MX2011012162A - Metodos y composiciones relacionados con fusiones de alk para el diagnostico y tratamiento de cancer. - Google Patents

Abstract

Se divulga métodos y composiciones para detectar la presencia de un cáncer en un sujeto y evaluar la eficacia de los tratamientos por el mismo. El método divulgado utiliza reacción en cadena de polimerasa con transcripción inversa (RT-PCR9 y técnicas múltiplex de reacción en cadena polimerasa, así como también el intercambio de plantillas y Reacción de Extensión (TEER) para detectar la presencia de mutaciones puntuales, truncamientos o funciones de quinasa de linfoma anaplásico.

Description

MÉTODOS Y COMPOSICIONES RELACIONADOS CON FUSIONES DE ALK PARA EL DIAGNÓSTICO Y TRATAMIENTO DE CÁNCER CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona con el campo de la detección o diagnóstico de cáncer.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Se cree que las mutaciones de la quinasa de linfoma anaplásico (ALK) intervienen en el desarrollo de subconjuntos de numerosos cánceres que incluyen i) carcinoma pulmonar de células no pequeñas; ii) linfoma de células B grandes difuso; iii) carcinoma esofágico de células escamosas; iv) linfoma anaplásico de células grandes; v) neuroblastoma (un tipo de cáncer infantil que se origina en el sistema nervioso periférico en desarrollo); y vi) los sarcomas denominados tumores miofibroblásticos inflamatorios (IMT). Los pacientes con muchas de estas malignidades no evolucionan favorablemente, debido en parte a la detección tardía del cáncer, ya que se carece de métodos de diagnóstico clínico eficientes. La detección y el diagnóstico precoz de los cánceres mediados por ALK aumentan drásticamente las tasas de supervivencia entre los pacientes; por ejemplo, la detección precoz del linfoma anaplásico de células grandes ALK-positivo puede derivar en tasas de supervivencia de hasta 83%, mientras que la detección tardía está asociada en algunas instancias con una supervivencia de únicamente 50% de los pacientes. Una tecnología que permita una detección más precoz de estos cánceres facilitaría enormemente el tratamiento médico de los pacientes que los padezcan, contribuyendo en última instancia a mejorar los resultados de los tratamientos. Los datos preclínicos y clínicos precoces indican que únicamente estos cánceres que expresan las mutaciones activadoras de ALK que impulsan su desarrollo y avance exhiben sólidas respuestas antitumorales a los inhibidores de ALK de molécula pequeña.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN Los métodos y composiciones descritos en la presente están relacionados con el campo de la detección o el diagnóstico de la presencia de una enfermedad o afección como el cáncer; evaluación de la susceptibilidad o riesgo de una enfermedad o afección como el cáncer; monitoreo del avance de una enfermedad como el cáncer; y determinación de la susceptibilidad o resistencia al tratamiento terapéutico de una enfermedad como el cáncer, en donde la enfermedad o afección es un cáncer asociado con una variación de ácido nucleico, truncamiento o fusión de genes del gen de ALK. Se entiende y se contempla en la presente que los métodos descritos en la presente permiten una detección rápida y sensible a las mutaciones raras (es decir, variaciones de nucleótidos que son escasas en cantidad), incluyendo las mutaciones que comprenden fusiones de polipéptidos en presencia de ADN normal excedente, así como la detección de truncamientos raros y sobreexpresión aberrante de genes de tipo silvestre.

De acuerdo con los fines de esta invención, según se realizan y describen en más profundidad en la presente, un aspecto de esta invención se relaciona con métodos para detectar la presencia de un cáncer mediante la detección de la variación de un nucleótido dentro de un ácido nucleico de interés que comprende realizar una reacción en cadena de polimerasa con transcripción inversa (RT-PCR) en ARNm extraído a partir de una muestra de tejido de un sujeto con un cáncer; en donde la presencia de un producto de amplificación o un aumento de un producto de amplificación con relación a un testigo indica la presencia de una fusión, variación de nucleótido, truncamiento o expresión excesiva, detectando así la presencia de un cáncer. En particular, un aspecto de esta invención se relaciona con métodos para detectar la presencia de un cáncer al detectar la presencia de una o más fusiones relacionadas con ALK, y/o la expresión regulada hacia arriba de ALK de tipo silvestre, como puede ocurrir en determinados cánceres.

Las ventajas adicionales de los métodos y composiciones descritos se explicarán en parte en la descripción a continuación y en parte se entenderán a partir de dicha descripción, o se podrán aprender mediante la puesta en práctica de los métodos y composiciones divulgados. Las ventajas de los métodos y composiciones divulgados se llevarán a cabo y lograrán mediante los elementos y combinaciones particularmente indicados en las reivindicaciones adjuntas. Debe entenderse que tanto la descripción general precedente como la siguiente descripción detallada son ejemplares y explicativas y no limitan las reivindicaciones de la invención.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS Los dibujos adjuntos, que se incorporan a esta memoria descriptiva y forman parte de la misma, ilustran diversas realizaciones de los métodos y composiciones divulgados y, conjuntamente con la descripción, sirven para explicar los principios de los métodos y composiciones divulgados.

La figura 1 muestra proteínas de fusión de ALK representativas, redisposiciones cromosómicas que las generan, su ocurrencia en linfomas ALK-positivos y sarcomas de tumores miofibroblásticos inflamatorios (IMT) y sus localizaciones subcelulares. Se muestra un listado parcial de las fusiones de ALK oncogénicas más comunes (no se muestran: AL017-ALK, CARS-ALK, MYH9-ALK, SEC31 L1 -ALK, MSN-ALK y TFGXU-ALK). C: cistólico; N: nuclear; CM: membrana celular; NM: membrana nuclear. TPM3: tropomiosina-3; ATIC: 5-aminoimidazol-4-carboxamida ribonucleótido formiltransferasa/IMP ciclohidrolasa; CLTC: cadena pesada de clatrina; TFG: gen fusionado a TRK; TPM4: tropomiosina-4; MSN: moesina; RanBP2: proteína 2 de unión a Ran; EML4: proteína 4 similar a proteína asociada a microtúbulos equinodermos.

La figura 2 muestra cebadores directos e inversos para reacciones de RT-PCR para detectar fusiones de ALK.

La figura 3 muestra la posición aproximada de las sondas y región de rotura de ALK de tipo silvestre y diversas parejas de fusión, incluyendo siete variantes de EML4-ALK, NPM-ALK, MSN-ALK, CLTC-ALK, TPM-ALK y KIF5B-ALK.

La figura 4 muestra la amplificación de RT-PCR de los objetivos de fusión de ALK.

Las figuras 5A y 5B muestran una detección de fusión de ALK y la identificación de un amplicón mediante RT-PCR. La figura 5A muestra que se puede obtener y evaluar una muestra de un sujeto para detectar la presencia de fusiones de ALK (conocidas o previamente no identificadas), ALK de tipo silvestre, dominios de quinasa de ALK, así como testigos de reacción para normalización entre ensayos (COX5B) y testigos de ensayo positivos y negativos. La figura 5B muestra ejemplos de identificación de fusiones o tipos silvestres por tamaño de amplicón.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Antes de divulgar y describir los presentes compuestos, composiciones, artículos, dispositivos y/o métodos, se debe entender que éstos no están limitados a métodos de síntesis específicos o métodos de biotecnología recombinante específicos, a menos que se indique lo contrario, ni a reactivos particulares, a menos que se especifique lo contrario, ya que éstos pueden indudablemente variar. También debe entenderse que la terminología empleada en la presente tiene la finalidad de describir realizaciones particulares únicamente y no se pretende que sea restrictiva.

Como se utiliza en la presente memoria descriptiva y las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "un/a" y "el/la" incluyen referentes plurales a menos que el contexto indique claramente lo contrario. En consecuencia, por ejemplo, la referencia a "portador farmacéutico" incluye mezclas de dos o más de dichos portadores y similares.

Los rangos se pueden expresar en la presente como de "aproximadamente" un valor específico y/o hasta "aproximadamente" otro valor específico. Cuando se expresa dicho rango, otra realización incluye de un valor específico y/o hasta otro valor específico. En forma similar, cuando los valores se expresan como aproximaciones, al usar el antecedente "aproximadamente" se entenderá que el valor específico forma otra realización. Asimismo, se entenderá que los puntos finales de cada uno de los rangos son significativos tanto en relación con el otro punto final como independientemente del otro punto final. Se debe entender además que en la presente se divulgan una serie de valores y que cada valor se divulga también como un "valor aproximado" además del valor en sí mismo. Por ejemplo, si se divulga el valor "10", también se divulga "aproximadamente 10". También se entiende que cuando se divulga un valor que es "menor o igual" a dicho valor, también se divulgan valores que son "mayores o iguales a dicho valor" y posibles rangos entre los valores, según entenderán apropiadamente los expertos en la técnica. Por ejemplo, si se divulga el valor "10", también se divulga el valor "menor o igual a 10" así como "mayor o igual a 10". Se comprenderá además que, a lo largo de esta solicitud, los datos se indican en una variedad de formatos diferentes y que estos datos representan puntos finales y puntos de partida y rangos para cualquier combinación de los puntos de datos. Por ejemplo, si se divulga un punto de datos específico de "10" y un punto de datos específico de "15", se considerarán divulgados puntos de datos "mayores", "mayores o iguales", "menores", "menores o iguales" e "iguales a 10 y 15", así como "entre 10 y 15".

En esta memoria descriptiva y en las reivindicaciones que siguen, se hará referencia a una serie de términos que se definirán con los siguientes significados: "Opcional" u "opcionalmente" significa que la circunstancia o evento descrito posteriormente puede ocurrir o no, de forma tal que la descripción incluye instancias donde la circunstancia o evento ocurre e instancias en las que no.

Un "aumento" puede referirse a cualquier cambio que resulta en una cantidad mayor de una composición o compuesto, tal como un producto de amplificación con relación a un testigo. Por lo tanto, por ejemplo, un aumento en la cantidad de productos de amplificación puede incluir, a modo no taxativo, un aumento de 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o 100%. Asimismo, se contempla en la presente que la detección de un aumento en la expresión o abundancia de ADN, ARNm o una proteína relativa a un testigo necesariamente incluye la detección de la presencia de ADN, ARNm o una proteína en situaciones en las que el ADN, ARNm o la proteína no esté presente en el testigo.

"Obtener una muestra de tejido" significa recoger una muestra de tejido de un sujeto o medir un tejido en un sujeto. Se entiende y contempla en la presente que las muestras de tejido se pueden obtener por medios conocidos en la técnica, que incluyen técnicas invasivas y no invasivas. Se entiende también que los métodos de medición pueden ser directos o indirectos. Los ejemplos de métodos para obtener o medir una muestra de tejido pueden incluir, a modo no taxativo, biopsia de tejidos, lavado de tejido, aspiración, extracción de muestra con hisopo, punción lumbar, resonancia magnética (MRI), tomografía computarizada (CT), tomografía por emisión de positrones (PET) y rayos X (con y sin medios de contraste).

La detección sensible de una mutación en un sitio conocido en el ADN se puede realizar fácilmente con las tecnologías existentes. Los cebadores específicos de alelos se pueden diseñar para dirigirse a una mutación en un lugar conocido, de tal modo que su señal se puede amplificar preferentemente a través de ADN de tipo silvestre. Desafortunadamente, esto no es posible con mutaciones desconocidas que pueden ocurrir en cualquier posición (base) en la secuencia objetivo.

Métodos para detectar un cáncer relacionado con ALK En un aspecto, los métodos divulgados se relacionan con métodos de detección o diagnóstico de la presencia de una enfermedad o afección como el cáncer; evaluación de la susceptibilidad o riesgo de una enfermedad o afección como el cáncer; monitoreo del avance de una enfermedad o afección como el cáncer; y determinación de la susceptibilidad o resistencia al tratamiento terapéutico de una enfermedad o afección como el cáncer en un sujeto que comprende detectar la presencia o medir el nivel de expresión de ARNm a partir de una muestra de tejido del sujeto, en donde un aumento en la cantidad del producto de amplificación con relación a un testigo indica la presencia de un cáncer y en donde el cáncer está asociado con una variación de ácido nucleico, truncamiento o fusión de genes de ALK.

Quinasa de linfoma anaplásico (ALK) El gen ALK codifica un receptor de tirosina quinasa (RTK) denominado ALK (SEQ ID No.: 1 ) (No. de Acceso de Genbank U62540 (secuencia de codificación humana)) y normalmente se expresa principalmente en los sistemas nerviosos central y periférico. El polipéptido ALK de 1620aa comprende un dominio extracelular de 1030aa que incluye una secuencia de péptidos de señal amino-terminal de 26aa y sitios de unión ubicados entre los residuos 391 y 401. Adicionalmente, el polipéptido ALK comprende un dominio de quinasa (residuos 1116-1383) que incluye tres tirosinas responsables de la autofosforilación dentro del bucle de activación en los residuos 1278, 1282 y 1283. Se ha demostrado que las mutaciones de ALK activan constitutivamente la función catalítica de la quinasa de la proteína ALK, mientras que el ALK mutante desregulado activa las proteínas de señalización celular corriente abajo en vías que promueven la proliferación celular aberrante. De hecho, las mutaciones que originan una actividad de la quinasa de ALK desregulada están asociadas con diversos tipos de cáncer.

Las fusiones de ALK representan la mutación más común de esta tirosina quinasa. Estas fusiones incluyen, a modo no taxativo, nucleofosmina-ALK (NPM-ALK), 5-aminoim¡dazol-4-carboxamida ribonucleótido formiltransferasa/IMP ciclohidrolasa (ATIC-ALK), cadena pesada de clatrina-ALK (CLTC-ALK), gen de cadena pesada de quinesina-1-ALK (KIF5B-ALK); proteína 2 de unión a Ran-ALK (RANBP2-ALK), SEC31 L1 -ALK, tropomiosina-3-ALK (TPM3-ALK), tropomiosina-4-ALK (TPM4-ALK), gen fusionado a TRK (grande)-ALK (TFGL-ALK), gen fusionado a TRK (pequeño)-ALK (TFGS-ALK), CARS-ALK, EML4-ALK, 5-aminoimidazol-4-carboxamida ribonucleótido formiltransferasa /IMP ciclohidrolasa-ALK (ATIC-ALK), AL017-ALK, moesina-ALK (MSN-ALK), gen de cadena pesada de miosina no muscular-ALK (MYH9-ALK) y gen fusionado a TRK (extra grande)-ALK (TFGXL-ALK). Se han identificado seis fusiones de ALK, CARS-ALK, CLTC-ALK, RANBP2-ALK, SEC31 L1-ALK, TPM3-ALK y TPM4-ALK en IMT. Se han detectado las fusiones TPM3-ALK, TPM4-ALK y CLTC-ALK en linfomas clásicos de células T o células nulas y sarcomas IMT, mientras que CARS-ALK, RANBP2-ALK y SEC31 L1 -ALK ocurren en IMT. CLTC-ALK y NPM-ALK también aparecen en linfomas plasmablásticos e inmunoblásticos de células B. La fusión TPM4-ALK ocurre en carcinomas esofágicos de células escamosas y las fusiones de ALK, EML4-ALK, TFG-ALK y KIF5B-ALK se detectan en cánceres pulmonares de células no pequeñas. Se ha identificado recientemente EML4-ALK en carcinomas colorrectales y de mama. Por lo tanto, en un aspecto, se divulgan en la presente métodos para detectar la presencia de una fusión relacionada con ALK que comprende detectar la presencia o medir la cantidad de ácido nucleico asociado con una fusión de ALK a partir de una muestra de tejido de un sujeto, en donde la presencia de un ácido nucleico o un aumento en un ácido nucleico con relación a un testigo indica la presencia de una fusión de ALK.

Las fusiones de ALK están asociadas con diversos tipos de cáncer conocidos. Se entiende que una o más fusiones de ALK pueden estar asociadas con un cáncer específico. Asimismo, se entiende que hay diversos tipos de cáncer asociados con las fusiones de ALK que incluyen, a modo no taxativo, linfoma anaplásico de células grandes (ALCL), neuroblastoma, cáncer de mama, cáncer de ovario, carcinoma colorrectal, carcinoma pulmonar de células no pequeñas, linfoma de células B grandes difuso, carcinoma esofágico de células escamosas, linfoma anaplásico de células grandes, neuroblastoma, tumores miofibroblásticos inflamatorios, histiocitosis maligna y glioblastomas.

ALCL. Los linfomas anaplásicos de células grandes comprenden -2,5% de todos los linfomas no hodgkinianos; dentro de los grupos etarios pediátricos específicamente, -13% de todos los linfomas no hodgkinianos (30 - 40% de todos los linfomas infantiles de células grandes) son de este tipo. Los estudios de pacientes con ALCL ahora dividen los linfomas no hodgkinianos en subconjuntos ALK-positivo y ALK-negativo; ~60% de todos los ALCL son provocados por fusiones de ALK. Por razones que aún no se han aclarado los pacientes con ALCL ALK-positivo evolucionan significativamente mejor después de una quimioterapia convencional multiagente con CHOP que aquellos que padecen la enfermedad ALK-negativa (con tasas de supervivencia generales de 5 años de ~75% en comparación con ~35%, respectivamente). Sin embargo, más de un tercio de los pacientes padecen múltiples recaídas tras la quimioterapia, por lo que la supervivencia libre de la enfermedad durante 5 años de ALCL ALK-positivo es apenas ~40%.

ALK+ Linfoma de células B grandes difuso. En 2003, se demostró que las fusiones de ALK ocurrían en una forma de linfoma no hodgkiniano que no era ALCL con la descripción de CLTC-ALK o NPM-ALK en linfomas de células B grandes difuso (ALK+ DLBCL). De acuerdo con su linaje B, estos linfomas no hodgkinianos expresan marcadores de células citoplasmáticas IgA y marcadores de células plasmáticas y poseen morfología inmunoblástica. Los estudios de investigación translacionales revelaron el ARNm de t(2; 7) y CLTC-ALK en la mayoría de estos linfomas, mientras que el inmunoetiquetado confirmó tinción ALK granular idéntica a la observada en ALCL CLTC-ALK-positivo. Con respecto a todas las demás proteínas de parejas de fusión de ALK, un motivo de auto-asociación en la porción CLTC de CLTC-ALK media la auto-asociación y activación constitutivas de la quinasa de fusión para impulsar la linfomagénesis. ALK+ DLBCL ocurren predominantemente en adultos; sin embargo, el ARNm de t(2;5) y NPM-ALK en linfomas pediátricos son idénticos fenotípicamente a linfomas no hodgkinianos B CLTC-ALK-positivo en adultos. Se cree que aproximadamente 0,5-1 % de todos los DLBCL son ALK-positivos. La identificación de DLBCL causados por ALK mutante es importante porque los pacientes con estos linfomas tienen resultados mucho más inferiores que los pacientes con DLBCL ALK-negativo luego de tratamientos con CHOP; por lo tanto, los pacientes con ALK+ DLBCL se deberían considerar indudablemente como candidatos para la terapia con inhibidor de quinasa dirigido a ALK.

ALK+ histiocitosis sistémica. Las fusiones de ALK se describieron en 2008 en otro neoplasma hematopoyético: la histiocitosis sistémica. Tres casos de esta forma de histiocitosis no caracterizada previamente, que se presenta en la primera infancia, exhibieron inmunorreactividad a ALK y un caso analizado molecularmente expresó TPM3-ALK.

Además de las malignidades hematológicas mencionadas anteriormente, en las cuales se ha demostrado que las fusiones de ALK constitutivamente activadas son el mecanismo causante en muchos casos, recientemente se ha demostrado que la génesis de subconjuntos de diversos tumores sólidos en algunas instancias, tumores humanos muy comunes como cáncer pulmonar de células no pequeñas, cáncer colorrectal y de mama, se debe a ALK activada de forma aberrante.

Tumor miofibroblástico inflamatorio. El primer tumor no hematopoyético que se descubrió que expresaba fusiones de ALK fue el sarcoma denominado tumor miofibroblástico inflamatorio (IMT), una proliferación de células fusiformes en el tejido blando y visceras de niños y adultos jóvenes (edad promedio en el diagnóstico ~10 años). Muchos IMT son indolentes y se pueden curar por resección. No obstante, los IMT recurrentes localmente, invasivos y metastásicos no son poco comunes y las actuales quimioterapias y radioterapias son completamente ineficaces. En la presente invención se divulga la intervención del cromosoma 2p23 (la ubicación del gen ALK) en los IMT, así como la reorganización del gen ALK. Se ha demostrado la inmunorreactividad de ALK en 7 de 11 IMT y se identificaron TPM3-ALK y TPM4-ALK en varios casos. Asimismo, se detectaron dos fusiones de ALK adicionales ALK en IMT, CLTC- y RanBP2-ALK. También se han examinado las fusiones de ALK mediante inmunotinción en 73 IMT, detectando que el 60% (44 de los 73 casos) era ALK-positivo. Por lo tanto, la desregulación de ALK tiene importancia patogénica en una mayoría de IMT.

Carcinoma pulmonar de células no pequeñas. El rol de las fusiones de ALK se amplió más con la descripción de la nueva proteína quimérica EML4-ALK en 5 de 75 (6,7%) pacientes japoneses con carcinoma pulmonar de células no pequeñas. Poco después, un grupo diferente corroboró la existencia de las fusiones de ALK en cáncer pulmonar, que descubrió que 6 de 137 (4,4%) pacientes chinos con cáncer pulmonar expresaron fusiones de ALK (EML4-ALK, 3 pts; TFG-ALK, 1 pt; X-ALK. Han surgido dos temas comunes: 1 ) las fusiones de ALK ocurren predominantemente en pacientes con adenocarcinoma (si bien se observan NSCLC ALK-positivos ocasionales de histologías escamosas o mixtas), en su mayoría en individuos con ningún antecedente de tabaquismo o antecedentes mínimos y 2) las anormalidades de ALK generalmente ocurren independientemente de otras anormalidades genéticas comunes (por ejemplo, mutaciones de EGFR y KRAS). El porcentaje exacto de NSCLC provocados por fusiones de ALK todavía no está claro, pero las estimaciones basadas en la bibliografía médica sugieren un rango de -5-10%.

Carcinoma esofágico de células escamosas. En 45 pacientes iraníes, un abordaje proteómico identificó proteínas infra o sobre representadas en carcinomas esofágicos de células escamosas (ESCC); la TPM4-ALK estuvo entre esas proteínas sobrerrepresentadas. Un segundo estudio ESCC basado en proteómica -en este caso, en pacientes chinos- también identificó TPM4-ALK en estos tumores.

Carcinoma colorrectal, cáncer de mama. Se inspeccionaron tres tipos de tumor humanos -cáncer colorrectal, de mama y pulmonar de células no pequeñas, para la presencia de la fusión EML4-ALK (no se evaluaron otras mutaciones de ALK en este estudio). Además de confirmar la expresión de EML4-ALK en NSCLC (en 12 de 106 especímenes estudiados, 1 1 ,3%), un subconjunto de carcinomas de mama (5 de 209 casos, 2,4%) y colorrectal (2 de 83 casos, 2,4%) fueron EML4-ALK-positivos. Además de las variantes conocidas de EML4-ALK 1 (E13; A20) y 2 (E20; A20), se encontró una nueva variante (E21 ; A20) en el carcinoma colorrectal.

ALK en neuroblasioma familiar y esporádico. El neuroblastoma es el tumor sólido extracraneal más común de la niñez y deriva de la cresta neural en desarrollo. Un pequeño subconjunto (~1 -2%) de neuroblastomas exhibe una predisposición familiar con una herencia dominante autosómica. La mayoría de los pacientes con neuroblastoma tiene una enfermedad agresiva asociada con las probabilidades de supervivencia <40% a pesar de la quimioterapia y radioterapia intensivas y la enfermedad representa -15% de toda la mortalidad por cáncer en la niñez. Se había encontrado previamente que la ALK era constitutivamente activada también debido a la sobreexpresión de alto nivel como resultado de la amplificación génica en un pequeño número de líneas celulares de neuroblastoma, de hecho, la amplificación de ALK ocurre en -15% de los neuroblastomas además de las mutaciones puntuales activadoras. Estas mutaciones de sentido erróneo en ALK se confirmaron como mutaciones activadoras que impulsan el crecimiento del neuroblastoma; más aun, la incubación de las líneas celulares de neuroblastoma con los inhibidores de molécula pequeña de ALK revelan esas células con activación de ALK (pero no líneas celulares con niveles normales de expresión de ALK de tipo silvestre) para exhibir fuertes respuestas citotóxicas.

Estudios recientes demuestran que la inhibición de estas formas mutantes de ALK con fármacos de molécula pequeña candidatos suprime esta proliferación celular anormal y promueve la apoptosis en neuroblastoma y otras líneas celulares de tumor impulsadas por ALK. Estos descubrimientos destacan la necesidad de una prueba de diagnóstico especializada para las mutaciones de ALK - una prueba que tendría múltiples aplicaciones clínicas. Por ejemplo, dicho ensayo podría usarse para someter a prueba a los niños de familias afectados con neuroblastoma hereditario para ayudar a facilitar la detección de tumores en una etapa precoz que es cuando están más apropiados para el tratamiento. La detección y el diagnóstico precoces de cánceres mediados por ALK aumentan drásticamente las tasas de supervivencia dentro de la población de pacientes. Por lo tanto, en un aspecto divulgado en la presente se encuentran métodos de detección o diagnóstico de la presencia de una enfermedad o afección tal como cáncer, por ejemplo un cáncer relacionado con una quinasa de linfoma anaplásico (ALK) que comprende la detección de la presencia o la medición del nivel de ADN, ADNc o el nivel de expresión de ARNm asociado con una variación de ácido nucleico, truncamiento o fusiones de ALK a partir de una muestra de tejido del sujeto; en donde un aumento en la cantidad del producto de amplificación con relación a un testigo indica la presencia de un cáncer relacionado con ALK. También se divulgan métodos para evaluar la susceptibilidad o el riesgo de una enfermedad o afección, monitorear el avance de la enfermedad, o determinar la susceptibilidad o resistencia al tratamiento terapéutico para un cáncer asociado con una variación de ácido nucleico, truncamiento o fusión de ALK en un sujeto que comprende detectar la presencia o medir el nivel de ADN, ADNc, o el nivel de expresión de un ARNm a partir de una muestra de tejido del sujeto; en donde un aumento en la cantidad del producto de amplificación con relación a un testigo indica la presencia de un cáncer relacionado con ALK.

