MX2011006586A

MX2011006586A - Injertos de hueso con actividad de proteasa reducida y metodos de seleccion y uso.

Info

Publication number: MX2011006586A
Application number: MX2011006586A
Authority: MX
Inventors: Vladimir Kery; Conan S Young; Leo B Snel; Charles E Hart
Original assignee: Biomimetic Therapeutics Inc
Priority date: 2008-12-19
Filing date: 2009-12-18
Publication date: 2011-06-30
Also published as: EP2376106A1; AU2009327377A1; BRPI0923015A2; CA2747508A1; JP2012512728A; CN102316890A; US20100196347A1; IL213608A0; WO2010071857A1; KR20110100269A; EP2376106A4

Abstract

La invención propone injertos de hueso (tal como aloinjertos de hueso) con una actividad proteasa reducida Estos injertos de hueso son útiles por ejemplo en conjunción con un polipéptido de interés (tal como una plaqueta derivada del factor de crecimiento) para tratar, estabilizar, prevenir y/o retrasar una condición de hueso, periodontio, ligamento, cartílago o tendón en in individuo (tal como un humano) Adicionalmente, la invención proporciona métodos para medir la actividad de proteasa asociada con el injerto de hueso, reduciendo el nivel de actividad de proteasa asociado con el injerto de hueso, seleccionar un injerto de hueso con un nivel aceptable de actividad de proteasa y los métodos de administrar un injerto de hueso y un polipéptido de interés a un individuo.

Description

INJERTOS DE HUESO CON ACTIVIDAD DE PROTEASA REDUCIDA Y METODOS DE SELECCIÓN Y USO REFERENCIA CRUZADA A SOLICITUDES RELACIONADAS Esta solicitud reivindica el beneficio bajo el Código de Estados Unidos 35 § 119(e) de las solicitudes de patente provisionales de los Estados Unidos de América números 61/139,448, presentada el 19 de diciembre de 2008, 61/149,998, presentada el 4 de febrero de 2009, y la solicitud de patente provisional de los Estados Unidos de América número 61/154,311 presentada el 20 de febrero de 2009, los contenidos de las cuales son aquí incorporados por referencia en su totalidad.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Los injertos de hueso (tal como aloinjertos) pueden transplantarse en un individuo para facilitar el sanado del hueso, el fortalecimiento del hueso, y/o para mejorar la función del hueso. En algunos casos, el hueso de un donante humano es transplantado en otro humano. Los aloinjertos de hueso humano son piezas del esqueleto aislados post mortem de donantes humanos.

Uno o más polipéptidos (tales como factores de crecimiento) pueden administrarse en conjunto con el injerto del hueso para aumentar la efectividad del injerto del hueso- Por ejemplo, el factor de crecimiento derivado de plaquetas de recombinante humano BB (rhPDGF-BB) es un potente polipéptido sanador de heridas y estimulante de la proliferación y el restablecimiento de las células óseas. En particular, una combinación de un injerto humano de hueso y el factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) puede usarse para la regeneración del hueso en la sanación de huesos por fracturas y otras lesiones de hueso (véase, por ejemplo, la solicitud de patente de los Estados Unidos de América número de publicación 2007/0207185, presentada el 9 de febrero de 2007) .

Los injertos de hueso mejorados (tales como aloinjertos) son necesarios para la administración en conjunto con un polipéptido de interés (tal como un polipéptido que promueve la reparación, sanación o crecimiento del hueso) para tratar, prevenir, y/o retrasar un hueso, periodontal, ligamento, cartílago, o condición del tendón, enfermedad o defecto. Deseablemente, el injerto de hueso tiene un efecto mínimo sobre la función biológica, y/o la estructura del polipéptido de interés .

BREVE SÍNTESIS DE LA INVENCIÓN En un aspecto, la invención describe métodos de selección de un injerto de hueso (tal como un aloinjerto de hueso) para la administración a un individuo en conjunto con un polipéptido de interés (por ejemplo, el factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) ) . En algunas incorporaciones, el método involucra la medición de la actividad de proteasa asociada con un injerto de hueso, en donde la cantidad de actividad de proteasa asociada con el injerto de hueso determina si el injerto de hueso es seleccionado para administración a un individuo en conjunto con el polipéptido de interés. En algunas incorporaciones, el método involucra el seleccionar un injerto de hueso con un aceptable nivel de actividad de proteasa para la administración a un individuo en conjunto con el polipéptido de interés. En algunas incorporaciones, el método de seleccionar un injerto de hueso para administración a un individuo en conjunto con el factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) incluye el seleccionar un injerto de hueso con una actividad de proteasa de menos de alrededor de 50 tripsinas equivalentes (en donde 1 tripsina equivalente es la cantidad de la actividad de la proteasa equivalente a 1 ng de tripsina usando un sustrato de proteasa, por ejemplo, caseína succinilatada en un juego de ensayo de proteasa QuantiCleave (de Pierce, de Rockford, Illinois) ) para administración al individuo en conjunto con el factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) . En algunas incorporaciones, el método de selección de un injerto de hueso para administración a un individuo en conjunto con el factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) incluye el seleccionar un injerto de hueso con una actividad de proteasa de entre alrededor de 50 a alrededor de 65 tripsinas equivalentes (tal como de alrededor de 50 a alrededor de 55, de alrededor de 55 a alrededor de 60, ó de alrededor de 60 a alrededor de 65 tripsinas equivalentes) para administración al individuo en conjunto con el factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) . En algunas incorporaciones, el método de seleccionar un injerto de hueso para administración a un individuo con factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) incluye el seleccionar un injerto de hueso con una actividad de proteasa de menos de alrededor de 50 tripsina equivalentes (tal como de menos de alrededor de 45, de menos de alrededor de 40, de menos de alrededor de 35, de menos de alrededor de 30, de menos de alrededor de 25, de menos de alrededor de 20, de menos de alrededor de 15, de menos de alrededor de 10, de menos de alrededor de 5, de alrededor de 0 equivalentes de tripsina) para administración al individuo en conjunto con el factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) . En algunas incorporaciones, el método de seleccionar un injerto de hueso para administración a un individuo en conjunto con el factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) incluye el seleccionar un injerto de hueso con una actividad de proteasa de alrededor de cualquiera de 50, 55, 60, ó 65 tripsinas equivalentes para administración al individuo en conjunto con el factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) . En algunas incorporaciones de cualesquiera métodos, el método incluye el administrar el seleccionado injerto de hueso y el polipéptido de interés al individuo. En algunas incorporaciones, la actividad de proteasa de dos o más injertos de hueso es medida, y el injerto de hueso con la más baja actividad de proteasa es administrada al individuo en conjunto con el polipéptido de interés. En algunas incorporaciones, la actividad de proteasa del seleccionado injerto de hueso es de menos de alrededor de 50 tripsinas equivalentes. En algunas incorporaciones, la actividad de proteasa del seleccionado injerto de hueso es de entre alrededor de 50 a alrededor de 65 tripsinas equivalentes (tal como de alrededor de 50 a alrededor de 55, de alrededor de 55 a alrededor de 60, ó de alrededor de 60 a alrededor de 65 tripsinas equivalentes) . En algunas incorporaciones, la actividad de proteasa del seleccionado injerto de hueso es de alrededor de 50, 55, 60 ó 65 tripsinas equivalentes. En algunas incorporaciones, la actividad de proteasa del seleccionado injerto de hueso es de menos de alrededor de 50 tripsinas equivalentes (tal como de menos de alrededor de 45, de menos de alrededor de 40, de menos de alrededor de 35, de menos de alrededor de 30, de menos de alrededor de 25, de menos de alrededor de 20, de menos de alrededor de 15, de menos de alrededor de 10, de menos de alrededor de 5, de alrededor de 0 tripsinas equivalentes).

En algunas incorporaciones de cualesquiera métodos, la medición de la actividad de la proteasa asociada con un injerto de hueso comprende a) remover al menos una parte de la cantidad total de una proteasa asociada con el injerto de hueso del injerto de hueso; y b) medir la cantidad de un sustrato de polipéptido que es hendido por la proteasa removida, por ende determinando la cantidad de actividad de proteasa asociada con el injerto de hueso. En algunas incorporaciones, el paso a) comprende el aumentar la resistencia iónica de la solución que comprende al injerto de hueso y la proteasa. En algunas incorporaciones, el paso a) comprende el incubar el injerto de hueso y la proteasa en una solución salina. En algunas incorporaciones, la solución salina es una solución de cloruro de sodio (NaCl) . En algunas incorporaciones, la solución salina contiene entre alrededor de 0.15 masa molar de cloruro de sodio (NaCl) y alrededor de 1.5 masa molar de cloruro de sodio (NaCl) o entre alrededor de 0.3 masa molar de cloruro de sodio (NaCl) y alrededor de 1.5 masa molar de cloruro de sodio (NaCl) . En algunas incorporaciones, la solución salina contiene alrededor de 0.3 masa molar de cloruro de sodio (NaCl) . En algunas incorporaciones, el paso b) comprende el separar el sustrato de polipéptido hendido, el sustrato de polipéptido no hendido, y el injerto de hueso. En algunas incorporaciones, la cromatografía de alto desempeño líquido es usada para separar al sustrato de polipéptido hendido, al sustrato de polipéptido no hendido, y al injerto de hueso. En algunas incorporaciones, la cromatografía de exclusión de tamaño es usada para separar al sustrato de polipéptido hendido, al sustrato de polipéptido no hendido, y al injerto de hueso. En algunas incorporaciones, otro método de separación es usado para separar al sustrato de polipéptido hundido, el sustrato de polipéptido no hendido, y/o el injerto de hueso. Otros métodos de separación ejemplares, incluyen a centrifugación simple, cromatografía de intercambio de ión, y electroforesis .

En algunas incorporaciones de cualquiera de los métodos, la medición de la actividad de proteasa asociada con un injerto de hueso comprende la medición de la cantidad de un sustrato de polipéptido que es hendido por una actividad de proteasa asociada con el injerto de hueso. En algunas incorporaciones, la medición de la cantidad del sustrato de polipéptido hendido comprende a) incubar al sustrato de polipéptido con el injerto de hueso, b) remover al menos una parte de la cantidad total del sustrato de polipéptido hendido del injerto de hueso, y c) medir la cantidad de sustrato de polipéptido hendido. En algunas incorporaciones, el paso b) comprende el aumentar la resistencia iónica de la solución que comprende al injerto de hueso y al sustrato de polipéptido. En algunas incorporaciones, el paso b) comprende el incubar el injerto de hueso y el sustrato de polipéptido en una solución salina. En algunas incorporaciones, la solución salina es una solución de cloruro de sodio (NaCl) . En algunas incorporaciones, la solución salina contiene entre alrededor de 0.1 masa molar y alrededor de 2.0 masa molar de cloruro de sodio (NaCl) . En algunas incorporaciones, la solución salina contiene alrededor de 0.6 masa molar de cloruro de sodio (NaCl). En algunas incorporaciones, el paso c) comprende el separar el sustrato de polipéptido hendido, el sustrato de polipéptido no hendido y el injerto de hueso. En algunas incorporaciones, la cromatografía de alto desempeño líquido es usada para separar al sustrato de polipéptido hendido, el sustrato de polipéptido no hendido, y al injerto de hueso. En algunas incorporaciones, la cromatografía de exclusión de tamaño es usada para separar al sustrato de polipéptido hendido, el sustrato de polipéptido no hendido, y al injerto de hueso. En algunas incorporaciones, otro método de separación es usado para separar al sustrato de polipéptido hendido, al estrato de polipéptido no hendido, y/o al injerto de hueso. Otros ejemplares métodos de separación incluyen la centrifugación simple, la cromatografía de intercambio de ion, y la electroforesis .

En algunas incorporaciones de cualquiera de los métodos, el polipéptido de interés y el sustrato de polipéptido es el mismo. En algunas incorporaciones, el polipéptido de interés y el sustrato de polipéptido son diferentes. En algunas incorporaciones, el polipéptido de interés es el factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) . En algunas incorporaciones, el injerto de hueso incluye a fosfato de calcio (tal como fosfato ß-tricalcio) que ha sido añadido al injerto de hueso. En algunas incorporaciones, el injerto de hueso incluye uno o más de otros compuestos (tales como glicerina) que han sido añadidos al injerto de hueso.

En un aspecto, la invención exhibe métodos para medir la actividad de proteasa asociada con un injerto de hueso (tal como un aloinjerto de hueso) . En algunas incorporaciones, el método incluye a) remover al menos una parte de la cantidad total de una proteasa asociada con el injerto de hueso desde el injerto del hueso,- y b) medir la cantidad de un sustrato de polipéptido que es hendido por la proteasa removida, por ende determinando la cantidad de la actividad de proteasa asociada con el injerto de hueso. En algunas incorporaciones, el método para medir la actividad de proteasa asociada con el injerto de hueso incluye a) remover al menos una parte de la cantidad total de una proteasa asociada con el injerto de hueso desde el injerto de hueso por la incubación del injerto de hueso en una solución salina que contiene alrededor de 0.15 masa molar de cloruro de sodio (NaCl) a alrededor de 1.5 masa molar de cloruro de sodio (NaCl) (tal como entre alrededor de 0.3 masa molar de cloruro de sodio y alrededor de 1.5 masa molar de cloruro de sodio); y b) medir la cantidad de factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) que es hendido por la proteasa removida, por ende determinando la cantidad de actividad de proteasa asociada con el injerto de hueso. En algunas incorporaciones, de cualquiera de los métodos, el paso a) comprende el aumentar la resistencia iónica de la solución que comprende al injerto de hueso y la proteasa. En algunas incorporaciones, el paso a) comprende el incubar el injerto de hueso y la proteasa en una solución salina. En algunas incorporaciones, la solución salina es una solución de coluro de sodio (NaCl) . En algunas incorporaciones, la solución salina contiene entre alrededor de 0.15 masa molar de cloruro de sodio y alrededor de 1.5 masa molar de cloruro de sodio o entre alrededor de 0.3 masa molar de cloruro de sodio y alrededor de 1.5 masa molar de cloruro de sodio. En algunas incorporaciones, la solución salina contiene alrededor de 0.3 masa molar de cloruro de sodio. En algunas incorporaciones, el paso b) comprende el separar al sustrato de polipéptido hendido, el sustrato de polipéptido no hendido, y al injerto de hueso. En algunas incorporaciones, la cromatografía de alto desempeño liquido es usada para separar al sustrato de polipéptido hendido, el sustrato de polipéptido no hendido, y al injerto de hueso. En algunas incorporaciones, la cromatografía de exclusión por tamaño es usada para separar al sustrato de polipéptido hendido, al sustrato de polipéptido no hendido, y al injerto de hueso. En algunas incorporaciones, otro método de separación es usado para separar al sustrato de polipéptido hendido, al sustrato de polipéptido no hendido, y/o al injerto de hueso. Otros métodos de separación ejemplares incluyen centrifugación simple, cromatografía de intercambio de ión, y electroforesis . En algunas incorporaciones, el método de medición de la actividad de la proteasa asociada con un injerto de hueso incluye (i) remover al menos una parte de la cantidad total de una proteasa asociada con el injerto de hueso del injerto de hueso; y (ii) medir la cantidad o concentración de una o más de las proteasas removidas del injerto de hueso, por ende determinando la cantidad de actividad de la proteasa asociada con el injerto de hueso. En algunas incorporaciones, el sustrato de polipéptido es el factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) . En algunas incorporaciones, el injerto de hueso incluye a fosfato de calcio (tal como a fosfato de ß-tricalcio) que ha sido añadido al injerto de hueso. En algunas incorporaciones, el injerto de hueso incluye a uno o más de otros compuestos (tal como glicerina) que ha sido añadido al injerto de hueso.

En algunas incorporaciones de cualquiera de los métodos, el método para medir la actividad de proteasa asociada con un injerto de hueso incluye el medir la cantidad de un sustrato de polipéptido que es hendido por una actividad de la proteasa asociada con el injerto de hueso. En algunas incorporaciones, la medición de la cantidad de sustrato de polipéptido hendido incluye (i) incubar al sustrato de polipéptido con el injerto de hueso, (ii) remover al menos una parte de la cantidad total del sustrato de polipéptido hendido del injerto de hueso; y (iii) medir la cantidad de sustrato de polipéptido hendido. En algunas incorporaciones, el método para medir la actividad de la proteasa asociada con un injerto de hueso incluye (i) incubar al factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) con el injerto de hueso, (ii) remover al menos una parte de la cantidad total del factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) hendido del injerto de hueso, y (iii) medir la cantidad del factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) hendido. En algunas incorporaciones, el paso (ii) comprende el aumentar la resistencia iónica de la solución que comprende al injerto de hueso y al sustrato de polipéptido. En algunas incorporaciones, el paso (ii) comprende el incubar al injerto de hueso y al sustrato de polipéptido en una solución salina. En algunas incorporaciones, la solución salina es una solución de cloruro de sodio (NaCl) . En algunas incorporaciones, la solución salina contiene entre alrededor de 0.15 masa molar y alrededor de 2.0 masa molar de cloruro de sodio. En algunas incorporaciones, la solución salina contiene alrededor de 0.6 masa molar de cloruro de sodio. En algunas incorporaciones, el paso (iii) comprende el separar al sustrato de polipéptido hendido, al sustrato de polipéptido no hendido, y al injerto de hueso. En algunas incorporaciones, la cromatografía de alto desempeño líquido es usada para separar al sustrato de polipéptido hendido, el sustrato de polipéptido no hendido, y al injerto de hueso. En algunas incorporaciones, la cromatografía de exclusión por tamaño es usada para separar al sustrato de polipéptido hendido, al sustrato de polipéptido no hendido, y al injerto de hueso. En algunas incorporaciones, otro método de separación es usado para separar al sustrato de polipéptido hendido, al sustrato de polipéptido no hendido, y al injerto de hueso. Otros ejemplares métodos de separación incluyen a centrifugado simple, cromatografía de intercambio de ion, y electroforesis . En algunas incorporaciones, el sustrato de polipéptido es el factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) . En algunas incorporaciones, el injerto de hueso incluye a fosfato de calcio (tal como a fosfato de ß-tricalcio) que ha sido añadido al injerto de hueso. En algunas incorporaciones, el injerto de hueso incluye a uno o más de otros compuestos (tal como glicerina) , que ha sido añadido al injerto de hueso.

En un aspecto, la invención exhibe métodos para disminuir la actividad de la proteasa asociada con un injerto de hueso (tal como un aloinjerto de hueso) . En algunas incorporaciones, el método incluye el remover al menos una parte de la cantidad total de una proteasa asociada con el injerto de hueso desde el injerto de hueso. En algunas incorporaciones, el método para disminuir la actividad de la proteasa asociada con el injerto de hueso involucra el remover al menos una parte de la cantidad total de una proteasa asociada con el injerto de hueso desde el injerto de hueso al incubar el injerto de hueso en una solución salina que contiene entre alrededor de 0.5 masa molar de cloruro de sodio y alrededor de 1.5 masa molar de cloruro de sodio ó entre alrededor de 0.3 masa molar de cloruro de sodio y alrededor de 1.5 masa molar de cloruro de sodio. En algunas incorporaciones, el método incluye el medir la cantidad de proteasa que permanece asociada con el injerto de hueso. En algunas incorporaciones, el remover la proteasa comprende el aumentar la resistencia iónica de la solución que comprende al injerto de hueso y a la proteasa. En algunas incorporaciones, el remover la proteasa comprende el incubar al injerto de hueso y la proteasa en una solución salina. En algunas incorporaciones, la solución salina es una solución de cloruro de sodio. En algunas incorporaciones, la solución salina contiene entre alrededor de 0.15 masa molar de cloruro de sodio y alrededor de 1.5 masa molar de cloruro de sodio ó entre alrededor de 0.3 masa molar de cloruro de sodio y alrededor de 1.5 masa molar de cloruro de sodio. En algunas incorporaciones, la solución salina contiene alrededor de 0.3 masa molar de cloruro de sodio (NaCl) . En algunas incorporaciones, el injerto de hueso incluye a fosfato de calcio (tal como a fosfato de ß-tricalcio) que ha sido añadido al injerto de hueso. En algunas incorporaciones, el injerto de hueso incluye a uno o más de otros compuestos (tal como glicerina) que ha sido añadido al injerto de hueso. En algunas incorporaciones, el método comprende el añadir un inhibidor de proteasa al injerto de hueso.

En un aspecto, la invención exhibe métodos para preparar un injerto de hueso (tal^ como un injerto de hueso o un aloinjerto de hueso para usarse en el tratamiento de un hueso, periodonto, ligamento, cartílago, o condición del tendón en un individuo) . En algunas incorporaciones, el método incluye el mejoramiento que comprende en la remoción de al menos una parte de la cantidad total de una proteasa asociada con el injerto de hueso (tal como un injerto de hueso que ha experimentado uno o más de los pasos de tratamiento para hacerlo adecuado para usarse en humanos) . En algunas incorporaciones, la remoción de la proteasa comprende el aumentar la resistencia iónica de una solución que comprende al injerto de hueso y la proteasa. En algunas incorporaciones, el método incluye el mejoramiento que comprende el aumentar la resistencia iónica de una solución que comprende al injerto de hueso (tal como un injerto de hueso que ha experimentado uno o más de los pasos de tratamiento para hacerlo adecuado para usarse en humanos) y la proteasa. En algunas incorporaciones, el método incluye el mejoramiento que comprende el lavado del injerto de hueso (tal como un injerto de hueso que a experimentado uno o más de los pasos de tratamiento para hacerlo adecuado para uso en humanos) con una solución salina. En algunas incorporaciones, el método incluye el incubar el injerto de hueso y la proteasa en una solución salina. En algunas incorporaciones, la solución salina es una solución de cloruro de sodio (NaCl) , tal como entre alrededor de 0.15 masa molar de cloruro de sodio y alrededor de 1.5 masa molar de cloruro de sodio ó de entre alrededor de 0.3 masa molar de cloruro de sodio y alrededor de 1.5 masa molar de cloruro de sodio. En algunas incorporaciones, la solución salina es de alrededor de 0.3 masa molar de cloruro de sodio. En algunas incorporaciones, el injerto de hueso incluye a fosfato de calcio (tal como a fosfato de ß-tricalcio) que ha sido añadido al injerto de hueso. En algunas incorporaciones, el injerto de hueso incluye a uno o más de otros compuestos (tales como glicerina) que ha sido añadida al injerto de hueso. En algunas incorporaciones, el método comprende el añadir un inhibidor de proteasa al injerto de hueso.

En un aspecto, la invención proporciona métodos para tratar a un individuo. En algunas incorporaciones, el método incluye el administrar un injerto de hueso (tal como un aloinjerto de hueso) y un polipéptido de interés (por ejemplo, el factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) a un individuo. En algunas incorporaciones, el injerto de hueso ha sido seleccionado con base en el nivel de actividad de la proteasa. En algunas incorporaciones, el método involucra a) seleccionar un injerto de hueso que tiene un nivel aceptable de actividad de proteasa, y b) administrar el injerto de hueso y un polipéptido de interés al individuo. En algunas incorporaciones, el método comprende el administrar un injerto de hueso y el factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) a un individuo, en donde la actividad de la proteasa del injerto de hueso es menos de alrededor de 50 tripsinas equivalentes. En algunas incorporaciones, el método comprende el administrar un injerto de hueso y el factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) a un individuo, en donde la actividad de la proteasa del injerto de hueso está entre alrededor de 50 a alrededor de 65 tripsinas equivalentes (tal como de alrededor de 50 a alrededor de 55, de alrededor de 55 a alrededor de 60, o de alrededor de 60 a alrededor de 65 tripsinas equivalentes) . En algunas incorporaciones, el método comprende el administrar un injerto de hueso y el factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) a un individuo, en donde la actividad de la proteasa del injerto de hueso es de alrededor de cualquiera de 50, 55, 60 ó 65 tripsinas equivalentes. En algunas incorporaciones, el método comprende el administrar un injerto de hueso y el factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) a un individuo, en donde la actividad de la proteasa del injerto de hueso es de menos de alrededor de 50 tripsinas equivalentes, (tal como de menos de alrededor de 45, de menos de alrededor de 40, de menos de alrededor de 35, de menos de alrededor de 30, de menos de alrededor de 25, de menos de alrededor de 20, de menos de alrededor de 15, de menos de alrededor de 10, de menos de alrededor de 5, de menos de alrededor de 0 tripsinas equivalentes) . En algunas incorporaciones, al menos una parte de la cantidad total de una proteasa asociada con el injerto de hueso ha sido removida del injerto de hueso antes de administrar el injerto de hueso al individuo. En algunas incorporaciones, el método incluye el remover al menos una parte de la cantidad total de una proteasa asociada con el injerto de hueso desde el injerto de hueso antes del paso b) . En algunas incorporaciones, el método comprende el añadir un inhibidor de proteasa al injerto de hueso antes del paso b) . En algunas incorporaciones, la actividad de la proteasa de dos o más injertos de hueso es medida, y el injerto de hueso con la menor actividad de proteasa es administrado al individuo en conjunto con el polipéptido de interés. En algunas incorporaciones, la actividad de proteasa del seleccionado injerto de hueso es de menos de alrededor de 50 tripsinas equivalentes. En algunas incorporaciones, la actividad de la proteasa del seleccionado injerto de hueso es de entre alrededor de 50 a alrededor de 65 tripsinas equivalentes (tal como de alrededor de 50 a alrededor de 55, de alrededor de 55 a alrededor de 60, o de alrededor de 60 a alrededor de 65 tripsinas equivalentes) . En algunas incorporaciones, la actividad de la proteasa del seleccionado injerto de hueso es de alrededor de 50, 55, 60 ó 65 tripsinas equivalentes. En algunas incorporaciones, la actividad de la proteasa del seleccionado injerto de hueso es de menos de alrededor de 50 tripsinas equivalentes (tal como de menos de alrededor de 45, de menos de alrededor de 40, de menos de alrededor de 35, de menos de alrededor de 30, de menos de alrededor de 25, de menos de alrededor de 20, de menos de alrededor de 15, de menos de alrededor de 10, de menos de alrededor de 5, de alrededor de 0 tripsinas equivalentes).

