MX2011007882A - HOMOLOGOS-PEPTIDO NOVEDOSO PARA INHIBIR ANTICUERPOS ß1- ADRENOCEPTORES. - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a mutantes ciclopéptidos homólogos ß-AR novedosos que comprenden solo dos residuos cisteína capaces de formar un enlace intramolecular y que comprenden un residuo de ácido a-aminobutírico (ABu), o su análogo, que reemplaza el residuo cisteína que corresponde a la cisteína 216 de la secuencia de aminoácidos ß1-AR humana. La presente invención además se refiere a péptidos lineales que pueden formar estos mutantes ciclopéptidos y a las moléculas de ácido nucleico que codifican péptidos de los cuales pueden fabricarse estos mutantes ciclopéptidos y péptidos lineales. Aún más, vectores que comprenden las moléculas de ácido nucleico y células hospederas recombinantes que comprenden las moléculas de ácido nucleico o vectores se proporcionan. Además, se proporciona un método para producir los mutantes ciclopéptidos descritos. Además se describe una composición que comprende el o los péptidos, la o las moléculas de ácido nucleico, el o los vectores o células hospederas de la invención. La presente invención también se refiere a medios terapéuticos y de diagnóstico, métodos y usos que aprovechan el o los péptidos de la invención y a medios, métodos y usos para detectar anticuerpos receptores anti-ß-adrenérgicos, en particular anticuerpos receptores anti-ß1-adrenérgicos.

Description

HOMÓLOGOS-PÉPTIDO NOVEDOSOS PARA INHIBIR ANTICUERPOS ß?- ADRENOCEPTORES La presente invención se refiere a novedosos mutantes ciclopéptidos homólogos ß-AR que comprenden solo dos residuos cisteína capaces de formar un enlace intramolecular Y que comprenden un residuo de ácido alfa oí-aminobutírico (ABu) , o un análogo del mismo, que reemplaza al residuo cisteína que corresponde a la cisteína 216 de la secuencia de proteínas ß?-AR humana. La presente invención además se refiere a péptidos lineales que pueden formar estos mutantes ciclopéptidos y a moléculas de ácido nucleico que codifican péptido de los cuales pueden fabricarse estos mutantes ciclopéptido y péptidos lineales. Aún más, se proporcionan vectores que comprenden las moléculas de ácido nucleico y células hospederas recombinantes que comprenden las moléculas de ácido nucleico o vectores. Además, se proporciona un método para producir los mutantes ciclopéptidos descritos. Adicionalmente, se describe una composición que comprende el o los péptidos, la o las moléculas de ácido nucleico, el o los vectores o la o las células hospederas de la invención. La presente invención también se refiere a medios terapéuticos y de diagnóstico, a métodos y usos que aprovechan el o los péptidos de la invención y a los medios, métodos y usos para detectar anticuerpos receptores anti-ß-adrenérgicos , en particular anticuerpos receptores anti-ß?- adrenérgicos .

La falla de bomba y dilatación cardiaca progresiva de etiología desconocida se ha denominado cardiomiopatía dilatada "idiopática" (DCM = Dilated Cardiomyopathy) (Ric ardson 1996 Circulation, 93, 841-842). DCM representa una de las causas principales de falla cardiaca severa con una incidencia anual de hasta 100 pacientes y una prevalencia de 300-400 pacientes por millón (reporte AHA 2007) .

En la actualidad, la gran mayoría de DCM se considera que surge de una infección inicial (primordialmente viral) que lleva a miocarditis aguda, que ante activación del sistema inmune puede progresar a miocarditis autoinmune (crónica) que resulta en dilatación cardiaca y severa falla cardiaca congestiva; esta última progresión ocurre particularmente cuando está asociada (a) con el desarrollo de autoanticuerpos contra distintas proteínas de membrana o de sarcolemma de miocitos, que son esenciales para función cardiaca (Freedman 2004, Jahns 2006) , o (b) con inflamación crónica del miocardio y persistencia viral (Kühl 2005) . Estos recientes hallazgos son además reforzados por el hecho de que, pacientes con DCM a menudo tienen alteraciones tanto en inmunidad humoral como celular (Jahns 2006, Limas 1997, Luppi 1998, Mahrholdt 2006) . Bajo estas condiciones, puede proceder una reacción inflamatoria aguda inicial en un tipo de inflamación de bajo grado (MacLellan 2003), lo que facilita el desarrollo de respuestas anormales o aberrantes al activador infeccioso primario (Freedman 2004, Kühl 2005, MacLellan and Lusis 2003, Maekawa 2007, Smulski 2006) .

En el contexto de su respuesta humoral, un número sustancial de pacientes de -DCM se ha encontrado que desarrollan anticuerpos de reacción cruzada y/o autoanticuerpos a diversos antígenos cardiacos .

Homologías entre' moléculas de superficie de miocitos tales como receptores de membrana y proteínas virales o bacterianas, se han propuesto como un mecanismo para la elaboración de autoanticuerpos cardiacos endógenos por mimetismo de antígeno (Hoebeke 1996, Mobini 2004) . La enfermedad cardiaca de Chagas, una cardiomiopatía inflamatoria de lenta evolución, es uno de los ejemplos más prominentes para este mecanismo (Elies 1996, Smulski 2006) . Otro mecanismo-probablemente más relevante-que lleva a la producción de autoanticuerpos cardiacos endógenos sería la lesión cardiaca primaria seguida por liberación (súbita o crónica) de una "cantidad crítica" de determinantes de antígeno del citoplasma o membrana de miocito, previamente ocultos al sistema inmune. Esta lesión muy probablemente ocurre ante infecciones agudas (miocarditis), falla cardiaca tóxica o isquémica (infarto al miocardio) que resulta en necrosis o apoptosis de miocitos (Caforio 2002, Rose 2001) . Presentación de autoantígenos de miocardio al sistema inmune puede entonces inducir una respuesta autoinmune, que en el peor caso resulta en perpetuación de daño de miocitos inmuno-mediado, que involucra ya sea respuestas inmunes celulares (por ejemplo célula T) o humorales (por ejemplo células B) , o coactivación tanto del sistema inmune adaptativo e innato (Eriksson 2003, Rose 2001).

Desde un punto de vista patofisiológico, se ve razonable el ligar el potencial nocivo (por ejemplo que induce cardiomiopat a) de un autoanticuerpo especifico deL corazón a la accesibilidad y a la relevancia funcional del objetivo correspondiente. Receptores de superficie de miocitos son fácilmente accesibles a los autoanticuerpos (Okazaki 2005) . Los dos candidatos más promisorios son el ß?-AR cardiaco (que representa el subtipo adrenoceptor predominante en el corazón) y el receptor acetilcolina M2-muscarínico; contra ambos autoanticuerpos receptores se han detectado en pacientes de DCM (Fu 1993, Jahns 1999b, Matsui 1995). Mientras que anticuerpos antimuscarínicos (que exhiben una acción tipo agonista en el receptor M2 acetilcolina cardiaco) han sido primordialmente asociados con efectos cronotrópicos negativos a nivel sinoatrial (por ejemplo, disfunción del nodo de seno, fibrilación atrial (Baba 2004, Wang. 1996)), anticuerpos anti- i-AR agonísticos se han asociado tanto con la ocurrencia de arritmia severa a nivel ventricular (Christ 2001, Iwata 2001a) , como el desarrollo de hipertrofia ventricular izquierda (maladaptativa) , finalmente conmutando a agrandamiento ventricular izquierdo y falla cardiaca progresiva (Iwata 2001b, Jahns 1999b, Khoynezhad 2007) . Ambos autoanticuerpos parecen estar dirigidos contra el segundo bucle extraeelular de los receptores respectivos . Para generar una respuesta autoinmune, proteínas de membrana de miocitos (por ejemplo receptores) deben ser degradadas a pequeños oligopéptidos capaces de formar un complejo con una molécula MHC o HLA clase II del hospedero (Hoebeke 1996) . En el caso del análisis basado en computadora del ß?-AR humano para tramos de aminoácidos inmunogénicos potenciales ha mostrado que la única porción de la molécula receptora que contiene los epítopos de células B y T y que son accesibles a anticuerpos fue de hecho el segundo bucle receptor extraeelular pronosticado (ß?-ECn) (Hoebeke 1996). Esto puede explicar el uso exitoso de segundos péptidos de bucle para la generación de anticuerpos receptores específicos ß? en diferentes modelos de animales (Iwata 2001b, Jahns. 2000, Jahns 1996). Aún más, en la última década, varios grupos han demostrado independientemente que segundos anticuerpos de bucle, de preferencia reconocen ß?-AR nativos intactos en diversos ensayos inmunológicos (ELISA de células enteras, inmunoprecipitación, inmunoflourescencia) , indicando que son "conformacionales" (Hoebeke 1996, Jahns 2006) . La prueba funcional reveló que los mismos anticuerpos también afectan la función receptora, tal como producción de cAMP intracelular y/o actividad de proteína quinasa dependiente de cAMP (PKA) , sugiriendo que pueden actuar como reguladores alostéricos de actividad ß?-AR (Jahns 2000, Jahns 2006) , lo que está soportado por los datos recientes en la estructura detallada de la proteína ß?-AR de pavo por Warne et al. (2008 Nature, 454: 486-491) .

Siguiendo los postulados de Witebsky (Witebsky 1957) , la evidencia indirecta para la etiología autoinmune de una enfermedad, requiere la identificación del activador (por ejemplo el autoantígeno responsable) e inducción de una inmunorespuesta dirigida, por autoantígeno en un animal experimental, que entonces debe desarrollar una enfermedad similar. Evidencia directa sin embargo requiere reproducción de la enfermedad por transferencia de anticuerpos patogénicos homólogos o células T autoreactivas de uno a otro animal de la misma especie (Rose 1993) .

Para analizar el potencial patogenético de anticuerpos anti-pi-AR, Jahns et al., ha seleccionado un enfoque in vivo experimental que cumple con los criterios Witebsky para evidencia directa de enfermedades autoinmunes . DCM se induce por inmunización de ratas procreadas contra ß?-ECII (100% de homología de secuencia entre humanos y ratas, evidencia indirecta) ; entonces la enfermedad se reproduce en animales sanos por transferencia isogénica de "autoanticuerpos" anti-ß?-?? de rata (evidencia directa) (Jahns 2004) . Los animales desarrollaron dilatación y disfunción ventricular izquierda (LV = Left Ventricular) progresiva, una disminución relativa en espesor de pared LV y regulación por disminución selectiva de ß?-AR, una característica que también se ve en DCM humana (Lohse 2003).

Estos resultados, junto con un efecto a corto plazo tipo agonista de los anticuerpos in vivo (Jahns 2004) , sugiere que tanto los fenotipos cardiomiopáticos inducidos como los transferidos, pueden atribuirse primordialmente a la activación de receptor leve pero sostenida que se logra por anticuerpos anti-Pi-AR estimulatorios (Jahns 2008) . Esta hipótesis es soportada por el gran cuerpo de datos disponibles en los efectos cardiotóxicos de activación ß?-AR excesiva y/o de largo plazo que se ve después de manipulación genética o farmacológica (Engelhardt 1999, Woodiwiss 2001) . Por lo tanto, la cardiomiopatía inmune dilatada (DiCM = Dilated Immune-Cardiomyo-Pathy) anti-Pi-AR puede considerarse como una entidad de enfermedad patogenética por sí misma, junto con otras enfermedades autoinmunes dirigidas al receptor establecidas tales como miastenia gravis o enfermedad de Grave (Freedman 2004, Hershko 2005, Jahns 2004, Jahns 2006) .

La importancia clínica de autoanticuerpos cardiacos es difícil de estimar, ya que bajos títulos de estos anticuerpos también pueden ser detectados en la población sana, como parte del repertorio inmunológico natural (Rose 2001) . Sin embargo, respecto a anticuerpos anti- i-AR funcionalmente activos datos previos de Jahns et al . , han demostrado que su prevalencia es casi despreciable en individuos sanos (<1%) siempre que un procedimiento de criba o supervisión en sistemas celulares que presentan el blanco (por ejemplo ß?-AR) en su conformación natural se utilice (Jahns 1999b). Al emplear el último método de criba, la ocurrencia de autoanticuerpos anti-Pi-AR también puede excluirse en pacientes con falla cardiaca hipertensiva o valvular crónica (Jahns 1999a) . En contraste, la prevalencia de estimular anti- i-AR fue -10% en cardiomiopatía isquémica (ICM) y -30% en cardiomiopatía dilatada (DCM) (Jahns 1999b), que fue significativamente superior que en controles sanos, pero en el intervalo menor de reportes previos en colectivas DCM (33% a 95% de prevalencia) (Limas 1992, Magnusson 1994, allukat 1995) . Parece concebible que diferencias en métodos de criba dirigidos a detectar autoanticuerpos anti- i-AR funcionalmente activos, muy probablemente toman en cuenta el amplio intervalo de prevalencias reportadas en el pasado (Limas 1992). De hecho, solo una fracción menor de autoanticuerpos anti-p-AR humanos definidos por ELISA fue capaz de ligar a ß-AR nativa ubicada en superficie celular. Solo esta fracción de ß?-AR humana reconocida (como se determina por inmunoflourescencia) y activada (como se determina por aumentos en actividad celular cAMP y/o PKA) en la membrana de células eucarióticas intactas (Jahns 2000, Ja ns 1999b) . Por lo tanto, sistemas celulares que presentan el blanco en su conformación natural, representan una herramienta esencial en la criba para autoanticuerpos anti-ß-AR relevantes funcionalmente (Nikolaev 2007, Jahns 2008) .

Clínicamente, la presencia de autoanticuerpos anti-ß?-AR en DCM se ha mostrado que está asociada con una función cardiaca más severamente deprimida (Jahns 1999b) , la ocurrencia de arritmia ventricular más severa (Chiale 2001), y una incidencia superior de muerte cardiaca súbita (Iwata 2001a) . Recientes datos que comparan pacientes de DCM anticuerpos positivos con anticuerpos negativos sobre un periodo de seguimiento mayor a 10 años no solo confirma una superior prevalencia de arritmia ventricular en la presencia de activación de sino también revela que la positividad de anticuerpos pronostica un riesgo de mortalidad cardiovascular incrementado casi triple (Stórk 2006) . En conjunto, los datos clínicos disponibles subrayan la relevancia patofisiológica de anticuerpos funcionalmente activos en DCM (Jahns 2008) .

Una estrategia farmacológica generalmente aceptada en la actualidad sería el uso de agentes beta bloqueadores, a fin de atenuar o incluso abolir los efectos estimulatorios ? mediados por autoanticuerpos, al menos si ß-bloqueadores pueden sin duda evitar la activación inducida por anticuerpo de ß?-AR (Freedman 2004 , Jahns 2000 , Matsui 2001 , Jahns 2006 ) . Nuevos enfoques terapéuticos actualmente incluyen eliminación de anti-Pi-AR estimulatorios por inmunoadsorción no selectiva o selectiva (Hershko 2005 , Wallukat 2002 ) , o hacer blanco directo de los anticuerpos anti- i-ECu y/o las células B que producen anti-Pi-ECu mismas, (esto es, inducción de tolerancia inmune) (Anderton 2001 ) . La inmunoadsorción no selectiva sin embargo, debido a un riesgo de infección incrementado después de agotamiento inmunológico, requiere la sustitución de igG humano, en base a seguridad (Félix 2000 ) con todos los efectos secundarios posibles de proteínas humanas sustituidas que se conocen en la técnica incluyendo severas reacciones anafilácticas y muerte .

WO 01 / 21660 describe ciertos péptidos homólogos a epítopos del Io y 2 o bucles de ß?-AR, y propone aplicar estos péptidos a intervención médica de cardiomiopatía dilatativa (DCM = Dilatative Cardiomyopathy) . Incluso si WO 01 / 21660 menciona marginalmente que pueden modificarse péptidos a fin de protegerlos contra proteasas de suero, por ejemplo por ciclización, no se dan ejemplos y modalidades correspondientes y no se muestra cualquier efecto in vi tro o in vivo de los péptidos propuestos en el curso de DCM o en el curso de títulos del receptor-anticuerpo. Aún más, en WO 01/21660 pretende basarse en los enfoques de inmunoadsorción no selectivos anteriormente mencionados que contienen los riesgos mencionados correspondientes.

Los ciclopéptidos ß?-ECn homólogos recientemente desarrollados (por ejemplo, ß?-ECn-CPs) se emplearon seis semanas después de la inducción activa de anticuerpos anti-ß?-ECn estimulatorios . ß?-ECn-CPs son ciclopéptidos que contienen 3 residuos cisteína (Cys) y por lo tanto pueden formar enlaces intramoleculares, con lo que hay una opción potencial por formar dos enlaces intramoleculares diferentes (además de la ciclización entre el extremo N- y C-), individualmente. ß?-ECn-CP reduce en forma significativa la cantidad de anticuerpos en circulación y evita efectivamente el desarrollo de dilatación y disfunción cardiaca (Boivin 2005) . Los ß?-ECn-CPs anteriormente mencionados también se describieron en WO 2006/103101.

En vista de la técnica presente, el problema técnico subyacente a la presente invención es el proporcionar medios y métodos mejorados y que se obtengan fácilmente para la intervención médica de enfermedades relacionadas a anticuerpos anti-ß-??. En particular a anticuerpos anti-ß?-ECu .

El problema técnico se resuelve por el suministro de las modalidades caracterizadas en las reivindicaciones.

De acuerdo con esto, en un primer aspecto, la presente invención se refiere a mutantes-ciclopéptidos homólogos ß-AR (también denominados aquí como "péptidos cíclicos" o "ciclopéptidos" y semejantes) , en particular a mutantes-ciclopéptidos homólogos ß?-AR, es decir mutantes ciclopéptidos homólogos ß?-ECn ( ß?-ECn-CPs ) . Estos péptidos cíclicos/mutantes ciclopéptidos se caracterizan estructuralménte porgue son capaces de formar sólo un enlace disulfuro intramolecular individual y que imitan/remedan casi en forma perfecta la conformación estérica tridimensional de (el o los epítopos presentados en) las regiones de enlace y reconocimiento de anticuerpo nativas de ß?-ECn.

En particular, en el primer aspecto, la presente invención se refiere a un péptido cíclico de la fórmula I: ciclo (x-Xh-Cys-x-xa-xb-xc-x-Cys-y-Xi-x) (I) , en donde a) x es un aminoácido diferente a Cys ; b) h es un entero de 1 a 15; c) i es cualquier entero de 0 a 14; d) uno de xa, xb y xc es Pro; e) y es ácido a-aminobutírico (ABu) o un análogo ABu; y f) el ciclopéptido consiste de al menos 16 y 25 aminoácidos cuando más.

Modalidades particularmente preferidas de este péptido cíclico son como se discute a continuación, péptidos cíclicos específicos como se ilustra en las fórmulas VII, IX, IX', VI o VIII.

La presente invención resuelve el problema técnico anteriormente identificado ya que, como se documentó con anterioridad y en los ejemplos anexos, se encontró de manera sorprendente que en particular- ß?-ECn-CPs contiene sólo dos residuos Cys que pueden formar un enlace disulfuro intramolecular individual sencillo definido, y que tienen el residuo Cys correspondiente a -Cys 216 de ß?-AR reemplazado por un residuo ABu, y también capaces de inhibir anticuerpos anti-p-AR, y son particularmente útiles para la inhibición de anticuerpos anti~ i-AR estimulatorios con alta efectividad.

Se demostró en el contexto de esta invención que el reemplazar el residuo Cys correspondiente a Cys 216 de la secuencia de aminoácidos ß?-AR humana, particularmente un residuo ABu resulta en ?-?^?-^?e con una eficacia mejorada para inhibir anticuerpos anti-3i-AR. Se proporcionan evidencias aquí que este potencial inhibitorio mejorado se debe a una imitación casi perfecta estérica del reconocimiento de anticuerpo nativo y regiones de enlace de ß?-ECn que resultan del reemplazo Cys?ABu.

En particular, en el contexto de esta invención, se encontró de manera sorprendente que ß?-ECn-CPs que tienen el residuo Cys correspondiente a Cys 216 de ß?-AR reemplazado por un residuo Abu, de hecho tienen una eficiencia bloqueadora de anticuerpos significativamente superior (al menos in vivo) que ß?-???-??e que tienen el residuo Cys reemplazado por otro residuo tipo Cys (por ejemplo por un residuo serina (Ser)). En otras palabras, los mutantes Cys/ABu como se describe aquí, tienen una superior capacidad para inhibir enlace de anticuerpos anti-betal-ECII a betal-ECII-péptidos , es decir una superior afinidad a anticuerpos anti-betal-ECII en comparación con mutantes que tienen el correspondiente Cys reemplazado por otro aminoácido (por ejemplo mutantes Cys/Ser). Esto es, por ejemplo indicado por valores EC50 menores para mutantes 22AA Cys/ABu en comparación con mutantes 22AA Cys/Ser necesarios para obtener efectos inhibitorios comparables en anticuerpos anti-betal-ECII. Éstos hallazgos son, por ejemplo evidentes de los ensayos de competencia de enlace realizados en contexto de los ejemplos anexos (Figura 15 C) .

Evaluación no invasiva (Figuras 14 A-C) e invasiva (Figuras 14 D-F) de función cardiaca hecha en el contexto de los ejemplos anexos también dirige hacia una mejor cardioprotección in vivo que se logra con los ciclopéptidos aquí descritos. En particular, los mutantes cyc22AA de esta invención bloquean (o depuran) antiacuerpos conformacionales incluso mejor que en los ciclopéptidos más grandes homólogos ECII previamente descritos (por ejemplo péptidos cyc25AA) o ciclopéptidos menores (por ejemplo péptidos cycl8AA) conocidos en la técnica (WO 2006/103101) con el mutante 22AA Cys/Abu gue es incluso más eficiente que el mutante 22AA Cys/Ser (Figuras 13 B y 14 B) sin ningunos efectos adversos en la función del riñón o del hígado (Figuras 14 G y H) .

Además, los ciclopéptidos de la invención comprenden sólo dos cisteínas, que pueden formar un solo enlace disulfuro intramolecular individual definido, pueden ser obtenidos/fabricados fácilmente, caracterizados en forma bioquímica y purificados. Esto es particularmente cierto cuando se requieren fracciones puras de los mismos isómeros ciclopéptidos. En el contexto de esta invención, se evita una mezcla de isómeros ciclopéptido, es decir estereoisómeros que comprenden isómero ciclopéptido con diferentes enlaces disulfuro intramoleculares. Como se documenta a continuación, debido a esta prevención, puede obtenerse un producto médico específico y limpio (que cumple con las normas GLP/GMP) que comprende isómeros todos con el mismo enlace disulfuro intramolecular. Por ejemplo, sólo un puente . disulfuro sencillo Cys-S-S-Cys puede ya ocurrir en forma espontánea, o instalarse químicamente por tratamiento con D SO al 3% (puente S-S forzado) a fin de lograr los criterios de estabilidad de acuerdo con las reglas GLP-/GMP- actuales como un prerrequisito para su uso ya sea como una sustancia farmacéutica o como un agente de diagnóstico en enfermedad de humanos (corazón) .

Un hallazgo sorprendente adicional en contexto de la presente invención fue - como se ilustra en los ejemplos anexos - que la naturaleza exacta del intercambio de uno de los residuos cisteína con un aminoácido diferente a Cys, como por ejemplo un residuo serina, determina en forma marcada la potencia neutralizante de anticuerpo de los péptidos cíclicos derivados de ß?-ECn .

Por ejemplo, un intercambio Cys?Ser como en la posición 18 del ciclopéptido 25-mérico aquí descrito en forma ejemplar y de preferencia, en la posición 17 del péptido 22-mérico aquí ejemplar y descrito de preferencia o en la posición 14 del ciclopéptido 18-mérico aquí descrito en forma ejemplar y de preferencia respectivamente, da por resultado péptidos cíclicos (péptidos Cys-Ser cíclicos) con excelentes efectos neutralizantes de anticuerpo y farmacológicos in vitro (Figuras 2-4 y 12), mientras que el intercambio Cys?Ser en la posición 17, 16 o 13 del péptido cíclico 25-mérico, 22-mérico o 18-mérico aquí descritos ejemplares respectivamente (péptidos Ser-Cys cíclicos) , de manera sorprendente casi no tiene efecto inhibitorio (Figuras 2/3). Este efecto inhibitorio no puede ser detectado respecto a sus propiedades como depuradores de anticuerpos y en términos de su capacidad para inhibir efectos de anticuerpos funcionales, como neutralización de estímulo de receptor in vitro como se ilustra por ejemplo en las Figuras 2-4. Éstos hallazgos demuestran una comparabilidad de ciclopéptidos 25AA, 22AA y 18AA sin ninguna mutación Cys con los imitantes cíclicos 25AA, 22AA o 18AA Cysl8, 17 o 14?ABul8, 17 o 14 (Cys-ABu) (o los respectivos imitantes Cysl8, 17 o 14?Serl8, 17 o 14 (Cys-Ser) ) , pero no con los mutantes cíclicos 25AA o 18AA Cysl7 o 13?Serl7 o 13 (Ser-Cys) .

Además, se demostró en contexto de esta invención que un intercambio Cys?ABu como el de una posición 17 del ciclopéptido 22-mérico aquí descrito en forma ejemplar y más preferible (fórmula IX') da por resultado péptidos cíclicos (péptidos Cys-ABu cíclicos) con efectos farmacéuticos y neutralizantes de anticuerpos comparables (in vi tro; ver, por ejemplo la Figura 12) con respecto a los péptidos cíclicos correspondientes 22-méricos (y 18-méricos) Cys-Ser. En vista de esta fuerte evidencia se proporciona que también un intercambio Cys?ABu como en la posición 18 del péptido 25-mérico aquí descrito en forma ejemplar y de preferencia (fórmulas VII/IX) o en la posición 14 del péptido 18-mérico aquí descrito en forma ejemplar y más preferible (fórmulas VI /VIII) , respectivamente da por resultado adicionales péptidos cíclicos Cys-ABu con excelentes efectos comparables cardioprotectores y neutralizantes y aún más pronunciados de anticuerpos in vivo (Figura 13B y Figura 14A-F) .

Fue un hallazgo adicional en el contexto de la presente invención que una imitación estérica casi perfecta del dominio ECII-ß?-?? puede obtenerse por un péptido ciclizado Cys-ABu homólogo de segundo bucle que comprende particularmente 22 aminoácidos, por ejemplo 21 aminoácidos de la secuencia primaria original publicada del ß?-AR humano, es decir los aminoácidos 200 (R) a 221 (T) (numeración de acuerdo con Frielle et al. 1987, PNAS 84, páginas 7920-7924), con un residuo aminoácido adicional (por ejemplo glicina (G) ) para cerrar el ciclo sintético en la posición 222 de la secuencia de proteínas ß?-AR humana para formar un ciclopéptido 22 AA (Figura 11) .

Sin estar ligados por teoría, la actividad cardioprotectora e inmunomoduladora de los peptidos cíclicos depende sústancialmente de su conformación. Se encontró adicionalmente en el contexto de esta invención que una introducción del aminoácido glicina de origen natural más pequeño en el sitio de cierre de anillo (pronosticado) (o en la posición correspondiente, Figura 11) lleva a un enlace mejorado de los autoanticuerpos anti-ß?-??, es decir aparentemente mejora en forma adicional la similaridad por ejemplo del ciclopéptido 22 AA con el dominio ????-ß?-??. En particular, los ejemplos anexos, entre otros, indican que los ciclopéptidos 22AA tienen una eficiencia bloqueadora de anticuerpo significativamente superior in vivo que otros ciclopéptidos que imitan ECII- más grandes (es decir ciclopéptidos 25AA) o más pequeños (es decir ciclopéptidos 18AA) . Estudios de modelado auxiliado por computadora con el ciclopéptido 22AA confirman una excelente imitación de la segunda estructura de bucle extracelular pronosticada con una diferencia calculada en tamaño de sólo 4.5 Angstroms (4.5 Á) en la base del ciclopéptido (opuesto al sitio de enlace de anticuerpo considerado) , cuando se compara con la hélice posterior de segundo bucle extracelular nativa pronosticada (ver también la Figura 11 anexa) . Aún más, se demostró aquí en los ejemplos anexos que particularmente el ciclopéptido 22 AA reduce el título de autoanticuerpos anti- i-AR in vivo con una eficiencia extraordinaria superior (Figuras 13A y B) .

Ya que el reemplazo de una de las tres cisteínas presentes en el péptido 22AA cíclico permite la introducción de un puente disulfuro reforzado (como un segundo ciclo "interno", generado por doble ciclización) entre las dos cisteínas restantes, el ciclopéptido 22AA cíclico resultante también representa un producto definido en forma bioquímica no ambigua (Figura 16 (HPLC) , Figura 17 (espectros MS/MS) ) .

También se encontró de manera sorprendente que un intercambio de Gln*-»D-Glu en la posición 25 (mutantes ciclopéptidos 25-méricos) o 18 (mutantes ciclopéptidos 18-méricos) no influencia de manera significante la capacidad de bloqueo de los ciclopéptidos, independientemente de su longitud; es decir, 25 contra 18 aminoácidos como se muestra en las Figuras 1 y 3) .

Los siguientes ejemplos también documentan que los péptidos cíclicos como se describe aquí, muestran características mejoradas, por ejemplo en comparación con péptidos que comprenden tres residuos Cys (por ejemplo los péptidos cíclicos Cys-Cys descritos en WO 2006/103101) .

Ejemplos de características mejoradas de los péptidos cíclicos de esta invención son la capacidad extremadamente buena para bloquear ambos anticuerpos anti- i-AR, in vitro (Fig.12) y in vivo (Fig. 13) y su capacidad de producción avanzada de acuerdo con las normas GLP/GMP.

En el contexto de la presente invención, los hallazgos in vitro generalmente se confirmaron en pruebas in vivo (Figuras 5-10 y 13/14). De manera interesante, la diferencia en la eficiencia de bloqueo de los ciclo péptidos mutados Cysi8,i7 Ó i4?Ser18;i7 ó 14 comparado con los péptidos lineales fue aún más pronunciada in vivo (Figuras 5-7). Lo mismo aplica para la eficacia de bloqueo de los ciclopeptidos mutados Cysi8, n Ó i4?Seri8, 17 0 14 en comparación con los ciclopéptidos mutados Cysi8, n 0 i4?Seri8, 17 0 14 (ver, por ejemplo Figuras 12 y 13).

El modelo de rata establecido de la cardiomiopatía autoinmune inducida por anticuerpo anti-betal-adrenérgica (Jahns, 2004 y Jahns , 2008) sirvió para estimar la eficacia de los mutantes ciclopéptidos homólogos betal-ECII generados in vivo.

Además , los experimentos in vivo demostraron que la capacidad bloqueadora de anticuerpo de ciclopéptidos mutantes aparentemente no es afectada por una reducción en el números de aminoácidos de un ciclopéptido 25-mérico a uno 18-mérico; ambos en datos in vitro e in vivo demuestran una comparabilidad excelente de estos dos mutantes ciclopéptido 25AA Cys/Ser o 18AA Cys/Ser de enlace disulfuro sencillo que contienen 2 cisteínas (Figuras 7-10) .

Además se encontró en el contexto de la presente invención que mutantes péptido con una estructura cíclica (es decir péptidos cíclicos) como se describió y proporcionó aquí, son superiores a sus contrapartes lineales en términos de reconocimiento o depuración de anticuerpos anti- -AR conformacionales , su potencial neutralizante de anticuerpo (es decir farmacéutico) y su vida media en suero crudo (por ejemplo: lineal < 8h, cíclico >12h; en particular: lineal 6±lh, cíclico 48±12h) . Estos resultados se obtuvieron por el empleo ejemplar de ensayos de competencia ELISA y ensayos FRET funcionales (cAMP) , e incubación de péptidos lineales contra cíclicos con sueros de humano, conejo o rata, respectivamente (Figuras 18 - 20) .

Animales a los cuales se administran los péptidos cíclicos 18-mérico, 22-mérico o 25-mérico como se describe aquí - en particular el mutante Cys/Abu 22 mérico -no muestran signos de anormalidades (por ejemplo, parámetros de laboratorio rutinarios de funciones de riñon e hígado así como pesos de órganos Figura 14 G y H) , y solo el efecto deseado de péptido administrado, es decir el bloqueo de anticuerpos anti-ß?-??, se detectó. De acuerdo con esto, los péptidos como se proporciona aquí después de 11 (cyc 22AA Cys/Abu) o 12 aplicaciones (cyc 22AA Cys/Ser) , correspondientes a 12 meses de tratamiento, no exhiben efectos secundarios indeseados o toxicidades específicas de órganos al régimen de dosis aplicado (Figuras 14 G y H) .

La capacidad bloqueadora de anticuerpo de ciclopéptidos mutados de esta invención es ventajosamente alta, siempre que el péptido no sea más corto que 18AA y no más largo que 25AA. Esto se demostró en forma ejemplar por la reducción del número de aminoácidos del péptido de 25 a 18. Sin embargo, dentro del intervalo de 18 a 25 aminoácidos, péptidos cíclicos que tienen 22 aminoácidos son más efectivos de acuerdo con esta invención y de acuerdo con esto, son una modalidad preferida particular. Un ejemplo de este péptido cíclico 22-mero particularmente preferido se ilustra en la fórmula IX'.

Una ventaja de los imitantes ciclopéptido de la presente invención es - al mutar una cisteína particular (el Cys correspondiente a Cys216 de la secuencia de aminoácidos de ß?-AR) a un residuo ABu y por formación de refuerzo del puente S-S intramolecular único posible a través de un procedimiento de ciclización especifico S-S - que su restricción de conformación se incremente. En comparación con péptidos conocidos en la técnica, esta restricción incrementada de los péptidos de la invención lleva a una molécula que imita mejor el o los epítopos presentados en la conformación nativa del segundo bucle ß?-ECn en la superficie celular .