Por lo tanto, en un aspecto, la detección de las secuencias de fusión de ALK indica la presencia de un cáncer. Por lo tanto, en la presente se divulgan métodos para diagnosticar un cáncer relacionado con la quinasa de linfoma anaplásico (ALK) en un sujeto que comprende detectar la presencia o medir el nivel de expresión de ARNm a partir de una muestra de tejido del sujeto; en donde el ARNm es específico para una fusión de ALK; y en donde un aumento en la cantidad de ARNm con relación a un testigo indica la presencia de un cáncer relacionado con ALK.

Los cánceres relacionados con la fusión de ALK pueden tratarse con inhibidores de quinasa de ALK. Sin embargo, también se han descubierto cánceres resistentes al inhibidor de quinasa de ALK. Estos cánceres son fusiones de ALK que comprenden además mutaciones puntuales de ALK en cánceres familiares y esporádicos (por ejemplo, neuroblastoma, cáncer de mama, cáncer de ovario, carcinoma colorrectal, carcinoma pulmonar de células no pequeñas, linfoma de células B grandes difuso, carcinoma esofágico de células escamosas, linfoma anaplásico de células grandes, neuroblastoma, tumores miofibroblásticos inflamatorios, histiocitosis maligna y glioblastomas). Las mutaciones en ALK resultan en activación constitutiva de ALK. Por consiguiente los cánceres asociados con ALK están impulsados por estas mutaciones puntuales activadoras. Las mutaciones en el dominio catalítico de tirosina quinasa M1 166R, A1168P, I 1171 , F1174I, F1 174L, R1 192P, F1245C, F1245V, F1245L, F1245I, I1250T y R1275Q y en el dominio extracelular en V476A se asocian con neuroblastoma. Las mutaciones en R401Q, A1 168P y V757M se identificaron en carcinomas colorrectales. Adicionalmente, se identificaron mutaciones en L560F en cáncer de mama y en A877S en cáncer de ovario. Por lo tanto, en un aspecto, la detección de la presencia de un cáncer se logra a través de la detección de mutaciones puntuales en la secuencia de ALK (es decir, detectando la mutación puntual, se identifica un cáncer relacionado con ALK). Por lo tanto, se divulgan en la presente métodos para detectar la presencia de un cáncer relacionado con ALK, en donde el cáncer comprende, además, una o más mutaciones puntuales en la regulación hacia arriba de ALK o ALK de tipo silvestre.

Las fusiones de ALK divulgadas también pueden causar la desregulación de ALK de tipo silvestre. La ALK de tipo silvestre desregulada puede resultar en un aumento de la ALK de tipo silvestre producida, así como también de la desregulación de la actividad catalítica de la quinasa. Alternativamente, un cáncer puede tener una patología molecular primaria a partir de otro receptor tirosina quinasa (RTK) tal como cMET o IGFR, pero desarrollar resistencia a los inhibidores a través de activación de vía paralela de vías de señalización a través de ALK. Por lo tanto, otro medio para detectar la presencia de un cáncer es a través de la detección de un aumento en la expresión de ALK de tipo silvestre. Adicionalmente, los genes de ALK de tipo silvestre truncados que no tienen las regiones reguladoras pueden resultar en una función catalítica de la quinasa de ALK constitutiva. Por lo tanto, se divulgan en la presente métodos para diagnosticar la presencia de un cáncer que comprende detectar la presencia o el aumento relativo en la expresión de ARNm en relación con una secuencia de ALK truncada.

Se entiende y se contempla en la presente que la causa de un cáncer relacionado con ALK puede no solo deberse a la desregulación de ALK de tipo silvestre o fusiones conocidas de ALK, sino una o más fusiones de ALK sin identificar. Los métodos que solamente son capaces de detectar fusiones conocidas serían incapaces de detectar fusiones previamente desconocidas o mutaciones de ALK. Detectando no solamente la presencia de un truncamiento, variación de ácido nucleico de ALK o una fusión de ALK, sino también detectando la presencia de ALK de tipo silvestre y la actividad de quinasa de ALK, el experto en la técnica podrá determinar si el cáncer se debe a una ALK de tipo silvestre desregulada, una fusión de ALK conocida o una fusión de ALK o mutación de ALK previamente no identificadas. Por consiguiente, se divulgan en la presente métodos para diagnosticar un cáncer, evaluar la susceptibilidad o riesgo de cáncer, o detectar la presencia de la desregulación de ALK que comprende, además, detectar le presencia de ALK de tipo silvestre y métodos que comprenden además detectar la presencia de la actividad de quinasa de ALK. Por lo tanto, por ejemplo, se divulgan en la presente métodos para diagnosticar un cáncer relacionado con ALK que comprende detectar la presencia de ácido nucleico asociado con una fusión de ALK, ALK de tipo silvestre y/o un dominio de quinasa de ALK a partir de una muestra de tejido en un sujeto.

Detección y cuantificación de ARNm Los métodos divulgados en la presente se refieren a la detección de la variación de ácido nucleico en la forma de, por ejemplo, mutaciones puntuales y truncamientos, o la detección de la expresión de fusiones de ALK, expresión de ALK de tipo silvestre aberrante, o expresión de mutantes de truncamiento de ALK. Para estas últimas detecciones de nivel de expresión, los métodos comprenden detectar la abundancia o la presencia de ARNm, o ambas. Por lo tanto, se divulgan en la presente métodos y composiciones para diagnosticar un cáncer relacionado con la quinasa de linfoma anaplásico (ALK) en un sujeto, que comprenden medir la presencia o nivel de ARNm a partir de una muestra de tejido del sujeto; en donde un aumento en la cantidad de ARNm con relación a un testigo indica la presencia de un cáncer relacionado con ALK.

Existen una cantidad de procedimientos ampliamente utilizados para detectar y determinar la abundancia de un ARNm específico en una muestra de ARN total o poli(A). Por ejemplo, se pueden detectar ARNm específicos utilizando análisis Northern blot, ensayos de protección de nucleasa (NPA), hibridación in situ o reacción en cadena de polimerasa con transcripción inversa (RT-PCR) y micromatriz.

En teoría, cada una de estas técnicas puede utilizarse para detectar ARN específicos y para determinar precisamente su nivel de expresión. En general, el análisis Northern es el único método que proporciona información acerca del tamaño de transcripción, mientras que los NPA son la manera más fácil de examinar simultáneamente mensajes múltiples. La hibridación in situ se utiliza para localizar la expresión de un gen específico dentro de un tipo de tejido o de células y la RT-PCR es el método más sensible para detectar y cuantificar la expresión génica.

La RT-PCR permite la detección de un transcrito de ARN de cualquier gen, independientemente de la escasez del material de partida o la abundancia relativa del ARNm específico. En una RT-PCR, se copia una plantilla de ARN en un ADN complementario (ADNc) utilizando una transcriptasa inversa retroviral. El ADNc luego se amplifica exponencialmente mediante PCR utilizando una polimerasa de ADN. La transcripción inversa y las reacciones de la PCR pueden ocurrir en los mismos o en diferentes tubos. La RT-PCR es un tanto tolerante al ARN degradado. Mientras que el ARN esté intacto dentro de la región comprendida por los cebadores, el objetivo se amplificará.

La RT-PCR cuantitativa relativa implica amplificar un testigo interno simultáneamente con el gen de interés. El testigo interno se utiliza para normalizar las muestras. Una vez normalizadas, las comparaciones directas de abundancia relativa de un ARNm específico pueden realizarse a través de las muestras. Es crucial que se elija un testigo interno con un nivel constante de expresión a través de todas las muestras experimentales (es decir, no afectadas por tratamiento experimental). Los testigos internos comúnmente utilizados (por ejemplo, GAPDH, ß-actina, ciclofilina) varían con frecuencia en expresión y, por lo tanto, pueden no ser testigos internos apropiados. Adicionalmente, los testigos internos más comunes se expresan a niveles mucho más altos que el ARNm que se estudia. Para que los resultados RT-PCR sean significativos, todos los productos de la reacción de PCR deben analizarse en el rango lineal de amplificación. Esto se vuelve difícil para los transcritos de niveles de abundancia ampliamente diferentes.

Se utiliza una RT-PCR competitiva para la cuantificación absoluta. Esta técnica implica diseñar, sintetizar, cuantificar de forma precisa un ARN competidor que puede distinguirse del objetivo endógeno por una pequeña diferencia en tamaño o secuencia. Las cantidades conocidas del ARN competidor se agregan a las muestras experimentales y se realiza una RT-PCR. Las señales del objetivo endógeno se comparan con las señales del competidor para determinar la cantidad de objetivo presente en la muestra.

Por lo tanto, en la presente se divulgan en un aspecto métodos para diagnosticar un cáncer relacionado con la quinasa de linfoma anaplásico (ALK) en un sujeto que comprenden llevar a cabo una reacción de RT-PCR en ARNm a partir de una muestra de tejido del sujeto; en donde la reacción en cadena de polimerasa con transcripción inversa (RT-PCR) comprende un cebador inverso capaz de hibridarse específicamente con una o más secuencias de ALK y al menos un cebador directo; y en donde un aumento en la cantidad del producto de amplificación con relación a un testigo indica la presencia de un cáncer relacionado con ALK. Como los métodos divulgados pueden utilizarse para detectar ALK de tipo silvestre, fusiones de ALK y actividad de dominio de quinasa de ALK, también se divulgan en la presente métodos para diagnosticar un cáncer relacionado con la quinasa de linfoma anaplásico (ALK) o detectar la desregulación de una quinasa de ALK en un sujeto que comprende llevar a cabo una primera reacción de RT-PCR en ARNm a partir de una muestra de tejido del sujeto; en donde la reacción en cadena de polimerasa con transcripción inversa (RT-PCR) comprende un cebador inverso capaz de hibridarse específicamente con una o más secuencias de ALK y al menos un cebador directo en donde el cebador directo se híbrida específicamente con una pareja de fusión de ALK; una segunda reacción de RT-PCR en ARNm a partir de una muestra de tejido del sujeto; en donde la reacción en cadena de polimerasa con transcripción inversa (RT-PCR) comprende un cebador directo e inverso capaces de hibridarse específicamente con una o más secuencias de ALK; una tercera reacción de RT-PCR en ARNm a partir de una muestra de tejido del sujeto; en donde la reacción en cadena de polimerasa con transcripción inversa (RT-PCR) comprende un cebador directo e inverso capaces de hibridarse específicamente con una o más secuencias de dominio de quinasa de ALK; y donde la presencia de un amplicón o el aumento en la cantidad del producto de amplificación con relación a un testigo indica la presencia de un cáncer relacionado con ALK y la presencia de la desregulación de la quinasa de ALK. Específicamente, la presencia de un amplicón de fusión de ALK y un amplicón de dominio de quinasa indica la presencia de una fusión de ALK conocida; la presencia de un amplicón de tipo silvestre y un amplicón de dominio de quinasa indica el ALK de tipo silvestre y la presencia del amplicón de dominio de quinasa solo indica la presencia de una fusión de ALK o de ALK mutada previamente no identificadas.

El análisis Northern es el método más fácil para determinar el tamaño de la transcripción y para identificar alternativamente los transcritos empalmados y los miembros de familia multigénicos. También puede utilizarse para comparar directamente la abundancia relativa de un mensaje dado entre todas las muestras en un blot. El procedimiento de Northern blot es directo y proporciona oportunidades para evaluar el progreso en varios puntos (por ejemplo, la integridad de la muestra de ARN y cuán eficientemente se ha transferido a la membrana). Las muestras de ARN primero se separan por tamaño a través de electroforesis en gel de agarosa bajo condiciones de desnaturalización. El ARN luego se transfiere a una membrana, se lo retícula y se lo híbrida con una sonda etiquetada. Pueden utilizarse sondas radioetiquetadas no isotópicas o de alta actividad específica, incluyendo sondas cebadas aleatoriamente, traducidas por mella o sondas de ADN generadas por PCR, sondas ARN transcritas ¡n vitro y oligonucleótidos. Adicionalmente, las secuencias que tienen solo homología parcial (por ejemplo, ADNc a partir de una especie diferente o fragmentos de ADN genómicos que pueden contener un exón) pueden utilizarse como sondas.

El ensayo de protección de nucleasa (NPA, que incluye tanto los ensayos de protección de ribonucleasa como los ensayos de nucleasa S1 ) es un método sensible para la detección y cuantificación de los ARNm específicos. La base del NPA es la hibridación de solución de una sonda antisentido (radioetiquetada o no isotópica) con una muestra de ARN. Luego de la hibridación, la sonda de hebra simple sin hibridar y el ARN son degradados por las nucleasas. Los fragmentos protegidos que permanecen se separan en un gel de acrilamida. La hibridación de solución es típicamente más eficiente que la hibridación basada en membrana y puede alojar hasta 100 pg de ARN de muestra en comparación con los 20-30 µg máximos de las hibridaciones blot. Los NPA son también menos sensibles a la degradación de muestra de ARN que el análisis Northern puesto que la escisión solo se detecta en la región de superposición con la sonda (las sondas tienen con frecuencia aproximadamente 100-400 bases de largo).

Los NPA son el método de preferencia para la detección simultánea de varias especies de ARN. Durante la hibridación de la solución y el análisis posterior, las interacciones de objetivo/sonda individuales son completamente independientes entre sí. Por lo tanto, varios objetivos de ARN y testigos apropiados pueden ensayarse simultáneamente (se han usado hasta doce en la misma reacción), siempre que las sondas individuales sean de diferentes longitudes. Los NPA también se usan comúnmente para mapear precisamente los terminales de ARNm y las uniones de intrones/exones.

La hibridación in situ (ISH) es una herramienta poderosa y versátil para localizar los ARNm específicos en células o tejidos. A diferencia del análisis Northern y los ensayos de protección de nucleasas, la ISH no requiere el aislamiento o la separación electroforética del ARN. La hibridación de la sonda ocurre dentro de la célula o tejido. Puesto que la estructura celular se mantiene a través del procedimiento, la ISH proporciona información acerca de la ubicación del ARNm dentro de la muestra de tejido.

El procedimiento comienza fijando las muestras en formalina tamponada neutra y embebiendo el tejido en parafina. Las muestras luego se rebanan en secciones finas y se montan en portaobjetos de microscopio. (Alternativamente, el tejido puede seccionarse estando helado y fijarse luego en paraformaldehido). Luego de una serie de lavados para desencerar y rehidratar las secciones, se realiza una digestión de proteinasa K para aumentar la accesibilidad de la sonda y luego se híbrida una sonda etiquetada con las secciones de muestra. Las sondas radioetiquetadas se visualizan con película líquida secada en los portaobjetos, mientras que las sondas etiquetadas no isotópicamente se detectan convenientemente con reactivos colorimétricos o fluorescentes.

Debido a las limitaciones de la tecnología de secuenciación, especialmente sensibilidad, se han desarrollado a través de los años numerosas tecnologías de escaneo para mutaciones desconocidas: cromatografía líquida de alto rendimiento de desnaturalización (dHPLC) Xiao y Oefner, 2001 , escaneo de secuencia de escisión de base (BESS), polimorfismo de conformación de hebra única (SSCP) (Orita et.al., 1989), análisis heterodúplex (HA) (Nagamine et.al. 1989), electroforesis en gel sensible a la conformación (CSGE) (Ganguly y Prockop, 1995; Ganguly et. al. 1993), electroforesis en gel de gradiente de desnaturalización (DGGE) (Fodde y Losekoot, 1994), electroforesis en gel de desnaturalización constante (CDGE) (Hovig et al. 1991 ), electroforesis en gel de gradiente de temperatura temporal (TTGE) (Chen et.al. 1999), escisión química de desajustes (Cotton et al 1988; Tabón et al. 2006), escisión enzimática de desajustes (Winter et al., 1985; Myers et al. 1985) y enzimas de reparación de desajustes (Oldenburg y Siebert, 2000; Babón et. al. 1999; Youil et. al. 1996; Bro et. al. 1996; Lu y Hsu, 1992). Estas tecnologías no han tenido un uso extenso ya que tienen una o más de las siguientes limitaciones; son trabajosas, difíciles de automatizar (bajo rendimiento), baja sensibilidad o dificultad para reproducir. La mayoría de los ensayos de mutación puntuales se enfocan en la detección de las mutaciones puntuales conocidas dentro de los sitios de genes objetivo. Sin embargo, para los genes como ALK, las mutaciones puntuales espontáneas surgen a través de grandes regiones de ADN que requieren una tecnología que pueda escanear muchos cientos de pares de base. Se han desarrollado muchas tecnologías de mutación puntual desconocida pero la mayoría o todas tienen limitaciones que excluyen su utilización en la detección de mutaciones genéticas raras.

Por el contrario, el Intercambio de Plantillas y Reacción de Extensión (TEER™) utiliza en sus últimas etapas una amplificación selectiva para aumentar la sensibilidad de la detección de mutaciones raras y desconocidas. Esta ventaja se traduce en una capacidad para detectar enfermedades en forma precoz, así como la capacidad para monitorear la acumulación de cambios mutacionales adicionales en cánceres mientras continúan avanzando y mutando. Además, TEER™ es adaptable a las múltiples plataformas que incluyen PCR en tiempo real, análisis de fragmentos y electroforesis. Por ejemplo, TEER™ que comienza a partir de una adquisición de la muestra hasta la detección de punto final de mutaciones raras puntuales activadoras de ALK a partir de un espécimen de muestra clínica mixta que contiene una abundancia de ADN normal a partir de células no tumorales contaminantes. El proceso entero puede completarse en aproximadamente 5,5 horas.

La plataforma TEER™ consiste en 5 etapas básicas. 1. Un oligonucleótido de alelo específico que contiene una etiqueta de fluoresceína fluorescente de secuenciación (FAM) y una etiqueta de biotina para la purificación de captura de fase sólida se utiliza para la amplificación de una plantilla inicial ALK de 270 pb que contiene mutaciones raras o novedosas. 2. El amplicón se desnaturaliza con calor y luego se lo deja hibridar junto con la plantilla de ALK de tipo silvestre desnaturalizada, que permite que ocurra el Intercambio de Plantilla. 3. Cualquier nucleótido desajustado luego se escinde enzimáticamente utilizando la nucleasa de hebra única, CEL 1. 4. La hebra de ADN que contiene la base desajustada escindida se extiende con Taq polimerasa. 5. Los cebadores de RT-PCR específicos luego se utilizan para detectar solamente la región 5' de la plantilla extendida. La combinación de la amplificación TEER™ y la cuantificación permite un alto rendimiento y una detección sensible. Cualquier mutación posible (o ausente) se amplifica y cuantifica utilizando un sitio de cebador inverso único presente solamente en la plantilla purificada TEER™ extendida. El fondo derivado de plantillas de tipo silvestre contaminantes se mantiene a un mínimo con la utilización de una secuencia de oligocaptura biotinilada en el cebador directo inicial y la utilización de Exo III para digerir cualquier dúplex de hebra doble que contenga extremos 3' o 5' complementarios (Patente de Estados Unidos No. 6.150.105, que se incorpora a la presente en su totalidad por sus descripciones del intercambio de plantillas y reacción de extensión).

El proceso TEER™ fue originalmente desarrollado para abordar una necesidad en el campo oncológico para una herramienta de alto rendimiento para detectar polimorfismos genéticos no descubiertos en plantillas a partir de células y tejidos malignos. Originalmente se demostró el TEER™ utilizando electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE). TEER™ está diseñado para detectar la variación genética en plantillas de ADN que pueden contener mutaciones raras, conocidas o nuevas en comparación con una plantilla de ADN no mutada testigo. En base al hecho de que los productos de secuenciación son únicos para la plantilla a partir de la cual se generan, se utilizó TEER™ para comparar una plantilla de ADN "desconocida" que contenía potencialmente mutaciones con una plantilla que se confirmó que no tenía mutaciones. Cualquier cambio en los productos de secuenciación reflejó una mutación genética en la plantilla de ADN desconocida y pudo visualizarse mediante electroforesis en gel. Más recientemente, el proceso TEER™ se adaptó a la plataforma de detección de microtitulación de fase sólida para permitir un análisis de alto rendimiento y mejorar la facilidad de utilización. Las plantillas de ADN testigo y "desconocidas" se amplificaron utilizando un cebador biotinilado 5' para generar productos PCR biotinilados. Luego se formó un ADN homodúplex y heterodúplex mediante la hibridación de los amplicones de PCR a partir de las plantillas de ADN testigo y "desconocidas". Luego de la hibridación, el ADN homodúplex y heterodúplex se unió a la fase sólida a través de la conjugación a pocilios de microplaca recubiertos con estreptavidina en los cuales se pudieron realizar fácilmente todas las etapas del proceso TEER™, simplificando de gran modo el manejo y el procesamiento de las muestras. El proceso TEER™ es un ensayo modificado de hibridación de oligonucleótidos de alelo específico y puede formar un complejo con una plataforma PCR en tiempo real para un alto rendimiento y alta sensibilidad.

Detección y cuantificación de ADN Los métodos divulgados en la presente se refieren a la detección de la variación de ácido nucleico en la forma de, por ejemplo, mutaciones puntuales y truncamientos, o la detección de la expresión de fusiones de ALK, expresión de ALK de tipo silvestre aberrante, o expresión de mutantes de truncamiento de ALK. Para estas últimas detecciones de nivel de expresión, los métodos comprenden detectar la abundancia o la presencia de ARNm, o ambas. Alternativamente, la detección puede dirigirse a la abundancia o presencia de ADN, por ejemplo, ADNc. Por lo tanto, se divulgan en la presente métodos y composiciones para diagnosticar un cáncer relacionado con la quinasa de linfoma anaplásico (ALK) en un sujeto que comprende medir la presencia o nivel de ADN a partir de una muestra de tejido de un sujeto; en donde un aumento en la cantidad de ADN con relación a un testigo indica la presencia de un cáncer relacionado con ALK.

Existe una cantidad de procedimientos ampliamente utilizados para detectar y determinar la abundancia de un ADN particular en una muestra. Por ejemplo, la tecnología de PCR permite la amplificación y posterior detección de cantidades minúsculas de un ácido nucleico objetivo. Los detalles de PCR se describen bien en la técnica, incluyendo, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos Nos. 4.683.195 de Mullís et al., 4.683.202 de Mullís y 4.965.188 de Mullís et al. Generalmente, los cebadores de oligonucleótidos se aparean con las hebras desnaturalizadas de ácido nucleico objetivo y los productos de extensión de cebador se forman mediante la polimerización de desoxinucleósidos trifosfatos mediante una polimerasa. Un método de PCR típico implica ciclos repetitivos de desnaturalización de ácido nucleico de plantilla, apareamiento de cebador y extensión de los cebadores apareados mediante la acción de una polimerasa termoestable. El proceso resulta en una amplificación exponencial del ácido nucleico objetivo y, por lo tanto, permite la detección de objetivos que existen en concentraciones muy bajas en una muestra. Se entiende y se contempla en la presente que existen vanantes de métodos de PCR conocidos en la técnica y que pueden también utilizarse en los métodos divulgados, por ejemplo, PCR cuantitativa (QPCR); micromatrices, PCT en tiempo real; PCR de inicio en caliente; PCR anidado; PCR específica de alelo; y PCR "touchdown".

Micromatrices Una matriz es una disposición ordenada de muestras, que proporcionan un medio para ajustar las muestras conocidas y desconocidas de ADN en base a reglas de apareamiento de base y para automatizar el proceso de identificación de los desconocidos. Un experimento de matriz puede utilizar sistemas de ensayo comunes tales como microplacas o membranas de transferencia convencionales y pueden crearse a mano o utilizando la robótica para depositar la muestra. En general, las matrices se describen como macromatrices o micromatrices, la diferencia es el tamaño de los puntos de muestra. Las macromatrices contienen tamaños de punto de muestra de aproximadamente 300 micrones o mayores y pueden obtenerse imágenes de las mismas fácilmente mediante escáneres existentes de gel y blot. Los tamaños de punto de muestra en una micromatriz pueden ser de 300 micrones o menores, pero típicamente menores a 200 micrones en diámetro y estas matrices contienen usualmente miles de puntos. Las micromatrices requieren robótica especializada y/o equipamiento de imagenología que generalmente no se encuentran disponibles en el mercado como un sistema completo. Las terminologías que se han utilizado en la bibliografía para describir esta tecnología incluyen, a modo no taxativo: biochip, chip de ADN, micromatriz de ADN, GeneChip® (Affymetrix, Inc que se refiere a sus ensayos de ADN de alta densidad basados en oligonucleótidos y matriz génica.

Las micromatrices de ADN, o chips de ADN se fabrican mediante robótica de alta velocidad, generalmente en sustratos de vidrio o nylon, para los cuales se utilizan sondas con identidad conocida para determinar la unión complementaria, de esta forma permitiendo los estudios masivos de expresión génica en paralelo y de descubrimiento de genes. Un experimento con un único chip de ADN puede proporcionar información acerca de miles de genes simultáneamente. Se contempla en la presente que las micromatrices divulgadas pueden utilizarse para monitorear la expresión génica, el diagnóstico de enfermedades, descubrimiento de genes, descubrimiento de fármacos (fármacogenómica) e investigación toxicológica o tóxicogenómica.