En algunas incorporaciones de cualquiera de los métodos, seleccionando al injerto de hueso con un aceptable nivel de actividad de la proteasa comprende (i) remover al menos una parte de la cantidad total de una proteasa asociada con el injerto de hueso desde el injerto de hueso; y (ii) medir la cantidad de un sustrato de polipéptido que es hendido por la proteasa removida, por ende determinando la cantidad de actividad de la proteasa asociada con el injerto de hueso. En algunas incorporaciones, el paso (i) comprende el aumentar la resistencia iónica de la solución que comprende al injerto de hueso y a la proteasa. En algunas incorporaciones, el paso (i) comprende el incubar el injerto de hueso y la proteasa en una solución salina. En algunas incorporaciones, la solución salina es una solución de cloruro de sodio. En algunas incorporaciones, la solución salina contiene entre alrededor de 0.15 masa molar de cloruro de sodio, y alrededor de 1.5 masa molar de cloruro de sodio o entre alrededor de 0.3 masa molar de cloruro de sodio y alrededor de 1.5 masa molar de cloruro de sodio. En algunas incorporaciones, la solución salina contiene alrededor de 0.3 masa molar de cloruro de sodio. En algunas incorporaciones, el paso (ii) comprende el separar al sustrato de polipéptido hendido, el sustrato de polipéptido no hendido y el injerto de hueso. En algunas incorporaciones, la cromatografía de alto desempeño líquido es usada para separar al sustrato de polipéptido hendido, el sustrato de polipéptido no hendido, y el injerto de hueso. En algunas incorporaciones, la cromatografía de exclusión por tamaño es usada para separar al sustrato de polipéptido hendido, el sustrato de polipéptido no hendido, y al injerto de hueso. En algunas incorporaciones, otro método de separación es usado para separar al sustrato de polipéptido hendido, el sustrato de polipéptido no hendido, y/o al injerto de hueso. Otros ejemplares métodos de separación incluyen a centrifugación simple, cromatografía de intercambio de ión, y electroforesis .

En algunas incorporaciones de cualquiera de los métodos, seleccionar el injerto de hueso con un aceptable nivel de actividad de la proteasa que comprende el medir la cantidad del sustrato de polipéptido que es hendido por una actividad de la proteasa asociada con el injerto de hueso. En algunas incorporaciones, el medir la cantidad de sustrato de polipéptido hendido comprende (i) incubar un sustrato de polipéptido con el injerto de hueso, (ii) remover al menos una parte de la cantidad total del sustrato de polipéptido hendido desde el injerto de hueso, y (iii) medir la cantidad de sustrato de polipéptido hendido. En algunas incorporaciones, el paso (ii) comprende el aumentar la resistencia iónica de la solución que comprende el injerto de hueso y el sustrato de polipéptido. En algunas incorporaciones, el paso (ii) comprende el incubar el injerto de hueso y el sustrato de polipéptido en una solución salina. En algunas incorporaciones, la solución salina es una solución de cloruro de sodio. En algunas incorporaciones, la solución salina contiene alrededor de 0.6 masa molar de cloruro de sodio. En algunas incorporaciones, el paso (iii) comprende el separar al sustrato de polipéptido hendido, el sustrato de polipéptido no hendido, y el injerto de hueso. En algunas incorporaciones, la cromatografía de alto desempeño líquido es usada para separar al sustrato de polipéptido hendido, el sustrato de polipéptido no hendido, y al injerto de hueso. En algunas incorporaciones, la cromatografía de exclusión por tamaño es usada para separar al estrato de polipéptido hendido, al sustrato de polipéptido no hendido, y al injerto de hueso. En algunas incorporaciones, otro método de separación es usado para separar al sustrato de polipéptido hendido, al sustrato de polipéptido no hendido, y al injerto de hueso. Otros métodos ejemplares de separación incluyen a centrifugado simple, cromatografía de intercambio de ion, y a electroforesis .

En algunas incorporaciones de cualquiera de los métodos, el polipéptido de interés y el sustrato de polipéptido son el mismo. En algunas incorporaciones, el polipéptido de interés y el sustrato de polipéptido son diferentes. En algunas incorporaciones, el polipéptido de interés es el factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) . En algunas incorporaciones, el injerto de hueso incluye a fosfato de calcio (tal como a fosfato de ß-tricalcio) que ha sido añadido al injerto de hueso. En algunas incorporaciones, el injerto de hueso incluye a uno o más de otros compuestos (tales como glicerina) que ha sido añadida al injerto de hueso.

En algunas incorporaciones de cualquiera de los métodos, el método de tratamiento comprende el administrar un injerto de hueso y un polipéptido de interés (por ejemplo, el factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) ) a un individuo. En algunas incorporaciones, al menos una parte de la cantidad total de una proteasa asociada con el injerto de hueso ha sido removida del injerto de hueso. En algunas incorporaciones, el método para tratar a un individuo incluye a) remover al menos una parte de la cantidad total de una proteasa asociada con el injerto de hueso del injerto de hueso, y b) administrar el injerto de hueso y un polipéptido de interés al individuo. En algunas incorporaciones, el método incluye el administrar un injerto de hueso y el factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) a un individuo, en donde al menos una parte de la cantidad total de una proteasa asociada con el injerto de hueso ha sido removida del injerto de hueso al incubar el injerto de hueso en una solución salina (tal como una solución salina que contiene entre alrededor de 0.3 masa molar de cloruro de sodio y alrededor de 1.5 masa molar de cloruro de sodio). En algunas incorporaciones, un inhibidor de proteasa es añadido al injerto de hueso.

En algunas incorporaciones de cualquiera de los métodos, el método incluye el medir la cantidad de proteasa que permanece asociada con el injerto de hueso. En algunas incorporaciones, el remover al menos una parte de la cantidad total de una proteasa asociada con el injerto de hueso comprende el aumentar la resistencia iónica de la solución que comprende al injerto de hueso y la proteasa. En algunas incorporaciones, el remover al menos una parte de la cantidad total de una proteasa asociada con el injerto de hueso comprende el incubar el injerto de hueso y la proteasa en una solución salina. En algunas incorporaciones, la solución salina es una solución de cloruro de sodio. En algunas incorporaciones, la solución salina contiene 4 entre alrededor de 0.15 masa molar de cloruro de sodio y alrededor de 1.5 masa molar de cloruro de sodio o entre alrededor de 0.3 masa molar de cloruro de sodio y alrededor de 1.5 masa molar de cloruro de sodio. En algunas incorporaciones, la solución salina contiene alrededor de 0.3 masa molar de cloruro de sodio. En algunas incorporaciones, el polipéptido de interés es el factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) . En algunas incorporaciones, el injerto de hueso incluye a un fosfato de calcio (tal como un fosfato ß-trifosfato) que ha sido añadido al injerto de hueso. En algunas incorporaciones, el injerto de hueso incluye a uno o mas de otros compuestos (tal como glicerina) que ha sido añadida al injerto de hueso.

En un aspecto, la invención describe a cualquiera de los injertos de hueso (tal como a un aloinjerto de hueso) descrito aquí para usar como un medicamento. En algunas incorporaciones, la invención describe a cualquiera de los injertos de hueso descritos aquí en conjunto con cualquier polipéptido de interés para usar como un medicamento. En algunas incorporaciones, la invención describe un injerto de hueso descrito aquí en conjunto con cualquier polipéptido de interés para usar en un método de tratamiento de un individuo (tal como un individuo con un hueso, periodonto, ligamento, cartílago, o condición del tendón). En algunas incorporaciones, la invención describe el uso de cualquiera de los injertos de hueso descritos aquí en conjunto con cualquier polipéptido de interés para la fabricación de un medicamento, tal como un medicamento para tratar a un individuo (tal como un individuo con una condición de hueso, periodonto, ligamento, cartílago o tendón) .

La invención también describe una composición que comprende o consiste de un injerto de hueso (tal como un aloinjerto de hueso) y una sal (tal como una solución de cloruro de sodio). En algunas incorporaciones, la composición también comprende a un polipéptido de interés (tal como un factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) . En algunas incorporaciones, la composición incluye entre alrededor de 0.00001 masa molar y alrededor de 1.5 masa molar de sal, alrededor de 0.01 masa molar y alrededor de 1.5 masa molar de sal, alrededor de 0.01 y alrededor de 0.15 masa molar de sal, alrededor de 0.15 masa molar y alrededor de 1.5 masa molar de sal, ó alrededor de 0.3 masa molar y alrededor de 1.5 masa molar de sal. En alguna incorporación, la composición incluye entre alrededor de 0.00001 masa molar y alrededor de 1.5 masa molar de cloruro de sodio, alrededor de 0.01 masa molar y alrededor de 1.5 masa molar de cloruro de sodio, alrededor de 0.01 y alrededor de 0.15 masa molar de cloruro de sodio, alrededor de 0.15 masa molar y alrededor de 1.5 masa molar de cloruro de sodio, ó de alrededor de 0.3 masa molar y alrededor de 1.5 masa molar de cloruro de sodio .

La invención también describe a una composición producida por cualquiera de los métodos descritos aquí, tal como una composición que comprende a un injerto de hueso (tal como un aloinjerto) y a una solución salina. En algunas incorporaciones, la composición también comprende a un polipéptido de interés (tal como al factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) ) .

Debe entenderse que una, alguna, o todas las propiedades de las varias incorporaciones descritas aquí pueden combinarse para formar otras incorporaciones de la presente invención. Estos y otros aspectos de la invención serán aparentes para uno con habilidad en el arte.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La Figura 1 es una síntesis de un protocolo ejemplar para estudiar el aglutinamiento y la liberación del factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) del injerto de hueso .

La Figura 2 es una gráfica mostrando la liberación del factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) en una hora y en 24 horas del injerto de hueso usando aumentadas concentraciones de sal. La gráfica muestra la cantidad de factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) liberado usando una solución amortiguadora de fosfato (PBS) (barra izquierda lejana) o aumentar las concentraciones de la solución de cloruro de sodio hasta a 1.5 masa molar (barra derecha lejana) después de ya sea 1 hora ó de 24 horas.

La Figura 3 es una gráfica mostrando que el factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) es rápidamente removido por disolución del injerto de hueso con una recuperación de 40-60 % y que la recuperación del factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) depende poco del tiempo de mezclado. Los tiempos de mezclado fueron de 10 minutos (barra izquierda) , 60 minutos (barra media) , y toda la noche (barra derecha) mientras que la remoción por disolución fue instantánea al añadir la sal, rotando por 2 minutos a 15,330 por gramo y tomando los sobrenadantes para análisis. El factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) en un experimento de control fue tomado al 100 por ciento. Esta gráfica sugiere que algún factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) permanece asociado con el injerto de hueso.

La Figura 4A es un cromatograma que muestra el uso de la cromatografía por exclusión de tamaño (SEC) para cuantificar la cantidad de factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) removido por disolución de la matriz del injerto de hueso humano y para analizar su tamaño original y/o la agregación. La cromatografía líquida de alto desempeño por exclusión de tamaño (SE-HPLC) muestra el tamaño original del factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) y de sus interacciones, el agregado del factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) , y otros componentes de la muestra. La Figura 4B muestra la calibración de la columna por exclusión de tamaño usando estándares de proteína de diferentes tamaños moleculares indicados .

La Figura 4C es una gráfica mostrando la calibración de la columna de cromatografía por exclusión de tamaño (SEC) usando diferentes concentraciones del factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) .

Las Figuras 5A y 5B son cromatogramas que muestran que el perfil de la cromatografía por exclusión de tamaño (SEC) es dependiente de la temperatura del tiempo de liberación. Estos cromatogramas muestran significativos remociones por disolución de los polipéptidos no específicos a más altas temperaturas y más largos tiempos de liberación. La remoción por disolución del factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) no cambia mucho bajo las condiciones probadas.

Las Figuras 6A y 6B son cromatogramas mostrando que el perfil de la cromatografía por exclusión de tamaño (SEC) es dependiente de la muestra.

La Figura 7 es una gráfica mostrando la actividad de la proteasa medida usando el ensayo de proteasa Quanti-Cleave™ (de Pierce, Rockford, Illinois) . El injerto de hueso humano 07-0720-A peso en 50, 25, y 12.5 miligramos de partes alícuotas en suspensión (A), el mismo injerto de hueso incubado con 0.66 masa molar de cloruro de sodio por 60 minutos a temperatura de la habitación y entonces lavado tres veces con 20 mM de acetato de sodio (peso atómico), el mismo injerto de hueso incubado con 0.66 M de cloruro de sodio por 60 minutos y entonces lavado con el acetato de sodio y la actividad de la proteasa medida en presencia de 5 mM de (EDTA) (A E) , el sobrenadante del injerto de hueso obtenido de la incubación del injerto de hueso con 0.66 masa molar de cloruro de sodio por 60 minutos a temperatura de la habitación (A S) , el mismo pero ensayado en presencia de 5 mM de (EDTA) (AWSE) . Los datos mostrados son promedios de tres experimentos normalizados por miligramo de injerto de hueso seco.

La Figura 8 es una síntesis de un protocolo ejemplar para estudiar el aglutinamiento y la liberación del factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) del injerto de hueso para diferentes lotes de injerto de hueso.

Las Figuras 9A y 9B son una tabla y un gráfico mostrando que no hay estadísticamente significancia en el efecto de la edad y el género del injerto de hueso humano sobre la liberación del factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) .

La Figura 10 es un gráfico que muestra la recuperación del factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) de injertos de hueso humanos medidos por la prueba de ELISA (ensayo inmuno enzimático) (barra izquierda) o la cromatografía de exclusión de tamaño (SEC) (barra derecha) para varias muestras de injerto de hueso. La cantidad original del factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) usada en el experimento fue normalizado a 100 por ciento comparado a las cantidades recuperadas del factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) .

La Figura 11 es una gráfica que sintetiza la recuperación del factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) de injertos de hueso humanos por la prueba de ELISA (ensayo inmuno enzimático) (barra izquierda) o la cromatografía de exclusión de tamaño (SEC) (barra derecha) para 10 diferentes muestras de injerto de hueso. 1 La Figura 12 es una cromatograma mostrando el uso de la fase invertida de la cromatografía de alto desempeño líquido (HPLC) para cuantificar la cantidad de factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) y para detectar los cambios en su estructura química debido a corte proteolítico y/o modificaciones químicas.

Las Figuras 13A-13E son cromatogramas que muestran perfiles de la fase invertida de la cromatografía de alto desempeño líquido del factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) liberado de varias muestras de injerto de hueso (Figuras 13A-13D) y una muestra de control del factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) (Figura 13E) . Pasadas triples son mostradas . Picos nuevos BC y CD indican productos de cortes proteolíticos del factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) en un caso donde el injerto de hueso contiene actividad proteolítica.

Las Figuras 14A y 14B son un total del perfil de corriente iónica (TIC) de la muestra del factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) y una tabla que muestra la identificación de productos de corte del factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) productos hendidos por ESI LC/MS.

La Figura 15 es una secuencia de amino ácido del factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) mostrando los sitios de corte proteolítico del factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) aislado de las plaquetas humanas (Hart y otros, Purificación del factor de crecimiento derivado de plaquetas AB (PDGF-AB) y del factor de crecimiento derivado de plaquetas BB (PDGF-BB) de extractos de plaquetas humanas y la identificación de todos los tres dímeros del factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) en las plaquetas humanas Bioquímica, 29:166.172, 1990, la cual es aquí incorporada por referencia en su totalidad, particularmente con respecto a los polipéptidos del factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) ) . El mismo corte del factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) fue inducido por el injerto de hueso humano que contiene una actividad proteolítica como se muestra en la Figura 14.

La Figura 16 es una síntesis de un protocolo ejemplar para estudiar la remoción de la actividad de la proteasa del injerto de hueso.

Las Figuras 17A-17E son cromatogramas que muestran una fase invertida de los perfiles de la cromatografía de alto desempeño líquido (HPLC) del factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) incubado por diferentes tiempos con el extracto 07 -0720 -A del injerto de hueso humano (sobrenadante) .

Las Figuras 18A y 18B son gráficas que muestran el tiempo de dependencia del corte proteolítico del factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) .

Las Figuras 19A-19C son cromatogramas que muestran la fase invertida de los perfiles de la cromatografía de alto desempeño líquido (HPLC) del factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) incubado por diferentes tiempos con el injerto de hueso humano 07 -0720 -A después de la remoción por disolución de 0.3 masa molar de sal .

La Figura 20 es una gráfica que muestra la liberación acumulativa del factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) del injerto de hueso secado desmineralizado secado congelado (DMFDBA) seguido de lavados por 5 minutos con agua estéril (barra izquierda) , salina estéril (barra central) , o de remoción por disolución de amortiguado estéril (barra derecha) .

Las Figuras 21A-21D muestran la comparación de la función molecular de las proteínas/péptidos contenidos en varios lotes de aloinjertos.

La Figura 22 muestra una comparación de las proteínas superiores que comprenden 5 por ciento o más de cualquiera de los aloinjertos en varios lotes de aloinjertos.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente invención se basa en parte en el sorprendente descubrimiento de que los injertos de hueso (tales como aloinjertos de hueso humano) pueden tener residual actividad de proteasa aún después de que han sido tratados para reducir la cantidad de polipéptidos endógenos para minimizar las reacciones adversas cuando se transplantan en humanos. En particular, se descubrió que la cantidad de actividad de proteasa residual asociada con los injertos de hueso humanos es variable. Esta actividad residual de la proteasa es indeseable para los injertos de hueso que son administrados en conjunto con un polipéptido de interés (tal como un factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) ) a un individuo debido a que la actividad de la proteasa puede cortar al polipéptido de interés (ya sea antes o después de que el polipéptido de interés es administrado al individuo) . El corte del polipéptido de interés produce variabilidad en la estructura del polipéptido de interés debido que es producida una mezcla de completa longitud y de polipéptido cortado. Además, el porcentaje del polipéptido cortado puede aumentar con el tiempo.

Por el contrario, una composición más uniforme del polipéptido de interés es deseable para minimizar o prevenir cambios en la actividad biológica que puede ocurrir debido a los cambios en la estructura del polipéptido de interés. En particular, es deseable el minimizar los cambios a la estructura (por ejemplo, su estructura primaria, secundaria, o terciaria) y/o la función de un polipéptido de interés debido a la interacción con una matriz del injerto de hueso por métodos terapéuticos que involucran la administración del polipéptido de interés y un injerto de hueso a un individuo (tal como un humano con una condición de hueso, periodonto, ligamento, cartílago, o tendón) .

La invención también proporciona métodos de medición de la actividad de la proteasa asociada con un injerto de hueso. La medición permite a uno el determinar si un particular injerto de hueso debe administrarse a un individuo (tal como a un humano con una condición de hueso, periodonto, ligamento, cartílago, o de tendón) en combinación con un polipéptido de interés. Adicionalmente, la invención describe métodos de reducir el nivel de la actividad de la proteasa asociada con un injerto de hueso. Estos métodos permiten a los injertos de hueso con un aceptable nivel de actividad de la proteasa (o ninguna actividad de la proteasa) de generarse para aplicaciones terapéuticas.

En las siguientes secciones, ejemplares injertos de hueso, polipéptidos de interés, y sustratos de polipéptido son primero descritos. Entonces, son explicados ejemplares métodos para caracterizar injertos de hueso y/o seleccionar injertos de hueso con deseables propiedades. Después, son descritos los métodos para disminuir el nivel de la actividad de la proteasa asociada con un injerto de hueso. Ejemplares métodos y juegos de r tratamiento son entonces descritos.

Injertos de Hueso Ejemplares Los injertos de hueso de ejemplo incluyen a los aloinjertos de hueso, isoinjertos, autoinjertos, y xenoinj ertos , Los aloinjertos de hueso incluyen hueso o células de hueso de un donador que puede transplantarse en un miembro no idénticamente genético de la misma especie. El transplante de hueso o de células del hueso de un donador idéntico genéticamente, por ejemplo, un gemelo idéntico, es denominado un isoinjerto. Cuando una célula o un tejido es transplantado de un sitio a otro en el mismo individuo, es denominado un autoinjerto. Por el contrario, un transplante de otra especie es denominado un xenoinj erto. En algunos casos, el hueso de un donador humano es transplante en otro humano. Los aloinjertos de hueso humano ejemplares son piezas del esqueleto óseo aislado post-mortem de donadores humanos. El injerto de hueso puede mineralizarse o parcialmente o completamente desmineralizarse usando métodos estándar (~4 por ciento residual es usualmente el más desmineralizado usado) . En particulares incorporaciones, el injerto de hueso es no desmineralizado. En particulares incorporaciones , los injertos de hueso son desorganificados usando métodos estándar. En particulares incorporaciones, los injertos de hueso son no desmineralizados y desorganificados . En algunas incorporaciones, el injerto de hueso contiene una combinación de (i) hueso mineralizado y (ii) hueso parcialmente o completamente desmineralizado. Si se desea, el injerto de hueso puede ser parcialmente o completamente desproteinizado usando métodos estándar, tales como bloque de hueso humano o bovino desproteinizado. Ejemplares injertos de hueso incluyen a injertos de hueso desmineralizado secado congelado (DFDBA) , injerto de hueso secado congelado (FDBA) , un aloinjerto de hueso congelado fresco, una matriz de hueso desmineralizado en partícula (DB ) , o un bloque de hueso (véase, por ejemplo, el documento U.S.S.N. 60/890,763, presentado el 20 de febrero de 2007; la publicación de los Estados Unidos de América número 2007/0207185, presentada el 9 de febrero de 2007; la publicación de los Estados Unidos de América número 2007/0129807, presentada el 17 de noviembre de 2006, las cuales son aquí incorporadas por referencia en su totalidad, particularmente con respecto a los injertos de hueso) . En algunas incorporaciones, el injerto de hueso es un bloque autólogo cortical, esponjoso, o córtico-esponj oso . En algunas incorporaciones, el injerto de hueso es un material xenogénico desorganificado, por ejemplo, BioOss (Geistlich Biomaterials , Inc.). En algunas incorporaciones, el injerto de hueso es un injerto de hueso preparado corriereialmente para uso en humanos. En algunas incorporaciones, el injerto de hueso ha sido tratado tal que es adecuado para uso en humanos. Ejemplares pasos de tratamiento para hacer un injerto de hueso adecuado para usar en humanos incluye, pero no está limitado a, control de biocarga, valoración de biocarga, contaminación minimizada, limpieza rigurosa, desinfección y enjuagado, fresado, secado congelado, hacer alícuota, empacado, esterilización terminal, mineralización, desmineralización, secado congelado, preparación aséptica, formación de bloque o gránulos de hueso, o de cualquier combinación de dos o más de los anteriores. En algunas incorporaciones, el injerto de hueso experimenta Allowash XG™ (control de biocarga, valoración de la biocarga, contaminación minimizada, limpieza rigurosa, desinfección, y enjuagado) . En varias incorporaciones, el aloinjerto de hueso es fresado o no fresado, secado congelado o no secado congelado, esterilizado o preparado justo asépticamente. En algunas incorporaciones, el injerto de hueso es tratado con uno o más químicos (tal como peróxido de hidrógeno, surfactantes de detergente, tal como un nonoxinil-9 ó alcohol isopropilo) , o antibióticos (tales como polimixina ó bacitracin) . En algunas incorporaciones, el injerto de hueso es expuesto ya sea a radiación de rayos gamma o a un óxido etileno para esterilización. No todos los injertos de hueso son esterilizados terminales. En algunas incorporaciones, el injerto de hueso es tratado para remover virus y/o bacterias.

En algunas incorporaciones, el injerto de hueso ha sido lavado (tal como lavado en agua, salina, o amortiguadora de remoción por disolución) antes de la adición de un polipéptido de interés. Ejemplares injertos de hueso son derivados de uno o más de los siguientes tipos de hueso: húmero, cubito, radio, fémur, tibia, rótula, hueso del tobillo, huesos de la muñeca, del carpo, metacarpo, falanges, tarsianos, metatarsianos, costillas, esternón, vértebras, escápula, clavícula, pelvis, sacro, y huesos craneofaciales . Donadores ejemplares para injertos de hueso incluyen a primates (por ejemplo, un humano, un mono, gorila, lémur, etc.), un bovino, un equino, un porcino, un ovino, un canino, y un felino.

En algunas incorporaciones, el injerto de hueso incluye partículas, mezclas, mallas, o bloques. Cualquier tamaño total apropiado de injerto de hueso puede usarse, tal como un tamaño total útil para tratar un defecto o lesión de hueso de un tamaño particular. En algunas incorporaciones, el injerto de hueso consiste de partículas de cualquier apropiado tamaño, tal como de entre alrededor de 50 y alrededor de 750 nanómetros, de alrededor de 50 y alrededor de 500 nanómetros, de alrededor de 125 y alrededor de 500 nanómetros, de alrededor de 250 y alrededor de 710 nanómetros, 6 de alrededor de 125 y alrededor de 1000 nanómetros. En algunas incorporaciones, el injerto de hueso consiste de un bloque de hueso con un diámetro promedio de entre alrededor de 50 nanómetros y alrededor de 100 milímetros, ó de alrededor de 0.1 milímetros y de alrededor de 100 milímetros. En algunas incorporaciones, las partículas son de menos de alrededor de 100 nanómetros (tal como de entre alrededor de 50 y alrededor de 90 nanómetros) o mayor de 355 nanómetros (tal como de entre alrededor de 360 y alrededor de 1000 nanómetros) , dado que el injerto de hueso con un tamaño de partícula de entre alrededor de 100 y alrededor de 355 nanómetros puede ser menos capaz de fluir que el deseado para algunas aplicaciones. La capacidad de flujo se refiere a la capacidad de pasar el material a través de la cánula o de un tubo de pequeño calibre como una mezcla homogénea, esto es, sin la separación de líquido de la partícula. En algunas incorporaciones, un amplio rango de tamaño (tal como de entre alrededor de 250 y alrededor de 710 nanómetros) es usado para maximizar la producción del injerto de hueso. Por ejemplo, el hueso base cortical es procesado sobre un equipo de molido estándar que produce partículas en un rango de diferentes tamaños. Mayor el rango de tamaño que es permitido, mayor es la producción.

