MX2011004909A - Composiciones y metodos para inhibir la expresion de genes del factor vii. - Google Patents

Abstract

La invención está relacionada con un ácido ribonucleico de doble cadena (ARNds) para inhibir la expresión del gen del factor VII. La invención también está relacionada con una composición farmacéutica que comprende las moléculas de ARNds o de ácido nucleico o vectores que codifican lo mismo junto con un transportador farmacéuticamente aceptable; métodos para tratar enfermedades causadas mediante la expresión del gen del factor VII utilizando la composición farmacéutica; y métodos para inhibir la expresión del factor VII en una célula.

Description

COMPOSICIONES Y METODOS PARA INHIBIR LA EXPRESION DE GENES DEL FACTOR VII Descripción de la Invención Esta invención está relacionada con ácidos ribonucleicos de doble cadena (ARNds) , y su uso en la mediación de la interferencia de ARN para inhibir la expresión del gen del factor VII, en particular en la inhibición de la expresión del zimógeno del factor VII en el hígado y posteriormente disminuir los niveles en plasma del zimógeno del factor VII. Además, el uso de los ARNds es parte de la invención para tratar/prevenir un amplio intervalo de enfermedades/trastornos tromboembólicos que están asociados con la activación de los factores de coagulación Vlla, IXa, Xa, Xlla, trombina, como la trombosis arterial y venosa, inflamación, arteriosclerosis y cáncer.

El factor VII (FVII) es una glucoproteína dependiente de la vitamina K que participa en la iniciación de la ruta extrínseca de la coagulación sanguínea. El FVII se sintetiza en el hígado y circula principalmente en plasma como un zimógeno inactivo de cadena sencilla. Tras unirse al factor tisular (TF, por sus siglas en inglés) expuesto por el daño vascular, el FVII se escinde en su forma activa de dos cadenas (FVIIa) mediante la escisión de un enlace peptídico único que resulta en una cadena ligera de 20-kDa y una cadena Ref.219457 pesada de 30-kDa. La cadena ligera de FVIIa comprende dos dominios similares al factor de crecimiento epidérmico (EGF-1, EGF-2) y un ácido ?-carboxiglutámico (Gla) que permite la unión de calcio, lo que provoca un cambio conformacional en la molécula, que expone nuevos epítopos y que facilita su posterior unión al TF. La cadena pesada contiene el dominio catalítico que es estructuralmente homólogo a las otras serina proteasas de la coagulación. El complejo TF: FVIIa a su vez activa el FIX y FX mediante escisión proteolítica limitada que conduce a la formación de trombina y finalmente a un coágulo de fibrina.

El gen humano del FVII se expresa en hepatocitos pero el estado basal del nivel de ARNm del FVII es muy bajo. La secuencia completa del FVII humano se ha inferido a partir de un clon de ADNc de longitud completa (Hagen F. S., et al . , Proc. Nati. Acad. Sci . USA (1986) 83:2412-2416). Los niveles elevados del FVII se han asociado con factores de riesgo independientes para el desarrollo de enfermedad cardiovascular. En los pacientes con hipercolesterolemia el nivel del FVII se ha correlacionado independientemente con variables proinflamatorias como la proteína C-reactiva (CRP, por sus siglas en inglés) o citocinas (IL-6) . No obstante, no todos los estudios han confirmado el FVII como un factor de riesgo independiente en las enfermedades coronarias (Lowe G. D. 0. et al., Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol . (2004) 24 :1529-1534) .

El complejo TF:FVIIa juega un papel crítico en la compleja relación entre la coagulación y las respuestas inflamatorias. Además de su papel bien conocido en la coagulación, el complejo TF:FVIIa también induce cambios intracelulares como la transducción de señales que afectan a los procesos celulares como la inflamación, angiogénesis y la patofisiología del cáncer y de la aterosclerosis .

Las evidencias en los experimentos conceptuales en modelos animales han demostrado que la inhibición específica de FVIIa o una reducción del nivel de zimógeno del FVII en plasma resulta en un efecto antitrombótico y antiinflamatorio sin aumentar la propensión al sangrado (Xu H., et al., J. Pathol . (2006) 210:488-496). En modelos de septicemia, se observó la inhibición de la activación de la coagulación inducida por endotoxina, la reducción de la expresión de mediadores inflamatorios interleucina-6 (11-6), IL-8 y la prevención de la mortalidad en monos tratados tanto con un FVIIa con el sitio activo inactivado (Taylor F. et al., Blood. (1998) 91:1609-1615) como con un fragmento Fab monoclonal frente a FVIl/VIIa (Biemond B. J. et al., Thromb. Haemost. (1995) 73:223-230). El FVIIa con el sitio activo inactivado mostró también poderosas propiedades antiinflamatorias en la pancreatitis aguda experimental (Andersson E. et al., Scand. J. Gastroenterology (2007) 42: 765-770), previniendo la infiltración en tejidos de neutrófilos en los pulmones, íleo y colon y reduciendo los marcadores inflamatorios como la IL-6 y la proteína inflamatoria de macrófagos-2 (MIP-2) .

Además, la inyección intraarticular de complejo TF:,FVIIa en ratones, induce la infiltración de monocitos en el tejido sinovial seguido de la destrucción de cartílago y hueso. La gravedad de la artritis se redujo significativamente en ratones mutantes de TF indicando que los complejos TF/FVII, se encuentran frecuentemente de forma intraarticular en las articulaciones de los pacientes con artritis reumatoide, es un componente importante en la inducción y la progresión de artritis destructiva crónica. (Yang Y. H. et al., Am. J. Pathol . (2004) 164:109-117).

Si se bloquea el complejo TF:FVIIa mediante anticuerpo monoclonal anti-TF (Mueller B. M. et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA (1992) 89:11832-11836), inhibidor de la ruta de factor tisular (Amirkhosravi A. et al., Semin. Thromb. Hemost . (2007) 33:643-652) o anulando la expresión de TF mediante AR si específico de TF, se inhibe la metástasis pulmonar experimental (Amarzguioui M. et al., Clin. Cáncer Res. (2006) 12:4055-4061), lo que sugiere que el complejo TF:FVIIa también está involucrado en la promoción de crecimiento tumoral y metástasis y sugiere además que la inhibición del complejo TF:FVIIa es una estrategia clínica viable para el tratamiento del cáncer.

A pesar de los avances significativos en el tratamiento de los trastornos trombóticos e inflamatorios, el conocimiento actual de por ejemplo, enfermedades arteriales coronarias, aterosclerosis , artritis reumatoide, trastornos proliferativos como cáncer/metástasis, sugiere que una sustancia terapéuticamente activa y segura con ambas propiedades anti -trombóticas y anti- inflamatorias es una mejora sobre la terapia estándar.

Las moléculas de ARN de doble cadena (ARNds) han demostrado bloquear la expresión génica en un mecanismo regulatorio altamente conservado conocido como ARN de interferencia (iARN) . La invención proporciona moléculas de ácido ribonucleico de doble cadena (ARNds) capaces de disminuir de forma selectiva y eficiente la expresión de FVII. El uso de iARN del FVII proporciona un método para el tratamiento terapéutico y/o profiláctico de enfermedades/trastornos que están asociadas con la formación de FVIIa, complejo TF-FVIIa, factores de coagulación como IXa, Xa, Xlla y trombina, factores de inflamación como citocinas y proteína C-reactiva (CRP) , activadas directamente o indirectamente por FVIIa y TF. Los estados particulares de enfermedad/trastorno incluye el tratamiento terapéutico y/o profiláctico de trombosis arterial y venosa, trombosis venosa profunda, angina de pecho inestable, síndrome coronario agudo, infarto de miocardio, apoplejía por fibrilación atrial, embolismo pulmonar, embolismo cerebral, embolismo renal, isquemia de extremidad crítica, isquemia de extremidad aguda, coagulación intravascular diseminada (provocada por ejemplo por bacterias, enfermedades virales, cáncer, septicemia, trauma múltiple) , gangrena, enfermedad de células de Sickle, periarteritis nudosa, síndrome de Kawasaki, enfermedad de Buerger, síndrome antifosfolípido, respuestas inflamatorias incluyendo pero sin limitarse a aterosclerosis aguda o crónica, artritis reumatoide, trastornos proliferativos como cáncer/metástasis, pancreatitis, cuyo método comprende la administración de ARNds contra FVII a un ser humano o animal. Los compuestos de esta invención pueden también utilizarse para la prevención de trombosis cuando la sangre está en contacto con dispositivos médicos dentro del cuerpo (por ejemplo, válvulas protésicas cardíacas mecánicas y biológicas, cánulas vasculares, catéteres vasculares, injertos vasculares) o fuera del cuerpo (por ejemplo, hemodiálisis , máquina de corazón-pulmón).