Aún más, el ciclopéptido de la presente invención se muestra que bloquea la actividad de autoanticuerpos betal-receptores aislados de pacientes DCM humanos, como se muestra en forma ejemplar para las fracciones IgG preparadas a partir de una paciente femenina de 28 años de edad (ver Figura 19 y ejemplos anexos) . Además, al utilizar péptidos 22AA Cys/Abu mutados Ala cíclicos (de acuerdo con la Figura 15A) para estos experimentos de bloqueo (la pre-incubación de preparaciones IgG humanas con un exceso de 40-veces de los mutantes Ala cyc22AA Cys/ABu 0, 1, y 8, respectivamente), el aminoácido prolina (en la posición de bucle ß?-ECII 213; referido aquí también como xc) se identificó como el aminoácido más preferido que constituye el epítopo ß?-receptor dirigido por autoanticuerpos de receptor humano (Figura 19) .

Los beta bloqueadores , tales como bisoprolol, que se emplean en la técnica para el tratamiento de DCM y otras enfermedades provocadas por anticuerpos anti^i-AR estimulatorios, reducen en forma significante tanto el ritmo cardiaco como la presión sanguínea. En contraste, una aplicación in vivo de los ciclopéptidos mutantes como se describe en el contexto de la presente invención, no tiene impacto negativo en la función pulmonar, ritmo cardiaco o presión sanguínea (Figuras 10 y 14 D-F) . Además, una cantidad de parámetros de laboratorio importantes para estimar la función del hígado y riñon no se influencian por inyecciones de ciclopéptido repetidas (Figura 14 G) . Por lo tanto, los péptidos cíclicos descritos en el contexto de la presente invención, son, ínter alia, particularmente adecuados para el tratamiento de grupos de pacientes distintos que de otra forma no pueden tratarse al utilizar un beta bloqueador, es decir pacientes quienes por ejemplo, ya sufren de bradicardia o de quienes el uso de beta bloqueadores no es posible debido a contra-indicaciones (como aquellos que sufren de enfermedad obstructiva pulmonar o hipotensión) .

Como se mencionó, una ventaja adicional de los medios y métodos de la presente invención, particularmente sobre medios y métodos que aprovechan péptidos (cíclicos) derivados de ß?-ECn y que todavía tienen 3 cisteínas (tal como se describe por ejemplo en WO 2006/103101) , es que la formación de mezclas de isómeros ciclopéptido puede evitarse.

La caracterización bioquímica de una mezcla de isómeros ciclopéptido diferentes, formados durante ciclización de péptidos que comprenden tres o más residuos Cys, es laboriosa. De acuerdo con esto, la producción de fracciones péptido cíclico puras que contienen solo una clase de un isómero ciclopéptido es intensa en costo y tiempo, cuando se aprovechan péptidos que comprenden tres o más residuos Cys. Esto es particularmente cierto, cuando los péptidos cíclicos se producen bajo normas GLP/GMP.

En contraste, los péptidos cíclicos de la presente invención pueden caracterizarse fácilmente y producirse como fracciones puras del mismo isómero. Esto lleva a una alta reproducibilidad. De acuerdo con esto, una ventaja particular de los péptidos de la presente invención es que mezclas de isómeros, que deben separarse y deben caracterizarse en pruebas laboriosas, se evitan, y que al menos una etapa de producción adicional (separación y/o caracterización bioquímica) puede omitirse finalmente (ver también Sewald 2002).

La presente invención inter alia, se basa en experimentos descritos en los ejemplos anexos.

En contexto de estos ejemplos, una de las cisteínas ya sea en la posición 17 o en la posición 18 del ciclopéptido ß?-ECu 25AA o la cisteína en la posición 14 del ciclopéptido ß?-?0??-18?? se reemplaza por un residuo serina (mutación Cysi? Ó i8?Seri7 Ó is Y mutación Cysi4?Ser14, respectivamente) , o la cisteína en la posición 17 del ciclopéptido ß?-?(_??-22?? se reemplaza por un residuo ABu (mutación Cysi7->ABui7) , de manera tal que puede formarse solo un enlace disulfuro intramolecular sencillo (S-S) individual (Figura 11,). Medidas como esta se proporcionan en potencial para reducir efectos secundarios y mantener o incrementar la eficacia biológica de las construcciones de la presente invención. Los péptidos cíclicos de esta invención pueden obtenerse en contraste con los péptidos de la técnica previa que forman mezclas de los isómeros, por procesos de fabricación simples, robustos y altamente reproducibles . Estos pueden ajustarse en escala eficientemente. Además, estos procesos evitan separación de mezclas de isómeros y son adecuados para las normas GLP/GMP. Los ejemplos anexos proporcionan los métodos de fabricación/producción correspondientes .

En los ejemplos anexos, la ciclización de los péptidos de la invención fue, inter alia, obtenida por la introducción de una mutación "Gly", por ejemplo en el sitio de cierre (anillo) del péptido cíclico (Figura 11) .

Además , el número de aminoácidos (AA) se reduce de 25AA a 22AA y además a 18AA en conjuntos adicionales de mutantes ciclopéptidos de la presente invención. Esta medida proporciona el potencial para reducir al mínimo los efectos secundarios inmunologicos potenciales de las construcciones y cribar por/identificar la longitud opcional de los imitantes ciclopéptido dentro del intervalo de 18 a 25 aminoácidos. Los mutantes ciclopéptido 18AA o 25AA contienen un intercambio cisteína?ABu en la posición 14 y 18, respectivamente, (18AA que contiene ciclopéptidos mutantes Cysl3-ABui4 y 25AA que contiene ciclopéptidos mutantes Cysie-Seri7) opcionalmente combinados con un intercambio (adicional) glutamina-/D-ácido glutámico, por ejemplo en el sitio de cierre de anillo del péptido cíclico (mutación Gln<?D-Glu) . Los mutantes ciclopéptidos 22AA preferidos contienen un intercambio cisteína?ABu en la posición 17 (que contiene 22AA Cysl6-ABui7) , opcionalmente combinado con la introducción de un residuo Gly en la posición 22 (un sitio de cierre de anillo posible del péptido cíclico; Figura 11) .

Tomados en conjunto, los datos in vitro que se proporcionan experimentales así como los datos in vivo, claramente demuestran que la capacidad bloqueadora de anticuerpo de los ciclopéptidos mutantes descritos no se afecta marcadamente por la reducción del número de aminoácidos de un ciclopéptido 25-mérico a un 22-mérico o 18-mérico, por ejemplo cuando se utiliza un intervalo de dosis desde 0.25 a 5.0 mg/kg de peso corporal (Bw) o de 1.0 a 2.0 mg/kg de Bw o en particular de 0.3 a 2.0 mg/kg de Bwor. Datos in vitro e in vivo indican una excelente comparabilidad de los dos ciclopéptidos 25AA Cys/ABu de enlace disulfuro sencillos que contienen cisteína (fórmulas VI /VIII) o mutantes ciclopéptidos 18AA Cys/ABu (fórmulas VII /IX) a una dosis de 1.0 mg/kg de Bw. Sin embargo, péptidos cíclicos "intermedios" de 19 a 24AA aparentemente exhiben una actividad incrementada de acuerdo con esta invención. Particularmente, péptidos cíclicos de 22AA (ciclopéptidos 22AA Cys/ABu) exhiben una actividad incrementada de acuerdo con esta invención. Un ejemplo preferido de este péptido cíclico "intermedio" es un péptido cíclico que comprende o consiste de los residuos de aminoácido como se muestra en la fórmula IX ' .

Aún más, la naturaleza exacta del intercambio de uno de los residuos cisteína con un residuo serina (es decir, mutación Cys/Ser (ABu) o Ser (ABu)/Cys) determina marcadamente la potencia de los péptidos cíclicos descritos in vitro y también in vivo (Figuras 2, 3, 6, 7, 13 y 14).

Una modalidad preferida de la presente invención se basa en experimentos in vivo que atienden diferentes modos de aplicación/administración de los péptidos cíclicos aquí descritos, en particular del epítopo ?-ECn anteriormente mencionado que imita mutantes ciclopéptido 22AA. Estos experimentos . in vivo también se describen en los ejemplos anexos. En el contexto de estos ejemplos, la cisteína en la posición 17 del ßl-ECII-22AA-ciclopéptido se reemplaza por un residuo ABu (mutación Cysl7?ABul7 ) , de manera tal que solo un enlace disulfuro intramolecular sencillo individual (S-S) puede formarse (Figura 11) . Los diferentes protocolos de aplicación/administración como se describe aquí, comprenden ya sea aplicaciones intravenosas mensuales de los mutantes ciclopéptidos aquí descritos (por ejemplo cyc22AACys/Abu) , o de preferencia, una triple inyección (por ejemplo, una inyección cada semana, en 3 semanas subsecuentes) cada tres meses. Esquemas de administración como estos proporcionan el potencial para reducir la cantidad de ciclopéptidos inyectados, para reducir la carga de venipuntura (mensual regular) y/o incrementar la flexibilidad de aplicación (para ambos, pacientes humanos y animales); mientras que se mantiene o incrementa la eficiencia biológica de las construcciones inyectadas de la presente invención.

Con respecto a las construcciones aquí descritas (en particular cyc22AA Cys/Abu) , inyecciones triples (1 inyección por semana en 3 semanas subsecuentes) seguido por una intervención de dos meses como intervalo de tiempo libre, se muestran de eficiencia extraordinaria para reducir el título de anticuerpos nti- i-ECu en circulación (Figuras 21 A y B) , para invertir el fenotipo cardiomiopático (Figuras 22A-C) .

Receptores ß-adrenérgicos (ß-ARs) , particularmente los receptores ß?-adrenérgicos (ß?-ARs), son bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, la secuencias de nucleótido y aminoácidos (SEQ ID NO. 24) del ß?-AR humano (también conocido como receptor ß-1-adrenérgico (ADRBl) ) pueden obtenerse de entrada de banco de datos NM_000684 o NP_000675. ß-ARs se conoce que forman dos dominios extracelulares aquí denominados como ECi y ECu o Paj-ECi y (¾(i)-ECn . Como se mencionó anteriormente, los péptidos cíclicos de la presente invención comparten similaridad de secuencia con ß?-ECn, particularmente con el tramo de aminoácidos DEARRCYNDPKCCDFV , (SEQ ID NO. 17) O RAESDEARRCYNDPKCCDFVTNR (SEQ ID NO. 18) del ß?-AR humano (posiciones de aminoácidos 204 a 219 o 200 a 222, respectivamente) o en particular, con el tramo de aminoácidos DEARRCYNDPK (SEQ ID NO. 29) o ESDEARRCYNDP (SEQ ID NO. 30) del ß?-AR humano.

El término " ß-AR" como se emplea aquí, de preferencia se refiere a un receptor ß?-adrenérgico (ß?-AR) , más preferiblemente a ß?-AR humano como se describió con anterioridad. La estructura detallada de la proteína ß?-AR de pavo, fue, entre otros, analizada por Warne et al. (2008 Nature, 454: 486-491).

Un péptido cíclico que aquí se proporciona puede tener al menos una de las características seleccionadas del grupo que consiste de: a) ser capaz de ligar (auto-) anticuerpos contra el bucle ECu del receptor ß?-adrenérgico (ß?-AR) ,- b) ser capaz de inhibir la interacción entre ß?-AR y (auto- ) anticuerpos contra el bucle ECu de ß?-AR; c) imitar al menos un epítopo presentado en la conformación nativa del bucle ECu de ß?-AR; y d) ser capaz de reducir una activación mediada por anticuerpo de ß?-AR.

Como se mencionó anteriormente, el péptido cíclico de la presente invención se define por la fórmula general ciclo (x-Xh-Cys-x-xa-xb-xc-x-Cys-y-xi-x) (fórmula I) . En esta fórmula, "y" es ABu (ácido a-aminobutírico) o un análogo ABu. ABu no es de origen natural; es decir un aminoácido no genéticamente codificado, bien conocido en la técnica. Por ejemplo también se conoce como ácido alfa-aminobutírico, AABA, ácido 2-aminobutírico, ácido 2-aminobutanoico , etc. En la técnica, ABu por ejemplo se ilustra por las fórmulas químicas CH3CH2CH(NH3)COÓH o C4H9N02. Se prefiere en el contexto de esta invención que Abu es L-Abu (ácido L- -aminobutírico) . Sin embargo, Abu también puede ser D-Abu (ácido D-a-aminobutírico) .

Por ejemplo, Wlodaver (Science, 1989, 245 (4918) : 616-21) describe la determinación de la estructura de cristal de proteasa Hiv-1 químicamente sintetizada, con base en la estructura de proteasa del virus Rous sarcoma que tiene las cisteínas reemplazadas por ABu.

Además del propio ABu, "y" de la fórmula I puede ser cualquier análogo ABu, siempre que este aminoácido no forma un enlace intramolecular (por ejemplo un enlace disulfuro) con otro aminoácido del ciclopéptido que aquí se proporciona (en particular con otro Cys del péptido cíclico que aquí se proporciona). "y" puede ser cualquier análogo ABu similar a Cys (es decir que tiene una estructura química similar y/o un "comportamiento estructural" similar dentro de una estructura péptido tri-dimensional) , excepto porque no forma un enlace intramolecular (por ejemplo un enlace 'disulfuro) con otro aminoácido del pép.tido cíclico que aquí se proporciona (en particular con otro Cys del péptido cíclico que se proporciona aquí) . "Análogo ABu" en el contexto de esta invención significa un residuo, particularmente un residuo aminoácido, que tiene un carácter estructural similar al de ABu. El término "análogo ABu" particularmente se refiere a un residuo (aminoácido) que tiene una estructura química y/o "comportamiento" dentro de una estructura de péptido tri-dimensional que es más similar al del propio ABu que el de cualquier otro residuo aminoácido, como, por ejemplo, al de Ser.

El significado del término "análogo ABu" como se emplea a través de esta solicitud, es claro para la persona con destreza. Por lo tanto, la persona con destreza está fácilmente en posición para deducir que compuestos particulares caen bajo el significado de este término, es decir que compuestos estructural y/o funcionalmente están más claramente relacionados al propio ABu, que a cualquier otro aminoácido que pueda reemplazar Cys de acuerdo con estas invención, por ejemplo Ser o Selenocisteína.

"Análogos ABu" particulares de acuerdo con la presente invención pueden ser aquellos, la cadena lateral C de los cuales es recortada o alargada en comparación con el propio ABu. Los residuos C de la cadena C pueden ser de hasta 10, de preferencia hasta 6. Por ejemplo, estos "análogos ABu" con una cadena lateral C acortada o alargada son ácido 2-aminopropiónico, y de preferencia ácido 2-aminopentanoico o ácido 2-aminohexanoico.

El término "ABu" como se refiere aquí, en particular en las fórmulas ilustradas, se refieren tanto a un análogo ABu o se prefiere el propio ABu.

Como se mencionó, una característica principal de los péptidos cíclicos de esta invención es que comprenden solo dos Cys capaces de formar un enlace intramolecular. Estos péptidos cíclicos por ejemplo pueden obtenerse al substituir un tercer Cys de un homólogo péptido al ß?-ECn por un aminoácido diferente. De esta manera, el Cys a substituir es aquel que corresponde al 2° o que se prefiere, 3° Cys del ß?-ECn que se encuentra en proximidad directa entre sí (posición de aminoácido 215 y 216 de ß?-AR humano (ver también NP_000675 y SEQ ID NO. 24). Estos dos residuos Cys, son referidos aquí como "Cys-Cys", "Cys/Cys", "Cys2i5-Cys2i6" o "Cys2i5/Cys2i6" y semejantes) .

Los péptidos mutantes o mutaciones resultantes como se describe aquí de acuerdo con esto, se denominan como péptidos mutantes o mutaciones "Cys-ABu", "Cys/ABu", " Cysi3 , i6 Ó i7- Bui , i7 Ó 18" o " Cysn, i5 Ó 17/ABU14, i7 Ó ís" péptidos mutantes o mutaciones "Cys-Ser", "Cys/Ser", "Cysia, le ó i7-Seri4, 17 Ó is" o "Cys13, 16 0 i7/Seri4, 17 ó i8" o péptidos mutantes o mutaciones "Ser-Cys", "Ser/Cys", "Seri3 6 i7-Cysi4 0 ís" o " Seri3 0 i7/Cysi 0 is" dependiendo en cual de los Cys ' se reemplaza y que tanto aminoácidos comprende el péptido mutante (18, 22 ó 25).

En forma alterna, los péptidos mutantes como se describe aquí, se definen por referencia a los intercambios de aminoácidos particulares en una cierta posición. Después, los péptidos mutantes/mutaciones por ejemplo se denominan péptidos mutantes/mutaciones "Cysi4, i7 0 i8?ABui4, i7 ¿ i8", péptidos mutantes/mutaciones "Cysi4, 17 0 i8?Ser14, i7 ó i8", o péptidos mutantes/mutaciones "Cysi30 n?Seri3 ó 17 " / dependiendo de si el Cys correspondiente a Cys2L6 o el Cys correspondiente a Cys2i5/ respectivamente de ß?-AR se reemplaza por un aminoácido diferente y que tantos aminoácidos comprende el péptido mutante.

Los índices "13, 16 ó 17", "14, 17 ó 18", "13 ó 17" o "14 ó 18" se refieren a la posición en el péptido cíclico ejemplificado de la invención, con lo que la posición 1 corresponde al primer "x" como se define en la fórmula I, es decir ciclo (x-xh-Cys-x-xa-xb-xc-x-Cys-y-Xi-x) .

De acuerdo con esto, términos como péptidos mutantes/mutaciones "Cysi3-Seri4" o "Cysi3/Seri4 " se emplean en el mismo sentido que péptidos mutantes/mutaciones "Cysi4?Seri4 " y en este ejemplo particular, se refieren a péptidos 18-mero descritos aquí. Términos como péptidos mutantes/mutaciones "Cysi6-Ser17 " o "Cysi6/Seri7" y "Cysi6-ABui7" o "Cysi6/ABui7" , respectivamente, se emplean en el mismo sentido que péptidos mutantes/mutaciones "Cysn-.Ser17" y "Cysi7?ABuri7" , respectivamente, y en este ejemplo particular, se refieren a péptidos 22mero descritos aquí. Términos como péptidos mutantes/mutaciones "Cysi7-Seri8" o se emplean en el mismo sentido que péptidos mutantes/mutaciones "Cysi8?Seri8" y en este ejemplo particular, se refieren a péptidos 25mero aquí descritos.

En forma análoga, términos como péptidos mutantes/mutaciones "Seri3-Cysi4" o "Seri3/Cysi4" se emplean en el mismo sentido que péptidos mutantes/mutaciones "CySi3?Seri3" y en este ejemplo particular, se refieren a péptidos 18mero aquí descritos, y términos como péptidos mutantes/mutaciones " Ser17-Cysi8" o "Seri/Cysi8" se emplean en el mismo sentido que péptidos mutantes/mutaciones "Cysi7?Seri7" , y en este ejemplo particular, se refieren a los péptidos 25mero aquí descritos.

Los índices ejemplares dados anteriormente se refieren a la posición del aminoácido indicado dentro del péptido 18-mero, 22-mero o 25-mero particular aquí descrito, respectivamente.

En el contexto de esta invención, el punto de partida con respecto a una posición de aminoácido indicada dada para un péptido cíclico aquí descrito es el aminoácido N-terminal de la estructura principal linearizada el péptido cíclico (como la primer "x" en la fórmula I, ver con anterioridad) . El punto de partida con respecto a una posición de aminoácido indicada para un péptido lineal aquí descrito es su aminoácido N-terminal.

Como también se mencionó con anterioridad, en las fórmulas del péptido cíclico de la presente invención, h puede ser cualquier entero de 1 a 15, de preferencia de 5 a 9, y/o i puede ser cualquier entero de 0 a 14, de preferencia de 1 a 14, más preferiblemente de 0 a 6 y aún más preferible de 1 a 6. De acuerdo con esto, h puede ser 1, 2, 3, 4, 5, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 óo 15 y/o i puede ser 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 ó 14. De preferencia, h es 5, 8 o 9 y/o i es 3 , 4 ó 6. Más preferiblemente, h es 8 y/o i es 4.· En modalidades de esta invención particularmente preferidas, ¾ representa los tramos de aminoácidos particulares DEARR (SEQ ID NO. 19), AESDEARR (SEQ ID NO. 31) o RAESDEARR (SEQ ID NO . 20) y/o x± representa los tramos de aminoácidos particulares DFV (SEQ ID NO. 21), DFVT (SEQ ID NO. 32) o DFVTNR (SEQ ID NO. 22) . En modalidades más particularmente preferidas de esta invención, xh representa el tramo de aminoácidos particulares AESDEARR (SEQ ID NO. 31) y/o xi representa el tramo de aminoácidos particulares DFVT (SEQ ID NO. 32) .

El péptido cíclico de la presente invención (o su parte cíclica) puede consistir de al menos 18 aminoácidos y de cuando más 25 aminoácidos. De acuerdo con esto, el péptido cíclico de la presente invención puede consistir de 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 o 25 aminoácidos, con lo que 18 o 25 aminoácidos en particular se prefieren y en particular 22 aminoácidos se prefieren más. En una modalidad menos preferida, también se prevén péptidos menores, es decir péptidos que comprenden 16 o 17 aminoácidos.

Un péptido cíclico particularmente preferido en el contexto de esta invención es uno de longitud (21+1=) 22AA, que tiene tamaños máximo y mínimo definidos de la molécula cíclica dependiendo de la composición de aminoácido respectiva, constituido por 21 aminoácidos de la secuencia primaria original del ß?-AR humano (es decir, los aminoácidos 200 a 221; Frielle 1987, PNAS 84, 7920-7924) con una glicina adicional como el 22° aminoácido en la posición de cierre de anillo asumida (posición 22).

Sin estar ligados por teoría, el número de aminoácidos y de esta manera la longitud de la estructura primaria (es decir, la estructura principal de aminoácidos) de péptidos cíclicos que ligan anticuerpos anti-ß?-?? es crucial para sus efectos biológicos y/o fabricación exitosa/efectiva.

Una longitud de péptido igual . o superior a 26 aminoácidos (estructura primaria) puede ser estimulante directamente (esto es, sin el uso de proteínas portadoras) de células T inmunocompetentes y de esta manera puede provocar un aumento paradójico indeseado de producción de anticuerpo anti-pi-receptor a través de estímulo de células B mediadas por T.

Una longitud de péptido inferior a 16 aminoácidos (estructura primaria) lleva a cristalización indeseada durante el proceso de producción y problemas para disolver los productos sintetizados en una solución acuosa, por ejemplo para propósitos de inyecciones i.v. o s.c.

En una modalidad menos preferida de esta invención también péptidos cíclicos que caen bajo las definiciones dadas anteriormente a) a f) de la fórmula I,¦ pero que consiste de solo 17 aminoácidos o aún menos preferido, que consiste de solo 16 aminoácidos, se proporciona. Un ejemplo no limitante de este péptido cíclico menos preferido es el péptido ciclo (Ala-Arg-Arg-Cys-Tyr-Asn-Asp-Pro-Lys-Cys-ABu- Asp-Phe-Val-Tyr-Gln/DGlu) (que se forma por una estructura principal de .aminoácidos como se ilustra en SEQ ID NO. 23) .

Se prefiere particularmente aquí que los péptidos cíclicos descritos contengan solo un Pro. De acuerdo con esto, se prefiere en particular que "x" de las fórmulas ilustradas aquí, excepto exactamente uno de xa, xb y x°, no sea Pro. Dentro del tramo de aminoácidos xa, xb y x° como se ilustra en la fórmula I (o en otras fórmulas) , se prefiere que x° sea Pro.

Se prevé particularmente aquí que un aminoácido acídico, como Asp o Glu, preceda a Pro contenido en .el péptido cíclico de la invención. De acuerdo con esto, se prefiere que xb como se ilustra en la fórmula I (u otras fórmulas) sea un aminoácido acídico, como Glu o de preferencia Asp. Particularmente, cuando x° es Pro, xb puede ser un aminoácido acídico, cuando xb es Pro, xa puede ser un aminoácido acídico y cuando xa es Pro, el x de la fórmula I (o de otras fórmulas) que se encuentra entre xa y el primer Cys puede ser un aminoácido acídico, en donde el aminoácido acídico puede ser uno como se describe particularmente aquí.

De preferencia, xa es Asn, xb es Asp, xc es Pro ylo x después de xc es Lys . En una modalidad particularmente preferida de los péptidos aquí descritos, el tramo de aminoácidos xa-xb-xc como se ilustra en las fórmulas que se proporcionan aquí es Asn-Asp-Pro (N-D-P) . En una modalidad aún más preferida, el tramo de aminoácido xa-xb-x°-x como se ilustra en las fórmulas que aqui.se proporcionan es Asn-Asp-Pro-Lys (N-D-P-K) .

Más específicamente, el péptido cíclico de la presente invención puede definirse por las fórmulas I' o I": ciclo (xi-Xh-Cys-x-xa-xb-xc-x-Cys-y-xi-x) (I'); ciclo (xin-xh-Cys-x-xa-xb-xc-x-Cys-y-Xi-x) (I") .

Aún más específicamente, el péptido cíclico de la presente invención puede definirse por la fórmula I''' o j- / / . ciclo (Xi-xh-Cys-x-xa-xb-xc-x-Cys-y-Xi-Xn) {!' ''); ciclo (xni-Xh-Cys-x-xa-xb-xc-x-Cys-y-Xi-xIV) (!'''').

En general, Xi y xn como se ilustra en las fórmulas I' y I''' (y en las otras fórmulas aquí ilustradas) puede como se mencionó, ser cualquiera aminoácido excepto Cys. Sin embargo, particularmente cuando el cierre de anillo de los péptidos cíclicos de la invención ocurre entre x? y xn, se prevé particularmente que i y xn sean estos aminoácidos capaces de formar un enlace péptido, o semejantes, entre sí bajo condiciones de una ciclización "cabeza a cola" . Ciclizaciones "cabeza a cola" se conocen en la técnica (e.g. Kates and Albericio: Solid phase synthesis, CRC-Press, 2000; Williams, Chemical Approaches to the Synthesis of Peptides, CRC-Press 1997; Benoiton: Chemistry of Peptide Synthesis. CRC-Press, 2005) y sus ejemplos se dan en la parte experimental. Ejemplos posibles de aminoácidos que pueden ser xr son Gly, Val, Thr, Ser y de preferencia, Ala. Ejemplos posibles de aminoácidos que pueden ser xn son Glu y de preferencia Gln. Menos se prefiere que xn también pueda ser Asp o Asn. Más se prefieren que Xi es Ala y ??? es Gln o Glu (de preferencia DGlu) .

De acuerdo con esto, en los péptidos cíclicos de esta invención xn como se refiere en la fórmula I' y I' ' ' pueden ser Gln o Glu, en donde Glu también puede ser DGlu (D-Glu; ácido D-Glutámico) . Sin embargo, aquí se prefieren aminoácidos de origen natural. Por lo tanto, se prefiere más que xn sea Gln.

La persona con destreza es capaz de elegir aminoácidos apropiados como Xi y/o de las formulas I' y I ' ' ' de acuerdo con esta invención en base a las enseñanzas que aquí se proporcionan y su conocimiento de la técnica (e.g. Williams, Chemical Approaches to the Synthesis of Peptides, CRC-Press 1997; Benoiton: Chemistry of Peptide Synthesis. CRC-Press, 2005)).

Xm y xIV como se ilustra en las fórmulas I'' y I' ' '' (y en las otras fórmulas aquí ilustradas) pueden según se menciona, también representar cualquier aminoácido excepto Cys . Sin embargo, particularmente cuando el cierre de- anillo de los péptidos cíclicos de la invención ocurre entre xm y xiv , se prevé particularmente que xm y ??? son aquellos aminoácidos capaces de formar un enlace péptido o semejantes, entre si bajo condiciones de una ciclización de "cabeza a cola" . Un ejemplo posible de un aminoácido que puede ser Xm es Arg. Un ejemplo posible y más preferido de un aminoácido que puede ser ??? es Gly o un análogo de Gly. "Análogo Gly" en este contexto significa un residuo, particularmente un residuo aminoácido, que tiene un carácter estructural similar al de Gly. En particular "análogo Gly" se refiere por ejemplo a un residuo (aminoácido) que tiene el mismo tamaño (o incluso más pequeño) que un residuo Gly. Se encontró de manera sorprendente en el contexto de esta invención que un residuo pequeño (aminoácido) particularmente como Gly en la posición "Xiv" lleva a una imitación mejorada de ECII de ß?-AR por los péptidos cíclicos correspondientes de la invención.

La persona con destreza es capaz de elegir residuos aminoácido apropiados para ser ??tt y/o xlv de las fórmulas I" y I"" de acuerdo con esta invención, en base con la enseñanza que aquí se proporciona y su conocimiento de la técnica (por ejemplo Williams, Chemical Approaches to the Synthesis of Péptidos, CRC-Press 1997; Benoiton: Chemistry of Péptido Synthesis. CRC-Press, 2005).

Además se prefiere particularmente aquí que los péptidos cíclicos de esta invención carezcan de Trp y/o His. De acuerdo con esto, se prevé particularmente en el contexto de la invención que ni una x ni y como se ilustra en cualquiera de las Fórmulas I o I"' o es Trp o His .

Además, se prefiere que los péptidos cíclicos proporcionados carecen de sitios susceptibles para hidrólisis o ruptura de proteasas, como por ejemplo proteasas de suero. Los significados de los términos "hidrólisis" y "proteasas (de suero)" son bien conocidos en la técnica.

Un péptido como aquí se proporciona también puede ser descrito como un péptido que consiste de o que comprende una secuencia de aminoácidos homologa a SEQ ID NO. 17 (que representa un tramo de aminoácido de tipo silvestre que comprende epítopos de ?i-ECn) , en donde (a) el aminoácido que corresponde a la posición 13 (o menos preferido, que corresponde a la posición 12) de SEQ ID NO. 17 no es Cys y el aminoácido que corresponde a las posiciones 6 y 12 (o menos preferido, correspondiente a la posición 6 y 13) de SEQ ID NO. 17 es Cys, (b) en donde la secuencia de aminoácidos no contiene más de Cys capaz de formar un enlace intramolecular dentro del péptido, es decir dentro de aquella parte del péptido que es homologa a SEQ ID NO. 17, o (c) en donde el péptido puede funcionar como un péptido cíclico de acuerdo con esta invención, por . ejemplo es capaz de bloquear anticuerpos anti- ?-AR, o en donde el péptido puede formar este péptido cíclico. Opcionalmente, las adicionales disposiciones dadas aquí respecto a la estructura de los péptido lineales y/o cíclicos descritos aplican aquí, mutatis mutandis . El así definido péptido consiste de un tramo de 16 aminoácidos que son homólogos a SEQ ID NO. 17 flanqueados en el extremo N- y C- por uno o más aminoácidos, de preferencia aminoácidos de origen natural, como "xi"/"Xm" en la posición 1 y "xn"/"Xiv" en la última posición de las fórmulas I' a I"" dadas aq í .

En contexto de la invención y en particular en el contexto del SEQ ID NO. 17 (tipo silvestre) , "homólogo" significa idéntico a nivel aminoácidos por al menos 18.75%, al menos 37.5%, al menos 50%, al menos 56.25%, al menos 62.5%, al menos 68.75%, al menos 75%, al menos 81.25%, al menos 87.5% o 93.75%, en donde se prefieren los valores superiores .

En general, el significado del término "aminoácido" o "residuo aminoácido" se conoce en la técnica y se emplea de conformidad aquí. De esta manera, se nota que cuando un "aminoácido" es un componente de un péptido/proteína, el término "aminoácido" se emplea aquí en el mismo sentido que "residuo aminoácido".

Particularmente, un "aminoácido" o "residuo aminoácido" como se refiere aquí, excepto el ABu o análogo ABu, de preferencia se prevé que sea un aminoácido de origen natural, más preferible un L-aminoácido de origen natural (excepto el DGlu anteriormente mencionado) . Sin embargo, a pesar de que se prefiere menos, un "aminoácido" o "residuo aminoácido" en el contexto de esta invención ("x" referido en la fórmula I y en otras fórmulas dadas aquí) también puede ser un aminoácido que no es de origen natural (es decir sintético), como por ejemplo, norleucina o ?-alanina.

También en la técnica se conoce el significado de los términos "aminoácido acídico(s)", "aminoácido básico(s)", "aminoácidoalifático (s) " y " aminoácido polar(s)" (por ejemplo, Stryer, Biochemie, Spectrum Akad. Verlag, 1991, Item I. 2.). Estos términos se emplean de manera correspondiente a través de esta invención. De esta manera, las disposiciones particulares aquí dadas respecto a los péptidos cíclicos de la invención también aplican.

Particularmente, el término "aminoácido acídico(s)" como se emplea aquí, se pretende que signifique un aminoácido seleccionado del grupo que comprende Asp, Asn, Glu, y Gln, de preferencia Asp y Glu; el término "aminoácido básico (s) " como se emplea aquí se pretende que signifique un aminoácido seleccionado del grupo que comprende Arg, Lys y His, de preferencia Arg y Lys; el término "aminoácido alifático (s) " como se emplea aquí, se pretende que signifique cualquier aminoácido seleccionado del grupo que comprende Gly, Ala, Ser,' Thr, Val, Leu, lie, Asp, Asn, Glu, Gln, Arg, Lys, Cys y Met; y el término "aminoácido polar (es) "como se emplea aquí se pretende que signifique cualquier aminoácido seleccionado del grupo que comprende. Cys, Met, Ser, Tyr, Gln, Asn y menos preferido Trp.