En particulares incorporaciones, el injerto de hueso comprende o consiste de una proporción de alrededor de 1:1 de hueso cortical molido seco congelado para desmineralizar hueso cortical base secado congelado. En tales incorporaciones, no es añadido fosfato de calcio exógeno.

Injertos de hueso poroso, de conformidad con algunas incorporaciones, pueden comprender a poros que tienen diámetros en el rango desde alrededor de 1 nanómetro a alrededor de 1 milímetro. En una incorporación, un injerto de hueso comprende macroporos que tienen diámetros en el rango desde alrededor de 100 nanómetros a alrededor de 1 milímetro. En otra incorporación, un injerto de hueso comprende a mesoporos, que tienen diámetros en el rango desde alrededor de 10 nanómetros a alrededor de 100 nanómetros. En otra incorporación, un injerto de hueso comprende a microporos que tienen diámetros de menos de 10 nanómetros. Incorporaciones de la presente invención contemplan a injertos de hueso que comprenden macroporos, mesoporos, microporos, o cualquier combinación de los mismos. Un injerto de hueso poroso, en una incorporación, incluye a un injerto de hueso con una porosidad de alrededor de o mayor de cualquiera de 25, 30, 40, 50, 60, 70, 75, 80, 85, 90 ó 95 por ciento. En algunas incorporaciones, la estructura porosa del injerto de hueso permite la infiltración de las células (tales como osteoblastos) en los poros de la matriz. En algunas incorporaciones, un injerto de hueso comprende a una estructura porosa que tiene poros multidireccionales y/o interconectados . En otras incorporaciones, un injerto de hueso comprende una estructura porosa que tiene poros que no están interconectados. En otras incorporaciones, un injerto de hueso comprende a una estructura porosa que tiene una mezcla de poros interconectados y de poros que no están interconectados. En algunas incorporaciones, un injerto de hueso es poroso y permite el absorber agua en una cantidad en el rango desde alrededor de 1 a alrededor de 15 veces la masa del injerto de hueso.

En algunas incorporaciones, el injerto de hueso incluye a fosfato de calcio que ha sido añadido al injerto de hueso (tal como un fosfato de calcio exógeno) . Por ejemplo, cualquiera de los fosfatos de calcio descritos en la publicación de los Estados Unidos de América número 2007/0207185, presentada el 9 de febrero de 2007, puede usarse (la cual es aquí incorporada por referencia en su totalidad, particularmente con respecto a los fosfatos de calcio) . Los fosfatos de calcio adecuados para usar en conjunto con un injerto de hueso, en algunas incorporaciones de la presente invención, tienen una proporción atómica de calcio a fósforo en el rango desde alrededor de 0.5 a alrededor de 2.0. Ejemplos no limitantes de fosfatos de calcio adecuados para usar en conjunto con un injerto de hueso comprenden a fosfato de calcio amorfo, monohidrato de fosfato de monocalcio (MCPM) , fosfato anhídrido monocalcio (MCPA) , dihidrato de fosfato de dicalcio (DCPD) , fosfato dicalcio anhídrido (DCPA) , fosfato octacalcio (OCP) , fosfato a-tricalcio, fosfato ß-tricalcio (ß-TCP) , hidroxiapatita (OHAp) , hidroxiapatita pobremente cristalina, fosfato tetracalcio (TTCP) , decafosfato heptacalcio, metafosfato de calcio, dihidrato pirofosfato de calcio, fosfato de calcio carbonatado, y pirofosfato de calcio. En algunas incorporaciones, la matriz incluye alrededor de cualquiera de 1, 2, 3, 4, 5, ó 6 veces de más injerto de hueso por peso que el peso del fosfato de calcio añadido, tal como el fosfato ß-tricalcio (ß-TCP) . En algunas incorporaciones, la matriz incluye alrededor de 80 por ciento por peso de injerto de hueso (tal como de aloinjerto de hueso) y de alrededor de 20 por ciento por peso de otro fosfato de calcio, tal como el fosfato ß-tricalcio (ß-TCP) . En algunas incorporaciones, el fosfato de calcio (tal como el ß-TCP) tiene una porosidad de alrededor de o de más de cualquiera de 40, 50, 60, 70, 75, 80, 85, 90, ó de 95 por ciento.

En algunas incorporaciones, un aglutinante biocompatible es añadido al injerto de hueso (tal como un injerto de hueso solo o una mezcla de un injerto de hueso y un fosfato de calcio exógeno) . Por ejemplo, cualquiera de los aglutinantes biocompatibles descritos en la publicación de los Estados Unidos de América número 2007/0207185, presentada el 9 de febrero de 2007, puede usarse (la cual es aquí incorporada por referencia en su totalidad, particularmente con respecto a los aglutinantes biocorapatibles) . Los aglutinantes biocorapatibles , en algunas incorporaciones, pueden comprender a colágeno, elastina, polisacáridos , ácidos nucléicos, carbohidratos, proteínas, polipéptidos, poli (a-ácidos hidroxi), poli (lactonas) , poli (ácidos amino) , poli (anhídridos) , poliuretanos , poli (orto-ésteres) , poli (anhídrido-co-imidas) , poli (ortocarbonatos) , poli (OÍ-hidroxi alcanoatos) , poli (dioxanonas) , poli (fosfo-ésteres) , ácido polilacético, poli (L-lactido) (PLLA) , poli (D, L-lactido) (PDLLA) , poliglicólido (PGA) , poli (láctido-co-glicólido (PLGA) , poli (L . láctido-co-D, L-láctido) , poli (D, L-láctido-co-trimetileño carbonato) , ácido poliglicólico, polihidroxibutirato (PHB) , poli ( e -caprolactona) , poli (d-valerolactona) , poli (?-butirolactona) , poli (caprolactona) , poliacrílico ácido, ácido policarboxílico, poli (alilamina hidrocloruro) , poli (dialildimetilamonio cloruro), poli (etilenoimina) , polipropileno fumarato, alcohol polivinil, polivinilpirrolidona, polietileno, polimetilmetacrilato, fibras de carbón, poli (etileno glicol) , poli (etileno óxido), poli (alcohol vinil) , poli (vinilpirrolidona) , poli (etiloxazolina) , poli (óxido etileno) -co-poli (óxido propileno) copolímeros en bloque, poli (etileno tereftalato) poliamida, y copolímeros y mezclas de los mismos. Aglutinantes biocompatibles , en otras incorporaciones, pueden comprender a ácido algínico, goma arábiga, goma de guar, goma de xantano, gelatina, quitina, quitosana, acetato de quitosana, lactato de quitosana, sulfato condroitina, N-=-carboximetil quitosana, una dextran (por ejemplo, a-ciclodextrina, ß-ciclodextrina, ?-ciclodextrina, ó sulfato dextran de sodio) , pegamento de fibrina, lecitina, derivados de fosfatidilcolina, glicerol, ácido hialurónico, hialuronato de sodio, una celulosa (por ejemplo, metilcelulosa, carboximetilcelulosa, hidroxipropil metil celulosa, o hidroxietil celulosa) , una glucosamina, un proteoglican, un almidón (por ejemplo, hidroxietil almidón o almidón soluble) , ácido lacético, ácido plurónico, sodio glicerofosfato, glicogen, una queratina, seda y derivados y mezclas de los mismos.

En algunas incorporaciones, la estructura porosa del injerto de hueso permite por la liberación de más de o de alrededor de cualquiera de 20, 30, 40, 50, 60, ó 70 por ciento de un polipéptido de interés (tal como un factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) ) después de alrededor de 1 hora (con base en la cantidad del polipéptido de interés medido usando un apropiado ensayo tal como un ensayo inmunoabsorbente enlazado por enzima (ELISA) ó el ensayo de cromatografía por exclusión de tamaño descrito aquí) . En otras incorporaciones, la estructura porosa del injerto de hueso permite por la liberación de más de o de alrededor de cualquiera de 20, 30, 40, 50, 60, ó de 70 por ciento del polipéptido de interés (tal como el factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) ) después de alrededor de 8 horas. En otras incorporaciones, la estructura porosa del injerto de hueso permite por la liberación de más de o de alrededor de 20, 30, 40, 50, 60 ó de 70 por ciento del polipéptido de interés (tal como el factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF)) después de alrededor de 24 horas.

En algunas incorporaciones, el injerto de hueso es bioabsorbible . La capacidad de ser "bioabsorbible" se refiere a la capacidad de un injerto de hueso de volverse a absorber o remodelarse in vivo. El proceso de reabsorción involucra la degradación y la eliminación del material original a través de la acción de fluidos corporales, enzimas, o de células. El material reabsorbido puede usarse por el individuo tratado en la formación de nuevo tejido, o puede de otro modo reutilizarse por el individuo tratado, o puede excretarse. Un injerto de hueso, en algunas incorporaciones, puede reabsorberse dentro de un año de administración in vivo. En otras incorporaciones, un injerto de hueso puede reabsorberse dentro de 1, 3, 6, ó 9 meses de administración in vivo. La bioabsorción es dependiente de: 1) la naturaleza del material de matriz (por ejemplo, su hechura química, estructura física, y tamaño) ; 2) la ubicación dentro del cuerpo en el cual la matriz es colocada; 3) la cantidad de material de matriz que es usada; 4) el estado metabólico del individuo siendo tratado (diabético/no diabético, osteoporótico , fumador, edad, uso de esteroides, etc.); 5) la extensión y/o el tipo de lesión o de condición tratada; y, 6) el uso de otros materiales además de la matriz tal como factores del hueso anabólico, catabólico, y anticatabólico .

Polipéptidos de Interés Ejemplares Cualquier polipéptido de interés puede usarse con los injertos de hueso descritos aquí. Los términos "polipéptido" y "proteína" son usados intercambiadamente para referirse a polímeros de amino ácidos de cualquier longitud. El polímero puede ser lineal o ramificado, puede comprender a amino ácidos modificados, y puede interrumpirse por no aminoácidos. Los términos también abarcan a un polímero aminoácido que ha sido modificado naturalmente o por intervención; por ejemplo, formación de unión disulfuro, glicosilación, lapidación, acetilación, fosforilación, ó cualquier otra manipulación o modificación, tal como conjugación con un componente de etiquetado. También incluidos dentro de la definición están, por ejemplo, los polipéptidos que contienen a uno o más análogos de un aminoácido (incluyendo, por ejemplo, aminoácidos no naturales, etc.), así como a otras modificaciones conocidas en el arte.

En algunas incorporaciones, el polipéptido de interés es un polipéptido capaz de ser hendido por una o más proteasas asociadas con un injerto de hueso. Si se desea, la capacidad de un polipéptido de interés de hendirse por una o más proteasas asociadas con un injerto de hueso puede medirse usando cualquiera de los métodos descritos aquí (tal como por incubación del polipéptido de interés con un injerto de hueso, separar al polipéptido de interés del injerto de hueso, y medir la cantidad de polipéptido de interés que fue hendido) . Deseablemente, los métodos descritos aquí reducen la cantidad de una proteasa asociada con un injerto de hueso que puede hendir al polipéptido de interés. En algunas incorporaciones, más de un polipéptido de interés (tal como 2, 3, 4, 5, ó más de diferentes polipéptidos) son usados en los métodos, composiciones, o juegos descritos aquí. En algunas incorporaciones, el polipéptido de interés promueve la reparación, sanado o crecimiento del hueso.

En algunas incorporaciones, el polipéptido de interés es el factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) , el cual es un factor de crecimiento naturalmente liberado de plaquetas en sitios de la lesión. El factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) sinergiza con el factor de crecimiento vascular endotelial (VEGF) para promover la neovascularización, y estimula la quimotaxis y la proliferación de células derivadas de células madre mesenquimales incluyendo a tenocitos, osteoblastos , condrocitos, y células vasculares de músculo suave. En algunas incorporaciones, el factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) comprende a homodímero del factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) y a heterodímero, incluyendo a factor de crecimiento derivado de plaquetas AA (PDGF-AA) , al factor de crecimiento derivado de plaquetas BB (PDGF-BB) , factor de crecimiento derivado de plaquetas AB (PDGF-AB) , factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) factor de crecimiento derivado de plaquetas CC (PDGF-CC) factor de crecimiento derivado de plaquetas DD (PDGF-DD) , y mezclas y derivados de los mismos. En algunas incorporaciones, el factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) comprende al factor de crecimiento derivado de plaquetas BB (PDGF-BB) . En otras incorporaciones, el factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) comprende al recombinante humano del factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) , tal como el recombinante humano factor de crecimiento derivado de plaquetas BB (rhPDGF-BB) . En algunas incorporaciones, el factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) comprende a fragmentos del factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) . En una incorporación, el recombinante humano del factor de crecimiento derivado de plaquetas B (rhPDGF-B) comprende los siguientes fragmentos: secuencias de aminoácidos 1-31, 1-32, 33-108, 33-109, y/o 1-108 de toda la cadena B. la completa secuencia de aminoácido (aminoácidos 1-109) de la cadena B del factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) es proporcionado en la Figura 15 de la patente de los Estados Unidos de América número 5,516,896 (la cual es aquí incorporada por referencia en su totalidad, particularmente con respecto a los polipéptidos del factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) ) . Debe entenderse que las composiciones del recombinante humano del factor de crecimiento derivado de plaquetas (rhPDGF) de la presente invención pueden comprender una combinación de intactos recombinante humano del factor de crecimiento derivado de plaquetas B (rhPDGF-B) (aminoácidos 1-109) y de fragmentos de los mismos. Otros fragmentos del factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) pueden emplearse tal como aquellos descritos en la patente de los Estados Unidos de América número 5,516,896. De conformidad con algunas incorporaciones, el recombinante humano del factor de crecimiento derivado de plaquetas BB (rhPDGF-BB) comprende mayor de o alrededor de cualquiera de 65%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, ó de 99% del intacto recombinante humano del factor de crecimiento derivado de plaquetas B(rhPDGF-B) (aminoácidos 1-109) .

En algunas incorporaciones, el polipéptido de interés es un polipéptido que es hendido por una o más proteasas (tal como aminopeptidasas , carboxipeptidasas , y metaloproteasas) asociadas con un injerto de hueso que también ha hendido al factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) . Por ejemplo, el polipéptido de interés puede tener uno o más sitios de hendido mostrados en la figura 15 para el factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) : hendido de la unión del péptido después del Serl, Leu5, ó Arg32. En algunas incorporaciones, el polipéptido de interés contiene al menos alrededor de cualquiera de 2, 3, 4, 5, 6, 7, ó más aminoácidos contiguos que son idénticos a 2, 3, 4, 5, 6, 7, ó más aminoácidos contiguos del polipéptido del factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) que incluyen Serl, Leu5 , ó Arg32. En algunas incorporaciones, el polipéptido de interés contiene al menos alrededor de cualquiera de 4, 5, 6, 7, ó más aminoácidos contiguos que son mayores de o de alrededor de 80, 85, 95, 99 ó 100 por ciento idénticos a los aminoácidos contiguos de un polipéptido del factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) que incluyen al Serl, Leu5, ó Arg32. Secuencias de identidad pueden medirse, por ejemplo, usando el software de análisis de secuencia con parámetros por defecto especificados en el mismo (por ejemplo, Paquete de Software de Análisis de Secuencia de Genetics Computer Group, Centro de Biotecnología de la Universidad de isconsin, 1710 University Avenue, Madison, isconsin 53705) . Este programa de software iguala secuencias similares al asignar grados de homología a varios reemplazos de aminoácidos, supresiones, y otras modificaciones.

En algunas incorporaciones, el polipéptido de interés es obtenido de fuentes naturales. En otras incorporaciones, el polipéptido de interés es producido por técnicas de ADN recombinante (ácido desoxiribonucleico) . En algunas incorporaciones, el polipéptido de interés o fragmentos del mismo pueden producirse usando técnicas de síntesis del péptido conocidas para uno con habilidad en el arte, tal como síntesis de péptido fase sólida.

Cuando se obtiene de fuentes naturales, el polipéptido de interés puede ser, por ejemplo, derivado de fluidos biológicos. Los fluidos biológicos, de conformidad con algunas incorporaciones, pueden comprender a cualquier fluido tratado o sin tratar asociado con organismos vivos, incluyendo sangre. Los fluidos biológicos pueden también comprender a componentes de sangre incluyendo a concentrados de plaquetas, plaquetas aféresis, plasma rica de plaquetas, plasma, suero plasma recién congelada, y capa leucocitaria . Los fluidos biológicos pueden comprender a plaquetas separadas del plasma y resuspendidas en un fluido fisiológico.

Cuando se produce por técnicas de ADN recombinante, una secuencia de ADN codificada en un solo monómero (por ejemplo,, una cadena de factor de crecimiento derivado de plaquetas B (PDGF-B) o una cadena de factor de crecimiento derivado de plaquetas A (PDGF-A) ) puede insertarse en células cultivadas procarióticas o eucarióticas para expresión en subsiguientemente producir al homodímero (por ejemplo, el factor de crecimiento derivado de plaquetas BB (PDGF-BB) ó factor de crecimiento derivado de plaquetas AA (PDGF-AA) ) . El homodímero del factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) producido por las técnicas recombinantes puede usarse en algunas incorporaciones. En algunas incorporaciones, un homodímero del factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) es producido en células de levadura construidas tales como Saccharamyces cerevisiae . En otras incorporaciones, el heterodímero del factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) puede generase al insertar secuencias de ADN codificadas para ambas unidades monoméricas del heterodímero en células cultivadas procarióticas o eucarióticas y permitiendo a las unidades monoméricas trasladadas de procesarse por las células para producir al heterodímero (por ejemplo, el factor de crecimiento derivado de plaquetas AB (PDGF-AB) . Polipéptidos de interés recombinantes comercialmente disponibles (tales como el factor humano de crecimiento derivado de plaquetas BB (PDGF-BB) puede obtenerse de una variedad de fuentes.

En algunas incorporaciones, el polipéptido de interés está en una forma altamente purificada. El "polipéptido purificado", como se usa aquí, comprende a composiciones que tienen mayor de o alrededor de 95 por ciento por peso del polipéptido de interés antes de la incorporación en las soluciones de la presente invención. La solución puede prepararse usando cualquier amortiguador o diluyente aceptable de forma farmacéutica. En otras incorporaciones, el polipéptido de interés puede ser sustancialmente purificado. El "polipéptido sustancialmente purificado", como se usa aquí, comprende a composiciones que tienen alrededor de 5 por ciento a alrededor de 95 por ciento por peso del polipéptido de interés antes de la incorporación en soluciones de la presente invención. En una incorporación, el polipéptido sustancialmente purificado comprende a composiciones que tienen alrededor de 65 por ciento a alrededor de 95 por ciento por peso del polipéptido de interés antes de la incorporación en soluciones de la presente invención. En otras incorporaciones, el polipéptido de interés sustancialmente purificado comprende a composiciones que tienen alrededor de 70 por ciento a alrededor de 95 por ciento, alrededor de 75 por ciento a alrededor de 95 por ciento, alrededor de 80 por ciento a alrededor de 95 por ciento, alrededor de 85 por ciento a alrededor de 95 por ciento, ó alrededor de 90 por ciento a alrededor de 95 por ciento, por peso del polipéptido de interés, antes de la incorporación en soluciones de la presente invención. El polipéptido purificado de interés y el polipéptido sustancialmente purificado de interés pueden incorporarse en el injerto de hueso.

En otra incorporación, el polipéptido de interés puede ser parcialmente purificado. Ejemplares polipéptidos parcialmente purificados (tales como el factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) ) comprenden a composiciones que tienen al polipéptido de interés en el contexto del plasma rica de plaquetas, plasma congelada reciente, o cualquier otro producto de sangre que requiere recolección y separación para producir al polipéptido de interés. Incorporaciones de la presente invención contemplan que cualquiera de las isoformas de polipéptido proporcionados aquí, incluyendo a los homodímeros y los heterodímeros, pueden purificarse o parcialmente purificarse. Composiciones de la presente invención que comprenden a mezclas de polipéptido pueden comprender a isoformas, variantes, o fragmentos del polipéptido de interés en proporciones parcialmente purificadas. El factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) parcialmente purificado o purificado, en algunas incorporaciones, puede ser preparado como se describe en la publicación de los Estados Unidos de América número 2006/0084602, presentada el 23 de junio de 2005 (la cual es aquí incorporada por referencia en su totalidad, particularmente con respecto a los polipéptidos del factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) ) .

Sustratos de Polipéptido Ejemplares Cualquier polipéptido capaz de ser hendido por una proteasa puede usarse como un sustrato de polipéptido en cualquiera de los métodos descritos aquí para medir la actividad de la proteasa asociada con un injerto de hueso o seleccionar un injerto de hueso con un aceptable nivel de actividad de la proteasa. Ejemplares sustratos de polipéptido incluyen a cualquiera de los polipéptidos de interés descritos aquí. En algunas incorporaciones, el sustrato de polipéptido es un polipéptido conocido para ser hendido por una o más proteasas (tales como aminopéptidasas , carboxipeptidasas , y/o metaloproteasas) . En algunas incorporaciones, el sustrato de polipéptido es un polipéptido comercialmente disponible (por ejemplo, caseína succinilatada en el juego de ensayo de proteasa QuantiCleave™ (de Pierce, de Eockfrd, Illinois) , hemoglobina bovina (cat.#H2625, de Sigma-Aldrich, de St. Louis, Missouri), gelatina (cat.#G7765, de Sigma, de St . Louis, Missouri), o caseína fluoresceina isotiocianato de leche bovina Tipo 1 (Cat.#C0403, de Sigma Aldrich, de St . Louis, Missouri)).

Métodos Ejemplares para caracterizar y/o seleccionar los injertos de hueso Si se desea, cualquiera de los injertos de hueso descritos aquí puede analizarse para determinar la cantidad de actividad de la proteasa (tal como la actividad de uno o más de los aminopéptidos , carboxipeptidasas, y/o metaloproteasas) asociadas con el injerto de hueso (por ejemplo, para predecir que tanto de un polipéptido de interés será hendido por la actividad de la proteasa asociada con el injerto de hueso cuando el polipéptido de interés es administrado en conjunto con el injerto de hueso) . En uno de tales aspectos, la invención describe métodos para medir la actividad de la proteasa asociada con un injerto de hueso. En algunas incorporaciones, el método incluye medir la cantidad de un sustrato de polipéptido (tal como el factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) ) que es hendido por una actividad de la proteasa asociada con el injerto de hueso. En algunas incorporaciones, medir la cantidad de sustrato de polipéptido hendido incluye (i) incubar al sustrato de polipéptido con el injerto de hueso, (ii) remover al menos una parte de la cantidad total del sustrato de polipéptido hendido del injerto de hueso, y (iii) medir la cantidad de sustrato de polipéptido hendido. En algunas incorporaciones, el paso (ii) comprende aumentar la resistencia iónica de la solución que comprende al injerto de hueso y al sustrato de polipéptido. En algunas incorporaciones, el paso (ii) comprende el incubar al injerto de hueso y al sustrato de polipéptido en una solución salina. En algunas incorporaciones, la solución salina es una solución de cloruro de sodio, tal como de entre alrededor de 0.15 masa molar y alrededor de 2.0 masa molar del cloruro de sodio, ó de alrededor de 0.6 masa molar del cloruro de sodio. En algunas incorporaciones, el paso (iii) comprende el separar al sustrato de polipéptido hendido, el sustrato de polipéptido no hendido, y al injerto de hueso. En algunas incorporaciones, la cromatografía de alto desempeño líquido (HPLC) es usada para separar al sustrato de polipéptido hendido, el sustrato de polipéptido no hendido, y al injerto de hueso. En algunas incorporaciones, la cromatografía de exclusión por tamaño (SEC) es usada para separar al sustrato de polipéptido hendido, el sustrato de polipéptido no hendido, y al injerto de hueso. En algunas incorporaciones, el sustrato de polipéptido es el factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) ) .