Existen dos variantes de tecnología de micromatriz de ADN, en términos de la propiedad de la secuencia de ADN de matriz con identidad conocida. Las micromatrices de tipo I comprenden una sonda de ADNc (500~5.000 bases de largo) que se inmoviliza en una superficie sólida tal como vidrio utilizando colocación por robot y expuesta a un conjunto de objetivos ya sea separadamente o en una mezcla. Este método se denomina tradicionalmente micromatriz de ADN. Con las micromatrices de Tipo I, múltiples copias localizadas de una o más secuencias de polinucleótidos, preferiblemente copias de una secuencia de polinucleótidos simple, se inmovilizan en una pluralidad de regiones definidas de la superficie del sustrato. Un polinucleótido se refiere a una cadena de nucleótidos que está en el rango de 5 a 10.000 nucleótidos. Estas copias inmovilizadas de una secuencia de polinucleótidos son adecuadas para la utilización como sondas en experimentos de hibridación.

Para preparar perlas recubiertas con sondas inmovilizadas, las perlas se sumergen en una solución que contiene la secuencia de sondas deseada y luego se inmoviliza en las perlas mediante medios covalentes o no covalentes. Alternativamente, cuando las sondas se inmovilizan en varillas, una sonda dada puede colocarse en regiones definidas de la varilla. Los dispensadores típicos incluyen una micropipeta que suministra una solución al sustrato con un sistema robótico para controlar la posición de la micropipeta con respecto al sustrato. Puede haber una multiplicidad de dispensadores de modo que los reactivos se suministren a las regiones de la reacción simultáneamente. En una realización, se forma una micromatriz mediante la utilización de tecnología de chorro de tinta en base al efecto piezoeléctrico, por el cual un tubo angosto que contiene un líquido de interés, tal como reactivos de síntesis de oligonucleótidos, se rodea mediante un adaptador. Una carga eléctrica enviada a través del adaptador causa que el adaptador se expanda a una tasa diferente que el tubo y fuerce una pequeña caída de líquido en un sustrato.

Las muestras pueden ser cualquier muestra que contenga polinucleótidos (objetivos de polinucleótidos) de interés y se obtengan a partir de fluido corporal (sangre, orina, saliva, flema, jugos gástricos, etc.), células cultivadas, biopsias, u otras preparaciones de tejidos. El ADN o ARN puede aislarse a partir de la muestra de acuerdo con cualquier número de métodos bien conocidos por aquellos expertos en la técnica. En una realización, el ARN total se aisla utilizando el reactivo de aislamiento de ARN total TRIzol (Life Technologies, Inc., Rockville, Md.) y el ARN se aisla utilizando cromatografía de columna oligo d(T) o perlas de vidrio. Luego de la hibridación y procesamiento, las señales de hibridación obtenidas deberían reflejar con precisión las cantidades de polinucleótido objetivo testigo agregado a la muestra.

La pluralidad de regiones definidas en el sustrato puede disponerse en una variedad de formatos. Por ejemplo, las regiones pueden disponerse en perpendicular o en paralelo a la longitud de la cubierta. Más aun, los objetivos no tienen que unirse directamente al sustrato, sino que pueden unirse al sustrato a través de un grupo enlazante. Los grupos enlazantes pueden variar típicamente de aproximadamente 6 a 50 átomos de largo. Los grupos enlazantes incluyen oligómeros de etilenglicol, diaminas, diácidos y similares. Los grupos reactivos en la superficie del sustrato reaccionan con una de las porciones terminales del enlazante para unir el enlazante al sustrato. La otra porción terminal del enlazante luego se funcionaliza para unir las sondas.

Los polinucleótidos de muestra pueden etiquetarse con uno o más restos de etiquetado para permitir la detección de complejos de polinucleótidos de sonda/objetivo hibridados. Los restos de etiquetado pueden incluir composiciones que pueden detectarse mediante medios espectroscopios, fotoquímicos, bioquímicos, bioelectrónicos, inmunoquímicos, eléctricos, ópticos o químicos. Los restos de etiquetado incluyen radioisótopos, tales como 32P, 33P o 35S, compuestos quimioluminiscentes, proteínas de unión etiquetadas, átomos de metales pesados, marcadores espectroscópicos, tales como marcadores y colorantes fluorescentes, etiquetas magnéticas, enzimas enlazadas, etiquetas de espectrometría de masas, etiquetas de giro, donantes y aceptores de transferencia de electrones, biotina y similares.

El etiquetado puede llevarse a cabo durante una reacción de amplificación, tal como una reacción en cadena de polimerasa y en reacciones de transcripción in vitro o in vivo. Alternativamente, el resto de etiquetado puede incorporarse luego de la hibridación una vez que el complejo de sonda-objetivo se ha formado. En una realización, la biotina se incorpora primero durante una etapa de amplificación como se describió anteriormente. Luego de la reacción de hibridación, los ácidos nucleicos sin unir se enjuagan de modo que la única biotina que permanece unida al sustrato sea la que se une a los polinucleótidos objetivo que se hibridan con las sondas de polinucleótidos. Luego se agrega un fluoróforo conjugado con avidina, tal como avidina-ficoeritrina, que se une con una alta afinidad a la biotina.

La hibridación causa que una sonda de polinucleótidos y un objetivo complementario formen un dúplex estable a través del apareamiento de base. Los métodos de hibridación son bien conocidos por aquellos expertos en la técnica. Las condiciones rigurosas para la hibridación pueden definirse mediante la concentración de sal, temperatura y otros químicos y condiciones. Los parámetros adicionales de variación, tales como el tiempo de hibridación, la concentración del detergente, (dodecil sulfato de sodio, SDS) o solvente (formamida) y la inclusión o exclusión de ADN portador, son bien conocidos por aquellos expertos en la técnica. Las variaciones adicionales sobre estas condiciones serán fácilmente evidentes para aquellos expertos en la técnica.

Los métodos para detectar la formación de complejos son bien conocidos por aquellos expertos en la técnica. En una realización, las sondas de polinucleótidos se etiquetan con una etiqueta fluorescente y la medición de los niveles y patrones de formación de complejos se logra mediante la microscopía de fluorescencia, preferiblemente microscopía de fluorescencia confocal.

Un láser de ion de argón excita la etiqueta fluorescente, las emisiones se dirigen a un fotomultiplicador y la cantidad de luz emitida se detecta y cuantifica. La señal detectada debería ser proporcional a la cantidad del complejo de polinucleótidos sonda/objetivo en cada posición de la micromatriz. El microscopio de fluorescencia puede asociarse con un dispositivo de escáner impulsado por computadora para generar una imagen bidimensional cuantitativa de las intensidades de hibridación. La imagen escaneada se examina para determinar el nivel de abundancia/expresión de cada polinucleótido objetivo hibridado.

En un experimento de hibridación diferencial, los objetivos de polinucleótido a partir de dos o más muestras biológicas diferentes se etiquetan con dos o más etiquetas fluorescentes diferentes con diferentes longitudes de onda de emisión. Las señales fluorescentes se detectan separadamente con diferentes fotomultiplicadores fijados para detectar longitudes de onda específicas. Se obtienen los niveles relativos de abundancias/expresión de los polinucleótidos objetivo en dos o más muestras. Típicamente, las intensidades de fluorescencia de micromatriz pueden normalizarse para tomar en cuenta las variaciones en las intensidades de hibridación cuando se utiliza más de una micromatriz bajo condiciones de prueba similares. En una realización, las intensidades de hibridación individuales del complejo sonda/objetivo de polinucleótido se normalizan utilizando las intensidades derivadas de los testigos de normalización internos contenidos en cada micromatriz.

Las micromatrices de Tipo II comprenden una matriz de sondas de oligonucleótidos (oligos de 20~80 mer) o ácido peptidonucleico (PNA) que se sintetiza ya sea in situ (en chip) o mediante síntesis convencional seguida por inmovilización en chip. La matriz se expone a un ADN de muestra etiquetado, hibridado y se determina la identidad/abundancia de las secuencias complementarias. Este método, "históricamente" denominado chips de ADN, fue desarrollado en Affymetrix, Inc., que vende sus productos fabricados fotolitográficamente bajo la marca comercial GeneChip®.

El concepto básico detrás de la utilización de las matrices de Tipo II para la expresión génica es simple: los objetivos ADNc o ARNc derivados del ARNm de una muestra experimental se hibridan con sondas de ácido nucleico unidas al soporte sólido. Mediante el monitoreo de la cantidad de etiqueta asociada con cada ubicación de ADN, es posible deducir la abundancia de cada especie de ARNm representada. Si bien la hibridación ha sido utilizada durante décadas para detectar y cuantificar ácidos nucleicos, la combinación de la miniaturización de la tecnología y las grandes y crecientes cantidades de información de secuencias, han expandido enormemente la escala en la cual se estudia la expresión génica.

La fabricación de micromatrices puede comenzar con una oblea cuadrada de cuarzo de 5 pulgadas. Inicialmente el cuarzo se lava para asegurar una hidroxilación uniforme a través de su superficie. Debido a que el cuarzo se hidroxila naturalmente, proporciona un excelente sustrato para la unión de químicos, tales como moléculas enlazantes, que luego se utilizan para posicionar las sondas en las matrices.

La oblea se coloca en un baño de silano, que reacciona con los grupos hidroxilo del cuarzo y forma una matriz de moléculas enlazadas de forma covalente. La distancia entre estas moléculas de silano determina la densidad de empaquetado de la sonda, permitiendo que las matrices mantengan más de 500.000 ubicaciones de sonda, o características, dentro de solamente 1 ,28 centímetros cuadrados. Cada una de estas características aloja millones de moléculas de ADN idénticas. La película de silano proporciona una densidad de hidroxilo uniforme para iniciar el montaje de la sonda. Las moléculas enlazantes, unidas a la matriz de silano, proporcionan una superficie que puede activarse espacialmente mediante la luz.

La síntesis de sonda ocurre en paralelo, resultando en la adición de un nucleótido A, C, T, o G a múltiples cadenas crecientes simultáneamente. Para definir cuáles cadenas de oligonucleótidos recibirán un nucleótido en cada etapa, las máscaras fotolitográficas, que llevan ventanas de 18 a 20 micrones cuadrados que corresponden con las dimensiones de las características individuales, se colocan sobre la oblea recubierta. Las ventanas se distribuyen sobre la máscara en base a la secuencia deseada de cada sonda. Cuando se hace brillar la luz ultravioleta sobre la máscara en la primera etapa de la síntesis, los enlazantes expuestos se vuelven desprotegidos y quedan disponibles para el acoplamiento de nucleótidos.

Una vez que las características deseadas se hayan activado, una solución que contiene un único tipo de desoxinucleósido con un grupo de protección desmontable se enjuaga sobre la superficie del agua. El nucleótido se acopla a los enlazantes activados, iniciando el proceso de síntesis.

Si bien cada posición en la secuencia de un oligonucleótido puede ocuparse por 1 de 4 nucleótidos, resultando en una necesidad evidente de 25 x 4 o 100 máscaras diferentes por oblea, el proceso de síntesis puede diseñarse para reducir significativamente este requisito. Los algoritmos que ayudan a minimizar la utilización de máscaras calculan cómo coordinar mejor el crecimiento de la sonda mediante el ajuste de las tasas de síntesis de sondas individuales y la identificación de las situaciones cuando pueda usarse la misma máscara múltiples veces.

Algunos de los elementos clave de la selección y diseño son comunes a la producción de todas las micromatrices, independientemente de su aplicación pretendida. Las estrategias para optimizar la hibridación de sondas, por ejemplo, se incluyen sin variar en el proceso de selección de sondas. La hibridación bajo condiciones particulares de pH, sal y temperatura puede optimizarse tomando en cuenta las temperaturas de fusión y utilizando reglas empíricas que se correlacionen con los comportamientos de hibridación deseados.

Para obtener una visión completa de la actividad de un gen, algunas sondas se seleccionan a partir de regiones compartidas por variantes múltiples de empalme o poliadenilación. En otros casos, se favorecen las sondas únicas que distinguen entre variantes. La distancia entre sondas también se toma en cuenta en el proceso de selección.

Se utiliza un conjunto diferente de estrategias para seleccionar sondas para genotipar matrices que dependen de múltiples sondas para interrogar nucleótidos individuales en una secuencia. La identidad de una base objetivo puede deducirse utilizando cuatro sondas idénticas que varían solamente en la posición objetivo, cada una conteniendo una de las cuatro bases posibles.

Alternativamente, la presencia de una secuencia de consenso puede evaluarse utilizando una o dos sondas que representan alelos específicos. Para genotipar muestras heterocigóticas o mezcladas genéticamente, pueden crearse matrices con varias sondas para proporcionar información redundante, resultando en un genotipado inequívoco. Además, pueden utilizarse sondas genéricas en algunas aplicaciones para maximizar la flexibilidad. Algunas matrices de sondas, por ejemplo, permiten la separación y análisis de productos de reacción individuales a partir de mezclas complejas, tales como aquellas utilizadas en algunos protocolos para identificar los polimorfismos de nucleótido único (SNP).

PCR en tiempo real La PCR en tiempo real monitorea la fluorescencia emitida durante la reacción como un indicador de la producción de amplicones durante cada ciclo de PCR (es decir, en tiempo real) en oposición a la detección de punto final. El progreso en tiempo real de la reacción puede verse en algunos sistemas. La PCR en tiempo real no detecta el tamaño del amplicón y por tanto no permite la diferenciación entre la amplificación de ADN y ADNc, sin embargo, no está influida por la amplificación no específica salvo que se utilice SYBR Green. La cuantificación de PCR en tiempo real elimina el procesamiento post-PCR de los productos PCR. Esto ayuda a aumentar el rendimiento y reducir las probabilidades de arrastre de contaminación. La PCR en tiempo real también ofrece un rango dinámico amplio de hasta 107 veces. El rango dinámico de cualquier ensayo determina cuánta concentración objetivo puede variar y aun cuantificarse. Un rango dinámico amplio significa que se puede someter a ensayo a un amplio rango de relaciones de objetivo y normalizador con igual sensibilidad y especificidad. Por consiguiente, cuanto más amplio sea el rango dinámico, más precisa será la cuantificación. Cuando se combina con RT-PCR, una reacción de RT-PCR en tiempo real reduce el tiempo que se necesita para medir la cantidad de amplicones proporcionando la visualización del amplicón a medida que el proceso de amplificación avanza.

El sistema de PCR en tiempo real se basa en la detección y cuantificación de un reportero fluorescente. La señal aumenta en proporción directa a la cantidad de producto de PCR en una reacción. Mediante el registro de la cantidad de emisión de fluorescencia en cada ciclo, es posible monitorear la reacción de PCR durante la fase exponencial donde el primer aumento significativo en la cantidad de producto de PCR se correlaciona con la cantidad inicial de la plantilla objetivo. Cuanto más alto sea el número de copia inicial del objetivo de ácido nucleico, más temprano se observa un aumento significativo en fluorescencia. Un aumento significativo en la fluorescencia por encima del valor base medido durante los ciclos 3-15 puede indicar la detección del producto de PCR acumulado.

Se establece un umbral de fluorescencia fijo significativamente por encima del nivel de base que puede alterarse por el operador. El parámetro CT (ciclo de umbral) se define como el número de ciclo en el cual la emisión de fluorescencia excede el umbral fijo.

Existen tres principales sistemas de monitoreo de fluorescencia para la amplificación de ADN: (1 ) sondas de hidrólisis; (2) sondas de hibridación; y (3) agentes de unión a ADN. Las sondas de hidrólisis incluyen las sondas TaqMan, balizas moleculares y Scorpion. Estas utilizan la actividad de exonucleasa 5' fluorogénica de Taq polimerasa para medir la cantidad de las secuencias objetivo en muestras de ADNc.

Las sondas TaqMan son oligonucleótidos más largos que los cebadores (20-30 bases de largo con un valor Tm de 10° más alto) que contienen un colorante fluorescente usualmente en la base 5' y un colorante de aplacamiento (usualmente TAMRA) típicamente en la base 3'. Cuando se irradia, el colorante fluorescente excitado transfiere energía a la molécula del colorante de aplacamiento cercana en vez de fluorescer (esto se denomina FRET = transferencia de energía por resonancia fluorescente o Fórster.) Por lo tanto, cercanía del reportero y el aplacador evita la emisión de cualquier fluorescencia mientras la sonda está intacta. Las sondas TaqMan están diseñadas para aparearse con una región interna de un producto de PCR. Cuando la polimerasa replica una plantilla en la cual se une una sonda TaqMan , su actividad de exonucleasa 5' escinde la sonda. Esto finaliza la actividad del aplacador (sin FRET) y el colorante reportero comienza a emitir fluorescencia, que aumenta en cada ciclo proporcional a la tasa de escisión de la sonda. La acumulación de productos de PCR se detecta mediante el monitoreo del aumento en la fluorescencia del colorante reportero (nótese que los cebadores no se etiquetan). El ensayo TaqMan utiliza parámetros universales de ciclos térmicos y condiciones de reacción de PCR. Debido a que la escisión ocurre solamente si la sonda se híbrida con el objetivo, el origen de la fluorescencia detectada es una amplificación específica. El proceso de hibridación y escisión no interfiere con la acumulación exponencial del producto. Un requisito específico para las sondas fluorogénicas es que no haya G en el extremo 5'. Una 'G' adyacente al colorante reportero puede aplacar la fluorescencia del reportero incluso luego de la escisión.

Las balizas moleculares también contienen colorantes fluorescentes (FAM, TAMRA, TET, ROX) y aplacadores (típicamente DABCYL) en cualquier extremo pero están diseñadas para adoptar una estructura de horquilla mientras están libres en la solución para acercar el colorante fluorescente y el aplacador para que ocurra la FRET. Estas tienen dos brazos con secuencias complementarias que forman un híbrido o tronco muy estable. La cercanía del reportero y el aplacador en esta configuración de horquilla suprime la fluorescencia del reportero. Cuando la baliza se híbrida con el objetivo durante la etapa de apareamiento, el colorante reportero se separa del aplacador y el reportero fluoresce (no ocurre la FRET). Las balizas moleculares permanecen intactas durante la PCR y deben unirse nuevamente para dirigirse a cada ciclo para la emisión de fluorescencia. Esto se correlacionará con la cantidad de producto de PCR disponible. Todas las químicas de PCR en tiempo real permiten la detección de múltiples especies de ADN (multiplexación) mediante el diseño de cada sonda/baliza con un par de flúor/aplacamiento espectralmente único siempre que la plataforma sea adecuada para fusionar el análisis de curva si se utiliza SYBR Green. Mediante la multiplexación, el o los objetivos y el testigo endógeno pueden amplificarse en un único tubo.

Con las sondas Scorpion, el cebado específico de secuencia y la detección del producto de PCR se logra utilizando un único oligonucleótido. La sonda Scorpion mantiene una configuración de tronco-bucle en el estado sin hibridar. El fluoróforo se acopla al extremo 5' y se alpaca mediante un resto acoplado al extremo 3'. La porción 3' del tronco también contiene una secuencia que es complementaria al producto de extensión del cebador. Esta secuencia se enlaza al extremo 5' de un cebador especifico a través de un monómero no amplificable. Luego de le extensión del cebador Scorpion, la secuencia de sonda específica es capaz de unirse a su complemento dentro del amplicón extendido abriendo por lo tanto el bucle de la horquilla. Esto evita que la fluorescencia se aplaque y se observa una señal.

Otra alternativa es la química de colorante de unión a ADN de doble hebra que cuantifica la producción del amplicón (incluyendo una amplificación no específica y un complejo de cebador-dímero) mediante la utilización de un agente intercalante fluorescente especifico no de secuencia (SYBR Green I o bromuro de etidio). No se une a ADN monocatenario. El SYBR Green es un colorante de unión de surco menor fluorogénico que exhibe poca fluorescencia cuando está en solución pero emite una fuerte señal fluorescente tras la unión al ADN de doble hebra. Las desventajas de la PCR en tiempo real basada en SYBR Green incluyen el requisito para la optimización extensiva. Además, las amplificaciones no específicas requieren ensayos de seguimiento (curva de punto de fusión o análisis de disociación) para la identificación del amplicón. El método ha sido utilizado en el genotipado HFE-C282Y. Otro problema controlable es que los amplicones más largos crean una señal más fuerte (si se combina con otros factores, esto puede causar saturación de cámara CDC, véase a continuación). Normalmente el SYBR Green se utiliza en reacciones de plexación única, sin embargo cuando se acopla con el análisis de punto de fusión, se puede utilizar para reacciones múltiplex.

El ciclo umbral o el valor CT es el ciclo en el cual se detecta primero un aumento en ARn (para la definición de ARn, véase a continuación). El ciclo de umbral es cuando el sistema comienza a detectar el aumento en la señal asociado con un crecimiento exponencial del producto de PCR durante la fase lineal logarítmica. Esta fase proporciona la información más útil acerca de la reacción (ciertamente más importante que el punto final). La pendiente de la fase lineal logarítmica es una reflexión de la eficiencia de la amplificación. La eficiencia (Eff) de la reacción puede calcularse mediante la fórmula: Eff=10("1 pendien,e)-1. La eficiencia de la PCR debería ser 90 -100% (3,6 > pendiente > 3, 1 ). Un número de variables puede afectar la eficiencia de la PCR. Estos factores incluyen la longitud del amplicón, estructura secundaria y calidad del cebador. Aunque se pueden obtener datos válidos que caen dentro del rango de eficiencia, debería optimizarse adicionalmente la qRT-PCR o diseñarse amplicones alternativos. Para que la pendiente sea un indicador de amplificación real, (más que un desplazamiento de señal), debe haber un punto de inflexión. Este es el punto en la curva de crecimiento cuando comienza la fase lineal logarítmica. También representa la mayor tasa de cambio a través de la curva de crecimiento. (El desplazamiento de señal se caracteriza por un aumento o disminución gradual en la fluorescencia sin la amplificación del producto). El parámetro importante para la cuantificación es CT. Cuanto más alta sea la cantidad inicial del ADN genómico, más pronto se detecta el producto acumulado en el proceso PCR y más bajo es el valor Cy. El umbral debería ubicarse por encima de cualquier actividad de línea base y dentro de la fase de aumento exponencial (que parece lineal en la transformación logarítmica). Algunos software permiten la determinación del umbral de ciclo (CT) mediante un análisis matemático de la curva de crecimiento. Esto proporciona una mejor reproducibilidad de pasada en pasada. Un valor CT de 40 significa la no amplificación y este valor no puede incluirse en los cálculos. Además de utilizarse para la cuantificación, el valor CT puede utilizarse para el análisis cualitativo como una medición de aprobación/falla.

Los ensayos múltiplex TaqMan pueden realizarse utilizando múltiples colorantes con distintas longitudes de onda de emisión. Los colorantes disponibles para este propósito son FAM, TET, VIC y JOE (el más costoso). El TAMRA se reserva como el aplacador en la sonda y ROX como la referencia pasiva. Para obtener mejores resultados, se recomienda la combinación de FAM (objetivo) y VIC (testigo endógeno) (tienen la mayor diferencia en máximo de emisión) mientras que JOE y VIC no deberían combinarse. Es importante que si la capa de colorante no ha sido elegida de forma correcta, la máquina leerá igualmente el espectro del otro colorante. Por ejemplo, tanto VIC como FAM emiten fluorescencia en un rango similar entre sí y cuando se realiza una coloración única, los pocilios deberían etiquetarse correctamente. En el caso de la multiplexación, la compensación espectral para el análisis post-pasada debería encenderse (en ABI 7700: Instrumento/Diagnósticos/Opciones Avanzadas/Miscelánea). La activación de compensación espectral mejora la resolución espectral del colorante.

PCR anidada Los métodos divulgados pueden además utilizar PCR anidada. La PCR anidada aumenta la especificidad de la amplificación de ADN, reduciendo el fondo debido a la amplificación no específica del ADN. Se están utilizando dos conjuntos de cebadores en dos PCR sucesivas. En la primera reacción, un par de cebadores se utiliza para generar productos de ADN, los cuales, además del objetivo pretendido, pueden consistir aun en fragmentos de ADN no específicamente amplificados. El o los productos luego se utilizan en una segunda PCR con un conjunto de cebadores cuyos sitios de unión son completamente o parcialmente diferentes y se ubican en 3' de cada uno de los cebadores utilizados en la primera reacción. La PCR anidada es con frecuencia más exitosa en la amplificación específica de fragmentos largos de ADN que la PCR convencional, pero requiere más conocimiento en detalle de las secuencias objetivo.

Por lo tanto, en la presente se divulgan en un aspecto métodos para diagnosticar un cáncer relacionado con la quinasa de linfoma anaplásico (ALK) en un sujeto que comprende llevar a cabo una reacción de PCR en ADN a partir de una muestra de tejido del sujeto; en donde la reacción de PCR comprende un cebador inverso capaz de hibridarse específicamente con una o más secuencias de ALK y al menos un cebador directo; y donde un aumento en la cantidad del producto de amplificación con relación a un testigo indica la presencia de un cáncer relacionado con ALK.

Cebadores y sondas Como se utiliza en la presente, "cebadores" son un subconjunto de sondas que son capaces de soportar algún tipo de manipulación enzimática y que pueden hibridarse con un ácido nucleico objetivo de tal modo que la manipulación enzimática pueda ocurrir. Un cebador puede estar hecho a partir de cualquier combinación de nucleótidos o derivados de nucleótidos o análogos disponibles en la técnica que no interfieren con la manipulación enzimática.

