que aproximadamente 1000 nm, menor que aproximadamente 500 nm, menor que aproximadamente 250 nm, menor que aproximadamente 100 nm o menor que aproximadamente 50 nm, lo cual puede determinarse con métodos de dispersión lumínica o de microscopía, o bien con otros métodos apropiados que han de resultar bien conocidos para aquellos versados en la técnica. (2) RÉGIMEN DE TRATAMIENTO Y MÉTODO DE LA INVENCIÓN El ITPP induce la normalización de los vasos en el interior de los tumores. La normalización de los vasos que induce el ITPP en el interior de los tumores sirve para contrarrestar la hipoxia, que es una causa fundamental de la resistencia que presentan las células tumorales a la radiación y a las drogas citotóxicas, y también de las metástasis de los tumores.

En un aspecto, en la presente invención se provee un régimen de tratamiento o un método para tratar el cáncer o un tumor en un sujeto, que comprenden administrar de manerai simultánea o consecutiva una cantidad eficaz para el uso terapéutico de ITPP y de un agente quimioterapéutico . La frase "cantidad eficaz para el uso terapéutico" hace referencia a una cantidad de una sustancia, una composición, un conjunto de elementos o un régimen de tratamiento como un todo que da como resultado un efecto local o sistémico deseado, que típicamente se encuentra dentro de un rango razonable para la relación beneficio/riesgo, en el contexto de un régimen o un método de tratamiento. La cantidad eficaz para el uso terapéutico de una sustancia variará en función del sujeto y la condición de enfermedad que se desee tratar, del peso y la edad del sujeto, de la severidad de la condición de enfermedad, del modo de administración y de factores semejantes, lo cual podrá ser determinado fácilmente por aquellos versados en la técnica. Por ejemplo, algunas de las composiciones que se describen en la presente pueden administrarse en una cantidad suficiente para producir un efecto deseado, dentro de un rango razonable para la relación beneficio/riesgo, con relación al tratamiento mencionado.

Los agentes quimioterapéuticos apropiados para usar en' los métodos de la presente invención pueden incluir los que se mencionaron con anterioridad. En determinadas formas de realización, el agente quimioterapéutico es paclitaxel, cisplatino o gemcitabina.

Los ejemplos de cánceres incluyen, sin limitaciones, los neoplasmas hematológicos , que abarcan las leucemias, los mielomas y los linfornas, los carcinomas, que abarcan los adenocarcinomas y los carcinomas de las células escamosas, los melanomas y los sarcomas. Los carcinomas y los sarcomas frecuentemente también se conocen como "tumores sólidos" . Los tipos de tumores que pueden tratarse con los métodos de la presente invención preferiblemente son tumores sólidos que incluyen, sin limitaciones, los sarcomas, los carcinomas y otros cánceres que toman la forma de tumores sólidos, que incluyen, sin limitaciones, los tumores que afectan a la línea germinal, los tumores que afectan al sistema nervioso central, el cáncer de mama, el cáncer de próstata, el cáncer cervical, el cáncer de cuello uterino, el cáncer de pulmón, el cáncer de ovario, el cáncer de testículo, el cáncer de tiroides, los astrocitomas , los gliomas, el cáncer de páncreas, el cáncer de estómago, el cáncer de hígado, el cáncer de colon, los melanomas, el cáncer renal, el cáncer de vejiga, el cáncer de esófago, el cáncer de laringe, el cáncer de parótida, el cáncer del tracto biliar, el cáncer rectal, el cáncer de endometrio, los carcinomas de las células escamosas, los adenocarcinomas, los carcinomas de las células pequeñas, los neuroblastomas , los mesoteliomas , los carcinomas adrenocorticales , los carcinomas epiteliales, los tumores desmoldes, los tumores desmoplásticos de las células pequeñas redondas, los tumores endocrinos, los tumores de la familia del sarcoma de Ewing, los tumores que afectan a las células germinales, los hepatoblastomas , los carcinomas hepatocelulares , los linfornas, los melanomas, los sarcomas del tejido blando diferentes de los rabdomiosarcomas , los osteosarcomas , los tumores del neuroectodermo primario periférico, los retinoblastomas , los rabdomiosarcomas y los tumores de Wilms.

En una forma de realización, el ITPP y el agente quimioterapéutico se administran de manera simultánea. En una forma de realización específica, se administra de manera simultánea ITPP y un inhibidor del metabolismo que es un nucleósido, tal como la gemcitabina, que hace las veces de agente quimioterapéutico. En otra forma de realización específica, el cáncer es un cáncer de páncreas. En determinadas formas de realización, el cáncer es un melanoma.

En otra forma de realización, el ITPP y el agente quimioterapéutico se administran de manera consecutiva. Por ejemplo, el ITPP puede administrarse antes de la administración del agente quimioterapéutico. En una forma de realización preferida, el agente quimioterapéutico se administra una vez que ha ocurrido una normalización parcial de los vasos en el tumor. Tal como se lo emplea en la presente, el término "normalización parcial de los vasos en el tumor" hace referencia a un estado fisiológico en el que la vasculatura existente en el tumor presenta una estructura mejorada en el endotelio vascular y la membrana basal, por lo que presenta menos pérdidas, dilatación y/o hipoxia. Esta normalización parcial de los vasos en el tumor puede determinarse detectando y/o monitoreando el cambio en el nivel de uno o más de los siguientes parámetros: la p02, elnivel del factor 1 alfa que puede ser inducido por la hipoxia (HIF-la) , del VEGF, de la tirosina quinasa Tie-2 y de la hemo-oxigenasa 1 (HO-1) , o bien monitoreando el estado fisiológico de los vasos en el tumor, para lo cual puede recurrirse a tecnologías que incluyen el diagnóstico por imágenes basado en la resonancia magnética (MRI) y la angiografía basada en la resonancia magnética (MRA) .

En una forma de realización preferida, el ITPP se administra aproximadamente entre 2 horas y 5 días antes de la administración del agente quimioterapéutico . En otra forma de realización preferida, el ITPP se administra aproximadamente entre 1 y 4 días antes de la administración del agente quimioterapéutico, tal como entre 2 y 3 días antes de la administración del agente quimioterapéutico (que por ejemplo, puede ser un agente dirigido a los microtúbulos , tal como el paclitaxel, o un agente que se intercala en el ADN, tal como el cisplatino) .