La invención proporciona moléculas de ácido ribonucleico de doble cadena (ARNds) capaces de disminuir de forma selectiva y eficiente la expresión del FVII en hepatocitos al silenciar el (los) gen(es) de FVII, disminuyendo así el nivel de proteína FVII sintetizada en el hígado y finalmente reduciendo la actividad del FVII en plasma. En una modalidad preferida la molécula de ARNds descrita es capaz de inhibir la expresión de un gen del FVII en al menos un 70%. La invención también proporciona composiciones y métodos dirigidos específicamente al hígado con ARNds de FVII, para tratar condiciones patológicas y enfermedades provocadas por la expresión del gen FVII que incluye los descritos anteriormente.

En una modalidad, la invención proporciona moléculas de doble cadena de ácido ribonucleico (ARNds) para inhibir la expresión de un Factor VII, en particular la expresión del gen del Factor VII de mamíferos o humano. El ARNds comprende al menos dos secuencias que son complementarias entre ellas. El ARNds comprende a una cadena sentido que comprende una primera secuencia y una cadena antisentido que puede comprender una segunda secuencia, véase también la provisión de pares de ARNds específicos en las tablas anexas 1, 4, 6 y 7. En una modalidad la cadena sentido comprende una secuencia con una identidad de al menos un 90% a al menos una porción de un ARNm que codifica FVII. La secuencia está localizada en una región de complementariedad de la cadena sentido hacia la cadena antisentido. En una modalidad preferida el ARNds está dirigido particularmente hacia el gen humano del Factor VII, en otra modalidad preferida el ARNds está dirigido hacia el gen de conejillo de indias {Cavia porcellus) o de rata {Rattus norvegicus) del Factor VII.

En una modalidad, la cadena antisentido comprende una secuencia de nucleótidos que es sustancialmente complementaria en al menos una parte de un ARNm que codifica el gen del Factor VII, y la región de complementariedad es preferiblemente inferior a 30 nucleótidos de longitud. Además, es preferible que la longitud de las moléculas ds de la invención descritas aquí (longitud doble) esté en el intervalo entre alrededor de 16 y 30 nucleótidos, en particular en el intervalo entre alrededor de 18 y 28 nucleótidos. Particularmente útil en el contexto de esta invención son las longitudes dobles entre alrededor de 19, 20, 21, 22, 23 o 24 nucleótidos. Lo más preferible son los tramos dobles de 19, 21 o 23 nucleótidos. El ARNds, tras contactar con una célula que expresa un gen del Factor VII, inhibe la expresión de un gen del Factor VII in vitro en al menos un 70%.

Se proporcionan moléculas de ARNds seleccionadas en las tablas anexas 6 y 7, con moléculas de ARNds preferible que comprenden los nucleótidos 1-19 de SEC ID NO: 413, 414, 415, 416, 417, 418, 419, 420, 421, 422, 423, 424, 425, 426, 427, 428, 429, 430, 431, 432, 433, 434, 435, 436, 437 y 438.

En una modalidad, las moléculas de ARNds comprenden una cadena antisentido con un extremo terminal 3' de 1-5 nucleótidos de longitud, preferiblemente de 1-2 nucleótidos de longitud. Preferiblemente el extremo terminal de la cadena antisentido comprende uracilo o nucleótidos que son complementarios en al menos un 90% al ARNm que codifica el Factor VII.

En otra modalidad preferida, las moléculas de ARNds comprenden una cadena sentido con un extremo terminal 3' de 1-5 nucleótidos de longitud, preferiblemente de 1-2 nucleótidos de longitud. Preferiblemente el extremo terminal de la cadena sentido comprende uracilo o nucleótidos que son idénticos en al menos un 90% al ARNm que codifica el Factor VII .

En otra modalidad preferida, las moléculas de ARNds comprenden una cadena sentido con un extremo terminal 3' de 1-5 nucleótidos de longitud, preferiblemente de 1-2 nucleótidos de longitud, y una cadena antisentido con un extremo terminal 3' de 1-5 nucleótidos de longitud, preferiblemente de 1-2 nucleótidos de longitud. Preferiblemente el extremo terminal de la cadena sentido comprende uracilo o nucleótidos que son idénticos en al menos un 90% al ARNm que codifica el Factor VII y el extremo terminal de la cadena antisentido comprende uracilo o nucleótidos que son complementarios en al menos un 90% al ARNm que codifica el Factor VII.

En las moléculas preferibles de ARNds, Ínter alia y preferiblemente, la cadena sentido se selecciona de entre el grupo que consiste en las secuencias de ácidos nucleicos descritas en SEC ID NO: 413, 415, 417, 419, 421, 423, 425, 427, 429, 431, 433, 435, y 437 y la cadena antisentido se selecciona de entre el grupo que consiste en las secuencias de ácidos nucleicos descritas en SEC ID NO: 414, 416, 418, 420, 422, 424, 426, 428, 430, 432, 434, 436 y 438. De acuerdo con esto, la molécula de ARNds de la invención puede, ínter alia, comprender los pares de secuencia seleccionados de entre el grupo que consiste en SEC ID NO: 413/414, 415/416, 417/418, 419/420, 421/422, 423/424, 425/426, 427/428, 429/430, 431/432, 433/434, 435/436 y 437/438. En el contexto de las moléculas específicas de ARNds proporcionadas aquí, los pares de SEC ID NO están relacionados con las correspondientes secuencias de cadenas sentido y antisentido (5' a 3') como también se muestran en las tablas anexas.

También se proporcionan aquí las moléculas de ARNds modificadas y se describen en particular en las tablas anexas 1 y 4, proporcionando ejemplos ilustrativos de moléculas de ARNds modificadas de la presente invención.

Las Tablas 2 y 3 proporcionan parámetros relevantes selectivos biológicos, clínicos y farmacéuticos de ciertas moléculas de ARNds de esta invención.

Como se ha indicado antes, la Tabla 1 proporciona ejemplos ilustrativos de ARNds modificados de esta invención (de los que se proporciona las correspondientes cadenas sentido y antisentido en esta tabla) . Así, las modificaciones ilustrativas de aquellos constituyentes de los ARNds de la invención se proporcionan aquí como ejemplos de las modificaciones. También se comprenden otras modificaciones de estos ARNds (y sus constituyentes) como una modalidad de esta invención. Se proporcionan los ejemplos correspondientes en la descripción más detallada de esta invención.

Las Tablas anexas 4 y 7 también proporcionan otras moléculas de ARNsi /ARNds útiles en el contexto de esta invención, mientras que la Tabla 4 proporciona ciertas características sorprendentes biológicas y/o clínicas relevantes de las moléculas ARNsi /moléculas de ARNds modificadas de esta invención como se muestra en la Tabla 7. Estas moléculas de ARN comprenden modificaciones ilustrativas de nucleótidos.

Las moléculas más preferibles de ARNds se proporcionan en las tablas anexas 1 y 4 y, inter alia y preferiblemente, cuando la cadena sentido se selecciona de entre el grupo que consiste en las secuencias de ácidos nucleicos descritas en SEC ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23 y 25 y la cadena antisentido se selecciona de entre el grupo que consiste en las secuencias de ácidos nucleicos descritas en SEC ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24 y 26. De acuerdo con esto, la molécula de ARNds de la invención puede, inter alia, comprender los pares de secuencia seleccionados de entre el grupo que consiste en SEC ID NO: 1/2, 3/4, 5/6, 7/8, 9/10, 11/12, 13/14, 15/16, 17/18, 19/20, 21/22, 23/24 y 25/26. Las moléculas más preferibles de ARNds comprenden los pares de secuencia 19/20 y 11/12. En el contexto de las moléculas específicas de ARNds proporcionadas aquí, los pares de SEC ID NO están relacionados con las correspondientes secuencias de las cadenas sentido y antisentido (5' a 3') como también se muestran en las tablas anexas.