Como se utiliza en la presente, "sondas" son moléculas capaces de interactuar con un ácido nucleico objetivo, típicamente en un modo específico de secuencia, por ejemplo a través de la hibridación. La hibridación de los ácidos nucleicos se entiende bien en la técnica y se describe en la presente. Una sonda típicamente puede estar hecha a partir de cualquier combinación de nucleótidos o derivados de nucleótidos o análogos disponibles en la técnica.

Se divulgan las composiciones que incluyen cebadores y sondas, que son capaces de interactuar con los ácidos nucleicos divulgados tales como SEQ ID NO: 1 o su complemento. En algunas realizaciones los cebadores se utilizan para soportar reacciones de extensión de ácido nucleico, reacciones de replicación de ácido nucleico, y/o reacciones de amplificación de ácido nucleico. Típicamente los cebadores serán capaces de extenderse en un modo específico de secuencia. La extensión de un cebador en un modo específico de secuencia incluye cualquier método donde la secuencia y/o composición de la molécula de ácido nucleico a la cual el cebador se híbrida o de otro modo se asocia se dirige o influye en la composición de secuencia del producto producido por la extensión del cebador. La extensión del cebador en un modo específico de secuencia por lo tanto incluye, pero no se limita a, PCR, secuenciación de ADN, extensión de ADN, polimerización de ADN, transcripción de ARN, o transcripción inversa. Se divulgan las técnicas y condiciones que amplifican el cebador en un modo específico de secuencia En algunas realizaciones los cebadores se utilizan para las reacciones de amplificación de ADN, tales como PCR o secuenciación directa. Se entiende que en algunas realizaciones los cebadores también pueden extenderse utilizando técnicas no enzimáticas, donde por ejemplo, los nucleótidos u oligonucleótidos utilizados para extender el cebador se modifican de tal modo que reaccionarán químicamente para extender el cebador en un modo específico de secuencia. Típicamente los cebadores divulgados se hibridan con los ácidos nucleicos divulgados o región de los ácidos nucleicos o se hibridan con el complemento de los ácidos nucleicos o complemento de una región de los ácidos nucleicos. Como ejemplo de la utilización de los cebadores, pueden utilizarse uno o más cebadores para crear productos de extensión y templados a partir de un primer ácido nucleico.

El tamaño de los cebadores o sondas para la interacción con los ácidos nucleicos puede ser cualquier tamaño que soporte la manipulación enzimática del cebador, tal como la amplificación de ADN o la simple hibridación de la sonda o cebador. Un cebador o sonda típicos serían de al menos 6, 7, 8, 9, 10, 1 1 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 , 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41 , 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51 , 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61 , 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71 , 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81 , 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91 , 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1250, 1500, 1750, 2000, 2250, 2500, 2750, 3000, 3500 o 4000 nucleótidos de largo.

En otras realizaciones, un cebador o sonda puede ser menor o igual a 6, 7, 8, 9, 10, 1 1 , 12 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 , 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41 , 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51 , 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61 , 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71 , 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81 , 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91 , 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1250, 1500, 1750, 2000, 2250, 2500, 2750, 3000, 3500 o 4000 nucleótidos de largo.

Los cebadores para el ácido nucleico de interés típicamente serán utilizados para producir productos de extensión y/u otros productos replicados o amplificados que contengan una región del ácido nucleico de interés. El tamaño del producto puede ser tal que el tamaño pueda determinarse con precisión dentro de 3 o 2 o 1 nucleótidos.

En algunas realizaciones el producto puede ser, por ejemplo, de al menos 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 , 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41 , 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51 , 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61 , 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71 , 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81 , 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91 , 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1250, 1500, 1750, 2000, 2250, 2500, 2750, 3000, 3500 o 4000 nucleótidos de largo.

En otras realizaciones el producto puede ser, por ejemplo, menor o igual a 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 , 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41 , 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51 , 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61 , 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71 , 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81 , 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91 , 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1250, 1500, 1750, 2000, 2250, 2500, 2750, 3000, 3500 o 4000 nucleótidos de largo.

Por lo tanto, se entiende y se contempla en la presente que las reacciones de RT-PC y PCR requieren cebadores directos e inversos para formar un par de cebadores. Divulgado en la presente, el cebador directo puede seleccionarse del grupo que consiste en /sic/ Por ejemplo, el cebador directo puede ser un cebador de ALK intracelular tal como, por ejemplo, (cebador 100) 5'ACTACTGCTTTGCTGGCAAGACCT (SEQ ID NO: 6); un cebador de fusión EML4-ALK extracelular tal como, por ejemplo, (cebador 103) 5'TGTTCAAGATCGCCTGTCAGCTCT (SEQ ID NO 3); un cebador de fusión NPM-ALK extracelular tal como, por ejemplo, (cebador 102) 5' TCTGTACAGCCAACGGTTTCCCTT (SEQ ID NO 4); un cebador de fusión CTLC-ALK extracelular tal como, por ejemplo, (cebador 105) 5'GAGAGTGCTTTGGAGCTTGTCTGT (SEQ ID NO: 5); o un cebador de ALK de tipo silvestre extracelular a partir de una región de no homología, tal como, por ejemplo, (cebador 104) 5' TTCCTTCATCAGTCCACTGGGCAT (SEQ ID NO: 2). Los cebadores directos e inversos adicionales que pueden utilizarse en los métodos divulgados en la presente pueden encontrarse en la Tabla 3.

El cebador inverso puede ser, por ejemplo, cebador 101 : 5' TCGTCCTGTTCAGAGCACACTTCA (SEQ ID NO: 7). Alternativamente, el cebador inverso puede ser SEQ ID NO: 32', (SEQ ID NO: 46', (SEQ ID NO: 47', (SEQ ID NO: 56', (SEQ ID NO: 57' o SEQ ID NO: 58. Se entiende que los métodos comprenden al menos un cebador directo y un cebador inverso. Por lo tanto, en la presente se divulgan métodos para diagnosticar un cáncer relacionado con la quinasa de linfoma anaplásico (ALK) en un sujeto que comprende llevar a cabo una reacción de RT-PCR en un ARNm a partir de una muestra de tejido del sujeto; en donde la reacción en cadena de polimerasa con transcripción inversa (RT-PCR), comprende un cebador inverso capaz de hibridarse específicamente a una o más secuencias de ALK y al menos un cebador directo; en donde el cebador directo se selecciona del grupo que consiste en el cebador KIF5B-ALK, cebador NPM-ALK, cebador ATIC-ALK, cebador CLTC-ALK, RANBP2-ALK, cebador SEC31 L1-ALK, cebador TPM3-ALK, cebador TPM4-ALK, cebador TFGL-ALK, cebador TFGS-ALK, cebador CARS-ALK, cebador EML4-ALK, cebador AL01 7-ALK, cebador MYH9-ALK, cebador MSN-ALK y cebador TFGXL-ALK; y en donde un aumento en la cantidad del producto de amplificación con relación a un testigo indica la presencia de un cáncer relacionado con ALK. Por lo tanto, también se divulgan métodos donde el cebador directo se selecciona del grupo que consiste en SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41 , SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51 , SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 55 y SEQ ID NO: 59. Por ejemplo, en la presente se divulgan , métodos para diagnosticar un cáncer relacionado con la quinasa de linfoma anaplásico (ALK) en un sujeto que comprende llevar a cabo una reacción de RT-PCR en ARNm a partir de una muestra de tejido del sujeto; en donde la reacción en cadena de polimerasa con transcripción inversa (RT-PCR) comprende un cebador inverso capaz de hibridarse específicamente a una o más secuencias de ALK y al menos un cebador directo; en donde el cebador directo es un cebador de fusión NPM-ALK que comprende SEQ ID NO: 4 y en donde un aumento en la cantidad del producto de amplificación con relación a un testigo indica la presencia de un cáncer relacionado con ALK.

Como ejemplos adicionales de pares de cebadores, se divulgan específicamente en la presente métodos donde el cebador directo es un cebador de ALK de tipo silvestre y el cebador inverso es SEQ ID NO: 7; donde el cebador directo es un cebador KIF5B-ALK y el cebador inverso es SEQ ID NO: 7; donde el cebador directo es un cebador NPM-ALK y el cebador inverso es SEQ ID NO: 7; donde el cebador directo es un cebador ATIC-ALK y el cebador inverso es SEQ ID NO: 7; donde el cebador directo es un cebador CLTC-ALK y el cebador inverso es SEQ ID NO: 7; donde el cebador directo es un cebador RANBP2-ALK y el cebador inverso es SEQ ID NO: 7; donde el cebador directo es un cebador SEC31 L1 -ALK y el cebador inverso es SEQ ID NO: 7; donde el cebador directo es un cebador TPM3-ALK y el cebador inverso es SEQ ID NO: 7; donde el cebador directo es un cebador TPM4-ALK y el cebador inverso es SEQ ID NO: 7; donde el cebador directo es un cebador TFGL-ALK y el cebador inverso es SEQ ID NO: 7; donde el cebador directo es un cebador TFGS-ALK y el cebador inverso es SEQ ID NO: 7; donde el cebador directo es un cebador CARS-ALK y el cebador inverso es SEQ ID NO: 7; donde el cebador directo es un cebador EML4-ALK y el cebador inverso es SEQ ID NO: 7; donde el cebador directo es un cebador AL017-ALK y el cebador inverso es SEQ ID NO: 7; donde el cebador directo es un cebador MYH9-ALK y el cebador inverso es SEQ ID NO: 7; donde el cebador directo es un cebador TFGXL-ALK y el cebador inverso es SEQ ID NO: 7. También se divulgan métodos donde el par de cebadores comprende SEQ ID NOS: 2 y 7, SEQ ID NOS: 3 y 7, SEQ ID NOS: 4 y 7, SEQ ID NOS: 5 y 7 o SEQ ID NOS: 6 y 7.

Ejemplos adicionales de pares de cebadores, que se divulgan específicamente en la presente, son métodos en donde el cebador directo es un cebador de ALK de tipo silvestre y el cebador inverso es SEQ ID NO: 46; donde el cebador directo es un cebador KIF5B-ALK y el cebador inverso es SEQ ID NO: 46; donde el cebador directo es un cebador NPM-ALK y el cebador inverso es SEQ ID NO: 46; donde el cebador directo es un cebador ATIC-ALK y el cebador inverso es SEQ ID NO: 46; donde el cebador directo es un cebador CLTC-ALK y el cebador inverso es SEQ ID NO: 46; donde el cebador directo es un cebador RANBP2-ALK y el cebador inverso es SEQ ID NO: 46; donde el cebador directo es un cebador SEC31 L1-ALK y el cebador inverso es SEQ ID NO: 46; donde el cebador directo es un cebador TPM3-ALK y el cebador inverso es SEQ ID NO: 46; donde el cebador directo es un cebador TPM4-ALK y el cebador inverso es SEQ ID NO: 46; donde el cebador directo es un cebador TFGL-ALK y el cebador inverso es SEQ ID NO: 46; donde el cebador directo es un cebador TFGS-ALK y el cebador inverso es SEQ ID NO: 46; donde el cebador directo es un cebador CARS-ALK y el cebador inverso es SEQ ID NO: 46; donde el cebador directo es un cebador EML4-ALK y el cebador inverso es SEQ ID NO: 46; donde el cebador directo es un cebador AL017-ALK y el cebador inverso es SEQ ID NO: 46; donde el cebador directo es un cebador MYH9-ALK y el cebador inverso es SEQ ID NO: 46; donde el cebador directo es un cebador TFGXL-ALK y el cebador inverso es SEQ ID NO: 46. También se divulgan métodos donde el par de cebadores comprende SEQ ID NOS: 2 y 46, SEQ ID NOS: 3 y 46, SEQ ID NOS: 4 y 46, SEQ ID NOS: 5 y 46, SEQ ID NOS: 6 y 46, SEQ ID NOS: 33 y 46, SEQ ID NOS: 34 y 46, SEQ ID NOS: 35 y 46, SEQ ID NOS: 36 y 46, SEQ ID NOS: 37 y 46, SEQ ID NOS: 38 y 46, SEQ ID NOS: 39 y 46, SEQ ID NOS: 40 y 46, SEQ ID NOS: 41 y 46, SEQ ID NOS: 42 y 46, SEQ ID NOS: 43 y 46, SEQ ID NOS: 44 y 46, SEQ ID NOS: 45 y 46, SEQ ID NOS: 485 y 46, SEQ ID NOS: 49 y 46, SEQ ID NOS: 50 y 46, SEQ ID NOS: 51 y 46, SEQ ID NOS: 52 y 46, SEQ ID NOS: 53 y 46, SEQ ID NOS: 54 y 46, SEQ ID NOS: 55 y 46 o SEQ ID NO: 58 y 46.

Se entiende y se contempla en la presente que hay situaciones donde puede ser ventajoso utilizar más de un par de cebadores para detectar la presencia de una fusión, truncamiento, o mutación de sobreexpresión. Dichas reacciones de RT-PCR pueden llevarse a cabo separadamente o en una reacción única. Cuando se colocan múltiples pares en una única reacción, esto se denomina "PCR múltiplex". Por ejemplo, la reacción puede comprender un cebador de ALK de tipo silvestre apareado con un cebador inverso, así como también un cebador de fusión de ALK apareado con el mismo cebador inverso. Por lo tanto, en la presente se divulgan en un aspecto métodos para diagnosticar un cáncer relacionado con la quinasa de linfoma anaplásico (ALK) en un sujeto que comprende llevar a cabo una reacción de RT-PCR en ARNm a partir de una muestra de tejido del sujeto; en donde la reacción en cadena de polimerasa con transcripción inversa (RT-PCR) comprende un cebador inverso capaz de hibridarse específicamente con una o más secuencias de ALK y al menos dos cebadores directos; y en donde un aumento en la cantidad del producto de amplificación con relación a un testigo indica la presencia de un cáncer relacionado con ALK. Se divulgan de modo similar métodos que comprenden al menos tres cebadores directos. Se entiende y se contempla en la presente que cualquier combinación de dos o más o tres o más de los cebadores directos divulgados en la presente pueden utilizarse en la reacción múltiplex. Por lo tanto, por ejemplo, se describen en la presente métodos para diagnosticar, en donde los cebadores directos son un cebador NPM-ALK y un cebador de ALK de tipo silvestre. También se describen, por ejemplo, métodos para diagnosticar, en donde los cebadores directos son un cebador ELM4-ALK y un cebador de ALK de tipo silvestre.

Otros ejemplos de conjuntos de cebadores directos de PCR múltiplex incluyen, a modo no taxativo, un cebador de fusión KIF5B-ALK y un cebador de ALK de tipo silvestre, un cebador de fusión CLTC-ALK y un cebador de ALK de tipo silvestre, un cebador de fusión RANBP2-ALK y un cebador de ALK de tipo silvestre, un cebador de fusión ATIC-ALK y un cebador de ALK de tipo silvestre, un cebador de fusión SEC31 L1 -ALK y un cebador de ALK de tipo silvestre, un cebador de fusión TP 3-ALK y un cebador de ALK de tipo silvestre, un cebador de fusión TPM4-ALK y un cebador de ALK de tipo silvestre, un cebador de fusión TFGL-ALK y un cebador de ALK de tipo silvestre, un cebador de fusión TFGS -ALK y un cebador de ALK de tipo silvestre, un cebador de fusión CARS-ALK y un cebador de ALK de tipo silvestre, un cebador de fusión AL017-ALK y un cebador de ALK de tipo silvestre un cebador de fusión MYH9-ALK y un cebador de ALK de tipo silvestre un cebador de fusión MSN-ALK y un cebador de ALK de tipo silvestre, un cebador de ALK truncado y un cebador de ALK de tipo silvestre, un cebador de fusión ELM4-ALK y un cebador de ALK truncado, un cebador de fusión NPM-ALK y un cebador de ALK truncado, un cebador de fusión CLTC-ALK y un cebador de ALK truncado, un cebador de fusión RANBP2-ALK y un cebador de ALK truncado, un cebador de fusión ATIC-ALK y un cebador de ALK truncado, un cebador de fusión SEC31 L1 -ALK y un cebador de ALK truncado, un cebador de fusión TPM3-ALK y un cebador de ALK truncado, un cebador de fusión TPM4-ALK y un cebador de ALK truncado, un cebador de fusión TFGL-ALK y un cebador de ALK truncado, un cebador de fusión TFGS-ALK y un cebador de ALK truncado, un cebador de fusión CARS-ALK y un cebador de ALK truncado, un cebador de fusión AL017-ALK y un cebador de ALK truncado, un cebador de fusión MYH9-ALK y un cebador de ALK truncado y un cebador de fusión MSN-ALK y un cebador de ALK truncado.

Ejemplos adicionales incluyen, a modo no taxativo, un cebador de fusión ELM4-ALK, un cebador de ALK de tipo silvestre y un cebador de ALK truncado; un cebador de fusión NPM-ALK, un cebador de ALK de tipo silvestre y un cebador de ALK truncado; un cebador de fusión CLTC-ALK, un cebador de ALK de tipo silvestre y un cebador de ALK truncado; un cebador de fusión RANBP2-ALK, un cebador de ALK de tipo silvestre y un cebador de ALK truncado; un cebador de fusión ATIC-ALK, un cebador de ALK de tipo silvestre y un cebador de ALK truncado; un cebador de fusión SEC31 L1-ALK, un cebador de ALK de tipo silvestre y un cebador de ALK truncado; un cebador de fusión TPM3-ALK, un cebador de ALK de tipo silvestre y un cebador de ALK truncado; un cebador de fusión TPM4-ALK, un cebador de ALK de tipo silvestre y un cebador de ALK truncado; un cebador de fusión TFGL-ALK, un cebador de ALK de tipo silvestre y un cebador de ALK truncado; un cebador de fusión TFGS-ALK, un cebador de ALK de tipo silvestre y un cebador de ALK truncado; un cebador de fusión CARS-ALK, un cebador de ALK de tipo silvestre y un cebador de ALK truncado; un cebador de fusión AL017-ALK, un cebador de ALK de tipo silvestre y un cebador de ALK truncado; un cebador de fusión MYH9-ALK, un cebador de ALK de tipo silvestre y un cebador de ALK truncado; y un cebador de fusión MSN-ALK, un cebador de ALK de tipo silvestre y un cebador de ALK truncado.

Por lo tanto, en un aspecto, un tubo de reacción única puede incluir un cebador directo que se híbrida con una o más fusiones de ALK, un ALK de tipo silvestre o un dominio de quinasa de ALK y un cebador inverso que se híbrida con un ALK de tipo silvestre. Se entiende que los métodos divulgados en la presente pueden comprender tubos de reacción múltiple. Por ejemplo los métodos pueden incluir una primera reacción para detectar la presencia de una fusión de ALK conocida que comprende uno o más cebadores de fusión de ALK directos y un cebador de ALK inverso que se híbrida con ALK de tipo silvestre (por ejemplo, los cebadores directos de SEQ ID NOs) 2, 3, 4, 5, 6, 34,35, 36, 37, 38, 39, 40, 41 , 42, 43, 44, 48, 49, 50, 51 , 52, 53 y 59 y el cebador inverso de SEQ ID Nos: 7, 32, 46, 47, 56, 57 o 58), un segundo tubo de reacción que comprende un cebador directo e inverso para la detección de ALK de tipo silvestre (por ejemplo, el cebador directo de SEQ ID NOs: 33, 54, o 55 y el cebador inverso de SEQ ID Nos: 7, 32, 46, 47, 56, 57 o 58); un cebador directo e inverso para detectar la presencia del dominio de quinasa de ALK (por ejemplo, el cebador directo de SEQ ID NOs: 45 o 48 y el cebador inverso de SEQ ID Nos: 7, 32, 46, 47, 56, 57 o 58); un cebador directo e inverso para detectar un testigo; un cebador directo e inverso para un testigo ADNc positivo; y un cebador directo e inverso para un testigo ADNc negativo. En un método de tubo de reacción múltiple, se extrae el ARN a partir de una muestra de tejido obtenida de un sujeto; el ARN se transcribe inversamente para producir ADNc; el ADNc se divide entre uno o más tubos de reacción y se realizan ensayos RT-PCR o de micromatriz. Asumiendo que los testigos funcionan como se diseñaron, un experto en la técnica puede detectar el producto de amplificación en el tubo de fusión, tubo de tipo silvestre y tubo de quinasa. Un ensayo que resulta en la presencia de un amplicón en el tubo de fusión y el tubo de quinasa, pero no en el tubo de tipo silvestre, indica la presencia de una fusión de ALK conocida. Si el tubo de fusión es negativo, pero el tubo de tipo silvestre y el tubo de quinasa son positivos, entonces solamente está presente la ALK de tipo silvestre. Si los tubos de tipo silvestre y de reacción de fusión son negativos, pero el tubo de quinasa es positivo, entonces está presente una fusión desconocida previamente. Si el tubo de quinasa es negativo y el tubo de fusión o de tipo silvestre es positivo, no existe ALK funcional y la muestra de tejido no contiene un cáncer relacionado con ALK (véase la Figura 5A). Se entiende que midiendo el tamaño del amplicón, se puede determinar la identidad de una fusión de ALK o ALK de tipo silvestre particulares dentro de una muestra (véase la Figura 5B). Cuando un amplicón tiene un tamaño que no se asocia con una fusión de ALK o ALK de tipo silvestre particulares, entonces el amplicón representa una fusión de ALK previamente desconocida.

Sondas y cebadores de cambio fluorescente Las sondas de cambio fluorescente y los cebadores de cambio fluorescente se refieren a todas las sondas y cebadores que implican un cambio en la intensidad o longitud de onda de la fluorescencia en base a un cambio en la forma o conformación de la sonda o cebador y el ácido nucleico a ser detectado, ensayado o replicado. Los ejemplos de sondas y cebadores de cambio fluorescente incluyen balizas moleculares, Amplifluor, sondas FRET, sondas FRET escindibles, sondas TaqMan, cebadores Scorpion, oligos triplex fluorescentes que incluyen, a modo no taxativo, balizas moleculares triples o sondas FRET triples, polímeros conjugados solubles en agua fluorescentes, sondas PNA y sondas QPNA.

Las sondas y cebadores de cambio fluorescente pueden clasificarse de acuerdo con su estructura y/o función. Las sondas de cambio fluorescente incluyen sondas aplacadas de horquilla, sondas aplacadas de escisión, sondas activadas de escisión y sondas activadas fluorescentes. Los cebadores de cambio fluorescente incluyen cebadores aplacados de tronco y cebadores aplacados de horquilla.

Las sondas aplacadas de horquilla son sondas que cuando no están unidas a una secuencia objetivo forman una estructura de horquilla (y típicamente un bucle) que trae a una etiqueta fluorescente y a un resto de aplacamiento a la proximidad de tal modo que la fluorescencia a partir de la etiqueta se aplaca. Cuando la sonda se une a una secuencia objetivo, el tronco se interrumpe, el resto de aplacamiento no se encuentra más en proximidad a la etiqueta fluorescente y la fluorescencia aumenta. Ejemplos de sondas aplacadas de horquilla son balizas moleculares, oligos triplex fluorescentes, balizas moleculares triplex, sondas FRET triplex y sondas QPNA.

Las sondas activadas de escisión son sondas en las cuales la fluorescencia se aumenta mediante la escisión de la sonda. Las sondas activadas de escisión pueden incluir una etiqueta fluorescente y un resto de aplacamiento en proximidad de tal modo que la fluorescencia a partir de la etiqueta se aplaca. Cuando la sonda se corta o digiere, (típicamente mediante la actividad de exonucleasa 5'-3' de una polimerasa durante la amplificación), el resto de aplacamiento no se encuentra más en proximidad a la etiqueta fluorescente y la fluorescencia aumenta. Las sondas TaqMan son un ejemplo de las sondas activadas de escisión.

Las sondas aplacadas de escisión son sondas en las cuales la fluorescencia se disminuye o altera mediante la escisión de la sonda. Las sondas aplacadas de escisión pueden incluir una etiqueta fluorescente aceptora y un resto donante de tal modo que, cuando el aceptor y el donante se encuentran en proximidad, la transferencia de energía por resonancia fluorescente a partir del donante al aceptor hace que el aceptor fluorezca. Las sondas son por lo tanto fluorescentes, por ejemplo, cuando se hibridan con una secuencia objetivo. Cuando la sonda se corta o digiere, (típicamente mediante la actividad de exonucleasa 5'-3' de una polimerasa durante la amplificación), el resto donante no se encuentra más en proximidad a la etiqueta fluorescente del aceptor y la fluorescencia a partir del aceptor disminuye. Si el resto donante es en sí mismo una etiqueta fluorescente, puede liberar energía como fluorescencia (típicamente a una longitud de onda diferente que la fluorescencia del aceptor) cuando no se encuentra en proximidad a un aceptor. El efecto general entonces sería una reducción de la fluorescencia del aceptor y un aumento en la fluorescencia del donante. La fluorescencia del donante en el caso de las sondas aplacadas de escisión es equivalente a la fluorescencia generada por sondas activadas de escisión teniendo al aceptor como el resto de aplacamiento y al donante como la etiqueta fluorescente. Las sondas FRET escindibles (transferencia de energía por resonancia fluorescente) son un ejemplo de las sondas aplacadas de escisión.