Es posible realizar múltiples administraciones de ITPP y un agente quimioterapéutico . En determinadas formas de realización, se realiza una sola administración. En otras formas de realización, se realizan dos o más administraciones (por ejemplo, dos, tres, cuatro o más administraciones) de ITPP y un agente quimioterapéutico. Las administraciones pueden estar separadas por un período de entre 1 día y 6" meses, tal como entre 1 día y 3 meses, entre 1 semana y 2 semanas, entre 2 semanas y 3 semanas, entre 3 semanas y 1 mes, entre 1 mes y 2 meses o entre 2 meses y 3 meses.

El agente quimioterapéutico puede administrarse en una dosis o una cantidad sub-terapéutica, sobre la base de la dosis que habría de administrarse si se lo usara por sí solo. En una forma de realización, la dosis o la cantidad sub-terapéutica que se administra del agente quimioterapéutico es inferior a 90% de la dosis completa aprobada para el agente quimioterapéutico, o bien es una dosis como las que se describieron con anterioridad.

En la presente invención también se provee un método para tratar un cáncer que se caracteriza por ser resistente a diversas drogas. En determinadas formas de realización, un cáncer que es resistente a diversas drogas no puede ser tratado con uno o más agentes quimioterapéuticos . Por ejemplo, el tamaño de los tumores asociados a un cáncer que es resistente a diversas drogas puede no reducirse cuando se aplica un tratamiento con un agente determinado. Adicionalmente o como alternativa, dicho agente puede no inhibir significativamente el progreso de un tumor como los mencionados (por ejemplo, de la etapa II a la etapa III o de la etapa III a la etapa IV) . Los ejemplos de agentes quimioterapéuticos a los que pueden ser resistentes determinados cánceres, particularmente los melanomas, incluyen los agentes que están dirigidos a los microtúbulos (por ejemplo, el paclitaxel) y los agentes que se intercalan en el ADN (por ejemplo, los agentes basados en platino, tales como el cisplatino) . Se describen ensayos para determinar la resistencia a diversas drogas, por ejemplo, en Lowe et al. (1993) Cell 74:95 7-697, que se incorpora en la presente a modo de referencia. En otras formas de realización, un cáncer que es resistente a diversas drogas es un cáncer que se caracteriza por la presencia de niveles significativamente incrementados del transportador canalicular multiespecífico para aniones orgánicos 1 y/o de la bomba para expulsar drogas que está asociada a la glucoproteína P, en comparación con un cáncer sin dicha resistencia.

Los métodos para tratar un cáncer que es resistente a diversas drogas pueden comprender la administración de ITPP solo o de ITPP en combinación con otro agente quimioterapéutico, tal como los que se describen en la presente .

En la presente invención también se proveen métodos para tratar una afección hiperproliferativa que comprenden administrarle a un sujeto que lo necesita una cantidad eficaz para el uso terapéutico de ITPP, donde la afección hiperproliferativa no es un cáncer ni se caracteriza por una angiogénesis indeseable. Las afecciones hiperproliferativas que pueden tratarse con los métodos de la presente invención incluyen, sin limitaciones, la nefropatía diabética, la glomeruloesclerosis , la nefropatía caracterizada por la presencia de IgA, la cirrosis, la atresia biliar, la insuficiencia cardiaca congestiva, el escleroderma, la fibrosis inducida por radiación, la fibrosis pulmonar (que abarca la fibrosis pulmonar idiopática, la enfermedad vascular provocada por el colágeno, la sarcoidosis, las enfermedades de las regiones intersticiales de los pulmones y los trastornos pulmonares extrínsecos), la psoriasis, las lesiones genitales y las enfermedades caracterizadas por una proliferación celular excesiva, que abarcan las enfermedades hiperproliferativas de los queratinocitos , tales como la hiperqueratosis , la ictiosis, el queratoderma o el liquen plano. En algunas formas de realización, el tejido o el órgano que está afectado por la afección hiperproliferativa es hipóxico. En otra forma de realización, el método para tratar una afección hiperproliferativa también comprende administrar un agente anti-hiperproliferativo adicional. Los agentes anti-hiperproliferativos incluyen la doxorrubicina, la daunorrubicina, la mitomicina, la actinomicina D, la bleomicina, el cisplatino, VP16, la enediina, el taxol, la vincristina, la vinblastina, la carmustina, la melfalán, la ciclofosfamida, el clorambucil, el busulfán, la lomustina, el 5-fluorouracilo, la gemcitabina, el BCNU y la camptotecina .

En la presente invención también se provee un método para potenciar la respuesta inmune en un sujeto que lo necesita, que comprende administrarle al sujeto una cantidad eficaz para el uso terapéutico de ITPP, donde el sujeto no padece un cáncer o un tumor de otro tipo. En una forma de realización, el sujeto no padece una angiogénesis indeseable. (3) DEFINICIONES Tal como se los emplea en la presente, los términos y las frases más adelante tienen los significados que se proveen. A menos que se los defina de otro modo, todos los términos técnicos y científicos que se usan en la presente tienen el mismo significado que comúnmente les dan aquellos versados en la técnica.

El término "agente" se emplea en la presente para hacer referencia a un compuesto químico, a una mezcla de compuestos químicos, a una macromolécula biológica (tal como un ácido nucleico, un anticuerpo, una proteína o una porción de ésta, por ejemplo, un péptido) o a un extracto preparado con materiales biológicos, tales como bacterias o células o tejidos provenientes de plantas, de hongos o de animales (particularmente de mamíferos) . La actividad de un agente de este tipo puede tornarlo apropiado como "agente terapéutico" , lo cual hace referencia a una o más sustancias que presentan actividad biológica, fisiológica o farmacológica en un sujeto, ya sea a nivel local o de manera sistémica.

El término "administración parenteral" es conocido en la técnica y hace referencia a un modo de administración que no tiene lugar por vía enteral o tópica, que usualmente implica una inyección, lo que incluye, sin limitaciones, las inyecciones y las infusiones intravenosas, intramusculares, intraarteriales , intratecales , intracapsulares , intraorbitales , intracardiacas , intradérmicas , intraperitoneales , transtraqueales , subcutáneas, subcuticulares , intraarticulares , subcapsulares , subaracnoideas , intraespinales o intrasternales .

Un "paciente", un "sujeto", un "individuo" o un "huésped" hacen referencia a un ser humano o a un animal no 4 O humano .

Una "droga" o un "agente citotóxico" hacen referencia a cualquier agente que puede destruir las células, preferiblemente las células cancerosas.