En una modalidad particular adicional del primer aspecto de esta invención, el péptido cíclico como aquí se proporciona puede ser un péptido cíclico de la fórmula II, III o III ' : ciclo (xi-xi-Xi-x-X2-X2-Cys-x-xa-x-xc-x-Cys-y-Xi-Xn) (II) ; ciclo (xi-X2-x-xi-x-xi-xi-x-X2-X2-Cys-x-xa-xb-x-x-Cys-y-Xi-xII) (III); ciclo (xui, 2-x-Xi-x-Xi-Xi-x-X2-X2-Cys-x-xa-xb-xc-x-Cys-y-Xi-Xiv) (???'), en donde a) i se elige en forma individual e independiente del grupo que consiste de aminoácidos acídicos; y/o b) x2 se elige en forma individual e independiente del grupo que consiste de aminoácidos básicos.

En una modalidad más específica del primer aspecto de esta invención, el péptido cíclico como aquí se proporciona puede ser un péptido cíclico de las fórmulas IV, V o V : ciclo (xI-xi-xi-x4-X2-X2-Cys-x3-xA5-xb-xc-X2-Cys-y-xi-X3-X3-X11) (IV); CiclO (Xl-X2-X4- l- 4- l- l- 4-X2-X2-CyS-X3-Xa5-Xb-XC-X2- Cys-y-xi-x3-x3-X4-x5-X2-xII) (V) ; Ciclo (XIII, 2-X4- l- 4- l- l-X -X2-X2-CyS-X3-Xa5-Xb-XC-X2- Cys-y-Xi-x3-x3-X4-Xiv) (V1 ) , en donde a) xi se elige en forma individual e independiente del grupo que consiste de aminoácidos acídicos; b) x2 se elige en forma individual e independientemente del grupo que consiste de aminoácidos básicos ; c) X3 se elige en forma individual e independiente del grupo que consiste de Leu, lie, Val, et, Trp, Tyr y Phe; d) x4 se elige en forma individual e independiente del grupo que consiste de Ser, Thr, Ala y Gly; y/o e) x5 se elige en forma individual e independiente del grupo que consiste de Gln y Asn.

En una modalidad adicional del primer aspecto de esta invención, los péptidos cíclicos comprende un tramo de aminoácido como se define por la posición de aminoácidos 2-12 o 2-14 de las fórmulas II o IV, un tramo de aminoácido como se define por la posición de aminoácidos 4-16 o 4-18 de la fórmula III o V o un tramo de aminoácidos como se define por la posición de aminoácidos 3-15 o 3-17 de la fórmula o III1 o V . En una modalidad más general del primer aspecto de esta invención, el péptido cíclico como se proporciona aquí puede ser un péptido cíclico de las fórmulas II, III o III'.

En una modalidad particular adicional del primer aspecto de esta invención, el péptido cíclico como se proporciona aquí puede comprender el tramo de aminoácidos b) aci-Glu-Ala-bas-bas-Cys-Tyr-neu-aci-neu-bas ; c) aci-neu-aci-Glu-Ala-bas-bas-Cys-Tyr-neu-aci-neu-bas ; d) aci-Glu-Ala-bas-bas-Cys-Tyr-neu-aci-neu-bas-Cys-Ser; o aci-neu-aci-Glu-Ala-bas-bas-Cys-Tyr-neu-aci-neu-bas-Cys-Ser, en donde "aci" representa aminoácido acídico, "neu" representa aminoácido neutro y "bas" representa aminoácido básico. Cada residuo aminoácido de los cuatro tramos aminoácido anteriores también puede definirse independientemente como el residuo aminoácido correspondiente de cualquiera de las fórmulas I, II, III, ???', IV, V, y V como aquí se proporciona.

En una modalidad particular adicional del primer aspecto de esta invención, el péptido cíclico como aquí se proporciona puede comprender el tramo de aminoácidos e) Asp-Xxxi-Xxx4-Arg-Arg-Cys-Xxx3-Asn- Asp-Pro-Lys (SEQ ID NO. f) Glu-Ser-Asp-Xxxi-Xxx4-Arg-Arg-Cys- Xxx3-Asn-Asp-Pro-Lys (SEQ ID NO. 30), donde Xxxi se define como Xxx3 se define como "x" o "x3". y/o Xxx se define como "x" o "x4" como se menciono en las fórmulas anteriormente ilustradas. Por ejemplo, el tramo de aminoácidos anteriormente mencionado puede ser g) Asp-Glu-Ala-Arg-Arg-Cys-Tyr-Asn-Asp- Pro-Lys (SEQ ID NO. 29) o h) Glu-Ser-Asp-Glu-Ala-Arg-Arg-Cys-Tyr- Asn-Asp-Pro-Lys (SEQ ID NO . 30) .

En particular se prevé aquí que los péptidos cíclicos de esta invención comprenden uno o más epítopos desarrollados o transportados por ?i-ECn, como por ejemplo, epítopos transportados por cualquiera de los tramos de aminoácidos anteriormente mencionados (o por partes de los péptidos cíclicos descritos que comprenden estos tramos de aminoácidos). En este contexto, el término "epítopo" particularmente se refiere a un tramo de aminoácidos al cual se liga un anticuerpo (auto) anti- ?i-AR. Particularmente, un epítopo en el contexto de esta invención consiste de al menos 3, al menos 4, al 'menos 5, al menos 6, al menos 7, al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13 o al menos 14 aminoácidos. La persona con destreza en la técnica está en la posición para deducir cual o cuales residuo aminoácido (s ) particulares de ?i-ECn contribuyen a (uno o varios) epítopos a los cuales ligan los anticuerpos (auto)anti- ?i-AR. Por lo tanto, puede deducir que residuos aminoácidos particulares tienen al menos que estar comprendidos en los péptidos cíclicos de esta invención, a fin de asegurar que estos péptidos ligan anticuerpos (auto) anti- ?i-AR. Para este propósito, varios medios y métodos conocidos en la técnica pueden emplearse (por ejemplo, medios y métodos para cartografiar epítopo (como PepSpots , PepSpots , Biacore, Mino acid scans (like alanine scans) ) .

Ejemplos no limitantes de un péptido cíclico de acuerdo con esta invención son péptidos cíclicos seleccionado del grupo que consiste de: a) péptido cíclicos que se forman o son capaces de formarse por la secuencia de aminoácidos como se ilustra en cualquiera de SEQ ID NO. 25, 27, 1, 2 y 9 a 10; i) péptido cíclicos que son capaces de formarse por una secuencia de aminoácidos como se codifica por una secuencia de nucleótidos como se ilustra en cualquiera de SEQ ID NO. 26, 28, 9, 10, 13 y 14; y j ) péptido cíclicos que son capaces de formarse por una secuencia de aminoácidos como se codifica por una secuencia de nucleótidos que difiere de la secuencia de nucleótido como se ilustra en cualquiera de SEQ ID NO. 26, 28, 9, 10, 13 y 14 debido a la degeneración del código genético.

De los péptidos cíclicos de acuerdo con esta invención, aquellos péptidos cíclicos que son péptidos mutantes Cys-Ser, es decir que tienen Cys correspondiente al tercer Cys de la ?i-ECn (el Cys en la posición 216 de ?i-AR) intercambiado por ABu o un análogo del mismo, se prefieren en particular. Los ejemplos dados anteriormente se refieren a estos péptidos cíclicos particularmente preferidos. Como se demuestra en los ejemplos anexos, estos péptidos cíclicos son particularmente útiles para inhibir o diagnosticar/detectar anticuerpos anti- ?i-AR.

La estructura particular de los péptidos cíclicos particularmente preferidos e emplificados se dan por cualquiera de las siguientes fórmulas VI a IX' : ciclo (Arg-Ala-Glu-Ser-Asp-Glu-Ala-Arg-Arg-Cys-Tyr-Asn-Asp-Pro-Lys-Cys-ABu-Asp-Phe-Val-Thr-Gly) (IX' ) ; ciclo (Ala-Asp-Glu-Ala-Arg-Arg-Cys-Tyr-Asn-Asp-Pro-Lys-Cys-ABu-Asp-Phe-Val-Gln) (VI) ; ciclo (Ala-Arg-Ala-Glu-Ser-Asp-Glu-Ala-Arg-Arg-Cys-Tyr-Asn-Asp-Pro-Lys-Cys-ABu-Asp-Phe-Val-Thr-Asn-Arg-Gln) (VII) ; ciclo (Ala-Asp-Glu-Ala-Arg-Arg-Cys-Tyr-Asn-Asp-Pro-Lys-Cys-ABu-Asp-Phe-Val-DGlu) (VIII) ; y ciclo (Ala-Arg-Ala-Glu-Ser-Asp-Glu-Ala-Arg-Arg-Cys-Tyr-Asn-Asp-Pro-Lys-Cys-ABu-Asp-Phe-Val-Thr-Asn-Arg-DGlu) (IX) · Ejemplos no limitantes de péptidos cíclicos menos preferidos de acuerdo con esta invención son péptido cíclicos seleccionados del grupo que consiste de: a) péptido cíclicos que se forman por una secuencia de aminoácidos como se ilustra en cualquiera de SEQ ID NO. 5, 6 11 y 12; b) péptido cíclicos que se forman por una secuencia de aminoácidos como se codifica por una secuencia nucleótido como se ilustra en cualquiera de SEQ ID NO. 7, 8, 15 y 16; y c) péptido cíclicos que se forman o capaces de formar una secuencia de aminoácidos como se codifica por una secuencia de nucleótidos que difiere ce la secuencia de nucleótidos como se ilustra en cualquiera de SEQ ID NO. 7, 8, 15 y 16 debido a la degeneraron del código genético.

La estructura particular de los péptidos cíclicos menos preferidos ejemplificados anteriores se da por cualquiera de las siguientes fórmulas X a XIII: ciclo (Ala-Asp-Glu-Ala-Arg-Arg-Cys- yr-Asn-Asp-Pro-Lys-ABu-Cys-Asp-Phe-Val-Gln) (X) ,- ciclo (Ala-Arg-Ala-Glu-Ser-Asp-Glu-Ala-Arg-Arg-Cys-Tyr-Asn-Asp-Pro-Lys-ABu-Cys-Asp-Phe-Val-Thr-Asn-Arg-Gln) (XI); ciclo (Ala-Asp-Glu-Ala-Arg-Arg-Cys-Tyr-Asn-Asp-Pro-Lys-ABu-Cys-Asp-Phe-Val-DGlu) (XII) ; ciclo (Ala-Arg-Ala-Glu-Ser-Asp-Glu-Ala-Arg-Arg-Cys-Tyr-Asn-Asp-Pro-Lys-ABu-Cys-Asp-Phe-Val-Thr-Asn-Arg-DGlu) (XIII).

Los péptidos anteriores son modalidades menos preferidas de esta invención ya que los péptidos como los péptido cíclicos "Cys-ABu" correspondientes (o péptido cíclicos "Cys-Ser") son entre otros, in vivo más funcionales que los péptidos mutantes cíclicos "ABu-Cys" menos referidos (péptido cíclicos "Ser-Cys").

En este contexto, se anota que los ejemplos más preferidos de los péptidos cíclicos de acuerdo con esta invención son particularmente aquellos péptidos cíclicos, la función farmacológica y/o de diagnóstico de los cuales se ha demostrado en los ejemplos anexos o la función farmacológica y/o de diagnóstico de los cuales puede ser al menos pronosticada en base a los . ejemplos (por ejemplo aquellos caracterizados por cualquiera de las fórmulas VI a IX' ) .

La presente invención también se refiere a péptidos cíclicos derivados de ECu de /?2-AR, como aquellos péptidos cíclicos que corresponden a los derivados péptidos de ? ECn de esta invención pero que estructuralmente están, más cercanamente relacionados a ECu de ?2-AR.

Estos péptidos pueden ser por ejemplo empleados como péptidos de referencia/control, cuando se prueban/ensayan péptidos derivados de ß?-??tt. Un ejemplo no limitante particular de estos péptidos cíclicos derivados de ECII de ?2~AR es el péptido cíclico como se ilustra por la siguiente fórmula: ciclo (Arg-Ala-Glu-Ser-Asp-Glu-Ala-Arg-Arg-Cys-Tyr-Asn-Glu-Pro-Lys-Cys-Abu-Asp-Phe-Val-Thr-Gly) .

Se entenderá que para los diversos péptidos de la presente invención, una cierta flexibilidad y variabilidad en la secuencia primaria, es decir la estructura principal de secuencia de aminoácidos, es posible siempre que la estructura secundaria y terciaria total de los péptidos respectivos, que se define por al menos algunos residuo aminoácidos fijos y por su arreglo espacial, se asegura (ver, por ejemplo, Fórmula I,) .

Con base en las enseñanzas que aquí se proporcionan, la persona con destreza por una parte está fácilmente en posición de encontrar variantes correspondientes de los péptidos de la invención. Por otra parte, la persona con destreza es capaz de probar si una variante determinada de los péptidos de la presente invención todavía tiene la función deseada, por ejemplo la capacidad para ligar específicamente a anticuerpos ?-AR, y por lo tanto tiene el potencial para una intervención médica correspondiente, como las aplicaciones terapéuticas y de diagnóstico descritas y proporcionadas aquí. Guía experimental correspondiente para estas pruebas, es decir ensayos respectivos, se proporcionan y describen aquí en forma ejemplar, particularmente en los ejemplos anexos.

De acuerdo con esto, también se proporcionan aquí variantes de los péptidos aquí descritos e ilustrados, dado que, primero, estas variantes todavía son funcionalmente activas de acuerdo con esta invención, es decir funcionalmente activas como socios de enlace para anticuerpos anti- ?-AR, particularmente para anticuerpos anti-3i-AR contra /?I-ECII, más en particular funcionalmente activos como inhibidores de ß?-AR y aún más preferiblemente activos en inhibir la interacción entre anticuerpos ß?-AR y anti- ?i-AR contra el ß?-ECjx, más preferiblemente anticuerpos auto-anti- ?i-AR contra ^i-ECn; y, en segundo, que estas variantes no están presentes en forma de mezclas de isómeros o no forman mezclas de isómeros cuando se ciclizan de acuerdo con (el método de producción de) esta invención. Estas variantes se prevé que solo tienen dos ciertos residuos Cys que se forman o son capaces de formar solo un enlace intramolecular individual (por e emplo enlace disulfuro) .

Dentro de las variantes de los péptidos de la presente invención, por ejemplo se prevé que uno o más aminoácidos de los péptidos ("x" como se refiere, por ejemplo, en la fórmula I) se reemplazan por uno o más otros aminoácidos de origen natural o sintético. En este contexto, se prefiere que este o estos intercambios de aminoácidos sean uno o varios (a) intercambios de aminoácidos conservadores, es decir que el aminoácido de reemplazo pertenezca a la misma categoría de aminoácidos que el aminoácido a reemplazar. Por ejemplo, un aminoácido acídico puede ser reemplazado por otro aminoácido acídico, un aminoácido básico puede ser reemplazado por otro aminoácido básico,- un aminoácido alifático puede ser reemplazado por otro aminoácido alifático y/o un aminoácido polar puede ser reemplazado por otro aminoácido polar.

De acuerdo con esto, en forma particular preferida y variantes proporcionadas de los (ciclo) péptidos de la presente invención son variantes en donde al menos uno de un aminoácido acídico se reemplaza por un aminoácido diferente seleccionado del grupo que consiste de aminoácidos acídicos, al menos uno de los aminoácidos básicos se reemplaza por un aminoácido diferente seleccionado del grupo que consiste de aminoácidos básicos, al menos uno de un aminoácido polar se reemplaza por un aminoácido diferente seleccionado del grupo que consiste de aminoácidos polares y/o al menos un aminoácido alifático se reemplaza por un aminoácido diferente seleccionado del grupo que consiste de aminoácidos alifáticos (dado que se cumplen los requerimientos anteriormente mencionados) .

Se prevé particularmente que los intercambios de aminoácidos que llevan variaciones de los péptidos (cíclicos) descritos son tales, que el patrón de polaridad y carga dentro de la estructura terciaria de la variante resultante, todavía imita en . forma sustancial la estructura tridimensional de el o los epítopos ECu correspondientes de ß?-AR.

Con respecto a las "Variantes" de los (ciclos) de la presente invención, la aquí definida Cys también puede ser reemplazada por otros aminoácidos,- siempre que el reemplazo todavía lleve a un enlace intramolecular individual, como aquel de un enlace disulfuro dentro del ciclo péptido, es decir para evitar la formación de mezclas de isómeros durante ciclización y/o una imitación correcta de ECu de ß?-AR. Este aminoácido puede entre otros, ser un aminoácido que no es de origen natural, como un aminoácido que no es de origen natural que tiene un grupo -SH capaz de formar una unión disulfuro. Sin embargo se prefiere aquí que el Cys dado en la fórmula I anterior, sin duda es un aminoácido de origen natural, de preferencia la propia Cys.

También se reconocerá por aquellos con destreza en la técnica que uno o varios de los aminoácidos que forman el péptido (cíclico) de la presente invención pueden ser modificados. De acuerdo con esto cualquier aminoácido como se emplea aquí también puede representar su forma modificada. Por ejemplo, un residuo alaniná como se emplea aquí puede comprender un residuo alanina modificado. Estas modificaciones pueden entre otras ser una metilación o acilación o semejantes. Esta o estas modificaciones o uno o varios aminoácidos modificados se prevén en el contexto de la presente invención siempre que el aminoácido así modificado y más particularmente el péptido que contiene este aminoácido así modificado todavía este funcionalmente activo como se define aquí, como funcionalmente activo como un inhibidor de anticuerpos anti^i-AR, de preferencia activos para inhibir la interacción entre ß?-AR y anticuerpos y más preferiblemente autoanticuerpos dirigidos contra ß?-AR. Ensayos correspondientes para determinar si este péptido, es decir un péptido . que comprende uno o varios aminoácidos modificados, cumple con este requerimiento se conoce por la persona con destreza en la técnica y entre otros también se describen aquí particularmente en su parte ejemplar.

La invención también proporciona derivados de los péptidos (cíclicos) descritos tales como sales con ácidos orgánicos e inorgánicos fisiológicos como HC1, H2SOi, H3PO4, ácido málico, ácido fumárico, ácido citrónico, ácido tartárico, ácido acético.

Como se emplea aquí, las secuencias de los péptidos descritos se indican del extremo N al extremo C, con lo que el extremo N está en el lado izquierdo y el extremo C está en el lado derecho de la secuencia de aminoácidos ilustrada respectiva. Cuando se refiere a péptidos cíclicos, las secuencias correspondientes se indican del lado que corresponde al lado izquierdo de la fórmula I al lado que corresponde al lado derecho de la fórmula I.

Un "peptido cíclico" o "ciclopéptido" y semejantes de acuerdo con la presente invención es un peptido que forma intramolecularmente una estructura de anillo molecular dentro de su secuencia de aminoácidos primaria/estructura principal de aminoácidos en al menos uno, de preferencia al menos dos más preferible exactamente dos enlaces intramoleculares que tienen carácter covalente. La formación de esta estructura de anillo molecular es, en el contexto de esta invención también denominada "ciclización" .

En una modalidad particularmente preferida, el péptido cíclico de esta invención tiene dos enlaces intramoleculares que tienen carácter covalente, en donde uno de estos enlaces es un enlace intramolecular entre los extremos terminales N y C de un péptido que es la secuencia de aminoácidos primaria/estructura principal de aminoácidos del péptido cíclico descrito y el otro es un enlace intramolecular entre dos aminoácidos no terminales de este péptido. Como se mencionó, estos dos aminoácidos no terminales pueden ser dos Cys .

En general, "ciclización" de acuerdo con esta invención puede ocurrir en al menos un enlace que es un enlace covalente seleccionado del grupo que consiste de enlaces S-S, enlaces péptido, enlaces de carbono tales como C-C o C=C, enlaces éster, enlaces éter, enlaces azo, enlaces C-S-C, enlaces C-N-C y enlaces C=N-C.

Particularmente, el enlace péptido como se menciona a través de esta invención puede formarse por el grupo NH2 de un aminoácido N-terminal y el grupo COOH de un aminoácido C-terminal de un péptido que forma la secuencia de aminoácidos primaria/estructura principal de aminoácidos del péptido cíclico descrito.

De preferencia, un enlace intramolecular entre los extremos de terminal N y C de un péptido que forman la secuencia de aminoácidos primaria/estructura principal de aminoácidos del péptido cíclico descrito, es un enlace péptido y un enlace intramolecular entre dos aminoácidos no terminales de este péptido es un enlace S-S (es decir enlace disulfuro) .

En contexto de esta invención, un enlace S-S intramolecular dentro del péptido cíclico que se proporciona, puede formarse entre dos residuos Cys con una secuencia de aminoácidos primaria/estructura principal de aminoácidos del péptido cíclico.

Dentro de los péptidos cíclicos de esta invención, no solo los dos enlaces covalentes intramoleculares particulares anteriormente mencionados pueden formarse sino también pueden ocurrir adicionales enlaces intramoleculares, con la condición de que la funcionalidad aquí descrita de los péptidos cíclicos se mantiene y que los péptidos cíclicos todavía pueden ser fácilmente caracterizados en forma bioquímica, que, por ejemplo significa que no se forman mezclas de isómeros durante la ciclización de la secuencia de aminoácidos primaria/estructura principal de aminoácidos correspondiente .

Por ejemplo, estos enlaces intramoleculares adicionales son uniones adicionales formadas por una cadena lateral de grupos H2 y grupos COOH de los aminoácidos constituyentes .

Términos como "estructura principal de aminoácidos" o "secuencia de aminoácidos primaria" como se emplea a través de la presente invención, se refieren por una parte a ese componente estructural o parte de un péptido cíclico que se forma o se puede formar por su secuencia de aminoácidos correspondiente. Por otra parte, estos términos se refieren a los péptidos lineales capaces de formar los péptidos cíclicos de esta invención por ciclización.

En una modalidad particular del primer aspecto de esta invención, un péptido cíclico se proporciona que se obtiene por el método para producir un péptido cíclico como aquí se proporciona. Las definiciones dadas a continuación también aplican respecto a este péptido cíclico que se proporciona particularmente de la presente invención.

En una modalidad del primer, aspecto de esta invención, también estos péptidos se proporcionan, los péptidos cíclicos descritos se pueden formar o son formados. Particularmente estos péptidos son los péptidos lineales que forman o son capaces de formar los péptidos cíclicos aquí descritos, es decir su secuencia de aminoácidos primaria/estructura principal de aminoácidos.

En general, este péptido lineal pueden ser cualquier péptido, el enlace covalente del extremo N y C del cual resulta en un péptido cíclico como se describe de acuerdo con la presente invención. Por ejemplo, este péptido lineal puede ser algún tipo de compuesto intermediario en un procedimiento para producir los péptidos cíclicos de esta invención, como el método para producir un péptido cíclico como aquí se describe.

En general, el extremo terminal N y C de un péptido lineal que aquí se proporciona, puede ser cualquier par de aminoácidos que se encuentran en proximidad directa entre sí con la estructura principal de aminoácidos de un péptido cíclico descrito en el contexto de esta invención. En otras palabras, la ciclización (cierre de anillo) el péptido cíclico de esta invención en general puede ocurrir entre cualquiera de los pares de aminoácidos . La persona con destreza fácilmente está en la posición de encontrar estos pares de aminoácidos particulares que son efectivos/adecuados para actuar como extremos terminales N y C de un péptido lineal aquí descrito, es decir que son efectivos/adecuados para actuar como un par de aminoácidos involucrados en la ciclización/cierre de anillo como se define en el contexto de esta invención.

En un ejemplo preferido pero no limitante, la ciclización (cierre de anillo) de un péptido lineal de esta invención puede ocurrir entre Ala y Gln o Glu, es decir el aminoácido N-terminal de este péptido lineal sería Ala y el aminoácido C-terminal sería Gln o Glu. Ejemplos de estos péptidos lineales capaces de formar el péptido cíclico de la presente invención son SEQ ID NO. 1 y 2 y menos se prefieren SEQ ID NO. 3 y 4.

En otro ejemplo preferido pero no limitante, la ciclización (cierre de anillo) de un péptido lineal de esta invención, puede ocurrir entre Lys y Pro, es decir el aminoácido N-terminal de este péptido lineal sería Lys y el aminoácido C-terminal sería Pro. Ejemplos de estos péptidos lineales capaces de formar el péptido cíclico de la presente invención son SEQ ID NO. 9 y 10 y menos preferidos SEQ ID NO. 11 y 12.

En un ejemplo más preferido pero no limitante, particularmente cuando un péptido . cíclico 22mero se proporciona, la ciclización (cierre.de anillo) de un péptido lineal de esta invención puede ocurrir entre Arg y Gly, es decir el aminoácido N-terminal de este péptido lineal será Arg y el aminoácido C-terminal sería Gly. Un ejemplo de este péptido lineal capaz de formar el péptido cíclico de la presente invención es SEQ ID NO. 25.

En otro ejemplo más preferido pero no limitante, en particular cuando un péptido cíclico 22me o se proporciona, puede ocurrir la ciclización (cierre de anillo) de un péptido lineal de esta invención entre Lys y Pro, es decir el aminoácido N-terminal de este péptido lineal sería Lys y el aminoácido C-terminal sería Pro. Un ejemplo de este péptido lineal capaz de formar el péptido cíclico de la presente invención es SEQ ID NO. 27.

Además de esta estructura principal de aminoácido, los péptidos cíclicos de la invención pueden comprender (por ejemplo tienen el ligando en forma covalente (a) uno o varios sustituyentes adicionales como etiquetas, anclas (como anclas de membrana proteinácea) , etiquetas (etiquetas HIS) y semejantes. Sustituyentes y métodos apropiados para agregarlos al péptido cíclico de esta invención se conocen por aquellos con destreza en la técnica.

Ejemplos de etiquetas en este contexto incluyen entre otras, fluorócromos (como fluoresceína, rodamina, Rojo Texas, etc.), enzimas (como peroxidasa de rábano picante, ß-galactosidasa, fosfatasa alcalina) , isótopos radioactivos (como 32P, 33P, 35S, 1251 o 1231, 1351, 1241, 11C, 150), biotina, digoxigenina, metales coloidales, compuestos quimio o bioluminescentes (como dioxetanos, luminol o acridinios) . Una etiqueta particularmente prevista que puede ligarse al péptido de esta invención es un fluorócromo que pertenece a un par FRET, de fluorócromos , por ejemplo una variante GFP (por ejemplo GFP, eGFP, EYFP o ECFP) .

Una variedad de técnicas están disponibles para etiquetar biomoléculas , como es bien conocido por la persona con destreza- en la técnica y se consideran dentro del alcance de la presente invención y comprenden inter alia, acoplamiento covalente de enzimas de grupos biotinilo, fosforilaciones biotinilaciones , cebado aleatorio, desplazamientos de mella, prolongación (utilizando transferasa terminales). Estas, técnicas por ejemplo se describen en Tijssen, "Practice and theory of enzyme immunoassays " , Burden and von Knippenburg (Eds), Volume 15 (1985); "Basic methods in molecular biology" , Davis LG, Dibmer MD, Battey Elsevier (1990); Mayer, (Eds) " Immunochemical methods in cell and molecular biology" Academic Press, London (1987); o en la serie "Methods in Enzymology" , Academic Press, Inc. Métodos de detección comprenden pero no están limitados a autoradiografía, microscopía de fluorescencia, reacciones enzimáticas directas e indirectas, etc.

El o los sustituyentes pueden ligarse (por ejemplo en forma covalente) a los péptidos cíclicos de la invención en forma directa o por enlazadores . La persona con destreza fácilmente está en la posición de encontrar los enlazadores apropiados para emplearse en este contexto.

En un aspecto adicional, la presente invención se refiere a una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos que pueden formar o que pueden emplearse para formar o generar un péptido cíclico como se describe en el contexto de esta invención, o su secuencia de aminoácidos primarios/estructura principal de aminoácidos. La presente invención también se refiere a una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos que pueda formar o que puede emplearse para formar o generar los péptidos lineales como se dispone y describe aquí .

Por ejemplo, esta molécula de ácido nucleico pueden comprender una secuencia de nucleótidos como se ilustra en cualquiera de SEQ ID NO. 5, 6, 13, 14, 26 y 28 o menos preferido, SEQ ID NO. 7, 8, 15 y 16 o una secuencia de nucleótidos que difiere debido a la degeneración del código genético.

Este ABu o un análogo de ABu es un aminoácido no genéticamente codificado, no hay moléculas de ácido nucleico existentes que codifican en forma directa el péptido cíclico de la invención, su secuencia de aminoácidos primaria/estructura principal de aminoácidos o el péptido lineal correspondiente. Sin embargo, la persona con destreza está fácilmente en posición de proporcionar moléculas de ácido nucleico que codifican secuencias de aminoácidos que pueden servir como un producto básico o intermedio para la formación o generación de los péptidos cíclicos de la invención. Ejemplos de estas moléculas de ácido nucleicos son aquellas que codifican un tramo.de aminoácidos de ß?-ECn que corresponde a la secuencia de aminoácidos primaria/estructura principal de aminoácidos de los péptidos cíclicos de la invención que tienen ABu (o el análogo ABu) eliminado o reemplazado por cualquier . otro aminoácido genéticamente codificado, de preferencia por un aminoácido que pueden ser reemplazado por ABu (o el análogo ABu) posteriormente .

El significado de los términos "molécula (s) de ácido nucleico", "secuencia (s) de ácido nucleico" y "secuencia (s ) de nucleótido" y semejantes, son bien conocidos en la técnica y se emplean de acuerdo con esto en el contexto de la presente invención.

Por ejemplo, cuando se utilizan a través de esta invención, estos términos se refieren a toda las formas de tipos de origen natural o generados en forma recombinante de secuencias de nucleotido y/o secuencias /moléculas de ácido nucleico así como a secuencias de nucleotido químicamente sintetizadas y/o moléculas/secuencias de ácido nucleico. Estos términos también abarcan análogos de ácido nucleico y derivados de ácido nucleico tales como por ejemplo ADN de conformación restringida, APN, oligonucleótidos tiofosfatos y ribo-oligonucleótidos sustituidos. Además, estos términos también se refieren a cualquier molécula que comprende nucleotidos o análogos nucleotido.

De preferencia, los términos "molécula (s) de ácido nucleico", " secuencia (s ) de ácido nucleico" y "secuencia(s) de nucleotidos" y semejantes, se refieren a ácido deoxiribonucleico (DNA) o ácido ribonucleico (R A) . La o las "molécula (s) de ácido nucleico", "secuencia (s) de ácido nucleico" y "secuencia de nucleotido" pueden elaborarse por metodología química sintética que se conoce por una persona con destreza ordinaria en la técnica, o por el uso de tecnología recombinante, o pueden aislarse de fuentes naturales, o por una combinación de las mismas.

Las moléculas de ácido nucleico como se proporciona aquí son particularmente útiles para producir un péptido cíclico de la invención, por ejemplo por el método correspondiente aquí descrito.

Todavía en otro aspecto, la presente invención se refiere a un método para producir un péptido cíclico de la presente invención, que comprende las etapas de a) (i) cultivar la célula hospedera recom inante de la presente invención bajo condiciones tales que se expresa una secuencia de aminoácidos que puede formar o que puede utilizarse para formar o para generar una estructura principal de aminoácidos del péptido cíclico aquí descrito (o el péptido lineal de esta invención) , recuperar la secuencia de aminoácido y conectar la secuencia de aminoácidos en la estructura principal de aminoácidos (o el péptido lineal de estas invención) ; o (ii) sintetizar en forma química la estructura principal de aminoácidos del péptido cíclico aquí descrito (o el péptido lineal de esta invención) ; y b) ciclización de la estructura principal de aminoácidos (o el péptido lineal) para formar el péptido cíclico aquí descrito.

Las definiciones dadas previamente con respecto al término "ciclización" aplican aquí, mutatis mutandis. En el contexto particular del método anterior, el significado del término "ciclización" abarca tanto formación del puente intramolecular (enlace disulfuro) como el cierre de anillo por conexión covalente de los extremos N y C de las estructuras principales de los péptidos cíclicos a producir.

.Las definiciones aquí dadas respecto al péptido cíclico, su estructura principal de aminoácidos o el péptido lineal correspondiente de acuerdo con esta invención, así como con. respecto a la célula hospedera que aquí se proporciona, aplican aquí, mutatis mutandis.

En el contexto del método anterior para producir los péptidos cíclicos de esta invención, la persona con destreza sabe como la secuencia de aminoácidos codificada puede ser "convertida" en la estructura principal de aminoácidos de los péptidos cíclicos de la invención. Por ejemplo, si la secuencia de aminoácidos codificada carece del aminoácido en la posición correspondiente a la posición de ABu (o un análogo ABu) de los péptidos cíclicos proporcionados, la secuencia de aminoácidos codificada puede ser "convertida" de acuerdo con el método, al introducir ABu (o su análogo ABu) en la posición correspondiente. Si la secuencia de aminoácidos codificada comprende un aminoácido o un tramo de aminoácidos en lugar de ABu (o un análogo ABu) , la secuencia de aminoácidos puede ser "convertida" de acuerdo con el método al reemplazar el aminoácido o tramo de aminoácido con ABu (o un análogo ABu) .

Como ya se mencionó anteriormente con respecto a los péptidos cíclicos y lineales proporcionados, en una modalidad preferida de este aspecto adicional de la invención, el aminoácido N-terminal del péptido lineal/estructura principal de aminoácido a ciclizarse, a fin de producir un péptido cíclico de esta invención es Ala, Arg o Lys y el aminoácido C terminal correspondiente es Gln, Gly o Glu (también DGlu es posible) o Pro. Sin embargo, como se mencionó anteriormente, también otros aminoácidos N- y extermínales se prevén, es decir también otros sitios de ciclizacióri (cierre de anillo) pueden emplearse en el contexto del método descrito.

La persona con destreza en la técnica es fácilmente capaz de poner el método aguí descrito a producir un péptido cíclico en la práctica, con base en su conocimiento general común y la técnica previa como por ejemplo WO 2006/103101, que describe une metodología general de como sintetizar péptidos y particularmente ciclo péptidos. También, las enseñanzas de la invención, por ejemplo en la parte experimental anexa (ejemplo 1), proporcionan correspondiente guía técnica para habilitación.