Las sondas activadas fluorescentes son sondas o pares de sondas en las cuales la fluorescencia se aumenta o altera mediante la hibridación de la sonda con una secuencia objetivo. Las sondas activadas fluorescentes pueden incluir una etiqueta fluorescente aceptara y un resto donante de tal modo que, cuando el aceptor y el donante se encuentran en proximidad, (cuando la sondas se hibridan con una secuencia objetivo), la transferencia de energía por resonancia fluorescente a partir del donante al aceptor hace que el aceptor fluorezca. Las sondas activadas fluorescentes son típicamente pares de sondas diseñadas para hibridarse con secuencias adyacentes de tal modo que el aceptor y el donante se traigan a la proximidad. Las sondas activadas fluorescentes también pueden ser sondas únicas que contienen un donante y un aceptor donde, cuando la sonda no se híbrida con una secuencia objetivo, el donante y el aceptor no se encuentran en proximidad pero donde el donante y el aceptor se traen a proximidad cuando la sonda se híbrida con una secuencia objetivo. Esto puede lograrse, por ejemplo, colocando el donante y el aceptor en extremos opuestos de la sonda y colocando secuencias de complemento objetivo en cada extremo de la sonda donde las secuencias de complemento objetivo son complementarias a las secuencias adyacentes en una secuencia objetivo. Si el resto donante de una sonda activada fluorescente es en sí misma una etiqueta fluorescente, puede liberar energía como fluorescencia (típicamente a una longitud de onda diferente a la fluorescencia del aceptor) cuando no está en proximidad de un aceptor (es decir, cuando las sondas no se hibridan con una secuencia objetivo). Cuando las sondas se hibridan con una secuencia objetivo, el efecto general sería entonces una reducción de fluorescencia del donante y un aumento en la fluorescencia del aceptor. Las sondas FRET son un ejemplo de las sondas activadas fluorescentes.

Los cebadores aplacados de tronco son cebadores que cuando no se hibridan con una secuencia complementaria forman una estructura de tronco (ya sea en una estructura de tronco intramolecular o una estructura de tronco intermolecular) que trae a una etiqueta fluorescente y a un resto de aplacamiento a la proximidad de tal modo que la fluorescencia a partir de la etiqueta se > aplaca. Cuando el cebador se une a una secuencia complementaria, el tronco se interrumpe, el resto de aplacamiento no se encuentra más en proximidad a la etiqueta fluorescente y la fluorescencia aumenta. En el método divulgado, los cebadores aplacados de tronco se utilizan como cebadores para la síntesis de ácido nucleico y por lo tanto se incorporan al ácido nucleico sintetizado o amplificado. Ejemplos de cebadores aplacados de tronco son cebadores aplacados de ácido peptidonucleico y cebadores aplacados de horquilla.

Los cebadores aplacados de ácido peptidonucleico son cebadores asociados con un aplacador de ácido peptidonucleico o un flúor de ácido peptidonucleico para formar una estructura de tronco. El cebador contiene una etiqueta fluorescente o un resto de aplacamiento y se asocia ya sea con un aplacador de ácido peptidonucleico o un flúor de ácido peptidonucleico, respectivamente. Esto deja a la etiqueta fluorescente en proximidad del resto de aplacamiento. Cuando se replica el cebador, el ácido peptidonucleico se desplaza, permitiendo por lo tanto que la etiqueta fluorescente produzca una señal fluorescente.

Los cebadores aplacados de horquilla son cebadores que cuando no se hibridan con una secuencia complementaria forman una estructura de horquilla (y típicamente un bucle) que trae a una etiqueta fluorescente y a un resto de aplacamiento a la proximidad de tal modo que la fluorescencia a partir de la etiqueta se aplaca. Cuando el cebador se une a una secuencia complementaria, el tronco se interrumpe, el resto de aplacamiento no se encuentra más en proximidad de la etiqueta fluorescente y la fluorescencia aumenta. Los cebadores aplacados de horquilla se utilizan típicamente como cebadores para la síntesis de ácido nucleico y por lo tanto se incorporan al ácido nucleico sintetizado o amplificado. Ejemplos de cebadores aplacados de horquilla son los cebadores Amplifluor y los cebadores Scorpion.

Los cebadores activados por escisión son similares a las sondas activadas por escisión excepto que estos son cebadores que se incorporan a las hebras replicadas y entonces se escinden posteriormente.

Etiquetas Para ayudar en la detección y cuantificación de ácidos nucleicos producidos utilizando los métodos divulgados, las etiquetas pueden incorporarse directamente en nucleótidos y ácidos nucleicos o pueden acoplarse a moléculas de detección tales como sondas y cebadores. Como se utiliza en la presente, una etiqueta es cualquier molécula que puede asociarse con un nucleótido o ácido nucleico, directa o indirectamente y que resulta en una señal mensurable, detectable, ya sea directa o indirectamente. Muchas de esas etiquetas para incorporarse en nucleótidos y ácidos nucleicos o acoplarse a sondas de ácido nucleico son conocidas por aquellos expertos en la técnica. Ejemplos de etiquetas adecuadas para la utilización en el método divulgado son isótopos radiactivos, moléculas fluorescentes, moléculas fosforescentes, enzimas, anticuerpos y ligandos. Las etiquetas fluorescentes, especialmente en el contexto de sondas y cebadores de cambio fluorescente, son útiles para la detección o amplificación en tiempo real.

Ejemplos de etiquetas fluorescentes adecuadas incluyen isotiocianato de fluoresceína (FITC), 5,6-carboximetil fluoresceína, Texas Red, nitrobenz-2-oxa-1 ,3-diazol-4-ilo (NBD), cumarina, cloruro de dansilo, rodamina, amino-metil cumarina (AMCA), eosina, Eritrosina, BODIPY®, CASCADE BLUE®, OREGON GREEN®, pireno, lisamina, xantenos, acridinas, oxazinas, ficoeritrina, quelatos macrocíclicos de iones de lantánido tales como quantum dye™, colorantes de transferencia de energía fluorescente, tales como heterodímero de naranja de tiazol-etidio y los colorantes de cianina Cy3, Cy3.5, Cy5, Cy5.5 y Cy7. Ejemplos de otras etiquetas fluorescentes específicas incluyen 3-Hidroxipireno 5,8,10-Tri ácido sulfónico, 5-Hidroxi Triptamina (5-HT), Ácido de Fuchsin, Alizarina Compiexón, Rojo Alizarina, Aloficocianina, Aminocumarina, Estearato de Antroilo, Rojo Brillante Astrazón 4G, Naranja Astrazón R, Rojo Astrazón 6B, Amarillo Astrazón 7 GLL, Atabrina, Auramina, Aurofosfina, Aurofosfina G, BAO 9 (Bisaminofeniloxadiazol), BCECF, Sulfato de Berberina, Bisbenzamida, Solución Blancofor FFG, Blancofor SV, Bodipy F1 , Sulfoflavina Brillante FF, Azul calceína, Verde de Calcio, Solución Calcoflúor RW, Blanco Calcoflúor, Solución de Blanco Calcofor ABT, Solución Estándar de Blanco Calcofor, Carboestirilo, Amarillo Cascada, Catecolamina, Quinacrina, Corifosfina O, Cumarina-Faloidina, CY3.1 8, CY5.1 8, CY7, Dans (Ácido 1 -dimetil amino nafalina 5 sulfónico), Dansa (Ácido diamino naftil sulfónico), Dansilo NH-CH3, Diamino Fenil Oxidiazol (DAO), Ácido dimetillamino-5-sulfónico, Dipirrometenoboro Difluoruro, Flavina Brillante Difenilo 7GFF, Dopamina, Eritrosina ITC, Eucrisina, FIF (Fluorescencia inducida por Formaldehído), Naranja Flazo, Fluo 3, Fluorescamina, Fura-2, Rojo Brillante Genacril B, Amarillo Brillante Genacril 10GF, Rosado Genacril 3G, Amarillo Genacril 5GF, Ácido Gloxálico, Azul Granular, Hematoporfirina, lndo-1 , Cf Líquido Intrablanco, Leucofor PAF, Leucofor SF, Leucofor WS, Lisamina Rodamina B200 (RD200), Amarillo Lucifer CH, Amarillo Lucifer VS, Rojo Magdala, Azul Marina, Flavina Brillante Maxilon 10 GFF, Flavina Brillante Maxilon 8 GFF, MPS (Verde Metilo Pironina Estilbeno), Mitramicina, NBD Amina, Nitrobenzoxadidol, Noradrenalina, Rojo Rápido Nuclear, Amarillo Nuclear, Flavina Nylosan Brillante E8G, Oxadiazol, Azul Pacífico, Pararosanilina (Feulgen), Solución Phorwite AR, Phorwite BKL, Phorwite Rev, Phorwite RPA, Fosfina 3R, Ftalocianina, Ficoeritrina R, Ficoeritrina B, Negro Azul Poliazaindaceno Pontocromo, Porfirina, Primulina, Amarillo Procion, Pironina, Pironina B, Flavina Pirozal Brillante 7GF, Mostaza Quinacrina, Rodamina 123, Rodamina 5 GLD, Rodamina 6G, Rodamina B, Rodamina B 200, Rodamina B Extra, Rodamina BB, Rodamina BG, Rodamina WT, Serotonina, Rojo Brillante Sevron 2B, Rojo Brillante Sevron 4G, Rojo Brillante Sevron B, Naranja Sevron, Amarillo Sevron L, SITS (Primulina), SITS (Ácido Isotiosulfónico de Estilbeno), Estilbeno, Snarf 1 , sulfo Rodamina B Can C, Sulpfo Rodamina G Extra, Tetraciclina, Rojo Tiazina R, Tioflavina S, Tioflavina TCN, Tioflavina 5, Tiolita, Naranja Tiozol, Tinopol CBS, True Blue, Ultralite, Uranina B, Uvitex SFC, Naranja Xileno y XRITC.

La máxima absorción y emisión, respectivamente, de algunos de estos flúores son: FITC (490 nm; 520 nm), Cy3 (554 nm; 568 nm), Cy3.5 (581 nm; 588 nm), Cy5 (652 nm 672 nm), Cy5.5 (682 nm; 703 nm) y Cy7 (755 nm; 778 nm), permitiendo por lo tanto su detección simultánea. Otros ejemplos de colorantes de fluoresceína incluyen 6-carboxifluoresceína (6-FAM), 2',4', 1 ,4,-tetraclorofluorescelna (TET), 2',4',5',7',1 ,4-hexaclorofluoresceína (HEX), 2',7'-dimetox¡-4', 5'-dicloro-6-carboxyrodamina (JOE), 2'-cloro-5'-fluoro-7',8'-fusionado fenil-1 ,4-dicloro-6-carboxifluoresceína (NED) y 2'-cloro-7'-fenil-1 ,4-dicloro-6-carboxifluorescelna (VIC). Las etiquetas fluorescentes pueden obtenerse a partir de una variedad de Fuentes comerciales, incluyendo Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ; Molecular Probes, Eugene, OR; y Research Organics, Cleveland, Ohio.

Las etiquetas adicionales de interés incluyen aquellas que proporcionan señal solamente cuando la sonda con la cual se asocian se une específicamente a una molécula objetivo, donde dichas etiquetas incluyen: "balizas moleculares" como se describen en Tyagi & Kramer Nature Biotechnology (1996) 14:303 y EP 0 070 685 B1. Otras etiquetas de interés incluyen aquellas descritas en la Patente de Estados Unidos No. 5.563.037 la cual se incorpora a la presente a modo de referencia.

Los nucleótidos etiquetados son una forma de etiqueta que puede incorporarse directamente en los productos de amplificación durante la síntesis. Ejemplos de etiquetas que pueden incorporarse en ácidos nucleicos amplificados incluyen análogos de nucleótidos tales como BrdUrd, aminoalildesoxiuridina, 5-metilcitosina, bromouridina y nucleótidos modificados con biotina o con haptenos adecuados tales como digoxigenina. Los nucleótidos etiquetados con fluorescencia adecuados son Fluoresceína-isotiocianato-dUTP, Cianina-3-dUTP y Cianina-5-dUTP. Un ejemplo dé una etiqueta análoga de nucleótido para ADN es BrdUrd (bromodesoxiuridina, BrdUrd, BrdU, BUdR, Sigma-Aldrich Co). Otros ejemplos de análogos de nucleótidos para la incorporación de etiquetas en ADN son AA-dUTP (aminoalil-desoxiuridina trifosfato, Sigma-Aldrich Co.) y 5-metil-dCTP (Roche Molecular Biochemicals). Un ejemplo de un análogo de nucleótido para la incoporación de etiquetas en ARN es biotina-16-UTP (biotina-16-uridina-5'-trifosfato, Roche Molecular Biochemicals). La fluoresceína, Cy3 y Cy5 pueden enlazarse a dUTP para el etiquetado directo. Cy3.5 y Cy7 están disponibles como conjugados de avidina o anti-digoxigenina para una detección secundaria de sondas etiquetadas con biotina o digoxigenina.

Las etiquetas que se incorporan , en el ácido nucleico amplificado, tales como biotina, pueden detectarse posteriormente utilizando métodos sensibles bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, la biotina puede detectarse utilizando un conjugado de fosfatasa de estreptavidina alcalina (Tropix, Inc.), que se une a la biotina y posteriormente se detecta mediante la quimioluminiscencia de sustratos adecuados (por ejemplo, sustrato CSPD quimioluminiscente): disodio, 3-(4-metoxispiro-[l ,2,-dioxetano-3-2'-(5'-cloro)triciclo [3.3.1.13,7]decano]-4-il) fenil fosfato; Tropix, Inc.) Las etiquetas también pueden ser enzimas, tales como fosfatasa alcalina, peroxidasa de soja, peroxidasa de rábano picante y polimerasas, que pueden detectarse, por ejemplo, con amplificación de señal química o utilizando un sustrato para la enzima que produce luz (por ejemplo, un sustrato 1 ,2-dioxetano quimioluminiscente) o una señal fluorescente.

Las moléculas que combinan dos o más de estas etiquetas también se consideran etiquetas. Cualquiera de las etiquetas conocidas puede utilizarse con las sondas, etiquetas y métodos divulgados para etiquetar y detectar ácido nucleico amplificado utilizando el método divulgado. Los métodos para detectar y medir señales generadas por etiquetas también son conocidos por los expertos en la técnica. Por ejemplo, los isótopos radiactivos pueden detectarse mediante conteo de centelleo o visualización directa; las moléculas fluorescentes pueden detectarse con espectrofotómetros fluorescentes; las moléculas fosforescentes pueden detectarse con un espectrofotómetro o visualizarse directamente con una cámara; las enzimas pueden detectarse mediante la detección o visualización del producto de una reacción catalizado por la enzima; los anticuerpos pueden detectarse mediante la detección de una segunda etiqueta acoplada al anticuerpo. Como se utiliza en la presente, las moléculas de detección son moléculas que interactúan con el ácido nucleico amplificado y a las cuales se acoplan una o más etiquetas.

Se entiende y se contempla en la presente que un método de evaluar si un aumento en un ARNm particular o expresión de ARNm ha ocurrido o si un ARNm particular está presente es mediante comparación con una muestra testigo. Por lo tanto, en la presente se contemplan métodos para diagnosticar un cáncer ren un sujeto que comprende llevar a cabo una reacción de RT-PCR o PCR en ARNm a partir de una muestra de tejido del sujeto; en donde la reacción en cadena de polimerasa con transcripción inversa (RT-PCR) comprende un cebador inverso capaz de hibridarse específicamente con una o más secuencias de ALK y al menos un cebador directo; en donde un aumento en la cantidad del producto de amplificación con relación a . un testigo indica la presencia de un cáncer relacionado con ALK; y en donde el tejido testigo que se obtiene es un tejido no canceroso. Se entiende además que con respecto a los cánceres relacionados con ALK, puede utilizarse un testigo de tejido no canceroso pero no es necesario puesto que se puede utilizar también un tejido canceroso a partir de un cáncer no relacionado con ALK. Por lo tanto, en la presente se divulga el diagnóstico de un cáncer relacionado con la quinasa de linfoma anaplásico (ALK) en un sujeto que comprende llevar a cabo una reacción de RT-PCR en ARNm a partir de una muestra de tejido del sujeto; en donde la reacción en cadena de polimerasa con transcripción inversa (RT-PCR) comprende un cebador inverso capaz de hibridarse específicamente con una o más secuencias de ALK y al menos un cebador directo; y en donde un aumento en la cantidad del producto de amplificación con relación a un testigo indica la presencia de un cáncer relacionado con ALK; y en donde el tejido testigo se obtiene a partir de un tejido canceroso no relacionado con ALK.

Los métodos divulgados pueden utilizarse para diagnosticar cualquier enfermedad donde la proliferación celular descontrolada que ocurre en la presente se denomina "cáncer". Una lista no taxativa de los diferentes tipos de cánceres relacionados con ALK es la siguiente: linfomas (de Hodginks y de no Hodginks), leucemias, carcinomas, carcinomas de tejidos sólidos, carcinomas de células escamosas, adenocarcinomas, sarcomas, gliomas, gliomas de grado alto, blastemas, neuroblastomas, plasmocitomas, histiocitomas, melanomas, adenomas, tumores hipóxicos, mielomas, linfomas o sarcomas relacionados con el SIDA, cánceres metastásicos, o cánceres en general.

Una lista representativa pero no taxativa de los cánceres para los cuales pueden utilizarse los métodos divulgados para diagnosticar es la siguiente: linfoma, linfoma de células B, linfoma de células T, micosis fungoide, enfermedad de Hodgkin, leucemia mieloide, cáncer de vejiga, cáncer cerebral, cáncer del sistema nervioso, cáncer de cabeza y cuello, carcinoma de célula escamosa de cabeza y cuello, cáncer de riñón, cánceres pulmonares tales como cáncer pulmonar de células pequeñas y cáncer pulmonar de células no pequeñas, neuroblastoma/glioblastoma, cáncer de ovario, cáncer pancreático, cáncer de próstata, cáncer de piel, cáncer de hígado, melanoma, carcinomas de células escamosas de la boca, garganta, laringe y pulmón, cáncer de colon, cáncer cervical, carcinoma cervical, cáncer de mama y cáncer epitelial, cáncer renal, cáncer genitourinario, cáncer pulmonar, carcinoma esofágico, carcinoma de cabeza y cuello, cáncer de intestino grueso, cánceres hematopoyéticos; cáncer de testículo; cánceres de colon y de recto, cáncer prostático, o cáncer pancreático.

Por lo tanto, se divulgan en la presente métodos para diagnosticar un cáncer en donde el cáncer se selecciona del grupo que consiste en carcinoma pulmonar de célula no pequeña, linfoma de células B grandes difuso, histiocitosis sistémica, cáncer de mama, carcinoma colorrectal, carcinoma esofágico de células escamosas, linfoma anaplásico de células grandes, neuroblastoma y tumores miofibroblásticos inflamatorios (IMT). Por ejemplo, en la presente se divulgan métodos para diagnosticar un cáncer relacionado con la quinasa de linfoma anaplásico (ALK) en un sujeto que comprende llevar a cabo una reacción de RT-PCR en ARNm a partir de una muestra de tejido del sujeto; en donde la reacción en cadena de polimerasa con transcripción inversa (RT-PCR) comprende un cebador inverso capaz de hibridarse específicamente con una o más secuencias de ALK y al menos un cebador directo; en donde un aumento en la cantidad del producto de amplificación con relación a un testigo indica la presencia de un cáncer relacionado con ALK; y en donde el cáncer se selecciona del grupo que consiste en carcinoma pulmonar de células no pequeñas, linfoma de células B grandes difuso, histiocitosis sistémica, cáncer de mama, carcinoma colorrectal, carcinoma esofágico de células escamosas, linfoma anaplásico de células grandes, neuroblastoma y tumores miofibroblásticos inflamatorios (IMT).

Métodos para evaluar la adecuación de los tratamientos dirigidos a ALK Sin querer ceñirse a las teorías actuales, se cree que la inhibición de estas formas de genes ALK con candidatos de fármaco de molécula pequeña suprime la proliferación celular anormal y promueve la apoptosis en neuroblastoma y otras líneas celulares de tumor relacionadas con ALK; más aun, los modelos animales preclínicos y la experiencia clínica precoz con estos inhibidores indica que los inhibidores de molécula pequeña de ALK no solo poseen actividad antitumoral contra los cánceres relacionados con ALK, sino que también se toleran muy bien con toxicidades asociadas al objetivo no limitantes.

Estos descubrimientos destacan la necesidad de una prueba de diagnóstico especializada para las mutaciones de ALK. Por ejemplo, dicho ensayo puede usarse para someter a prueba a los niños de familias afectados con neuroblastoma hereditario para ayudar a facilitar la detección de tumores en una etapa precoz que es cuando los tumores están más apropiados para el tratamiento. Por consiguiente, en la presente se divulgan métodos para evaluar la adecuación de un tratamiento de inhibidor de ALK para un cáncer en un sujeto que comprende medir ARNm a partir de una muestra de tejido del sujeto; en donde un aumento en la cantidad de ARNm de secuencia de ALK con relación a un testigo indica un cáncer que puede tratarse con un inhibidor de ALK.

Se entiende y se contempla en la presente que cualquier técnica de medición de ARNm divulgada en la presente puede utilizarse en estos métodos. Por lo tanto, por ejemplo, se divulgan en la presente métodos para evaluar la adecuación de un tratamiento inhibidor de ALK para un cáncer en un sujeto que comprende llevar a cabo una reacción de RT-PCR con ARNm o reacción de PCR con ADN a partir de una muestra de tejido de un sujeto; en donde la reacción de RT-PCR comprende un cebador inverso capaz de hibridarse específicamente con una o más secuencias de ALK y al menos un cebador directo; y en donde un aumento en la cantidad del producto de amplificación con relación a un testigo indica un cáncer que puede tratarse con un inhibidor de ALK. También se entiende que los métodos divulgados pueden además comprender cualquier cebador divulgado en la presente y utilizar las técnicas PCR de multiplexación divulgadas.

Métodos para diagnosticar un cáncer relacionado con ALK desarrollado a partir de mutaciones puntuales de ALK y métodos para evaluar la resistencia a inhibidores de ALK.

La importancia del pronóstico y la relevancia para influir en las decisiones de la detección del tratamiento posterior de la enfermedad residual mínima (MRD) tras la terapia de cánceres relacionados con ALK puede mejorarse mediante un ensayo de diagnóstico altamente sensible y fácil de realizar tal como los que se proponen en la presente. Los estudios preclínicos han identificado un espectro de mutaciones puntuales de dominio de quinasa de ALK que confieren resistencia a inhibidores de molécula pequeña tales como NVP-TAE684 y PF-2341066. Dichos ensayos son conocidos por ser altamente predictivos de las mutaciones de resistencia al inhibidor clínicamente relevantes basadas en su utilización para la predicción de mutaciones que confieren resistencia a inhibidores tales como Gleevec que han sido utilizados clínicamente desde hace varios años ya.

Las presentes divulgaciones comprenden métodos y composiciones para ensayos de diagnóstico de ALK sensibles y específicos que pueden utilizarse para dirigir y apuntar selectivamente a la terapia de fármacos para los pacientes. Se pueden utilizar numerosas tecnologías de escaneo para las mutaciones desconocidas en los métodos divulgados en la presente tales como: cromatografía líquida de alto rendimiento de desnaturalización (dHPLC), escaneo de secuencia de escisión de base (BESS), polimorfismo de conformación de hebra única (SSCP), análisis heterodúplex (HA), electroforesis en gel sensible a la conformación (CSGE), electroforesis en gel de gradiente de desnaturalización (DGGE), electroforesis en gel de desnaturalización constante (CDGE), electroforesis en gel de gradiente de temperatura temporal (TTGE), polimorfismos de longitud de fragmento producidos por digestión de escisión (CFLP), escisión química de desajustes, escisión enzimática de desajustes y enzimas de reparación de desajustes. En un aspecto, se divulgan en la presente métodos para identificar cambios mutacionales de nucleótido único u otros cambios relacionados con el gen ALK util¡2:ando la tecnología de Intercambio de Plantillas y Reacción de Extensión (TEER™) para detectar mutaciones oncogénicas dentro de ALK o mutaciones que confieren resistencia al fármaco a los cánceres relacionados con ALK. La tecnología TEER™ puede identificar dichas mutaciones de ALK presentes en cánceres en etapas precoces y cánceres ALK resistentes al fármaco, incluyendo aun las mutaciones nuevas y raras. La tecnología TEER se describe en la Patente de Estados Unidos No. 6.610.486; Patente de Estados Unidos No. 6.150.105 y Solicitud de Estados Unidos No. 12/152.512 que se incorporan en la presente a modo de referencia en su totalidad por sus descripciones de la detección de la variación de nucleótidos.

Los métodos para la detección de una variación de ácido nucleico relacionada con ALK divulgados en la presente tienen mucho usos incluyendo pero no limitándose a la detección o diagnóstico de la presencia de una enfermedad o afección tal como el cáncer, evaluar la susceptibilidad o el riesgo para una enfermedad o afección asociados con una variación de ácido nucleico, el monitoreo del avance de la enfermedad y la determinación de la susceptibilidad o resistencia al tratamiento terapéutico.

Se entiende y se contempla en la presente que pueden existir casos en los cuales se distingue entre mutantes del mismo tipo (es decir, entre dos mutaciones puntuales o entre dos fusiones EML4-ALK). Por lo tanto, se entiende que cualquier método divulgado de diagnóstico de cáncer o evaluación de la adecuación de un tratamiento puede comprender además la secuenciación de cualquier amplicón que resulta a partir del método.