El término "vehículo farmacéuticamente aceptable" es conocido en la técnica y hace referencia a un material, una composición o un vehículo que es aceptable para aplicaciones farmacéuticas, que puede ser un relleno, un diluyente, un excipiente, un solvente o un material de encapsulación líquido o sólido, que sirve para llevar o transportar una composición o un componente de ésta. Cada vehículo debe ser "aceptable", lo que denota que debe ser compatible con la composición y con los otros componentes, y que no debe resultar perjudicial para el paciente. Algunos ejemplos de materiales que pueden servir como vehículos farmacéuticamente aceptables incluyen (1) los azúcares, tales como la lactosa, la glucosa y la sacarosa, (2) los almidones, tales como el almidón de maíz y el almidón de papa, (3) la celulosa y sus derivados, tales como la carboximetil celulosa de sodio, la etil celulosa y el acetato de celulosa, (4) el tragacanto en polvo, (5) la malta, (6) la gelatina, (7) el talco, (8) los excipientes, tales como la manteca de cacao y las ceras para supositorios, (9) los aceites, tales como el aceite de maní, el aceite de semilla de algodón, el aceite de sésamo, el aceite de oliva, el aceite de maíz y el aceite de soja, (10) los glicoles, tales como el propilenglicol , (11) los polioles, tales como la glicerina, el sorbitol, el manitol y el polietilenglicol , (12) los ásteres, tales como el oleato de etilo y el laurato de etilo, (13) el agar, (14) los agentes amortiguadores, tales como el hidróxido de magnesio y el hidróxido de aluminio, (15) el ácido algínico, (16) el agua libre de pirógeno, (17) la solución salina isotónica, (18) la solución de Ringer, (19) el alcohol etílico, (20) las soluciones amortiguadas con fosfato y (21) otras sustancias no tóxicas compatibles de uso habitual en las formulaciones farmacéuticas .

El término "agente terapéutico" es conocido en la técnica y hace referencia a cualquier unidad química que es una sustancia que presenta actividad biológica, fisiológica o farmacológica en un sujeto, ya sea a nivel local o de manera sistémica. El término también abarca cualquier sustancia que puede usarse en el diagnóstico, la cura, la mitigación, el tratamiento o la prevención de una enfermedad, o bien en la mejora del desarrollo físico o mental y/o de diversas afecciones en un animal o en un ser humano.

El "tratamiento" de una afección o una enfermedad hace referencia a la cura de la afección o la enfermedad o a la mejora de al menos uno de sus síntomas. El tratamiento incluye la administración de una composición con la que se reduce la frecuencia de los síntomas o se demora el inicio de una afección médica en un sujeto, en comparación con un sujeto al que no se le ha administrado la composición. De esta manera, el tratamiento del cáncer incluye, por ejemplo, la reducción de la cantidad y/o el tamaño de los focos de crecimiento canceroso en una población de pacientes que reciben un tratamiento, en comparación con una población control sin tratar, y/o la demora del surgimiento de los focos de crecimiento canceroso que pueden detectarse en una población tratada, en comparación con una población sin tratar, por ejemplo, en una magnitud de significación estadística y/o clínica.

EJEMPLOS La invención ha sido descripta de manera genérica. Ha de ser posible comprenderla con mayor facilidad al hacer referencia a los siguientes ejemplos, que se proveen meramente con el propósito de ilustrar determinados aspectos y formas de realización de la presente invención, por lo que no tienen el objeto de limitar la invención de modo alguno.

EJEMPLO 1. PRODUCCIÓN DE LA LÍNEA CELULAR B16F10LUCGFP La transducción del melanoma murino B16F10 se llevó a cabo con diversos vectores retrovirales : un ADNc que codificaba una luciferasa de luciérnaga dirigida por un promotor LTR 5' y seguida por una secuencia IRES y un ADNc de la EGFP. Los vectores se produjeron usando un plásmido pB N-Luc-I-GFP (que fue provisto gentilmente por el Doctor Magnus Essand, Uppsala, Suecia) y una línea de célula de agrupamiento PT67 (de Clontech) donde se expresaban de manera estable los genes gag, pol y env. Adicionalmente , se usó un plásmido pM13 con los genes gag y pol (que fue provisto gentilmente por la Doctora Christine Brostjan, Viena, Austria) para incrementar la eficiencia de la producción. Las células del agrupamiento se cultivaron en un medio DME HG (de PAA Laboratories) con la adición de 10% de FCS, penicilina (100 U/ml) y estreptomicina (100 yg/ml) y se transíectaron de manera concurrente con los plásmidos pBMN-Luc-I-EGFP y pM13 usando el reactivo SuperFect (de Qiagen) , de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Una vez completa la transíección, las células se cultivaron a 32°C durante 48 horas. Luego recolectó el medio que contenía los vectores retrovirales , se lo mezcló con un medio RPMI completo, en una proporción de 1:1 v/v, y se lo usó para transducir las células B16F10. Tres días después, se estimó la eficiencia de la transducción usando un microscopio de fluorescencia, sobre la base de la presencia de la EGFP (aproximadamente 5%) . Después de realizar diversos pasajes con las colonias positivas para la EGFP y tres procedimientos de clasificación con un citómetro de flujo MoFIo (de Dako Cytomation) , se obtuvo la línea celular B16F10LucGFP con una pureza superior a 99%.

EJEMPLO 2. SUSCEPTIBILIDAD DE LAS CÉLULAS A UNA QUIMIOTERAPIA, SOBRE LA BASE DE LA PRESIÓN DE Q2 Se representaron curvas de respuesta a la dosis del cisplatino (cis-diclorodiamina de platino, de Sigma-Aldrich) o del paclitaxel (de Calbiochem) bajo una p02 parcial con diversos valores durante 48 horas. La viabilidad de las células se determinó con una evaluación con un colorante azul de Alamar (de Biosource) , de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

EJEMPLO 3. EVALUACIÓN EXPERIMENTAL DE LAS METÁSTASIS Después de aplicar una inyección intravenosa de células de melanoma murino B16F10LucGFP (105 células en 0,1 mi de solución salina) en la vena caudal, se trataron los ratones (que eran ratones C57BL/6 hembra de ocho semanas de edad, de Janvier) con 1,5 g/kg de ITPP, que se aplicó a través de una inyección IP cada 5 días (con 10 ratones por grupo de tratamiento) . El tratamiento fue iniciado el quinto día después de la inoculación de las células tumorales. 19 ó 27 días después, se sacrificaron los ratones y se recolectaron los pulmones por separado. Se contaron los focos macroscópicos en los pulmones y se determinó el nivel de la luciferasa por medio de un ensayo de quimioluminiscencia (de Promega) , con el fin de determinar la cantidad de células de melanoma en los tejidos. Los procedimientos de todos los estudios con animales y el tratamiento de los animales fueron aprobados por el Comité de Ética para la Experimentación en Animales del Campus de la CNRS de Orleans, Francia.