En una modalidad las moléculas de ARNds de la invención comprenden una cadena sentido y antisentido en la que al menos una de las cadenas posee una vida media de al menos 24 horas. En otra modalidad las moléculas de ARNds de la invención no son inmunoestimuladoras , por ejemplo, no estimulan el INF- ni el TNF- in vitro.

Las moléculas de ARNds de la invención pueden estar comprendidas de nucleótidos naturales o pueden estar comprendidas de al menos un nucleótido modificado, como el nucleótido 21 -O-metilo modificado, un nucleótido que comprende un grupo 51 -fosforotioato, y un nucleótido terminal unido a un derivado de colesterilo o grupo bisdecilamida del ácido dodecanoico. Los nucleótidos modificados en 2' pueden tener la ventaja adicional en que ciertos factores inmunoestimuladores o citocinas están suprimidos cuando se utilizan in vivo las moléculas de ARNds de la invención, por ejemplo en circunstancias médicas. Alternativamente y sin ser limitante, el nucleótido modificado puede escogerse de entre el grupo de: un nucleótido 2 ' -desoxi-2 ' -fluoro modificado, un nucleótido 2 ' -desoxi-modificado, un nucleótido bloqueado, un nucleótido abásico, nucleótido 2'-amino modificado, nucleótido 2 ' -alquil-modificado, nucleótido morfolino, un fosforamidato, y un nucleótido que comprende una base no natural. En una modalidad preferida las moléculas de ARNds comprenden al menos uno de los siguientes nucleótidos modificados: un nucleótido 2'-0-metilo modificado, un nucleótido que comprende un grupo 5 ' -fosforotioato y una desoxitimidina . Las moléculas preferibles de ARNds que comprenden nucleótidos modificados se proporcionan en las tablas 1 y 4.

La invención también proporciona células que comprenden al menos uno de los ARNds de la invención. La célula es preferiblemente una célula de mamífero, como una célula humana. Además, también se comprenden tejidos y/o organismos no humanos que comprenden las moléculas de ARNds definidas aquí en esta invención, en los que los organismos no humanos son particularmente útiles para los propósitos de investigación o como herramienta de investigación, por ejemplo también en el análisis del fármaco.

Además, la invención está relacionada con un método para inhibir la expresión de un gen de FVII, en particular un gen de mamífero o humano de FVII, en una célula, tejido u organismo que comprende los siguientes pasos: (a) introducir en la célula, tejido u organismo un ácido ribonucleico de doble cadena (ARNds) como se define aquí ; (b) mantener la célula, tejido u organismo producido en el paso (a) durante un tiempo suficiente para obtener una degradación del transcrito del ARNm del gen de FVII, inhibiendo así la expresión del gen del FVII en una célula determinada.

La invención también está relacionada con las composiciones farmacéuticas que comprenden los ARNds de esta invención. Estas composiciones farmacéuticas son particularmente útiles en la inhibición de la expresión de un gen del FVII en una célula, un tejido o un organismo. La composición farmacéutica que comprende uno o más de los ARNds de la invención puede también comprender (a) transportador (es) , diluyente(s) y/o excipiente (s) farmacéuticamente aceptable (s) .

En otra modalidad, la invención proporciona métodos para tratar, prevenir o gestionar trastornos trombóticos que están asociados con la activación de factores de coagulación, inflamaciones o trastornos proliferativos , el método comprende la administración a un sujeto que necesite el tratamiento, prevención o administración de una cantidad terapéutica o profilácticamente efectiva de uno o más de los ARNds de la invención. Preferiblemente, el sujeto es un mamífero, más preferiblemente un paciente humano.

En una modalidad, la invención proporciona un método para tratar un sujeto con una afección patológica mediada por la expresión de un gen del Factor VII. Tales afecciones comprenden trastornos, como los trastornos tromboembólicos , eventos inflamatorios no deseados o trastornos proliferativos y aquellos descritos anteriormente. En esta modalidad, el ARNds actúa como un agente terapéutico para controlar la expresión de un gen del Factor VII. El método comprende la administración de una composición farmacéutica de la invención al paciente (por ejemplo un humano) , de forma que se silencia la expresión del gen del Factor VII. Debido a su alta especificidad, el ARNds de la invención está dirigido específicamente a los ARNm de un gen del Factor VII. En una modalidad preferida los ARNds descritos disminuyen específicamente los niveles de ARNm del FVII y no afectan directamente a la expresión y/o niveles de ARNm de genes no objetivo en la célula.

En una modalidad preferida los ARNds descritos disminuyen los niveles de ARNm del Factor VII en el hígado en al menos un 80% in vivo, y disminuyen los niveles de zimógeno del Factor VII en el plasma en al menos un 95% in vivo. En otra modalidad los ARNds descritos prolongan el tiempo de protrombina e inhiben la generación de trombina y la formación de trombos in vivo. En aún otra modalidad preferida estos efectos antitrombóticos mediados por las moléculas de ARNds descritas se asocian con una disminución de los niveles del FVII en plasma in vivo y de niveles de ARNm del FVII en hígado in vivo.

En una modalidad las moléculas de ARNds descritas aumentan el tiempo de coagulación en sangre in vivo en al menos el doble.

Particularmente útil con respecto a los ARNds terapéuticos es el grupo de ARNds dirigidos contra el Factor VII de conejillo de indias que puede utilizarse para estimar la toxicidad, eficacia terapéutica y dosis efectivas y las vidas medias in vivo para los ARNds individuales en un conejillo de indias o modelo de cultivo celular.

En otra modalidad, la invención proporciona vectores para inhibir la expresión de un gen del Factor VII en una célula, en particular el gen del Factor VII que comprende una secuencia reguladora unida de forma operativa a una secuencia de nucleótidos que codifica al menos una cadena de uno de los ARNds de la invención.

En otra modalidad, la invención proporciona una célula que comprende un vector para inhibir la expresión de un gen del Factor VII en una célula. El vector comprende una secuencia reguladora unida de forma operativa a una secuencia de nucleótidos que codifica al menos una cadena de uno de los AR ds de la invención. Más aún, es preferible que el vector comprenda, a parte de la secuencia reguladora, una secuencia que codifique al menos una "cadena sentido" de los ARNds de la invención y al menos una "cadena antisentido" de los ARNds. También se prevé que la célula reivindicada comprenda dos o más vectores que comprendan, a parte de las secuencias reguladoras, la(s) secuencia (s) aquí definida (s) que codifica (n) al menos una cadena de uno de los ARNds de la invención.

En una modalidad, el método comprende administrar una composición que comprende un ARNds, en la que el ARNds comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a al menos una parte de un transcrito de ARN de un gen del Factor VII del mamífero a tratar. Como se ha indicado antes, también pueden utilizarse vectores y células que comprenden moléculas de ácido nucleico que codifican al menos una cadena de las moléculas de ARNds aquí definidas como composiciones farmacéuticas y pueden, por lo tanto, también emplearse en los métodos aquí descritos para tratar a un sujeto que necesite de intervención médica. Debe también notarse que estas modalidades relacionadas con las composiciones farmacéuticas y a los correspondientes métodos para tratar a un sujeto (humano) también están relacionadas con aproximaciones como la terapia génica. Las moléculas de ARNds específicas del Factor VII como las proporcionadas aquí o moléculas de ácido nucleico que codifican cadenas individuales de estas moléculas de ARNds de la invención pueden también insertarse en vectores y utilizarse como vectores de terapia génica para pacientes humanos. Los vectores de terapia génica pueden liberarse a un sujeto mediante, por ejemplo, inyección intravenosa, administración local (véase Patente Estadounidense 5,328,470) o mediante inyección estereotáctica (véase por ejemplo, Chen et al. (1994) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 91:3054-3057). La preparación farmacéutica del vector de terapia génica puede incluir el vector de terapia génica en un diluyente aceptable, o puede comprender una matriz de liberación lenta en la que está embebida el vehículo de liberación génica. Alternativamente, cuando el vector de liberación génica completo puede producirse intacto a partir de células recombinantes , por ejemplo, vectores retrovirales , la preparación farmacéutica puede incluir una o más células que producen el sistema de liberación génica.