Métodos de detección sistemática Las fusiones de AL y mutaciones puntuales divulgadas en la presente son objetivos para los tratamientos del cáncer. Por lo tanto, se divulga en la presente un método para detectar sistemáticamente un agente que inhibe un cáncer relacionado con ALK en un sujeto que comprende a) obtener una muestra de tejido de un sujeto con un cáncer relacionado con ALK; b) poner en contacto la muestra de tejido con el agente c) extraer ARNm a partir de la muestra de tejido; d) llevar a cabo una reacción de RT-PCR en el ARNm a partir de la muestra de tejido; en donde la reacción de RT-PCR comprende un cebador inverso capaz de hibridarse específicamente con una o más secuencias de ALK y al menos un cebador directo; y en donde una disminución en la cantidad del producto de amplificación con relación a un testigo sin tratar indica un agente que puede inhibir un cáncer relacionado con ALK. Ácidos nucleicos El método y las composiciones divulgados utilizan varios ácidos nucleicos. Generalmente, se puede utilizar cualquier ácido nucleico en el método divulgado. Por ejemplo, los ácidos nucleicos de interés divulgados y los ácidos nucleicos de referencia divulgados pueden elegirse en base al análisis y la información deseados que se obtengan o evalúen. Los métodos divulgados también producen ácidos nucleicos nuevos y alterados La naturaleza y estructura de dichos ácidos nucleicos se establecerá mediante la manera en que se produzcan y manipulen en los métodos.

Por lo tanto, por ejemplo, se producen productos de extensión y ácidos nucleicos de hibridación en los métodos divulgados. Como se utiliza en la presente, los ácidos nucleicos de hibridación son híbridos de productos de extensión y el segundo ácido nucleico.

Se entiende y se contempla en la presente que un ácido nucleico de interés puede ser cualquier ácido nucleico para el cual se desea la determinación de la presencia o ausencia de la variación de nucleótido. Por lo tanto, por ejemplo, el ácido nucleico de interés puede comprender una secuencia que corresponde a la secuencia de tipo silvestre del ácido nucleico de referencia. Se divulga además en la presente que los métodos divulgados pueden llevarse a cabo donde el primer ácido nucleico es un ácido nucleico de referencia y el segundo ácido nucleico es un ácido nucleico de interés o donde el primer ácido nucleico es el ácido nucleico de interés y el segundo ácido nucleico es el ácido nucleico de referencia.

Se entiende y se contempla en la presente que un ácido nucleico de referencia puede ser cualquier ácido nucleico contra el cual se deberá comparar un ácido nucleico de interés. Típicamente, el ácido nucleico de referencia tiene una secuencia conocida (y/o se conoce que tiene una secuencia de interés como una referencia). Si bien no se requiere, es útil si la secuencia de referencia tiene una relación que se sabe o se sospecha cercana con el ácido nucleico de interés. Por ejemplo, si se desea detectar una variación única de nucleótido, la secuencia de referencia puede elegirse de manera útil para que sea una secuencia que es un homólogo o una coincidencia cercana al ácido nucleico de interés, tal como un ácido nucleico derivado a partir del mismo gen o elemento genético a partir del mismo organismo o individuo o uno relacionado. Por lo tanto, por ejemplo, se contempla en la presente que el ácido nucleico de referencia puede comprender una secuencia de tipo silvestre o alternativamente puede comprender una mutación conocida que incluye, por ejemplo, una mutación, cuya presencia o ausencia se asocia con una enfermedad o resistencia al tratamiento terapéutico. Por lo tanto, por ejemplo, se contempla que los métodos divulgados pueden utilizarse para detectar o diagnosticar la presencia de mutaciones conocidas en un ácido nucleico de interés mediante la comparación del ácido nucleico de interés con un ácido nucleico de referencia que comprende una secuencia de tipo silvestre (es decir, que se conoce que no posee la mutación) y el examen de la presencia o ausencia de variación en el ácido nucleico de interés, donde la ausencia de variación indicaría la ausencia de una mutación. Alternativamente, el ácido nucleico de referencia puede poseer una mutación conocida. Por lo tanto, por ejemplo, se contempla que los métodos divulgados pueden utilizarse para detectar la susceptibilidad para una enfermedad o afección mediante la comparación del ácido nucleico de interés con un ácido nucleico de referencia que comprende una mutación conocida que indica la susceptibilidad para una enfermedad y el examen de la presencia o ausencia de la mutación, en donde la presencia de la mutación indica una enfermedad.

En la presente, el término "variación del nucleótido" se refiere a cualquier cambio o diferencia en la secuencia de nucleótidos de un ácido nucleico de interés con relación a la secuencia de nucleótidos de un ácido nucleico de referencia. Por lo tanto, se dice que una variación de nucleótidos ocurre cuando las secuencias entre el ácido nucleico de referencia y el ácido nucleico de interés (o su complemento, según sea apropiado en el contexto) difieren. Por lo tanto, por ejemplo, una sustitución de una adenina (A) a una guanina (G) en una posición particular en un ácido nucleico serla una variación de nucleótidos dado que el ácido nucleico de referencia comprende una A en la posición correspondiente. Se entiende y se contempla en la presente que la determinación de una variación se basa en el ácido nucleico de referencia y no indica si una secuencia es de tipo silvestre o no. Por lo tanto, por ejemplo, cuando un ácido nucleico con una mutación conocida se utiliza como el ácido nucleico de referencia, se consideraría que un ácido nucleico que no posea la mutación (incluyendo un ácido nucleico de tipo silvestre) poseería una variación de nucleótidos (relativa al ácido nucleico de referencia).

Nucleótidos Los métodos y las composiciones divulgados utilizan varios nucleótidos. A través de esta solicitud y de los métodos divulgados en la presente se hace referencia al tipo de base para un nucleótido. Se entiende y se contempla en la presente que cuando se hace referencia al tipo de base, esto se refiere a una base que en un nucleótido en una hebra de ácido nucleico es capaz de hibridarse (unirse) con un conjunto definido de una o más bases canónicas. Por lo tanto, por ejemplo, cuando se hace referencia a productos de extensión extendidos en presencia de tres tipos de nucleótidos resistentes a la nucleasa y no en presencia de nucleótidos que comprenden el mismo tipo de base que los nucleótidos modificados, significa que si, por ejemplo, la base del nucleótido modificado era una adenina (A), los nucleótidos resistentes a la nucleasa pueden ser, por ejemplo, guanina (G), timina (T) y citosina (C). Cada una de estas bases (que representa las cuatro bases canónicas) es capaz de hibridarse con una base diferente de las cuatro bases canónicas y por lo tanto cada una califica como un tipo diferente de base como se define en la presente. En otro ejemplo, la base de inosina se aparea principalmente con adenina y citosina (en ADN) y por lo tanto puede considerarse como un tipo de base diferente a adenina y a citosina, -cuyas bases se aparean con timina y guanina, respectivamente- pero no un tipo de base diferente a guanina o timina -cuyas bases se aparean con citosina y adenina, respectivamente- porque el apareamiento de base de guanina y timina se superpone (es decir, no es diferente) al patrón de hibridación de inosina.

Cualquier tipo de base modificada o alternativa puede utilizarse en los métodos y composiciones divulgados, generalmente limitados solamente por las capacidades de las enzimas utilizadas para utilizar dichas bases. Se conocen muchos nucleótidos y bases modificados y alternativos, algunos de los cuales se describen a continuación y en cualquier otra parte de la presente. El tipo de base que dichas bases modificadas y alternativas representan puede determinarse mediante el patrón de apareamiento de base para dicha base como se describe en la presente. Por lo tanto, por ejemplo, si el nucleótido modificado fuera una adenina, cualquier base análoga, derivada, modificada, o variante que basó sus pares primariamente con timina sería considerada como el mismo tipo de base que la adenina. En otras palabras, mientras que el análogo, derivado, modificado o variante tenga el mismo patrón de apareamiento de base que otra base, se lo puede considerar como el mismo tipo de base. Se pueden realizar modificaciones a los grupos azúcar o fosfato de un nucleótido. Generalmente dichas modificaciones no cambiarán el patrón de apareamiento de base de la base. Sin embargo, el patrón de apareamiento de base de un nucleótido en una hebra de ácido nucleico determina el tipo de base de la base en el nucleótido.

Los nucleótidos modificados que deberán incorporarse en productos de extensión y eliminarse selectivamente mediante los agentes divulgados en los métodos divulgados pueden ser cualquier nucleótido modificado que funcione como se necesita en el método divulgado como se describe en cualquier otra parte de la presente. Los nucleótidos modificados también pueden producirse en hebras de ácido nucleico existentes, tales como productos de extensión, mediante, por ejemplo, modificación química, modificación enzimática, o una combinación.

Se conocen muchos tipos de nucleótidos resistentes a la nucleasa y pueden utilizarse en los métodos divulgados. Por ejemplo, los nucleótidos que tienen grupos fosfato modificados y/o grupos azúcar modificados pueden ser resistentes a una o más nucleasas. La resistencia a la nucleasa se define en la presente como la resistencia a la eliminación a partir de un ácido nucleico mediante una o más nucleasas. Generalmente, la resistencia a la nucleasa de un nucleótido particular puede definirse en términos de una nucleasa relevante. Por lo tanto, por ejemplo, si una nucleasa particular se utiliza en el método divulgado, los nucleótidos resistentes a la nucleasa solamente necesitan ser resistentes a dicha nucleasa particular. Los ejemplos de nucleótidos resistentes a la nucleasa útiles incluyen nucleótidos tiomodificados y nucleótidos boranomodificados.

Existe una variedad de moléculas divulgadas en la presente que están basadas en ácido nucleico. Los ejemplos no taxativos de estas y otras moléculas se describen en la presente. Se entiende que por ejemplo, un nucleótido es una molécula que contiene un resto de base, un resto de azúcar y un resto de fosfato. Los nucleótidos pueden enlazarse entre sí a través de sus restos de fosfato y restos de azúcar creando un enlace de internucleósidos. El resto de base de un nucleótido puede ser adenina-9-ilo (adenina, A), citosina-1 -ilo (citosina, C), guanin-9-ilo (guanina, G), uracil-1-ilo (uracilo, U) y timin-1-ilo (timina, T). El resto de azúcar de un nucleótido es una ribosa o desoxirribosa. El resto de. fosfato de un nucleótido es un fosfato pentavalente. Un ejemplo no taxativo de un nucleótido sería 3'-AMP (3'-adenosina monofosfato) o 5'-GMP (5'-guanosina monofosfato).

Un análogo de nucleótido es un nucleótido que contiene algún tipo de modificación a los restos de base, azúcar, o fosfato. Las modificaciones al resto de base incluirían modificaciones naturales y sintéticas de A, C, G y T/U así como también diferentes bases de purina o pirimidina, tales como uracil-5-ilo (?), hipoxantin-9-ilo (inosina, I) y 2-aminoadenin-9-ilo. Una base modificada incluye, a modo no taxativo, 5-metilcitosina (5-me-C), 5-hidroximetil citosina, xantina, hipoxantina, 2-aminoadenina, 6-metilo y otros derivados de alquilo de adenina y guanina, 2-propilo y otros derivados de alquilo de adenina y guanina, 2-tiouracilo, 2-tiotimina y 2-tiocitosina, 5-halouracilo y citosina, 5-propinil uracilo y citosina, 6-azo uracilo, citosina y timina, 5-uracilo (pseudouracilo), 4- tiouracilo, 8-halo, 8-amino, 8-tiol, 8-tioalquilo, 8-hidroxilo y otras adeninas y guanines 8-susitituidas, 5-halo en particular 5-bromo, 5-trifluorometilo y otros uracilos y citosinas 5- substituidos, 7-metilguanina y 7-metiladenina, 8-azaguanina y 8-azaadenina, 7-deazaguanina y 7-deazaadenina y 3-deazaguanina y 3-deazaadenina. Las modificaciones de base adicionales pueden encontrarse por ejemplo en la Patente de Estados Unidos No. 3.687.808, que se que se incorpora a la presente en su totalidad por sus enseñanzas de las modificaciones de base. Ciertos análogos de nucleótidos, tales como pirimidinas 5-sustituidas, 6-azapirimidinas y purinas N-2, N-6 y 0-6 sustituidas, incluyendo 2-aminopropiladenina, 5-propiniluracilo y 5-propinilcitosina. La 5-metilcitosina puede aumentar la estabilidad de la formación dúplex. A menudo las modificaciones de base de tiempo pueden combinarse por ejemplo con una modificación de azúcar, tal como 2'-0-metoxietilo, para lograr propiedades únicas tales como estabilidad dúplex aumentada. Existen numerosas patentes de Estados Unidos tales como 4.845.205; 5.130.302; 5.134.066; 5.175.273; 5.367.066; 5.432.272; 5.457.187; 5.459.255; 5.484.908; 5.502.177; 5.525.71 1 ; 5.552.540; 5.587.469; 5.594.121 , 5.596.091 ; 5.614.617; y 5.681.941 , que detallan y describen un rango de modificaciones de base. Cada una de estas patentes se incorpora a la presente a modo de referencia.

Los análogos de nucleótidos también pueden incluir modificaciones del resto de azúcar.

Las modificaciones al resto de azúcar incluirían modificaciones naturales de la ribosa y desoxirribosa así como también modificaciones sintéticas. Las modificaciones de azúcar incluyen, a modo no taxativo, las siguientes modificaciones en la posición 2': OH; F; O-, S- o N-alquilo; O-, S-o N-alquenilo; O-, S- o N-alquinilo; u O-alquilo-O-alquilo, en donde el alquilo, alquenilo y alquinilo pueden ser alquilo C1 a C10 o alquenilo y alquinilo C2 a C10 sustituidos o insustituidos. Las modificaciones de azúcar 2' también incluyen, a modo no taxativo, -0[(CH2)n 0]m CH3, -0(CH2)n OCH3, -0(CH2)n NH2, -0(CH2)n CH3, -0(CH2)n -ONH2 y -0(CH2)n0N[(CH2)n CH3)]2, donde n y m son de 1 hasta aproximadamente 10.

Otras modificaciones en la posición 2' incluyen a modo no taxativo: alquilo inferior C1 a C10, alquilo inferior sustituido, alcarilo, aralquilo, O-alcarilo o O-aralquilo, SH, SCH3, OCN, Cl, Br, CN, CF3, OCF3, SOCH3, S02 CH3, ON02, N02, N3, NH2, eterocicloalquilo, heterocicloalcarilo, aminoalquilamino, polialquilamino, sililo sustituido, un grupo de escisión de ARN, un grupo reportero, un intercalador, un grupo para mejorar las propiedades farmacocinéticas de un oligonucleótido o un grupo para mejorar las propiedades farmacodinámicas de un oligonucleótido y otros sustituyentes que tienen propiedades similares. También se pueden realizar modificaciones similares en otras posiciones en el azúcar, en particular la posición 3' del azúcar en el nucleótido terminal 3' o en los oligonucleótidos enlazados 2'-5' y la posición 5' del nucleótido terminal 5'. Los azúcares modificados también incluirían aquellos que contienen modificaciones en el oxígeno anular que forma un puente, tal como CH2 y S. Los análogos de azúcar de nucleótido también pueden tener miméticos de azúcar tales como restos de ciclobutilo en lugar del azúcar de pentofuranosilo. Existen numerosas patentes de Estados Unidos que describen la preparación de dichas estructuras de azúcar modificadas tales como 4.981.957; 5.118.800; 5.319.080; 5.359.044; 5.393.878; 5.446.137; 5.466.786; 5.514.785; 5.519.134; 5.567.81 1 ; 5.576.427; 5.591.722; 5.597.909; 5.610.300; 5.627.053; 5.639.873; 5.646.265; 5.658.873; 5.670.633; y 5.700.920, cada una de las cuales se incorpora a la presente a modo de referencia.

Los análogos de nucleótidos también pueden modificarse en el resto de fosfato. Los restos de fosfato modificados incluyen, a modo no taxativo, aquellos que pueden modificarse de tal modo que el enlace entre dos nucleótidos contiene un fosforotioato, fosforotioato quiral, fosforoditioato, fosfotriéster, aminoalquilfosfotriéster, metilo y otros fosfonatos de alquilo que incluyen 3 -alquileno fosfonato y fosfonatos quirales, fosfinatos, fosforamidatos que incluyen 3'-amino fosforamidato y aminoalquilfosforamidatos, tionofosforamidatos, tionoalquilfosfonatos, tionoalquilfosfotriésteres y boranofosfatos. Se entiende que estos enlaces de fosfatos o fosfatos modificados entre dos nucleótidos pueden estar a través de un enlace 3'-5' o un enlace 2'-5' y el enlace puede contener polaridad invertida tal como 3'-5' a 5'-3' o 2'-5' a 5'-2'. También se incluyen varias formas de sales, sales mixtas y ácidos libres. Numerosas patentes de Estados Unidos describen cómo realizar y utilizar nucleótidos que contienen fosfatos modificados e incluyen, a modo no taxativo, 3.687.808; 4.469.863; 4.476.301 ; 5.023.243; 5.177.196; 5.188.897; 5.264.423; 5.276.019; 5.278.302; 5.286.717; 5.321.131 ; 5.399.676; 5.405.939; 5.453.496; 5.455.233; 5.466.677; 5.476.925; 5.519.126; 5.536.821 ; 5.541.306; 5.550.111 ; 5.563.253; 5.571.799; 5.587.361 ; y 5.625.050, cada una de las cuales se incorpora a la presente a modo de referencia.

Se entiende que los análogos de nucleótidos solamente necesitan una modificación única, pero también pueden contener múltiples modificaciones dentro de uno de los restos o entre diferentes restos.

Los sustitutos de nucleótidos son moléculas que tienen propiedades funcionales similares a los nucleótidos, pero no contienen un resto de fosfato, tal como ácido peptidonucleico (PNA). Los sustitutos de nucleótidos son moléculas que reconocerán ácidos nucleicos de una manera Watson-Crick o Hoogsteen, pero los cuales se enlazan entre sí a través de un resto diferente a un resto de fosfato. Los sustitutos de nucleótidos son capaces de conformar una estructura de tipo doble hélice cuando interactúan con el ácido nucleico objetivo apropiado.

Los sustitutos de nucleótido son nucleótidos o análogos de nucleótido cuyos restos de fosfato y/o restos de azúcar han sido remplazados. Los sustitutos de nucleótido no contienen un átomo de fósforo convencional. Los sustitutos para el fosfato pueden ser, por ejemplo, enlaces de internucleósidos de alquilo o cicloalquilo de cadena corta, enlaces de internucleósidos mixtos de heteroátomo y alquilo o cicloalquilo, o uno o más enlaces de internucleósidos heteroatómicos o heterocíclicos de cadena corta. Estos incluyen aquellos que tienen enlaces morfolino (formados en parte a partir de la porción de azúcar de un nucleósido); estructuras principales de siloxano; estructuras principales de sulfuro, sulfóxido y sulfona; estructuras principales de formacetilo y tioformacetilo; estructuras principales que contienen alqueno, estructuras principales de sulfamato; estructuras principales de metilenimino y metilenhidrazino; estructuras principales de sulfonato y sulfonamida; estructuras principales de amida; y otros que tienen partes mixtas de componentes N, O, S y CH2. Numerosas patentes de Estados Unidos divulgan cómo realizar y utilizar estos tipos de reemplazos de fosfatos e incluyen, a modo no taxativo, 5.034.506; 5.166.315; 5.185.444; 5.214.134; 5.216.141 ; 5.235.033; 5.264.562; 5.264.564; 5.405.938; 5.434.257; 5.466.677; 5.470.967; 5.489.677; 5.541.307; 5.561.225; 5.596.086; 5.602.240; 5.610.289; 5.602.240; 5.608.046; 5.610.289; 5.618.704; 5.623.070; 5.663.312; 5.633.360; 5.677.437; y 5.677.439, cada una de las cuales se incorpora a la presente a modo de referencia.

También se entiende en un sustituto de nucleótido que los restos de azúcar y de fosfato del nucleótido pueden remplazarse, por ejemplo mediante un enlace de tipo amida (aminoetilglicina) (PNA). Las patentes de Estados Unidos 5.539.082; 5.714.331 ; y 5.719.262 describen cómo realizar y utilizar moléculas PNA, cada una de las cuales se incorpora a la presente a modo de referencia.

También es posible enlazar otros tipos de moléculas (conjugados) a nucleótidos o análogos de nucleótidos. Los conjugados pueden enlazarse químicamente al nucleótido o análogos de nucleótidos. Dichos conjugados incluyen, a modo no taxativo, restos de lípidos tales como resto de colesterol, ácido cólico, un tioéter, por ejemplo, hexil-S-tritiltiol, un tiocolesterol, una cadena alifática, por ejemplo, residuos de dodecandiol o undecilo, un fosfolípido, por ejemplo, di-hexadecil-rac-glicerol o trietilamonio 1 ,2-di-0-hexadecil-rac-glicero-3-H-fosfonato, una cadena de poliamina o una cadena de polietilenglicol, o ácido adamantano acético, un resto de palmitilo o un resto de octadecilamina o hexilamino-carbonil-oxicolesterol. Numerosas patentes de Estados Unidos describen la preparación de dichos conjugados e incluyen, a modo no taxativo, la patente de Estados Unidos Nos. 4.828.979; 4.948.882; 5.218.105; 5.525.465; 5.541.313; 5.545.730; 5.552.538; 5.578.717. 5.580.731 ; 5.580.731 ; 5.591.584; 5.109.124; 5.1 18.802; 5.138.045; 5.414.077; 5.486.603; 5.512.439; 5.578.718; 5.608.046; 4.587.044; 4.605.735; 4.667.025; 4.762.779; 4.789.737; 4.824.941 ; 4.835.263; 4.876.335; 4.904.582; 4.958.013; 5.082.830; 5.112.963; 5.214.136; 5.082.830; 5.1 12.963; 5.214.136; 5.245.022; 5.254.469; 5.258.506; 5.262.536; 5.272.250; 5.292.873; 5.317.098; 5.371.241. 5.391.723; 5.416.203. 5.451.463; 5.510.475; 5.512.667; 5.514.785; 5.565.552; 5.567.810; 5.574.142; 5.585.481 ; 5.587.371 ; 5.595.726; 5.597.696; 5.599.923; 5.599.928 y 5.688.941 , cada una de las cuales se incorpora a la presente a modo de referencia.

Una interacción Watson-Crick es al menos una interacción con la cara Watson-Crick de un nucleótido, análogo de nucleótido, o sustituto de nucleótido. La cara Watson-Crick de un nucleótido, análogo de nucleótido, o sustituto de nucleótido incluye las posiciones C2, N1 y C6 de un nucleótido, análogo de nucleótido o sustituto de nucleótido basado en purina y las posiciones C2, N3, C4 de un nucleótido, análogo de nucleótido, o sustituto de nucleótido basado en pirimidina.

Una interacción Hoogsteen es la interacción que ocurre en la cara Hoogsteen de un nucleótido o análogo de nucleótido, que se expone en el surco mayor del ADN dúplex. La cara Hoogsteen incluye la posición N7 y los grupos reactivos (NH2 u O) en la posición C6 de los nucleótidos de purina.

Hibridación/hibridación selectiva El término hibridación típicamente significa una interacción impulsada por una secuencia entre al menos dos moléculas de ácido nucleico, tales como un cebador o una sonda y un gen. La interacción impulsada por una secuencia significa una interacción que ocurre entre dos nucleótidos o análogos de nucleótidos o derivados de nucleótidos en un modo específica de nucleótidos. Por ejemplo, G interactuando con C o A interactuando con T son interacciones impulsadas por secuencias. Típicamente las interacciones impulsadas por secuencias ocurren en la cara Watson-Crick o Hoogsteen del nucleótido. La hibridación de dos ácidos nucleicos está afectada por un número de condiciones y parámetros conocidos por aquellos expertos en la técnica. Por ejemplo, las concentraciones de sal, pH y temperatura de la reacción afectarán si dos moléculas de ácido nucleico se hibridarán.

Los parámetros para la hibridación selectiva entre dos moléculas de ácido nucleico son bien conocidos por aquellos expertos en la técnica. Por ejemplo, en algunas realizaciones las condiciones de hibridación selectivas pueden definirse como condiciones de hibridación rigurosas. Por ejemplo, la rigurosidad de la hibridación está controlada, por la temperatura y la concentración de sal de alguna o de ambas etapas de hibridación y lavado. Por ejemplo, las condiciones de hibridación para lograr hibridación selectiva pueden implicar hibridación en una solución de alta fuerza iónica (6X SSC o 6X SSPE) a una temperatura que está aproximadamente 12-25°C por debajo de Tm (la temperatura de fusión a la cual la mitad de las moléculas se disocian de sus parejas de hibridación) seguido del lavado a una combinación de temperatura y concentración de sal elegida de tal modo que la temperatura de lavado sea aproximadamente 5°C a 20°C por debajo de Tm. Las condiciones de temperatura y sal fácilmente se determinan empíricamente en experimentos preliminares en los cuales las muestras de ADN de referencia inmovilizadas en filtros se hibridan con un ácido nucleico etiquetado de interés y luego se lavan bajo condiciones de rigurosidad diferentes. Las temperaturas de hibridación son típicamente más altas para las hibridaciones ADN-ARN y ARN-ARN. Las condiciones pueden utilizarse como se describió anteriormente para lograr la rigurosidad, o como se conoce en la técnica. Una hibridación rigurosa preferible para una hibridación ADN:ADN puede ser de aproximadamente 68°C (en solución acuosa) en 6X SSC o 6X SSPE seguido por un lavado a 68°C. La rigurosidad de la hibridación y lavado, si se desea, puede reducirse por consiguiente a medida que se disminuye el grado de complementariedad deseado y, además, dependiendo de la riqueza de G-C o A-T de cualquier área en donde se busca variabilidad. Del mismo modo, la rigurosidad de la hibridación y lavado, si se desea, puede aumentarse por consiguiente a medida que la homología deseada se aumenta y, además, dependiendo de la riqueza de G-C o A-T de cualquier área en donde se desea la alta homología, todo como se conoce en la técnica.