Como se describe además en los ejemplos, los métodos fueron desarrollados para separar al factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) u otro polipéptido de interés después de aglutinar un injerto de hueso. Por ejemplo, cuando una mezcla del recombinante humano del factor de crecimiento derivado de plaquetas BB (rhPDGF-BB) y el injerto de hueso fueron lavados con un amortiguador de baja resistencia iónica, menos de 10 por ciento del recombinante humano del factor de crecimiento derivado de plaquetas BB (rhPDGF-BB) que ha sido unido a la matriz del injerto de hueso fue recuperado del injerto de hueso (por la liberación del recombinante humano del factor de crecimiento derivado de plaquetas BB (rhPDGF-BB) del injerto de hueso en la solución) . Aumentando la resistencia iónica del amortiguador aumenta la cantidad del recombinante humano del factor de crecimiento derivado de plaquetas BB (rhPDGF-BB) que fue liberado del injerto de hueso (Figura 2) . La concentración óptima de sal (tal como el cloruro de sodio (NaCl) fue de 0.6 molar, aún cuando otras concentraciones tales como entre alrededor de 0.5 masa molar y alrededor de 2.0 pueden usarse . La liberación recombinante humano del factor de crecimiento derivado de plaquetas BB (rh PDGF-BB) desde la matriz fue casi instantáneo bajo estas condiciones (Figura 3) . Otras sales monovalentes o bivalentes pueden usarse para lograr liberar el recombinante humano del factor de crecimiento derivado de plaquetas (rh PDGF) u otro polipéptido de interés del injerto de hueso tal como cloruro de potasio (KCl) , cloruro de litio (LiCl) , (NH4)2S0 , NaHP04 , etc. Si se desea, el ensayo inmunoabsorbente enlazado por enzima (ELISA) puede usarse para medir la cantidad del factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) u otro polipéptido de interés (tal como la cantidad de polipéptido soluble) que es liberado del injerto de hueso. El ensayo inmunoabsorbente enlazado por enzima (ELISA) descrito en los ejemplos mide el aglutinante del factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) a su receptor, permitiendo la cantidad del factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) que aún es capaz de aglutinarse a su receptor para medirse. Los ejemplos describen la fase inversa de la cromatografía de alto desempeño líquido (HPLC) (RPHPLC) y los métodos de la cromatografía de exclusión de tamaño (SEC) , por ejemplo, la cromatografía de alto desempeño por exclusión de tamaño (HPSEC) que fue usada para separar al factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) hendido y al factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) no hendido del injerto de hueso, permitiendo al porcentaje del factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) que fue hendido por la proteasa asociada con el injerto de hueso para determinarse. Por ejemplo, estos métodos permiten cambios en la estructura (tal como el hendido o la modificación química) y la extensión de la agregación del polipéptido a determinarse. Por ejemplo, si el factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) se agrega, su tamaño aumenta y se remueve por disolución a más tempranos tiempos de remoción por disolución como se muestra en la Figura 5B a 37 grados centígrados. Cualesquiera cambios en el perfil de la fase inversa de la cromatografía de alto desempeño líquido (RPHPLC) (tal como la apariencia de nuevos picos) indican un posible cambio en la estructura del recombinante humano del factor de crecimiento derivado de plaquetas BB (rh PDGF-BB) , más seguramente debido a un hendido proteolítico o a modificación química de algún residuo de aminoácido o de ambos. Estos métodos también permiten la separación del recombinante humano del factor de crecimiento derivado de plaquetas BB (rh PDGF-BB) de polipéptidos del injerto de hueso endógeno que pueden de otro modo dificultar el análisis del recombinante humano del factor de crecimiento derivado de plaquetas BB (rh PDGF-BB) . Para determinar la cantidad del recombinante humano del factor de crecimiento derivado de plaquetas BB (rh PDGF-BB) usando el método de la cromatografía por exclusión de tamaño (SEC) , los picos que corresponden al recombinante humano del factor de crecimiento derivado de plaquetas BB (rh PDGF-BB) fueron integrados, y la concentración del recombinante humano del factor de crecimiento derivado de plaquetas BB (rh PDGF-BB) fue determinada por el uso de una curva de calibración calculada de los estándares del recombinante humano del factor de crecimiento derivado de plaquetas BB (rh PDGF-BB) de conocidas concentraciones como se muestra en las Figuras 4A-4C. Para determinar la cantidad del recombinante humano del factor de crecimiento derivado de plaquetas BB (rh PDGF-BB) usando el método de la fase inversa de la cromatografía de alto desempeño líquido (RPHPLC) , la suma de todas las áreas pico pertenecientes a los componentes del recombinante humano del factor de crecimiento derivado de plaquetas BB (rh PDGF-BB) son usadas. En efecto, algunos injertos de hueso inducen hendido proteolítico del recombinante humano del factor de crecimiento derivado de plaquetas BB (rh PDGF-BB) , como se demuestra por la apariencia de nuevos picos en el perfil de la fase inversa de la cromatografía de alto desempeño líquido (RPHPLC) (Figura 14A) . Debido a que los nuevos picos pueden separarse en el perfil de la fase inversa de la cromatografía de alto desempeño líquido (RPHPLC) , el método de la fase inversa de la cromatografía de alto desempeño líquido (RPHPLC) puede usarse para identificación de nuevos picos de polipéptidos por la espectrometría de masa (Figura 14B) o cualquier otro método estándar (por ejemplo, la secuencia terminal Edman-N) . Por tanto, los sitios de hendido en el recombinante humano del factor de crecimiento derivado de plaquetas BB (rh PDGF-BB) (Figura 15) u otro polipéptido de interés y/o las proteasas que causan el hendido pueden identificarse. Si se desea, las propiedades funcionales del polipéptido de interés pueden medirse después de que son liberadas del injerto de hueso usando ensayos con base de células estándar, tales como los ensayos que miden la proliferación de células en respuesta a incubación con un factor de crecimiento de interés (por ejemplo, bioensayos de fosfatasa alcalina con base de célula) . Por ejemplo, puede usarse un bioensayo que mide el efecto estimulante del recombinante humano del factor de crecimiento derivado de plaquetas BB (rh PDGF-BB) en el crecimiento de células MG-63.

En algunas incorporaciones, el método para medir la actividad de la proteasa asociada con un injerto de hueso incluye a) remover al menos una parte de la cantidad total de una proteasa asociada con el injerto de hueso desde el injerto de hueso; y b) medir la cantidad de un sustrato de polipéptido que es hendido por la proteasa removida, por ende determinando la cantidad de la actividad de la proteasa asociada con el injerto de hueso. En algunas incorporaciones, el paso- a) comprende el aumentar la resistencia iónica de la solución que comprende al injerto de hueso y la proteasa. En algunas incorporaciones, el paso a) comprende el incubar el injerto de hueso y la proteasa en una solución salina. En algunas incorporaciones, la solución salina es una solución de cloruro de sodio (NaCl) , tal como entre alrededor de 0.15 masa molar de cloruro de sodio, y alrededor de 1.5 masa molar de cloruro de sodio, ó de alrededor de 0.3 masa molar de cloruro de sodio y alrededor de 1.5 masa molar de cloruro de sodio. En algunas incorporaciones, el paso b) comprende el separar el sustrato de polipéptido hendido, el sustrato de polipéptido no hendido, y el injerto de hueso. En algunas incorporaciones, la cromatografía de alto desempeño líquido (HPLC) o la cromatografía por exclusión de tamaño (SEC) es usada para separar al sustrato de polipéptido hendido, al sustrato de polipéptido no hendido, y al injerto de hueso. En algunas incorporaciones, el método para medir la actividad de la proteasa asociada con un injerto de hueso incluye (i) remover al menos una parte de la cantidad total de una proteasa asociada con el injerto de hueso; y (ii) medir la cantidad o concentración de una o más de las proteasas removidas del injerto de hueso, por ende determinando la cantidad de actividad de la proteasa asociada con el injerto de hueso. En algunas incorporaciones, el sustrato del polipéptido es el factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) .

Como además se describe en los ejemplos, métodos fueron desarrollados para remover al menos una parte de la actividad de la proteasa del injerto de hueso. La actividad de la proteasa fue casi completamente removida por disolución del injerto de hueso humano usando 0.3 masa molar de cloruro de sodio (NaCl) , aún cuando otras concentraciones de sal pueden usarse, tales como de entre alrededor de 0.15 masa molar y alrededor de 1.5 masa molar. Ochenta minutos fueron el tiempo óptimo para ensayar la actividad de la proteasa a 37 grados centígrados usando el factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) como el sustrato, aún cuando otros tiempos de incubación y temperaturas pueden usarse. Si se desea, la secuencia terminal Edman-N puede usarse para identificar a la proteasa después de que es removida del injerto de hueso. Alternativamente o adicionalmente, la espectrometría de masa puede' usarse para determinar el tamaño y la identidad de la proteasa después de que es removida del injerto de hueso usando métodos estándar tales como aquellos descritos en la presente.

En un aspecto, la invención caracteriza métodos de selección de un injerto de hueso para administración a un individuo en conjunto con un polipéptido de interés (por ejemplo, el factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) ) . En algunas incorporaciones, el método involucra medir la actividad de la proteasa asociada con un injerto de hueso, en donde la cantidad de la actividad de la proteasa asociada con el injerto de hueso determina si el injerto de hueso es seleccionado para administración al individuo en conjunto con el polipéptido de interés. En algunas incorporaciones, el método involucra el seleccionar un injerto de hueso con un aceptable nivel de actividad de la proteasa para administración al individuo en conjunto con el polipéptido de interés. En algunas incorporaciones, la actividad de la proteasa de dos o más de los injertos de hueso es medida, y el injerto de hueso con la más baja actividad de proteasa es administrado al individuo en conjunto con el polipéptido de interés. En algunas incorporaciones, la actividad de la proteasa del seleccionado injerto de hueso es menor de alrededor de 50 tripsinas equivalentes. En algunas incorporaciones, la actividad de la proteasa del seleccionado injerto de hueso es de entre alrededor de 50 a alrededor de 65 tripsinas equivalentes (tal como de alrededor de 50 a alrededor de 55, de alrededor de 55 a alrededor de 60, ó de alrededor de 60 a alrededor de 65 tripsinas equivalentes) . En algunas incorporaciones, la actividad de la proteasa del seleccionado injerto de hueso es de alrededor de cualquiera de 50, 55, 60 ó de 65 tripsinas equivalentes. En algunas incorporaciones, la actividad de la proteasa del seleccionado injerto de hueso es de menos de alrededor de 50 tripsinas equivalentes (tal como de menos de alrededor de 45, de menos de alrededor de 40, de menos de alrededor de 35, de menos de alrededor de 30, de menos de alrededor de 25, de menos de alrededor de 20, de menos de alrededor de 15, de menos de alrededor de 10, de menos de alrededor de 5, de alrededor de 0 tripsinas equivalentes) . En algunas incorporaciones, el método también involucra seleccionar un injerto de hueso que aglutina una cantidad aceptable de polipéptido de interés inicial y/o que libera un porcentaje aceptable del polipéptido de interés que se aglutina al injerto de hueso.

Métodos ejemplares de disminución de la actividad de la proteasa asociada con un injerto de hueso En un aspecto, la invención describe métodos para disminuir la actividad de la proteasa con un injerto de hueso. En algunas incorporaciones, el método incluye el remover al menos una parte de la cantidad total de una proteasa asociada con el injerto de hueso desde el injerto de hueso. En algunas incorporaciones, el remover la proteasa comprende el aumentar la resistencia iónica de la solución que comprende al injerto de hueso y la proteasa. En algunas incorporaciones, el remover la proteasa comprende el incubar el injerto de hueso y la proteasa en una solución salina (tal como una solución de cloruro de sodio) . En algunas incorporaciones, la solución de sal contiene entre alrededor de 0.15 masa molar de cloruro de sodio y alrededor de 1.5 masa molar de cloruro de sodio ó entre alrededor de 0.3 masa molar de cloruro de sodio y alrededor de 1.5 masa molar de cloruro de sodio. En algunas incorporaciones, la solución salina contiene alrededor de 0.3 masa molar de cloruro de sodio. En algunas incorporaciones, el método incluye el medir la cantidad de proteasa que permanece asociada con el injerto de hueso. En algunas incorporaciones, el injerto de hueso retiene al menos una parte de su actividad osteoinductiva después de que la proteasa es removida. En algunas incorporaciones, el injerto de hueso retiene al menos una parte de los polipéptidos endógenos asociados con él (tal como el Perfil Metabólico Base (BMP) ) después de que la proteasa es removida. En algunas incorporaciones, el injerto de hueso es entonces administrado a un individuo como se describe abajo.

En algunas incorporaciones, un inhibidor de proteasa puede añadirse al injerto de hueso. Por ejemplo, un inhibidor de proteasa específico a una o más proteasas en el injerto de hueso puede añadirse, por ejemplo, un inhibidor de proteasa para la catepsina G, la matriz metaloproteasa- 9 , y/o quimasa.

Métodos ejemplares para lavar el injerto de hueso En algunas incorporaciones, el injerto de hueso (tal como un aloinjerto de hueso humano) es lavado (tal como lavado en agua, salina, o amortiguador de remoción por dilución) antes de la adición de un polipéptido de interés. Este paso de lavado puede ser además de o en vez de la remoción de una parte de la actividad de proteasa del injerto de hueso. En algunas incorporaciones, este paso de lavado remueve un residuo ácido del injerto de hueso. En algunas incorporaciones, este paso de lavado mejora la capacidad del injerto de hueso para retener a un polipéptido de interés.

Por ejemplo, la Figura 20 sintetiza como el lavado desmineraliza el injerto de hueso humano en cualquier agua, salina, o amortiguador de remoción por disolución que afecta el aglutinado del factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) al injerto de hueso. Las tendencias indican que el lavado del injerto de hueso por 5 minutos en agua estéril lleva a una disminución en la cantidad del factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) liberado del injerto de hueso DM al final del estudio de 60 minutos. Más del factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) fue liberado después de 5 minutos de lavado salino, y el lavado en un amortiguador de remoción por disolución fue de algún modo lavado entre agua y salina.

Los lavados fueron conducidos como sigue. La muestra del injerto de hueso (-0.1 gramos) fue colocada en un tubo pequeño de plástico y entonces ya sea 0.1 mililitros de agua, solución salina, o amortiguador de remoción por disolución fueron añadidos a la muestra. La mezcla fue dejada asentarse a temperatura de la habitación por 5 minutos con ocasional mezclado suave a mano. Al final de los 5 minutos, el fluido es jalado del material de injerto de hueso usando una pipeta, y el fluido restante fue removido por la compresión del material con un aplicador de algodón estéril de punta Q. Seguido a esto, una solución de 0.3 miligramos por mililitro del recombinante humano del factor de crecimiento derivado de plaquetas BB (rh PDGF-BB) fueron añadidos al injerto de hueso lavado y las muestras fueron removidas para cuantificación del factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) por el ensayo inmunoabsorbente enlazado por enzima (ELISA) por 60 minutos.

Métodos de Tratamiento de ejemplo En otro aspecto, la invención proporciona métodos para tratar a un individuo que usa cualquiera de los injertos de hueso y uno o más polipéptidos de interés descritos aquí. En algunas incorporaciones, el método incluye administrar un injerto de hueso y un polipéptido de interés (por ejemplo PDGF) a un individuo. En algunas incorporaciones, el injerto de hueso se ha seleccionado con base en el nivel de actividad de proteasa. En algunas incorporaciones, por lo menos una parte de la cantidad total de una proteasa asociada con el injerto de hueso se ha removido del injerto de hueso antes de administrar el injerto de hueso da un individuo. En algunas incorporaciones, la actividad de proteasa para dos o más injertos de hueso es medida, y el 7 injerto de hueso con la actividad de proteasa más baja es administrado al individuo en conjunción con el polipéptido de interés. En algunas incorporaciones, la actividad de proteasa del injerto de hueso seleccionado es menor de alrededor de 50 equivalentes de tripsina. En algunas incorporaciones, la actividad de proteasa del injerto de hueso seleccionado es de entre 50 equivalentes de tripsina a alrededor de 65 equivalentes de tripsina (tal como de alrededor de 50 a alrededor de 55, de alrededor de 55 a alrededor de 60, o de alrededor de 60 a alrededor de 65 equivalentes de tripsina). En algunas incorporaciones, la actividad de proteasa del injerto de hueso seleccionado es alrededor de cualquiera de 50, 55, 60 ó 65 equivalentes de tripsina. En algunas incorporaciones, la actividad de proteasa del injerto de hueso seleccionado es de menos de alrededor de 50 equivalentes de tripsina (tal como de alrededor de 45, menos de alrededor de 40, menos de alrededor de 35, menos de alrededor de 35, menos de alrededor de 30, menos de alrededor de 25, menos de alrededor de 20, menos de alrededor de 15, menos de alrededor de 10, menos de alrededor de 5, alrededor de 0 equivalentes de tripsina). En varios ejemplos, la actividad del polipéptido de interés (por ejemplo, PDGF) puede ser mantenida, después del contacto con el injerto de hueso, por lo menos por alrededor de 30 minutos, por lo menos por alrededor de 1 hora, por lo menos por alrededor de 2 horas, por lo menos por alrededor de 4 horas, por lo menos por alrededor de 8 horas, por lo menos por alrededor de 24 horas, por lo menos por alrededor de 2 días, por lo menos por alrededor de 3 días, por lo menos por alrededor de 5 días, por lo menos por alrededor de 1 semana.

Una mezcla compuesta de injerto de hueso (tal como aloinjerto de hueso humano) y rhPDGF-BB puede ser usado para el tratamiento de huesos; para la promoción del crecimiento de hueso, del periodontio, del ligamento o cartílago, del aumento de hueso; de procedimientos artrodéticos ; del tratamiento de la columna vertebral; del tratamiento de la osteonecrosis (ONJ) o de la osteoradionecrosis de la quijada (ORNJ) ; el tratamiento de tendones o lesiones de puño girador; o la osteogenésis de distracción (por ejemplo, véase la publicación de la solicitud de patente de los Estados Unidos de América No. 2006/0084602, presentada el 23 de Junio de 2005; de la publicación de la solicitud de patente de los Estados Unidos de América No. 2007/0207185, presentada el 9 de Febrero de 2007; de la publicación de la solicitud de patente de los Estados Unidos de América No. 2007/0129807, presentada el 17 de Noviembre de 2006; de la publicación de la solicitud de patente del tratado de cooperación de patentes WO2008/073628 , presentada el 5 de Noviembre de 2007; de la publicación de la solicitud de patente del tratado de cooperación de patentes WO PCT/US2008/065666 , presentada el 3 de Junio de 2008; de la de la publicación de la solicitud de patente del tratado de cooperación de patentes WO2008/103690, presentada el 20 de Febrero de 2008; de la publicación de la solicitud de patente de los Estados Unidos de América No. 2008/0027470, presentada el 2 de Julio de 2008; de la publicación de la solicitud de patente de los Estados Unidos de América No. 61/026,934, presentada el 7 de Febrero de 2008; las cuales son cada una incorporadas aquí por referencia en sus totalidades, particularmente con respecto al tratamiento de huesos; la promoción del crecimiento de hueso, periodontio, del ligamento, del cartílago, del aumento de hueso; los procedimientos artrodéticos ; el tratamiento de la columna vertebral; el tratamiento de la osteonecrosis (ONJ) o de la osteoradionecrosis de la quijada (ORNJ) ; el tratamiento de tendones o de lesiones de puño girador; o la osteogenésis de distracción. En adición a o como una alternativa a PDGF, cualquier otro polipéptido de interés puede ser administrado con el injerto de hueso para tratar, estabilizar, prevenir y/o retrasar un hueso, periodontio, cartílago o condición de tendón. Por tanto, la presente invención también proporciona métodos para tratar huesos (tal como hueso osteoporótico o lesionado) , fracturas de radio distal, cuerpos vertebrales, periodontio, ligamento o cartílago. Adicionalmente, la presente invención proporciona métodos para el aumento de hueso, los procedimientos artrodéticos; el tratamiento de osteonecrosis u osteoradionecrosis, el tratamiento de tendones o lesiones de puño girador, y la osteogenésis de distracción.

En una incorporación, un método para tratar un hueso comprende proporcionar una composición que comprende un polipéptido de interés y un injerto de hueso (tal como un polipéptido de interés colocado en un inserto de hueso) y aplicar la composición al hueso. En algunas incorporaciones, la aplicación de la composición al hueso lesionado puede comprender el moldear la composición a los contornos del hueso lesionado. Una composición, por ejemplo, puede ser moldeada en un sitio de fractura de hueso llenando por tanto el volumen creado por la fractura. Un método para tratar el hueso, en otra incorporación, comprende el proporcionar una composición que comprende a su vez un polipéptido de interés y un injerto de hueso, colocar la composición en una jeringa, e inyectar la composición en un sitio del hueso lesionado. En una incorporación, una composición que comprende un polipéptido de interés y un injerto de hueso puede ser inyectada en un volumen creado por una fractura de hueso. La inyección de la composición, en algunas incorporaciones, puede comprender el penetrar el tejido que rodea o cubre un sitio del hueso lesionado con la jeringa y depositar la composición en el sitio del hueso lesionado. En una incorporación, por ejemplo, una jeringa puede penetrar en la piel y el tejido subyacente, tal como el músculo, que cubre un sitio de fractura de hueso y subsecuentemente depositar una composición de la presente invención en y alrededor de la fractura. En tal incorporación, las técnicas invasivas usadas para exponer el sitio de fractura para el tratamiento, tal como las incisiones y la remoción del tejido pueden ser minimizadas.

En algunas incorporaciones, la composición es aplicada directamente a un sitio dañado y el polipéptido de interés es liberado para facilitar el sanado del hueso. En una incorporación, la composición de la presente invención puede ser aplicada directamente al hueso dañado, lesionado o fracturado. En otras incorporaciones, las composiciones de la presente invención pueden ser aplicadas a un hardware usado para facilitar la estabilización de fractura, por ejemplo clavos intramedulares , tornillos y otros equipos usados por un médico de una habilidad ordinaria en el arte, tal como la cirugía ortopédica. En otra incorporación, las composiciones pueden ser aplicadas a las aberturas en el hueso, tal como en los sitios de la evolución de fracturas, orificios para tornillos, orificios para recibir clavos intratnedularmente , o a los canales medulares.

Las composiciones de la presente invención son usadas para facilitar el sanado del hueso, incluyendo las fracturas de hueso, los defectos de hueso y las fusiones de hueso. Cualquier hueso puede ser tratado con las composiciones de la presente invención, incluyendo pero no limitándose al húmero, ulna, radio, fémur, tibia, fíbula, patela, huesos de tobillo, huesos de muñeca, cárpales, metacarpales , falanges, tarsales, metatarsales , costilla, esternón, vértebras, escápula, clavícula, pelvis, sacro y huesos craneofaciales . En algunas incorporaciones, el individuo tratado tiene osteoporosis .

La presente invención también proporciona métodos para el tratamiento de fracturas, daños o lesiones del radio, particularmente el radio distal y las estructuras anatómicas asociadas de la muñeca. Los presentes métodos pueden acelerar la respuesta de sanado en fracturas de radio distal, incluyendo la unión de hueso del sitio de fractura. Las fracturas del radio distal, de acuerdo a las incorporaciones de la presente invención, comprenden todos los tipos de fractura, incluyendo fracturas intra-articulares y extra-articulares, como se describió por el sistema de clasificación AO de las fracturas de radio distal. En algunas incorporaciones, una fractura de radio distal comprende una fractura tipo A (extra-articular) . En otras incorporaciones, una fractura de radio distal comprende la fractura tipo B (articular parcial) . En otra incorporación, una fractura de radio distal comprende una fractura de tipo Cl (articular completa, articular simple, y fractura metafisello) . En una incorporación adicional, una fractura de radio distal comprende una fractura tipo C2 (articular completa, articular simple con fractura de metafisello complejo) . En algunas incorporaciones, una fractura de radio distal comprende una fractura tipo C3 (articular completa, articular compleja y fractura de metafisello) .

En otra incorporación, un método para tratar una fractura del radio distal comprende el proporcionar una composición que comprende un polipéptido de interés y un injerto de hueso (tal como un polipéptido de interés colocado en un injerto de hueso) y aplicar la composición a una fractura en el radio distal. En algunas incorporaciones, la aplicación de la composición comprende el inyectar la composición adentro de la fractura del radio distal. En una incorporación la inyección comprende la inyección percutánea de la composición en el sitio de fractura. En otra incorporación, la composición es inyectada adentro de una fractura abierta o expuesta quirúrgicamente del radio distal. En otra incorporación, la aplicación comprende la colocación de la composición en la fractura con una espátula u otro dispositivo. En algunas incorporaciones, un método para tratar una fractura del radio distal además comprende el reducir la fractura y/o estabilizar la fractura. La reducción de la fractura, de acuerdo a algunas incorporaciones comprende la reducción abierta. En otras incorporaciones, la reducción de la fractura comprende la reducción cerrada. Además, la estabilización de la fractura de radio distal, en algunas incorporaciones, comprende aplicar un dispositivo de fijación externo o interno a la fractura, tal como una placa volar. En otra incorporación, un método para el tratamiento de una fractura de radio distal comprende el acelerar el nuevo llenado de hueso en la fractura, en donde la aceleración comprende el proporcionar una composición que comprende un polipéptido de interés y un injerto de hueso y aplicar la composición a la fractura.

La presente invención proporciona métodos útiles para tratar las estructuras de la columna vertebral incluyendo los cuerpos vertebrales. En algunas incorporaciones, son proporcionados métodos para promover la formación de hueso en el cuerpo vertebral. En otras incorporaciones, los métodos son proporcionados para prevenir o disminuir la posibilidad de fracturas de compresión de vértebras. En otra incorporación, los métodos son proporcionados para evitar o disminuir la posibilidad de fracturas de compresión vertebral secundaria asociadas con la vertebroplastía y la tifoplastía. Los presentes métodos son útiles para tratar los cuerpos vertebrales de los individuos con osteoporosis . En algunas incorporaciones, la presente invención proporciona métodos para promover la formación de hueso en un cuerpo vertebral comprendiendo el proporcionar una composición que comprende un polipéptido de interés y un injerto de hueso (tal como un polipéptido de interés colocado en un injerto de hueso) y aplicar la composición a por lo menos un cuerpo vertebral. La aplicación de la composición a por lo menos un cuerpo vertebral, en algunas incorporaciones, comprende el inyectar la composición adentro de por lo menos un cuerpo vertebral. En algunas incorporaciones, la composición puede ser aplicada a una pluralidad de cuerpos vertebrales. La aplicación de la composición en algunas incorporaciones, comprende el inyectar por lo menos un cuerpo vertebral con la composición. Las composiciones de la presente invención en algunas incorporaciones, son inyectadas adentro del hueso cancelous o un cuerpo vertebral . Los cuerpos vertebrales en lagunas incorporaciones comprenden cuerpos vertebrales toráxicos, cuerpos vertebrales lumbares, o combinaciones de los mismos. Los cuerpos vertebrales, en algunas incorporaciones, comprenden cuerpos vertebrales cervicales, cuerpos vertebrales cocigeales, el sacro o combinaciones de los mismos.

En otro aspecto, la presente invención proporciona métodos que comprenden evitar o disminuir la posibilidad de fracturas de compresión vertebral, incluyendo fracturas de compresión vertebral secundarias. La prevención o disminución de la posibilidad de las fracturas de compresión vertebral, de acuerdo a las incorporaciones de la presente invención comprenden el proporcionar una composición que comprende un polipéptido de interés en un injerto de hueso y aplicar la composición a por lo menos un cuerpo vertebral. En algunas incorporaciones, la aplicación de la composición a por lo menos un cuerpo vertebral comprende el inyectar la composición adentro de por lo menos un cuerpo vertebral. En una incorporación, la composición es aplicable a un segundo cuerpo vertebral, en algunos casos, a un cuerpo vertebral adyacente, subsecuente a la vertebroplastía o la quifoplastía de un primer cuerpo vertebral. En algunas incorporaciones, una composición que comprende un polipéptido de interés colocada en un injerto de hueso es aplicada a por lo menos un cuerpo vertebral de alto riesgo. Los "cuerpos vertebrales de alto riesgo" (HVB) , como se usó aquí, se refieren a los cuerpos vertebrales de las vértebras T5 a T12 así como Ll a L4 , las cuales son de gran riesgo de sufrir fracturas de compresión vertebral secundarias.