En otro aspecto de la invención, las moléculas de ARNds específicas del Factor VII que modulan la actividad de expresión del gen del Factor VII se expresan a partir de unidades de transcripción insertadas en vectores de ADN o ARN (véase, por ejemplo, Skillern, A., et al., Publicación InteARNcional PCT No. O 00/22113) . Estos transgenes pueden introducirse como una construcción lineal, un plásmido circular, o un vector viral, que puede incorporarse y heredarse como un transgén integrado en el genoma hospedero. El transgén puede también construirse de forma que permita heredarse en un plásmido extracromosómico (Gassmann, et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA (1995) 92:1292).

Las cadenas individuales de un ARNds pueden transcribirse mediante promotores en dos vectores de expresión separados y cot-ransfectarse en una célula objetivo. Alternativamente cada cadena individual del ARNds puede transcribirse mediante promotores que están localizados en el mismo plásmido de expresión. En una modalidad preferida, se expresa un ARNds es como una repetición invertida unida mediante una secuencia de polinucleótido enlazadora de forma que el ARNds posee una estructura en horquilla .

Los vectores de expresión recombinante de ARNds son preferiblemente plásmidos de ADN o vectores virales. Los vectores virales que expresan ARNds pueden construirse basándose en, pero sin limitarse a ellos, virus adenoasociados (para una revisión, véase Muzyczka, et al., Curr. Topics Micro. Immunol . (1992) 158:97-129))·; adenovirus (véase, por ejemplo, Berkner, et al., BioTechniques (1998) 6:616), Rosenfeld et al. (1991, Science 252:431-434), y Rosenfeld et al. (1992), células 68:143-155)); o alfavirus así como otros conocidos en la técnica. Los retrovirus se han utilizado para introducir una serie de genes en muchos tipos diferentes de células, incluyendo células epiteliales, in vitro y/o in vivo (véase, por ejemplo, Danos y Mulligan, Proc. Nati. Acad. Sci. USA (1998) 85:6460-6464). Los vectores retrovirales recombinantes capaces de transducir y expresar genes insertados en el genoma de una célula pueden producirse mediante la transfección de un genoma retroviral recombinante en las líneas celulares de empaquetamiento adecuadas como la PA317 y Psi-CRIP (Comette et al., 1991, Human Gene Therapy 2:5-10; Cone et al., 1984, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 81:6349). Los vectores adenovirales recombinantes pueden utilizarse para infectar una amplia variedad de células y tejidos en hospederos susceptibles (por ejemplo, rata, hámster, perro, y chimpancé) (Hsu et al., 1992, J. Infectious Disease, 166:769), y también poseen la ventaja de no necesitar células mitóticamente activas para la infección.

El promotor que dirige la expresión de ARNds en un plásmido de ADN o un vector vírico de la invención puede ser un promotor eucariota de la polimerasa I de ARN (por ejemplo, promotor de ARN ribosómico) , polimerasa II de ARN (por ejemplo, promotor temprano de CMV o promotor de actina o promotor ARNsn de Ul) o preferiblemente el promotor de la polimerasa III de ARN (por ejemplo, promotor de ARNsn U6 o de ARN 7SK) o un promotor procariota, por ejemplo el promotor T7 , a menos que el plásmido de expresión también codifique la polimerasa de ARN T7 necesaria para la transcripción desde un promotor de T7. El promotor también dirige la expresión del transgén en el páncreas (véase, por ejemplo, la secuencia reguladora de la insulina para el páncreas (Bucchini et al., 1986, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 83:2511-2515)).

Además, la expresión del transgén puede regularse de forma precisa, por ejemplo, utilizando una secuencia reguladora inducible y sistemas de expresión como una secuencia reguladora que es sensible a ciertos reguladores fisiológicos, por ejemplo, niveles de glucosa en circulación, u hormonas (Docherty et al., 1994, FASEB J. 8:20-24). Los sistemas de expresión inducibles, adecuados para el control de la expresión de transgén en células o en mamíferos incluyen regulación mediante ecdisona, mediante estrógenos, progesterona, tetraciclina, inductores químicos de la dimerización, e isopropil-beta-Dl-tiogalactopiranósido (EPTG, por sus siglas en inglés) . Un experto en la materia será capaz de elegir la secuencia reguladora/promotora apropiado en base al uso que se pretende del transgén de ARNds.

Preferiblemente, los vectores recombinantes capaces de expresar moléculas de ARNds se liberan como se describe a continuación, y persisten en las células objetivo. Alternativamente, pueden utilizarse los vectores víricos que proporcionan una expresión transitoria de moléculas de ARNds.

Los vectores pueden administrarse de forma repetida si es necesario. Una vez expresado, el ARNds se une al ARN objetivo y modula su función o expresión. La liberación de vectores que expresan ARNds puede ser sistémica, como mediante administración intravenosa o intramuscular, mediante administración en células objetivo explantadas del paciente seguido de la reintroducción en el paciente, o mediante cualquier otro método que permita la introducción en una célula hospedera deseada.

Los plásmidos de ADN de expresión de ARNds se transfectan normalmente en células objetivo como un complejo con transportadores lipidíeos catiónicos (por ejemplo, Oligofectamina) o transportadores lipidíeos no catiónicos (por ejemplo, Transit-TKO™) . También se contempla por la invención transíecciones lipídicas múltiples para supresiones mediadas por ARNds dirigidos contra diferentes regiones de un único gen A del Factor VII o múltiples gen A del Factor VII durante un periodo de una semana o más. La introducción satisfactoria de vectores de la invención en células hospederas puede monitorizarse utilizando diferentes métodos conocidos. Por ejemplo, la transfección transitoria puede señalarse con un marcador, como un marcador fluorescente, como la Proteína Verde Fluorescente (GFP, por sus siglas en inglés) . La transfección estable de células ex vivo puede asegurarse utilizando marcadores que proporcionan la célula transfectada resistencia a factores ambientales específicos (por ejemplo, antibióticos y fármacos) , como la resistencia a la higromicina B.

La siguiente descripción detallada describe cómo realizar y utilizar el ARNds y las composiciones que contiene ARNds para inhibir la expresión de un gen objetivo del Factor VII, así como composiciones y métodos para tratar enfermedades y trastornos provocados por la expresión del gen del Factor VII .

DEFINICIONES Por conveniencia, el significado de ciertos términos y frases utilizados en la especificación, ejemplos, y reivindicaciones anexas, se proporcionan a continuación. Si existe una aparente discrepancia entre la utilización de un término en otras partes de esta especificación y su definición proporcionada en esta sección, la definición en esta sección debe prevalecer.

"G," "C," "A", "U" y "T" o "dT" respectivamente, cada una generalmente se refiere a un nucleótido que contiene guanina, citocina, adenina, uracilo y desoxitimidina como base, respectivamente. No obstante, el término "ribonucleótido" o "nucleótido" puede también referirse a un nucleótido modificado, como se detalla en más profundidad más adelante, o una porción similar de sustitución. Las secuencias que comprenden las porciones de sustitución son modalidades de la invención. Tal como se detalla más adelante, las moléculas aquí descritas de ARNds pueden también comprender "extremos terminales", es decir, nucleótidos desparejados, terminales que no están involucrados directamente en la estructura de ARN de doble hélice formada normalmente por el par aquí definido de "cadena sentido" y "cadena antisentido" . A menudo, el tramo terminal comprende el nucleótido desoxitimidina, en la mayoría de las modalidades, 2 desoxitimidinas en el extremo 3'. Los extremos terminales se describen e ilustran más adelante .