En el Ejemplo 1 anexo no limitante, los mutantes ciclopéptido primero se sintetizaron en forma de sus estructuras principales de aminoácidos/péptidos lineales (por ejemplo al aplicar un enfogue de síntesis química, como la estrategia Fmoc / ter butilo (como se describe en WO 2006/103101; Chen W.C. and White P.D. : Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis, Oxford University Press 2003)), y después se ciclizaron en forma covalente en la estructura principal por condensación del grupo carboxilo C-terminal con el grupo amino del aminoácido N-terminal ( "head to tail" ciclization; ates S. and Albericio F.: Solid phase synthesis, CRC-Press, 2000) .

De manera subsecuente, un enlace disulfuro se establece entre esos dos residuos cisteína de los péptidos lineales que son capaces de formar una unión disulfuro (por ejemplo, entre Cys7 y Cysi3 del péptido 18mero, entre Cysio y Cysi6 del péptido 22mero o entre Cysn y Cysn del péptido 25mero) por interacción química que se conoce en la técnica (e.g. Benoiton N.L.: Chemistry of Petide Synthesis. CRC-Press, 2005) .

En general, en el contexto de la etapa de "ciclización" del método anteriormente descrito, el cierre de anillo de la estructura principal lineal de los péptidos cíclicos a producirse, puede realizarse antes o después de la formación del puente S-S. En otras palabras, el puente S-S entre los dos residuos Cys de la cadena AA de los péptidos pueden ser la primera etapa en el procedimiento de "ciclización" del proceso de producción descrito y el cierre de anillo puede ser la segunda etapa o vice versa. La persona con destreza en la especialidad es capaz de encontrar cual de estos enfoques particulares es apropiado para una configuración determinada de las condiciones previa de producción.

Como se mencionó anteriormente; las estructuras principales de aminoácidos/péptidos lineales de los péptidos cíclicos a producirse, también pueden producirse al utilizar técnicas de ingeniería recombinante . Estas técnicas son bien conocidas en la especialidad (por ejemplo Sambrook, supra) . Como también se mencionó anteriormente, por este tipo de producción de las estructuras principales de aminoácido/péptidos lineales pueden aprovecharse particularmente las moléculas de ácidos nucleicos, vectores y/o células hospederas aquí descritos e ilustrados. Las definiciones dadas de manera correspondiente con anterioridad aplican aquí, mutatis mutandis .

Varios enfoques de la síntesis de péptidos, en particular enfoques de síntesis de péptidos cíclicos se conocen en la técnica (e.g. Williams, Chemical Appro ches to the Synthesis . of Peptides, CRC-Press 1997; Benoiton: Chemistry of Peptide Synthesis. CRC-Press, 2005). La persona con destreza está fácilmente en posición para aplicar el conocimiento de la técnica previa a los requerimientos particulares de la producción de los péptidos cíclicos proporcionados, por ejemplo del método descrito para producir los péptidos cíclicos proporcionados, con base en la enseñanza aquí suministrada.

Como ya se mencionó anteriormente, esta invención también se refiere a un péptido cíclico que se obtiene o es capaz de obtenerse por el método anteriormente descrito, pero también a un péptido lineal correspondiente (secuencia primaria/estructura principal de aminoácidos del péptido cíclico correspondiente) capaz de obtenerse u obtenido por el método anteriormente descrito como algún tipo de producto intermedio (particularmente un producto capaz de obtenerse u obtenido por la etapa a) del método anteriormente descrito) .

En general, el péptido cíclico de acuerdo con la presente invención, puede entre otros, ser empleado en enfoques de intervención médica. Estos enfoques comprenden el uso como en un agente de diagnóstico y para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de enfermedades o el uso en o como una composición, de preferencia una composición farmacéutica, una composición de diagnóstico o un equipo de diagnóstico, de preferencia para la detección de anticuerpos anti-p-AR, más preferiblemente para la detección de anticuerpos anti- i-AR.

Como se mencionó, los anticuerpos como se define o describe aquí de preferencia son autoanticuerpos .

Usos y aplicaciones no limitantes de los compuestos, particularmente el péptido cíclico de acuerdo con la presente invención se describen aquí, por ejemplo más a continuación .

La presente invención también se refiere a una composición que comprende un péptido cíclico o uno lineal, una molécula de ácido nucleico, un vector o una célula hospedera recombinante como se describe y proporciona en el contexto de la presente invención, y opcionalmente un portador.

En una modalidad particular de este aspecto, la composición es una composición farmacéutica y el portador es un portador farmacéutico aceptable.

La composición de esta invención, particularmente la composición farmacéutica de esta invención, es particularmente útil cuando se emplea en el tratamiento, mejora o prevención como se describe y define aquí. De acuerdo con esto, la composición farmacéutica de esta invención puede emplearse para el tratamiento, mejora o prevención de una enfermedad, en donde la actividad de un ß-AR se mejoró para el tratamiento de un paciente que tiene anticuerpos contra un ß-AR. Aún más, la composición farmacéutica de esta invención puede emplearse para inducir tolerancia inmune de un paciente, particularmente tolerancia inmune de un paciente respecto a tramos inmunogénicos de ß?-AR endógeno.

Aparte de contener al menos un péptido cíclico de la presente invención, la composición (farmacéutica) que se proporciona ya puede comprender dos o una pluralidad (como al menos 3 o al menos 5) péptidos cíclicos de la presente invención.

Igualmente, no solo uno, sino también dos o una pluralidad (como al menos 3 o al menos 5) de los péptidos cíclicos, pueden administrarse a un paciente que requiere intervención médica de acuerdo con la presente invención. De esta manera, la administración de más de un péptido cíclico puede ser en forma simultánea o sucesiva.

Aún más, en una modalidad particular, la presente invención se refiere a la composición farmacéutica, el método o usos para intervención médica o el péptido cíclico o la composición farmacéutica como se describe aquí, en donde el péptido cíclico se administra con o la composición farmacéutica comprende al menos un agente farmacéutico activo adicional .

El agente farmacéutico activo adicional como mínimo puede ser un bloqueador ß-receptor, de preferencia un bloqueador ß-AR selectivo, como por ejemplo, un bloqueador ß?-AR seleccionado del grupo que consiste de atenolol, metoprolol, nebivolol, bisoprolol y semejantes.

Sin estar ligado por teoría, este tipo de combinación particular puede proporcionar protección . de regulación por disminución de ß?-AR selectiva inducida por anticuerpos, por los péptidos cíclicos que aquí se proporcionan, ya que ß?-AR es al mismo tiempo regulada por incremento por ß-bloqueadores como bisoprolol o metoprolol, y finalmente resulta en un efecto sinergístico de los péptidos cíclicos y el o los ß-bloqueadores adicionales.

El portador opcionalmente comprendido en la composición (farmacéutica) de la invención o administrarse junto con la composición (farmacéutica) o el péptido cíclico de la invención, puede particularmente ser un portador, excipiente o diluyente farmacéutico aceptable.

Estos portadores son bien conocidos en la técnica. La persona con destreza fácilmente está en posición para encontrar estos portadores que son particularmente adecuados para emplearse de acuerdo con la presente invención.

A continuación, se describen varios esquemas de administración no limitantes y el uso de un portador farmacéutico aceptable conveniente correspondiente.

Para una administración de la composición farmacéutica y/o los péptidos cíclicos de acuerdo con esta invención mediante inyección subcutánea (s.c.) o intravenosa (i.v.), compuestos de la invención pueden formularse en solución acuosa, de preferencia en amortiguadores fisiológicos compatibles tales como solución de Hank, solución de Ringer o amortiguador salino fisiológico. Para administración transmucosal y transpulmonar, penetrantes apropiados a la barrera a permear se emplean en la formulación. Estos penetrantes en general se conocen en la técnica.

El uso de portadores farmacéuticos aceptables para formular los compuestos de acuerdo con la presente invención en dosis o composiciones farmacéuticas adecuadas para administración sistémica, es decir intravenosa/intraarterial , o subcutánea, está dentro del alcance de la presente invención. Con una selección adecuada de portador y práctica de fabricación conveniente, las composiciones de la presente invención, en particular aquellas formuladas como soluciones, pueden administrarse en forma parenteral, tal como por inyección intravenosa. Los compuestos pueden formularse fácilmente utilizando portadores farmacéuticos aceptables bien conocidos en la técnica, en dosis adecuadas para administración subcutánea u oral. Estos portadores permiten que los compuestos de acuerdo con la presente invención sean formulados como tabletas, pildoras, cápsulas, grageas, líquidos, geles, jarabes, fangos, suspensiones y semejantes, para ingestión oral por un sujeto a tratar.

Los compuestos de la presente invención o medicamentos que los comprenden, pretendidos para administrarse en forma intra corpórea/ intracelular, pueden administrarse utilizando técnicas bien conocidas por aquellos con destreza ordinaria en la especialidad. Por ejemplo, estos agentes pueden encapsularse en liposomas, después administrarse como se describió anteriormente. Los liposomas son bicapas de lípidos esféricas con interiores acuosos. Todas las moléculas presentes en una solución acuosa al tiempo de formación del liposoma, se incorporan en el interior acuoso. Los. contenidos liposomales ambos se protegen del microambiente externo y debido a . que los liposomas se funden con las membranas celulares, se suministran eficientemente cerca de la superficie celular. Sistemas de suministro que involucran liposomas se describen en la patente de los E.U.A. No. 4,880,635 otorgada a Janoff et al. Las publicaciones y patentes proporcionan descripciones útiles de técnicas para suministro de droga de liposomas .

Composiciones farmacéuticas que comprenden un compuesto de acuerdo con la presente invención para administración parenteral y/o subcutánea, incluyen soluciones acuosas del o de los compuesto activos en forma soluble en agua. Adicionalmente, suspensiones de los compuestos activos pueden prepararse como suspensiones de inyección aceitosas apropiadas. Solventes lipofílicos o vehículos convenientes incluyen aceites grasos tales como aceite de ajonjolí, o aceite de ricino o ésteres de ácidos grasos sintéticos, tales como etil oleato o triglicéridos , o liposomas. Suspensiones para inyecciones acuosas pueden contener compuestos que aumentan la viscosidad de la suspensión, tal como carboximetil celulosa de sodio, sorbitol, dextrano o semejantes. Opcionalmente, la suspensión también puede contener estabilizantes convenientes o agentes que aumentan la solubilidad del compuesto para permitir la preparación de soluciones altamente concentradas y para permitir una liberación constantemente lenta de la substancia en el organismo .

Es claro para la persona con destreza que, como de acuerdo con la presente invención, la composición farmacéutica descrita o péptido cíclico puede administrarse en una dosis farmacéutica/terapéuticamente efectiva, lo que significa que se ha alcanzado ¦ una cantidad efectiva farmacéutica/terapéutica del compuesto administrado. De preferencia, una dosis efectiva farmacéutica/terapéutica se refiere a la cantidad del compuesto administrado (ingrediente activo) que produce mejora de síntomas o una prolongación de supervivencia de un sujeto que puede ser determinado por una persona con destreza en la especialidad realizando pruebas rutinarias .

Se nota que el régimen de dosis de los compuestos a administrarse de acuerdo con la presente invención, será determinado por el médico a cargo y los factores clínicos . Como es bien conocido en las técnicas médicas, dosis para cualquier paciente dependen de muchos factores, incluyendo el tamaño del paciente, área superficial del cuerpo, edad, el compuesto particular a administrar, sexo, hora y ruta de administración, salud general, y otras drogas que se administran en forma concurrente. Una persona con destreza en la técnica está al tanto de y es capaz de probar la dosis relevantes, los compuestos para aplicarse en forma médica de acuerdo con la presente invención que se van a administrar.

Como se muestra aquí, el efecto de los péptidos cíclicos que aquí se proporcionan, es decir el bloqueo de los anticuerpos anti- i-AR, puede obtenerse en una forma dependiente de dosis.

De esta manera, la eficiencia de los ciclopéptidos mutados Cys?Ser como se describe aquí, depende de una concentración umbral (Figuras 6 y 7) . El mutante Cys-ABu como se describe aquí, puede actuar igualmente.

De acuerdo con esto, la composición farmacéutica o péptido cíclico descritos pueden administrarse particularmente en una forma que está presente en una concentración, es decir alcanza una concentración umbral, de al menos 0.05 mg por kg de peso corporal, de preferencia en una concentración de al menos 0.1 mg por kg de peso corporal , más preferible en un intervalo de 0.1 mg por kg de peso corporal (100 g/kg) a 100 mg por kg de peso corporal, más preferible en un intervalo de 1 mg por kg de peso corporal a 100 mg por kg de peso corporal y más preferible en un intervalo de 1 mg por kg de peso corporal a 10 mg por kg de peso corporal .

Particularmente, la dosis efectiva de la · composición farmacéutica descrita o péptido cíclico puede ser de aproximadamente 1 mg por kg de peso corporal. También, superiores concentraciones de la composición farmacéutica descrita o péptido cíclico, en general se prevén que se alcanzan por esquemas de administración aplicados de manera correspondiente. Por ejemplo, estas superiores concentraciones pueden ser al menos 2, 3, 4 ó 5 mg por kg de peso corporal . Concentraciones de al menos 1 mg por kg de peso corporal o al menos 2 mg por kg de peso corporal, se prefieren .

Un esquema de administración no limitante particularmente preferido para aplicarse en el contexto de esta invención es una aplicación s.c. o i.v. cada dos o cuatro semanas .

En el modelo de rata empleado aquí, una dosis de 1 a 4 mg/kg i.v. cada mes salteado, fue suficiente para obtener niveles terapéuticos de los compuestos de acuerdo con la presente invención, con dosis respectivas para humanos de preferencia de aproximadamente 0.3-10 mg/kg i.v. o s.c, más preferible de aproximadamente 1-10 mg/kg i.v. o s.c, aún más preferible de aproximadamente 1-5 mg/kg i.v. o s.c. En una modalidad particular, la dosis respectiva para humanos es de aproximadamente 0.1-10 mg/kg i.v. o s.c, más preferible aproximadamente 0.3-5 mg/kg i.v. o s.c, aún más preferible aproximadamente 0.3-2 mg/kg i.v. o s.c.

Como se demuestra aquí, la administración de los péptidos cíclicos descritos puede inicialmente disparar una respuesta inmune opuesta transitoria, en particular cuando se aplica a dosis superiores. Estas respuestas inmunes transitorias a largo plazo son compensadas por la actividad de inactivación del anticuerpo de los péptidos cíclicos administrados. Esto puede llevar a un efecto desacelerado de los péptidos cíclicos administrados, es decir una eliminación desacelerada de los anticuerpos anti-ß?-?? y por lo tanto una reducción desacelerada de actividad ß?-AR (aberrante) .

La presente invención también se refiere a un método para a) el tratamiento, mejora o prevención de una enfermedad en donde la actividad de un ß-AR, de preferencia ß?-AR, se me ora; b) el tratamiento de un paciente que tiene anticuerpos contra ß-AR, de preferencia contra ß?-AR, o que sufre de o está en riesgo en desarrollar una enfermedad como se describe aquí; o c) inducir tolerancia inmune, que comprende la etapa de administrar a un paciente que requiere esta intervención médica, una cantidad farmacéutica activa de un péptido cíclico y/o de una composición farmacéutica como se describe aquí, y opcionalmente un portador farmacéutico aceptable.

La presente invención también se refiere a un péptido cíclico o una composición farmacéutica como se describe aquí, y opcionalmente un portador farmacéutico aceptable, para, o para uso en, a) el tratamiento, mejora o prevención de una enfermedad en donde la actividad de un ß -AR , de preferencia ß?-AR , se mejora; b) el tratamiento de un paciente que tiene anticuerpos contra un ß -AR , de preferencia contra ß? -AR , o que sufre de o está en riesgo de desarrollar una enfermedad como se describe aquí; o c) inducir tolerancia inmune.

La presente invención además se refiere a un equipo para utilizar en un régimen para a) el tratamiento, mejora o prevención de una enfermedad en donde la actividad de un receptor ß-adrenérgico ( ß -AR) se mejora; b) el tratamiento de un paciente que tiene anticuerpos contra un ß -AR ; o c) inducir tolerancia inmune, el régimen comprende uno o más ciclos, de preferencia dos o más ciclos, cada ciclo consiste de un periodo de inducción/tratamiento de 2 a 70 días de acuerdo con (a) a (c) seguido por un periodo de reposo de 6 a 280 días, en donde el equipo comprende: (i) de 2 a 70 dosis (es decir, dosis diarias, semanales o mensuales) de un péptido cíclico o una composición farmacéutica de acuerdo con la presente invención; y opcionalmente (ii) de 6 a 280 dosis (por ejemplo dosis diarias, semanales o mensuales) de un placebo o un suplemento de nutrientes; y opcionalmente, (iii) un medio para disponer los componentes de manera tal que faciliten el cumplimiento con el régimen, pero no contienen un péptido cíclico o composición farmacéutica de la presente invención.

En una modalidad particular, el péptido cíclico o composición farmacéutica de la presente invención, o el péptido cíclico o composición farmacéutica a administrar en el contexto de los métodos para tratar, mejorar, evitar o inducir la presente invención, se van a administrar de acuerdo con el régimen anteriormente descrito.

En el régimen descrito, el periodo de reposo puede ser aproximadamente 1, 2, 3, 4 ó 5 veces el periodo de tratamiento/inducción, en donde se prefiere aproximadamente 3 veces el periodo, de tratamiento/inducción. El periodo de tratamiento/inducción puede ser aproximadamente 2, 3, 4 o 5 semanas, en donde aproximadamente 3 semanas se prefiere. Por lo tanto, el periodo de reposo puede particularmente ser de aproximadamente 2 a 25 semanas. De preferencia, el periodo de reposo es aproximadamente 6, 9, 12 ó 15 semanas, en donde aproximadamente 9 semanas se prefieren.

Además, en el régimen descrito, el péptido cíclico o composición farmacéutica puede por ejemplo, administrarse 1 a 7 veces a la semana durante ¦ el periodo de tratamiento/inducción, en donde se prefiere una vez por semana durante el periodo de tratamiento/inducción.

La dosis total a administrarse en el contexto del régimen como se define aquí, puede determinarse por el médico a cargo y depende de factores clínicos como el tamaño del paciente, área superficial del cuerpo, edad. Esto se describe con más detalle aquí en otra parte.

Por ejemplo, la dosis total del péptido cíclico o composición farmacéutica a administrar en el contexto del régimen aquí definido, corresponde a una dosis mensual de 0.1-10 mg/kg, de preferencia de aproximadamente 0.3-5 mg/kg, más preferible de aproximadamente 0.3-2 mg/kg y más preferible de aproximadamente 1 mg/kg.

En un ejemplo particularmente preferido del régimen aquí definido, la dosis total requerida se administra en porciones semanales sobre un periodo de tratamiento/inducción de 3 semanas seguido por un periodo de reposo de 9 semanas.

Cada una de las porciones semanales puede ser particularmente una de las dosis mensuales anteriormente descritas, de preferencia la dosis mensual de aproximadamente 1.0 mg/kg.

Las dosis de un péptido cíclico o composición farmacéutica comprendidas en el equipo de la invención puede proporcionarse en ampolletas individuales o varias o todas las dosis pueden combinarse en una o más ampolletas comunes. De preferencia, la cantidad de la composición farmacéutica/péptido ciclico a administrarse en un cierto punto en tiempo (por ejemplo día) dentro' del periodo de tratamiento/ inducción (por ejemplo porción semanal como se describió anteriormente) se combina en una sola ampolleta. Con respecto al régimen de administración más preferido, se prevé que una dosis mensual se proporcione en una sola ampolleta, en donde un equipo correspondiente comprende tres de estas ampolletas. Opcionalmente, el equipo además puede comprender un folleto/manual de instrucciones que guía al médico a cargo/paciente para administrar una vez las 3 dosis mensuales una vez por semana sobre un periodo de 3 semanas (el periodo de tratamiento/inducción) seguido por un periodo de 9 semanas (el periodo de reposo) .

En general, el péptido cíclico, la composición farmacéutica o el equipo de la presente invención puede proporcionarse con/comprender un jnanual/folleto de instrucciones. El manual /folleto puede guiar al médico a cargo/paciente a través del régimen de administración del péptido cíclico o composición farmacéutica de la invención. En particular, el manual/ folleto de instrucciones puede guiar al médico a cargo/paciente a través del régimen como se describió con anterioridad.

Péptidos cíclicos preferidos a administrarse de acuerdo con el régimen anteriormente descrito y los péptidos cíclicos 22-mero aguí descritos, en particular los péptidos cíclicos 22-mero capaces de formar o formados por la secuencia de aminoácidos como se ilustra en SEQ ID No. 25 o 27.

Las enfermedades para ser intervenidas en forma médica (tratadas, mejoradas, evitadas o diagnosticadas) de acuerdo con esta invención o las enfermedades que el paciente sufre como se define y describe aquí, son de preferencia aquellas, en donde ß?-AR se activa en una forma no fisiológica, más preferible se activa por anticuerpos, más preferiblemente por auto-anticuerpos que se dirigen contra ß?-AR.

En forma ejemplar y de preferencia, las enfermedades a ser intervenidas médicamente de acuerdo con esta invención o las enfermedades que sufre el paciente como se define y describe aquí, sin embargo no se limitan si al grupo de enfermedades del corazón.

Particularmente, las enfermedades cardiacas que van a ser intervenidas médicamente de acuerdo con esta invención o las enfermedades cardiacas que el paciente sufre como se describe y define aquí, pueden comprender pero no están limitadas a enfermedad cardiaca infecciosa y no infecciosa, enfermedad cardiaca isquémica y no iesquémica, enfermedad cardiaca inflamatoria y miocarditis, dilatación cardiaca, cardiomiopatia idiopática, cardiomiopatía dilatada (idiopática) (DCM) , inmuno-cardiomiopatía, falla cardiaca, y cualquier arritmia cardiaca incluyendo latidos de captura prematura ventricular y/o supraventricular así como cualquier arritmia atrial incluyendo fibrilación atrial y/o palpitación atrial .

En otras palabras, la enfermedad cardiaca como se refiere en las descripciones y definiciones dadas aquí con respecto a los métodos o el péptido cíclico o la composición farmacéutica de la invención, pueden ser enfermedades cardiacas seleccionadas del grupo que comprende enfermedad cardiaca e infecciosa y no infecciosa, enfermedad cardiaca isquémica y no isquémica, enfermedad cardiaca inflamatoria y miocarditis, dilatación cardiaca, cardiomiopatía idiopática, cardiomiopatía dilatada (idiopática) (DCM) , cardiomiopatía inmune, falla cardiaca, y cualquier arritmia cardiaca incluyendo latidos de captura prematura ventricular y/o supraventricular así como cualquier arritmia atrial incluyendo fibrilación atrial y/o palpitación atrial.

Habrá de notarse que la enfermedad más preferida para ser intervenida médicamente (tratada, mejora, evitada o diagnosticada) de acuerdo con esta invención o la enfermedad más preferida la cual sufre el paciente como se define y describe aquí es DCM, de preferencia DCM idiopática.

Un sub-grupo particular de los "pacientes" para propósitos de la presente invención son aquellos pacientes que sufren de cualquiera de las enfermedades aquí descritas, más particularmente el grupo de enfermedades cardiacas descritas aquí y que tienen al mismo tiempo anticuerpos dirigidos contra ß-ARs, más preferible anticuerpos contra ß?-AR, con lo que los anticuerpos de preferencia son auto-anticuerpos .

Una enfermedad para ser intervenida médicamente (tratada, mejorada, evitada o diagnosticada) de acuerdo con esta invención o una enfermedad que sufre el paciente como se define y describe aquí, se pretende inducida por anticuerpos contra ß-AR, de preferencia por anticuerpos contra ß?-AR. De preferencia, estos anticuerpos son auto-anticuerpos.

Los medios y métodos que se proporcionan aquí son particularmente útiles cuando se proporcionan en la profilaxis/prevención de una enfermedad como se define aquí. Esto significa que un paciente puede ser tratado con el péptido cíclico y/ composición farmacéutica de la invención antes del inicio (de síntomas) de una enfermedad como se define aquí. Por ejemplo, este tratamiento preventivo puede seguir una aplicación de diagnóstico precedente que, por ejemplo, aprovecha los medios y métodos de diagnóstico que aquí se proporcionan. De esta manera, se prefiere que se aplique un tratamiento preventivo que aprovecha los medios y métodos terapéuticos de esta invención, cuando se diagnostica el riesgo por desarrollar una enfermedad como se define aquí, por ejemplo cuando se detectan (auto-) anticuerpos anti-ß-?? .

En este contexto, un "paciente" preferido es aquel que tiene el riesgo de desarrollar una enfermedad como se define aquí. Particularmente, dicho paciente es aquel que tiene (auto- ) anticuerpos anti-ß-??, de preferencia (auto-) anticuerpos anti- i-AR, pero que no sufre (aún) de una enfermedad como se define aquí, o sus síntomas.

La inmuno tolerancia a inducirse en el contexto de esta invención se prevé particularmente obtenida por supresión de la producción de anticuerpos contra tramos inmunogénicos de la molécula ß-AR, que sin estar ligados por teoría, puede ser debido a un bloqueo de los sitios de reconocimiento de antígeno de las células B tempranas (maduras) productoras de anticuerpos y células B de memoria.

Está dentro de la presente invención que la composición farmacéutica o péptido cíclico proporcionado sea particularmente útil para el tratamiento, prevención y/o mejora de cualquiera de las enfermedades y grupos de pacientes o pacientes como se define aquí, incluyendo la detección de anticuerpos anti^-AR en estos pacientes al utilizar los compuestos anteriormente mencionados. · Un "paciente" para los propósitos de la presente invención, es decir a quien un compuesto de acuerdo con la presente invención se va a administrar o quien sufre de la enfermedad como se define y describe aquí, o quien se pretende sea diagnosticado de acuerdo con esta invención, incluye tanto humanos como otros animales y organismos . De esta manera, los compuestos y métodos de esta invención son aplicables a o en conexión tanto con terapia de humanos como aplicaciones veterinarias incluyendo diagnósticos, procedimientos y métodos de diagnóstico así como procedimientos y métodos de clasificación por etapas. En la modalidad preferida, el paciente es un mamífero y en la modalidad más preferida, el paciente es humano.

Los péptidos cíclicos mutantes de acuerdo con la presente invención también pueden emplearse para la preparación de un medicamento para el tratamiento, prevención y/o mejora de cualquiera de las enfermedades y grupos de paciente/pacientes como se define aquí. Lo que se dice aquí para la composición farmacéutica aplica también al medicamento para la fabricación del cual pueden emplearse los péptidos de la presente invención.

En un aspecto aún' adicional, la presente invención se refiere a un agente de diagnóstico que comprende o es un péptido cíclico o una composición de acuerdo con esta invención y opcionalmente al menos un compuesto biológicamente activo adicional.

De preferencia, el agente de diagnóstico aquí descrito consiste de o comprende un péptido mutante de la presente invención, con lo que el péptido mutante comprende una etiqueta. Ésta etiqueta puede seleccionarse del grupo que comprende etiquetas radioactivas y etiquetas fluorescentes. Etiquetas respectivas se conocen por aquellos con destreza en la técnica. Las definiciones y descripciones de etiquetas como se da con anterioridad, aplican aquí, mutatis mutandis . Típicamente, el péptido es la parte del agente de diagnóstico que confiere características de enlace específicas al agente de diagnóstico, de preferencia enlace a anticuerpos anti-ß?-AR, mientras que la etiqueta confiere las características de señalización al agente de diagnóstico.

El agente de diagnóstico de esta invención puede comprender, aparte de (a) uno o varios péptidos mutantes etiquetados o no etiquetados de la presente invención, un compuesto biológicamente activo adicional. Este compuesto biológicamente activo adicional puede ser un medio para conferir características de señalización al agente de diagnóstico, particularmente en caso que los péptidos mutantes de la presente invención no estén etiquetados. Por ejemplo, el compuesto biológicamente activo adicional puede ser un anticuerpo, de preferencia un anticuerpo monoclonal y más preferiblemente un anticuerpo etiquetado que liga específicamente a un péptido mutante de la presente invención o a un complejo que consiste de un péptido mutante de la presente invención y un anticuerpo anti-p-AR, de preferencia un anticuerpo anti- i-AR.

En un aspecto adicional, la presente invención se refiere a un método para diagnosticar una enfermedad como se define y describe aquí, que comprende las etapas de: a) detectar anticuerpos contra un ß-AR (por ejemplo en una muestra) utilizando el péptido cíclico o la composición o el agente de diagnóstico de la presente invención; y b) diagnosticar la enfermedad, cuando el título de los anticuerpos se incrementa.

En un aspecto adicional, la presente invención se refiere a un método para diagnosticar a un paciente que puede ser tratado utilizando los péptidos mutantes, composiciones farmacéuticas y medicamentos de acuerdo con la presente invención. En contexto de este método en particular también una etapa para detectar anticuerpos contra un ß-AR (por ejemplo en una muestra) utilizando los compuestos de la presente invención y/o una etapa de considerar si el resultado de la etapa de detección indica una enfermedad como aquí se define, puede ser empleado. Como se mencionó, se indica una enfermedad como se define aquí o el riesgo de desarrollar una enfermedad como se define aquí, cuando el título de los anticuerpos anti- -AR se incrementa.

En otro aspecto, la presente invención se refiere a un péptido cíclico, una composición o un agente de diagnóstico como se proporciona y describe aquí para diagnosticar (por ejemplo en una muestra) una enfermedad como se define aquí. De nuevo, una enfermedad como se define aquí o el riesgo para desarrollar una enfermedad como se define aquí, se indica por un título incrementado de los anticuerpos anti^-AR.

En el contexto de la presente invención el término "título incrementado de anticuerpos anti^-AR" significa que el título de anticuerpos anti^-AR (por ejemplo en una muestra derivada de un paciente a diagnosticarse de acuerdo con esta invención) es superior que el de un paciente de control sano, es decir un paciente que no sufre de una enfermedad como se define aquí y/o un paciente que carece de anticuerpos anti-p-AR.

Como se mencionó, en pacientes sanos, anticuerpos anti^-AR usualmente están difícilmente presentes o detectables o no lo están por completo. De acuerdo con esto, un "título incrementado de anticuerpos anti^-AR" de acuerdo con la presente invención, de preferencia se refiere a cualquier ocurrencia de anticuerpos anti- ~AR, es decir cualquier ocurrencia de una cantidad · detectable · de anticuerpos anti- -AR.

Una "muestra" conveniente de acuerdo con la presente invención incluye, pero no está limitada a. (a) una o varias muestras biológicas o médicas, como por ejemplo (a) una o varias muestras que comprenden células o tejidos. Por ejemplo, dicha o dichas (a) muestra o muestras pueden comprender material biológico de biopsias. El significado de "biopsias" se conoce en la técnica. Por ejemplo, biopsias comprenden células o tejidos tomados por ejemplo por el médico a cargo de un paciente/sujeto como se describe aquí. De manera ejemplar pero no limitante, la muestra biológica o médica a analizarse en el contexto de la presente invención es o se deriva de sangre, plasma, glóbulos blancos, orina, semen, esputo, fluido cerebroespinal, linfa o tejidos o células linfáticas, células musculares, células cardíacas, células de venas o arterias, células nerviosas, células de la médula espinal, células del cerebro, células de hígado, células de riñon, células del tracto intestinal, células de testículos, células del tracto urogenital, células de colon, piel, hueso, médula ósea, placenta, fluido amniótico, cabello, cabello y/o folículos, células madre (embriónicas, neuronales y/u otras) o líneas celulares primarias o inmortalizadas (linfocitos, macrófagos o líneas celulares). "Muestras" preferidas de acuerdo con la presente invención son aquellas derivadas de sangre o plasma. La muestra biológica o médica como se define aquí también puede ser o estar derivada de biopsias, por ejemplo biopsias derivadas de tejido cardiaco, venas o arterias.

En un aspecto adicional, la presente invención se refiere a un equipo de diagnóstico, por ejemplo un equipo de diagnóstico para la detección de anticuerpos contra un ß-AR, que comprende el péptido cíclico, composición o agente de diagnóstico de la invención.

El equipo de acuerdo con la presente invención comprende al menos uno de los compuestos como se describe de acuerdo con la invención, como, por ejemplo un péptido cíclico o lineal de la presente invención, una molécula de ácido nucleico, vector o célula hospedera de la invención o una composición o agente de diagnóstico de acuerdo con la presente invención. En una modalidad particular, el equipo además comprende un folleto de instrucciones y/o un amortiguador para utilizar en la aplicación del equipo y/o al menos un recipiente de reacción para llevar a cabo la reacción de detección para la cual el equipo es o se va a utilizar. En una modalidad adicional, al menos uno, algunos o todos los reactivos utilizados en conexión con la aplicación del equipo, están presentes como porciones útiles para llevar a cabo la o las reacciones para las cuales se va a utilizar el equipo .