En algunas incorporaciones, una composición de la presente invención es aplicada a un segundo cuerpo vertebral subsecuente a la vertebroplastía o quifoplastía de un primer cuerpo vertebral. En algunas incorporaciones, el segundo cuerpo vertebral esta adyacente al primer cuerpo vertebral . En otras incorporaciones, el segundo cuerpo vertebral no esta adyacente al primer cuerpo vertebral. En una incorporación adicional, una composición de la presente invención es aplicada a un tercer cuerpo vertebral subsecuente a la vertebroplastía o la quifiplastía de un primer cuerpo vertebral. En algunas incorporaciones, el tercer cuerpo vertebral esta adyacente al primer cuerpo vertebral. En otras incorporaciones, el tercer cuerpo vertebral no esta adyacente al primer cuerpo vertebral .

Las incorporaciones de la presente invención adicionalmente contemplan la aplicación de las composiciones proporcionadas aquí a una pluralidad de cuerpos vertebrales, incluyendo los cuerpos vertebrales de alto riesgo, subsecüentes a la vertebroplastía o la quifoplastía de un primer cuerpo vertebral. Se entiende que los cuerpos vertebrales primero, segundo y tercero, como se usan aquí, no se refieren a ninguna posición específica en la columna vertebral como métodos para inhibir las fractura de compresión vertebral, incluyendo las fracturas de compresión secundaria, y que puedan ser aplicados a todos los tipos de cuerpos vertebrales incluyendo los cuerpos vertebrales toráxicos, los cuerpos vertebrales lumbares, los cuerpos vertebrales cervicales, los cuerpos vertebrales cocigeales y al sacro.

La invención también proporciona métodos para promover el crecimiento de hueso, periodontio, el ligamento o cartílago en un mamífero mediante el aplicar al hueso, al periodontio, al ligamento o cartílago una composición que comprende un polipéptido de interés y un injerto de hueso (tal como un polipéptido de interés colocado en un injerto de hueso) . En algunas incorporaciones, el método incluye el sanado del hueso, del periodontio, del ligamento o cartílago, y/o la regeneración de tales tejidos y estructuras. En algunas incorporaciones, el hueso, el periodontio, el ligamento o cartílago es dañado o herido y requiere la regeneración o el sanado .

La presente invención también proporciona métodos para llevar a cabo los procedimientos de aumento de hueso. En una incorporación, un método para llevar a cabo un procedimiento de aumento de hueso comprende el proporcionar una composición que comprende un polipéptido de interés y un injerto de hueso (tal como un polipéptido de interés colocado en un injerto de hueso) , y aplicar la composición a por lo menos un sitio del aumento de hueso deseado. En algunas incorporaciones, un método para llevar a cabo un procedimiento de aumento de hueso comprende el aplicar la composición a por lo menos un sitio de aumento de hueso en el maxilar o la mandíbula. En algunas incorporaciones, la composición esta empacada en un sitio de aumento de hueso deseado en el maxilar o mandíbula. En otra incorporación, el polipéptido de interés es aplicado al sitio de implantación antes, y opcionalmente después de la colocación de la composición comprendiendo el polipéptido de interés y el injerto de hueso adentro del sitio de implantación. Mediante el mejora el depósito del hueso en el maxilar o mandíbula, el borde arbolar puede ser incrementado como para subsecuentemente recibir un implanto . Tales implantes pueden ser usados para una variedad de propósitos, incluyendo como un soporte para un diente u otro dispositivo dental, y para varias aplicaciones orales o maxilofaciales , incluyendo huecos de extracción, elevación sinus y aumentación de borde.

La presente invención también proporciona métodos para llevar a cabo procedimientos artrodéticos . En una incorporación, un método para llevar a cabo un procedimiento artrodético comprende el proporcionar una composición que comprende un polipéptido de interés y un injerto de hueso (tal como un polipéptido de interés colocado en un injerto de hueso) y aplicar la composición a un sitio de fusión de hueso deseada en una junta. En algunas incorporaciones, un método para llevar a cabo un procedimiento artrodético comprende el aplicar la composición a un sitio de fusión de hueso deseada en una pluralidad de juntas. En algunas incorporaciones, la composición es empacada en un sitio de fusión de hueso deseada en una junta. En algunas incorporaciones, la composición puede ser empacada de manera que la composición este en contacto con el área de superficie completa de los huesos que van a ser fusionados en la junta. La composición también puede adicionalmente ser aplicada a la vecindad del sitio de fusión de hueso para reforzar adicionalmente la junta fusionada. En algunas incorporaciones, un método para llevar a cabo un procedimiento artrodétido además comprende el alinear la junta e insertar por lo menos un dispositivo de fijación, tal como un tornillo, dentro de por lo menos un grueso de la junta. En algunas incorporaciones, una pluralidad de tornillos son insertados en por lo menos un hueso de la junta. En otra incorporación, un método de la presente invención comprende el acelerar la unión de huesos en un procedimiento artrodético en donde la aceleración de la unión de hueso comprende proporcionar una composición que comprende un polipéptido de interés y un injerto de hueso (tal como un polipéptido de interés colocado en in injerto de hueso) y aplicar la composición a por lo. menos un sitio de fusión de hueso en una junta .

Los huesos en cualquier junta pueden ser fusionados usando las composiciones y los métodos de la presente invención. Tales juntas incluyen, pero no se limitan a juntas del pie, de los dedos, del tobillo, de la rodilla, de la cadera, de la espina, de la costilla, del esternón, la clavícula, de la junta, del hombro, de la escápula, del codo, de la muñeca, de la mano, de los dedos, de la quijada, y del cráneo. Deberá entenderse que la presente invención puede ser aplicada a cualquier sitio deseado para la atrodésis en el esqueleto espinal o apéndicular. En una incorporación de la presente invención, los procedimientos artrodéticos comprenden la artrodésis del pie y del tobillo incluyendo la artrodésis subtalar, la artrodésis talonavicular, la artrodésis triple y la artrodésis de tobillo.

La invención también proporciona métodos para tratar, prevenir o desacelerar la progresión de ONJ o de ORNJ. Las composiciones pueden ser administradas a través de cualesquier medios apropiados. En una incorporación, la administración de la composición comprende un polipéptido de interés y un injerto de hueso (tal como un polipéptido de interés colocado en un injerto de hueso) que puede ocurrir a través de la aplicación directa de la composición en el sitio deseado. En otra incorporación, la administración de la composición comprendiendo un polipéptido de interés y un injerto de hueso (tal como un polipéptido de interés colocado en un injerto de hueso) puede ocurrir a través de la aplicación directa de la composición en el sitio deseado. Tales sitios incluyen, pero no se limitan al maxilar, a la mandíbula, y su adnexia los cuales incluyen las estructuras alveolares, y cualquier otro hueso o tejidos suaves afectados por ONJ o por ORNJ. En la mandíbula, los sitios anteriores a la almohadilla retromolar pueden constituir un sitio deseado. Por ejemplo, cuando un campo quirúrgico es abierto en el maxilar o la mandíbula de un paciente con ONJ o con ORNJ, y un sitio necrótico es preparado, la composición puede ser aplicada a través de una entrega de jeringa, a través de una aguja o cánula, por aplicación directa con espátula, con fórceps, con cuchara u otros medios aceptables. En otras incorporaciones, cuando un sitio predictado como para ser vulnerable a ONJ o a ORNJ es identificado, el sitio puede ser expuesto quirúrgicamente y la composición puede ser aplicada, o la composición puede ser aplicada mediante jeringa e inyección de aguja a través de la piel en la cercanía del sitio deseado sin exponer quirúrgicamente el sitio en la mandíbula maxilar. En otras incorporaciones, la composición puede ser aplicada al sitio deseado a través de la administración percutánea directa.

En algunas incorporaciones, la composición es administrada concurrentemente con el procedimiento dental o en forma corta después del procedimiento dental. Por ejemplo, paciente en riesgo y teniendo un procedimiento quirúrgico dental tal como una extracción tiene la composición que contiene polipéptido, en una incorporación, administrada conjuntamente con, por ejemplo, un vendaje o medicamento de extracción dental. En aún otro ejemplo, este es una cistectomía oro-dental en donde la composición que contiene polipéptido es colocada en la cavidad cística. Aún otro ejemplo incluye un procedimiento periodontal en donde los tejidos gingivales fueron cortados y se llevó a cabo la cirugía alveolar y/o inter-radicular óseo dental y la composición que contiene polipéptido es administrada conjuntamente con el vendaje de terapia periodontal.

En algunas incorporaciones, la cantidad de la composición administrada es determinada por el volumen de hueso que se ha removido quirúrgicamente, por ejemplo de un soquete de extracción, de una cistrectomía o durante una cirugía de hueso periodontal . En algunas incorporaciones para el tratamiento profiláctico de ORNJ o de ONJ con una composición, puede ser considerada a un criterio de diagnóstico la determinación radiográfica del engrosamiento del ligamento periodontal.

La presente invención también proporciona métodos para la sujeción o la resujeción de tendones al hueso, el reforzamiento de la sujeción del tendón al hueso así como el tratamiento de los tendones, tal como los tendones que exhiben rasgado, deslaminación o cualquier otra deformación. En una incorporación, un método para volver a sujetar un tendón a un hueso comprende el proporcionar una composición que comprende una solución de PDGF colocada en una matriz biocompatible y aplicar la composición a por lo menos un sitio de resujeción de tendón sobre el hueso. En otra incorporación, un método de reforzamiento de la sujeción de un tendón a un hueso comprende el proporcionar una composición que comprende una solución PDGF colocada en una matriz biocompatible y aplicar la composición a por lo menos un sitio de sujeción del tendón al hueso. Los métodos de reforzamiento de sujeción de tendón al hueso, en algunas incorporaciones, ayudan a prevenir o a inhibir el desprendimiento de tendón del hueso, tal como las lesiones de puño giratorio .

La presente invención también proporciona métodos para tratar las rasgaduras de puño girador. En una incorporación, un método para tratar las rasgaduras de puño girador comprenden el proporcionar una composición que comprende un polipéptido de interés y un injerto de hueso (tal como un polipéptido de interés colocado en un injerto de hueso) y aplicar la composición a por lo menos un sitio de resujeción de tendón sobre la cabeza del húmero. En algunas incorporaciones, la aplicación de la composición en por lo menos un sitio de la resujeción del tendón puede comprender el moldear la composición a los contornos del sitio de resujeción en la cabeza del húmero. Una composición, por ejemplo, puede ser moldeada y formada en canal sobre una superficie de una cabeza de húmero para recibir el tendón desprendido. La composición puede ser aplicada en la cercanía del sitio de inserción del tendón adentro del hueso para reforzamiento adicional de la sujeción.

En algunas incorporaciones, un método para tratar rasgaduras de puño girador además comprende el colocar por lo menos unos medios de anclaje tal como un ancla de hueso en la cabeza de húmero, en donde la ancla de hueso además comprende un polipéptido de interés (tal como un polipéptido de interés colocado en un injerto de hueso) y acoplar por lo menos un tendón desprendido a dicha ancla de hueso. En las incorporaciones de la presente invención, los tendones pueden ser asegurados a las anclas de hueso a través de las suturas . Las suturas también pueden ser empapadas en soluciones de un polipéptido de interés (tal como PDGF) o recubierta en composiciones de polipéptido antes del uso.

En otra incorporación, un método para tratar un tendón comprende el proporcionar una composición que comprende un polipéptido de interés y un injerto de hueso (tal como un polipéptido de interés colocado en un injerto de hueso) y aplicar la composición a una superficie de por lo menos un tendón. En algunas incorporaciones, el por lo menos un tendón es un tendón lesionado o dañado, tal como un tendón que exhibe rasgado, deslaminación o cualquier otra deformación.

En algunas incorporaciones, un método para estimular y/o para acelerar la osteogenésis comprende el proporcionar una composición que comprende un polipéptido de interés y un injerto de hueso (tal como un polipéptido de interés colocado en un injerto de hueso) y aplicar una cantidad efectiva de la composición a por lo menos un sitio de distracción de hueso. En algunas incorporaciones, la composición comprende un polipéptido de interés y un injerto de hueso (tal como un polipéptido de interés colocado en un injerto de hueso) es aplicado durante la distracción de hueso. En otras incorporaciones, la composición es aplicada después de la distracción de hueso. En una incorporación, una cantidad efectiva de la composición es aplicada durante y después de la distracción de hueso.

La presente invención también proporciona métodos para acelerar la unión de hueso después de la distracción de hueso. En algunas incorporaciones, un método para acelerar la unión de hueso después de la distracción de hueso comprende el proporcionar una composición que comprende un polipéptido de interés y un injerto de hueso (tal como un polipéptido de interés colocado en un injerto de hueso) y aplicar una cantidad efectiva de la composición a por lo menos un sitio de la distracción de hueso .

La presente invención adicionalmente proporciona métodos para llevar a cabo los procedimientos de osteodistracción . En una incorporación, un método para llevar a cabo un procedimiento de osteodistracción comprende (a) dividir un hueso en un primer segmento de hueso y un segundo segmento de hueso, (b) mover por lo menos uno de los segmentos de hueso primero y segundo para producir un espacio entre los segmentos de hueso primero y segundo, y (c) estimular la osteogenésis en el espacio, en donde la osteogenésis estimulante comprende el proporcionar una composición de polipéptido de interés y un injerto de hueso (tal como un polipéptido de interés colocado en un injerto de hueso) y por lo menos colocar parcialmente una cantidad efectiva de la composición en el espacio. En algunas incorporaciones, los pasos (b) y (c) pueden ser repetidos tantas veces como sea necesario para alargar el hueso cualquier cantidad deseada .

En algunas incorporaciones de los métodos de la presente invención, la aplicación de la composición comprende inyectar la composición en un sitio de distracción de hueso. En una incorporación, la inyección comprende la inyección percutánea de la composición en el sitio de distracción. En otra incorporación, la composición es inyectada en un sitio abierto o quirúrgicamente expuesto de la distracción de hueso. En otra incorporación adicional, la aplicación de la composición comprende el colocar la composición en un sitio de la distracción de hueso con una espátula u otro dispositivo.

En algunas incorporaciones, una composición de la presente invención es aplicada a por lo menos un sitio de distracción de hueso durante la fase de distracción de un procedimiento de osteodistracción . En otras incorporaciones, una composición de la presente invención es aplicada a por lo menos un sitio de la distracción de hueso durante la fase de consolidación después de la distracción de hueso. En una incorporación adicional, es aplicada una composición de la presente invención a por lo menos un sitio de la distracción de hueso durante las fases de distracción y consolidación.

Como se proporcionó aquí, los procedimientos de ostodistracción, de acuerdo a las incorporaciones de la presente invención comprenden aquellas usadas en el tratamiento de hipoplasia mandibular bilateral, microsomía hemifacial, fémur corto congenital, hemimelia fiobular, hemiatrofía, acondroplasía, neurofibromatosis , piernas arqueadas, fracturas de placa de crecimiento, defectos de hueso, aplicaciones cranofaciales , ostomielitis , artritis séptica, y poliomielitis.

En algunas incorporaciones, el injerto de hueso es filtrado usando métodos estándar para asegurarse de que no esta contaminado con virus del donante. El tipo de hueso que va ser tratado puede ser el mismo, o diferente, del tipo de hueso que es usado como la fuente del injerto de hueso.

Los métodos de la presente invención pueden ser usados para tratar a cualquier individuo. Para el uso aquí a menos que se indique claramente de otra manera, un "individuo" se usó aquí e intenta un mamífero, incluyendo pero no se limita a un primate (por ejemplo un humano, un mono, gorila, chango, lémur, etc.), un bovino, un equino, una porcino, una oveja, un canino y un felino. Por tanto la invención encuentra uso en ambas la medicina humana y en el contexto veterinario, incluyendo el uso en animales agrícolas y animales domésticos . El individuo puede haberse diagnosticado con, se sospecha que tiene o que esta en riesgo de desarrollar una indicación, tal como un hueso, periodontio, ligamento, cartílago, o condición de tendón. El individuo puede exhibir uno o más síntomas asociados con la indicación. El individuo puede ser genéticamente o de otra manera predispuesto a desarrollar tal condición.

Como se usó aquí "en necesidad de" incluye los individuos que tienen una condición o enfermedad o están "en riesgo" de la condición de enfermedad. Como se usó aquí, un individuo "en riesgo" es un individuo quien esta en riesgo de desarrollar una condición. Un individuo "en riesgo" puede no tener una enfermedad o condición detectable, y puede o no tener una enfermedad detectable exhibida antes de entrar a los métodos de tratamiento descritos aquí . La frase "en riesgo" denota que un individuo tiene uno o más de los llamados factores de riesgo, los cuales son parámetros que pueden ser medidos que se correlacionan con el desarrollo de una enfermedad o condición y que se conocen en el arte . Un individuo que tiene uno o más de estos factores de riesgo tiene una probabilidad más alta de desarrollar la enfermedad o la condición que un individuo sin el factor o factores de riesgo. Estos factores de riesgo incluyen, pero no se limitan a la edad, el sexo, la raza, la dieta, la historia de enfermedades previas, la presencia de una enfermedad precursora, a la genética (consideraciones de herencia) y exposición ambiental.

Como se usó aquí "tratamiento" o el "tratar" es un acercamiento para tener resultados benéficos o deseados, incluyendo los resultados clínicos deseados. Para los propósitos de esta invención, los resultados benéficos o deseados clínicos incluyen, pero no se limitan a uno o más de los siguientes: disminuir los síntomas que resultan de la enfermedad, aumentando la calidad de vida de aquellos que sufren de la enfermedad, disminuyendo la dosis de otros medicamentos requeridos para tratar la enfermedad, y/o para retrasar la progresión de la enfermedad.

Como se usó aquí, "el retrasar el desarrollo de una enfermedad" significa el diferir, esconder, desacelerar, retardar, estabilizar y/o posponer el desarrollo de la enfermedad (tal como una condición de hueso, de periodontio, de ligamento, de cartílago, o de tendón) . Este retraso puede tener duraciones de tiempo variables dependiendo de la historia de la enfermedad y/o del individuo que esta siendo tratado. Como es evidente para un experto en el arte, un retraso suficiente o significante 4 puede, en efecto, abarcar la prevención de que el individuo no desarrolle la enfermedad.

Como se usó aquí, una "dosis efectiva" o "cantidad efectiva" de injerto de hueso, de polipéptido, de droga, de compuesto o composición farmacéutica en una cantidad suficiente para efectuar los resultados deseados o benéficos. Para uso profiláctico, los resultados benéficos o deseados incluyen los resultados tal como eliminar o reducir el riesgo, disminuir la severidad o retrasar el inicio de la enfermedad, incluyendo los síntomas bioquímicos, histológicos, y/o de comportamiento de la enfermedad, sus complicaciones y los fenotipos patológicos intermedios que se presentan durante el desarrollo de la enfermedad. Para el uso terapéutico, los resultados benéficos o deseados incluyen los resultados clínicos tal como la disminución de uno o más de los síntomas resultando de la enfermedad, aumentando la calidad de vida de aquellos que sufren de la enfermedad, disminuyendo la dosis de otros medicamentos requeridos para tratar la enfermedad, mejorando el efecto de otro medicamento tal como el tener como objetivo, el retrasar la progresión de la enfermedad y/o prolongar la supervivencia. Una dosis efectiva puede ser administrada en una o más administraciones. Para los propósitos de esta invención, una dosis efectiva de injerto de hueso, de polipéptido y de compuesto de droga o composición farmacéutica es una cantidad suficiente para lograr el tratamiento profiláctico o terapéutico ya sea directamente o indirectamente. Como se entendió en el contexto clínico, una cantidad efectiva del injerto de hueso, del polipéptido, de la droga, del compuesto o composición farmacéutica puede o no ser lograda en conjunción con otro injerto de hueso, polipéptido, droga, compuesto o composición farmacéutica. Por tanto una "dosis efectiva" puede ser considerada en el contexto de administrar uno o más agentes terapéuticos, y un agente único puede ser considerado para ser dado en una cantidad efectiva en conjunción con uno o más de otros agentes, un resultado deseado puede ser logrado.

Como se empleó aquí, "en conjunción con" se refiere a la administración de una modalidad de tratamiento "tal como un injerto de hueso" en adición a otra modalidad de tratamiento (tal como un polipéptido de interés) . Tal como, "en conjunción con" se refiere a la administración de una modalidad de tratamiento antes, durante o después de la administración de otra modalidad de tratamiento al individuo. En algunas incorporaciones, un injerto de hueso y un polipéptido de interés son administrados simultáneamente, en secuencia o concurrentemente. En algunas incorporaciones, el polipéptido de interés se aglutina o se coloca en el injerto de hueso antes de que ambos el polipéptido de interés y el injerto de hueso sean simultáneamente administrados a un individuo. En algunas incorporaciones, el injerto de hueso es administrado al individuo (con o sin la unión del polipéptido de interés) , y después el polipéptido de interés es administrado en o cerca del sitio del injerto de hueso en el individuo .

En algunas incorporaciones, las soluciones que comprenden el polipéptido de interés son formadas mediante el solubilizar el polipéptido de interés en uno o más amortiguadores. Los amortiguadores adecuados para el uso en las soluciones de polipéptido de la presente invención pueden comprender pero no se limitan a carbonatos, fosfatos, (por ejemplo, agua salda amortiguada- fosfato) histidina, acetatos (por ejemplo, acetato de sodio) , amortiguadores acídicos tal como el ácido acético y HC1, y los amortiguadores orgánicos tal como lisina, los amortiguadores Tris (por ejemplo, tris (hidroximetilo) aminoetano) , N-2 -hidroxietilpiperazina-N' -2 -ácido etanosulfónico (HEPES) , y 3- (N-morfolino) ácido propano sulfónico (MOPS) . Los amortiguadores pueden ser seleccionados con base en la biocompatibilidad con el polipéptido de interés y la capacidad del amortiguador para impedir la modificación de polipéptido indeseable. Los amortiguadores pueden adicionalmente ser seleccionados con base en la compatibilidad con los tejidos anfitriones. En una incorporación, el amortiguador de acetato de sodio es usado. Los amortiguadores pueden ser empleados a diferentes moles, por ejemplo alrededor de 0.1 mM a alrededor de 100 mM, alrededor de 1 m a alrededor de 50 mM, alrededor de 5 mM a alrededor de 40 mM, alrededor de 10 mM a alrededor de 30 mM, alrededor de 15 mM a alrededor de 25 mM, o cualquier molaridad dentro de estos rangos. En algunas incorporaciones, un amortiguador de acetato es empleado a una cantidad molar de alrededor de 20 mM. En otra incorporación, las soluciones que comprenden el polipéptido de interés pueden ser formadas mediante el solubilizar liofilizado el polipéptido de interés en agua, en donde antes de la solubilización el polipéptido de interés es liofolizado desde un amortiguador apropiado.

Las composiciones y los métodos se proporcionan por la presente invención pueden comprender un injerto de hueso y una solución del polipéptido de interés, en donde la solución es dispersada en el injerto de hueso. En algunas incorporaciones, el polipéptido de interés (tal como, PDGF) esta presente en la solución en una concentración variando de desde alrededor de 0.01 mg/ml a alrededor de 10.0 mg/ml, de desde alrededor de 0.05 mg/ml a alrededor de 5.0 mg/ml, o de desde alrededor de 0.1 mg/ml a alrededor de 1.0 mg/ml. En algunas incorporaciones preferidas, el polipéptido de interés esta presente en la solución a una concentración de 0.3 mg/ml. En otras incorporaciones, el polipéptido de interés esta presente en la solución a una cualquiera de las siguientes concentraciones: a alrededor de 0.05 mg/ml, a alrededor de 0.1 mg/ml, a alrededor de 0.15 mg/ml, a alrededor de 0.2 mg/ml, a alrededor de 0.25 mg/ml, a alrededor de 0.3 mg/ml, a alrededor de 0.35 mg/ml, a alrededor de 0.4 mg/ml, a alrededor de 0.45 mg/ml, a alrededor de 0.5 mg/ml, a alrededor de 0.55 mg/ml, a alrededor de 0.6 mg/ml, a alrededor de 0.65 mg/ml, a alrededor de 0.7 mg/ml, a alrededor de 0.75 mg/ml, a alrededor de 0.8 mg/ml, a alrededor de 0.85 mg/ml, a alrededor de 0.9 mg/ml, a alrededor de 0.95 mg/ml, ó a alrededor de 1.0 mg/ml. Se deberá entender que estas concentraciones son simplemente ejemplos de incorporaciones particulares y que las concentraciones del polipéptido de interés pueden estar dentro de cualquiera de los rangos de concentración declarados arriba o a cualquier otra concentración adecuada. Varias cantidades del polipéptido de interés pueden ser usadas en las composiciones de la presente invención. Las cantidades del polipéptido de interés que pueden ser usadas incluyen las cantidades en los siguientes rangos: alrededor de 1 µ a alrededor de 10 g a alrededor de 25 mg, alrededor de 100 g a alrededor 10 mg y alrededor de 250 g a alrededor 5 mg.

En algunas incorporaciones, alrededor de 1.5 mL de una solución de polipéptido de interés (tal como PDGF u otro factor de crecimiento) es combinado con alrededor de 2 centímetros cúbicos (ce) de injerto de hueso. En varias incorporaciones, la proporción de la cantidad de solución de un polipéptido de interés (tal como PDGF u otro factor de crecimiento) para el injerto de hueso es de alrededor de 1:2, 3:4, o de 1:1 (proporción de volumen líquido (mL a volumen seco (centímetro cúbico)). En algunas incorporaciones, la concentración del PDGF en la solución es de entre alrededor de 0.1 a alrededor de 1.0 mg/mL.

La concentración del polipéptido de interés (tal como PDGF u otros factores de crecimiento) en las incorporaciones de la presente invención puede ser determinada mediante el uso del inmuno ensayo enlazado de enzima como se describe en la patente de los Estados Unidos de América No. 6,221,625; en la patente de los Estados Unidos de América No. 5,747,273; y en la patente de los Estados Unidos de América No. 5,290,708 (las cuales son aquí incorporadas por referencia en sus totalidades, articularmente con respecto a los ensayos ELISA) o cualquier otro ensayo conocido en el arte para determinar la concentración de polipéptido. Aún cuando se proporcionan aquí la proporción molar de PDGF es determinada con base en el peso molecular del dímero PDGF (por ejemplo PDGF-BB, peso molecular de alrededor de 25 kDa) .