El término "Factor VII" o "FVII" tal como se usa aquí está relacionado en particular con el factor VII de coagulación también descrito anteriormente como "proconvertina" o "acelerador de la conversión de protrombina en suero" y el término está relacionado con los correspondientes genes, ARNm codificados, proteína/polipéptido codificado así como a fragmentos funcionales del mismo. El término "gen/secuencia del Factor VII" no sólo se refiere a la(s) secuencia (s) de tipo silvestre (s) sino también a mutaciones y alteraciones que puede haber en el gen/secuencia. De acuerdo con esto, la presente invención no se limita a las moléculas específicas de ARNds proporcionadas aquí. La invención también está relacionada con moléculas de ARNds que comprenden una cadena antisentido que es al menos un 85% complementaria al tramo de nucleótidos correspondientes a un transcrito de ARN de un gen del Factor VII que comprende las mutaciones/alteraciones.

Tal como se usa aquí, "la secuencia objetivo" se refiere a una porción contigua de la secuencia de nucleótidos de una molécula de ARNm formada durante la transcripción de un gen del Factor VII, incluyendo ARNm que es un producto de ARN que procesa un producto de transcripción primario.

Tal como se usa aquí, el término "cadena que comprende una secuencia" se refiere a un oligonucleótido que comprende una cadena de nucleótidos que está descrita por la secuencia referida para usar la nomenclatura de nucleótidos estándar. No obstante, tal como se detalla aquí, la "cadena que comprende una secuencia" puede también comprender modificaciones, como nucleótido modificados.

Tal como se usa aquí, y a no ser que se indique de otra manera, el término "complementario" cuando se utiliza para describir una primera secuencia de nucleótidos con relación a una segunda secuencia de nucleótidos, se refiere a la capacidad de un oligonucleótido o polinucleótido que comprende la primera secuencia de nucleótidos de hibridar y formar una estructura dúplex bajo ciertas condiciones con un oligonucleótido o polinucleótido que comprende la segunda secuencia de nucleótidos. Secuencias "complementarias", tal como se usa aquí, pueden también incluir, o formarse por completo a partir de, pares de bases no Watson-Crick y/o pares de bases formadas a partir de nucleótidos modificados no naturales y, siempre que se cumplan los requisitos anteriores respecto a su capacidad de hibridar.

Las secuencias referidas como "totalmente complementarias" comprenden emparejamiento de bases de los oligonucleótidos o polinucleótidos que comprende la primera secuencia de nucleótidos a los oligonucleótidos o polinucleótidos que comprende la segunda secuencia de nucleótidos sobre la longitud completa de la primera y segunda secuencia de nucleótidos.

No obstante, cuando una primera secuencia se refiere como "sustancialmente complementaria" respecto a la segunda secuencia aquí, las dos secuencias pueden ser totalmente complementarias, o pueden formar una o más, pero preferiblemente no más de 4 , 3 ó 2 desparej amientos de pares de bases tras la hibridación.

Los términos "complementario" , "totalmente complementario" y "sustancialmente complementario" aquí pueden utilizarse respecto al emparejamiento de bases entre la cadena sentido y la cadena antisentido de un AR ds, o entre la cadena antisentido de un ARNds y una secuencia objetivo, como podrá entenderse a partir del contexto en que se usa.

El término "ARN de doble cadena" o "ARNds" , tal como se usa aquí, se refiere a una molécula de ácido ribonucleico, o complejo de moléculas de ácido ribonucleico, con una estructura dúplex que comprende dos cadenas anti-paralelas y sustancialmente complementarias de ácido nucleico. Las dos cadenas que forman la estructura dúplex pueden ser diferentes porciones de una molécula de ARN más larga, o pueden ser moléculas de ARN separadas. Cuando las dos cadenas son parte de una molécula más larga, y por lo tanto están conectadas por una cadena contigua de nucleótidos entre el extremo 3'- de una cadena y el extremo 5'- de la correspondiente otra cadena que forma la estructura dúplex, la cadena de ARN conectora está referida como "horquilla" . Cuando las dos cadenas están conectadas covalentemente por otro medio diferente de una cadena contigua de nucleótidos entre el extremo 3'- de una cadena y el extremo 5'- de la correspondiente otra cadena que forma la estructura dúplex, la estructura conectora es referida como "enlazadora" . Las cadenas de ARN pueden tener el mismo o un número diferente de nucleótidos. Además de la estructura dúplex, un ARNds puede comprender una o más secuencias terminales de nucleótidos. Los nucleótidos en las "secuencias terminales" pueden comprender entre 0 y 5 nucleótidos, en donde "0" indica que no hay nucleótidos adicionales que formen una "secuencia terminal" y en la que "5" indica cinco nucleótidos adicionales en las cadenas individuales del dúplex de ARNds.

Estas "secuencias terminales" opcionales están localizadas en el extremo 3 ' de las cadenas individuales. Tal como se detallará más adelante, también las moléculas de AR ds que comprenden sólo una "secuencia terminal" en una de las dos cadenas pueden ser útiles e incluso ventajoso en el contexto de esta invención. La "secuencia terminal" comprende preferiblemente entre 0 y 2 nucleótidos. Más preferiblemente 2 nucleótidos "dT" (desoxitimidina) se encuentran en el extremo 3' de ambas cadenas de ARNds. De acuerdo con esto, una "secuencia terminal de nucleótidos" se refiere al nucleótido o nucleótidos desparejados que sobresalen de la estructura dúplex de un ARNds cuando un extremo 3' de una cadena de ARNds se extiende más allá del extremo 5' de la otra cadena, o viceversa. "Romo" o "extremo romo" significa que no hay nucleótidos desparejados en el extremo del ARNds, es decir, no hay secuencia terminal de nucleótidos. Un ARNds "de extremo romo" es un ARNds que es de doble cadena en su longitud completa, es decir, no hay secuencia terminal de nucleótidos en ningún extremo de la molécula.

El término "cadena antisentido" se refiere a la cadena de un ARNds que incluye una región que es sustancialmente complementaria a una secuencia objetivo. Tal como se usa aquí, el término "región de complementariedad" se refiere a la región sobre la cadena antisentido que es sustancialmente complementaria a una secuencia, por ejemplo una secuencia objetivo. Cuando la región de complementariedad no es totalmente complementaria a la secuencia objetivo, los desparejamientos están más tolerados en las regiones terminales y, si lo están, están preferiblemente en una región terminal o regiones, por ejemplo, entre 6, 5, 4, 3, ó 2 nucleótidos de los extremos 5' y/o 3'.

El término "cadena sentido" tal como se usa aquí, se refiere a la cadena de un ARNds que incluye una región que es sustancialmente complementaria a una región de la cadena antisentido. "Sustancialmente complementario" significa preferiblemente que al menos un 85% de los nucleótidos solapados en la cadena sentido y antisentido son complementarios .

"Introducir en una célula", cuando se refiere a un ARNds, significa facilitar la captación o absorción en la célula, como lo entiende un experto en la materia. La absorción o captación del ARNds puede ocurrir a través de procesos difusivos pasivos o celulares activos, o mediante agentes auxiliares o dispositivos. El significado de este término no está limitado a las células in vitro; un ARNds puede también "introducirse en una célula" , en la que la célula es parte de un organismo vivo. En el ejemplo, la introducción en la célula incluirá la liberación en el organismo. Por ejemplo, para la liberación in vivo, el ARNds puede inyectarse en un tejido o administrarse de forma sistémica. Se prevé, por ejemplo que las moléculas de ARNds de esta invención se administren a un sujeto que necesite de intervención médica. Dicha administración puede comprender la inyección de ARNds, el vector o una célula de esta invención en un lugar enfermo en el sujeto, por ejemplo en el tejido hepático /células o en tejido canceroso /células, como el tejido de cáncer hepático. No obstante, también comprende la inyección muy próxima al tejido enfermo. La introducción in vitro en una célula incluye métodos conocidos en la materia como la electroporacion y la lipofección.

Los términos "silencio", "inhibe la expresión de" y "suprimido" , en la presente referido al gen del Factor VII, aquí se refiere en al menos la supresión parcial de la expresión de un gen del Factor VII, manifestado por la reducción de la cantidad de ARNm transcrito a partir de un gen del Factor VII que puede aislarse a partir de una primera célula o grupo de células en los que se transcribe el gen del Factor VII y que se trata o ha sido tratado de forma que se inhibe la expresión de un gen del Factor VII, en comparación con una segunda célula o grupo of células sustancialmente idénticas a la primera célula o grupo de células pero que no se ha tratado o ha sido tratado de esta manera (células control) . Los grados de inhibición se expresa normalmente en términos de (ARNm en células - (AR m en células •1009/ (AR m en células Alternativamente, el grado de inhibición puede proporcionarse en términos de una reducción de un parámetro que está funcionalmente unido al gen de transcripción del Factor VII, por ejemplo, la cantidad de proteína codificada por un gen del Factor VII que se secreta por una célula, o el número de células que muestran un fenotipo determinado.