Un enfoque particular para utilizar los compuestos de acuerdo con la presente invención como un diagnóstico y en un método de diagnóstico respectivamente, es un procedimiento de criba de tres etapas. Por ejemplo, este método comprende realizar un ELISA con los péptidos cíclicos de acuerdo con la presente invención así como determinar inmunofluorescencia y determinar respuestas cAMP en células que expresan ß-AR humano nativo. Habrá de reconocerse que cada una y cualquiera de las etapas anteriormente mencionadas puede como tal ser realizada para la detección de los anticuerpos utilizando los péptidos cíclicos de acuerdo con la presente invención. Una gran cantidad de pacientes, por ejemplo pacientes de falla cardiaca, de esta manera pueden cribarse para anticuerpos anti-ß?-??. funcionalmente activos. En conexión con dichos métodos de diagnóstico (pero también con otros aquí descritos), la definición de anticuerpos anti-ß?-??. funcionalmente activos, de preferencia se basa en sus efectos en señalización mediada por receptor, esto es, sus efectos en niveles de cAMP celular y en la actividad de la proteína quinasa dependiente de cAMP (PKA) . A P cíclico es un segundo mensajero universal de muchos receptores acoplados a proteína G incluyendo la familia ß-AR. Ejerce sus efectos mediante PKA, canales de iones controlados por cAMP, fosfo-di-esterasas, e intercambio de proteínas directamente activado por cAMP, conocido como Epacl y 2. La técnica previa describe varios métodos de fluorescencia para medir cAMP en células intactas que pueden todos emplearse en conexión con el método de diagnóstico de la presente invención. Transferencia de energía-resonancia de fluorescencia (FRET = Fluorescence Resonance Energy Transfer) entre variantes de proteína fluorescente verde (GFP = Green Fluorescent Protein) fusionadas a las subunidades regulatorias y catalíticas de PKA, se han descrito para estudiar las dinámicas espacio-temporales de cAMP en neuronas (Hempel CM, Vincent P, Adams SR, Tsien RY, Selverston AI. Nature. 1996; 384:113-114) o miocitos cardíacos. (Zaceólo M, Pozzan T., Science. 2002; 295:1711-1715).

Más recientemente, indicadores de fluorescencia de una sola cadena se han descrito en la técnica, que se caracterizan por tener una proteína fluorescente ciano mejorada (CFP) o fluorescente amarilla (YFP) fusionada al dominio de enlace cAMP de Epac-proteínas , que permite lograr una superior sensibilidad y mejor resolución temporal de las mediciones cAMP. Este sistema entre otros se describe en WO 2005/052186. Éste sistema puede emplearse en conexión con cualquier procedimiento de diagnóstico, utilizando los péptidos cíclicos u otros compuestos correspondientes de acuerdo con la presente invención. También, dicho sistema puede emplearse sin embargo aunque no se limita á analizar la prevalencia de anticuerpos anti- i-AR funcionalmente activos. De preferencia, este método de diagnóstico se aplica a una cohorte de pacientes DCM tipados con anticuerpos previamente o cualquier individuo a estimarse en lo que cualquier individuo que se sospecha sufre de cualquiera de las enfermedades aquí descritas . o que está en riesgo de sufrirlas. En una etapa adicional del método de diagnóstico y método de criba, la capacidad de ß-bloqueadores para inhibir activación de receptor inducido por anticuerpos anti- i-AR puede ser estimada y determinada, respectivamente. Él ensayo anteriormente descrito que es un método basado en FRET como se describe en WO 2005/052186 que utiliza los péptidos de acuerdo con la presente invención es ventajoso ya que es más simple, menos consumidor de tiempo y al mismo tiempo describe o identifica todos los pacientes DCM previamente considerados como positivos de anticuerpo anti-ß?-ECn. Esta modalidad de un método de diagnóstico basado en FRET haciendo uso de uno o varios de los péptidos de acuerdo con la presente invención, se basa en detectar incrementos inducidos por anticuerpo en cAMP.

En conjunto, la criba por Epac-FRET, tal como por ejemplo como se describe en WO 2005/052186, parece representar un enfoque de una sola etapa muy sensible, permitiendo detectar anticuerpos de activación dirigidos contra ß?-AR humano. Por lo tanto, la presente invención también se refiere al uso°de uno o varios de los péptidos de acuerdo con la presente invención para utilizar en un ensayo Epac-FRET . Más preferiblemente, este ensayo Epac-FRET se utiliza para diagnóstico, aún más preferiblemente para el diagnóstico de pacientes que sufren de o se sospecha que sufren de cualquiera de las enfermedades aquí descritas.

En vista de lo anterior, particularmente es preferido un uso o aplicación de la tecnología FRET, particularmente un sistema de detección basado en FRET, de acuerdo con esta invención.

En un aspecto adicional, la presente invención se refiere a un método para detectar anticuerpos contra un ß-AR (por ejemplo en una muestra cómo se define aquí) que comprende la etapa de hacer contacto el péptido cíclico de la invención con los anticuerpos a detectar.

En un aspecto adicional, la presente invención se refiere al péptido cíclico, composición o agente de diagnóstico como se describe aquí para detectar (por ejemplo en una muestra como se define aquí) anticuerpos contra un ß- AR.

El método anterior para detectar anticuerpos o péptido cíclico, composición o agente de diagnóstico es particularmente útil para emplearse en el contexto de las aplicaciones de diagnóstico como se describe y proporciona en el contexto de esta invención.

A través de la presente solicitud, las siguientes abreviaturas tendrán los siguientes significados: Ab o ab: anticuerpo, Abs o abs : anticuerpos, AR: receptor adrenérgico, EC dominio extracelular de un ß-AR, ECu dominio extracelular II de un ß-AR y AA aminoácido.

La presente invención además se describe por referencia a las siguientes figuras y ejemplos no limitantes.

Las Figuras muestran: La Figura 1 es un diagrama que ilustra el esquema de ciclopéptidos i-ECu-25AA o 18AA mutados (anillos negros con los residuos Cys originales (bolas blancas) o las Cisteínas Ser mutadas (bolas negras; Cys /Ser o Ser/Cys, respectivamente) , junto con los aminoácidos involucrados al formar la estructura de anillo primario después de cierre de cabeza-a-cola (sitio de cierre cualquiera de Ala-DGlu, o Pro-Lys) .

Para la síntesis de péptidos Pi-ECn-18AA cíclicos (o 1-ECn-25AA) en la fase sólida, Fmoc-Glu-ODmab u otro aminoácido Fmoc que tiene un grupo protector de cadena lateral, que pueden romperse selectivamente en una forma ortogonal, se incorpora en el extremo C-terminal del péptido lineal. El rompimientos del péptido cíclico de la resina de síntesis genera un péptido amida (en el caso de D-Glu?Gln) y la remoción de los grupos protectores de la cadena lateral se realiza al tratar la resina con trifluoro acetato ácido/triisopropilsilano/etanditiol/agua por varias horas.

La Figura 2 es un diagrama que ilustra la capacidad bloqueadora de mutantes ciclopéptido i-ECn-18AA que tienen un cierre de anillo D-Glu en señalización mediada por receptor ? (ensayo cAMP funcional) utilizando un enfoque por transferencia de energía de resonancia-florescencia (FRET) .

El efecto de la preincubación (12h, 4°C, incubador rotatorio) de anticuerpos igG anti- i-ECll de una rata representativa (suero) (Figura 4, número de rata 4) con mutantes ciclopéptidos i-ECn-18AA (mutación Cys/Ser, azul oscuro (3); mutación Ser/Cys, azul claro (4)) se comparó con el efecto de un ciclopéptido 25AA Cys/Cys que contiene 3 Cys (rojo (2)) o el resultado que se obtiene con anticuerpos anti-Pi-ECu IgG en la ausencia de péptidos bloqueadores (negro (1)). El eje y representa la proporción YFP/CFP normalizada de las señales de emisión FRET registradas, el e e x corresponde al tiempo de registro dado en segundos (s) .

La Figura 3 es un diagrama compuesto de dos paneles principales (superior e inferior) que reanudan el efecto de bloqueo de ambos mutantes 25AA- y 18AA-ciclopéptido que tiene un sitio de cierre Gln, así como mutante ciclopéptido 18AA que tiene un sitio de cierre D-Glu después de preincubación (12h, 4 grados C, incubación giratoria), con suero aislado de 69 diferentes ratas inmunizadas de anticuerpo positivas en un ensayo de competencia ELISA utilizando el péptido 25AA Cys/Cys lineal que contiene 3 Cys, como un antígeno. El panel superior ilustra suero de rata que de preferencia reacciona con los ciclopéptidos mutados Cys/Ser (reacción tipo 1, n=64), separados en cyc25AA (Gln) -péptidos (izquierda) y cycl8AA(Gln y D-Glu) -péptidos (derecha). El panel inferior ilustra los sueros de rata que reaccionan con ambos ciclopéptidos imitados Cys/Ser y Ser/Cys (reacción tipo 2, n=5) , de nuevo separados en los resultados que se obtienen con cyc25AA(Gln) -péptidos (izquierda) y cycl8AA(Gln y D-Glu) -péptidos (derecha) .

Las primeras tres columnas en el lado izquierdo dentro de los dos paneles representan los resultados que se obtienen con el (Gln- ) ciclopéptido 25AA que contiene 3 Cys (columnas negras) y los (Gln- ) ciclopéptidos Pi-ECn-25AA mutantes (no imitado) (Cys/Ser mutación, columnas blancas; Ser/Cys mutación, columnas sombreadas horizontalmente) .

Las cinco columnas en el lado derecho dentro de los dos paneles representan los resultados que se obtienen con el (Gln- ) ciclopéptido 18AA que contiene 3 Cys (no mutado) (columnas negras) en comparación con los diferentes 18AA ciclopéptidos mutantes que contienen 2 Cys (mutante 18AA Cys/Ser con el sitio de cierre Gln, columnas blancas; 18AA Cys/Ser mutante con un sitio de cierre D-Glu, columnas izquierdas sombreadas diagonalmente; mutante 18AA Ser/Cys con un sitio de cierre Gln, columnas derechas sombreadas diagonalmente; mutante 18AA Ser/Cys con un sitio de cierre D-Glu, columnas sombreadas verticalmente) .

Las barras de error representan el error estándar del promedio (± SEM) . El eje y representa la eficiencia de bloqueo de los diversos péptidos utilizados dado en % de reactividad ELISA bloqueada contra no bloqueada de los sueros .

La Figura 4 es un diagrama que resume la capacidad de bloqueo dependiente de dosis (eje x, abscisa: exceso molar -vez (veces) de péptidos específicos) de diversos betal-ECll-péptidos lineales y cíclicos dado en % del título de anticuerpo no bloqueado (eje y, ordenadas), incluyendo péptidos lineales 25AA Cys/Cys (cuadrados negros), mutantes ciclopéptido 25AA Cys/Ser (cuadrados blancos), ciclopéptidos 18AA Cys/Cys (diamantes negros), mutantes ciclopéptido 18AA Cys/Ser (diamantes blancos), y mutantes péptido lineales 18AA Cys/Ser (diamantes sombreados verticalmente) , en un ensayo de competencia ELISA realizado con sueros 1 de n=6 ratas inmunizadas de anticuerpo positivo seleccionadas al azar. Todos los sueros se bloquean más eficientemente por el ciclopéptido mutante betal-ECII-18AA Cys/Ser seguido por el ciclopéptido no mutante 18AA Cys/Cys y el ciclopéptido mutante 25AA Cys/Ser. Todos los ciclopéptidos fueron substancialmente superiores a sus contrapartes lineales (con o sin mutación) en términos de sus capacidades de bloqueo de anticuerpo (P<0.005).

La Figura 5 es un diagrama que resume la capacidad de bloqueo in vivo en de total cinco aplicaciones (profilácticas) de diversos péptidos betal-ECII-lineales y cíclicos, iniciado 3 meses después de la primer inmunización (y dos refuerzos de antígeno betal-ECII/GST subsecuentes, que corresponden a un protocolo de prevención) . Títulos de suero de los anticuerpos betal receptores, fueron determinados antes y 18-2 Oh después de cada inyección de péptido (abscisa, tiempo en meses) y se dan en % de los títulos de anticuerpo correspondientes sin tratar inmunizadas (eje y, ordenadas) . Los péptidos inyectados fueron: péptido lineal 25AA Cys/Cys (cuadrados negros), ciclopéptido 25AA Cys/Cys (cuadrados blancos) , ciclopéptido 18AA Cys/Cys (diamante negro) , mutante ciclopéptido 18AA Cys/Ser (diamantes blancos) , y el mutante péptido lineal ' 18AA Cys/Ser (diamantes sombreados verticalmente) . También in vivo, la eficiencia de los péptidos cíclicos fue substancialmente superior a sus contrapartes lineales. La más alta eficiencia en términos de neutralización de anticuerpo se logró con 1.0 mg/kg de peso corporal (Bw) de ciclo-péptidos 25AA Cys/Cys o 18AA Cys/Cys-no mutantes (87.7±2% o 89.9±3% de disminución después de 5 inyecciones de ciclopéptido, en comparación con animales no inmunizados sin tratar; ambos P< 0.005), seguido por el ciclopéptido mutante 18AA Cys/Ser (54.5±2% disminución después de 5 inyecciones de ciclopéptido; P<0.05), mientras que los péptidos 25AA Cys/Cys lineales o mutantes 18AA Cys/Ser lineales a una misma concentración no tuvieron efectos bloqueadores significantes (disminución de 25.8+3% o 4.5±11% después de 5 inyecciones, P=0.16 o P=0.8, respectivamente) . Círculos negros indican títulos de anticuerpo de animales inmunizados sin tratar regularmente (cada 4 semanas) que sirven como referencia, ajustado como 100%.

La Figura 6 es un diagrama que resume el efecto 18AA con un sitio de cierre Gln, determinado después de la primera inyección intravenosa (i.v.) de 1.0 mg/kg de peso corporal (Bw) en ratas inmunizadas positivas de anticuerpo. Sueros se tomaron 18-20 horas después de inyección i.v. de 1.0 ó 0.25 mg/kg de Bw de los péptidos indicados y ensayaron por reactividad por ELISA utilizando el péptido lineal 25AA Cys/Cys que contiene 3 Cys como un antígeno.

La primera hilera dentro del panel representa el grupo de ratas (n=5) tratadas con el ciclopéptido 25AA Cys/Ser (Gln) que contiene 2 Cys mutante (ilustrado esquemáticamente en la parte superior de la primera hilera, círculos sombreadas) , la segunda y tercer hileras representan grupos de ratas tratadas con el (Gln- ) ciclopéptido mutante 18AA Cys/Ser en dos concentraciones diferentes (n=40.1 mg/kg de Bw; n=9, 0.25 mg/kg de Bw, esquema del péptido cíclico ilustrado en la parte superior de la segunda hilera, círculos blancos), la cuarta hilera representa n=4 animales tratados con el (Gln-) ciclopéptido mutante 18AA Ser/Cys (1 mg/kg de Bw, esquema del péptido cíclico ilustrado en la parte superior de la cuarta hilera, diamantes negros), y la quinta hilera representa los resultados que se obtienen con(Gln-)péptidos lineales 18AA Cys/Ser que contienen 2 Cys (imitantes) inyectados i.v. (esquema del péptido lineal ilustrado en la parte superior de la quinta hilera, círculos negros) .

Las barras y números (en casillas) de cada hilera, representan los valores promedio de la capacidad de bloqueo del péptido indicado respectivamente dado en % de la inmunoreactividad ELISA de los sueros antes y 18-20 horas después de la inyección del péptido i.v. (eje y).

La Figura 7A es un diagrama que resumen el efecto bloqueador in vivo de ambos imitantes ciclopéptidos 25AA y 18AA con un sitio de cierre Gln, determinado después de un total de diez inyecciones intravenosas (i.v.) de 1.0 mg/kg de peso corporal (Bw) de los péptidos indicados en ratas inmunizadas positivas de anticuerpo. Sueros se tomaron antes y 18-20 horas después de inyección i.v. de los diversos péptidos cada 4 semanas (abscisa: tiempo en meses de tratamiento) y ensayaron por reactividad por ELISA utilizando el péptido .25AA Cys/Cys lineal que contiene 3 Cys como un antígeno .

La gráfica ilustra la disminución relativa (o aumento) en títulos de anticuerpo anti-betal-receptor específico en sueros de ratas inmunizadas de anticuerpo positivas después de inyección de los péptidos indicados y muestra el valor promedio respectivo de la capacidad de bloqueo del péptido dado en % de la inmunoreactividad ELISA antes de empezar el tratamiento (eje y, ordenadas).

Los símbolos indican: círculos negros, animales inmunizados sin tratar regularmente (cada 4 semanas) (n=9); diamantes blancos, (Gln-) ciclopéptido imitante 18AA Cys/Ser (1.0 mg/kg de Bw, n=20); cuadrados negros, (Gln-) ciclopéptido mutante 25AA Cys/Ser (1.0 mg/kg de Bw, n=5) .

La Figura 7B es un diagrama que resume el efecto bloqueador in vivo de diversas concentraciones de imitantes ciclopéptido 18AA con un sitio de cierre Gln, determinado después de un total de diez inyecciones intravenosas (i.v.) de 0.25, 1.0, 2.0, y 4.0 mg/kg de peso corporal (Bw) en ratas inmunizadas positivas de anticuerpo, independientemente del "estado respondiente" ciclopéptido de animales individuales. Se tomaron sueros antes y 18-20 horas después de inyección i.v. de los diversos péptidos cada 4 semanas (abscisa: tiempo en meses) , y ensayaron su reactividad por ELISA utilizando el péptido lineal 25AA Cys/Cys que contiene 3 Cys como un antígeno .

La gráfica ilustra la disminución relativa (o aumento) en títulos de anticuerpo anti-betal-receptor específico en sueros de ratas inmunizadas positivas de anticuerpo después de inyección de los péptidos indicados y muestra los valores promedio respectivos de la capacidad de bloqueo de los péptidos dado en % de la -inmunoreactividad ELISA inicial antes de empezar el tratamiento (eje y, ordenada) .

Los símbolos indican: círculos negros, animales inmunizados sin tratar regularmente (cada 4 semanas) (n=9); círculos blancos, (Gln-) ciclopéptido mutante 18AA Cys/Ser (0.25 mg/kg de Bw, n=4) ; diamantes blancos, (Gln- ) ciclopéptido mutante 18AA Cys/Ser (1.0 mg/kg de Bw, n=20); diamantes sombreados verticalmente, (Gln-) ciclopéptido mutante 18AA Cyr/Ser (2.0 mg/kg de Bw, n=5) ; diamantes negros, (Gln- ) ciclopéptido mutante 18AA Cyr/Ser (4.0 mg/kg de Bw, n=9).

La Figura 7C es un diagrama que resumen el efecto bloqueador in vivo de diversas concentraciones de imitantes ciclopéptido 18AA con un sitio de cierre Gln, determinado después de un total de diez inyecciones intravenosas (i.v.) de 0.25, 1.0, 2.0, y 4.0 mg/kg de peso corporal (Bw) en ratas inmunizadas positivas de anticuerpo, respecto solo a "respondientes" sensibles a ciclopéptido, definidos como animales que tienen, después de 7 inyecciones de ciclopéptido, un nivel de anti-cuerpo receptor restante máximo igual o inferior a 80% del título respectivo al inicio 0 de la terapia (compare las curvas entre Figura 7c y Figura 7b, esta última representa la respuesta no homogénea de origen natural de animales no seleccionados) . Se tomaron sueros como se describe anteriormente y ensayaron su reactividad por ELISA utilizando el péptido lineal 25AA Cys/Cys que contiene 3 como un antigeno.

La gráfica ilustra la disminución relativa en títulos de anticuerpo anti-betal-receptor específicos en sueros de respondientes inmunizados positivos de . anticuerpo después de inyección de los péptidos indicados, dando la capacidad de bloqueo en % de la inmunoreactividad ELISA inicial (eje y, ordenada) . Los símbolos indican (números respondientes en negritas) : círculos negros, animales no inmunizados sin tratar regularmente (cada 4 semanas) (n=9); círculos blancos, (Gln-) ciclopéptido mutante 18AA Cyr/Ser (0.25 mg/kg de Bw, n=3/4) ,-diamantes blancos, (Gln-) ciclopéptido mutante 18AA Cyr/Ser (1.0 mg/kg de Bw, n=16/20); diamantes sombreados verticalmente, (Gln- ) ciclopéptido mutante 18AA Cyr/Ser (2.0 mg/kg de Bw, n=2/5) ; diamantes negros, (Gln- ) ciclopéptido mutante 18AA Cyr/Ser (4.0 mg/kg de Bw, n=6/9) .

La Figura 8A es un diagrama que muestra el curso de tiempo (meses 0 a 20) de los diámetros ventriculares izquierdos de extremo sistólico y extremo diastólico internos (LVES, LVED) de animales inmunizados GS / i-ECu sin tratamiento (círculos negros) contra animales inmunizados GST/Pi-ECII tratados con los diversos ciclopéptidos indicados (ver leyenda) como se determina por ecocardiografía (sistema ecocardiográfico : Visual Sonics, Vevo 770 (versión V2.2.3), equipado con" un transductor 15-17.5 MHz) , con lo que LVES/LVED es el diámetro de extremo sistólico ventricular izquierdo/extremo diastólico ventricular izquierdo.

Los símbolos indican: círculos . blancos, animales de control no inmunizados sin tratar inyectados con NaCl al 0.9% (n=10) ; círculos negros, animales inmunizados sin tratar regularmente (cada 4 semanas) (n=9); diamantes blancos, (Gln- ) ciclopéptido mutante 18AA Cyr/Ser (1.0 mg/kg de Bw, n=20) ; cuadrados negros, (Gln- ) ciclopéptido mutante 25AA Cys/Ser (1.0 mg/kg de Bw, n=5); cuadrados blancos, (Gln- )péptido lineal mutante 18AA Cys/Ser (1.0 mg/kg de Bw, n=5) .

La Figura 8B es un diagrama similar que muestra el curso de tiempo (meses 0 a 20) de los diámetros ventriculares izquierdos de extremo sistólico interno y extremo diastólico (LVES, . LVED) de animales inmunizados GST/ i-ECII sin tratamiento (círculos negros) contra inmunizados GST/3i-ECll-, tratados con diferentes concentraciones del ciclopéptido mutante 18AA Cys/Ser (ver leyendas) . Los símbolos indican: círculos blancos, animales de control no inmunizados sin tratar inyectados con NaCl al 0.9% (n=10); círculos negros, animales inmunizados sin tratar regularmente (cada 4 semanas) (n=9): cuadrados blancos, (Gln- ) ciclopéptido mutante 18AA Cyr/Ser (0.25 mg/kg de Bw, n=4) ; diamantes blancos, (Gln- ) ciclopéptido mutante 18AA Cyr/Ser (1.0 mg/kg de Bw, n=20) ; diamantes sombreados verticalmente, (Gln- ) ciclopéptido mutante 18AA Cyr/Ser (2.0 mg/kg de Bw , n=5); diamantes negros, (Gln- ) ciclopéptido mutante 18AA Cyr/Ser • (4.0 mg/kg de Bw, n=9) .

La Figura 9A es un diagrama que ilustra el curso del tiempo (meses 0 a 20) del "índice Cardiaco" (CI) en ml/min/g (peso corporal) como se determina por ecocardiografía (sistema ecocardiográfico ver leyenda de la Figura 8a.). Los símbolos indican: círculos blancos, animales de control no inmunizados sin tratar inyectados con NaCl al 0.9% (n-10) ; círculos negros, animales inmunizados sin tratamiento regularmente (cada 4 semanas) (n=9) ; diamantes blancos, (Gln- ) ciclopéptido mutante 18AA Cyr/Ser (1.0 mg/kg de Bw, n=20); cuadrados negros, (Gln- ) ciclopéptido mutante 25AA Cys/Ser (1.0 mg/kg de Bw, n=5) ; cuadrados blancos, (Gln-)péptido lineal mutante 18AA Cys/Ser (1.0 mg/kg de Bw , n=5).

La Figura 9B es un diagrama similar que muestra el curso de tiempo (meses 0 a 20) del "índice cardiaco" (CI) en ml/min/g (peso corporal) como se determina por ecocardiografía (sistema ecocardiográfico ver leyenda de la Figura 17a) . Los símbolos indican: círculos blancos, animales de control no inmunizados inyectados con NaCl al 0.9% (n=10) ; círculos negros, animales inmunizados sin tratar regularmente (cada 4 semanas) (n=9); cuadrados blancos, 18AA Cys/Ser (Gln- ) ciclopéptido mutante (0.25 mg/kg de Bw, n=4) ; diamantes blancos, 18AA Cys/Ser (Gln- ) ciclopéptido mutante (1.0 mg/kg de Bw, n=20) ; diamantes sombreados verticalmente, 18AA Cys/Ser (Gln- ) ciclopéptido mutante (2.0 mg/kg de Bw, n=5) .

Las Figuras 10A-C, ilustran parámetros ' hemodinámicos que se obtienen en el estudio de terapia, después de 11 meses de tratamiento.

La Figura 10A en el lado izquierdo ilustra la frecuencia cardiaca (HF = Heart Frequence) dada en latidos por minuto (=bpm) , y en el lado derecho la presión de sangre sistólica LV (LV pres.) dada en mmHg; La Figura 10B en el lado izquierdo ilustra la contractilidad (+ dP/dt) en mmHg/s, y en el lado derecho la relajación (-dP/dt) en -mmHg/s; La Figura 10C, muestra la presión diastólica de extremo ventricular izquierdo (LVEDP) como se determina por cateterización cardiaca en mmHg.

Paneles izquierdo y derecho dentro de cada Figura separan datos obtenidos con (paneles izquierdos, constantemente 1.0 mg/kg de Bw de los péptidos diferentes) 18AA Cys/Ser cíclico (columnas sombreadas derechas diagonalmente, n=20 animales) , mutantes Cys/Ser lineales (columnas sombreadas horizontalmente, n=5 animales) , y mutantes 25AA Cys/Ser cíclicos (columnas sombreadas verticalm nte, n=5 animales) . Columnas en los paneles derechos representan datos que se obtienen con diversas concentraciones del imitante cycl8AA Cys/Ser; con columnas llenas con blanco, con puntos negros que corresponden a 0.25 mg/kg de B (n=4 animales) , columnas sombreadas derechas diagonalmente a 1.0 mg/kg de Bw (n=10 animales), columnas sombreadas izquierdas diagonalmente a 2.0 mg/kg de Bw (n=5 animales), y columnas estructuradas negras a 4.0 mg/kg/Bw (n=9 animales) . Columnas negras y blancas en cada panel sirven- como una referencia y corresponden ya sea a animales inmunizados sin tratamiento regular (cada 4 semanas) (control positivo, negro, n=9), o a animales de control no inmunizados inyectados con NaCl al 0.9% (control negativo, blanco, n=10) .

En las leyendas "Betal sin tratar" significa animales no tratados cardiomiopáticos positivos de anticuerpo anti-betal inmunizados (n=9, columnas negras [No.2]), "Controles" significan el grupo de control inyectado con NaCl al 0.9% (n=10, columnas blancas [No.l]), "18cyc Cys/Ser." Significa animales cardiomiopáticos anti-betal-positivos inmunizados tratados terapéuticamente con los mutantes 181in Cys/Ser lineal indicado (n=5 [1.0 mg/kg de ' Bw] [No.4]) o 18cyc Cys/Ser cíclicos (n=10 [1.0 mg/kg de Bw] [No.3])), o mutantes péptidos 25AA Cys/Ser cíclicos (n=4 [1.0 mg/kg de Bw] [No.5])) después de 9 meses de inmunización.

Paneles en el lado derecho ilustra los efectos de dosis diferentes de mutantes ciclopéptidos betal-ECII 18AA Cys/Ser inyectados en forma intravenosa (n=4 [0.25 mg/kg de Bw] ; n=20 [1.0 mg/kg de Bw] , n=5 [2.0 mg/kg de Bw] , y n=9 [4.0mg/kg de Bw] , [No.3-6] respectivamente). Diferencias entre los grupos se estimaron por ANOVA de una vía; n.s. = no significante, *P< 0.05, **P< 0.005.

La Figura 11 es un diagrama que ilustra el esquema de ciclopéptidos homólogos betal-ECII que contienen cisteína mutados (aminoácidos (AA) ) se representan como bolas blancas con el código de letras AA correspondiente escrito en cada bola) . Moléculas de cisteína y sus substitutos se ilustran como bolas negras. La ubicación asumida del puente disulfuro se representa por una línea negra con negritas.

Lado izquierdo: esquema que ilustra la secuencia original del bucle ECII del receptor adrenérgico betal humano; medio: péptido homólogo 22AA ECII cíclico con la mutación glicina en el sitio de cierre de anillo asumido (Posición 222) .

Los paneles derechos ilustran ejemplos de un mutante-péptido 22AA cíclico que solo contiene dos cisternas (es decir, posiciones 209 y 215) . El esquema superior muestra el mutante Cys/Ser, el esquema inferior ilustra el imitante Cys/ABu de la cisteína en la posición 216 (Péptido 22AA betal-ECII cíclico Cys2i6?Ser2:L6 y Péptido 22AA betal-ECII cíclico CyS2i6?ABu2i6 respectivamente) .

Números dados indican la numeración de los aminoácidos en la secuencia primaria original de acuerdo con Frielle et al. 1987, PNAS 84, páginas 7920-7924.

Las Figuras 12A y B ilustran la capacidad de bloqueo in vitro (^neutralización) d diversas variantes ciclopéptido que contiene cisteína del segundo bucle extra-celular (ECII) del receptor betal-adrenérgico humano, determinado por prueba de n=6 sueros individuales (Figura 12A) de ratas positivas betal-ECII-anticuerpo inmunizadas después de incubación durante la noche con los ciclopéptidos indicados (12-14h, 4 grados C) por ELISA. Columnas en la Figura 12A representan la eficiencia de bloqueador de anticuerpo-receptor de los ciclopéptidos indicados en % de las señales de anticuerpo- (ELISA- ) que se obtienen con sueros de rata positivas de anticuerpo sin bloquear. La Figura 12B ilustra los valores promedio^ SEM de cada uno de los grupos tratados de animales positivos betal-ECII-anticuerpo inmunizados; barras de error indican ± SEM.

Columnas blancas: mutante cycl8AA Cys/Ser (eficiencia de bloqueo 60.0±8.3%, P=0.0014 cuando se prueba por significancia contra sueros sin bloquear por prueba t de dos lados) ; Columnas sombreadas verticalmente : cycl8AA Cys/Cys (eficiencia de bloqueo 66.1±7.0%, P=0.00025). Columnas negras: cyc22AA Cys/Cys (eficiencia de bloqueo 82.0+5.0%, P=0.000046); columnas sombreadas diagonalmente (derecho): mutante cyc22AA Cys/Ser (eficiencia de bloqueo 74.9±5.0%, P=0.00026); columnas sombreadas diagonalmente (izquierdo): mutante cyc22AA Cys/Abu (eficiencia de bloqueo 79.4±4.0%, P=0.00014); columnas sombreadas horizontalmente : cyc25AA Cys/Cys (eficiencia de bloqueo 73.4±5.0%, P=0.00011).

La Figura 13A ilustra la capacidad de bloqueo in vivo (=neutrálizante) de dos mutantes ciclopéptido 18AA o 22AA que contienen ciste na del segundo bucle extracelular (ECII) del receptor betal-adrenérgico humano ante inyección terapéutica de las diferentes construcciones en ratas inmunizadas regularmente sobre 8 meses (primero = inmunización básica seguido por 7 refuerzos de antígeno cada 4 semanas) . El efecto de ocho inyecciones de ciclopéptido subsecuentes cada 4 semanas se ilustra. La figura ilustra los valores promedio ± SEM de cada uno de los grupos tratados de ratas cardiomiopáticas positivas betal-ECll-anticuerpo inmunizadas (número de animal por grupo se da en la leyenda) .

La gráfica de barras muestra el efecto promedio de ocho inyecciones de ciclopéptido subsecuentes, determinado 20-22 horas después de aplicación de las construcciones indicadas. Los títulos de anticuerpo de receptor restantes después de cada inyección en % de los títulos de anticuerpo al inicio de terapia (mes 8) se ilustran (columnas) . Barras de error indican ± SE . Números en columnas indican el número de inyección mensual (subsecuente) .

Columnas negras: animales positivos de anticuerpo sin tratar (título de referencia después en total 8+ 8 (=16) refuerzos de antígeno (comparado con el título al inicio de la terapia) 87.7±10.7%; n=5, control positivo). Columnas blancas: mutante cycl8AA Cys/Ser, n=5 animales (título de anticuerpo restante después de 8 inyecciones en por ciento del título al inicio de la terapia: 50.3±14.6%, P=0.005 cuando se prueba para* significancia contra el título de anticuerpo de animales positivos de anticuerpo sin tratar por prueba t de dos lados ) . Columnas sombreadas en diagonal (derecho) : mutante cyc 22AA Cys/Ser, n=5 animales (título de anticuerpo restante después de 8 inyecciones en por ciento del título al inicio de la terapia: 20.5±12.9%, P= 0.0001); columnas sombreadas diagonalmente (izquierdo) : mutante cyc 22AA Cys/Abu, n=5 animales (título de anticuerpo restantes después de 8 inyecciones en por ciento del título al inicio de la terapia: 9.8±4.3%, P= 2.0 x 10'8) .

La Figura 13B ilustra el curso de tiempo de títulos de anticuerpo después de 11 (22cyc Cys/Abu) o 12 (22cyc Cys/Ser) inyecciones de ciclo-péptido subsecuentes, determinadas antes y 20-22 horas después de aplicación de las construcciones indicadas. Valores se dan en por ciento de aumento o disminución en los títulos de anticuerpo respectivos después de cada inyección de ciclopéptido en comparación con el título de anticuerpo determinado al inicio de la terapia (mes 8) . Barras de error no se indican en la gráfica .

Círculos negros: animales positivos de anticuerpo sin tratar (n= 5, control positivo); cuadrados blancos: mutante cycl8AA Cys/Ser, 12 inyecciones, n= 5 animales; diamantes negros: mutante cyc 22AA Cys/Ser, 12 inyecciones, n=5 animales; diamantes blancos: mutante cyc 22AA Cys/Abu, 11 inyecciones, n=5 animales.

La Figura 14A es un diagrama que muestra el curso de tiempo (meses 0 a 21) de los diámetros ventriculares izquierdos sistólico extremo y diastólico extremo interno (LVES, LVED) de animales sin tratar inmunizados con GST/betal-ECII (círculos negros) contra inmunizado GST/betal-ECII tratados con los diversos ciclopéptidos indicados (ver leyenda) como se determina por ecocardiografía 2D- y modo (sistema ecocardiográfico : Visual Sonics, Vevo 770 (versión V2.2.3), equipado con un transductor de 15-17.5 MHz) , con lo que LVES/LVED es el diámetro diastólico extremo ventricular izquierdo/diámetro sistólico extremo ventricular izquierdo. Barras de error bars indican promedio ± SE .