Otra manera de definir la hibridación selectiva es mirando la cantidad (porcentaje) de uno de los ácidos nucleicos unidos al otro ácido nucleico. Por ejemplo, en algunas realizaciones las condiciones de hibridación selectivas serían cuando al menos aproximadamente 60, 65, 70, 71 , 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81 , 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91 , 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100 por ciento del ácido nucleico limitante se una al ácido nucleico no limitante. Típicamente, el cebador no limitante, está por ejemplo, en un exceso de 10 o 100 o 1000 veces. Este tipo de ensayo puede realizarse en condiciones donde tanto el cebador limitante como el no limitante están por ejemplo, 10 veces o 100 veces o 1000 veces por debajo de su kd, o donde solamente una de las moléculas de ácido nucleico es 10 veces o 100 veces o 1000 veces o donde una o ambas moléculas de ácido nucleico están por encima de sus kd.

Otra manera de definir la hibridación selectiva es mirando el porcentaje de cebador que queda enzimáticamente manipulado bajo condiciones donde se requiere que la hibridación promueva la manipulación enzimática deseada. Por ejemplo, en algunas realizaciones las condiciones de hibridación selectiva serían cuando al menos aproximadamente 60, 65, 70, 71 , 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81 , 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91 , 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100 por ciento del cebador se manipula enzimáticamente bajo condiciones que promueven la manipulación enzimática, por ejemplo si la manipulación enzimática es una extensión de ADN, entonces las condiciones de hibridación selectiva serían cuando al menos aproximadamente 60, 65, 70, 71 , 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81 , 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91 , 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100 por ciento de las moléculas de cebador se extienden. Las condiciones también incluyen aquellas sugeridas por el fabricante o indicadas en la técnica como apropiadas para que la enzima realice la manipulación.

Al igual que con la homología, se entiende que existe una variedad de métodos en la presente divulgados para determinar el nivel de la hibridación entre dos moléculas de ácido nucleico. Se entiende que estos métodos y condiciones pueden proporcionar porcentajes diferentes de hibridación entre dos moléculas de ácido nucleico, pero a menos que se indique lo contrario, sería suficiente con que se cumplan los parámetros de cualquiera de los métodos. Por ejemplo si se requiriera un 80% de hibridación y siempre que la hibridación ocurra dentro de los parámetros requeridos en cualquiera de estos métodos divulgados que se consideran en la presente.

Se entiende que aquellos expertos en la técnica entienden que si una composición o método cumple con cualquiera de estos criterios para determinar la hibridación ya sea colectivamente o individualmente es una composición o método que se divulga en la presente.

Kits En la presente se divulgan kits que se retiran en reactivos que pueden utilizarse para practicar los métodos divulgados en la presente. En particular, los kits pueden incluir cualquier reactivo o combinación de reactivos descritos en la presente o que se entendería que se requieren o que son beneficiosos en la práctica de los métodos divulgados. Por ejemplo, los kits pueden incluir uno o más cebadores divulgados en la presente para realizar las reacciones de extensión, replicación y amplificación descritas en ciertas realizaciones de los métodos, así como las soluciones amortiguadoras y enzimas requeridas para utilizar los cebadores como se pretende.

Se entiende que para detectar una fusión relacionada con ALK, se puede utilizar un cebador inverso que se híbrida con una ALK de tipo silvestre. Por lo tanto, se divulgan en la presente kits que incluyen al menos un cebador inverso donde el cebador inverso se híbrida con una porción de ALK de tipo silvestre tal como el dominio de quinasa de ALK de tipo silvestre. Los ejemplos de cebadores inversos que pueden utilizarse en los kits divulgados incluyen, a modo no taxativo, SEQ ID NO. 7, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 56 y SEQ ID NO: 57. Adicionalmente, se entiende que los kits divulgados en la presente pueden incluir uno o más cebadores directos que se hibridan específicamente con una pareja de fusión de ALK o ALK de tipo silvestre. Por lo tanto, por ejemplo el cebador directo puede hibridarse con ALK de tipo silvestre, 5-aminoimidazol-4-carboxamida ribonucleótido formiltransferasa/IMP ciclo idrolasa (ATIC), cadena pesada de clatrina (CLTC), proteína 2 de unión a ran (RANBP2), SEC31 L1 , tropomiosina-3 (TPM3), tropomiosina-4 (TPM4), gen fusionado a TRK (Grande) (TFGL), gen fusionado a TRK (Pequeño) (TFGS), CARS, AL017, moesina (MSN), gen de cadena pesada de miosina no muscular (MYH9) o gen fusionado a TRK (Extra Grande) (TFGXL). Una lista no taxativa de cebadores directos que pueden utilizarse en los kits divulgados en la presente incluye, a modo no taxativo, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41 , SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51 , SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 55 y SEQ ID NO: 59. Un experto en la técnica podrá apreciar que es adecuado tener un kit que comprenda más de un solo par de cebadores y podría incluir, por ejemplo, un cebador inverso único, tal como SEQ ID NO: 7 y múltiples cebadores inversos. Por lo tanto, se contemplan específicamente en la presente kits que incluyen uno o más cebadores directos que se hibridan específicamente con ALK de tipo silvestre, 5-aminoimidazol-4-carboxamida ribonucleótido formiltransferasa/IMP ciclohidrolasa (ATIC), cadena pesada de clatrina (CLTC), proteína 2 de unión a ran (RANBP2), SEC31 L1 , tropomiosina-3 (TPM3), tropomiosina-4 (TPM4), gen fusionado a TRK (Grande) (TFGL), gen fusionado a TRK (Pequeño) (TFGS), CARS, AL017, moesina (MSN), gen de cadena pesada de miosina no muscular (MYH9) o gen fusionado a TRK (Extra Grande) (TFGXL) y al menos un cebador inverso, en donde el cebador inverso es un cebador inverso de ALK de tipo silvestre tal como SEQ ID NO. 7, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 57 y SEQ ID NO: 58.

Se entiende que los kits divulgados pueden también incluir testigos para asegurar que los métodos divulgados en la presente funcionen apropiadamente y para normalizar los resultados entre los ensayos. Por lo tanto, por ejemplo, se divulgan en la presente testigos ADNc positivos, testigos ADNc negativos y pares de cebadores testigos. Por ejemplo, los kits divulgados puede incluir pares de cebadores testigo para la detección de ATP sintasa de Homo sapiens, transporte de H+, complejo mitocondrial F1 , subunidad O (ATP50), ARNm de protelna mitocondrial codificadora de genes nucleares; NADH deshidrogenasa de Homo sapiens (ubiquinona) 1 alfa subcomplejo 2, 8kDa (NDUFA2), ARNm; Gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa de Homo sapiens (GAPDH), ARNm; histona H3 de Homo sapiens, familia 3A (H3F3A), ARNm; proteasoma de Homo sapiens (prosoma, macropain) subunidad, tipo beta, 4 (PSMB4), ARNm; proteína ribosómica S27a (RPS27A) de Homo sapiens, variante de transcrito 1 , ARNm; factor de iniciación de traducción eucariota 4A de Homo sapiens, isoforma 2 (EIF4A2), ARNm; protelna ribosómica de L18 (RPL18) de Homo sapiens, ARNm; adenosina deaminasa de Homo sapiens, específico de ARN (ADAR), variante de transcrito 1 , ARNm; o citocromo c oxidasa de Homo sapiens subunidad Vb (COX5B), ARNm. Ejemplos de pares de cebadores incluyen, a modo no taxativo, los pares de cebadores encontrados en la Tabla 1.

TABLA 1 Nombre Cebador sentido Cebador antisentido de la secuencia ATP50 GCGTTTCTCTCTTCCCACTC GGCATAGCGACCTTCAATACC (SEQ ID NO: 58) (SEQ ID NO: 68) NDUFA2 GCCTGAAGACCTGGAATTGG CTGACATAAGTGGATGCGAATC (SEQ ID NO: 59) (SEQ ID NO: 69) GAPDH GGAAGGTGAAGGTCGGAGTC GCTGATGATCTTGAGGCTGTTG (SEQ ID NO: 60) (SEQ ID NO: 70) H3F3A CCAGCCGAAGGAGAAGGG AGGGAAGTTTGCGAATCAGAAG (SEQ ID NO: 61 ) (SEQ ID NO: 71 ) PS B4 TACCGCATTCCGTCCACTC GCTCCTCATCAATCACCATCTG (SEQ ID NO: 62) (SEQ ID NO: 72) RPS27A CGGCAGTCAGGCATTTGG CCACCACGAAGTCTCAACAC (SEQ ID NO: 63) (SEQ ID NO: 73) EIF4A2 CTCTCCTTCGTGGCATCTATG GGTCTCCTTGAACTCAATCTCC (SEQ ID NO: 64) (SEQ ID NO: 74) RPL18 GGACATCCGCCATAACAAGG ACAACCTCTTCAACACAACCTG (SEQ ID NO: 65) (SEQ ID NO: 75) ADAR AGACGGTCATAGCCAAGGAG GCAGAGGAGTCAGACACATTG (SEQ ID NO: 66) (SEQ ID NO: 76) COX5B ACGCAATGGCTTCAAGGTTAC CGCTGGTATTGTCCTCTTCAC (SEQ ID NO: 67) (SEQ ID NO: 77) Adicionalmente, se entiende que los kits divulgados pueden incluir los otros reactivos y materiales para realizar los métodos divulgados tales como enzimas (por ejemplo polimerasas), soluciones amortiguadoras, tubos de reacción. Adicionalmente los kits también pueden incluir nucleótidos modificados, nucleótidos resistentes a nucleasa y o nucleótidos etiquetados. Adicionalmente, los kits divulgados también pueden incluir instrucciones para realizar los métodos divulgados en la presente y software para permitir el cálculo de la presencia de una mutación ALK.

En un aspecto, los kits divulgados pueden comprender material suficiente en un ensayo único llevado a cabo simultáneamente o separadamente para realizar los métodos para determinar si una muestra contiene un ALK de tipo silvestre, una fusión de ALK conocida, o una fusión de ALK previamente sin identificar. Los kits también pueden incluir material suficiente para realizar las reacciones testigo. Por lo tanto se divulga en la presente, en un aspecto, kits que comprenden un tubo de reacción testigo ADNc positivo, un tubo de reacción testigo ADNc negativo, un tubo de reacción de cebador testigo, un tubo de reacción para detectar fusiones de ALK conocidas, un tubo de reacción para detectar ALK de tipo silvestre y un tubo de reacción para detectar actividad de quinasa.

En otra configuración, el kit divulgado puede utilizarse para determinar el estatus de ALK -ya sea expresión de tipo silvestre, sobreexpresión de dominio de quinasa o sobreexpresión de mutación de fusión - con base en las mediciones realizadas en relación con los genes testigo internos. Se entiende que los genes testigo internos, descritos en otro lugar de la presente divulgación, se expresan establemente y constitutivamente independientemente de los factores de ciclo celular, de desarrollo o ambientales. Por lo tanto, en un aspecto, el estatus de ALK puede determinarse mediante una ecuación de ALK (numerador)/testigo interno (denominador) donde el cociente resultante es un rango de resultados que indican que los tejidos evaluados, líneas celulares u otras muestras son ALK positivas o ALK negativas. Entendiendo que ciertos tejidos expresan transcritos testigo internos a diferentes niveles, la proporción y el cociente determinados para indicar el estatus ALK positivo o negativo serán establecidos separadamente para cada tipo de tejido y espécimen.

Las composiciones divulgadas en la presente y las composiciones necesarias para llevar a cabo los métodos divulgados pueden realizarse utilizando cualquier método conocido por aquellos expertos en la técnica para ese reactivo o compuesto particular a menos que se indique específicamente lo contrario.

Síntesis de ácido nucleico Los ácidos nucleicos divulgados, tales como los oligonucleótidos que se utilizarán como cebadores' pueden realizarse utilizando métodos de síntesis química convencionales o pueden producirse utilizando métodos enzimátícos o cualquier otro método conocido. Dichos métodos pueden variar desde una digestión enzimática convencional seguida por un aislamiento de fragmento de nucleótidos a métodos puramente sintéticos, por ejemplo, mediante el método de fosforamidita de cianoetilo utilizando un sintetizador de ADN Milligen o Beckman System 1 Plus (por ejemplo, sintetizador automático modelo 8700 de Milligen-Biosearch, Burlington, MA o modelo ABI 380B).

Ejemplos Los siguientes ejemplos se establecen de modo de proporcionarles a aquellos expertos en la técnica una divulgación y descripción completas de cómo se realizan y evalúan los compuestos, composiciones, artículos, dispositivos y/o métodos reivindicados en la presente y se pretende que sean puramente a modo de ejemplo y no se pretende que limiten la divulgación. Se han realizado esfuerzos para asegurar la precisión con respecto a los números (por ejemplo, cantidades, temperaturas, etc.) pero deberían contemplarse algunos errores y desviaciones. Al menos que se indique lo contrario, las partes son partes en peso, la temperatura es en °C o es a temperatura ambiente y la presión es atmosférica o cercana a atmosférica.

A. Ejemplo 1 : Genes de fusión de ALK en malignidades hematológicas y tumores sólidos (linfoma anaplásico de células grandes, ALK + linfoma de células B grandes difuso, ALK+histiocitosis sistémica, sarcoma IMT, carcinoma pulmonar de células no pequeñas, carcinoma esofágico de células escamosas, cáncer de mama, carcinoma colorrectal).

Si bien las mutaciones puntuales de ALK ocurren en el neuroblastoma, las denominadas "fusiones de ALK" representan de hecho la mutación más común de esta tirosina quinasa (Figura 1 ). Los subconjuntos de cada uno de los tumores hematológicos (derivados del sistema sanguíneo) y sólidos listados anteriormente en el título son causados por fusiones de ALK. Como ejemplo, la nueva proteína de fusión EML4-ALK se encuentra en casi el 7% de los pacientes japoneses con carcinoma pulmonar de células no pequeñas. Para realizar la detección por RT-PCR de secuencias de fusión de ALK, se obtienen muestras de tejido de un sujeto con un cáncer. El ARNm se extrae a partir de las muestras de tejido. La reacción de RT-PCR utiliza al menos un cebador directo y un cebador inverso. La figura 2 muestra ejemplos de varios apareamientos de cebadores. Por ejemplo, el cebador directo puede ser un cebador de ALK intracelular (cebador 100) 5'ACTACTGCTTTGCTGGCAAGACCT (SEQ ID NO: 6); un cebador de fusión EML4-ALK extracelular (cebador 103) 5TGTTCAAGATCGCCTGTCAGCTCT (SEQ ID NO: 3), un cebador de fusión NPM-ALK extracelular (cebador 102) 5TCTGTACAGCCAACGGTTTCCCTT (SEQ ID NO: 4); un cebador de fusión CTLC-ALK extracelular (cebador 105) 5'GAGAGTGCTTTGGAGCTTGTCTGT (SEQ ID NO: 5); o un cebador de ALK de tipo silvestre extracelular a partir de una región de no homología (cebador 104) 5' TTCCTTCATCAGTCCACTGGGCAT (SEQ ID NO: 2). El cebador inverso puede ser el cebador 101 : 5' TCGTCCTGTTCAGAGCACACTTCA (SEQ ID NO: 7). La reacción de RT-PCR resulta en productos de amplificación (es decir, amplicones) de los tamaños que se muestran en la Tabla 2.

Tabla 2 Par de cebadores Producto de PCR Amplicón Tamaño (pb) 104/101 ' Wt (lntra y Extra) 615 100/101 Wt (Solamente Intra) 200 103/101 EML4-ALK v1 1740 103/101 E L4-ALK V2 2500 103/101 E L4-ALK v3a 920 103/101 EML4-ALK v3b 955 103/101 EML4-ALKv4 2490 103/101 EML4-ALKv5a 691 103/101 EML4-ALKv5b 577 102/101 NPM-ALK 410 105/101 CLTC-ALK 529 B. Ejemplo 2: Intercambio de Plantillas y Reacción de Extensión (TEER) El Intercambio de Plantillas y Reacción de Extensión (TEER) se refiere a una clase de métodos que pueden comparar una plantilla de ácido nucleico desconocida o sin secuenciar con una plantilla secuenciada para determinar si estas son idénticas. Se basa en el hecho de que los productos de secuenciación son únicos para la plantilla a partir de la cual se generan. Los métodos y composiciones divulgados implican formas particulares de TEER.

Originalmente el Intercambio de Plantillas y Reacción de Extensión (TEER) se desarrolló para detectar mutaciones desconocidas de célula germinal y somáticas presentes en estado homocigótico o heterocigótico. Esto se demostró mediante la electroforesis en gel de poliacrilamida seguido por la detección quimioluminiscente. El proceso se convirtió a un formato de detección basado en la microtitulación. En un formato de placa de microtitulación, tiene un rendimiento mucho más alto y puede utilizarse para detectar sistemáticamente el ADN para mutaciones rápidamente antes de la secuenciación de ADN. Como método de detección sistemática de secuencia, es útil para la detección sistemática de grandes poblaciones de muestra donde la probabilidad de mutación en un gen particular para una muestra dada era bastante baja. TEER detecta sistemáticamente las muestras rápidamente y marca aquellas que contenían una mutación de tal modo que podían secuenciarse para identificar la mutación.

Se mostró que TEER detecta mutaciones en un formato de microplaca. Los pocilios de microplaca recubiertos con estreptavidina se utilizan para acoplar un Producto de PCR biotinilado a la fase sólida. Las moléculas homo y heterodúplex se forman durante la hibridación en la fase sólida. Cada etapa del proceso se logra rápidamente en la placa de microtitulación, esto simplifica en gran medida el manejo y procesamiento de las muestras.

C. Ejemplo 3: Detección de inserciones y eliminaciones TEER puede detectar inserciones y eliminaciones rápidamente. Estas mutaciones crean un desajuste en el punto de la inserción/eliminación o solo 3' de la mutación (en la hebra de extensión de tipo silvestre) donde el marco de la secuencia está cambiado. La detección de estas mutaciones puede impedirse en áreas donde estén presentes extensiones largas del mismo nucleótido o secuencias de repetición. Por ejemplo, cuando una extensión es suficientemente larga, puede comenzar a formarse un bucle de horquilla de tal modo que la inserción o eliminación se exprime y puede no detectarse. Las inserciones o eliminaciones cerca del medio de estas extensiones son más problemáticas para detectar que aquellas en los extremos.

D. Ejemplo 4: Detección por PCR en tiempo real de la mutación seleccionada con TEER Durante la transición de la química a las microplacas, era evidente que TEER estaba seleccionando una señal muíante a través de la señal normal o de tipo silvestre. Estaba generando una señal a partir de un "mutante" de las 60 extensiones de base única "normales". El aumento en la señal del heterodúplex sobre el homodúplex no fue dramático, aproximadamente 4 veces, pero proporcionó pruebas de que el proceso estaba funcionando. Esto, junto con la necesidad de aumentar la señal a una proporción de ruido de detección de microplaca, a la determinación de si la PCR podría utilizarse para amplificar la mutación de tal modo que pueda caracterizarse además por la secuenciación de ADN. La utilización de PCR para amplificar la mutación primero permite una detección rápida y sensible de mutaciones raras. Las muestras que son positivas pueden secuenciarse para ubicar e identificar la mutación. Cada una de las 4 bases está dirigida en una reacción separada de modo que se analice cada base en la secuencia. Una vez que la selección TEER se ha producido, los cuatro productos de reacción a partir de una muestra pueden combinarse y analizarse en una reacción de detección por PCR en tiempo real.

La primera etapa en TEER es el intercambio de plantillas. El ADN de tipo silvestre amplificado con PCR que ha sido modificado aleatoriamente en una base específica se híbrida con un ADN amplificado a partir de una muestra con una posible mutación. El ADN dúplex tiene desajustes en un extremo para impedir la degradación con Exo III y el extremo opuesto tiene un extremo 3'en receso para permitir la ligación de un sonda enlazante para el acoplamiento de fase sólida. El enlazante asegura que todos los objetivos se hibriden con sus complementos y que sea un producto de extensión de longitud completa. Cualquier producto de extensión incompleta no será ligado y será fácilmente eliminado de la placa utilizando un lavado riguroso. El ADN heterodúplex se trata con enzimas o químicos que se escinden específicamente en el nucleótido modificado solamente en la hebra de tipo silvestre. La hebra complementaria que contiene potencialmente una mutación no queda afectada. Esto crea un subconjunto de sitios abásicos representativos de cada caso de la base en la secuencia. Esto es esencialmente una escalera de secuenciaciones, menos la base dirigida, en una plantilla de longitud completa intacta.

La siguiente etapa en TEER es una reacción de extensión con nucleótidos resistentes a exonucleasa. Aquí se utilizan los alfa-tionucleótidos. Se entiende y se contempla en la presente que también se pueden utilizar nucleótidos de boro. Se utiliza una mezcla de tres alfa-tio desoxinucleótidos trifosfatos (dNTPs) que representan las tres mutaciones de nucleótidos posibles, en la reacción de extensión con Thermosequenase. No está presente un dNTP que se ajusta a la base dirigida. Por ejemplo, cuando la timina (a través del uracilo) fue la base dirigida, entonces los nucleótidos de extensión serían alfa-tio dATP, dCTP y dGTP La exonucleasa III puede utilizarse para seleccionar mutaciones. Los productos de extensión terminados con tionucleótidos representan las mutaciones y son resistentes a la exonucleasa III. La plantilla de tipo silvestre desprotegida se degrada.

La hebra de tipo silvestre editada ahora contiene una copia de la mutación. A medida que la polimerasa se extiende por el ADN utiliza desplazamiento de hebra, o una exonucleasa de 5' a 3' dependiendo de la polimerasa, para avanzar al final de la plantilla mutante. Este proceso libera el dúplex mutante a partir de la fase sólida. El ADN liberado puede transferirse a partir de la microplaca directamente en una reacción de PCR en tiempo real.

La plantilla mutante seleccionada se amplifica específicamente utilizando un cebador directo fluorescente en tiempo real y un cebador inverso. Por ejemplo, puede utilizarse el colorante SYBR Green o un cebador de horquilla fluorogénico que fluoresce solamente luego de que ha sido extendido tal como un cebador LUX (Invitrogen, Carlsbad, CA). La utilización de sondas de hibridación internas para PCR en tiempo real tales como las sondas Taqman o FRET etiquetadas doblemente no se recomienda puesto que no se conoce el sitio de mutación.

E. Ejemplo 5: Diseño y fabricación de micromatriz En la presente se describe el desarrollo de un diagnóstico de micromatriz para la identificación de mutaciones de ALK específicas. En la presente se describe la fabricación de una micromatriz de ADN compuesta por 47 elementos únicos que son capaces de detectar 12 mutaciones posibles y ALK de tipo silvestre como un testigo interno. Se pueden buscar dos posibilidades empíricas para optimizar la sonda de ácido nucleico de entrada, incluyendo la transcripción inversa, o la transcripción inversa y PCR (RT-PCR). La viabilidad in vitro en base a la detección precisa de fusiones y variantes de ALK subclonadas puede demostrarse a partir de construcciones de plásmidos y utilizando varias líneas celulares de cáncer humano que contienen fusiones de ALK mutantes intermezcladas en un rango de proporciones con las líneas celulares que contienen ALK de tipo silvestre. Las mutaciones de ALK pueden identificarse a partir de especímenes de biopsia de cáncer pulmonar. El presente trabajo puede incluir estudios de comparación de patrones con las normas diagnósticas disponibles, un ensayo ALK FISH e inmunohistoquímica (IHC) anti-ALK. 1. Diseño de oligonucleótidos Se diseñó una estrategia para identificar mutaciones de ALK y sus subvariantes a través de la detección de regiones únicas 5' de parejas de fusión de ALK. En general, la estrategia se predicó sobre la transcripción inversa y la extensión y/o amplificación a partir de una región dentro de la región 3' intracelular de ARNm de ALK, a través del sitio de unión y a la porción 5' de la pareja de fusión. El ADNc generado o ADN amplificado son post-etiquetados con una fluorosonda enlazada covalentemente y sirven como entrada a la micromatriz. Dos sondas complementarias a diferentes regiones dentro de la región 5' de la pareja de fusión o ADNc de ALK, impresas por triplicado, sirven como ADN de captura de micromatriz. La posición de hibridación y la detección de señal identifican la presencia de ALK y/o mutaciones de ALK y sus expresiones con relación a un conjunto de diez transcritos testigo internos constitutivos (Figura 3 y Tabla 3).