Las soluciones que comprenden el polipéptido de interés (tal como PDGF) , de acuerdo a las incorporaciones de la presente invención, pueden tener un pH variando de desde alrededor de 3.0 a alrededor de 8.0. En una incorporación, una solución que comprende polipéptido de interés tiene un pH variando de desde alrededor de 5.0 a alrededor de 8.0, más deseablemente de alrededor de 5.5 a alrededor de 7.0, más deseablemente de alrededor de 5.5 a alrededor de 6.5, o cualquier valor dentro de estos rangos. El pH de las soluciones que comprende el polipéptido de interés, en algunas incorporaciones, puede ser compatible con la estabilidad prolongada y la eficacia del polipéptido de interés o cualquier otro agente activo biológicamente deseado. Por ejemplo, el PDGF es generalmente más estable en un ambiente acídico. Por tanto, de acuerdo con algunas incorporaciones, la presente invención comprende una formulación de almacenamiento acídico de la solución de polipéptido (tal como una solución PDGF) . De acuerdo con algunas incorporaciones, la solución deseablemente tiene un pH de desde alrededor de 3.0 a alrededor de 7.0, y más deseablemente de desde alrededor de 4.0 a alrededor de 6.5. La actividad biológica del polipéptido de interés, sin embargo, puede ser optimizado en una solución teniendo un rango de pH neutral. Por tanto, en otras incorporaciones, la presente invención comprende una formulación de pH neutral de la solución de polipéptido. De acuerdo con esta incorporación, la solución de polipéptido deseablemente tiene un pH de desde alrededor de 5.0 a alrededor de 8.0, más deseablemente de desde alrededor de 5.5 a alrededor de 7.0, más deseablemente de desde alrededor de 5.5 a alrededor de 6.5.

En algunas incorporaciones, el pH del polipéptido conteniendo la solución puede ser alterado para optimizar las cinéticas de unión del polipéptido de interés a un sustrato matriz. Si se desea, al equilibrarse el pH del material al material adyacente, la unión del polipéptido de interés puede ser factible. El pH de las soluciones que comprenden el polipéptido de interés, en algunas incorporaciones, pueden ser controladas mediante los amortiguadores recitados aquí. Varios polipéptidos demostraron diferentes rangos de pH en los cuales estos son estables. Las estabilidades del polipéptido son primariamente reflejadas por los puntos isoeléctricos y los cambios en los polipéptidos. El rango de pH puede afectar la estructura de conformación de un polipéptido y la susceptibilidad del polipéptido para la degradación proteolítica, la hidrólisis, la oxidación y otros procesos que pueden resultar en la modificación para la estructura y/o la actividad biológica del polipéptido.

Las composiciones y los métodos de la presente invención de acuerdo a unas incorporaciones, pueden además comprender uno o más agentes biológicamente activos en adición al polipéptido de interés. Los agentes biológicamente activos de ejemplo incluyen las moléculas orgánicas, los materiales inorgánicos, los polipéptidos, los péptidos, los ácidos nucleicos (por ejemplo, los genes, los fragmentos de gen, los ácidos ribonucléicos de interferencia pequeña (siRNAs) , las secuencias reguladoras de gen, los factores de transcripción nucleares y las moléculas antisentido), las nucleoproteínas , los polisacaridós (por ejemplo, heparina) , las glicoproteínas y las lipoproteínas . Los ejemplos no limitantes de los compuestos biológicamente activos que pueden ser incorporados dentro de las composiciones de la presente invención incluyendo, por ejemplo, los agentes en contra del cáncer, los antibióticos, los analgésicos, los agentes en contra de la inflamación, los inmunosupresores , los inhibidores de enzima, los antihistamínicos , las hormonas, los relajantes de músculo, las prostaglandinas , los factores tróficos, los polipéptidos osteoinductivos, los factores de crecimiento, las vitaminas (tal como la vitamina D3) , los suplementos de calcio, los inhibidores de osteoclasto (por ejemplo, tal como los bisfosfonatos) y vacunas, están descritos en la publicación de la solicitud de patente de los Estados Unidos de América No. 2006/0084602, presentada el 23 de Junio de 2005 (la cual se incorpora aquí por referencia en su totalidad, particularmente con respecto a los agentes biológicamente activos) . En otras incorporaciones, las composiciones y los métodos de la presente invención pueden además comprender los medios de cultivo de célula, los polipéptidos estabilizantes tal como albúmina, agentes antibacterianos, los inhibidores proteasa (por ejemplo, el ácido etilendiaminatetraacético (EDTA) , el ácido etilen glicol-bis (beta-aminoetiléter) -?,?,?' ,?' -tetraacético (EGTA) , la aprotinina, el ácido E-aminocapróico (EACA) , etc.), el péptido o las moléculas orgánicas que contienen los inhibidores proteasa (tal como alfa 1 antitripsina (inhibidor de elastasa/tripsina) ovonucoide, el inhibidor pancreático, el amastin-HCl, inhibidores de metaloproteasa) , antidolor (inhibidor de proteasa cisteína y serina) , aprotinina (inhibidor de proteasa serina) ) , y/u otros factores de crecimiento tal como los factores de crecimiento de fibroblasto (FGFs) , los factores de crecimiento epidérmico (EGFs) , los factores de crecimiento transformante (TGFs) , los factores de crecimiento queratinocito (KGFs) , los factores de crecimiento tipo insulina (IGFs) , los factores de hemostasis tal como FXIII, losa polipéptidos morfogenéticos de hueso (BMPs) , u otros PDGFs incluyendo las composiciones de PDGF-AA, PDGF-BB, PDGF-AB, PDGF-CC y/o PDGF-DD. En algunas incorporaciones, las composiciones y los métodos de la invención además comprenden un agente estabilizante, tal como un polipéptido que es adherido por una o más proteasas asociadas con el injerto de hueso. En algunas incorporaciones, uno o más polipéptidos que son adheridos por una proteasa asociada con el injerto de hueso son agregados al injerto de hueso para reducir la cantidad de polipéptido de interés (tal como PDGF) que es adherido por la proteasa.

En algunas incorporaciones, las composiciones y los métodos de la invención además comprenden por lo menos un agente de contraste. En una incorporación, los agentes de contraste son opcionalmente combinados con las composiciones de la presente invención a fin de facilitar la visualización de la composición aplicada o inyectada. Los agentes de contraste de acuerdo a las incorporaciones de la presente invención son sustancias que operan para por lo menos parcialmente proporcionar diferenciación de dos o más tej idos del cuerpo cuando se forman imágenes . Los agentes de contraste, de acuerdo a algunas incorporaciones comprende los agentes de contraste catiónicos, los agentes de contraste aniónicos, los agentes de contraste no iónicos, o las mezclas de los mismos. En algunas incorporaciones, los agentes de contraste comprenden los agentes de contraste de radio opaco. Los agentes de contraste de radio opaco, los agentes de contraste radio opaco en algunas incorporaciones comprenden compuestos de iodo que incluyen (S)-N,N' -bis [2 -hidroxi- 1- (hisdroximetilo) -etilo] -2,4, 6-trioodo-5-lactamido-oisoftalamida (Iopadimol) y derivados de los mismos (vea por ejemplo la publicación de la solicitud de patente de los Estados Unidos de América No. 2007/0207185, presentada el 9 de Febrero de 2007 la cual se incorpora aquí por referencia en su totalidad, particularmente con respecto a los agentes de contraste) .

En algunas incorporaciones, por lo menos un agente (tal como un agente biológicamente activo, un inhibidor de proteasa, un agente de contraste) es administrado localmente . En tales incorporaciones, el agente puede ser incorporado en el injerto de hueso o de otra manera colocado en o alrededor de un sitio de un hueso para ser tratado. En otras incorporaciones, por lo menos un agente (tal como un agente biológicamente activo) es administrado sistemáticamente, oralmente, o intravenosamente a un individuo. En varias incorporaciones, uno o más inhibidores de proteasa son agregados al injerto de hueso, antes, durante o después de la adición del polipéptido de interés al injerto de hueso .

Equipos de Ejemplo En otro aspecto de la presente invención esta proporciona equipos que comprenden un primer recipiente que comprende un polipéptido de interés descrito aquí (tal como PDGF) y un segundo recipiente que comprende un injerto de hueso descrito aquí (tal como un injerto de hueso humano) . En algunas incorporaciones, el primer recipiente tiene una solución que comprende una concentración predeterminada de un polipéptido de interés (tal como PDGF) . La concentración del polipéptido de interés en algunas incorporaciones puede ser predeterminada de acuerdo a la naturaleza de la condición del hueso, periodontio, del ligamento, del cartílago o del tendón que esta siendo tratada. En algunas incorporaciones, el injerto de hueso comprende una cantidad predeterminada de acuerdo a la naturaleza del hueso, de la condición de periodontio, ligamento, cartílago o tendón que esta siendo tratado. En algunas incorporaciones, puede haber más de un recipiente que comprende diferentes tipos de injertos de huso. En algunas incorporaciones, la actividad de proteasa del injerto de hueso seleccionado es de menos de alrededor de 50 equivalentes de tripsina. En algunas incorporaciones, la actividad de proteasa del injerto de hueso es de entre alrededor de 50 a alrededor de 65 equivalentes de tripsina (tal como alrededor de 50 a alrededor de 55, alrededor de 55 a alrededor de 60 ó alrededor de 60 a alrededor de 65 equivalentes de tripsina) . En algunas incorporaciones, la actividad de proteasa del injerto de hueso seleccionado es de alrededor de 50, 55, 60 ó 65 equivalentes de tripsina. En algunas incorporaciones, la actividad de proteasa del injerto de hueso seleccionado es de menos de alrededor de 50 equivalentes de tripsina (tal como de menos de alrededor de 45, menos de alrededor de 40, menos de alrededor de 35, menos de alrededor de 30, menos de alrededor de 25, menos de alrededor de 20, menos de alrededor de 15, menos de alrededor de 10, menos de alrededor de 5, a alrededor de 0 equivalentes de tripsina). Una jeringa en algunas incorporaciones puede facilitar la dispersión de una solución del polipéptido de interés en el injerto de hueso para la aplicación en un sitio quirúrgico, tal como un sitio de un daño o lesión de hueso.

El equipo también puede contener instrucciones para el uso. Las instrucciones en relación al uso del injerto y del polipéptido de interés para tratar una condición de hueso, periodontio, ligamento, cartílago o tendón generalmente incluyen información en cuanto a la dosis, programa de dar la dosis y la ruta de administración para el tratamiento intentado. Los recipientes pueden ser dosis de unidad, paquetes de volumen (por ejemplo, paquetes de dosis múltiples) o dosis de unidades secundarias. Las instrucciones administradas en los equipos de la invención están típicamente escritos con instrucciones sobre una etiqueta o un inserto de paquete (por ejemplo, una hoja de papel incluida en el estuche o equipo) , pero las instrucciones que pueden ser leídas por la máquina por ejemplo, las instrucciones llevadas en un disco de almacenamiento óptico magnético) también son aceptables. La etiqueta o el inserto de paquete indican que la composición es usada para tratar, prevenir o retrasar el desarrollo de una condición de hueso, de periodontio, de ligamento, de cartílago, o de tendón descrita aquí. Las instrucciones pueden ser proporcionadas para practicar cualquiera de los métodos descritos aquí.

Los equipos de esta invención están en un empaque adecuado. Los empaques adecuados incluyen pero no se limitan a frascos, botellas, empaques flexibles (por ejemplo, bolsas de plástico o Mylar) y similares. Un equipo o recipiente puede 1 tener una lumbrera de acceso estéril (por ejemplo, un recipiente puede ser una bolsa de solución intravenosa o un recipiente teniendo un tapón que puede ser perforado por una aguja de inyección hipodérmica) . El equipo puede además comprender un agente biológicamente activo (en adición al polipéptido de interés), un agente de contraste, un inhibidor de proteasa, un amortiguador, o cualquier combinación de los anteriores.

Los siguientes son ejemplos proporcionados para ilustrar pero no en un sentido limitante de la invención.

EJEMPLOS Ejemplo 1. Aglutinamiento y liberación de PDGF desde una matriz de injerto de hueso congelado/secado ("FDBA") La figura 1 resume un protocolo de ejemplo para estudiar la unión y liberación del PDGF de un injerto de hueso. Para algunos experimentos, las cantidades fueron escaladas hacia abajo de dos o diez veces para conservar los materiales de injerto de hueso. En particular, 100 µ? de injerto de hueso humano (LifeNet, Inc.) fueron mezclados con 100 µ? de PDGF a una concentración de 0.3 mg/ml, en 20 mM de NaOAc, a un pH de 6.0 por diez minutos. El injerto de hueso consistió de partículas secas. El injerto de hueso fue congelado/secado antes de ser vendido (mencionado como un aloinjerto de hueso secado-congelado o FDBA) . Entonces, 200 µ? de NaCl (a varias concentraciones) en 20 mM de NaOAc, el pH de 6.0 o un agua salada amortiguada con fosfato (PBS) (sin NaOAc) fueron agregados. Diferentes concentraciones de NaCl fueron usadas para dar la concentración de final de NaCl listada en la figura 2. La solución fue entonces incubada por ya sea 1 hora o 24 horas. El PDGF en solución fue separado del injerto de hueso humano insoluble por centrifugación a -2000 x g por 6 minutos a 4 grados centígrados, y después la cantidad de rhPDGF-BB liberada de la matriz fue determinada por un ensayo ELISA Quantikine (R & D Systems, de Minneapolis, MN) usando las placas recubiertas con el receptor para el PDGF-BB humano. La figura 2 indica que una cantidad significante de PDGF fue liberada por la incubación de sal y la liberación es ambos rápida y dependiente de la sal.

La figura 3 indica que la liberación de PDFG es independiente del tiempo de mezclado y que la recuperación fue de 40-60 por ciento. En particular, el PDGF (0.5 mililitros de 0.3 miligramos/mililitros) fue incubado con el injerto de hueso congelado/secado (~ 0.5 mililitros) y se mezcló por 10 minutos, por 60 minutos, o durante la noche a la temperatura ambiente. Después 1 mililitro de 1 M de NaCl fue agregado como se describió anteriormente para la figura 1. La concentración de NaCl final fue de 667 mM. El PDGF fue separado del injerto de hueso mediante centrifugación a 15,334 x g por 2 minutos y el súper nadante conteniendo el PDGF fue analizado mediante SEC, mediante RPHPLC, mediante ELISA y mediante SDS-PAGE no reductor. El PDGF en el experimento de control fue normalizado a 100 por ciento, el rhPDGF-BB elutado del FDBA humano fue electroforéticamente no distinguible de una muestra de control del rhPDGF-BB por electroforesis de SDS-PAGE no reductora (los datos no están mostrados) . Además, el rhPDGF elutado del FDBA con el NaCl después de 10 minutos retuvo su biopotencia en comparación a la muestra de control de rhPDGF-BB como se determinó con un bioensayo a base de célula MG-63 estándar (datos no mostrados) . En PDGF liberado fue medido usando el ensayo ELISA estándar. El ensayo ELISA se llevó a cabo usando el inmunoensayo PDGF-BB humano Quantikinemarca re9istrada de R & D Systems, Inc., de acuerdo al protocolo del fabricante (vea por ejemplo, la red mundial en rndsystems.com/pdf/dbb0O.pdf). Brevemente, un receptor para PDGF-BB humano fue recubierto sobre una placa, entonces el PDGF fue unido y evaluado con un conjugado de anticuerpo-HRP secundario y la tetrametilbenzidina de cromógeno para detección. La figura 3 sugiere que algo del PDGF permanece unido al injerto de hueso. Alternativamente, las concentraciones de rhPDGF-BB en súper nadantes fueron determinadas usando el HPLC (SEC) de exclusión de tamaño sobre una columna de HPLC de 7.8 milímetros por 3 centímetros de TOSOH Biosep TSK-Gel y una precolumna de 6.0 milímetros por 4.0 centímetros de TOSOH Biosep TSK-Gel (Tosoh Bioscience, San Francisco, California) mediante la integración del perfil de elución del PDGF y usando la calibración a 5 concentraciones diferentes de PDGF estándar como se mostró en la figura 4C.

El SEC fue usado para cuantificar la cantidad de PDGF elutada desde la matriz de injerto de hueso congelado-secado y para analizar su estructura nativa y agregado (figuras 4A-4C, 5A, 5B, 6A y 6B) . El injerto de hueso (~ 1 mi) fue mezclado con PDGF (0.3 mg/ml; 1:1 vol/vol) , se elutó instantáneamente con 2 mililitros de 1 M de NaCl y se centrifugó a 15,334 g por 2 minutos. Los 100 µ? de súper nadantes fueron analizados por SEC. El SEC fue llevado a cabp usando la columna HPLC 7.8 milímetros por 30 centímetros de TOSOH BioswepTSK-gel con una columna de guarda de HPLC de 6.0 milímetros por 4.0 centímetros de TOSOH Biosep TSK-gel (TOSOH Bioscience, de San Francisco, California) con la fase móvil de 0.4 M de NaCl en 0.05 M de acetato de sodio, el pH de 4.0 a una taza de flujo de 0.8 milímetros/minuto a la temperatura ambiente. La figura 4C es una gráfica que muestra la calibración de la columna SEC.

El SEC mostró el tamaño nativo de PDGF y sus interacciones, el agregado de PDGF, y otros componentes de la muestra (figuras 4A y 4B) . Por ejemplo, así un nuevo pico de peso molecular alto aparece en el perfil SEC de injerto de hueso y el PDGF comparado al control de injerto de hueso o al control PDGF, entonces cualquier interacción de injerto de hueso con PDGF ocurrió y/o el PDGF mismo agregado en los conglomerados de dímeros debido a su interacción con el injerto de hueso. Un nuevo pico de peso molecular alto fue observado bajo ciertas condiciones. El perfil SEC fue independiente del tiempo de liberación y de la temperatura (figura 5A y 5B) . Estos cromatogramas muestran una elución significante de polipéptidos no específicos a temperaturas altas y tiempos de liberación más prolongados. La elución de PDGF permanece aproximadamente siendo la misma bajo las condiciones probadas para las figuras 5A y 5B. El perfil SEC también fue dependiente de muestra (figura 6A y 6B) .

Otros compuestos tal como el NEM y el ácido acético, fueron probados en el lugar de NaCl y también resultaron en la liberación de algo de PDGF desde el injerto de hueso congelado/secado .

Ejemplo 2. Unión y liberación de PDGF del injerto de hueso La figura 8 resume un protocolo de ejemplo para estudiar la unión y liberación del PDGF desde el injerto de hueso para diferentes lotes de injerto de hueso. Específicamente 0.5 mi de injerto de hueso humano fueron mezclados con 0.5 mililitros de PDGF a una concentración de 0.3 mg/ml, en 20 mM de NaOAc, a un pH de 6.0 por 1 hora. Después, un mililitro de 1 mM de NaCl en 20 mM de NaOAc, a un pH de 6.0 fue agregado. Después de agregar la sal, el súper nadante fue inmediatamente separado del injerto de hueso mediante centrifugación a 15,334 x g y se sometió a un análisis adicional (SEC, RPHPLC, y ELISA) . No hubo un efecto de género/edad estadísticamente significante del injerto de hueso humano sobre la liberación de PDGF (figuras 9A y 9B) . El PDGF fue cuantificado para las figuras 9A y 9B con base en el área pico total usando SEC y RPHPLC. La figura 10 mostró la recuperación de PDGF de los injertos de hueso medidos por ELISA o SEC como se describió en el ejemplo 1 para varias muestras de injerto de hueso. La cantidad original de PDGF usada en el experimento fue normalizada a 100 por ciento. Estos datos también se resumen en la figura 11 para 10 diferentes muestras de injerto de hueso.

El HPLC de fase invertida fue también usado para cuantificar la cantidad de PDGF y los cambios en su estructura debido al desdoblamiento proteolítico y/o a la modificación química (figuras 12 y 13A-13E) . Las muestras fueron reducidas por 200 mM de DTT y 4 M de guanidina HCL, el pH de 8.8 por 5 minutos a 50 grados centígrados. El HPLC de fase invertida se llevó a cabo usando una columna Vydac Ci8 de 5 µ?? 4.6 milímetros por 250 milímetros con un cartucho de protección de 5 µp? (de Grace Davison Discovery Sciences, de Hesperia, California) usando un gradiente de 24-80 por ciento de acetonitrilo en 0.06 por ciento de ácido trifluoroacético por 60 minutos a una tasa de flujo de 1.2 milímetros por minuto a 37 grados centígrados. La figura 12 ilustra varios fragmentos de PDGF posibles o polipéptidos químicamente modificados. Para las figuras 13A-13D, las corridas triplicadas fueron comparadas con un control de PDGF (figura 13E) .

Los productos de desdoblamiento de PDGF también fueron identificados usando ESI LC/MS sobre Thermo LCA Deca XP MAX, con un software Tune y Xcalibur después de la separacipon sobre la columna Vydac Ci8 de 5 µp? 4.6 milímetros por 250 milímetros con un cartucho de protección de 5 m (de Grace Davison Discovery Sciences, de Hesperia, California) usando las series Agilent 1100, con una bomba Agilent G1312A Bin, el Agilent G1329A ALS, el Agilent G1330B ALS, y el Agilent G13145A VWD. Los datos fueron adquiridos de m/z de 200-2000 para el modo MS (figuras 14A y 14B) .

Ejemplo 3. Unión y liberación de PDGF de un injerto de hueso La figura 16 resume un protocolo de ejemplo para estudiar la remoción de la actividad de proteasa del injerto de hueso. En particular, una mezcla de 1:1 (volumen/peso) de (i) 0.3 M de NaCl en 20 mM de NaOAc, a un H de 6.0 y (ii) una muestra de injerto de hueso humano 07-0720-A fueron incubados por 1 hora a 37 grados centígrados. Después, el injerto de hueso sólido fue sedimentado utilizando métodos estándar para separarlo del súper nadante líquido (extracto de injerto de hueso) . El sedimento de injerto de hueso sólido fue incubado con PDGF a 0.240 miligramos/mililitro, a 37 grados centígrados por ya sea 80 minutos o durante la noche. El súper nadante (el extracto de injerto de hueso) fue incubado con PDGF a 0.240 mg/ml a 37 grados centígrados por ya sea 0, 5, 10, 20, 40, 80 ó 160 minutos. El HPLC de fase invertida fue entonces llevado a cabo sobre las muestras como se describió en el ejemplo 2. Los perfiles HPLC de fase invertida de PDGF incubados por diferentes momentos con súper nadante (extracto de injerto de hueso) están mostrados en las figuras 17A-17E. El desdoblamiento de PDGF mediante el súper nadante/extracto de injerto de hueso fue dependiente del tiempo (figuras 18A y 18B) . Los perfiles HPLC de fase invertida de PDGF se incubaron por diferentes tiempos con el sedimento de injerto de hueso y están mostrados en las figuras 19A-19C. En las figuras 17A-17E y 19A-19C, el pico a 18.3 minutos representa el PDGF desdoblado. Las figuras 19A-19C indican la poca actividad de proteasa que permanece en el sedimento de injerto de hueso después de una elución de sal de 0.3 M.

Ejemplo 4. Unión y liberación de PDGF de un injerto de hueso Un ensayo de ejemplo para la actividad de proteasa está descrito abajo usando el equipo de ensayo proteasa QuantiCleavemarca de comercio, Pierce, catálogo # 23263. La muestra de injerto de hueso humano 07-0720 fue incubar incluida en una suspensión de 80 por ciento de injerto de hueso y 20 por ciento de ß-TCP (similar a aquella descrita en el ejemplo 1) . El amortiguador de ensayo fue preparado mediante el disolver el paquete amortiguador de borato BupH en 500 mi de agua DI para ser 50 m de borato, pH de 8.5. La solución de caseína succinilatada fue preparada mediante el disolver un recipiente (10 miligramos) de caseína succinilatada liofilizada en 5 mililitros de amortiguador de resuspensión de aloinjerto para hacer una solución de 0.2 miligramos/mililitro (esta solución puede ser usada por 48 muestras en una microplaca de 96 pozos) . La solución de suministro de tripsina fue preparada mediante el disolver la tripsina TPCK liofilizada en 1 mililitro de amortiguador de ensayo para hacer una solución de suministro de 50 mg/ml . Las partes alícuotas (10-560 L) de este suministro fueron congeladas y almacenadas a -80 grados centígrados. Un estándar de tripsina fue preparado mediante la dilución en serie del estándar de tripsina empezando de 10 g/ml . La solución de trabajo de TNBSA fue preparada mediante el agregar 100 pL de solución de suministro de TNBSA suministrada a 14.9 mililitros del amortiguador de ensayo. El amortiguador de resuspensión de aloinjerto (ARB) fue preparado mediante mezclar un volumen de 20 mM de NaOAc , a un pH de 6.0 con dos volúmenes de 20 mM de NaOAc y 1 M de NaCl. La solución de suministro de 100 mM de EDTA fue preparada mediante el pesar 2.92 gramos de EDTA y agregando 80 mililitros de agua. Esta solución de EDTA fue titrada con 2.5 M de NaOH a un pH de 7.00 y el volumen final fue ajustado a 100 mililitros .

El injerto de hueso de 80 por ciento y la suspensión de 20 por ciento de TCP fueron pesados (50, 25 ó 12-5 miligramos) en tubos centrífugos de 1.5 mililitros, y 200 pL de amortiguador de resuspensión de aloinjerto fueron agregados. La solución de sustrato (100 pL) fueron incubados con 50 pL de tripsina estándar o 50 pL de súper nadante de injerto de hueso (preparado como se describió en el ejemplo 2) y 200 pL del sustrato de caseína succinatada con mezclado a la temperatura ambiente por 20 minutos. El TNBS (50 pL) fueron agregados a cada estándar y el súper nadante. El TNBS (100 pL) fue agregado a cada suspensión de injerto de hueso. Las mezclas fueron incubadas por otros 20 minutos a la temperatura ambiente. Los injertos de hueso fueron centrifugados, y 200 pL de los súper nadantes resultantes fueron agregados a la microplaca con estándares de tripsina. La absorbencia a 450 nm fue medida sobre el lector de placa Spectramax (dispositivos moleculares) .