Circuios blancos, animales de control no-inmunizados inyectados con NaCl al 0.9% sin tratar (n=5) ; círculos negros, animales positivos de anticuerpo inmunizados sin tratar regularmente (cada 4 semanas) (n=5); cuadrados blancos, imitante cycl8AA Cys/Ser (1.0 mg/kg de Bw, n=5) ; diamantes negros, (Gly-)péptido mutante cyc 22AA Cys/Ser (1.0 mg/kg de Bw, n=5); diamantes blancos, (Gly- )péptido mutante cyc22AA Cys/ABu (l.Omg/kg de Bw, n=5) .

El asterisco indica nivel de significancia como se deriva de medidas repetidas A OVA y Bonferroni post hoc prueba; * = P<0.05, **= P<0.01, ***= P<0.005.

La Figura 14B es un diagrama que muestra el curso de tiempo (meses 8 a 21) del cambio en acortamiento fraccional ventricular izquierdo, dado el % de los valores que se obtienen al inicio de la terapia (LVED-LVES/LVED x 100) en ratas sin tratar inmunizadas GST/betal-ECII (círculos negros) contra animales tratados con los ciclopéptidos diferentes indicados (ver leyenda) como se determina por ecocardiografía modo 2D y (sistema ecocardiográfico: Visual Sonics, Vevo 770 (versión V2.2.3), equipado con un transductor de 17.5 MHz) , con lo que LVES/LVED es el diámetro diastólico de extremo ventricular izquierdo/diámetro sistólico de extremo ventricular izquierdo.

Diferencias entre ratas y animales sin tratar que reciben ciclopéptidos mutantes cyc22AA betal-ECII fueron altamente significantes, con imitantes 22AA Cys/Abu que aún son más eficientes que los mutantes 22AA Cys/Ser respecto a inversión de la disfunción cardiaca (después de 4, 8 o 12 meses de tratamiento; betal sin tratar contra 22Cys/Abu p<0.002 o p<0.0005; betal contra 22Cys/Ser p<0.004 o p<0.0007, respectivamente).

La Figura 14C es un diagrama que ilustra el curso de tiempo (meses 0 a 21) del "índice cardiaco" (CI) en ml/min/g (peso corporal) como se determina por ecocardiografía 2D y Doppler (sistema ecocardiográfico ver anteriormente) .

Círculos blancos, animales de control no inmunizados inyectados con NaCl al 0.9% (n=5); círculos negros, animales positivos de anticuerpo inmunizados regularmente sin tratar (cada 4 semanas) (n=6) ,- cuadrados blancos, mutante cycl8AA Cys/Ser (1.0 mg/kg de Bw, n=5) ; diamantes negros, (Gly- ) pép ido mutante cyc22AA Cys/Ser (1.0 mg/kg de Bw, n=5); diamantes blancos, (Gly- ) éptido mutante cyc 22AA Cys/ABu (1.0 mg/kg de Bw, n=5) .

El asterisco indican niveles de significancia como se deriva de medidas repetidas de ANOVA y Bonferroni post hoc de prueba; *P< 0.05, **P< 0.01, ***p< 0.005.

Las Figuras 14D-F, ilustran parámetros hernodinámicos de animales de control inyectados con NaCl al 0.9% (columnas blancas) contra animales sin tratar inmunizados con GST/betal-ECll (columnas negras) contra inmunizados con GST/betal-ECII inyectados con los ciclopéptidos ' diferentes indicados (ver leyenda) después de 12 meses de tratamiento.

La Figura 14D en el lado izquierdo ilustra la frecuencia cardiaca (HF) dada en latidos por minuto (=bpm) , y en el lado derecho la presión sanguínea sistólica LV (pres. LV) dado en mmHg; La Figura 14E en el lado izquierdo ilustra la contractilidad (+ dP/dt) en mmHg/s, y en lado derecho el relajamiento (-dP/dt) en -mmHg/s ; La Figura 14F muestra la presión diastólica extremo ventricular izquierdo (LVEDP) como se determina por cateterización cardiaca en mmHg.

Los paneles izquierdo y derecho en las Figuras 14D y 14E separan datos obtenidos con (paneles izquierdos, constantemente 1.0 mg/kg de Bw de los diferentes péptidos) imitantes 18AA Cys/Ser cíclicos (4, columnas sombreadas derecha diagonalmente, animales n=5) , mutantes 22AA Cys/Ser cíclicos (3, columnas sombreadas verticalmente, n=5 animales) , y mutantes 22AA Cys/ABu cíclicos (5, columnas sombreadas horizontalmente, n=5 animales) . Columnas negras y blancas en cada panel sirven como una referencia y corresponden ya sea a animales inmunizados sin tratamiento regularmente (cada 4 semanas) (control positivo, negro, n=6) , o animales de control no inmunizados inyectados con NaCl al 0.9% (control negativo, blanco, n=5) . Diferencias entre los grupos se estimaron por ANOVA de una vía; *P< 0.05, **P< 0.005.

La Figura 14G muestra dos paneles (a y b) con diferentes parámetros de laboratorio que se determinan en el suero de animales después de 12 meses de tratamiento. "Sin tratar Betal" y "Controles" en ambos paneles significan animales no tratados cardiomiopáticos positivos de anticuerpo anti-betal inmunizados (n=6, columnas negras, control positivo), y controles inyectados con NaCl al 0.9% (n=5, columnas blancas, control negativo), respectivamente. Además, los parámetros de laboratorio de animales cardiomiopáticos anti-betal-positivos inmunizados, tratados terapéuticamente con mutantes 18AA Cys/Ser cíclicos (n=5 [1.0 mg/kg de Bw] , 4, columnas sombreadas en diagonal), o mutantes 22AA Cys/Ser cíclicos (n=5 [1.0 mg/kg de Bw] , 3, columnas sombreadas verticalmente) , o mutantes 22AA Cys/Abu cíclicos (n=5 [1.0 mg/kg de Bw] , 5, columnas sombreadas horizontalmente) se dan. En el panel (a) "Crea" significa creatinina, " GOT" significa transaminasa oxaloacética glutámica, "GPT" significa piruvato transaminasa glutámica y "LDH" significa lactato dehidrogenasa. En el panel (b) "gammaGT" significa gamma glutamil transpeptidasa y "T-Bili" significa total de bilirrubina. Diferencias entre los grupos se estimaron por ANOVA de una vía; P< 0.05, **P< 0.005.

La Figura 14H ilustra parámetros macro-anatómicos (pesos húmedos de órgano) de ratas cardiomiopáticas anti-betal-positivas inmunizadas, tratadas terapéuticamente sobre 12 meses con mutantes 18AA Cys/Ser cíclicos (n=5 [1.0 mg/kg de Bw] , 4, columnas sombreadas en diagonal), o mutantes 22AA Cys/Ser cíclicos (n=5 [1.0 mg/kg de Bw] , 3, columnas sombreadas verticalmente) , o mutantes 22AA Cys/Abu cíclicos (n=5 [1.0 mg/kg de Bw] , 5, columnas sombreadas horizontalmente) . "Betal sin tratar" y "Controles" significan animales no tratados cardiomiopáticos positivos de anticuerpo anti-betal inmunizados (n=6, columnas negras, control positivo), y controles inyectados con NaCl al 0.9% (n=5, columnas blancas, control negativo), respectivamente.

Los pesos húmedos relativos de los órganos indicados (de izquierda a derecha: corazón, bazo, riñon derecho, riñon izquierdo, pulmón e hígado (xlO)) se dan en g/kg de peso corporal.

Riñon R significa derecho y Riñon L significa izquierdo. Diferencias entre los grupos se estimaron por ANOVA de una vía; n.s. = no significante, *P< 0.05, **P< 0.005.

La Figura 15A es un esquema que ilustra las secuencias de separación del mutante ciclopéptido 22AA Cys/Abu de la presente invención. El 21+1AA original correspondiente del segundo bucle extracelular de receptor betal-(AA200 a AA221) y beta2-adrenérgico humano (AA175 a AA 196) se ilustran. 4.5 unidades angstrom son la distancia a la base del bucle ECII nativo entre AA 200 y AA 220 (betal) o AA175 y AA 190 (beta2). En caso del ciclopéptido betal 22AA este espacio se llena por la AA glicina de origen natural más pequeña .

Las secuencias subyacentes ilustran los nueve ciclopéptidos diferentes generados para identificar adicionales AA necesarios para reconocimiento y neutralización de anticuerpo, derivado de la secuencia beta2-ECII (que no fue capaz de bloquear anticuerpos anti-betal-ECII) en ensayos de competencia de enlace y bloqueo subsecuentemente realizados utilizando ya sea 25AA betal-ECII-péptidos o 16AA betal-ECII-péptidos lineales biotinilados (N- y C-terminales ) , respectivamente (barrido de Ala 22AA Cys/Abu-ciclopéptidos) .

La Figura 15B es un diagrama que ilustra los resultados de bloqueo de diferentes anticuerpos de rata policlonal específicos betal-ECII diferentes (n=20; panel 1) o conejo (n=l; panel 2) y anticuerpos de ratón monoclonal (n=l; panel 3) o rata monoclonal (n=l; panel 4) previamente generados con mutantes ciclopéptido empleados para el barrido de alanina del mutante 22AA Cys/Abu-ciclopéptido de la presente invención.

Nueve diferentes ciclopéptidos imitados Ala específicos de sitio (Fig. 7a) se incubaron durante la noche con suero de n=20 diferentes ratas positivas anti-betal-ECII (panel 1) o un anti-betal-ECII de rata monoclonal previamente generado (panel 2), o un anti-betal-ECII, de conejo policlonal (panel 3), o un anti-betal-ECII monoclonal de ratón (panel 4) para estimar su capacidad respectiva de reconocimiento y neutralización de anticuerpo por ELISA utilizando el 25AA betal-ECII-péptido lineal que contiene 3 Cys como un antígeno . 22AbuO representa el producto de la invención. Las secuencias de los mutantes Ala 22Abul a 22Abu9 utilizadas para todos los experimentos (paneles 1-4) se citan subyacentes .

Además, la secuencia del péptido 22AA beta2-ECII cíclico correspondiente se indica, que en todos los experimentos no exhibe efecto bloqueador de anticuerpo, como se muestra en forma ejemplar en el panel 1.

ECII betal-22AA Cys-Cys/Abu ciclopéptido : 22AbuO RAESDEARRCYNDPKC Abu DFVTG ECII betal-22AA péptidos substituidos con alanina cíclicos Cys-Cys/Abu: 22Abul RAASDEARRCYNDPKC Abu DFVTG 22Abu2 RAEADEARRCYNDPKC Abu DFVTG 22Abu3. RAESAEARRCYNDPKC Abu DFVTG 22Abu4 RAESDEAARCYNDPKC Abu DFVTG 22Abu5 RAESDEARACYNDPKC Abu DFVTG 22Abu6 RAESDEARRCYADPKC Abu DFVTG 22Abu7 RAESDEARRCY APKC Abu DFVTG 22Abu8 RAESDEARRCYNDAKC Abu DFVTG 22Abu9 RAESDEARRCYNDPAC Abu DFVTG ECII beta2-22AA Cys-Cys/Abu ciclopéptido : Beta-2 RATHQEA I N CYA ETC Abu DFFTG La Figura 15C es un diagrama que ilustra los resultados de ensayos de competencia de enlace utilizando ciclopéptidos 22AA Cys/Ser contra 22AA Cys/Abu a f'in de bloquear el enlace de diferentes anti-betal-ECII de rata (por ejemplo monoclonal o policlonal) a 16AA betal-ECll-péptidos lineales biotinilados . La respectiva EC 50 de los ciclopéptidos indicados se da en las tablas subyacentes a cada figura.

El Panel 1 muestra las curvas de competencia de enlace (un sitio) que se obtienen con un anticuerpo anti-betal-ECII de rata monoclonal.

El Panel 2 muestra las curvas de competencia de enlace (un sitio) que se obtienen con un anticuerpo anti-betal-ECII de rata policlonal (K12R1) , que representa los 3 diferentes suero de rata probados.

El Panel 3 muestra las curvas de competencia de enlace (un sitio contra dos sitios) que se obtienen con un anticuerpo anti-betal-ECII de conejo policlonal, sugiriendo la presencia de dos entidades de anticuerpo diferentes con diferentes afinidades de 18Cys/Ser ciclopéptido en la sonda.

El Panel 4 muestra las curvas de competencia (un sitio) que se obtienen para diferentes 22AA-betal-ciclopéptidós mutados Ala específicos de sitio de la presente invención, con lo que 22AbuO representa el producto de la invención. Los datos ilustrados en el panel 4 son representativos para 3 diferentes sueros de rata policlonal probados .

La Figura 16 muestra el perfil de elución por cromatografía de líquido con alta presión (HPLC) de las dos cisternas que contienen ácido alfa butírico-L/Cys cyc22AA mutante (Abu) de la presente invención, un péptido cíclico con un sitio de cierre Gly. HPLC se lleva a cabo en un sistema HPLC analítico Hewlett Packard Series 1050 (Agilent Technologies Germany GmbH, Bóblingen) equipado con un detector de absorbancia de UV de longitud de onda dual; la absorbancia se lleva a 216 nm. Después de síntesis de péptido y ciclización, las muestras se disolvieron en H20/tri-fluoroácido al 0.1% (TFA) y cargaron en una columna HPLC analítica (Waters GmbH, Eschborn) XBridge BEH130, C18, 3,5 p (longitud de columna 50 mm, lumen 4.6 mm) con un flujo de 2 ml/min; después, un gradiente de separación de acetonitrilo de 0% a 75% (ACN) en la presencia de TFA al 0.1% se corre sobre 5 minutos. El péptido 22AA Cys/Abu cíclico mutante contiene solo dos cisteínas (conectadas por un segundo puente disulfuro reforzado) que dieron un pico de elución sencillo marcado que aparece a 3.81 minutos.

La Figura 17 muestra la caracterización del péptido mutante ECII-22AA Cys/Abu cíclico (con un sitio de cierre Gly) por espectroscopia de masa (MALDI-TOF) . El panel ilustra trazos MALDI del mutante cyc22AA Cys/Abu (2499.34 m/z) . La ordenada de cada gráfica muestra intensidades de señal medidas ("a.u." significa unidades arbitrarias), la abscisa indica la masa molecular (dada en m/z) . El análisis MALDI se llevó a cabo utilizando un espectroscopio de masas reflex II (Bruker Daltonic GmbH, Bremen) , equipado con un portador de muestra Scout-26. En cada caso, la molécula simplemente protonada fue analizada a 2200 m/z.

La Figura 18 muestra un panel que demuestra un perfil de elución de cromatografía de líquido con alta presión (HPLC) de la construcción que contiene 3 cisteínas cyc22AA Cys/Cys. HPLC se lleva a cabo como se describe en el contexto de la Figura 16, anterior. Las fracciones que contienen los péptidos betal-ECII-22AA Cys/Cys cíclicos con tres moléculas de cisteína de acceso libre exhiben el patrón de elución tipo montaña típico indicando la presencia de racematos de cisteína (elución entre 2.6 y 3.8 minutos).

La Figura 19 es un diagrama que ilustra la capacidad de bloqueo de diferentes 22AA Cys/Abu-ciclopép idos mutados de Ala específicos de sitio (Fig. 15A) en señalización mediada por ß?-receptor (ensayo cAMP funcional) utilizando un enfogue por transferencia de energía de resonancia-fluorescencia (FRET) como se describe en la Figura 2. El efecto de preincubación (12h, 4 grados C, incubador giratorio) de anticuerpos anti-Pi-ECII IgG humanos aislados de una paciente DCM femenina de 28 años de edad representativa con diferentes 22Abu-mutantes (como se define. en la Fig. 15A) se muestra. Números (n) indicados bajo las columnas corresponden al número de experimentos independientes realizados bajo las mismas condiciones.

Columna negra: paciente IgG, sin bloquear: 18±3% de actividad FRET; Columna de sombreado diagonal : paciente IgG (ineficientemente) bloqueado con el péptido cíclico 22Abu8 (17±2% de actividad de FRET) .

Columna sombreada vertical: paciente IgG (eficientemente) bloqueado con el péptido cíclico 22Abul (8±5% de actividad FRET, P<0.005 contra sin bloquear).

Columna sombreada horizontal: paciente IgG (eficientemente) bloqueado con el producto de la invención péptido cíclico 22AbuO (3±3% de actividad de FRET, P<0.001 contra no bloqueado) .

Ciclopéptido ECII betal-22AA Cys-Cys/Abu empleados: 22Abu0 RAESDEARRCY DPKC Abu DFVTG Péptidos substituidos con alanina cíclica ECII betal-22AA Cys-Cys/Abu empleados: 22Abul RAASDEARRCY DPKC Abu DFVTG 22Abu8 RAESDEARRCY DAKC Abu DFVTG.

La Figura 20 es un diagrama que muestra la vida media de imitantes ECII-péptido en sangre entera. Betal-ECII-péptido-mutantes (cycl8AA Cys/Ser) con una estructura cíclica (es decir los péptidos cíclicos como se describe aquí) tiene una vida media altamente significante mayor en sangre entera retirada tanto de ratas sin tratar (control) como sujetos sanos humanos (control) que sus contra-partes lineales (lineal: 5.5h; cíclico: 64.5). Los datos se obtienen después de incubación de péptidos lineales contra cíclicos con sangre entera de humano o rata en la presencia de heparina (24h, 4 grados C, incubador rotatorio) y supervisión de la cantidad de péptido intacto en los puntos en tiempo indicados. La cantidad de péptidos intactos restantes se determinó por ELISA de competencia con péptidos ß?-?0??-25??€??/0?3 lineales a 2 min, 10 min, 30 min, 1, 2, 4, 8, 16 y 22h.

Diamantes negros: péptidos 18AACys/Ser cíclicos Diamantes blancos: péptidos 18AACys/Ser lineales. La Figura 21A es un diagrama que resume el efecto de bloqueo in vivo de mutantes ciclopéptidos 22AA Cys/ABu, determinados después de nueve inyecciones intravenosas (i.v.) de 1.0 mg/kg de peso corporal (Bw) de los ciclopéptidos en ratas positivas de anticuerpo inmunizadas. Se retiraron sueros antes y 18-20 horas después de inyección i.v. de los diversos péptidos cada 4 semanas (abscisa: tiempo en meses de tratamiento) y ensayaron por reactividad por ELISA utilizando el péptido 25AA Cys/Cys que contiene 3 Cys como un antígeno.

La gráfica ilustra la disminución relativa en títulos de anticuerpo anti- i-ECH específicos en sueros de ratas inmunizadas positivas de anticuerpo después de inyección de los péptidos indicados y muestra el valor promedio respectivo de la capacidad de bloqueo del péptido dado en % de la inmunoreactividad de ELISA inicial antes de iniciar el tratamiento (eje y, ordenadas) .

Los símbolos indican: Círculos negros, animales inmunizados sin tratamiento regular (cada 4 semanas) (n=5) ; diamantes blancos, mutante 22AA Cys/ABu (1.0 mg/kg de Bw, n=5) . Barras de error no se indican en la gráfica.

La Figura 21B es un diagrama que resume el efecto bloqueador in vivo de mutantes ciclopéptidos 22AA Cys/ABu (1.0 mg/kg de peso corporal (Bw)), determinado después de nueve inyecciones intravenosas (i.v.) (3/3/3) u ocho triples (2/3/3) - una inyección por semana por tres semanas subsecuentes - cada 3 meses en ratas positivas de anticuerpo inmunizadas, respectivamente. Se retiraron sueros antes y 18-20 horas después de inyección i.v. de los diversos péptidos cada 4 semanas (abscisa: tiempo en meses de tratamiento) y ensayaron por reactividad por ELISA utilizando el péptido lineal 25AA Cys/Cys que contiene 3 Cys como un antigeno.

La gráfica ilustra la disminución relativa en títulos de anticuerpo anti- i-ECII específico en sueros de ratas inmunizadas positivas de anticuerpo después de inyección de los péptidos indicados a los puntos en tiempo indicados (flechas blancas) y muestran el valor promedio respectivo de la capacidad de bloqueo de los péptidos respectivos dado en % de la inmunoreactividad ELISA inicial antes de empezar el tratamiento (eje y, ordenada) .

Los símbolos indican: círculos negros, animales inmunizados sin tratamiento regular (cada 4 semanas) (n=5) ,- diamantes negros, mutante 22AA Cys/ABu (1.0 mg/kg de Bw, n=5) . Barras de error no se indican en la gráfica.

La Figura 22A es un diagrama que muestra el curso de tiempo (meses 0 a 15) del diámetro ventricular izquierdo diastólico de extremo interno relativo (LVED) de animales sin tratar inmunizados con GST/ i-ECII (círculos negros) contra inmunizados con GST/ i-ECII, con los protocolos/ciclopéptidos indicados (ver leyenda) como se determina por ecocardiografía (sistema ecocardiográfico : Visual Sonics, Vevo 770 (versión V2.2.3), equipado con un transductor 17.5 MHz) , con lo que LVED es el diámetro diastólico de extremo ventricular izquierdo dado en % de los valores respectivos al inicio de tratamiento (mes 9) .

Los símbolos indican: círculos negros, animales inmunizados regularmente sin tratar (cada 4 semanas) (n=9) ; diamantes blancos, mutante 22AA Cys/ABu (inyecciones mensuales con 1.0 mg/kg de Bw, n=5) ; diamantes negros mutante 22AA Cys/ABu (3 inyecciones triples mensuales de 1.0 mg/kg de Bw, n=5) . Barras de error no se indican en la gráfica.

La Figura 22B es un diagrama similar que muestra el curso del tiempo (meses 0 a 15) del diámetro ventricular izquierdo sistólico extremo interno relativo (LVED) de animales sin tratar inmunizados GST/ i-ECII (círculos negros) contra inmunizados GST^l-ECII tratados con los ciclopéptidos/protocolos indicados (ver leyenda) como se determina por ecocardiografía (sistema ecocardiográfico anteriormente descrito) con lo que LVED es el diámetro diastólico extremo ventricular izquierdo en % de los valores respectivos al inicio del tratamiento (mes 9).

Los símbolos indican los mismos grupos de terapia que en la Figura 22A. Barras de error no se indican en la gráfica .

La Figura 22C es un diagrama similar que muestra el curso de tiempo (meses 0 a 15) del "índice Cardíaco" (CI) dado en % de los valores respectivos al inicio del tratamiento (mes 9) de animales sin tratar inmunizados con GST/pi-ECII (círculos negros) contra animales inmunizados con GST/ i-ECII tratados con los ciclopéptidos/protocolos indicados (ver leyenda) como se determina por ecocardiografía (sistema ecocardiográfico descrito anteriormente) . Los símbolos indican los mismos grupos de terapia que en la Figura 22A. Barras de error no se indican en la gráfica, Los siguientes ejemplos no limitantes ilustran la invención . a) Ejemplo 1: Síntesis de ciclopéptidos mutantes Tres ejemplos particulares de los ciclopéptidos aquí descritos que pueden formar sólo un enlace disulfuro individual sencillo están compuestos por 18, 22 ó 25 aminoácidos (AA) : (Gln) ciclopéptido mutante ECn-18AA Cys/Ser, (Gly) ciclopéptido mutante ECn-22AA Cys/ABu y Cys/Ser y (Gln-) ciclopéptido mutante ECn-25AA Cys/Ser, respectivamente. La secuencia primaria es parcialmente homologa a la secuencia humana del ß?-AR (posiciones de aminoácidos 204 a 219, 200 a 220 y 200 a 222, respectivamente) . Al restringir la flexibilidad de conformación a través de ciclización de cabeza-a-cola del péptido lineal seguido por un segundo procedimiento de ciclización estabilizante de enlace disulfuro (sencillo) el mutante ciclopéptido 18AA, 22 o 25AA adopta una conformación que imita más cercanamente la del epítopo como se presenta en la superficie del bucle de proteína ß?-ECn nativa. Además, la ciclización se ha empleado como una herramienta para prolongar la duración de acción del péptido, ya que en general los péptidos cíclicos son más estables a proteólisis que sus contrapartes lineales .

En detalle, la secuencia péptido del mutante Ciclo (K-18-P) S-S Cíclico, Cys/ABu o Cys/Ser es: Ciclo-Ala-Asp-Glu-Ala-Arg-Arg-Cys-Tyr-Asn-Asp-Pro-Lys-Cys-ABu (Ser ) -Asp-Phe-Val-Gln; ciclización puede ocurrir entre Cys7 y Cysi3 (enlace disulfuro) y Alai y Glni8 (cierre de anillo) .

En detalle, la secuencia péptido mutante Cys/Ser Ciclo (K-22-P) S-S Cíclico es : Ciclo-Arg-Ala-Glu-Ser-Asp-Glu-Ala-Arg-Arg-Gys-Tyr-Asn-Asp-Pro-Lys-Cys-Ser-Asp-Phe-Val-Thr-Gly; la ciclización puede ocurrir entre Cysio y Cysi6 (enlace disulfuro) y . Argi y Gly22 (cierre de anillo) .

En detalle, la secuencia péptido del mutante Cys/Ser Ciclo (K-25-P) S-S Cíclico es: Ciclo-Ala-Arg-Ala-Glu-Ser-Asp-Glu-Ala-Arg-Arg-Cys-Tyr-Asn-Asp-Pro-Lys-Cys-Ser-Asp-Phe-Val-Thr-Asn-Arg-Gln ; · Ciclización puede ocurrir entre Cysn y Cysi7 (enlace disulfuro) y Alai y Gln25 (cierre de anillo) .

Los imitantes ciclopéptido de la presente invención primero se sintetizan como péptidos lineales y después se ciclizan en forma covalente en la estructura principal por condensación del grupo carboxilo C-terminal con el grupo amino del aminoácido N-terminal. Subsecuentemente, un enlace disulfuro entre los residuos cisteína 7 y 13 (ciclopéptido l"8mero) , residuos cisteína 10 y 16 (ciclopéptido 22mero) y residuos cisteína 11 y 17 (ciclopéptido 25mero) se establece.

El péptido lineal se ensambla por síntesis de péptido en fase sólida por etapas utilizando una estrategia Fmoc/terbutilo. Clorotritilo se utiliza como resina de partida. El primer aminoácido (Fmoc-Pro-OH) se acopla con DIEA en D F, el segundo con PYBOP/ ????7 DIEA en DMF y los siguientes aminoácidos con diisopropilcarboimida, HOBT en DMF. La calidad de péptido se supervisa en línea por detección UV. Procedimientos de desprotección/acoplamiento (exceso de dos veces) se describen a continuación: Tabla 1 : Procedimiento de desprotección/acoplamiento (exceso de dos veces) Etapa Solventes Ciclo 1 Acoplamiento / DMF ( * ) min Acoplamiento 2 DMF 3 x 1 min lavado 3 Piperidina 25% / 1 min Desprotección 4 DMF Piperidina 25% / 2 x 15 min Desprotecciones DMF 5 DMF 7 x lmin Lavado * tiempo de acoplamiento se determina por la prueba Kaiser.

Para ensamblado, los siguientes aminoácidos se emplearon (se proporcionan en forma ejemplar para el mutante péptido Cys/Ser cíclico 18mero) : Tabla 2 : Aminoácidos empleados para síntesis F-moc del mutante péptido Cys/Ser cíclico 18mero Aminoácido Fmoc-ASP (OtBu)-OH Fmoc-Asn(Trt) -OH Fmoc-Tyr (tBu) -OH Fmoc-Cyc (Trt) -OH Fmoc-Arg(Pbf) -OH Fmoc-Ala-OH Fmoc-Glu(OtBu)-OH Fmoc-D-Gl (OtBu) - Fmoc-Val-OH OH Fmoc-Phe-OH Fmoc-Ser (tBu) -OH Fmoc-Lys (Boc) -OH El péptido totalmente protegido con los grupos carboxilo C-terminal y amino N-terminal se rompe de la resina por tratamiento con hexafluoroisopropanol/diclorometano .

La ciclización se lleva ' a cabo posteriormente en solución de acuerdo con el siguiente protocolo: La ciclización de "cabeza a cola" del péptido protegido se realiza con PyBOP/NaHC03 en dilución DMF alta (10 mmoles de péptido lineal/lL de DMF) . La ciclización se completa después de 3 días. Después de evaporación de DMF, el péptido se lava con NaHC03 al 5%, H20 y H20 pura. La mezcla de reacción se enfría, y el péptido se desprotege exceptuando los grupos cisteína. Posteriormente, el péptido parcialmente protegido se aisla por precipitación con metil t-butil éter.

El péptido crudo es previamente purificado por cromatografía de líquido: Fase estacionaria: sílice C18, 15 um, 120 A Eluyente: H20 acetonitrilo + TFA al 0.1% Detección: UV (210 nm) La ciclización disulfuro se realiza en H20 (2 mg/mL) con la presencia de dimetil sulfóxido (3%) . La reacción de ciclización se completa después de 3 días.

El péptido se purifica por HPLC, utilizando las condiciones anteriormente descritas.

Las fracciones con pureza mayor a 95% se reúnen. El péptido se intercambia en una resina de intercambio de iones (Dowex 1X2) y la solución final se liofiliza. El contenido de péptido se determina por análisis de aminoácidos (secuenciado Edman) .

En particular, el péptido cíclico 22mero que contiene una sustitución cisterna Abu puede por ejemplo sintetizarse como sigue: El péptido primero se sintetiza como un péptido lineal y después se cicliza en resina en forma covalente en la estructura principal por condensación del grupo carboxilo C-terminal con el grupo amino del aminoácido N-terminal.

El péptido lineal se ensambla por síntesis de péptido en fase sólida, en etapas en un sintetizador de péptido de flujo continuo utilizando una estrategia Fmoc/terbutilo . Fmoc-Glu( Wang .resin LL)-ODmab (Merck Biosciences, sustitución 0.3 mmol/g) se utiliza como resina de partida. Los Fmoc-L aminoácidos excepto la cisterna se acoplan con PyBOP/NMM en DMF en un procedimiento de doble acoplamiento. Para evitar racemización durante acoplamientos de cisterna se incorporan las cisternas correspondientes también por doble acoplamiento como los Fmoc-L-Cys (Trt) -Opfp ésteres preactivados en DMF/HOBT (impreso en negritas en la siguiente secuencia) .

Para facilitar ciclización del péptido seudoprolina lineal se incorporan dipéptidos en la secuencia en las posiciones V-T y E-S (impreso en negritas en la siguiente secuencia) . Se ha mostrado que esos seudoprolina dipéptidos son herramientas extremadamente útiles para ayudar en la ciclización de péptidos . (Schmiedeberg (2002) Org. lett. 4, 59 and a) Haack (1992) Tetrahedron lett. 33, 1589; b) utter (1995) Pept. Res. 8, 145). Debido a la propensidad de los residuos seudoprolina para adoptar una conformación cis, la sustitución de Ser o Thr por un residuo seudoprolina tiene el efecto de llevar a los extremos de la cadena juntos o de reunir los extremos de la cadena, promover ciclización y reducir oligomerización y formación de ciclodímero. La secuencia nativa se regenera en ruptura y desprotección.

El péptido lineal ensamblado en la resina de esta manera por ejemplo tiene la siguiente secuencia: H-Ala-Arg (Pbf) -Arg ( Pbf) -Cys (Trt) -Tyr (tBu) -Asn ( rt) -Asp (OtBu) -Pro-Lys (Boc) -Cys (Trt) -Abu-As (OtBu) -Phe-Val- Thr (psi e, epro) -Gly-Arg (Pbf) -Ala-Glu (OtBu) -Ser(psi e,Mepro) -Asp (OtBu) -Glu (Wang resina LL) -ODmab.

El grupo ODmab se retira de la resina péptido por hidrato de hidracina al 2% en DMF y la ciclización del péptido se realiza en resina en PyBOP/NMM en DMF al reaccionar 5 horas a 50 grados Celsius y durante la noche a temperatura ambiente. Una prueba Kaiser realizada después de este tiempo no muestra cantidad residual de los grupos amino libres .

El péptido se rompe de la resina por TFA al 95%, trietilsilano al 4%, y agua al 1%.

Péptido crudo se rompe o desprende de la resina por TFA al 95%, trietilsilano al 4%, y agua al 1%.

Péptido crudo se purifica por cromatografía de líquido HPLC utilizando una fase estacionaría de Sílice C18 10um, 100 A con un eluyente de acetonitrilo (80%) en TFA-agua al 0.1% y TFA en agua al 0.1% (Figura 16). La detección se realiza a 220 rim. Fracciones purificadas se liofilizan y analizan por espectrometría de masa (MALDI-TOF; Figura 17) .

Todos los estudios siguientes in vitro e in vivo se llevaron a cabo con estos mutantes ciclopéptido producidos como se describió anteriormente.

Ejemplo 2: Ensayo de competencia ELISA in vitro La capacidad bloqueadora de mutantes ciclopéptido ß?-????-18?? (mutación Cysi3-Seri o Ser13-Cysi4 que tienen un intercambio D-Glu?Gln adicional, por ejemplo en el sitio de cierre dé anillo) se comparó con los ciclopéptidos 25AA o 18AA Cys/Cys que contienen 3 Cys después de preincubación (12h, 4°C, incubación giratoria durante la noche) de diferentes cantidades de sueros de ratas anticuerpo-positivas inmunizadas en un ensayo de competencia ELISA utilizando péptido 25AA Cys/Cys lineal que contiene 3 Cys como un antígeno. La Figura 3 muestra los resultados de mediciones realizadas con sueros de n=69 ratas positivas de anticuerpo inmunizadas utilizando diferentes ciclopéptidos de la presente invención.