Número de identificación Definición de secuencia ) ID NO: 15 ( () AAGCGSQTAE ELSQ4ALKE ID NO: 39- Secuencia de sonda ALV GCC4CTGAGTACa vriante 6 CGGGGCTTTATT ,, ELM4 TATGCTGGG 635ATA DirectoGGGGGC AAAAAT 606- ) 14L AK ( () V3BGSQ AE ID NO: 5QB EML4SE ID NO: 38- ALK GCCGCCTAGGA varate GGGCCinTATTTAA ,, EL4 AAACAGCCAAGT 632ecto GGG DirAATGGCCTT 594- TM(°C) )O3 N: 1 I ( () V3A2 GGCSQQTE ID EL4ALKSE ID NO: 37-- m a O en > Letra de identificación LG AK AAAGCGGCTTaate GGCCCGGT vrin 4ATAT Definición de secuencia ,, ELM4 AATCACTGTGCT 641 DectoGGCGG 59ir AATATTAT6- ))O:2 N 1 ALK 36 ( ( V3GSQQA ATTTE ID 3B EL ASEOM4A ID N:- ALK GGCTTTGGCTG vaateGCCGCCrin ATAATA Cebadores ,, EML4GGCGGC TTTAAA 642 Drecto ACCCGCCC 6iTAAT11- ) NO: 11 ALK ( ()Q V22 CCCGSQAAE ID 3A EL4SE ID NO: 35-- ALKCCGCCGGG AAA vaiate GCCGCCGGrnTAA ,, EML4 TATTGTACTTGT 631 DrectoCCGG 5i TTAATAAAT97- )O0 N: 1 TM(°C) (Q GTATSED I () CCGAACAACAASQ EML4ALKE ID NO: 34- ALKV2 CTGCGGCTATTC vaiante 2 AGGGCCGGrTATA ,, EML4 TACATCCCC 65AAA7 Directo AGCAGATAGGA 60T1- )O ID N: 9 (CCCQ AAACASE sesteilvr p () GCTACAGAGAC toSQO 33iE ID N: ALK GAAGAAGAACA deAe ALK d CTAAACGGCAAT ,, CLCCCGGT TATAAAAA 651 CebadoCGGCGGG0r TTTTA 64- )O 8 N: uesanivrl ( ()Q V1PRO ATGSEQTT ID ALKSE ID NO: 32 ALK GGCTTTGGCGeso deGCT invr AAAAGTAGTT ,, EML4 TGTGCTAAAGGC 645 Cebado GGCGCCGC 5rTTTA99- EML4- AGAGATATGCTG 60,6 I Directo AGAAATAGAGCA 60,6 ALK GATGAGCCCTG variante 7 CCAGGAGCTGCA V4-2 AGT (SEQ ID NO: EML4-ALK AG (SEQ ID NO: 16) 40) EML4- GGAGGATATGG 66,7 J Directo GCAGAGGCAATG 70,2 ALK AGATCCAGGGA NPM-ALK AATTACGAAGGC V5B GGCTTCCTGTAG (SEQ ID NO: 59) GAA (SEQ ID NO: 17) EML4- TGTGTAGTGCTT 64,1 K Directo TGCATCTCGTGAT 60,9 ALK CAAGGGCCAGG KIF5B- CGCAAACGCTA V5B-2 CT (SEQ ID NO: ALK (SEQ ID NO: 41 ) 18) EML4- TGTGTAGTGCTT 64,1 L Directo AAACTGAAAGAG 60,3 ALk V6 CAAGGGCCAGG TMP4- GCTGAGACCCGT CT (SEQ ID NO: ALK (SEQ ID NO: 42) 19) E L4- TGGGAAAGGAC 64,2 M Directo TCAGGAACAGCT 61 ,0 ALk V6- CTAAAGGAAGTG SN-ALK GGCCTTGGAAAT 2 GCCTGT (SEQ ID (SEQ ID NO: 43) NO: 20) EML4- CTGAAAGAGAAA 65,8 N Directo TTGTTTATGTGTA 59,8 ALK V7 TAGAGCACCAG CLTC-ALK CCGCCGGAAGC GAGCTGCAAGC (SEQ ID NO: 44) CAT (SEQ ID NO: 21) E L4- AGAAATAGAGCA 64,4 O Cebador TGTACCGCCGGA 65,3 ALK CCAGGAGCTGC de punto AGCACCAGGAG V7-2 AAGCCAT (SEQ de rotura (SEQ ID NO: 45) ID NO: 22) 3' KIF5B- CTATCAGCAAGA 65,0 Inverso C TTGCTCAGCTTGT 60,5 ALK AGTAGATCGCAT universal ACTCAGGGCT AAAGGAAGCAG (SEQ ID NO: 46) TCAGGTCA (SEQ ID NO: 23) KIF5B- ATGGCCAGAAG 64,7 Inverso B AGGGCTTCCATG 60,2 ALK 2 AGGGCATTCTG universal AGGAAATCCAGT CACAGATT (SEQ (SEQ ID NO: 47) ID NO: 24) MSN- TGACAGCTCGAA 63,9 Cebador TGTACCGCCGGA 65,3 ALK TCTCCCAGCTG F1 tubo 3 AGCACCAGGAG GAGAT (SEQ ID (punto de (SEQ ID NO: 48) NO: 25) rotura 3') MSN- TGGCCTTGGAAA 64,2 Cebador GATGAAATCACTG 72,5 ALK 2 TGGCAGAGCTG F2 tubo 4 TGCTAAAGGCGG ACA (SEQ ID NO: (Var 3A) C (SEQ ID NO: 49) 26) TMP4- CGTGCTGAATTT 64,0 Cebador GCAGACAAGCAT 56,3 ALK GCAGAGAGAAC F3 tubo 4 AAAGATGTCATCA GGTTGCA (SEQ (Var 3A) TC (SEQ ID NO: ID NO: 27) 50) TMP4- AAAGAGGCTGA 64,8 Cebador CCACACCTGGGA 61 ,1 ALK 2 GACCCGTGCTG F4 tubo 4 AAGGACCTAAAG AATTTGCA (SEQ (Var 6) G (SEQ ID NO: 51 ) ID NO: 28) NP - AATGTCTGTACA 63,5 Cebador TGCCATGCCCTAT 59,8 ALK GCCAACGGTTTC F8 tubo 4 TTCATCCAGGT CCTTGG (SEQ ID (CLTC) (SEQ ID NO: 52) NO: 29) NPM- AAG GTTGAAGTG 63,7 Cebador GCAGAGGCAATG 70,2 AL 2 TGGTTCAGGGC F9 tubo 4 AATTACGAAGGC CAGT (SEQ ID (NP ) (SEQ ID NO: 53) NO: 30) ALK de ATGTCACATGGA 64,6 Cebador F ACCCTGAAAGCC 69,7 tipo CCCTGAAAGCC tubo 5 ACAAGGTCATCT silvestre ACAAGGT (SEQ (tipo (SEQ ID NO: 54) ID NO: 31 ) silvestre) Inverso TCGTCCTGTTCA 60,1 Cebador F ACGCAATGGCTT 55,4 A de GAGCACACTTCA tubo 6 CAAGGTTAC (SEQ ALK (SEQ ID NO: 58) (tipo ID NO: 55) univers silvestre) al Cebador R CGCTGGTATTGTC 54,7 tubo 6 CTCTTCAC (SEQ (Cox5B) ID NO: 56) Cebador R AGGTCTTGCCAG 59,9 tubo 10 CAAAGCAGTAGTT (universal (SEQ ID NO: 57) inverso ALK) Sondas testigo internas Número de Nombre Longitud TM(°C) identificación 25 (ATP50) TGCGATGCTTCAGTACCTCTGTGGT 63,3 CAG (SEQ ID NO: 47) 26 (NDUFA2) CGACTTCGATATTAACAAGGATGGC 62,4 GGCG (SEQ ID NO:48) 27 (GAPDH) GGAAGGTGAAGGTCGGAGTCAACG 63,4 GATT (SEQ ID NO: 49) 28 (H3F3A) GTCCACTGAACTTCTGATTCGCAAA 62,3 CTTCCC (SEQ ID NO: 50) 29 (PS B4) TTTACCGCATTCCGTCCACTCCCGA 63,6 TT (SEQ ID NO: 51 ) 30 (RPS27A) CCAGGCTAGGGAGAGGAGAAACGA 62,9 AGTTC (SEQ ID NO: 52) 31 (EIF4A2) GCAACAGTTGGAGATTGAGTTCAAG 62, 1 GAGACC (SEQ ID NO: 53) 32 (RPL18) GCCAGAAGAACCAACTCCACATTCA 62,6 ACCAG (SEQ ID NO: 54) 33 (ADAR) ATCTGCGACTATCTCTTCAATGTGT 61 ,8 CTGACTCC (SEQ ID NO: 55) 34 (COX5B) CGGACGCAATGGCTTCAAGGTTACT 63,1 TCG (SEQ ID NO: 56) Definición Secuencia de sonda Definición de Cebadores de secuencia secuencia Tipo AGGATGGCGTCT Directo de tipo CTGAAAGCCACAAGGTCA silvestre CCTGCATTGTGTC silvestre TCTGCT (SEQ ID NO: 65) A (SEQ ID NO: 60) Rotura 3' TGTATGAAGGCCA Inverso de tipo CAATCATGATGCCGGAGA GGTGTCCGGAAT silvestre AAGCCA (SEQ ID NO: 66) (SEQ ID NO: 61 ) Cox 5B TCAGGCACCAGG Directo de AACTACTGCTTTGCTGGC GAAGACCCTAATT rotura 3' AAGACCTC (SEQ ID NO: T (SEQ ID NO: 62) 67) ADAR AACTCAGACCCAG Inverso de TCGTCCTGTTCAGAGCAC G I I I GGAACCTGA rotura 3' ACTTCA (SEQ ID NO: 7) (SEQ ID NO: 63) EIF4A2 TCCTTCGTGGCAT Directo Cox TGCAAAGAAGGGACTGG CTATGCTTACGGT 5B ACCCATA (SEQ ID NO: 68) (SEQ ID NO: 64) Inverso Cox TTGTC CTCTTC ACAG ATG 5B CAGCCT (SEQ ID NO: 69) Inverso ADAR AGACCAGACAGTCATAGC CAAGGA (SEQ ID NO: 70) Inverso ADAR AAGGCAGATGTGGAGTTG CTGTCT (SEQ ID NO: 71 ) Directo TATAACAGAGAACATGGC EIF4A2 GGCCCA (SEQ ID NO: 72) Cada sonda sintetizada se optimizó a una temperatura de fusión de 65°C y una región de hibridación única dentro de la pareja de fusión 5' de ALK utilizando el programa OLIGOANLYZER 3.1®. La temperatura de fusión y la longitud aproximada de 30 nucleótidos se seleccionaron en base a los informes de las condiciones optimizadas de micromatriz. Se ha agregado un enlazador 5' monometoxitritil amino C-6 a las sondas para permitir su purificación y conjugación a los portaobjetos de vidrio preparados. Este enlazante se seleccionó con base en la optimización química. Finalmente, se sintetizaron dos sondas para cada pareja de fusión de ALK, idealmente en diferentes regiones de la pareja de fusión, para proporcionar un método alternativo de identificación en caso que se impida que una sonda se una a una región mediante la restricción conformacional de la estructura terciaria de ADN. Estos criterios también se aplicaron al diseño de los testigos internos.

Cebadores de PCR Cada sonda sintetizada se optimizó nuevamente a una temperatura de fusión teórica de 60°C y regiones únicas de dentro de la pareja de fusión 5' y 3' del dominio intracelular de ALK utilizando el programa OLIGOANLYZER 3.1®. El cebador definido como "Cebador inverso de ALK universal" sirve como un cebador común para la etapa de transcripción inversa. Los otros cebadores listados permiten las etapas PCR posteriores y la amplificación de objetivos posibles. Estos criterios también se aplicaron al diseño de los testigos internos.

Optimización de cebadores de RT-PCR Los cebadores para RT-PCR fueron optimizados a una Tm de unión de 60°C para la generación de ADN objetivo posible. Estos cebadores fueron optimizados como reacciones de amplicón únicas; sin embargo, muchas o algunas pueden lotearse para permitir la multiplexación de ADN objetivo posible. La Figura 4 muestra la electroforesis en gel de los ADN objetivo amplificado a partir de cada variante y fusión de ALK de interés. El protocolo de amplificación de PCR utilizó 35 ciclos con 95°C durante 15 min; 94°C durante 30s; 52°C durante 1 min; 72°C durante 1 min; 72°C durante 15min y 4°C.

Será evidente para aquellos expertos en la técnica que se pueden realizar varias modificaciones y variaciones en la presente invención sin apartarse del alcance o espíritu de la invención. Otras realizaciones de la invención serán evidentes para aquellos expertos en la técnica a partir de la consideración de la especificación y práctica de la invención divulgada en la presente. Se pretende que las especificaciones y ejemplos se consideren como ejemplares solamente, con un alcance y espíritu verdaderos de la invención indicados por las reivindicaciones siguientes.

Se entiende que los métodos y composiciones divulgados no se limitan a la metodología, protocolos y reactivos particulares descritos, puesto que estos pueden variar. También se entenderá que la terminología utilizada en la presente tiene el propósito de describir realizaciones particulares solamente y no pretende limitar el alcance de la presente invención, la cual quedará limitada solamente por las reivindicaciones adjuntas.

A través de la descripción y las reivindicaciones de la presente memoria descriptiva, la palabra "comprender" y sus variaciones, tales como "que comprende" y "comprende", significa "incluye, a modo no taxativo" y no pretende excluir, por ejemplo, otros aditivos, componentes, números enteros o etapas.

Los expertos en la técnica reconocerán, o serán capaces de determinar mediante la simple utilización de experimentos de rutina, numerosos equivalentes para las realizaciones específicas del método y las composiciones descritos en la presente. Se pretende que dichos equivalentes estén abarcados por las siguientes reivindicaciones.

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Claims (48)

REIVINDICACIONES

1. Un método para diagnosticar un cáncer relacionado con la quinasa de linfoma anaplásico (ALK) que comprende detectar la presencia o medir la cantidad de ácido nucleico asociado con una variación de ácido nucleico, truncamiento o fusiones de ALK a partir de una muestra de tejido del sujeto; en donde un aumento en la cantidad del producto de amplificación o sonda etiquetada con relación a un testigo indica la presencia de un cáncer relacionado con ALK.

2. El método de la reivindicación 1 , en donde el ácido nucleico se mide mediante la medición de niveles de ARNm mediante la realización de una primera reacción en cadena de polimerasa con transcripción inversa (RT-PCR) en la muestra.

3. El método de la reivindicación 1 , en donde el ácido nucleico se mide mediante micromatriz.

4. El método de la reivindicación 2 o 3, en donde la reacción de RT-PCR o micromatriz comprende la utilización de un cebador inverso capaz de hibridarse específicamente con una o más secuencias de ALK y al menos uno o más cebadores directos.

5. El método de la reivindicación 4, en donde el cebador inverso se une a ALK.

6. El método de la reivindicación 5, en donde el cebador inverso es SEQ ID NO. 7, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 57 o SEQ ID NO: 58.

7. El método de la reivindicación 4, en donde al menos uno o más cebadores directos se hibridan con ALK de tipo silvestre, gen de cadena pesada de quinesina-1 (KIF5B), 5-aminoimidazol-4-carboxamida ribonucleótido formiltransferasa/IMP ciclohidrolasa (ATIC), cadena pesada de clatrina (CLTC), proteína 2 de unión a Ran (RANBP2), SEC31 L1 , tropomiosina-3 (TPM3), tropomiosina-4 (TPM4), gen fusionado a TRK (Grande) (TFGL), gen fusionado a TRK (Pequeño) (TFGS), CARS, AL017, moesina (MSN), gen de cadena pesada de miosina no muscular (MYH9) o gen fusionado a TRK (Extra Grande) (TFGXL).

8. El método de la reivindicación 7, en donde dichos uno o más cebadores directos comprenden al menos un cebador directo seleccionado del grupo que consiste en SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41 , SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51 , SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 55 y SEQ ID NO: 59.

9. El método de la reivindicación 8 que comprende dos o más, tres o más, cuatro o más, cinco o más, seis o más, siete o más, ocho o más, nueve o más, diez o más, once o más, doce o más, trece o más, catorce o más o quince o más cebadores directos.

10. El método de la reivindicación 4, en donde la micromatriz comprende, además, la utilización de una o más sondas seleccionadas del grupo que consiste en SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 , SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21 , SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30 o SEQ ID NO: 31.

1 1. El método de la reivindicación 1 , en donde el cáncer se selecciona del grupo que consiste en neuroblastoma, cáncer de mama, cáncer de ovario, carcinoma colorrectal, carcinoma pulmonar de células no pequeñas, linfoma de células B grandes difuso, carcinoma esofágico de células escamosas, linfoma anaplásico de células grandes, neuroblastoma, tumores miofibroblásticos inflamatorios, histiocitosis maligna y glioblastomas.

12. El método de la reivindicación 1 1 , en donde el cáncer es un neuroblastoma que tiene una o más mutaciones puntuales asociadas con ALK seleccionadas del grupo que consiste en V476A, M1166R, A1 168P, 11 171 , F1 174I, F1 174L, R1 192P, F1245C, F1245V, F1245L, F1245I, H250T y R1275Q.

13. El método de la reivindicación 11 , en donde el cáncer es un cáncer colorrectal que tiene una o más mutaciones puntuales asociadas con ALK seleccionadas del grupo que consiste en R401 Q, A1 168P V757M.

14. El método de la reivindicación 11 , en donde el cáncer es un cáncer de mama que tiene una mutación puntual asociada con ALK y en donde la mutación puntual es L560F.

15. El método de la reivindicación 11 , en donde el cáncer es un cáncer de ovario que tiene una mutación puntual asociada con ALK y en donde la mutación puntual es A877S.

16. El método de la reivindicación 1 que comprende, además, detectar la presencia de una variación de ácido nucleico, truncamiento o fusiones de ALK a partir de la muestra de tejido utilizando intercambio de plantillas y reacción de extensión (TEER).

17. El método de la reivindicación 2 que comprende, además, una segunda reacción de RT-PCR, en donde la segunda reacción de RT-PCR comprende la utilización de un cebador inverso capaz de hibridarse específicamente con una o más secuencias de ALK y al menos uno o más cebadores directos capaces de hibridarse específicamente con ALK de tipo silvestre.

18. El método de la reivindicación 17 que comprende, además, una tercera reacción de RT-PCR, en donde la tercera reacción de RT-PCR comprende un cebador directo y un cebador inverso que se hibridan específicamente con las secuencias ALK 5' y 3' del dominio de quinasa de ALK.

19. El método de la reivindicación 18, en donde al menos uno de los cebadores directos se híbrida específicamente con la proteína 4 similar a proteína asociada a microtúbulos equinodermos (EML4) o nucleofosmina (NPM).

20. Un método para detectar la presencia de la desregulación de una quinasa de ALK que comprende obtener una muestra de tejido de un sujeto, detectar la presencia o ausencia de una o más fusiones de ALK, detectar la presencia o ausencia de ALK de tipo silvestre y detectar la presencia o ausencia de un dominio de quinasa de ALK.

21. El método de la reivindicación 20, en donde el cáncer se selecciona del grupo que consiste en neuroblastoma, cáncer de mama, cáncer de ovario, carcinoma colorrectal, carcinoma pulmonar de células no pequeñas, linfoma de células B grandes difuso, carcinoma esofágico de células escamosas, linfoma anaplásico de células grandes, neuroblastoma, tumores miofibroblásticos inflamatorios, histiocitosis maligna y glioblastomas.

22. El método de la reivindicación 20, en donde el cáncer es un neuroblastoma que tiene una o más mutaciones puntuales asociadas con ALK seleccionadas del grupo que consiste en V476A, M1166R, A1 168P, 11 171 N, F1 174I, F1 174L, R1 192P, F1245C, F1245V, F1245L, F1245I, I1250T y R1275Q.

23. El método de la reivindicación 20, en donde el cáncer es un cáncer colorrectal que tiene una o más mutaciones puntuales asociadas con ALK seleccionadas del grupo que consiste en R401 Q, A1 168P y V757M.

24. El método de la reivindicación 20, en donde el cáncer es un cáncer de mama que tiene una mutación puntual asociada con ALK y en donde la mutación puntual es L560F.

25. El método de la reivindicación 20, en donde el cáncer es un cáncer de ovario que tiene una mutación puntual asociada con ALK y en donde la mutación puntual es A877S.

26. El método de la reivindicación 20, en donde el polinucleótido o polipéptido de ALK codificado por el polinucleótido sé detecta mediante RT-PCR o micromatriz.

27. El método de la reivindicación 26, en donde la reacción de RT-PCR o micromatriz comprende la utilización de un cebador inverso capaz de hibridarse específicamente con una o más secuencias de ALK y al menos uno o más cebadores directos capaces de hibridarse específicamente con una pareja de fusión de ALK conocida.

28. El método de la reivindicación 27, en donde el cebador inverso es SEQ ID NO. 7, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 57 o SEQ ID NO: 58.

29. El método de la reivindicación 27, en donde la pareja de fusión de ALK se selecciona del grupo que consiste en 5-aminoimidazol-4-carboxamida ribonucleótido formiltransferasa/IMP ciclohidrolasa (ATIC), gen de cadena pesada de quinesina-1 (KIF5B), cadena pesada de clatrina (CLTC), proteína 2 de unión a Ran (RANBP2), SEC31 L1 , tropomiosina-3 (TPM3), tropomiosina-4 (TPM4), gen fusionado a TRK (Grande) (TFGL), gen fusionado a TRK (Pequeño) (TFGS), CARS, AL017, moesina (MSN), gen de cadena pesada de miosina no muscular (MYH9) o gen fusionado a TRK (Extra Grande) (TFGXL).

30. El método de la reivindicación 27, en donde al menos uno o más cebadores directos comprenden al menos un cebador directo seleccionado del grupo que consiste en SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41 , SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51 , SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53 y SEQ ID NO: 59.

31. El método de la reivindicación 26, en donde la reacción de RT-PCR o micromatriz comprende la utilización de un cebador directo y un cebador inverso capaces de hibridarse específicamente con ALK de tipo silvestre.

32. El método de la reivindicación 31 , en donde el cebador directo se selecciona del grupo que consiste en SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 54 y SEQ ID NO: 55.

33. El método de la reivindicación 31 , en donde el cebador inverso se selecciona del grupo que consiste en SEQ ID NO:7, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 57 o SEQ ID NO: 58.

34. El método de la reivindicación 26, en donde la reacción de RT-PCR o micromatriz comprende la utilización de un cebador directo y un cebador inverso capaces de hibridarse específicamente con dominio de quinasa de ALK.

35. El método de la reivindicación 31 , en donde el cebador directo se selecciona del , grupo que consiste en SEQ ID NO: 45 y SEQ ID NO: 48.

36. El método de la reivindicación 31 , en donde el cebador inverso se selecciona del grupo que consiste en SEQ ID NO:7, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 57 o SEQ ID NO: 58.

37. Un método para detectar sistemáticamente un agente que inhibe un cáncer relacionado con ALK en un sujeto que comprende a) obtener una muestra de tejido de un sujeto con un cáncer relacionado con ALK; b) poner en contacto la muestra de tejido con el agente c) extraer ARNm a partir de la muestra de tejido; d) llevar a cabo una reacción de RT-PCR en el ARNm a partir de la muestra de tejido; en donde la reacción de RT-PCR comprende un cebador inverso capaz de hibridarse específicamente con una o más secuencias de ALK y al menos un cebador directo; y en donde una disminución en la cantidad del producto de amplificación en relación con un testigo sin tratar indica un agente que puede inhibir un cáncer relacionado con ALK.

38. Un kit para diagnosticar un cáncer relacionado con ALK que comprende (a) un primer cebador etiquetado con un primer reactivo de detección, en donde dicho primer cebador es un cebador inverso, en donde dicho cebador inverso es uno o más polinucleótidos que se hibridan con un primer polinucleótido que codifica la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO 1 o su complemento; / (b) al menos un segundo cebador, en donde dicho segundo cebador es un cebador directo, en donde dicho segundo cebador directo es uno o más polinucleótidos que se hibridan con un segundo polinucleótido que codifica 5-aminoimidazol-4-carboxamida ribonucleótido formiltransferasa/IMP ciciohidrolasa (ATIC), gen de cadena pesada de quinesina-1 (KIF5B), cadena pesada de clatrina (CLTC), proteína de unión a Ran 2 (RANBP2), SEC31 L1 , tropomiosina-3 (TPM3), tropomiosina-4 (TPM4), gen fusionado a TRK (Grande) (TFGL), gen fusionado a TRK (Pequeño) (TFGS), CARS, AL017, moesina (MSN), gen de cadena pesada de miosina no muscular (MYH9), gen fusionado a TRK (Extra Grande) (TFGXL), proteína 4 similar a proteína asociada a microtúbulos equinodermos (EML4) o nucleofosmina (NPM).

39. El kit de la reivindicación 38, en donde el cebador inverso es SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 57 o SEQ ID NO: 58.

40. El kit de la reivindicación 38, en donde al menos uno o más cebadores directos comprenden al menos un cebador directo seleccionado del grupo que consiste en SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41 , SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51 , SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 55 y SEQ ID NO: 59.

41. El kit de la reivindicación 38 que comprende dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once, doce, trece, catorce, quince o más cebadores directos que se hibridan específicamente con uno o más de 5-aminoimidazol-4-carboxamida ribonucleótido formiltransferasa/IMP ciciohidrolasa (ATIC), gen de cadena pesada de quinesina-1 (KIF5B), cadena pesada de clatrina (CLTC), proteína de unión a Ran 2 (RANBP2), SEC31 L1 , troponniosina-3 (TPM3), tropomiosina-4 (TPM4), gen fusionado a TRK (Grande) (TFGL), gen fusionado a TRK (Pequeño) (TFGS), CARS, AL017, moesina (MSN), gen de cadena pesada de miosina no muscular (MYH9), gen fusionado a TRK (Extra Grande) (TFGXL), proteína 4 similar a proteína asociada a microtúbulos equinodermos (EML4) o nucleofosmina (NPMJ.

42. El kit de la reivindicación 38 que comprende, además, un cebador directo que se híbrida específicamente con ALK de tipo silvestre.

43. El kit de la reivindicación 42, en donde el cebador directo se selecciona del grupo que consiste en SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 54 y SEQ ID NO: 55.

44. El kit de la reivindicación 38 que comprende, además, un cebador directo que se híbrida específicamente con el dominio de quinasa de ALK.

45. El kit de la reivindicación 44, en donde el cebador directo se selecciona del grupo que consiste en SEQ ID NO: 45 y SEQ ID NO: 48.

46. El kit de la reivindicación 38 que comprende, además, un par de cebadores testigo.

47. El kit de la reivindicación 46, en donde el par de cebadores testigo se híbrida específicamente con COX5B.

48. El kit de la reivindicación 38, en donde el primer y segundo cebador se etiquetan con un primer y segundo reactivo de detección, respectivamente.