Para este ensayo, las siguientes muestras y controles fueron analizados. "A" denota un injerto de hueso de control sin un lavado. Un volumen complementario de ARB fue agregado justo antes de agregar el sustrato. "Ac" denota un control que es el mismo que "A" excepto porque un volumen igual de ARB fue agregado en vez del sustrato. "AW" denota un injerto de hueso incubado con 150 pL de ARB por 60 minutos a la temperatura ambiente y después lavado 3 veces con 1 mililitro de NaOAc, el pH de 6.0, el injerto de hueso fue separado del súper nadante ("AWS") después del girado a 15,344xg por 2 minutos y después ensayado como se hizo para el injerto de hueso solo (A) . Todos los controles (denotados por "c" en el nombre de muestra) fueron preparados igual que las muestras regulares, excepto que en vez del sustrato proteasa (solución de caseína succinilatada) solo el ARB fue agregado adentro de la mezcla de incubación. Estos controles dan cuenta de los péptidos elutados desde el injerto de hueso con ARB que dan señales positivas falsas con el ácido sulfónico de trinitrobenseno (TNBS, el cual reacciona específicamente con el grupo amino N-terminal de péptidos dando una señal a 450 nm) . Los valores de muestra de los cuales estos controles fueron sustraídos están mostrados en la figura 7. El "AWEc" denota un control que es el mismo como "AW" excepto porque un volumen igual de ARB fue agregado en vez de los sustratos . "AWES" denota el súper nadante desde la incubación inicial de "AWE" por 60 minutos con 100 L de ARB . El "AWEcSc" denota un control que es el mismo que "AWES" excepto porque un volumen igual de ARB fue agregado en vez del sustrato. Las muestras denotadas por "E" en el nombre de muestra fueron obtenidas como muestras AW y AWS excepto porque el ensayo proteasa se llevó a cabo en la presencia de 5 mM de EDTA (agregado con el sustrato proteasa en la mezcla de reacción) .

La figura 7 muestra la actividad proteasa medida usando este método. Las señales de los controles de sustrato de no proteasa fueron restados para generar los datos para esta figura ya que los péptidos entonces elutados desde el injerto de hueso produjeron una señal grande en el ensayo. La actividad de proteasa fue distribuida parejamente entre el súper nadante soluble desde el lavado de sal y el sedimento de injerto de hueso insoluble. La proteasa soluble se espera que exhiba cinéticas de desdoblado más rápidas debido a la difusión de sustrato mejorada en comparación a la proteasa insoluble restante sobre o en el injerto de hueso.

Ejemplo 5. Métodos de determinación de proteasa de ejemplo Sí se desea, los métodos estándar pueden ser usados para identificar una o más proteasas asociadas con el injerto de hueso y/o uno o más de otros polipéptidos presentes. En particular, los siguientes métodos permiten la identificación de la mayoría o de todos los polipéptidos asociados con el injerto de hueso. Estos polipéptidos pueden incluir una o más proteasas que pueden desdoblar un polipéptido de interés (tal como PDGF) .

En principio, los eluentes de sal del injerto de hueso preparados como se describió en el ejemplo 3 son concentrados a por lo menos ~ lOOx usando un dispositivo de ultrafiltración de 1000 Da de corte y después usando ya sea directamente en un experimento LC MS/MS de MudPIT (tecnología de identificación de proteína multidimensional) (red de ancho mundial en fields.scripps.edu/mudpit/ ó cshprotocols . cshlp . org/cgi/content/full/2006/28/pdb .prot4555 , los cuales se incorporan aquí por referencia en sus totalidades, particularmente con respecto a los métodos LC MS/MS) o separados sobre un SDS PAGE, cortado, digerido en gel con tripsina y seguido ya sea por LC MS/MS o determinación MALDI MS de polipéptidos usando los mismos protocolos estándar. En un experimento MudPIT, la muestra diluida es cargada sobre una columna capilar de intercambio iónico. Después las fracciones de la columna son separadas sobre una columna C18 y se inyectan en el espectómetro de masa. En algunas incorporaciones, la digestión de tripsina del elutado de injerto de hueso se lleva a cabo y después la mezcla resultante es analizada usando LC MS/MS.

Para confirmar los datos, múltiples métodos ortogonales fueron aplicados y referidos en forma cruzada. En algunas incorporaciones, la confirmación final de la identificación de proteasa es un experimento en el cual ambos un polipéptido de interés (tal como PDGF) como el sustrato y un sustrato de péptido específico para la proteína sospechada identificada como MS son usados. El desdoblamiento mediante el elutado de injerto de hueso se compara al desdoblamiento mediante proteasa sospechosa purificada comprada de un vendedor. En algunas incorporaciones, las proteasas múltiples contribuyen simultáneamente a la degradación proteolítica de un polipéptido de interés (tal como PDGF) .

Por ejemplo, el siguiente protocolo puede ser usado. Este protocolo de ejemplo involucra la separación de proteína SDS- PAGE, en digestión de tripsina de gel, y MALDI MS . Sí se desea, las muestras pueden ser escaladas hacia arriba o hacia abajo dependiendo de la concentración de proteasa presente en el injerto de hueso. 1) Pesar una parte alícuota de injerto de hueso (tal como LifeNet, # 07—720B-320) en un tubo cónico de 15 mililitros . 2) Agregar 1:1 volumen/peso de amortiguador de resuspensión, mezclar bien e incubar por 1 hora a la temperatura ambiente sobre un rotador. a. Para la preparación de un amortiguador de resuspensión, mezclar 1 volumen de 20 mM de una solución de NaOAc a 2 volúmenes de solución de 20 mM de NaOAc y 1 M de NaCl . 3) Hacer girar las muestras de aloinjerto de hueso y controles a una velocidad máxima por 2 minutos. 4) Concentrar el súper nadante usando un dispositivo de ultrafiltrado de 1000 dalton en 100 pL. 5) Correr el gel para probar respecto de la presencia de una proteasa. a. Combinar 10 pL de súper nadante de la muestra de injerto de hueso a 10 pL de amortiguador de muestra Laemmli (BioRad # 161-0737) . b. Incubar a 90 grados centígrados por 5 minutos. c. Hacer girar la muestra a 14 x g por 1 minuto. d. Cargar sobre 10 pozos 12 por ciento de gel Tris-HCI (BioRad # 161-1156) .

Correr a 200 V por ~ 30 minutos.

Lavar 3 veces con H20 por 20 minutos cada lavada . g. Manchar durante la noche con una mancha Coomassie (BioRad # 161-0786) . 6) procesar el gel usando métodos estándar.

En la digestión de tripsoma-gel para un análisis subsecuente por espectrometría de masa se puede llevar a cabo como sigue. Para este método, usar reactivos limpios de pureza más alta y dedicarlos a este procedimiento. La agitación y/o la sonicación no son necesarias .

Reactivos generales Los siguientes reactivos generales son usados. 1) Bicarbonato de amonio. Disolver 0.79 gramos en 100 mililitros de MilliQ agua, filtrar y esterilizar (opcional) y colocar en una botella tapada apretadamente. Reemplazar después de 1 mes. 2) Acetonitrilo . 3) Ditiotreitol . (DTT, 154.2 gramos/mol) hacer una solución fresca de 45 mM en un tubo de 1.5 mM mediante el pesar menos de 10 miligramos y agregar una cantidad apropiada de agua milliQ. El DTT es solo necesario si la muestra no se ha reducido previamente y alquilatado durante la electroforesis de gel 2D. 4) Iodoacetamida . (IA, 165 g/mol . Hacer 100 mM de solución fresca en un tubo de 1.5 mililitros mediante el pesar menos de 10 miligramos y agregar la cantidad apropiada de agua milliQ. El IA es solo necesario si la muestra no se ha reducido previamente y alquilatado durante la electroforesis de 2D gel. 5) Ácido trifluoroacético . (TFA) (ampolletas de 10 por 1 mililitro, de Pierce catálogo # 28904) . En una cubierta de humos, abrir una ampolleta de 1 mililitro y mezclar 50:50 con agua milliQ para una solución de suministro de 50 por ciento después diluir 1:5 en agua milliQ para hacer una solución de suministro de trabajo de 10 por ciento. Todo puede ser almacenado a -20 grados centígrados. 6) Tripsina modificada. (5 recipientes cada uno conteniendo 20 g de tripsina liofilizada; Promega catálogo # V5111, usando oro de tripsina) . Resuspender para hacer una solución de trabajo de 0.1 miligramos/mililitro de suministro. Cuidadosamente una parte alícuota de 10 por 20 \xL en tubos de 0.5 mililitros y almacenar a -20 grados centígrados.

Reactivos específicos para proteínas manchadas con plata Los siguientes reactivos son específicos para las proteínas manchadas con plata; ferricianido de potasio y tiosulfato de sodio. Disolver 50 miligramos de ferricianido de potasio y 80 miligramos de tiosulfato de sodio en 5 mililitros de agua milliQ en un tubo de 15 mililitros limpio. Esta solución no es estable y debe hacerse fresca cada vez y usada dentro de 30 minutos .

Reactivos específicos para concentración y limpieza de péptido Los siguientes son recomendados: una pipeta 10 \xL (una que contenga puntas de 10 pL) y puntas de pipeta de ZipTipC18 (Millipore catálogo # ZTC18S096) .

Soluciones de trabajo Las siguientes soluciones de trabajo usualmente solo requieren 1 mililitro para 10-20 reacciones.

Hacer fresca diariamente : 1) 50 mM de bicarbonato de amonio, 50 por ciento de acetonitrilo . Mezckar volúmenes iguales de 100 mM de bicarbonato de amonio y 100 por ciento de acetonitrilo. 2) 25 mM de bicarbonato de amonio. Combinar 250 pL de 100 mM de bicarbonato de amonio y 750 xL de agua milliQ. 3) 0.1 por ciento de ácido trifluoroacético (TFA) . Diluir 10 L, 10 por ciento de TFA en 990 uL de agua milliQ. 4) 60 por ciento de acetonitrilo, 0.1 por ciento de TFA. Combinar 600 pL de acetonitrilo, 390 xh de agua milliQ y 10 uL de 10 por ciento de TFA.

Las puntas de pipeta no requieren ser cambiadas entre las muestras para los pasos 1-6. Hay un riesgo mínimo de contaminación cruzada de muestras hasta que la proteasa tripsina ha entrado en las rebanadas de gel y comenzar a digerir las muestras. La agitación y/o la sonicación no son necesarias .

Paso 1. Escisión de Banda. Para los geles mojados, insertar la orilla de esquina de una cuchilla recta en la esquina superior de la banda y cortar hacia abajo a lo largo de la longitud de la banda (no deslizar la cuchilla a través del gel) . Es mejor el minimizar el exceso de gel y mejor el desperdiciar un poco de proteína si es necesario. Esto ayuda a reducir el antecedente (y aumentar la concentración de proteína global) cortar los lados de la banda; y después cortar la banda en cubos de 1 milímetro y colocar en un tubo de 0.5 mililitros. Para geles archivados en hojas de acetato, cortar bandas usando la orilla de esquina de una cuchilla recta y colocar en un tubo de 0.5 mililitros.

Paso 2. Equilibrio. Usar 100 ]iL de 50 mM de bicarbonato de amonio por 15 minutos. Para geles archivados en hojas de acetato, remover las piezas de acetato usando fórceps, remover la rebanada de gel rehinchada, cortar en cubos de 1 milímetro y colocar de nuevo en el tubo. Descartar el lavado.

Un paso separado no es necesario para desmanchar las proteínas manchadas de azul coomassie. Suficiente desmanchado es logrado durante los pasos de procesamiento 4-5.

Faso 3. Remoción de plata. (Adaptado de Gharahdaghi y otros, electroforesis 20:601) . Agregar 100 xL de solución de tiosulfato de sodio/ferricianida de potasio al tubo que contiene las rebanadas de gel y dejar asentar por 5 minutos (o más si el color café no es removido del gel) . Descartar solución y reemplazar con un exceso de (250 µ?.) 100 mM de bicarbonato de amonio por 10 minutos. Remover el bicarbonato de amonio y reemplazar con 100 mM de bicarbonato de amonio por 10 minutos . Repetir este lavado de bicarbonato de amonio hasta que la coloración amarilla desaparece de las rebanadas de gel. Descartar el último lavado.

Paso 4. Reducción/Alquilación . (Este paso puede ser brincado si las muestras vienen de un protocolo 2D el cual incluye la reducción y la alquilación. Agregar 150 L de 50 mM de bicarbonato de amonio para muestra. Agregar 10 L de 45 mM de DTT e incubar a 50 grados centígrados por 15 minutos. Después agregar (al mismo tubo) 10 L de 100 mM de iodo acetamida y colocar en la oscuridad a la temperatura ambiente por 15 minutos. Esto resulta en la carabamidometilación de los residuos de cisteína (adición neta de 57 daltons a cada residuo de cisteína) .

Paso 5. Equilibración/Deshidratación . Reemplazar el líquido 50-100 µ?? de 100 por ciento de acetonitrilo por 10 minutos o hasta que las rebanadas de gel se vuelven blancas (puede tener que repetirse una vez) . Remover el líquido y secar por 5 minutos en un centrífugo con vacío. Las rebanadas de gel deshidratadas pueden ser almacenadas por meses en tubos de 0.5 mililitros tapados a -20 grados centígrados.

Como un paso opcional, antes de 100 por ciento de acetonitrilo, remover el líquido y reemplazar con 100 pL de 50 por ciento de acetonitrilo, 25 mM de bicarbonato de amonio (1:1 mezcla con 50 mM de acetonitrilo) y dejar asentar por 15 minutos. Esto puede ser repetido una vez para remover además la mancha coomassie residual.

Paso 6. Digerir. Volver a hinchar la rebanada de gel deshidratada en 10-15 L de 0.01 g/ L de tripsina modificada (Promega) en 12.5 mM de bicarbonato de amonio. Diluir la cantidad apropiada de 0.1 mg/mL de solución de tripsina de suministro 1:10 en 12.5 mM de bicarbonato de amonio y agregar cuidadosamente 10-15 L por muestra. Este es un paso crítico cuando la tripsina entra en el gel; usar solo lo que es necesario para cubrir las rebanadas de gel. Es mejor el tener toda la solución entrando en el gel que el tener un exceso restante después de 20 minutos. La digestión es completada por 2 horas a 37 grados centígrados o puede ir durante la noche si es necesario.

Empezando con el paso 7, usar una punta de pipeta fresca para cada muestra.

Paso 7. Sobrecolocación . (Opcional). Sí es necesario, después de que toda la solución de tripsina se ha metido en la rebanada de gel (~ 20 minutos), agregar 12.5 mM de bicarbonato de amonio (sin tripsina adicional) a intervalos de 5 L hasta que la rebanada de gel esta justo cubierta (no agregar exceso) .

Paso 8. Extracción de péptido. Remover el súper nadante, el cual puede contener algunos de los péptidos que se han difundido fuera de las rebanadas de gel, a un nuevo tubo de 0.5 mililitros etiquetado. Los péptidos extraídos de la rebanada de gel con 15-25 L, 60 por ciento de acetonitrilo, 0.1 por ciento de TFA. Después de 15 minutos, remover el extracto y combinar con el súper nadante en nuevo tubo y repetir con una segunda extracción como se indicó arriba. Cuando se transfiere la segunda extracción adentro del nuevo tubo conteniendo la primera extracción y el súper nadante, tomar con pipeta hacia arriba y hacia abajo unas cuantas veces para asegurar un mezclado completo de los reactivos. Finalmente, secar el extracto y/o súper nadante en el nuevo tubo usando un centrífugo de vacío para sequedad, pero no dejar que este demasiado después de que el líquido se ha evaporado (los tiempos varían con diferentes centrífugos de vacío, y pueden tomar de desde 30-60 minutos usando los volúmenes listados arriba; verificar como sea necesario) .

Paso 9. Análisis de reconstitución y masa.

Disolver los péptidos en 4 µ?? de 0.1 por ciento de TFA. Las muestras pueden ser analizadas directamente por LC/MS. Las muestras abundantes pueden ser analizadas directamente por MALDI-TOF MS, menos muestras menos abundantes requieren limpieza y concentración usando puntas de pipeta ZipTipC18 (Millipore, catálogo # ZTC18S096) (requiere un dispositivo de pipeta de 10 pL) . a. Equilibrar punta en 60 por ciento de acetonitrilo, 0.1 por ciento TFA (2 por 10 L) . b. Lavar en 0.1 por ciento de TFA (2 por 10 pL) . c. Cargar hasta 10 L de muestra con el pipeteado respectivo (-5 veces). d. Lavar en 0.1 por ciento TFA (2 por 10 L) e. Elutar en 2 µ?> 60 por ciento de acetonitrilo, 0.1 por ciento de TFA con pipeteado repetitivo. (2 L colocado en un tubo fresco antes de la elución) .

Paso 10. Preparación de muestra para MALDI-TOF MS. Aplicar 0.4 L de mezcla de péptido a un objetivo MALDI y sobrecolocar con 0.4 pL de una matriz de ácido a-ciano-4-hidroxicinámico (5 miligramos/mililitro en 60 por ciento de acetonitrilo y 0.1 por ciento TFA, súper nadante con 1 mg/ml de citrato de amonio) .

MALDI-TOF MS. Las mezclas de péptido fueron analizadas mediante un tiempo de vuelo de desabsorción láser ayudado con matriz (MALDI-TOF) y espectrometría de masa Tándem TOF/TOF usando un espectómetro de masa Voyager 4700 (de Applied Biosystems, de Framingham, MA, Estados Unidos de América) . Los datos espectrales de masa, en la forma de mapas de masa de péptido de los iones de péptido moleculares intactos (M+H) así como los datos de fragmentación derivados de los iones de péptido individuales, fueron usados para interrogar las bases de datos de proteína Swiss-Prot y NCBInr para coincidencias de proteína estadísticamente significantes usando el software GPS Explorer (de Applied Biosystems) corriendo el motor de búsqueda MASCOT (Matrix Science) . Los iones de péptido autolíptico tripsina (m/z = 842.51m 2211.10) fueron usados para la calibración interna de los mapas de masa de péptido, permitiendo que las búsquedas se llevaran a cabo con exactitud de masa de menos de 20 partes por millón. Las búsquedas también permitieron por un desdoblamiento omitido, la carbamidometilación completa de sulfohidrilos cisteína, y la oxidación parcial de residuos de metionina.

Ejemplo 6. Análisis de componentes de Proteina en Aloinjertos de Hueso Humano Mineralizado mediante Espectrometría de Masa El objetivo de este estudio fue la identificación de los componentes principales de la fracción de péptido elutada de aloinjerto humano bajo las condiciones de elución de rhPDGF-BB desde este material y comparar mediante LC/MS/MS los perfiles de péptido de los elutados desde los aloinjertos con y sin actividad proteolítica, identificando los candidatos potenciales para proteasas que provocan el desdoblamiento de rhPDGF-BB.

Materiales y Equipo Los siguientes materiales fueron usados para llevar a cabo la prueba: Materiales de Prueba y Lote Número Hueso Cortical Molido, tamaño de partícula * * 250 -1000 Fabricante = LifeNet BN: 07 -0720 Hueso Cortical Molido, tamaño de partícula = = 250 -1000 pm, Fabricante - LifeNet BN: 07 -2518 Hueso Cortical Molido, tamaño de partícula = = 250 -1000 µ??, Fabricante = LifeNet BN: 06 -5726 Hueso Cortical Molido, tamaño de partícula = = 250 -1000 µp?, Fabricante = LifeNet BN: 06 -1247 Las siguientes muestras fueron usadas para llevar a cabo la prueba : Suministros Catálogo Número Filtros centrífugos 1000 MWCO Catálogo pall # OD001C41 Reactivo A de ensayo de proteína BCA Catálogo Pierce H 23228 Reactivo B de ensaya de proteina BCA Catálogo Pierce f) 1859078 Estándar de Albúmina, 2.0 mg/ml» Catálogo Pierce ff 23209 Cloruro de Sedio (NaCl) , clase reactiva c Catálogo Fisher # 5271-10 equivalente Acido tricloroacético <TCA) , clase ACS o Catálogo Sigma-Aldrich # T6399-SG equivalente Acetona Catálogo Burdick and Jackson # 67- 54-1 JSppendor International 1,5 IBL Catálogo VWR # 89000-040 Tubo de prueba microestándar o equivalente Tris íhidroximetA ) aminometano [Base Catálogo Fisher # BP152-500 Tris) ] Urea Catálogo Fisher # 3P169-S0O Agua, clase HPLC o equivalente Catálogo J.T. Baker # 4218-02 Solución TCEP Bond Breaker"1"" Ar- "^"0 Catálogo Fisher # 77720 Iodoacetamida (IAA) Catálogo Sigma-Aldrich # 11149-2SG Cloruro de Calcio (CaCla) Catálogo Sigma-Aldrich £ C5670- 100G Ácido Hidrociórico (KClj , clase ACS o Catálogo EMD 8 HX0607-1 equivalente Acido Fórmico Catálogo EMD ft 11670-1 Sílice Ahumada, 360 OD, 100 ID Catálogo Polymc.ro Technologies § TSP10O375 etanol, clase HPLC o equivalente Catálogo VWR # JT9033-Q3 Kasil l, silicato de potasio PQ Corporation Formamida Catálogo Sigma-Aldrich H F-S786 Oro Tripsina Catálogo Prcmega V5280 Ácido de acetato Glacial, clase de Catálogo Fisher # 8PU8S-500 secuencia o equivalente Ácido Fórmico, 0.1 por ciento en agua, Catálogo VWR 8 JT9834-03 clase HPLC o equivalente Ácido Fórmico, 0.1 por ciento en Catálogo VWR íf JT9832-02 acetonitrilo, ciase HPLC o equivalente El siguiente equipo fue usado para llevar a cabo prueba : Preparación de Muestra Con la determinación de la identidad de los picos no conocidos, las muestras de aloinjerto de hueso humano fueron escogidas para se sometidas a un análisis MuDPIT más extenso. Cada muestra de aloinjerto fue mezclada con 1:3 (peso/volumen) de 20 mM de NaOAc, un pH de 6.0 (no conteniendo rhPDGF-BB) , y permitiendo el incubar por 1 hora a RT. Después de la incubación, las muestras fueron centrifugadas a 14,000 revoluciones por minuto.

El súper nadante fue removido y se dividió entre dos tubos de 1.5 L y se centrifugó a 14,000 revoluciones por minuto por 1 minuto. El súper nadante fue entonces removido de cualquier partículas de aloinjerto y se agregó al filtro de 1000 MWCO y se centrifugó a 4750 revoluciones por minuto durante la noche o hasta que la muestra fue concentrada a ~ 100 pL. Después de la concentración las muestras fueron congeladas a -80 grados centígrados.

La concentración de cada muestra fue determinada por un ensayo de proteína BCA, usando albúmina como el estándar. Una curva de calibración fue hecha usando la albúmina desde 1-1200 pg/mL. Las muestras fueron diluidas mediante varios grados usando el amortiguador de muestra (07-0720 diluido 1:2 $ 1:4, 07-2518 diluido 1:10, 06-5726 diluido 1:10, y 06-1247 diluido 1:4). El análisis BCA de cada muestra se llevó a cabo y los volúmenes de cada muestra se determinaron a ser iguales a 50 g.

Las muestras fueron entonces usadas en la precipitación TCA. 1/3 del volumen corriente determinado para 50 g para cada muestra fue entonces diluido hasta 200 L con 25 por ciento TCA. Las muestras fueron incubadas a 4 grados centígrados por 1 hora. Después de la incubación las muestras fueron centrifugadas a 4 grados centígrados por 30 minutos a 14,000 revoluciones por minuto. El súper nadante fue descartado. Las muestras fueron lavadas con 500 µ?? de acetona fría y se giraron a alrededor de nuevamente 14,000 revoluciones por minuto a 4 grados centígrados por 30 minutos. Una vez de nuevo el súper nadante fue descartado y el lavado fue repetido. La pelotilla de proteína no se pegó al lado del tubo fácilmente, de manera que el súper nadante fue removido tanto como es posible y la muestra se dejo secar en un centrífugo de vacío.

Después de completar el paso de secado, las muestras fueron suspendidas de nuevo en 40 L de 8 M de urea y 100 mM de Tris-HCl, a un pH de 8.5. A esta solución fueron agregados 0.4 pL de 500 mM de TCEP y se incubaron por 20 minutos a la temperatura ambiente. Después de la incubación, las muestras de proteína fueron alquilatadas con 0.8 L de 500 mM de iodo acetamida y se incubaron por 20 minutos en la oscuridad. Las muestras fueron entonces diluidas con 120 pL de 100 mM Tris-HCl pH de 8.5. A las muestras fueron agregadas 1.6 L 100 mM de CaCl2 y 0.5 g de tripsina y se incubaron para la digestión durante la noche a 37 grados centígrados. La siguiente mañana las muestras fueron removidas inmediatamente de la incubador y se colocaron a -80 grados centígrados.

Procedimiento RPHPLC El sistema HPLC fue puesto de acuerdo a las siguientes condiciones: cantidad de inyección: 12.5 g; Tiempo de corrida: ~ 120 minutas/pulsación; Gradiente: Tiempo 0: por ciento A (100), por ciento B (0), 500 L/minuto; Tiempo 10: por ciento A (100), por ciento B (0), 500 pL/minuto; Tiempo 10.5: por ciento A (100), por ciento B (0), 300 L/minuto; Tiempo 115: por ciento A (60), por ciento B (40), 300 pL/minuto; Tiempo 115.1: por ciento A (100), por ciento B (0), 300 pL/minuto; Tiempo 120: por ciento A (100), por ciento B (0), 300 L/minuto; .

Procedimiento MS El instrumento fue afinado usando el instrumento y la característica de autoafinación de software sobre el pico 433 de angiotensin. Los parámetros de instrumento fueron determinados por la característica de afinado automático sobre el instrumento, y están incluidos en el apéndice.

Las puntas fueron jaladas de 100 µp? de sílice fundida ID. La columna de fase-reversa frontal fue empacada con 5 m de resina Júpiter C18 y se empacaron apretadamente usando una celda de presión. La punta fue empacada y se sujetó de regreso a 20 centímetros (la misma columna analítica fue usada para todas las cuatro muestras.