EJEMPLO 4. MODELO DE MELANOMA SUBCUTÁNEO Se cultivaron células B16F10LucGFP en forma de tumores subcutáneos, después de inyectar 100 µ? de un material de siembra que comprendía aproximadamente 105 células en 25% de Matrigel™ (al 50% en OptiMEM) . El material de Matrigel provino de BD Biosciences, y el medio OptiMEM se obtuvo en Invitrogen. 25 días después de la inoculación, se sacrificaron los ratones y se extrajeron los tumores y los pulmones. Se aplicaron diversos protocolos de tratamiento de acuerdo con la duración de la aplicación y la dosis del ITPP (desde 100 yg/kg hasta 2,0 g/kg en solución salina, con una aplicación intraperitoneal ) , en combinación con cisplatino (10 mg/kg en solución salina, con una aplicación intraperitoneal) y paclitaxel (2 mg/kg en una mezcla con 50% de etanol y 50% de Cremophor EL, de Sigma-Aldrich, con una aplicación en el ojo izquierdo) . El tratamiento fue iniciado 7, 9 u 11 días después de la inoculación de las células de. melanoma .

EJEMPLO 5. CUANTIFICACIÓN BIOQUÍMICA DE LOS MARCADORES RELACIONADOS CON LA HIPOXIA, LA ANGIOGÉNESIS O LOS MELANOMAS Se homogenizaron los pulmones en un amortiguador de lisis (de Active motif ) . Después de centrifugar, se recolectó un sobrenadante transparente. Se determinó la cantidad total de proteínas con un conjunto de elementos para analizar las proteínas de BCA (Thermo Scientific) . Se determinó el nivel del HIF-?a, del VEGF, de la Tie-2 y de la HO-1 en lisados pulmonares usando un ELISA colorimétrico en sandwich, de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los conjuntos de elementos de ELISA para analizar el HIF-1 a, el VEGF y la Tie-2 provinieron de R&D . El conjunto de elementos de ELISA para analizar la HO-1 se obtuvo en Takara.

EJEMPLO 6. ANÁLISIS BASADO EN UNA REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA SEMI -CUANTITATIVA CON UNA TRANSCRIPTASA INVERSA Las secuencias de los cebadores que se emplearon en la reacción en cadena con la polimerasa Taqman y LOX fueron 5'-ATCGCCACAGCCTCCGCAGCTCA-3' (SEQ ID N° 1) y 5'-AGTAACCGGTGCCGTATCCAGGTCG-3 ' (SEQ ID N° 2). Para analizar la ß-actina (el control interno) , las secuencias de los cebadores fueron 5 ' -CCAGAGCAAGAGAGGCATCC-3 ' (SEQ ID N° 3) y 51 -CTGTGGTGGTGAAGCTGAAG-3 ' (SEQ ID N° 4). Las bandas del ADNc amplificado se cuantificaron con el software ImageQuant (de Becton y Dickinson) . Los niveles del ARNm de LOX fueron sometidos a una normalización en función del nivel del ARNm de la ß-actina.

EJEMPLO 7. COLORACIÓN I MUNOHISTOLÓGICA Se embebieron tejidos tumorales en el medio para congelar tejidos Tissue-Tek (de Sakura) , después de lo cual se los destruyó por congelación en nitrógeno líquido. Las criosecciones se fijaron y se colorearon usando anticuerpos monoclonales del tipo de la IgG2a de rata contra la proteína CD31 de ratón (PECA -1, una molécula que participa en la adhesión entre las plaquetas y las células endoteliales , de eBiosciences) , con un anticuerpo del tipo de la IgG de conejo contra la SMA (la actina del músculo liso; AbCAM) o con un anticuerpo del tipo de la IgG2a de ratón contra la glucoproteína P (C219, de Calbiochem) , en una dilución de 1:200 en FCS al 5% en PBS . Como anticuerpo secundario, se usó un anticuerpo contra la inmunoglobulina de rata del tipo de la IgG de rata marcado con FITC, un anticuerpo contra la inmunoglobulina de conejo del tipo de la IgG de cabra marcado con FITC o un anticuerpo contra la inmunoglobulina de ratón del tipo de la IgG de cabra marcado con FITC (en una dilución de 1:200 en PBS), respectivamente. Para detectar los núcleos de las células, se incubaron las secciones con bis-Benzimida H 33258 (de Sigma-Aldrich) en una dilución de 1:1000 en PBS. Los especímenes se montaron en Vectashield (de Vector) . Se llevó a cabo una detección por microscopía de fluorescencia en un microscopio _ invertido fluorescente 200M de Zeiss. Se analizó la necrosis de los tumores después de aplicar una coloración de hematoxilina y eosina sobre secciones de dichos tumores .

EJEMPLO 8. DIAGNÓSTICO POR IMÁGENES BASADO EN LA RESONANCIA MAGNÉTICA (MRI) Los ensayos de MRI se llevaron a cabo con un imán horizontal de 9,4 T para animales pequeños (94/21 USR, de Bruker Biospec) , que estaba equipado con un conjunto de gradiente de 950 mT/m. Los ratones fueron colocados en una bobina homogénea lineal (con un diámetro interno de 35 mm) . Se los mantuvo bajo anestesia gaseosa (50% de N20 con un flujo de 0,7 1/minuto y 50% de 02 con un flujo de 0,7 1/minuto, más isoflurano al 1,5%), a una temperatura constante de 36 °C. La frecuencia respiratoria se monitoreó durante el proceso de adquisición de datos usando un balón de aire localizado en el pecho de los ratones, con el fin de ajustar el flujo de la anestesia. La medición de la vascularización de los tumores se llevó a cabo por medio de una angiografía MR, usando una secuencia de disparo rápido en un ángulo reducido (FLASH) en los planos axial y coronal. La secuencia de pulsos FLASH se adaptó para estudiar la evolución de la angiogénesis en el tumor. Con esta técnica, es posible estudiar la estructura tridimensional del árbol vascular de un tumor en un mismo animal con el correr del tiempo .

EJEMPLO 9. MEDICIÓN DE LA P02 CON EL SISTEMA OXYLITE El sistema Oxylite 2000E (de Oxford Optronics) sirve para medir la p02. Se basa en la determinación de la duración de la fluorescencia dependiente del 02 que es emitida por el cloruro de rutenio cuando se lo inmoviliza en el extremo de una sonda de fibra óptica con un diámetro de 230 µp?. La duración del pulso fluorescente es inversamente proporcional a la tensión de oxígeno en el extremo de la sonda. Los ratones fueron anestesiados con una inyección intraperitoneal de xilazina/ketamina antes de insertar el extremo de la sonda del sistema Oxylite en el tumor y registrar la presión de oxígeno como se ha descripto.