Hubo dos patrones de reacción de los sueros de ratas tratadas (tipo 1/tipo 2) . Una fracción principal de los sueros (93%, Figura 3, panel superior tipo 1) se bloqueó en forma muy eficiente por los ciclopéptidos - mutantes 25AA. o 18AA Cys/Ser (69+2% o 68+3% (cierre Gln) / 69+2% (cierre D-Glu) , respectivamente) que fueron incluso superiores a los ciclopéptidos 25AA o 18AA Cys/Cys que contienen 3-Cys (65±2% o 59±2%, respectivamente) , mientras que los mutantes 25AA o 18AA Ser/Cys casi no tienen efecto inhibitorio, independientemente del aminoácido en el sitio de cierre (6±2%, 25AA Ser/Cys, P< 5x 10"30; 1±2%, 18AA Ser/Cys con Gln- (P< 3.7xl0"33) o 1±2% con cierre D-Glu, (P< 6xl0"55) .

Una fracción menor de los sueros (7%, Figura 3, panel inferior, tipo 2 y Figura 6) se bloqueó en forma similar por péptidos mutantes Cys/Ser o Ser/Cys - aunque en una menor proporción en términos de capacidad inhibitoria; además, para ambos ciclopéptidos 25AA y 18AA, los mutantes fueron menos efectivos que sus contrapartes 25AA o 18AA Cys/Cys que contienen 3 Cys . La capacidad bloqueadora de los ciclopéptidos mutantes 25AA o 18AA Cys/Ser fue 48±6% o 50±8% (cierre Gln) /47±5% (cierre D-Glu), respectivamente, que fue inferior de manera constante a la de los ciclopéptidos 25AA o 18AA Cys/Cys que contienen 3-Cys correspondientes (72+5% o 67±6%, respectivamente); sin embargo, en estos animales, los mutantes 25AA o 18AA Ser/Cys revelaron capacidades de bloqueo que fueron casi comparables con aquellas de' mutantes Cys/Ser (37±7% 25AA Ser/Cys, P=0.22 n.s.; 47±3% 18AA Ser/Cys con Gln-o 33±5% con cierre D-Glu, P=0.7 n.s. o P=0.08 n.s., respectivamente) .

De manera subsecuente, la capacidad bloqueadora dependiente de dosis de diversos betal-ECII-péptidos lineales y cíclicos in vitro se analizó al utilizar el mismo ensayo de competencia ELISA (Figura 4) : Experimentos que incluyen péptidos 25AA Cys/Cys lineales, mutantes péptidos 25AA Cys/Ser cíclicos, péptidos 18AA Cys/Cys cíclicos, mutantes péptidos 18AA Cys/Ser cíclicos y un mutante péptido 18AA Cys/Ser lineal, revelaron que en todos los sueros de n=6 ratas positivas de anticuerpo inmunizadas selectas aleatoriamente, fueron mejor bloqueadas en una forma dependiente de. dosis por ciclopéptidos mutantes betal-ECII-18AA Cys/Ser seguido por ciclopéptidos 18AA Cys/Cys no mutantes, y el mutante ciclopéptido 25AA Cys/Ser. Todos los ciclopéptidos fueron sustancialmente superiores a sus contrapartes lineales (con o sin mutación) en términos de capacidad de neutralización de anticuerpo (P<0.005; Figura 4) , dando ,por resultado una disminución dependiente de dosis en anticuerpos anti-betal-ECII libres en circulación de 53% con un exceso de 8 veces, 66% con un exceso de 20 veces, y aproximadamente 85% con un exceso de 80 veces de mutantes ciclopéptidos 18AA Cys/Ser. Los resultados correspondientes para péptidos 18AA Cys/Cys- o 25AA Cys/Ser cíclicos fueron: 46/30% [exceso 8 veces] , 56/49% [exceso 20 veces] , y 71/83% a un exceso de 80 veces. Péptidos lineales claramente fueron menos eficientes, dando por resultado una disminución dependiente de dosis en títulos de anticuerpo receptor de sólo 24% [exceso de 8 veces] , 35% [exceso de 20 veces] , y aproximadamente 50% a un exceso de 80 veces para ambos péptidos 25AA Cys/Cys lineales y 18AA Cys/Ser lineales.

Adicionalmente, la capacidad de bloqueo in vitro (= neutralización) de las variantes dé ciclopéptido novedosas del segundo bucle extracelular .(ECII) del receptor betal-adrenérgico humano incluyendo las variantes Abu descritas aquí, se probó con sueros de ratas positivas de anticuerpo betal-ECII inmunizadas después de incubación por 12-14h a 4 grados C (Figura 12). La eficiencia bloqueadora in vitro del ciclopéptido 22AA cyc22AA Cys/Cys (eficiencia bloqueadora 82.0±5.0% contra suero no bloqueado, P=0.000046) seguido por el mutante cyc22AA Cys/Abu (eficiencia bloqueadora 79.4±4.0%, P=0.00014) y el mutante cyc22AA Cys/Ser (eficiencia bloqueadora 74. ± 5.0%, P=0.00026), que subraya la relevancia de imitación óptima a las cisteínas de segundo bucle. La eficacia de estos péptidos de imitación beta-ECll (conformación) de forma óptima fue incluso superior que la capacidad de bloqueo de ciclopéptidos más largos que contienen 3 Cys previamente descritos, es decir, ciclopéptidos cyc25AA Cys/Cys (eficiencia bloqueadora 73.4±5.0%, P=0.00011) o ciclopéptidos cycl8AA Cys/Cys más cortos (eficiencia bloqueadora 66.1± 7.0% contra suero no bloqueado, P=0.00025; ver Figuras 12A y 12B) .

El péptido 22AA Cys/Abu cíclico, aunque comparablemente eficiente in yitro (eficacia de bloqueo de anticuerpo de imitante cyc22AA Cys/Abu 79.4+4.0% (P=0.00014) contra ratas inmunizadas sin tratar; cyc22AA Cys/Ser 74.9±5.0% (P=0.00026) contra ratas inmunizadas sin tratar; cyc22AA Cys/Abu contra cyc22AA Cys/Ser, P=0.5, Figura 12B) , claramente tiene una superior eficiencia de bloqueo de anticuerpos que el mutante cyc22AA Cys/Ser in vivo, como se evidencia por inyección de los ciclopéptidos en ratas cardiomiopáticas inmunizadas positivas de anticuerpo receptor (Figuras 13A y 13B) .

Ejemplo 3: Ensayo FRET Funcional In vitro La capacidad bloqueadora de imitantes ciclopéptidos ?i-ECn 25AA o 18AA (que tienen o no un D-Glu/Gln en el sitio de cierre de anillo) en señalización mediada por /?i-receptor (ensayo cAMP funcional) se ensayó utilizando un enfoque por transferencia de energía de resonancia-fluorescencia (FRET) (Figura 2) .

El efecto de la pre-incubación (12h, 4 grados C, incubador giratorio) de anticuerpos anti- ?i-ECu IgG de una rata representativa con mutante ?i-ECn-18AA ciclopéptido (mutaciones Cys/Ser o Ser/Cys, respectivamente) se comparó con el efecto inhibitorio de un ciclopéptido 25AA Cys/Cys que contienen 3 Cys o con el efecto de anticuerpos anti- ?i-ECn IgG no incubados con péptidos bloqueadores . La proporción YFP/CFP normalizada de las señales de emisión FRET registradas sirve para cuantificar el efecto de los imitantes ciclopéptidos en términos de bloqueo (en por ciento) de producción cAMP celular inducida por anticuerpo de células de riñon embriónico humano que expresan ?i-AR transfectadas en forma estable Epacl de manera transitoria (células HEK 293- .ß?) . El eje x en la Figura 2 corresponde al tiempo de registro dado en segundos. De nuevo, en términos de inhibir efectos de anticuerpo funcionales medibles (bloqueo de incrementos cAMP intracelulares ) el mutante ?i-ECu-18AA Cys/Ser cíclico fue substancialmente superior a su contraparte Ser/Cys, e incluso ligeramente más efectivo que el ciclopéptido 25AA Cys/Cys que contiene 3 Cys (Figura 2).

Tomados en conjunto, los resultados de las pruebas realizadas aquí demuestran que la capacidad bloqueadora de anticuerpo de ciclopéptidos mutados no se afectó por la reducción del número de aminoácidos de un péptido 25-merico a 18-merico. Los resultados también demuestran una comparabilidad excelente de ciclopéptidos 25AA Cys/Cys y 18AA Cys/Cys con los mutantes 25AA o 18AA Cys/Ser cíclicos, pero no con los imitantes 25AA o 18AA Ser/Cys cíclicos. De manera sorprendente, la naturaleza exacta del intercambio de un solo residuo cisteína con un residuo serina determina en forma marcada la potencia neutralizante de los péptidos mutados: el intercambio de Cys?Ser en la posición 18 (ciclopéptido 25-AA) o en la posición 14 (ciclopéptido 18-AA) , respectivamente, dio por resultado ciclo péptidos con excelentes efectos neutralizantes de anticuerpo y farmacológicos in vitro (Figuras 2,3), mientras que los mutantes Cysi7?Seri7 o Cysi3—Sern (péptido 25-AA o 18-AA, respectivamente) casi no tienen efecto inhibitorio, ni respecto a sus propiedades como depuradores de anticuerpo en términos de su capacidad para inhibir efectos de anticuerpo funcional (neutralización de estimulo receptor in vitro; Figuras 2,3 y Ejemplo 3). El intercambio D-Glu/Gln en la posición 25 (mutante ciclopéptido 25AA) o 18. (mutante ciclopéptido 18AA) no influencia significativamente la capacidad de blogueadora de los ciclopéptidos , independientemente de su longitud (es decir, 25 contra 18 aminoácidos; Figuras 3) .

Ejemplo 4: Modelo en animal, bloqueo "in vivo" de anticuerpos receptores El modelo en animal empleado en este ejemplo y cualquier otro ejemplo aquí descrito, si no se indica por el contrario, es el modelo de rata análogo a humano. Antes de evaluar y probar, respectivamente, este modelo de rata análogo a humano se trató como se describe a continuación utilizando los diversos compuestos de la presente invención, más particularmente compuestos de las fórmulas VI, VII, VIII y IX y como controles, un (Glni8-)péptido mutado ECn-18AA Cys/Ser lineal (con la siguiente secuencia de aminoácidos: Ala-Asp-Glu-Ala-Arg-Arg-Cys-Tyr-Asn-Asp-Pro-Lys-Cys-Ser-Asp-Phe-Val-Gln) y un (Gln2s) péptido ECn-25AA Cys/Cys que contienen 3 Cys no mutados lineales (con la siguiente secuencia de aminoácidos: Ala-Arg-Ala-Glu-Ser-Asp-Glu-Ala-Arg-Arg-Cys-Tyr-Asn-Asp-Pro-Lys-Cys-Cys-Asp-Phe-Val-Thr-Asn-Arg-Gln.

Los efectos bloqueadores in-???? de ambos ciclopéptidos imitantes 25AA y 18AA Cys/Ser (con un sitio de cierre Gln) , el ciclopéptido mutante 18AA Ser/Cys, y un péptido 18AA Cys/Ser lineal mutado se analizaron después de inyección intravenosa (i.v.) de 1.0 mg/kg de peso corporal (Bw) de cada construcción en ratas positivas de anticuerpo recientemente inmunizadas (es decir, uso profiláctico de ciclopéptidos en un tipo de estudio de "prevención"), con una primera aplicación de ciclopéptidos, 3 meses después de la inmunización inicial (y dos refuerzos subsecuentes a meses 2 y 3). En total, cinco aplicaciones profilácticas de las diversas construcciones se dieron a intervalos de 4 semanas, siempre dos semanas después del refuerzo de antígeno continuo mensual. Se tomaron sueros 18-20 horas después de inyección i.v. ? ensayaron por reactividad por ELISA utilizando el péptido 25AA Cys/Cys lineal que contienen 3 Cys como un antígeno (Figura 5) .

Estas primeras aplicaciones de ciclopéptido in vivo (profilácticas) demuestran que la más alta eficiencia en términos de neutralización de anticuerpos se logra con 1.0 mg/kg de peso corporal (Bw) de ciclopéptidos 25AA Cys/Cys o 18AA Cys/Cys no mutantes (87.7+2% o 89.9±3% como disminución después de cinco inyecciones de ciclopéptidos, en comparación con animales no inmunizados sin tratar; ambos P< 0.005), seguido por el ciclopéptido 18AA Cys/Ser mutante (54.5±2% disminución después de 5 inyecciones de ciclopéptido; P<0.05), mientras que péptidos 25AA Cys/Cys lineales o mutantes 18AA Cys/Ser lineales a una misma concentración, no tuvieron efectos bloqueadores significantes (disminución de título de anticuerpo 25.8±3% o 4.5±11% después de 5 inyecciones, P=0.16 o P=0.8; Figura 5).

Aún más, los efectos bloqueadores in vivo de mutantes ciclopéptidos 25AA y 18AA Cys/Ser terapéuticamente empleados, el (Gln-) ciclopéptido mutante 18AA Ser/Cys, y un péptido 18AA Cys/Ser lineal mutado se estimaron después de una primer dosis intravenosa (i.v.) (es decir, 1.0 mg/kg de peso corporal (Bw) ) de cada construcción inyectada en ratas positivas de anticuerpo anti-betal-ECu inmunizadas, que sin embargo presentan un fenotipo cardiomiopático (después de nueve meses de inmunización mensual lx con el antígeno betal-ECII/GST; Figuras 6-8) . Se tomaron sueros 18 a 20 horas después de la primera inyección i.v. de las diversas construcciones y ensayaron por reactividad por ELISA utilizando el péptido 25AA Cys/Cys lineal que contienen 3 Cys como un antígeno. Aplicación "Terapéutica" de diversos ciclopéptidos en ratas positivas de anticuerpo cardiomiopáticas revelo una superidor capacidad de bloqueo in vivo de mutantes ciclopéptidos 18AA Cys/Ser (lmg/kg/Bw) en comparación ya sea como mutante ciclopéptido 25AA Cys/Ser o los mutantes ciclopéptidos 18AA Ser/Cys claramente menos eficientes a la misma concentración (Figuras 6 y 7) . De nuevo, la eficiencia iñ vivo del mutante ciclopéptido 18AA Cys/Ser fue substancialmente superior a la del mutante péptido 18AA Cys/Ser lineal. Sin embargo, al disminuir la dosis de aplicación de los mutantes 18AA Cys/Ser cíclicos a 0.25 mg/kg de peso corporal (Bw) , no se logró disminución relevante en anticuerpos receptores, sugiriendo una relación de dosis-en-efecto por mutante ciclopéptido (Figura 6) .

Inyecciones terapéuticas repetidas de ciclopéptidos S-S sencillos mutantes cada 4 semanas en ratas inmunizadas a largo plazo con cardiomiopatía inmune inducida por anticuerpo confirman un tipo de relación de "dosis mínima critica" -y-efecto para mutantes ciclopéptidos S-S sencillos: una dosis de 0.25 mg/kg de Bw del ciclopéptido 18AA Cys/Ser - aunque capaces de depurar anti-cuerpos receptores en cierta medida -fue claramente menos eficiente en términos de ambos, (1) la disminución lograda en anticuerpos-receptores . en circulación (incluso cuando es respecto solo a "respondientes" sensibles a ciclopéptido, definido como animales que tienen, después de 7 inyecciones ciclopéptido, un nivel de anticuerpo restante máximo igual o inferior a 80% del título al inicio de la terapia (Figuras 7B y C) , y (2) en el efecto cardioprotector logrado (Figuras 7B, 8B, 9B, y 10) en comparación ya sea con una dosis de 1.0 o 2.0 mg/kg de peso corporal de ciclopéptido 18AA Cys/Ser. Estas últimas dosis fueron casi igualmente eficientes en términos tanto de neutralización de anticuerpos receptores en circulación (Figuras 7B y C) , en versión de características cardiomiopáticas inducidas por anticuerpo (Figuras 8B, 9B, y 10) . Un aumento adicional en la dosis de aplicación a 4.0 mg/kg de peso corporal, sin embargo no resulta en superior eficiencia - ni respecto a capacidad de depuración de anticuerpo (Figuras 7B y C) , ni respecto a efectos cardioprotectores (Figuras 8B, 9B, 10) .

Al inyectar los péptidos no se observaron efectos secundarios sistémicos o locales serios. Además, después de inyección de los diversos ciclopéptidos mutantes, tanto el ritmo cardiaco como la presión sanguínea de los animales no fueron afectados (Figura 10A) .

Como se mencionó, los efectos bloqueadores in-vivo de ambos ciclopéptidos mutados 25AA y 18AA Cys/Ser (con un sitio de cierre Gln) , el (Gln- ) ciclopéptido imitante 18AA Ser/Cys, y un péptido 18AA Cys/Ser lineal mutado se analizaron después de una primer inyección intravenosa (i.v.) de 1 mg/kg de peso corporal (Bw) de cada construcción en ratas positivas de anticuerpo inmunizadas. Sueros se tomaron 18-20 horas después de inyección i.v. y ensayaron por reactividad por ELISA utilizando el péptido 25AA Cys/Cys lineal que contienen 3 Cys como un antigeno. Los datos in vivo confirmaron una capacidad de bloqueo superior de los ciclopéptidos 18AA Cys/Ser mutados (1 mg/kg/Bw) en comparación ya sea con mutantes 25AA Cys/Ser o los ciclopéptidos mutados 18AA Ser/Cys claramente menos efectivos a una misma concentración (Figura 6) . La eficiencia in vivo del ciclopéptido 18AA Cys/Ser también fue substancialmente superior a la del péptido 18AA Cys/Ser lineal. De manera interesante, la diferencia en la eficiencia bloqueadora de los ciclopéptidos mutados Cys/Ser en comparación con los péptidos lineales fue incluso más pronunciada in vivo (Figuras 6, 7) .

Este hallazgo fue soportado por mediciones cinéticas comparativas que demuestran que la vida media de mutantes ECII-péptido en sangre entera ( ß?-ECII-péptidos , por ejemplo mutantes cyc 25AA-Cys/Cys o cyc 18AA- o 25AA-Cys/Ser con una estructura cíclica como los péptidos cíclicos aquí descritos) es más que 10 veces la vida media de sus contrapartes , lineales (lineal: aproximadamente 5.5h; cíclico: aproximadamente 64.5h). Los datos se obtuvieron después de incubación de péptidos lineales o cíclicos con sangre entera que se toma tanto de ratas sin tratar (control) de sujetos humanos sanos (control) en la presencia de heparina (24h, 4 grados C, incubador giratorio) , respectivamente. La cantidad de péptidos intactos restantes se determinó por ELISA de competencia con péptidos y#i-ECII-25AACys/Cys lineales a 2 min, 10 min, 30 min, 1, 2, 4, 8, 16 y 22h. (Figura 20).

Al inyectar los péptidos, no se observaron efectos secundarios locales o sistémicos serios. Además, después de inyección de los diversos ciclopéptidos mutantes, no fueron afectados tanto el ritmo cardiaco como la presión sanguínea de los animales .

Sin embargo, los datos in vivo también indican que la eficiencia del ciclopéptido mutado 18AA Cys/Ser igualmente puede depender de la dosis aplicada (Figuras 6, 7). Los resultados obtenidos son compatibles con una relación de dosis-y-efecto (mínima) para mutantes ciclopéptido S-S sencillos: una dosis de 0.25 mg/kg del mutado ciclopéptido 18AACys/Ser fue substancialmente menos eficiente en términos tanto de la disminución lograda en anticuerpos receptores en circulación como en el efecto cardioprotector logrado en comparación ya sea con una dosis de 1.0 o 2.0 mg/kg de peso corporal (Bw) (Figuras 6, 7) . Estas dosis fueron casi igualmente eficientes tanto en términos de neutralización de anticuerpos receptores en circulación como inversión de características cardiomiopáticas inducidas por anticuerpo (Figuras 7, 8, 9 y 10).' Un adicional incremento en la dosis aplicada a 4.0 mg/kg de Bw, sin embargo, no resulta en superior eficiencia - ni respecto a capacidad de producción de anticuerpo (Figura 7) ni respecto a efectos cardioprotectores in vivo (Figuras 8-10) . Una alta dosis ( = 4.0 mg/kg de Bw) de imitantes cycl8AA Cys/Ser, no aumenta la eficiencia; por el contrario, lleva a un aumento transitorio en títulos de anticuerpo, permitiendo reducciones significantes en títulos de anticuerpo-receptor solo después de la tercera o cuarta inyección de ciclopéptido. En forma más notable, el efecto de la capacidad neutralizante de anticuerpo de las diferentes concentraciones inyectadas de los ciclopéptidos mutantes cycl8AA Cys/Ser también se confirmó en términos de inversión de características cardiomiopáticas inducidas por anticuerpo en el curso del estudio con la mejor cardioprotección lograda por 1.0 o 2.0 mg/kg de Bw de mutantes ciclopéptidos 18AA Cys/Ser (Figuras 8B, 9B, y 10, ) .

Además, los experimentos in vivo demuestran que la capacidad de bloqueador de anticuerpo de ciclopéptidos mutantes aparentemente no se afecta por una reducción en el número de aminoácidos de un ciclopéptido 25-mérico a un 18-mérico; tanto los datos in vitro e in vivo demuestran una comparabilidad excelente de los dos . mutantes ciclopéptido 25AA Cys/Ser o 18AA Cys/Ser de enlace disulfuro sencillo que contienen 2 cisteínas (Figura 8A) . Deberá de notarse sin embargo, que ambos 1.0 mg/kg de Cys/Ser 25AA-mérico así como altas dosis de mutantes Cys/Ser 18AA-mérico (i.e., 4.0 mg/kg de Bw) llevan a un aumento transitorio inicial en títulos de anticuerpo (Figuras 7A y B) , y de esta manera posponen una reducción significante en títulos de anticuerpo de receptor a la tercera o cuarta aplicación de ciclopéptido (tercer o cuarto mes de terapia) . Este fenómeno no ocurre con cualquiera de las dosis de 1.0 o 2.0 mg/kg de Bw de mutantes ciclopéptidos 18AA Cys/Ser.

Además, la capacidad bloqueadora de anticuerpo de ciclopéptidos mutantes tampoco parece ser afectada por una reducción en el número de aminoácidos de un ciclopéptido 25-mérico a un 22-mérico, que, sin embargo parecen poseer mejores capacidades bloqueadoras de anticuerpo que el ciclopéptido 18-mérico - independientemente de la mutación en la posición 216 de la secuencia ß?-ECII. La capacidad bloqueadora in vivo (=neutralizante) de los mutantes ciclopéptidos que contienen cisteína novedosos (mutantes cyc22AA Cys/Ser y cyc22 Cys/Abu) del segundo bucle extra-celular (ECII) del receptor betal-adrenérgico humano aquí descrito, se probaron por inyección terapéutica en ratas que se han inmunizado regularmente sobre 8 meses (inmunización básica y siete refuerzos de antígeno subsecuentes cada 4 semanas (Figuras 13 y 14) , y compararon con los efectos de mutantes Cys/Ser betal-ECII 18AA cíclicos. Después de 12 inyecciones de ciclopéptido regulares (cycl8 Cys/Ser) cada 4 semanas, los títulos en animales positivos de anticuerpo sin tratar (significativamente) disminuyeron a 47.9±6.0% de los valores al inicio de la terapia (n=5 controles positivos) . En contraste, 12 inyecciones de mutantes cyc22AA Cys/Ser (n=5 animales) disminuyeron significativamente los títulos de anticuerpo a 15.0±10.6% (P=0.0001), o 11 inyecciones de los mutantes cyc22AA Cys/Abu de la invención (n=5 animales) aún más significativamente disminuyeron los títulos a 7.4 ± 4.0% de los títulos de anticuerpo al inicio de la terapia (P= 2.0 x 10-8) (Figuras 13A y B) .

La eficiencia in vivo de ambos mutantes cyc22AA-novedosos de esta manera fue substancialmente superior al mutante ciclopéptido 18AACys/Ser previamente descrito (n= 5 animales), que después de 12 inyecciones disminuye los títulos de anticuerpo a aproximadamente 50% de los títulos al inicio de la terapia (P= 0.005 contra animales positivos de anticuerpos sin tratar; ver Figura 13B) .

El mutante ciclopéptido 22AA Cys216?Abu216, aunque similarmente eficiente in vitro (prueba-t: P= 0.5 contra cyc22AA Cys216—Ser216 ) , de hecho tuvo una tendencia hacia eficacia blogueadora de anticuerpo superior in vivo en ratas inmunizadas positivas de anticuerpo-receptor que el mutante cyc22AA Cys216/Ser, como se evidencia en ratas inmunizadas a largo plazo positivas de anticuerpo-receptor (Figura 13B) .

Además, la evaluación de la eficacia cardioprotectora biológica de los imitantes ciclopéptido por seguimiento ecocardiográfico durante 12 meses de tratamiento, también sugiere una superioridad del mutante cyc22AA Cys/Abu sobre el mutante cyc22AA Cys/Ser.

Ambos ciclopéptidos 22AA aparecen más eficientes que un mutante péptido betal-ECII cíclico 18AA Cys/Ser respecto a sus efectos cardioprotectores in vivo, como se evidencia por las disminuciones (determinadas en forma no invasiva) en diámetros diastólico de extremo ventricular izquierdo (LVED) y sistólico de extremo (LVES) (Figuras 14A y B) , y el aumento en "índice Cardiaco" (CI, dado en ml/min/g de peso corporal; Figura 14C; derivado de ecocardiográfia bidimensional y Doppler utilizando un sistema ecocardiográfico Visual Sonics (Vevo 770, versión V2.2.3), equipado con un transductor 17.5 Hz) .

Similarmente, evaluación invasiva de los parámetros funciones cardiacos sugiere una tendencia (no significante) para una superior eficacia del mutante cyc22AA Cys/Abu comparado con el mutante cyc22AA Cys/Ser respecto a recuperación de la contractilidad ventricular (Figura 14E) e inversión de la presión diastólica de extremo LV (Figura 14F) .

En la siguiente etapa, la imitación de epítopo ß?-ECII y los mutantes ciclopéptido 22AA anteriormente mencionados de la presente invención se emplearon para experimentos in vivo, a fin de optimizar su estrategia de aplicación/administración. Los diferentes protocolos de aplicación comprenden ya sea aplicaciones intravenosas mensuales de mutantes ciclopéptido descritos por la presente invención (cyc22AACys/Abu) , o una triple inyección (una inyección cada semana en 3 semanas subsecuentes) cada tres meses. Medidas como estas, proporcionan el potencial para reducir la cantidad de ciclopéptidos inyectados o para reducir la carga de venipuntura (mensualmente regular) y para incrementar la flexibilidad de aplicación ' (para ambos, pacientes humanos y animales), mientras que se mantiene o incrementa la eficiencia biológica de las construcciones inyectadas de la presente invención.

Respecto a las construcciones cyc22AA Cys/Abu aquí descritas, triples inyecciones (1 inyección por semana en 3 semanas subsecuentes) seguidas por un intervalo de tiempo libre de intervención de dos meses, en donde fueron al menos tan eficientes que o incluso ligeramente superiores a aplicaciones mensuales para reducir el título de anticuerpo anti- i-ECII en circulación (Figuras 21A y B) , y para invertir el fenotipo cardiomiopático (Figura 22A-C) .

Tomadas en conjunto, debido a la actividad cardioprotecto.ra e inmunomoduladora de los péptidos cíclicos homólogos ECII aparece que es dependiente en forma substancial de su conformación, un puente disulfuro localizado en forma intramolecular es esencial para estabilizar y mantener la estructura tri-dimensional de la construcción de imitación de bucle ECII. En el péptido cíclico 21+1 (=22)AA, las cisteínas restantes (es decir en la posición 209 y 215, en el caso 216 se han mutado al aminoácido que no es de origen natural ácido L-alfa amino-butírico (Abu) ) mantiene una distancia definida (intramolecular) , reforzada adicionalmente por introducción del aminoácido de origen natural más pequeño glicina en el sitio de cierre de anillo (pronosticado) , a fin de permitir la formación de un puente disulfuro intramolecular que define estructura.

Ejemplo 5: Barrido o exploración de alanina de betal-ECII Para determinar adicionales aminoácidos esenciales para la conformación de imitación betal-ECII específica y de esta manera eficacia bloqueadora de anticuerpo del ciclopéptido (21+1=) ,22AA Cys/Abu novedoso, se realizó un barrido de alanina con el producto de investigación aquí presentado (Figura 15A) .

Para el barrido de Ala, cada uno de los nueve aminoácidos divergentes de la segunda secuencia de bucle del receptor beta2-adrenérgico humano, que no tiene efecto betal-anticuerpo-bloqueador , se han imitado a alanina antes de ciclización y prueban in vitro para su capacidad de bloqueo de anticuerpo respectiva.

Dominio (primero) Secuencia AA (último) Receptor ECII beta2-adrenérgico: 175 RATHQEAIN CYA ETCCD FFTG 196 Receptor ECII betal-adrenérgico: 200 RAESDEARRCYNDPKCCD FVTG 221 Ciclopéptido ECII betal-22AA Cys-Cys/Abu: RAESDEARRCY DPKC Abu DFV G Péptidos ala-substituidos cíclicos ECII betal-22AA Cys-Cys/Abu 1. RAASDEARRCYNDPKC Abu DFVTG 2. RAEADEARRCYNDPKC Abu DFVTG 3. RAESAEARRCYNDPKC Abu DFVTG 4. RAESDEAARCYNDPKC Abu DFVTG 5. RAESDEARACYNDPKC Abu DFVTG 6. RAESDEARRCYADPKC Abu DFVTG 7. RAESDEARRCYNAPKC Abu DFVTG 8. RAESDEARRCYNDAKC Abu DFVTG 9. RAESDEARRCYNDPAC Abu DFVTG El análisis de sus capacidades bloqueadoras de anticuerpo respectivas reveló de manera sorprendente, que mutación de AA situada en la segunda mitad del ciclopéptido betal-22AA (por ejemplo, aminoácidos 211-214: NDPK) disminuye dramáticamente la eficiencia bloqueadora (Figura 15B) .

Este hallazgo fue el mismo para ambos anticuerpos anti-betal-ECII de rata monoclonal y policlonal en conformación (Figura 15B, paneles 1 y 2), y también para anticuerpos de conejo policlonal de conformación (Figura 15B, panel 3) o anti-betal-ECII de ratón monoclonal (Figura 15B, panel 4) .

En forma consistente e independientemente de la especie en la que se generó el anti-betal-ECII, el AA por mucho más relevante para , conservar la capacidad bloqueadora de anticuerpo del ciclopéptido de la invención fue la prolina (P) en la posición 213 (en. total 89% de pérdida en capacidad de bloqueo en comparación con el producto de la invención) , seguido por ácido aspártico (D) en la posición 212 (en total 57% de pérdida en capacidad bloqueadora) , asparagina (N) en la posición 211 (en total pérdida 41% en capacidad bloqueadora) , y la lisina (K) en la posición 214 (en total 40% de pérdida en capacidad bloqueadora; numeración de acuerdo con Frielle et al. 1987, PNAS 84, páginas 7920-7924).

Además, en el caso del anti-betal-ECII monoclonal de ratón, también un intercambio de cada una de las dos argininas en la posición 207 (R; 81% de pérdida en capacidad bloqueadora) , y 208 (R; 96% de pérdida en capacidad bloqueadora) , y también aunque en una proporción menor, un intercambio del ácido aspártico en la posición 204 (D; 33% de pérdida en la capacidad bloqueadora) disminuyó significativamente la capacidad bloqueadora del ciclopéptido betal-22AA Cys/Abu de la invención.

En contraste, para la mayoría de los anticuerpos anti-betal-ECII (rata/conejo) , una substitución de aminoácidos con la primera mitad del ciclopéptido homólogo cyc22AA Cys/Abu betal-ECII (por ejemplo, aminoácidos 202-208: ESDEARR) no afecta de manera significativa la eficacia bloqueadora del ciclopéptido de la invención. De manera interesante, una substitución de serina en la posición 203 por alanina para distintos anticuerpos anti-betal-ECII incluso ligeramente incrementa su capacidad bloqueadora (por ejemplo, los anticuerpos monoclonal de rata, policlonal de conejo, y también unos cuantos de rata, ver también Figura 15B) .

Por los · aminoácidos esenciales de barrido Ala anteriormente descritos para reconocimiento de anticuerpo del o de los ciclopéptidos descritos se identificaron. En forma más notable, aminoácidos en las posiciones 12, 13, 14 y 15 del péptido cíclico de la presente invención (como se ilustra en la Figura 31A) se requiere que conserven la capacidad bloqueadora de anticuerpo del ciclopéptido, con prolina (aparte de cisteína) en la posición 14 que es uno de los AA más esenciales en el ciclopéptido 22AA (Figuras 15A y B) .

Ensayos de competencia-enlaces subsecuentes (Figura 15C) para comparar la respuesta de dosis de 22AA Cys/Ser en comparación con ciclopéptidos 22AA Cys/Abu de la invención respecto a su capacidad para inhibir el enlace de diferentes anti-betal-ECII de rata o conejo a 16AA betal-ECII-péptidos lineales biotinilados (es decir, para comparar afinidades de péptido/anticuerpo) confirman la aproximadamente 2-veces menor EC50 de 22AA Cys/Abu contra 22AA Cys/Ser-CP para anticuerpos de rata monoclonales (Figura 15C, panel 1) y policloñales , pero igualmente para anti-betal-ECII de conejo policlonal (Fig. 15C, panel 2 y 3) .

De manera sorprendente, en el caso del mutante péptido Cys/Ser cíclico 18AA, la curva de competencia de enlace de "dos sitios" que se obtiene con anticuerpos anti-betal-ECII conejo policlonal indica la presencia de al menos, dos entidades de anticuerpo diferentes en la preparación con diferentes afinidades de ciclopéptido betal-18AA Cys/Ser (Figura 15C, panel 3).