Para la preparación de la columne MuDPIT, una pieza larga de sílice fusionada fue enjuagada bajo presión con metanol y se secó. La sílice fusionada fue entonces cortada en piezas de 20 centímetros. 170 pL de Kasil fueron combinados con 30 pL de formamida y se pusieron a vértice por 30 segundos. La sílice fusionada fue colocada en la mezcla kasil (la acción capilar crea el frito) . La sílice Kasil-infusionada fue entonces horneada a 100 grados centígrados por 4 horas. Después del procedimiento de horneado el frito fue recortado a 0.5 centímetros. La columna fue entonces empacada con 3-4 centímetros de resina SCX Luna con una celda de presión; la resina fue empacada con metanol bajo presión. Otros 3-4 centímetros fueron entonces empacados con una resina C18 Júpiter usando la celda de presión. La columna fue entonces equilibrada con 0.1 por ciento de ácido fórmico por 5 minutos .

Antes de cargar la muestra sobre la columna, 40 pL de la muestra fueron removidos del congelador y se enfriaron con 1.5 pL de ácido fórmico. 12.5 pg fueron entonces agregados a la columna MuDPIT a través de celda de presión. La columna MuDPIT fue entonces colocada en línea hacia arriba de la columna analítica .

El análisis MuDPIT consistió de una serie de pulsaciones de sal de las cuales 5 L de 0 mM, 25 m , 50 mM, 75 mM, 100 mM, 150 mM, 200 mM, 300 mM, 500 mM, 750 mM, y 1000 mM fueron inyectados sobre la muestra. Para cada pulsación de sal, el gradiente fue usado como se mostró en el gradiente HPLC anterior .

Resultados Los resultados del análisis MuDPIT fueron complejos, con altos niveles de proteínas endógenas tal como colágeno o queratina. Los lotes de aloinjerto tuvieron el siguiente número de "acierto" de cada proteína en las muestras específicas, en donde proteína fue identificada de una base de datos con base en una secuencia de péptido confirmada: /0720 (2218); /1247 (755); /2518 (2197); /5726 (929). Los aloinjertOS 07-0720 y 07-2518 contuvieron considerablemente más proteínas/péptidos que los aloinjertos 06-5726 y 06-1247. Los aloinjertos 07-0720 y 07-2518 también son los dos lotes que mostraron niveles superiores de desdoblamiento proteolítico de rhPDGF-BB cuando los dos son combinados.

Una comparación se hizo con base en las anotaciones de gen ontología (GO) (http: //amigo . geneontology . org/cgi-bin/amigo/browse . cgi, base de liberación de base de datos GO 2009-07-02) lo cual hace comparaciones de proteínas con base en la función molecular, el proceso biológico o el componente celular. Los aloinjertos los cuales mostraron niveles altos de actividad de desdoblamiento proteolítico (07-0720-07-2518) tuvieron un porcentaje superior de proteínas que participaron en unión de ácido nucleico, actividad catalítica, actividad de transductor de señal, y unión de ión (vea la figura 21) . En contraste, los aloinjertos que no mostraron el desdoblamiento proteolítico (figuras 21C y 21D) tuvieron un porcentaje superior de proteínas que son parte de los componentes estructurales de tisú. Esto sugiere que algunos aloinjertos no están limpiados suficientemente como otros, dejando proteínas/péptidos atrás que reaccionan negativamente hacia cualquier ingrediente activo potencial. Las proteínas que constituyen más de 5 por ciento de por lo menos una muestra de aloinjerto (queratina, colágeno y albúmina de suero) fueron comparados (figura 22) . Las muestras que tuvieron menos proteínas/péptidos (y no tuvieron actividad proteolítica) tienen porcentajes supriores de estas proteínas, mientras que los lotes de aloinjerto "más contaminados" tuvieron concentraciones más bajas de estas proteínas.

Tres proteasas (Cathepsin G, matriz proteinasa-9 , Chymase) , o las proteínas conocidas porque provocan el desdoblamiento, fueron encontradas en las muestras 07-0720 y 07-2518 y no fueron detectadas en las muestras 06-5726 y 06-1247.

Los aloinjertos 07-0720y 07-2518 también tuvieron un porcentaje superior de otras proteínas/péptidos elutados desde los aloinjertos en el HPSEC comparado a aquellos elutados de los aloinjertos 06-5726 y 06-1247: 87.72 y 90.10 por ciento, respectivamente. En forma inversa, los aloinjertos 06-5726 y 06-1247, tuvieron 86.14 y 80.03 por ciento de otros péptidos/proteínas respectivamente, mediante HPSEC.

El perfil RPHPLC de aloinjerto 07-0720 no es idéntico a 07-2518, sugiriendo el desdoblamiento proteolítico que puede haber ocurrido por diferentes proteasas entre las dos muestras.

Aún cuando la invención anterior se ha descrito en algún detalle por vía de ilustración y ejemplo para propósitos de claridad de entendimiento, es evidente para aquellos expertos en el arte el que ciertos cambios y modificaciones menores pueden ser practicados. Por tanto, la descripción y los ejemplos no deben considerarse como limitantes del alcance de la invención.

Todas las referencias, publicaciones, patentes y solicitudes de patente descritas aquí son incorporadas aquí por referencia en su totalidad.

Como se usó aquí, la forma singular de "un", "una", y "el" incluyen las referencias plurales a menos que se indique de otra manera .

La referencia a "alrededor" un valor o parámetro aquí incluye (y describe) incorporaciones que están dirigidas a ese valor o parámetro por sí mismo. Por ejemplo, la descripción refiriéndose a "alrededor de X" incluye la descripción de "X" .

Se entiende que el aspecto y variaciones de la invención descritas aquí incluye "consistiendo" y/o "consistiendo esencialmente" de aspectos y variaciones.

Claims

R E I V I N D I C A C I O N E S

1. Un método para seleccionar un injerto de hueso para la administración a un individuo en conjunción con un polipéptido de interés que comprende el medir la actividad de proteasa asociada con un injerto de hueso, por lo que la cantidad de actividad de proteasa asociada con el injerto de hueso determina sí el injerto de hueso es seleccionado para la administración al individuo en conjunción con el polipéptido de interés.

2. El método tal y como se reivindica en la cláusula 1, caracterizado además porque comprende administrar el injerto de hueso seleccionado y el polipéptido de interés al individuo.

3. El método tal y como se reivindica en la cláusula 1, caracterizado porque la actividad proteasa de dos o más injertos de hueso es medida, y el injerto de hueso con la actividad de proteasa más baja es administrado al individuo en conjunción con el polipéptido de interés.

4. El método tal y como se reivindica en una cualquiera de las cláusulas 1-3, caracterizado porque la actividad de proteasa del injerto de hueso seleccionado es de menos de alrededor de 50 equivalentes tripsina.

5. El método tal y como se reivindica en una cualquiera de las cláusulas 1-3, caracterizado porque la medición de la actividad de proteasa asociada con el injerto de hueso comprende : (a) remover por lo menos una parte de la cantidad total de una proteasa asociada con el injerto de hueso desde el injerto de hueso; y (b) medir la cantidad de un sustrato de polipéptido que es desdoblado por la proteasa removida, determinando por tanto la cantidad de actividad de proteasa asociada con el injerto de hueso.

6. El método tal y como se reivindica en la cláusula 5, caracterizado porque el paso (a) comprende aumentar la resistencia iónica de la solución comprendiendo el injerto de hueso y la proteasa.

7. El método tal y como se reivindica en la cláusula 6, caracterizado porque el paso (a) comprende incubar el injerto de hueso y la proteasa en una solución de sal.

8. El método tal y como se reivindica en la cláusula 7, caracterizado porque la solución de sal es una solución NaCl .

9. El método tal y como se reivindica en la cláusula 8, caracterizado porque la solución de sal contiene entre alrededor de 0.15 M NaCl y alrededor de 1.5 M NaCl .

10. El método tal y como se reivindica en la cláusula 9, caracterizado porque la solución de sal contiene alrededor de 0.3 M de NaCl .

11. El método tal y como se reivindica en la cláusula 5, caracterizado porque el paso (b) comprende separar el sustrato de polipéptido desdoblado, el sustrato de polipéptido no desdoblado, y el injerto de hueso.

12. El método tal y como se reivindica en la cláusula 11, caracterizado porque la cromatografía de líquido de alto desempeño es usada para separar el sustrato de polipéptido desdoblado, el sustrato de polipéptido no desdoblado y el injerto de hueso.

13. El método tal y como se reivindica en la cláusula 11, caracterizado porque la cromatografía de exclusión de tamaño es usada para separar el sustrato de polipéptido desdoblado, el sustrato de polipéptido no desdoblado y el injerto de hueso.

1 . El método tal y como se reivindica en una cualquiera de las cláusulas 1-4, caracterizado porque la medición de la actividad de proteasa asociada con el injerto de hueso comprende el medir la cantidad de un sustrato de polipéptido que es desdoblada por una actividad proteasa asociada con el injerto de hueso.

15. El método tal y como se reivindica en la cláusula 14, caracterizado porque la medición de la cantidad del sustrato de polipéptido desdoblado comprende: (a) incubar el sustrato de polipéptido con el injerto de hueso, (b) remover por lo menos una parte de la cantidad total de sustrato de polipéptido desdoblado del injerto de hueso, (c) medir la cantidad de sustrato de polipéptido desdoblada.

16. El método tal y como se reivindica en la cláusula 15, caracterizado porque el paso (b) comprende aumentar la resistencia iónica de la solución que comprende el injerto de hueso y el sustrato de polipéptido.

17. El método tal y como se reivindica en la cláusula 16, caracterizado porque el paso (b) comprende incubar el injerto de hueso y el sustrato de polipéptido en una solución de sal .

18. El método tal y como se reivindica en la cláusula 16, caracterizado porque la solución de sal es una solución NaCl.

19. El método tal y como se reivindica en la cláusula 18, caracterizado porque la solución de sal contiene entre alrededor de 0.15 M y alrededor de 2.0 M NaCl .

20. El método tal y como se reivindica en la cláusula 19, caracterizado porque la solución de sal contiene alrededor de 0.6 M de NaCl .

21. El método tal y como se reivindica en la cláusula 15, caracterizado porque el paso (c) comprende el separar el sustrato de polipéptido desdoblado, el sustrato de polipéptido no desdoblado y el injerto de hueso.

22. El método tal y como se reivindica en la cláusula 21, caracterizado porque la cromatografía de líquido de alto desempeño es usada para separar el sustrato de polipéptido desdoblado, el sustrato de polipéptido no desdoblado y el injerto de hueso .

23. El método tal y como se reivindica en la cláusula 21, caracterizado porque la cromatografía de exclusión de tamaño es usada para separar el sustrato de polipéptido desdoblado, el sustrato de polipéptido no desdoblado y el injerto de hueso.

24. El método tal y como se reivindica en una cualquiera de las cláusulas 5-23, caracterizado porque el polipéptido de interés y el sustrato de polipéptido son los mismos .

25. El método tal y como se reivindica en una cualquiera de las cláusulas 5-23, caracterizado porque el polipéptido de interés y el sustrato de polipéptido son diferentes.

26. El método tal y como se reivindica en una cualquiera de las cláusulas 1-25, caracterizado porque el polipéptido de interés es una plaqueta derivada del factor de crecimiento (PDGF) .

27. Un método para seleccionar un injerto de hueso para la administración a un individuo en conjunción con PDFG que comprende el seleccionar un injerto de hueso con una actividad proteasa de menos de alrededor de 50 equivalentes tripsina para la administración a un individuo en conjunción con PDGF.

28. Un método para medir la actividad de proteasa asociada con el injerto de hueso, el método comprende: (a) remover por lo menos una parte de la cantidad total de la proteasa asociada con el injerto de hueso desde el injerto de hueso; y (b) medir la cantidad de sustrato de polipéptido que es desdoblada por la proteasa removida, determinando por tanto la cantidad de actividad proteasa asociada con el injerto de hueso.

29. El método tal y como se reivindica en la cláusula 28, caracterizado porque el paso (a) comprende aumentar la resistencia iónica de la solución que comprende el injerto de hueso y la proteasa.

30. El método tal y como se reivindica en la cláusula 29, caracterizado porque el paso (a) comprende incubar el injerto de hueso y la proteasa en una solución de sal.

31. El método tal y como se reivindica en la cláusula 30, caracterizado porque la solución de sal es una solución NaCl .

32. El método tal y como se reivindica en la cláusula 31, caracterizado porque la solución de sal contiene entre alrededor de 0.15 M NaCl y alrededor de 1.5 NaCl.

33. El método tal y como se reivindica en la cláusula 32, caracterizado porque la solución de sal contiene alrededor de 0.3 de NaCl .

34. El método tal y como se reivindica en la cláusula 28, caracterizado porque el paso (b) comprende el separar el sustrato de polipéptido desdoblado, el sustrato de polipéptido no desdoblado y el injerto de hueso.

35. El método tal y como se reivindica en la cláusula 34, caracterizado porque la cromatografía de líquido de alto desempeño es usada para separar el sustrato de polipéptido desdoblado, el sustrato de polipéptido no desdoblado y el injerto de hueso.

36. El método tal y como se reivindica en la cláusula 34, caracterizado porque la cromatografía de exclusión de tamaño es usada para separar el sustrato de polipéptido desdoblado, el sustrato de polipéptido no desdoblado y el injerto de hueso.

37. El método tal y como se reivindica en una cualquiera de las cláusulas 28-36, caracterizado porque el sustrato de polipéptido es PDGF.

38. Un método para medir la actividad de proteasa asociada con el injerto de hueso, el método comprende: (a) remover por lo menos una parte de la cantidad total de una proteasa asociada con el injerto de hueso desde el injerto de hueso mediante el incubar el injerto de hueso en una solución que contiene alrededor de 0.15 M de NaCl a alrededor de 1.5 M de NaCl; y (b) medir la cantidad de PDGF que es desdoblada mediante la proteasa removida, determinando por tanto la cantidad de actividad de proteasa asociada con el injerto de hueso.

39. Un método para medir la actividad proteasa asociada con el injerto de hueso, el método comprende el medir la cantidad de un sustrato de polipéptido que es desdoblada por una actividad de proteasa asociada con el injerto de hueso.

40. El método tal y como se reivindica en la cláusula 39, caracterizado porque la medición de la cantidad de sustrato de polipéptido desdoblada comprende: (i) incubar el sustrato de polipéptido con el injerto de hueso; (ii) remover por lo menos una parte de la cantidad total de sustrato de polipéptido desdoblado del injerto de hueso; y (iii) medir la cantidad de sustrato de polipéptido desdoblado.

41. El método tal y como se reivindica en la cláusula 40, caracterizado porque el paso (ii) comprende aumentar la resistencia iónica de la solución que comprende el injerto de hueso y el sustrato de polipéptido.

42. El método tal y como se reivindica en la cláusula 41, caracterizado porque el paso (ii) comprende incubar el injerto de hueso y el sustrato de polipéptido en la solución de sal .

43. El método tal y como se reivindica en la cláusula 42, caracterizado porque la solución de sal es una solución NaCl .

44. El método tal y como se reivindica en la cláusula 43, caracterizado porque la solución de sal contiene entre alrededor de 0.15 M y alrededor de 2.0 M de NaCl .

45. El método tal y como se reivindica en la cláusula 44, caracterizado porque la solución de sal contiene alrededor de 0.6 M de NaCl .

46. El método tal y como se reivindica en la cláusula 40, caracterizado porque el paso (iii) comprende el separar el sustrato de polipéptido desdoblado, el sustrato de polipéptido no desdoblado y el injerto de hueso.

47. El método tal y como se reivindica en la cláusula 46, caracterizado porque la cromatografía de líquido de alto desempeño es usada para separar el sustrato de polipéptido desdoblado, el sustrato de polipéptido no desdoblado y el injerto de hueso .

48. El método tal y como se reivindica en la cláusula 46, caracterizado porque la cromatografía de exclusión de tamaño es usada para separar el sustrato de polipéptido desdoblado, el sustrato de polipéptido no desdoblado y el injerto de hueso.

49. El método tal y como se reivindica en una cualquiera de las cláusulas 39-48, caracterizado porque el sustrato de polipéptido es PDGF.

50. Un método para medir la actividad de proteasa asociada con el injerto de hueso, el método comprende: (i) incubar PDGF con el injerto de hueso, (ii) remover por lo menos una parte de la cantidad total de PDFG desdoblada desde el injerto de hueso, y (iii) medir la cantidad de PDGF desdoblada.

51. Un método para disminuir la actividad de proteasa asociada con el injerto de hueso que comprende el remover por lo menos una parte de la cantidad total de una proteasa asociada con el injerto de hueso desde dicho injerto de hueso .

52. El método tal y como se reivindica en la cláusula 51, caracterizado además porque comprende medir la cantidad de proteasa que permanece asociada con el injerto de hueso .

53. El método tal y como se reivindica en una cualquiera de las cláusulas 51-52, caracterizado porque la remoción de la proteasa comprende aumentar la resistencia iónica de la solución comprendiendo el injerto de hueso y la proteasa.

5 . El método tal y como se reivindica en la cláusula 53, caracterizado porque la remoción de la proteasa comprende incubar el injerto de hueso y la proteasa en una solución de sal.

55. El método tal y como se reivindica en la cláusula 54, caracterizado porque la solución de sal es una solución NaCl.

56. El método tal y como se reivindica en la cláusula 55, caracterizado porque la solución de sal contiene entre alrededor de 0.15 M de NaCl y alrededor de 1.5 M de NaCl .

57. El método tal y como se reivindica en la cláusula 56, caracterizado porque la solución de sal contiene alrededor de 0.3 M de NaCl.

58. Un método para disminuir la actividad proteasa asociada con el injerto de hueso que comprende el remover por lo menos una parte de la cantidad total de una proteasa asociada con el injerto de hueso desde el injerto de hueso mediante el incubar el injerto de hueso en una solución de sal que contiene alrededor de 0.15 M de NaCl a alrededor de 1.5 M de NaCl.

59. Un método para tratar a un individuo, el método comprende administrar un injerto de hueso y un polipéptido de interés a un individuo, en donde el injerto de hueso se ha seleccionado con base en el nivel de actividad de proteasa.

60. El método tal y como se reivindica en la cláusula 59, caracterizado porque por lo menos una parte de la cantidad total de la proteasa asociada con el injerto de hueso se ha removido del injerto de hueso antes de administrar el injerto de hueso al individuo.

61. El método tal y como se reivindica en la cláusula 59, caracterizado porque la actividad de proteasa de dos o más injertos de hueso es medida, y el injerto de hueso con la actividad de proteasa más baja es administrado al individuo en conjunción con el polipéptido de interés.

62. El método tal y como se reivindica en una cualquiera de las cláusulas 59-61, caracterizado porque la actividad de proteasa del injerto de hueso seleccionado es de menos de alrededor de 50 equivalentes tripsina.

63. El método tal y como se reivindica en una cualquiera de las cláusulas 59-62, caracterizado porque el seleccionar el injerto de hueso con un nivel aceptable de actividad de proteasa comprende: (i) remover por lo menos una parte de la cantidad total de la proteasa asociada con el injerto de hueso desde el injerto de hueso; y (ii) medir la cantidad de un sustrato de polipéptido que es desdoblada por la proteasa removida, determinando por tanto la cantidad de actividad de proteasa asociada con el injerto de hueso.

64. El método tal y como se reivindica en la cláusula 63, caracterizado porque el paso (i) comprende aumentar la resistencia iónica de la solución que comprende el injerto de hueso y la proteasa.

65. El método tal y como se reivindica en la cláusula 64, caracterizado porque el paso (i) comprende incubar el injerto de hueso y la proteasa en una solución de sal.

66. El método tal y como se reivindica en la cláusula 65, caracterizado porque la solución de sal es una solución NaCl .

67. El método tal y como se reivindica en la cláusula 66, caracterizado porque la solución de sal contiene entre alrededor de 0.15 M de NaCl y alrededor de 1.5 M de NaCl .

68. El método tal y como se reivindica en la cláusula 67, caracterizado porque la solución de sal contiene alrededor de 0.3 M de NaCl .

69. El método tal y como se reivindica en la cláusula 63, caracterizado porque el paso (ii) comprende el separar el sustrato de polipéptido desdoblado, el sustrato de polipéptido no desdoblado y el injerto de hueso.

70. El método tal y como se reivindica en la cláusula 69, caracterizado porque la cromatografía de líquido de alto desempeño es usada para separar el sustrato de polipéptido desdoblado, el sustrato de polipéptido no desdoblado y el injerto de hueso.

71. El método tal y como se reivindica en la cláusula 69, caracterizado porque la cromatografía de exclusión de tamaño es usada para separar el sustrato de polipéptido desdoblado, el sustrato de polipéptido no desdoblado y el injerto de hueso.

72. El método tal y como se reivindica en una cualquiera de las cláusulas 59-62, caracterizado porque el seleccionar el injerto de hueso con un nivel aceptable de actividad de proteasa comprende el medir la cantidad de sustrato de polipéptido que es desdoblada por la actividad de proteasa asociada con el injerto de hueso.

73. El método tal y como se reivindica en la cláusula 72, caracterizado porque la medición de la cantidad de sustrato de polipéptido desdoblada comprende: (i) incubar un sustrato de polipéptido con el injerto de hueso; (ii) remover por lo menos una parte de la cantidad total del sustrato de polipéptido desdoblado desde el injerto de hueso,- y (iii) medir la cantidad de sustrato de polipéptido desdoblado.

74. El método tal y como se reivindica en la cláusula 73, caracterizado porque el paso (ii) comprende aumentar la resistencia iónica de la solución que comprende el injerto de hueso y el sustrato de polipéptido.

75. El método tal y como se reivindica en la cláusula 74, caracterizado porque el paso (ii) comprende incubar el injerto de hueso y el sustrato de polipéptido en una solución de sal .

76. El método tal y como se reivindica en la cláusula 75, caracterizado porque la solución de sal es una solución NaCl .

77. El método tal y como se reivindica en la cláusula 76, caracterizado porque la solución de sal contiene entre alrededor de 0.15 M y alrededor de 2.0 M de NaCl .

78. El método tal y como se reivindica en la cláusula 77, caracterizado porque la solución de sal contiene alrededor de 0.6 M de NaCl .

79. El método tal y como se reivindica en la cláusula 73, caracterizado porque el paso (iii) comprende el separar el sustrato de polipéptido desdoblado, el sustrato de polipéptido no desdoblado y el injerto de hueso.

80. El método tal y como se reivindica en la cláusula 79, caracterizado porque la cromatografía de líquido de alto desempeño es usada para separar el sustrato de polipéptido desdoblado, el sustrato de polipéptido no desdoblado y el injerto de hueso.

81. El método tal y como se reivindica en la cláusula 79, caracterizado porque la cromatografía de exclusión de tamaño es usada para separar el sustrato de polipéptido desdoblado, el sustrato de polipéptido no desdoblado y el injerto de hueso .

82. El método tal y como se reivindica en una cualquiera de las cláusulas 63-81, caracterizado porque el polipéptido de interés y el sustrato de polipéptido son los mismos .

83. El método tal y como se reivindica en una cualquiera de las cláusulas 63-81, caracterizado porque el polipéptido de interés y el sustrato de polipéptido son diferentes.

84. El método tal y como se reivindica en una cualquiera de las cláusulas 59-83, caracterizado porque el polipéptido de interés es PDGF.

85. Un método para tratar a un individuo, el método comprende administrar un injerto de hueso y PDFG a un individuo, en donde la actividad proteasa del injerto de hueso es de menos de alrededor de 50 equivalentes tripsina.

86. Un método para tratar a un individuo, el método comprende administrar un injerto de hueso y un polipéptido de interés a un individuo, en donde por lo menos una parte de la cantidad total de una proteasa asociada con el injerto de hueso se ha removido del injerto de hueso.

87. El método tal y como se reivindica en la cláusula 86, caracterizado además porque comprende medir la cantidad de proteasa que permanece asociada con el injerto de hueso.

88. El método tal y como se reivindica en una cualquiera de las cláusulas 86-87, caracterizado porque el remover por lo menos una parte de la cantidad total de una proteasa asociada con el injerto de hueso comprende aumentar la resistencia iónica de la solución que comprende el injerto de hueso y la proteasa.

89. El método tal y como se reivindica en la cláusula 88, caracterizado porque la remoción de por lo menos una parte de la cantidad total de una proteasa asociada con el injerto de hueso comprende el incubar el injerto de hueso y la proteasa en una solución de sal.

90. El método tal y como se reivindica en la cláusula 89, caracterizado porque la solución de sal es una solución de NaCl .

91. El método tal y como se reivindica en la cláusula 90, caracterizado porque la solución de sal contiene entre alrededor de 0.15 M de NaCl y alrededor de 1.5 M de NaCl.

92. El método tal y como se reivindica en la cláusula 91, caracterizado porque la solución de sal contiene alrededor de 0.3 M de NaCl.

93. El método tal y como se reivindica en una cualquiera de las cláusulas 86-92, caracterizado porque el polipéptido de interés es PDGF.

94. Un método para tratar a un individuo, el método comprende administrar un injerto de hueso y PDGF a un individuo, en donde por lo menos una parte de la cantidad total de una proteasa asociada con el injerto de hueso se ha removido del injerto de hueso mediante el incubar el injerto de hueso en una solución de sal. R E S U M E N La invención propone injertos de hueso (tal como aloinjertos de hueso) con una actividad proteasa reducida. Estos injertos de hueso son útiles por ejemplo en conjunción con un polipéptido de interés (tal como una plaqueta derivada del factor de crecimiento) para tratar, estabilizar, prevenir y/o retrasar una condición de hueso, periodontio, ligamento, cartílago o tendón en in individuo (tal como un humano) . Adicionalmente, la invención proporciona métodos para medir la actividad de proteasa asociada con el injerto de hueso, reduciendo el nivel de actividad de proteasa asociado con el injerto de hueso, seleccionar un injerto de hueso con un nivel aceptable de actividad de proteasa y los métodos de administrar un injerto de hueso y un polipéptido de interés a un individuo.