EJEMPLO 10. LOS ERITROCITOS INDUCIDOS CON ITPP CONTRARRESTAN SELECTIVAMENTE LA HIPOXIA EN EL MICROAMBIENTE DEL TUMOR Para confirmar que los eritrocitos inducidos con ITPP contrarrestan la hipoxia in vivo, se compararon los valores de la tensión de oxígeno en melanomas implantados debajo de la piel de la pata izquierda entre ratones tratados con ITPP y ratones sin tratar. La presión de oxígeno (p02) se midió determinando la duración de la fluorescencia dependiente del 02 que es emitida por el cloruro de rutenio cuando se lo inmoviliza en el extremo de una sonda de fibra óptica. La duración del pulso fluorescente es inversamente proporcional a la tensión de oxígeno en el extremo de la sonda. Si bien los tumores en los animales no tratados fueron fuertemente hipóxicos, con una presión de oxígeno con un valor inferior a 2 mm de Hg (figura 1) , en los tumores de los ratones que fueron tratados con ITPP, la p02 alcanzó un rango de 40 mm de Hg (figura 1A) . Este incremento en la p02 ocurrió incluso 30 minutos después de la inyección intraperitoneal de ITPP (figuras IB y C) . El valor se mantuvo en un rango elevado, de hasta 40 mm de Hg, lo cual se determinó 24 horas después de la inyección (figura 1A) , durante un período de al menos 48 horas. Más aun, los eritrocitos inducidos con ITPP atacaron específicamente los tumores hipóxicos. Tal como se demostró con mediciones paralelas en el músculo de la pata opuesta (derecha) del mismo animal, que no estaba afectada por el tumor, no hubo cambios o efectos sobre la p02 (figura 1C) . Por otro lado, la p02 en el tumor aumentó 30 minutos después de la inyección del ITPP. .

EJEMPLO 11. LOS ERITROCITOS INDUCIDOS CON ITPP IMPIDEN LA FORMACIÓN DE METÁSTASIS DE LAS CÉLULAS DE MELANOMA B16 EN LOS PULMONES Para convalidar el ITPP como agente anti-metastásico, se usó un modelo de metástasis "artificiales" en los pulmones, de acuerdo con el cual se inyectaron por vía intravenosa células de melanoma en ratones . Se empleó la línea celular B16F10LucGFP, que es una línea de melanoma B16F10 que ha sido transducida con genes indicadores de la GFP y de la luciferasa, con lo que es posible rastrear y cuantificar las células de melanoma mediante el análisis de la actividad de la luciferasa en los tejidos. Se llevaron a cabo experimentos para comparar el comportamiento biológico de la línea de células de melanoma B16F10 con el de las células B16F10LucGFP, en términos de la proliferación, la promoción de la angiogénesis y el desarrollo de metástasis. No se determinaron diferencias significativas ni sensibilidad de la luciferasa a la hipoxia, con lo que se convalidó el uso de la línea celular mencionada.

Se pusieron en práctica experimentos in vivo hasta que hubieran transcurrido 27 días después de la inoculación de las células de melanoma. Los nodulos metastásicos se redujeron de manera muy significativa cuando el tratamiento con ITPP se inició el quinto día después de la inyección de las células B16. Fue posible cuantificar este efecto midiendo la actividad de la luciferasa en los pulmones (figura 2A) . De esta manera, fue posible realizar la cuantificación bioquímica de las micrometástasis , que no habrían podido ser detectadas por medio de un examen visual. Para investigar si el efecto del ITPP estaba asociado a cambios en la presión parcial de oxígeno en los nodulos, se analizó la expresión de la isoforma HIF-? de la subunidad a del factor inducible por la hipoxia, que es crucial para las células de mamíferos respondan al nivel del oxígeno, por lo que se considera que es el sensor de 02 en las células. Una vez que se une al elemento que media en la respuesta a la hipoxia (HRE) , activa la cascada de genes relacionados con la hipoxia. En la figura 2B se ilustra que el nivel de HIF-lor, que presentó una regulación claramente positiva en los ratones que padecían melanomas sin tratar, se redujo dramáticamente en los pulmones de los ratones que fueron tratados con ITPP.

El nivel del factor de crecimiento del endotelio vascular (VEGF) depende del nivel del HIF-?a. El objetivo principal de los tratamientos anti-angiogénicos es reducir sus niveles con relación al control (figura 2C) , lo cual puede determinarse con un ELISA, bajo la influencia de eritrocitos inducidos con ITPP. Los resultados obtenidos se confirmaron estudiando la expresión de la Tie-2, que es una tirosina quinasa receptora que se encuentra específicamente en el endotelio y que resulta esencial para la maduración de los vasos sanguíneos normales, cuyo nivel se reduce en presencia de hipoxia. Este marcador, cuyo nivel se encuentra significativamente reducido en los pulmones hipóxicos, fue inducido nuevamente al aplicar un tratamiento con ITPP (figura 2D) , lo que refleja que los vasos en los nodulos metastásicos presentaban una angiogénesis desorganizada, por lo que, cuando la angiogénesis fue regulada por los eritrocitos inducidos con ITPP, el marcador de la Tie-2 se expresó nuevamente en más vasos maduros. Después de realizar el tratamiento con ITPP, el nivel de la hemo oxigenasa 1 (H0-1) , una enzima crioprotectora que es inducida por el HIF-l , también se redujo significativamente con relación a los ratones sin tratar (figura 2E) . La sobreexpresión de HO-1 da como resultado un incremento en la viabilidad, la proliferación y el potencial angiogénico de las células de melanoma, incrementa las metástasis y disminuye la supervivencia de los ratones control que presentan tumores . Mediante estudios adicionales basados en un análisis de PCR semi-cuantitativa del nivel del ARNm de la lisil-oxidasa (figura 2F) , una enzima que participa en el proceso invasivo de las células cancerosas y que está regulada por la hipoxia, también se demostró el efecto beneficioso del tratamiento con ITPP, con lo que se obtuvieron "eritrocitos con poca afinidad por el 02" .