Tal como se ilustra en los ejemplos anexos y en las tablas anexas proporcionadas aquí, las moléculas de la invención de AR ds son capaces de inhibir la expresión de un Factor VII humano en al menos alrededor del 70% de los ensayos in vitro, es decir in vitro. En otra modalidad las moléculas de ARNds de la invención son capaces de inhibir la expresión de un Factor VII de conejillo de indias en al menos un 70%, que también conduce a un efecto antitrombótico significativo in vivo. Los expertos en la materia pueden determinar fácilmente como una tasa de inhibición y efectos relacionados, en particular como consecuencia de los ensayos proporcionados aquí. Se proporcionan ARNds particulares preferibles, por ejemplo en la Tabla 1 anexada, en particular en el intervalo 1 a 13 (secuencias de cadena sentido y cadena antisentido proporcionadas allí en la orientación 5' a 3').

El término "no objetivo" tal como se usa aquí se refiere a todos los ARNm no objetivos del transcriptoma, que se predice mediante métodos in silico que hibridan con los AR ds descritos en base a la complementariedad de secuencia.

El ARNds de la presente invención preferiblemente inhibe específicamente la expresión del Factor VII, es decir no inhibe la expresión de cualquier no objetivo.

El término "vida media" tal como se usa aquí es una medida de estabilidad de un compuesto o molécula y puede evaluarse mediante métodos conocidos por un experto en la materia, especialmente como consecuencia de los ensayos proporcionados aquí .

El término "no inmunoestimulador" tal como se usa aquí se refiere a la ausencia de cualquier inducción de una respuesta inmune por las moléculas de ARNds de la invención.

Los métodos para determinar las respuestas inmunes son bien conocidos por los expertos en la materia, por ejemplo analizando la liberación de citocinas, como se describe en la sección de ejemplos.

Los términos "tratar", "tratamiento", y similares, indican en el contexto de esta invención el alivio de o mitigación de un trastorno relacionado con la expresión del Factor VII, como trastornos/enfermedades tromboembólicas , inflamaciones o trastornos proliferativos .

Tal como se usa aquí, una "composición farmacéutica" comprende una cantidad farmacológicamente efectiva de un ARNds y un transportador farmacéuticamente aceptable. No obstante, la "composición farmacéutica" puede también comprender cadenas individuales de la molécula de ARNds o los vectores aquí descritos que comprenden una secuencia reguladora unida de forma operativa a una secuencia de nucleótidos que codifica al menos una cadena sentido o una cadena antisentido que comprende el ARNds de esta invención. También se comprende que las células, tejidos u órganos aislados que expresan o comprenden los ARNds aquí definidos pueden usarse como "composiciones farmacéuticas" . Tal como se usa aquí, "cantidad farmacológicamente efectiva" "cantidad terapéuticamente efectiva" o simplemente "cantidad efectiva" se refiere a la cantidad de un ARN efectiva para producir el resultado farmacológico pretendido, terapéutico o preventivo.

El término "transportador farmacéuticamente aceptable" se refiere a un transportador para la administración de un agente terapéutico. Los transportadores incluyen, pero no se limitan a, salino, salino tamponado, dextrosa, agua, glicerol, etanol, y combinaciones de las mismas. El término específicamente excluye medios de cultivo celulares. Para fármacos administrados oralmente, los transportadores farmacéuticamente aceptables incluyen, pero no se limitan a excipientes farmacéuticamente aceptables como diluyentes inertes, agentes disgregantes, agentes enlazadoras, agentes lubricantes, agentes edulcorantes, agentes saborizantes , agentes colorantes y conservantes como los conocen los expertos en la materia.

Se contempla de forma particular que el transportador farmacéuticamente aceptable permita la administración sistémica de los ARNds, vectores o células de esta invención. Mientras que también se contempla la administración entérica, la administración parenteral y también la administración transdérmica o transmucosal (por ejemplo, insuflación, bucal, vaginal, anal) así como la inhalación del fármaco son vías posibles de administración a un paciente que necesite la intervención médica de compuestos de esta invención. Cuando se emplea la administración parenteral, esta puede comprender la inyección directa de los compuestos de esta invención en el tejido enfermo o al menos muy cerca. No obstante, también la administración intravenosa, intraarterial , subcutánea, intramuscular, intraperitoneal , intradérmica, intratecal y otras de los compuestos de esta invención están dentro del uso del experto, por ejemplo el médico.

Para, el uso intramuscular, subcutánea e intravenosa, las composiciones farmacéuticas de la invención se proporcionarán generalmente en soluciones estériles acuosas o suspensiones, tamponadas a un pH e isotonicidad apropiados. En una modalidad preferida, el transportador consiste exclusivamente de un tampón acuoso. En este contexto, "exclusivamente" significa sin agentes auxiliares o sustancias encapsulantes presentes que puedan afectar o mediar la captación de ARNds en las células que expresan un gen del Factor VII. Las suspensiones acuosas de acuerdo con la invención pueden incluir agentes suspensores como los derivados de celulosa, alginato sódico, polivinil -pirrolidona y goma de tragacanto, y un agente humectante como la lecitina. Los conservantes adecuados para las suspensiones acuosas incluyen p-hidroxibenzoato de etilo y n-propilo. Las composiciones farmacéuticas útiles de acuerdo con la invención también incluyen formulaciones encapsuladas para proteger el ARNds frente a la eliminación rápida del cuerpo, como una formulación de liberación controlada, que incluye implantes y sistemas de liberación microencapsulados. Pueden utilizarse polímeros biodegradables , biocompatibles como el acetato de etileno vinilo, polianhídridos , ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres , y ácido poliláctico. Los métodos para la preparación de las formulaciones serán evidentes a los expertos en la materia. También pueden utilizarse las suspensiones liposómicas como transportadores farmacéuticamente aceptables. Estas pueden prepararse de acuerdo con los métodos conocidos por los expertos en la materia, por ejemplo, como se describe en la publicación PCT WO 91/06309 que se incorpora aquí por referencia .

Tal como se usa aquí, una "célula transformada" es una célula en la que al menos se ha introducido un vector desde el que se puede expresar una molécula de AR ds o al menos una cadena de la molécula de ARNds. Dicho vector es preferiblemente un vector que comprende una secuencia reguladora unida de forma operativa a una secuencia de nucleótidos que codifica al menos una de una cadena sentido o una cadena antisentido que comprende el ARNds de esta invención.

Se puede esperar razonablemente que ARNds más cortos que comprenden una de las secuencias de la Tabla 1 y 4 menos sólo unos cuantos nucleótidos en uno o ambos extremos puede ser similarmente efectivo si se compara con el ARNds descrito anteriormente. Como se ha indicado antes, en la mayoría de modalidades de esta invención, las moléculas de ARNds proporcionadas aquí comprenden una longitud de dúplex (es decir, sin las "secuencias terminales") entre alrededor de 16 a alrededor de 30 nucleótidos. Las longitudes dobles de ARNds particularmente útiles están entre alrededor de 19 a alrededor de 25 nucleótidos. Más preferibles son las estructuras dúplex con una longitud de 19 nucleótidos. En las moléculas de ARNds de la invención, la cadena antisentido es al menos parcialmente complementaria a la cadena sentido.

El ARNds de la invención puede contener uno o más desparej amientos en la secuencia objetivo. En una modalidad preferida, el ARNds de la invención contiene no más de 3 desparejamientos . Si la cadena antisentido del ARNds contiene desparejamientos de una secuencia objetivo, es preferible que el área de desparej amiento no esté localizada en el centro de la región de complementariedad. Si la cadena antisentido del ARNds contiene desparej amientos de la secuencia objetivo, es preferible que el desparejamiento esté restringido a las regiones terminales, preferiblemente en 6, 5, 4, 3 ó 2 nucleótidos de los extremos 5' y/o 3'. Por ejemplo, para una cadena de ARNds de 23 nucleótidos que es complementaria a una región de un gen del Factor VII, el ARNds preferiblemente no contiene ningún desparej amiento dentro de los 13 nucleótidos centrales .