Las curvas de · competencia de "un sitio" que se obtienen para seleccionados de los ciclopéptidos betal-22AA Cys/Abu mutados con alanina específicos de, sitios diferentes de la presente invención, confirmó en forma impresionante los resultados de competencia ELISA .

Mientras que el ciclopéptido 22AA Cys/Abu de la invención (22AbuO) o un intercambio serina/alanina (22Abu2) bloqueó eficientemente el enlace de anticuerpo a 16AA betal-ECll-péptidos lineales biotinilados en aproximadamente la misma proporción, un intercambio prolina/alanina (22Abu8) disminuye la eficacia de enlace de anticuerpo (=afinidad de anticuerpo al mutante 22Abu8) en aproximadamente 400-veces (EC50: 5,54xl0~5 (22Abu8) contra l,67xl0~7 (22AbuO) ; Figura 15C, panel 4) .

Ejemplo 6: Bloqueo in vitro de activación de ß?-receptor-autoanticuerpos humanos La capacidad de bloqueo de imitantes ciclopéptidos ß?-ECn 22AA Cys/Abu en estímulo ß?-receptor inducido por activación de autoanticuerpos de ß?-receptor humanos (ensayo cAMP funcional) se ensayó utilizando un enfoque por transferencia de energía de resonancia-fluorescencia (FRET) (Figura 19) . La proporción YFP/CFP normalizada de las señales de emisión FRET registradas sirvió para cuantificar el efecto de los mutantes ciclopéptidos 22AA Cys/Abu en términos de bloqueo (en por ciento) de producción cAMP celular inducida por anticuerpo de células de riñon embriónico humano que expresan Epacl en forma estable transfectadas con ß?-AR (células HEK 293- ß? ) .

Para este propósito, anticuerpos IgG humanos aislados de una paciente DCM de 28 años de edad (representativa) fueron preincubados (12h, 4 grados C, incubador rotatorio) con diferentes mutantes de intercambio cyc22AA Cys/Abu-Ala (como se da en la Figura 15A) . IgG de paciente desbloqueado (humano) dio por resultado actividad 18±3% FRE . El péptido cíclico 22Abu8 (cyc RAESDEARRCYNDAKC Abu DFVTG) con un intercambio Pro2i6>Ala no fue capaz de bloquear la IgG de paciente (17±2% actividad residual FRET) , indicando que también en humanos la prolina en la posición 216 de la secuencia ß?-ECn representa un aminoácido esencial dentro del epítopo receptor reconocido y ligado por autoanticuerpos ß?-receptor humano. En contraste, IgG de paciente fue bloqueada en forma muy eficiente con el ß?-ECn-péptido mutante cyc22AACys/Abu sin cambio referido como 22AbuO (= cyc RAESDEARRCYNDPKC Abu DFVTG) que muestra solo actividad FRET residual despreciable después de preincubacion (3+3%, P<0.001 contra sin bloquear). Similarmente, el péptido cíclico 22Abul tuvo un fuerte efecto de bloqueo (8+5% de actividad FRET, P<0.005 contra IgG de paciente sin bloquear) , indicando que Glu2o2 no es un aminoácido que constituye epítopo importante y no es un objetivo relevante para autoanticuerpos ß?-receptores humanos .

En conjunto, los resultados de las pruebas realizadas aquí, demuestran que la capacidad bloqueadora de anticuerpo de ß?-ECn-ciclopéptidos mutados no se afectó por la reducción del número de aminoácidos de un péptido 25-mérico a un 22-mérico (o un 18-mérico) . Los resultados también demuestran una buena comparabilidad de ciclopéptidos 25AA Cys/Cys y 18AA Cys/Cys con los mutantes 25AA, 22AA o 18AA Cys/Ser cíclicos, y también con los mutantes 22AA Cys/ABu cíclicos respecto a sus capacidades para bloquear antißl-ECII-abs de rata o conejo. Esto también fue el caso para activar autoanticuerpos ß?-receptores humanos (aabs) . También anti-Pi-ECu humano parece dirigido contra un epítopo dentro del segundo bucle ß?-receptor que comprende ya sea aminoácidos clave CyS209 Pro2i3 , o los aminoácidos Pro2i3/Cys2i5 (numeración de acuerdo con Frielle et al. 1987, PNAS 84, páginas 7920-7924) .

La presente invención se refiere a las secuencias de nucleótidos y aminoácidos siguientes: SEQ ID o. 1: Secuencia de aminoácidos homologa a un epítopo ECu de ß?-AR humano (18AA; Cysi4->ABu14) ; Ciclización puede ocurrir entre Alai y Glni8 Ala-Asp-Glu-Ala-Arg-Arg-Cys-Tyr-Asn-Asp-Pro-Lys-Cys-ABu-Asp-Phe-Val-Gln SEQ ID No. 2: Secuencia de aminoácidos homologa a un epítopo ECu de ß?-AR humano (25AA; Cysi8?ABuis) ; Ciclización puede ocurrir entre Alai y Gln25 Ala-Arg-Ala-Glu-Ser-Asp-Glu-Ala-Arg-Arg-Cys-Tyr-Asn-Asp-Pro-Lys-Cys-ABu-Asp-Phe-Val-Thr-Asn-Arg-Gln SEQ ID No. 3: Secuencia de aminoácidos homologa a un ep topo ECu de ß?-AR humano (18AA; Cysi3?ABui3) ; Ciclización puede ocurrir entre Alai y Glni8 Ala-Asp-Glu-Ala-Arg-Arg-Cys-Tyr-Asn-Asp-Pro-Lys-ABu-Cys-Asp-Phe-Val-Gln SEQ ID No. 4: Secuencia de aminoácidos homologa a un epitopo ECu de ß?-AR humano (25AA; Cysi7?ABui7) ; Ciclización puede ocurrir entre Alai Y Gln25 Ala-Arg-Ala-Glu-Ser-Asp-Glu-Ala-Arg-Arg-Cys-Tyr-Asn-Asp-Pro-Lys-ABu-Cys-Asp-Phe-Val-Thr-Asn-Arg-Gln SEQ ID No. 5: Secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos homologa a un epitopo ECu de ß?-AR humano (18AA; CySi?Xxxi ) gcngacgaggcgcgccgctgctacaacgaccccaagtgcxxxgacttcgtc car SEQ ID No. 6: Secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos homologa a un epitopo ECu de ß?-AR humano gcncgggcggagagcgacgaggcgcgccgctgctacáacgaccccaagtgc XXXgacttcgtcaccaaccggcar SEQ ID No. 7: Secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos homologa a un epítopo ECu de ß?-AR humano (18AA; CySi3?Xxxi3) gcngacgaggcgcgccgctgctacaacgaccccaagXXXtgcgacttcgtc car SEQ ID No. 8: Secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos homologa a un epítopo ECu de ß?-AR humano gcncgggcggagagcgacgaggcgcgccgctgctacaacgaccccaagXXX tgcgacttcgtcaccaaccggcar SEQ ID No. 9: Secuencia de aminoácidos homologa a un epítopo ECu de ß?-AR humano (18AA; Cys3?ABu3) ; Ciclización puede ocurrir entre Lysi y Proís Lys-Cys-ABu-Asp-Phe-Val-Gln-Ala-Asp-Glu-Ala-Arg-Arg-Cys-Tyr-Asn-Asp-Pro SEQ ID No. 10: Secuencia de aminoácidos homologa a un epítopo ECu de ß?-AR humano (25AA; Cys3?ABu3) ,- Ciclización' puede ocurrir entre Lysi y Pro25 Lys-Cys-ABu-Asp-Phe-Val-Thr-Asn-Arg-Gln-Ala-Arg-Ala-Glu-Ser-Asp-Glu-Ala-Arg-Arg-Cys-Tyr-Asn-Asp-Pro SEQ ID No. 11: Secuencia de aminoácidos homologa a un epítopo ECu de ß?-AR humano (18AA; Cys2?ABu2) ; Ciclización puede ocurrir entre Lysi y Proís Lys-ABu-Cys-Asp-Phe-Val-Gln-Ala-Asp-Glu-Ala-Arg-Arg-Cys-Tyr-Asn-Asp-Pro SEQ ID No . 12 : Secuencia de aminoácidos homologa a un epítopo ECu de ß?-AR humano (25AA; Cys2?ABu2) ; Ciclización puede ocurrir entre Lysi y Pro25 Lys-ABu-Cys-Asp-Phe-Val-Thr-Asn-Arg-Gln-Ala-Arg-Ala-Glu-Ser-Asp-Glu-Ala-Arg-Arg-Cys-Tyr-Asn-Asp-Pro SEQ ID No. 13: Secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos homologa a un epítopo ECu de ß?-AR humano (18AA; Cys3?Xxx3) aagtgcXXXgacttcgtccargcngacgaggcgcgccgctgctacaacgac ccc SEQ ID No. 14: Secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos homologa a un epítopo ECu de ß?-AR humano (25AA; Cys3?Xxx3) aagtgcXXXgacttcgtcaccaaccggcargcncgggcggagagcgacgag gcgcgccgctgctacaacgacccc SEQ ID No. 15: Secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos homologa a un epítopo ECu de ß?-AR humano (18AA; Cys2-?Xxx2) aagXXXtgcgacttcgtccargcngacgaggcgcgccgctgctacaacgac ccc SEQ ID No. 16: Secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos homologa a un epítopo ECu de ß?-AR humano (25AA; Cys2?Xxx2) aagxxxtgcgacttcgtcaccaaccggcargcncgggcggagagcgacgag gcgcgccgctgctacaacgacccc SEQ ID No. 17: Secuencia de aminoácidos de una porción que contiene epítopo ECu de ß?-AR humano (16AA; posiciones AA 204 a 219) DEARRCYNDPKCCDFV SEQ ID No. 18: Secuencia de aminoácidos de una porción que contiene epítopo ECu de ß?-AR humano (23AA; posiciones AA 200 a 222) RAESDEARRCYNDPKCCDFVTNR SEQ ID No . 19 : Secuencia de aminoácidos de un epítopo ECu de ß?-ARDEARR humano SEQ ID No. 20: Secuencia de aminoácidos de un epítopo ECu (porción que contiene) de ß?-AR humano RAESDEARR . SEQ ID No. 21: Secuencia de aminoácidos de un epítopo ECu de ß?-ARDFV humano SEQ ID NO. 22: Secuencia de aminoácidos de un epítopo ECu de ß?-AR DFV NR humano SEQ ID NO. 23: Secuencia de aminoácidos homologa a un epítopo ECu de ß?-AR humano (16AA; CySn?ABun; N-terminal AA: Glni6 o DGlui6) ; Ciclización puede ocurrir entre Alai y Glni6/DGlui6 Ala-Arg-Arg-Cys-Tyr-Asn-Asp-Pro-Lys-Cys-AE-u-Asp-Phe-Val-Tyr-Gln SEQ ID No. 24: Secuencia de aminoácidos de ß?-AR humano 1 mgagvlvlga sepgnlssaa plpdgaataa rllvpasppa sllppasesp eplsqqwtag 61 mgllmalivl livagnvlvi vaiaktprlq tltnlfimsl asadlvmgll wpfgatiw 121 wgrweygsff celwtsvdvl cvtasietlc vialdrylai tspfryqsll trararglvc 181 tvwaisalvs flpilmhwwr aesdearrcy ndpkccdfvt nrayaiassv vsfyvplcim 241 afvylrvfre aqkqvkkids cerrflggpa rppspspspv papapppgpp rpaaaaatap 301 langragkrr psrlvalreq kalktlgiim gvftlcwlpf flanwkafh relvpdrlfv 361 ffnwlgyans afnpiiycrs pdfrkafqgl lccarraarr rhathgdrpr asgclarpgp 421 ppspgaasdd ddddwgatp parllepwag cnggaaadsd ssldepcrpg faseskv SEQ ID No. 25: Secuencia de aminoácidos homologa a un epítopo ECu de ß?-AR humano (22??; Cysi7?ABui7) ; Ciclización puede ocurrir entre Argi y Gly22 Arg-Ala-Glu-Ser-Asp-Glu-Ala-Arg-Arg-Cys-Tyr-Asn- Asp-Pro-Lys-Cys-ABu-Asp-Phe-Val-Thr-Gly SEQ ID No. 26: Secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos homologa a un epítopo ECu de ß?-AR humano (22AA; Cysi7-Xxxi7) cgggcggagagcgacgaggcgcgccgctgctacaacgaccccaagtgcXXX gacttcgtcaccGLY SEQ ID No. 27: - Secuencia de aminoácidos homologa a un epítopo ECu • de ß?-AR humano (22AA; Cys3?ABu3) ; Ciclización puede ocurrir entre Lysi y Pro22 Lys-Cys-ABu-Asp-Phe-Val-Thr-Gly-Arg-Ala-Glu-Ser- Asp-Glu-Ala-Arg-Arg-Cys-Tyr-Asn-Asp-Pro SEQ ID NO. 28: Secuencia de nucleótidos que codifica üna secuencia de aminoácidos homologa a un ep topo ECu de ß?-AR humano (22AA; Cys3?Xxx3) aagtgcXXXgacttcgtcaccGLYcgggcggagagcgacgaggcgcgccgc tgctacaacgacccc SEQ ID No. 29 : Secuencia de aminoácidos de un epitopo ECu (porción que contiene) de ß?-AR humano a) DEARRCYNDPK SEQ ID No. 30 : Secuencia de aminoácidos de un epitopo ECu (porción que contiene) de ß?-AR humano ESDEARRCYNDPK SEQ ID No. 31: Secuencia de aminoácidos de un epitopo ECu de ß?-AR humano AESDEARR SEQ ID No. 32: Secuencia de aminoácidos de un epitopo ECu de ß?-AR humano DFVT En las secuencias de nucleótidos, "XXX" representa una codificación triplete de nucleótidos para un aminoácido o tramo de aminoácido que pueda ser reemplazado por ABu; Xxx también puede significar que el triplete de nucleótido falta por completo; "GLY" representa cualquier triplete nucleótido que codifica para Gly (Glicina) , es decir para ggn. n representa cualquier nucleótido, particularmente a, c, g o t, y representa t o c y r representa para a o g.

En la secuencia de aminoácidos, "Xxx" representa un aminoácido o tramo de aminoácido que pueden ser reemplazados por ABu; Xxx también puede significar que el aminoácido falta por completo.

Como se emplea aquí, las secuencias de los diversos péptidos se indican del extremo N al extremo C, con lo que el extremo N está en el lado izquierdo y el extremo C está en el lado derecho de la secuencia de aminoácidos respectiva ilustrada .

Las siguientes abreviaturas adicionales se emplean aquí : Código de Código de 1- aminoácido : 3-letras : letra: Alanina Ala A Ácido a-aminobutírico ABu Arginina Arg R Asparagina Asn N Ácido aspártico Cisteína Ácido glutámico Glutamina Glicina Histidina Isoleucina Leucina Lisina Metionina Fenilalanina Prolina Serina Treonina Triptofano Tirosina Valina Asparagina o ácido aspártico Glutamina o ácido glutámico Leucina o Isoleucina Aminoácido no especificado o desconocido Referencias adicionales citadas American, Heart, Associatiori: 2007. Dallas; Heart disease and stroke statistics - 2007 update. Circulation 115: e69-el71 Anderton 2001 Immunology 104: 367-376 Baba 2004. Eur. Heart J. 25: 1108-1115 Boivin 2005 Eur. J. Heart Fail. 4, suppl .1 : 24 (104) Caforio 2002 Eur. J. Heart Fail. 4: 411-417 Chiale 2001 Circulation 103: 1765-1771 Chien 2000 Oncol . 27: 9-17 Christ 2001 J. Mol. Cell. Cardiol. 33: 1515-1525 Christ 2006 J. Mol. Cell Cardiol. 41: 716-723 Elies 1996 J. Immunol . 157: 4203-4211 Engelhardt 1999 . Proc . Nati. Acad. Sci. USA 96: 7059-7064 Eriksson 2003 Nat. Med. 9: 1484-1490 Fabrizio 1994 Drugs Ther. 8: 89-94 Félix 2000 J. Am. Coll. Cardiol. 35: 1590-1598 Ferrari 1995 J. Exp. Med. 182: 59-65 Freedman 2004 J. Clin. Invest. 113: 1379-1382 Fu 1993 J. Clin. Invest. 91: 1964-1968 Góser 2006 Circulation 114: 1693-1702 Hershko 2005 Ann. N.Y. Acad. Sci. 1051: 635-646 Hoebeke 1996 Int. J. Cardiol. 54: 103-111 Iwata 2001a J. Am. Coll. Cardiol. 37: 418-424 Iwata 2001b Circ. Res. 88: 578-586 Jahns 1996 Eur. J. Pharmacol. 316: 111-121 Jahns 1999a J. Am. Coll . Cardiol. 34: 1545-1551 Jahns 1999b Circulation 99: 649-654 Jahns 2000 J. Am. Coll . Cardiol. 36: 1280-1287 Jahns 2004- J. Clin. Invest. 113: 1419-1429 Jahns 2006 Trends Cardiovasc Med 16: 20-24 Jahns 2008 Autoimmunity 41: 454-461. hoynezhad 2007 Eur. J. Heart Fail. 9: 120-123 Kühl 2005 Circulation 112: 1965-1970 Li 2006 177: 8234-8240 Limas 1992 Am. Heart J. 123: 967-970 Limas 1996 Int. J. Cardiol. 54: 113-116 Limas 1997 Circulation 95: 1979-1980 Limas 2004 Am. J. Cardiol. 93: 1189-1191 Lohse 2003 Circ. Res. 93: 896-906 Luppi 1998 Circulation 98: 777-785 MacLellan 2003 Nat. Med. 9: 1455-1456 Maekawa 2007 Circulation 115: 5-8 Magnusson 1994 Circulation 89: 2760-2767 Magnusson 1996 Int. J. Cardiol. 54: 137-141 Mahrholdt 2006 Circulation 114: 1581-1590 Matsui 1995 Autoimmunity 21: 85-88 Matsui 2001 Autoimmunity 43: 217-220 Mobini 2004 Autoimmunity Rev. 3: 277-284 Morita 2005 J. Clin. Invest. 115: 518-526 Neumann 1990 J. Am. Coll. Cardiol. .16: 839-846 Nikolaev 2007 J. Am. Coll. Cardiol. 50: 423-431 Okazaki 2003 Nat . Med. 9: 1477-1483 Okazaki 2005 Trends Mol Med 11: 322-326 Po lner 1997 Am. J. Cardiol. 80: 1040-1045 Rose 1993 Immunol. Today 14: 426-430 Rose 2001 J. Clin. Invest. 107: 943-944 Schultheiss 1985 J. Mol. Cell Cardiol. 17: 603-617 Schultheiss 1988 J. Exp. Med. 168: 2102-2109 Schulze 1999 Cardiovasc. Res. 44: 91-100 Sewald 2002 Peptides: Chemistry and Biology, -VCH.

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Claims (50)

REIVINDICACIONES

1. Un péptido cíclico de la fórmula I : cyclo (x-xh-Cys-x-xa-xb-xc-x-Cys-y-Xi-x) (I) , en donde: a) x es un aminoácido diferente a Cys; b) h es cualquier entero de 1 a 15; c) i es cualquier entero de 0 a 14; d) uno de xa, xb y xc es Pro; e) y es ácido -aminobutírico (ABu) o un análogo ABu; y f) el péptido cíclico consiste de al menos 16 y cuando más 25 aminoácidos, y en donde el péptido i) es capaz de ligar (auto-) anticuerpos contra el bucle ECu del receptor ß?-adrenérgico (ß?-AR); ii) es capaz de inhibir la interacción entre ß?-AR y (auto-) anticuerpos contra el bucle ECu de ß?-AR; iii) imita el o los epítopos presentados en la conformación nativa del bucle ECu de ß?-AR; y/o iv) es capaz de reducir la activación mediada por anticuerpo de ß?-AR .

2. El péptido cíclico de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque h es 5, 8 ó 9.

3. El péptido cíclico de conformidad con la reivindicación 1 o 2, caracterizado porque i es 3 , 4 ó 6.

4. El péptido cíclico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porgue es un péptido cíclico de la fórmula I' ó I'': ciclo (xi-xh-Cys-x-xa-xb-xc-x-Cys-y-Xi-x) (?') ; ciclo (xin-xh-Cys-x-xa-xb-xc-x-Cys-y-Xi-x) (?'') , en donde Xi es Ala, Gly, Val, Thr o Ser y ??tt es Arg.

5. El péptido cíclico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque un péptido cíclico de las fórmulas I''' o I'''': ciclo (xi-xh-Cys-x-xa-xb-xc-x-Cys-y-Xi-Xii) (I'''); ciclo (xin-xh-Cys-x-xa-xb-xc-x-Cys-y-Xi-Xiv) {!'' ' ') , en donde xu is Gln, Glu, Asp o Asn y xIV es Gly o un análogo Gly.

6. El péptido cíclico de conformidad con la reivindicación 4 ó 5, caracterizado porque Xi es Ala.

7. El péptido cíclico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6, caracterizado porque xn es Gln o Glu.

8. El péptido cíclico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 4 a 7, caracterizado porque xn es DGlu.

9. El péptido cíclico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado porque x° es Pro .

10. El péptido cíclico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizado porque xb es un aminoácido acídico.

11. El péptido cíclico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, caracterizado porque x excepto xa, xb o xc no es Pro.

12. El péptido cíclico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, caracterizado porque es un péptido cíclico de las fórmulas II, III o III': ciclo (xi-Xi-Xi-x-X2-X2-Cys-x-xa-xb-xc-x-Cys-y7Xi-xII) (II); ciclo (xI-X2-x-xi-x-xi-xi-x-X2-X2-Cys-x-xa-xb-xc-x-Cys-y- i- n) (ni); ciclo (XIII, 2-x-Xi-x- i-xi-x- 2-X2-Cys- -xa-xb-xc-x-Cys-y-Xi-xIV) (III' ), en donde a) xi es seleccionado en forma individual e independiente del grupo que consiste de aminoácidos acídicos; y/o b) x2 se elige en forma individual e independiente del grupo que consiste de aminoácidos básicos.

13. El péptido cíclico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, caracterizado porque es un péptido cíclico de la fórmula IV, V o V: ciclo (xi-xi-Xi-X4-X2- 2-Cys-X3-xA5- b-xc-X2-Cys-y-xi-x3- ?3-?11) (IV); Ciclo (xI-X2-X4-Xl-X -Xi-Xi-X4-X2- 2- yS-X3-Xa5-Xb-XC- 2- Cys-y-Xi-x3-X3-X4-x5-X2-Xii) (V) ; Ciclo (Xni, 2- 4- i- 4- i- i- -X2-X2-Cys-X3-XA5-Xb-XC- 2- Cys-y- i- 3-X3-X4-Xiv) (V), en donde a) xi se elige en forma individual e independiente del grupo que consiste de aminoácidos acídicos; b) x2 se elige en forma individual e independiente del grupo que consiste de aminoácidos básicos; c) 3 se elige en forma individual e independiente del grupo que consiste de Leu, lie, Val, Met, Trp, Tyr y Phe; d) x4 se elige en forma individual e independiente del grupo que consiste de Ser, Thr, Ala y Gly; y/o e) x5 se elige en forma individual e independiente del grupo que consiste de Gln y Asn.

14. El péptido cíclico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, caracterizado porque comprende el tramo de aminoácidos b) Asp-Xxxi-Xxx4-Arg-Arg-Cys-Xxx3-Asn-Asp-Pro-Lys; o c) Glu-Ser-Asp-Xxxi-Xxx4-Arg-Arg-Cys-Xxx3-Asn-Asp-Pro-Lys , en donde Xx i se define como en cualquiera de las reivindicaciones la) , 12a) y 13a) , Xxx3 se define como en la reivindicación la) o 13c) y/o Xxx se define como en la reivindicación la) o 13d) .

15. El péptido cíclico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, caracterizado porque comprende el tramo de aminoácidos b) Asp-Glu-Ala-Arg-Arg-Cys-Tyr-Asn-Asp-Pro-Lys ; o c) Glu-Ser-Asp-Glu-Ala-Arg-Arg-Cys-Tyr-Asn-Asp-Pro-Lys .

16. El péptido cíclico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, caracterizado porque es un péptido cíclico seleccionado del grupo que consiste de: a) un péptido cíclico capaz de formarse o formado por una secuencia de aminoácidos como se ilustra en cualquiera de SEQ ID NO. 25, 27, 1, 2, 9 y 10; b) un péptido cíclico capaz de formarse por una secuencia de aminoácidos como se codifica por una secuencia de nucleótidos como se ilustra en cualquiera de SÉQ ID NO. 26, 28, 5, 6, 13 y 14; c) un péptido cíclico capaz de formar por una secuencia de aminoácidos como se codifica por una secuencia de nucleótidos que difiere de la secuencia de nucleótidos como se ilustra en cualquiera de SEQ ID NO. 26, 28, 5, 6, 13 y 14 debido a la degeneración del código genético; y d) un péptido cíclico de conformidad con cualquiera de las fórmulas VI a IX' : ciclo (Arg-Ala-Glu-Ser-Asp-Glu-Ala-Arg-Arg-Cys-Tyr-Asn-Asp-Pro-Lys-Cys-ABu-Asp-Phe-Val-Thr-Gly) (IX' ) ciclo (Ala-Asp-Glu-Ala-Arg-Arg-Cys-Tyr-Asn-Asp-Pro-Lys-Cys-ABu-Asp-Phe-Val-Gln) (VI) ; ciclo (Ala-Arg-Ala-Glu-Ser-Asp-Glu-Ala-Arg-Arg-Cys-Tyr-Asn-Asp-Pro-Lys-Cys-ABu-Asp-Phe-Val-Thr-Asn-Arg-Gln) (VII) ; ciclo (Ala-Asp-Glu-Ala-Arg-Arg-Cys-Tyr-Asn-Asp-Pro-Lys-Cys-ABu-Asp-Phe-Val-DGlu) (VIII) ; ciclo (Ala-Arg-Ala-Glu-Ser-Asp-Glu-Ala-Arg-Arg-Cys-Tyr-Asn-Asp-Pro-Lys-Cys-ABu-Asp-Phe-Val-Thr-Asn-Arg-DGlu) (IX) .

17. El péptido cíclico de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque al menos uno de aminoácidos acídicos se reemplaza por un aminoácido diferente seleccionado del grupo que consiste de aminoácidos acídicos.

18. El péptido cíclico de conformidad con la reivindicación 16 o 17, caracterizado porque al menos uno de los aminoácidos básicos se reemplaza por un aminoácido diferente seleccionado del grupo que consiste de aminoácidos básicos .

19. El péptido cíclico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 16 a 18, caracterizado porque al menos uno de los residuos aminoácidos alifáticos se reemplaza por un aminoácido diferente seleccionado del grupo que consiste de aminoácidos alifáticos.

20. El péptido cíclico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones l a 19, caracterizado porque la ciclización ocurre en al menos un enlace que es un puente covalente seleccionado del grupo que consiste de enlaces S-S, enlaces péptido, enlaces de carbono tales como C-C o C=C, enlaces éster, enlaces éter, enlaces azo, uniones C-S-C, uniones C-N-C y uniones C=N-C.

21. El péptido cíclico de conformidad ¦ con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20, caracterizado porque la ciclización ocurre en al menos dos uniones que son una unión S-S y un enlace péptido.

22. El péptido cíclico de conformidad con la reivindicación 20 ó 21, caracterizado porque la unión S se forma por dos residuos Cys del péptido.

23. El péptido cíclico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 20 a 22, caracterizado porque el . enlace péptido se forma por el grupo NH2 de un aminoácido N-terminal y el grupo COOH de un aminoácido C-terníinal .

24. El péptido cíclico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 20 a 23, caracterizado porque enlaces adicionales se forman por una cadena lateral de grupos NH2 y grupos COOH de los aminoácidos constituyentes .

25. Una molécula de ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos que puede (ser modificada para) formar o puede emplearse para formar o para generar la estructura principal de aminoácidos del péptido cíclico de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 24.

26. La molécula de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 25, caracterizada porque comprende una secuencia de nucleotidos como se ilustra en cualquiera de SEQ ID NO. 5, 6, 13, 14, 26 y 28 o una secuencia de nucleotidos que difiere de ellos debido a la degeneración del código genético .

27. Un vector que comprende la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 25 o 26.

28. Una célula hospedera recombinante que comprende la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 25 ó 26 o el vector de la reivindicación 27.

29. Un método para producir un péptido cíclico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 24, caracterizado porque comprende las etapas de a) (i) cultivar la célula hospedera recombinante de la reivindicación 28 bajo condiciones tales que una secuencia de aminoácidos que puede (ser modificada para) formar o puede emplearse para formar o para generar la estructura principal de aminoácidos del polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 24, se expresa, recuperando la secuencia de aminoácidos y convirtiendo la secuencia de aminoácidos en la estructura principal de aminoácidos; o (ii) sintetizar en forma química la estructura principal de aminoácidos del polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 24; y b) ciclización de la estructura principal de aminoácidos para formar el péptido cíclico de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 24.

30. El método de conformidad con la reivindicación 29, caracterizado porque la ciclización se define como en cualquiera de las reivindicaciones 20 a 24.

31. El método de conformidad con la reivindicación 30, caracterizado porque el aminoácido N-terminal es Ala o Arg y el aminoácido C-terminal es Gln o Glu o Gly, respectivamente, o el aminoácido N-terminal es Lys y el aminoácido C-terminal es Pro.

32. El método de conformidad con la reivindicación 31, caracterizado porque Glu es DGlu.

33. Un péptido cíclico que se obtiene por el método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 29 a 32.

34. Una composición que comprende un péptido cíclico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 24 y 33, una molécula de ácido nucleico de la reivindicación 25 ó 26, el vector de la reivindicación 27 o la célula hospedera recombinante de la reivindicación 28, y opcionalmente un portador.

35. La composición de conformidad con la reivindicación 34, caracterizada porque la composición es una composición farmacéutica y el portador es un portador farmacéutico aceptable.

36. Un método para a) el tratamiento, mejora o prevención de una enfermedad, en donde se mejora la actividad de un receptor ß-adrenérgico (ß-AR); b) el tratamiento de un paciente que tiene anticuerpos contra un ß-AR; o. c) inducir inmuno tolerancia, que comprende la etapa de administrar al paciente que requiere esta intervención médica, una cantidad farmacéutica activa de un péptido cíclico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 24 y 33 y/o de la composición farmacéutica de la reivindicación 35, y opcionalmente un portador farmacéutico aceptable.

37. Un péptido cíclico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 24 y 33 o una composición farmacéutica de la reivindicación 35 , y opcionalmente un portador farmacéutico aceptable, para a) el tratamiento, mejora o prevención de una enfermedad en donde se mejora la actividad de un ß-AR; b) el tratamiento de un paciente que tiene anticuerpos contra un ß-AR; o c) inducir inmuno tolerancia.

38 . La composición farmacéutica, el método o péptido cíclico de conformidad con cualquiera¦ de las reivindicaciones 35 a 37 , . caracterizados porque el péptido cíclico se administra con o la composición farmacéutica comprende al menos un agente activo farmacéutico adicional.

39 . La composición farmacéutica, el método o el péptido cíclico de conformidad con la reivindicación 38 , caracterizados porque el agente farmacéutico activo adicional como mínimo es un bloqueador ß-receptor.

40 . La composición farmacéutica, el método o el péptido cíclico de conformidad con la reivindicación 39 , caracterizados porque el bloqueador de ß-receptor es un bloqueador ß-AR selectivo.

41 . La composición farmacéutica, el método o el péptido cíclico de conformidad con la reivindicación 40 , caracterizados porque el bloqueador ß-AR selectivo es atenolol, metoprolol, nebivolol y bisoprolol.

42 . El método, péptido cíclico o la composición farmacéutica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 36 a 41, caracterizados porque la enfermedad en donde la actividad de un receptor ß-adrenérgico se mejora, es una enfermedad cardiaca o en donde el paciente sufre de una enfermedad cardiaca.

43. El método o el péptido cíclico o la composición farmacéutica de la reivindicación 42, caracterizados porque la enfermedad cardiaca se elige del grupo que consiste de enfermedad cardiaca infecciosa y no infecciosa, enfermedad cardiaca isquémica y no isquémica, enfermedad cardiaca inflamatoria y miocarditis, dilatación cardiaca, cardio-miopatia idiopática, cardiomiopatía (idiopática) dilatada (DCM) , cardiomiopatía inmune, falla cardiaca, y cualquier arritmia cardiaca incluyendo latidos de captura prematura supraventricular y/o ventricular así como cualsquiera arritmia atrial incluyendo fibrilación atrial y/o palpitación atrial .

44. El método o el péptido cíclico o la composición farmacéutica de la reivindicación 42 o 43, caracterizado porque la enfermedad es cardiaca DCM (idiopática) .

45. El método, el péptido cíclico o la composición farmacéutica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 36 a 44, caracterizados porque la enfermedad se induce por anticuerpos contra un ß-AR.

46. El método, el péptido cíclico o la composición farmacéutica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 36 a 41, caracterizados porque la inducción de tolerancia inmune se obtiene por supresión de la producción de anticuerpos contra un ß-AR.

47. El método, el péptido cíclico o la composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 46, caracterizados porque la inducción de tolerancia inmune se obtiene por supresión de la producción de anticuerpos contra un ß-AR a través de bloqueo de los sitios de reconocimiento de antígeno de las células B tempranas productoras de anticuerpos y células B de memoria.

48. El método, el péptido cíclico o la composición farmacéutica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 36 a 47, caracterizados porque el péptido cíclico o la composición farmacéutica se administran en que al menos 0.05 mg de péptido cíclico por kg de peso corporal se alcanza.

49. Método para detectar anticuerpos contra un ß-ÁR (en una muestra) que comprende la etapa de poner en contacto el péptido cíclico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 24 y 33 con los anticuerpos a detectar.

50. El método, el péptido cíclico o la composición farmacéutica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 36 a 49, caracterizados porque ß-AR es ß?-AR.