EJEMPLO 12. LOS ERITROCITOS INDUCIDOS CON ITPP ERRADICAN LAS METÁSTASIS DE MELANOMAS ORTÓPICOS EN LOS PULMONES Se evaluaron los efectos de los eritrocitos inducidos con ITPP sobre las metástasis después de implantar un tumor primario debajo de la piel. Con un tratamiento a corto plazo con ITPP (3 inyecciones con intervalos de 5 días) , que se inició el día 7 después de la inoculación del tumor, se produjo una reducción significativa de las metástasis en los pulmones (figura 3A) . Cuando el tratamiento con ITPP se inició el día 7, se obtuvo un resultado óptimo para protocolos de administración a corto plazo y crónica (los días 7, 12, 15, 18 y 19) . El inicio el día 9 u 11 fue menos eficaz: las administraciones crónicas incluso dieron como resultado un incremento en las metástasis en los pulmones (figura 3A) . Aunque la razón para esta observación no está clara, se cree que la administración crónica podría dar como resultado una inhibición completa de la angiogénesis y una alteración en fenotipo de los tumores, de manera tal que podría incrementarse su capacidad de invasión y las metástasis .

EJEMPLO 13. LOS ERITROCITOS INDUCIDOS CON ITPP INDUCEN LA NORMALIZACIÓN DE LOS VASOS EN LOS TUMORES Se evaluaron los cambios estructurales en la microcirculación en los tumores con una adaptación de MRA (angiografía basada en la resonancia magnética) del diagnóstico por imágenes basado en la resonancia magnética (MRI) , con el propósito de analizar la estructura tridimensional del árbol vascular en los tumores. 21 días después de desarrollar los melanomas, los tumores presentaron una arquitectura caótica típica en los vasos (figura 3Ba) . En los ratones que fueron tratados con ITPP el día 9 y 14 , la vasculatura se tornó menos densa y se normalizó de manera notable después de repetir el tratamiento los días 18 y 19. Cuando se examinó el interior de los tumores, se determinó la presencia de numerosos vasos en la periferia. Se demostró que hubo una normalización sobre la base del reclutamiento de pericitos alrededor de los vasos, que fueron marcados con los anticuerpos contra los antígenos del músculo liso (figura 3Bb) . Por otra parte, no fue posible observar este ordenamiento en los tumores no tratados (figuras 3Ba y b) . Esta tendencia a la "normalización" estuvo acompañada por una reducción notable en el tamaño de los pulmones (figura 3Ba) .

En los mismos tumores primarios implantados, se examinó el efecto del tratamiento con ITPP sobre las bombas para expulsar drogas, que son responsables de la resistencia a las terapias multidroga. El ITPP provoca una regulación negativa de la bomba para expulsar drogas que está asociada a la glucoproteína P. Este efecto puede contrarrestar la resistencia a las terapias multidroga y la interrupción de las interacciones entre las drogas y sus blancos, que se debe a una reducción en la concentración efectiva de las drogas en las células. Como consecuencia, la normalización de los vasos inducida por el ITPP está correlacionada con la reducción en la actividad de las bombas para expulsar drogas en los tumores, con lo que puede incrementarse la eficacia de las drogas contra las células tumorales.

EJEMPLO 14. LOS ERITROCITOS INDUCIDOS CON ITPP ERRADICAN LAS METÁSTASIS DE MELANOMAS ORTÓPICOS EN LOS PULMONES Y PROVOCAN UNA SINERGIA SIMULTANEA CON LA QUIMIOTERAPIA Debido a que el ITPP puede mejorar la distribución del oxígeno en los tejidos hipóxicos a través de los eritrocitos, se estudió su efecto sobre la eficacia del tratamiento de los melanomas con drogas como el paclitaxel y el cisplatino. Primero se evaluaron los efectos de las drogas sobre células de melanoma B16 bajo condiciones de normoxia e hipoxia seguida por reoxigenación in vitro. En la figura 4 se ilustra que la citotoxicidad de las drogas sobre las células B16 se redujo a medida que se incrementó la tensión de oxígeno (desde 1% hasta 11%) . Sin embargo, cuando ocurrió la reoxigenación de las células (desde 1% hasta 11% y luego 20%) , la citotoxicidad de las drogas se restableció hasta alcanzar un nivel que dependió de la p02 (figuras 4A y B) . Cuando se comparan los resultados obtenidos en este caso con los resultados que se obtuvieron para la modulación in vivo de la glucoproteína P en las células tumorales, puede inferirse que sería posible revertir la sensibilidad a las drogas, que es controlada por el incremento de la resistencia a las terapias multidroga inducido por la hipoxia, a través de la reoxigenación del tumor inducida por el ITPP.

Se realizó un tratamiento combinado con ITPP, paclitaxel y cisplatino in vivo. Las metástasis en los pulmones se incrementaron dramáticamente (figura 5A) después de un tratamiento simultáneo con ITPP, paclitaxel y cisplatino, y presentaron un perfil similar al que se observó con un tratamiento crónico con ITPP solo (véase la descripción precedente). Por sí solos, el paclitaxel y el cisplatino dieron como resultado una inhibición del crecimiento de las células endoteliales (figura 4C) , lo que sirve como fundamento para el efecto anti-angiogénico de estos compuestos in vivo. Se descubrió que estos tratamientos anti-angiogénicos , que destruyen la vascularización de los tumores, dan como resultado un incremento en la capacidad de invasión de las metástasis, ya que sirven como un medio para seleccionar las células tumorales que son resistentes a la hipoxia. De esta manera, se corroboran los datos que se ilustran en la figura 3 y se demuestra que la normalización de los vasos puede ser un abordaje más relevante y potencialmente beneficioso para llevar a cabo la terapia del cáncer, en comparación con la interrupción o la eliminación de la neo-angiogénesis en los tumores.

Se analizó el efecto del cronograma de inyección del ITPP y las drogas sobre el tratamiento de tumores sólidos desarrollados (figura 5B) y de sus metástasis en los pulmones (figura 5A) . Se expusieron ratones que habían sido tratados con ITPP solo hasta el día 14 nuevamente a ITPP solo los días 18 y 19, con el objeto de normalizar los vasos, después de lo cual se llevaron a cabo tratamientos con cisplatino y paclitaxel los días 20 y 21, antes de realizar el análisis el día 25. Los resultados fueron espectaculares, ya que se erradicaron las metástasis en los pulmones, lo que constituye un contraste directo con el tratamiento simultáneo (figura 5A) y permite confirmar la importancia del cronograma de aplicación en determinadas terapias contra el cáncer. En efecto, cuando se analizaron los microvasos en los tumores con una coloración con CD31 (PECAM-1) , que es un marcador con especificidad por el endotelio, después de efectuar el tratamiento con las drogas quimioterapéuticas, se observó una densidad reducida en los microvasos intratumorales en los animales que fueron tratados con ITPP, en comparación con la presencia de numerosos microvasos con una estructura desorganizada, una forma irregular y una coloración prominente con CD31 entre las células endoteliales en los controles (figura 5Ba) . Más aun, en la figura 5B se ilustra que, cuando se prolongó el tratamiento regular con ITPP los días 18 y 19 con el propósito de normalizar los vasos y la tensión de oxígeno, antes de efectuar el tratamiento con las drogas los días 20 y 21, se incrementó notablemente la citotoxicidad, como lo refleja la necrosis que se observó el día 25, donde las áreas necróticas corresponden a áreas difusas positivas para CD31 (figura 5Ba3), que están delimitadas por la coloración con hematoxilina y eosina (figura 5Ba3 y figura 5Bb3) , lo cual se confirmó a través de la reducción en el tamaño de los tumores y la inducción de la necrosis. Esto sirve para fundamentar el efecto notable que presenta el tratamiento con ITPP en combinación con la quimioterapia .