Como se ha indicado antes, al menos un extremo/cadena de ARNds puede tener una secuencia terminal de cadena única de 1 a 5 nucleótidos, preferiblemente de 1 ó 2 nucleótidos. El ARNds con al menos una secuencia terminal de nucleótidos posee inesperadamente propiedades inhibidoras superiores que sus homólogos de extremos romos. Además, los presentes inventores han descubierto que la presencia de una sola secuencia terminal de nucleótidos refuerza la actividad de interferencia del ARNds, sin afectar a su estabilidad general . El ARNds con una sola secuencia terminal ha demostrado ser particularmente estable y efectivo in vivo, así como en una variedad de células, medios de cultivo de células, sangre y suero. Preferiblemente, la secuencia terminal de cadena única está localizada en el extremo 3' de la cadena antisentido o, alternativamente, en el extremo 3' de la cadena sentido. El ARNds puede también tener un extremo romo, localizado preferiblemente en el extremo 5' de la cadena antisentido. Preferiblemente, la cadena antisentido del ARNds posee una secuencia terminal de nucleótidos en el extremo 3', y el extremo 5' es romo. En otra modalidad, uno o más de los nucleótidos en la secuencia terminal está sustituido por un nucleósido tiofosfato.

El ARNds de la presente invención puede también estar químicamente modificado para aumentar la estabilidad. Los ácidos nucleicos de la invención puede sintetizarse y/o modificarse mediante métodos bien conocidos en la materia, como los descritos en "Current protocols in nucleic acid chemistry" , Beaucage, S.L. et al. (Edrs.), John Wiley & Sons, Inc., New York, NY, USA, que se incorpora aquí por referencia. Las modificaciones químicas pueden incluir, pero no se limitan a modificaciones 2' , introducción de bases no naturales, unión covalente a un ligando, y sustitución de uniones fosfato por uniones tiofosfato. En esta modalidad, la integridad de la estructura dúplex está reforzada por al menos una, y preferiblemente dos, uniones químicas. La unión química puede lograrse mediante cualquiera de las técnicas bien conocidas, por ejemplo introduciendo enlaces covalentes, iónicos o puentes de hidrógeno; interacciones hidrófobas, de van der aals o de apilamiente-; mediante de coordinación metal-ion, o a través del uso de análogos de purina. Preferiblemente, los grupos químicos que pueden utilizarse para modificar el AR ds incluye, sin limitarse, azul de metileno; grupos bifuncionales, preferiblemente bis- (2-cloroetil) amina; N-acetil-N' - (p-glioxilbenzoil) cistamina; 4-tiouracilo; y psoraleno. En una modalidad preferida, el enlazador es un enlazador de hexaetilenglicol . En este caso, el ARNds se produce mediante síntesis en fase sólida y el enlazadora hexaetilenglicol se incorpora de acuerdo con métodos estándar (por ejemplo, Williams, D.J., y K.B. Hall, Biochem. (1996) 35:14665-14670). En una modalidad particular, el extremo 5' de la cadena antisentido y el extremo 3' de la cadena sentido están unidos químicamente a través de un enlace hexaetilenglicol. En otra modalidad, al menos un nucleótido del ARNds comprende un fosforotioato o grupos fosforoditioato . El enlace químico en los extremos del ARNds está preferiblemente formado por enlaces de triple-hélice.

En ciertas modalidades, puede formarse un enlace químico mediante uno o varios o grupos enlazadoras, en la que los grupos enlazadoras son preferiblemente cadenas de poli- (oxifosfinicooxi-1, 3-propandiol) y/o polietilenglicol . En otras modalidades, puede también formarse un enlace químico mediante análogos de purina introducidos en la estructura de doble cadena en lugar de purinas . En otras modalidades, puede formarse un enlace químico mediante unidades de azabenceno introducidas en la estructura de doble cadena. En otras modalidades, puede formarse un enlace químico mediante análogos de nucleótido ramificados en lugar de nucleótidos introducidos en la estructura de doble cadena. En ciertas modalidades, puede introducirse un enlace químico mediante luz ultravioleta.

En otra modalidad, los nucleótidos en una o ambas cadenas únicas pueden modificarse para prevenir o inhibir la activación de enzimas celulares, por ejemplo ciertas nucleasas. Las técnicas para inhibir la activación de enzimas celulares son conocidas en la materia incluyendo, pero sin limitarse a, modificaciones 2'-amino, modificaciones 2'-amino azúcar, modificaciones 2'-F azúcar, modificaciones 2'-F, modificaciones 2 '-alquilo azúcar, modificaciones de estructura sin cargas, modificaciones morfolino, modificaciones 2'-0-metilo, y fosforamidato (véase, por ejemplo, Wagner, iVat. Med. (1995) 1:1116-8). Así, al menos un grupo 2'-hidroxilo de los nucleótidos en un AR ds está sustituido por un grupo químico, preferiblemente por un grupo 2'-amino o un grupo 2' -metilo. También, al menos un nucleótido puede modificarse para formar un nucleótido bloqueado. Dicho nucleótido bloqueado contiene un puente de metileno que conecta el 2 '-oxígeno de la ribosa con el 4'-carbono de la ribosa. La introducción de un nucleótido bloqueado en un oligonucleótido mejora la afinidad de secuencias complementarias y aumenta la temperatura de fusión en varios grados .

Las modificaciones de moléculas de ARNds proporcionadas aquí puede influir positivamente su estabilidad in vivo así como in vitro y también mejorar su liberación en la porción objetivo (enferma) . Además, las modificaciones estructurales y químicas pueden influir positivamente en las reacciones fisiológicas hacia las moléculas de ARNds tras la administración, por ejemplo, la liberación de citocinas que preferiblemente se suprime. Tales modificaciones estructurales y químicas son conocidas en la material y están, entre otras, ilustradas en Nawrot (2006) Current Topics in Med Chem, 6, 913-925.

Conjugar un ligando a un ARNds puede aumentar su absorción celular así como su afinidad a un tejido en particular. En ciertos casos, se conjuga un ligando hidrófobo al ARNds para facilitar la impregnación directa de la membrana celular. Alternativamente, el conjugado a ligando al ARNds es un sustrato para la endocitosis mediada por receptor. Estas aproximaciones se han utilizado para facilitar la impregnación de la célula a oligonucleótidos antisentido. Por ejemplo, se ha conjugado el colesterol a varios oligonucleótidos antisentido resultando en compuestos que son sustancialmente más activos en comparación con sus análogos no conjugados. Véase M. Manoharan Antisense & nucleic acid Drug Development 2002, 12, 103. Otros compuestos lipófilos que se han conjugado a oligonucleótidos incluye el ácido 1-piren butírico, 1 , 3 -bis-0- (hexadecil ) glicerol , y mentol . Un ejemplo de un ligando para la endocitosis mediada por receptores el ácido fólico. El ácido fólico entra en la célula mediante endocitosis mediada por receptor folato. Los compuestos de AR ds portadores de ácido fólico serán transportados de forma eficiente en la célula mediante la endocitosis mediada por receptor folato. La unión de ácido fólico al extremo 3' de un oligonucleótido resulta en un aumento de la captación celular de oligonucleótidos (Li, S.; Deshmukh, H. M . ; Huang, L. Pharm. Res. 1998, 15, 1540). Otros ligandos que se han conjugado a oligonucleótidos incluyen polietilenglicoles , bloques de carbohidrato, agentes de entrecruzamiento, conjugados de porfirina, y péptidos de liberación .

En ciertos ejemplos, la conjugación de un ligando catiónico a oligonucleótidos resulta a menudo en una resistencia mejorada a nucleasas. Ejemplos representativos de ligandos catiónicos son propilamonio y dimetilpropilamonio . Curiosamente, se ha descrito que los oligonucleótidos antisentido retienen su alta afinidad de unión al ARNm cuando el ligando catiónico se dispersa a lo largo del oligonucleótido. Véase M. Manoharan Antisense & Nucleic Acid Drug Develop ent 2002, 12, 103 y sus referencias.