EJEMPLO 15. EL TRATAMIENTO CON ITPP EN COMBINACIÓN CON GEMCITABINA PRESENTA EFECTOS ADITIVOS FUERTES EN MODELOS EN ANIMALES En un modelo de tumores pancreáticos en ratas y un modelo de xenoinjerto de tumores pancreáticos humanos Panc-1 en ratones, el tratamiento con ITPP en combinación con gemcitabina dio como resultado un efecto aditivo f erte. Primero se examinó el efecto del tratamiento con ITPP solo en ambos modelos y se lo comparó con el efecto de la gemcitabina y del placebo (figuras 6 y 8) . Luego se investigó efecto del tratamiento con ITPP en combinación con gemcitabina en ambos modelos y se lo comparó con el efecto del tratamiento con gemcitabina sola o con un placebo.

En el modelo de tumores pancreáticos en rata, las ratas en el grupo que sería sometido al tratamiento combinado recibieron ITPP (1,5 mg/kg) en combinación con gemcitabina (25 mg/kg o 50 mg/kg) cada semana, entre el día 14 y el día 49. Las ratas en el grupo que sería sometido al tratamiento con gemcitabina recibieron gemcitabina (100 mg/kg) sola los días 16, 18 y 20. Las ratas en el grupo control no fueron tratadas. La tasa de supervivencia de los animales evaluados aumentó significativamente en el grupo que fue sometido al tratamiento combinado. El perfil de supervivencia de los animales también presentó una dependencia de la dosis de gemcitabina (figura 7) .

En el modelo de xenoinjerto de tumores, los ratones en el grupo que sería sometido al tratamiento combinado recibieron ITPP (2 mg/kg) en combinación con gemcitabina (25 m9/kg o 50 mg/kg) cada semana, entre el día 14 y el día 49. Los ratones en el grupo que sería sometido al tratamiento con gemcitabina recibieron gemcitabina (100 mg/kg) sola los días 16, 18 y 20. Los ratones en el grupo control no fueron tratados . Se demostró que el tratamiento combinado dio como resultado un incremento en el índice de supervivencia de los animales, en comparación con el tratamiento con gemcitabinai sola. Sin embargo, no se detectó una dependencia de la dosis de gemcitabina (figura 9) .

Se determinó la mediana de la supervivencia de los animales que padecían un adenocarcinoma en los conductos pancreáticos y que fueron tratados con 0XY111A y/o con gemcitabina. Los datos se resumen en la tabla 1 a continuación .

En el modelo de tumores pancreáticos de rata, también se analizó la expresión del HIF-?a, del VEGF, de la caspasa-3 y de la ß-actina después de efectuar el tratamiento con ITPP, con gemcitabina o con el placebo (figura 10) .

EJEMPLO 16. EL TRATAMIENTO CON ITPP INCREMENTA LA INFILTRACIÓN Y LA INVASIÓN DE LOS TUMORES POR LAS CÉLULAS INMUNES En un modelo de tumores B16, se demostró que el tratamiento con OXY111A incrementa significativamente la infiltración de macrófagos CD68 (del tipo M2) en los tumores después de una inyección intraperitoneal de 0XY111A, que se aplicó los días 7, 8, 14, 15, 21, 22, 29 y 30 (figura 11) .

En el mismo modelo, el tratamiento con ITPP también incrementó significativamente la infiltración de las células NK CD49b y la presencia de las células EC CD31 en los tumores de melanoma B16, así como la invasión de las células NK en dichos tumores (figuras 12 y 13) .

Claims

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN Habiendo descrito la presente invención, se considera como novedad, y por lo tanto se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes: REIVINDICACIONES

1. Un método para tratar el cáncer, que comprende administrarle a un sujeto que lo necesita una cantidad eficaz para el uso terapéutico de ITPP; y administrarle al sujeto una cantidad eficaz para el uso terapéutico de un agente quimioterapéutico una vez que ha ocurrido una normalización parcial en la vasculatura del tumor.

2. El método de la reivindicación 1, que también comprende detectar la aparición de una normalización parcial en la vasculatura del tumor.

3. El método de la reivindicación 3, donde la aparición de una normalización parcial en la vasculatura del tumor se detecta midiendo la presión parcial de oxígeno (p02) en el tumor.

4. El método de la reivindicación 1, donde el agente quimioterapéutico se administra en una dosis sub-terapéutica .

5. El método de la reivindicación 4, donde la dosis sub-terapéutica del agente quimioterapéutico es menor que 70% de la dosis nominal aprobada.

6. Una composición farmacéutica que comprende tripirofosf to de inositol (ITPP) y un agente quimioterapéutico que se selecciona entre el paclitaxel y el cisplatino .

7. La composición farmacéutica de la reivindicación 6, donde el agente quimioterapéutico es paclitaxel.

8. La composición farmacéutica de la reivindicación 6, donde el agente quimioterapéutico es cisplatino.

9. Un régimen de tratamiento para tratar el cáncer en un sujeto, que comprende administrar de manera simultánea o consecutiva una cantidad eficaz para el uso terapéutico de ITPP y un agente quimioterapéutico que se selecciona entre el paclitaxel y el cisplatino.

10. El régimen de tratamiento de la reivindicación 9, donde el ITPP y el agente quimioterapéutico se administran de manera simultánea.

11. El régimen de tratamiento de la reivindicación 9, donde el ITPP y el agente quimioterapéutico se administran de manera consecutiva.

12. El régimen de tratamiento de la reivindicación 11, donde el ITPP se administra antes de la administración del agente quimioterapéutico.

13. El régimen de tratamiento de cualquiera de las reivindicaciones 9-12, donde el agente quimioterapéutico es paclitaxel .

14. El régimen de tratamiento de cualquiera de las reivindicaciones 9-12, donde el agente quimioterapéutico es cisplatino .

15. Una composición farmacéutica que comprende tripirofosfato de inositol (ITPP) y una cantidad sub-terapéutica de un agente quimioterapéutico.

16. La composición farmacéutica de la reivindicación 15, donde el agente quimioterapéutico se selecciona entre la aminoglutetimida, la amsacrina, el anastrozol, la asparraginasa, el BCG, la bicalutamida, la bleomicina, la buserelina, el busulfán, la camptotecina, la capecitabina, el carboplatino, la carmustina, el clorambucil, el cisplatino, la cladribina, el clodronato, la colchicina, la ciclofosfamida, la ciproterona, la citarabina, la dacarbazina, la dactinomicina, la daunorrubicina, el dienestrol, el dietilstilbestrol , el docetaxel, la doxorrubicina, la epirrubicina, el estradiol, la estramustina, el etopósido, el exemestano, el filgrastim, la fludarabina, la fludrocortisona, el fluorouracilo , la fluoximesterona, la flutamida, la gemcitabina, la genisteína, la goserelina, la hidroxiurea, la idarrubicina, la ifosfamida, el imatinib, el interferón, el irinotecano, el letrozol, la leucovorina, la leuprolida, el levamisol, la lomustina, la mecloretamina, la medroxiprogesterona, el megestrol, el melfalán, la mercaptopurina, el mesna, el metotrexato, la mitomicina, el mitotano, la mitoxantrona, la nilutamida, el nocodazol, la octreótido, el oxaliplatino, el paclitaxel, el pamidronato, la pentostatina, la plicamicina, el porfímero, la procarbazina, el raltitrexed, el rituximab, la estreptozocina, la suramina, el tamoxifeno, la temozolomida, el tenipósido, la testosterona, la tioguanina, el tiotepa, el dicloruro de titanoceno, el topotecano, el trastuzumab, la tretinoina, la vinblastina, la vincristina, la vindesina y la vinorelbina.

17. La composición farmacéutica de la reivindicación 16, donde el agente quimioterapéutico se selecciona entre el paclitaxel y el cisplatino.

18. La composición farmacéutica de la reivindicación 17, donde el agente quimioterapéutico es paclitaxel.

19. La composición farmacéutica de la reivindicación 17, donde el agente quimioterapéutico es cisplatino.

20. La composición farmacéutica de la reivindicación 15, donde la dosis sub-terapéutica del agente quimioterapéutico es menor que 70% de la dosis nominal aprobada .

21. Un régimen de tratamiento para tratar el cáncer en un sujeto, que comprende administrar de manera simultánea o consecutiva una cantidad eficaz para el uso terapéutico de ITPP y una cantidad sub-terapéutica de un agente quimioterapéutico .

22. El régimen de tratamiento de la reivindicación 21, donde el agente quimioterapéutico se selecciona entre la aminoglutetimida, la amsacrina, el anastrozol, la asparraginasa, el BCG, la bicalutamida, la bleomicina, la buserelina, el busulfán, la camptotecina, la capecitabina, el carboplatino, la carmustina, el clorambucil, el cisplatino, la cladribina, el clodronato, la colchicina, la ciclofosfamida, la ciproterona, la citarabina, la dacarbazina, la dactinomicina, la daunorrubicina, el dienestrol, el dietilstilbestrol, el docetaxel, la doxorrubicina, la epirrubicina, el estradiol, la estramustina, el etopósido, el exemestano, el filgrastim, la fludarabina, la fludrocortisona, el fluorouracilo, la fluoximesterona, la flutamida, la gemcitabina, la genisteína, la goserelina, la hidroxiurea, la idarrubicina, la ifosfamida, el imatinib, el interferón, el irinotecano, el letrozol, la leucovorina, la leuprolida, el levamisol, la lomustina, la mecloretamina, la medroxiprogesterona, el megestrol, el melfalán, la mercaptopurina, el mesna, el metotrexato, la mitomicina, el mitotano, la mitoxantrona, la nilutamida, el nocodazol, la octreótido, el oxaliplatino, el paclitaxel, el pamidronato, la pentostatina, la plicamicina, el porfímero, la procarbazina, el raltitrexed, el rituximab, la estreptozocina, la suramina, el tamoxifeno, lai temozolomida, el tenipósido, la testosterona, la tioguanina, el tiotepa, el dicloruro de titanoceno, el topotecano, el trastuzumab, la tretinoina, la vinblastina, la vincristina, la vindesina y la vinorelbina.

23. El régimen de tratamiento de la reivindicación 22, donde el agente quimioterapéutico se selecciona entre el paclitaxel y el cisplatino.

24. El régimen de tratamiento de la reivindicación 23, donde el agente quimioterapéutico es paclitaxel.

25. El régimen de tratamiento de la reivindicación 23, donde el agente quimioterapéutico es cisplatino.

26. El régimen de tratamiento de la reivindicación 21, donde la dosis sub-terapéutica del agente quimioterapéutico es menor que 70% de la dosis nominal aprobada.

27. Un método para tratar el cáncer en un sujeto, que comprende administrar de manera simultánea o consecutiva una cantidad eficaz para el uso terapéutico de ITPP y una cantidad sub-terapéutica de un agente quimioterapéutico.

28. Un método para tratar un cáncer resistente a las terapias multidroga en un sujeto, que comprende administrar una cantidad eficaz para el uso terapéutico de ITPP.

29. El método de la reivindicación 28, donde el cáncer es resistente al paclitaxel y/o al cisplatino.

30. Un método para tratar una afección hiperproliferativa, que comprende administrarle a un sujeto que lo necesita una cantidad eficaz para el uso terapéutico de ITPP, donde la afección hiperproliferativa no es un cáncer ni se caracteriza por una angiogénesis indeseable.

31. El método de la reivindicación 30, donde la afección hiperproliferativa condición se selecciona entre la nefropatía diabética, la glomeruloesclerosis , la nefropatía caracterizada por la presencia de IgA, la cirrosis, la atresia biliar, la insuficiencia cardiaca congestiva, el escleroderma, la fibrosis inducida por radiación, la fibrosis pulmonar, la psoriasis, las lesiones genitales y las enfermedades caracterizadas por una proliferación celular excesiva .

32. El método de la reivindicación 30, donde el tejido o el órgano que está afectado por la afección hiperproliferativa es hipóxico.

33. El método de la reivindicación 30, que también comprende administrar un agente anti -hiperproliferativo adicional .

34. Un método para potenciar la respuesta inmune en un sujeto, que comprende administrarle a un sujeto que lo necesita una cantidad eficaz para el uso terapéutico de ITPP, donde el sujeto no padece un cáncer o un tumor de otro tipo.

35. El método de la reivindicación 34, donde el sujeto no padece una angiogénesis indeseable.