El ARNds conjugado a ligando de la invención puede sintetizarse mediante el uso de un ARNds que lleve una funcionalidad reactiva terminal, como la derivada de la unión de una molécula de enlace en el ARNds. Este oligonucleótido reactivo puede reaccionar directamente con ligandos comercialmente disponibles, los ligandos que se sintetizan portando cualquier clase de grupos protectores, o ligandos que poseen una porción de unión unidas a ellos. Los métodos de la invención facilitan la síntesis de ARNds conjugado a ligando mediante el uso de, en algunas modalidades preferibles, monómeros de nucleósido que se han conjugado de forma apropiada con ligandos y que pueden además estar unidos a un material de soporte sólido. Los conjugados ligando nucleósido, opcionalmente unido a un material de soporte sólido, se preparan de acuerdo con algunas modalidades preferibles de los métodos de la invención mediante la reacción de un ligando de unión a suero seleccionado con una porción de unión localizada en la posición 5' de un nucleósido o oligonucleótido. En ciertos ejemplos, un ARNds que lleva un ligando aralquilo unido al extremo 3' del ARNds se prepara primero mediante la unión covalente de un bloque de construcción de monómero a un soporte controlado de vidrio poroso mediante un grupo aminoalquilo de cadena larga. Después, los nucleótidos se unen mediante técnicas de síntesis estándar en fase sólida al bloque de construcción de monómero unido al soporte sólido. El bloque de construcción de monómero puede ser un nucleósido u otro compuesto orgánico que es compatible con la síntesis en fase sólida.

El ARNds utilizado en los conjugados de la invención puede realizarse convenientemente y de forma rutinaria a través de técnicas bien conocidas de síntesis en fase sólida. Es también conocido el uso de técnicas similares para preparar otros oligonucleótidos , como los fosforotioatos y los derivados alquilados.

Las enseñanzas respecto a la síntesis de oligonucleótidos particulares modificados pueden encontrarse en las siguientes patentes: Patente Estadounidense No. 5.218.105, relacionada con oligonucleótidos conjugados con poliamina; Patente Estadounidense No. 5,541,307, relacionada con oligonucleótidos con estructuras modificadas; Patente Estadounidense No. 5,521,302, relacionada con procesos para preparar oligonucleótidos con enlaces quirales fosforosos; Patente Estadounidense No. 5,539,082, relacionada con péptidos de ácidos nucleicos; Patente Estadounidense No. 5.554.746, relacionada con oligonucleótidos con estructuras ß-lactama; Patente Estadounidense No. 5,571,902, relacionada con métodos y materiales para la síntesis de oligonucleótidos; Patente Estadounidense No. 5,578,718, relacionada con nucleósidos con grupos tioalquilo, en la que los grupos pueden utilizarse como enlazadoras de otras porciones unidas a cualquier posición del nucleósido; Patente Estadounidense No. 5,587,361 relacionada con oligonucleótidos con enlaces fosforotioato de alta pureza quiral; Patente Estadounidense No. 5,506,351, relacionada con procesos para la preparación de 2'-0-alquil guanosina y compuestos relacionados, incluyendo compuestos 2 , 6 -diaminopurina ; Patente Estadounidense No. 5,587,469, relacionada con oligonucleótidos con purinas N-2 sustituidas; Patente Estadounidense No. 5, 587,.470, relacionada con oligonucleótidos con 3 -deazapurinas ; Patente Estadounidense No. 5,608,046, relacionadas con análogos de nucleósido 4'-desmetilo conjugados; Patente Estadounidense No. 5,610,289, relacionada con análogos de oligonucleótido con estructura modificada; Patente Estadounidense No. 6,262,241 relacionada con, inter alia, métodos para sintetizar 2'-fluoro-oligonucleótidos .

En el ARNds conjugado a ligando y nucleósidos unidos a una secuencia específica portadora de un molécula ligando de la invención, los oligonucleótidos y oligonucleósidos pueden ensamblarse en un sintetizador de ADN adecuado utilizando los precursores de nucleótido o nucleósido estándar, o precursores conjugados de nucleótido o nucleósido que ya llevan la porción de enlace, precursores conjugados a nucleótido o nucleósido con ligando que ya llevan la molécula ligando, o bloques de construcción portadores de ligando no nucleósido.

Cuando se utilizan precursores conjugados a nucleótido que ya llevan una porción de unión, la síntesis de los nucleósidos unidos a una secuencia específica está normalmente completado, y la molécula ligando reacciona entonces con la porción de unión para formar el oligonucleótido conjugado a ligando. Los conjugados de oligonucleótido portadores de una serie de moléculas como esteroides, vitaminas, lípidos y moléculas marcadoras, se han descrito anteriormente (véase Manoharan et al., Solicitud PCT O 93/07883) . En una modalidad preferida, los oligonucleótidos o nucleósidos unidos de la invención se sintetizan mediante un sintetizador automatizado utilizando fosforamiditas derivadas de un conjugado ligando nucleósido además de las fosforamiditas disponibles comercialmente .

La incorporación de un grupo 2 ' -O-metilo, 21 -0-etilo, 2¦ -0-propilo, 2'-0-alilo, 2 ' -O-aminoalquilo o 2'-desoxi-2 ' -fluoro en nucleósidos de un oligonucleótido confiere propiedades de hibridación aumentadas al oligonucleótido. Además, los oligonucleótidos que contienen estructuras fosforotioato poseen aumentada la estabilidad de nucleasa. Así, los nucleósidos unidos funcionalizados , de la invención pueden aumentarse para incluir una estructura fosforotioato o un grupo 2' -O-metilo, 2'-0-etilo, 21 -O- propilo, 2 ' -O-aminoalquilo, 21 -O-alilo o 21 -desoxi-21 -fluoro .

En algunas modalidades preferibles, las secuencias de nucleósido funcionalizadas de la invención que poseen un grupo amino en el extremo 5' se preparan utilizando un sintetizador de ADN, y después reaccionaron con un derivado de éster activo de un ligando seleccionado. Los derivados de un éster activo son bien conocidos por los expertos en la materia. Los ésteres activos representativos incluyen ésteres de N-hidrosuccinimida, ésteres tetrafluorofenólicos , ésteres pentafluorofenólicos y ésteres pentacloro-fenólicos . La reacción del grupo amino y del éster activo produce un oligonucleótido en que el ligando seleccionado está unido a la posición 5' a través de un grupo de unión. El grupo amino en el extremo 5' puede prepararse utilizando un reactivo C6 modificador 5' -amino. En una modalidad preferida, las moléculas ligando pueden conjugarse a oligonucleótidos en la posición 5' mediante el uso de un ligando fosforamidita de nucleósido en la que el ligando está unido al grupo hidroxi 5' directamente o indirectamente mediante un enlazadora. Dicho ligando fosforamidita de nucleósido se utiliza normalmente en el extremo de un proceso de síntesis automatizado para proporcionar un oligonucleótido conjugado a ligando que lleva al ligando en el extremo 5'.

En una modalidad preferida de los métodos de la invención, la preparación de oligonucleótidos conjugado a ligando comienza con la selección de moléculas precursoras apropiadas tras la construcción de la molécula ligando.

Normalmente, el precursor es un derivado protegido apropiadamente de los nucleósidos comúnmente utilizados. Por ejemplo, los precursores sintéticos para la síntesis de los oligonucleótidos conjugados a ligando de la invención incluye, pero no se limitan a, 2 ' -aminoalcoxi-51 -ODMT-nucleósidos, 2 ' -6-aminoalquilamino-51 -ODMT-nucleósidos , 5 '-6-aminoalcoxi-21 -desoxi -nucleósidos , 5 ' -6-aminoalcoxi-2-protegidos-nucleósidos , 31 -6-aminoalcoxi-51 -ODMT-nucleósidos, y 3 ' -aminoalquilamino-5 ' -ODMT-nucleósidos que pueden estar protegidos en la porción nucleobase de la molécula. Los métodos para la síntesis de los precursores de nucleósido protegidos unidos a amino son conocidos por los expertos en la materia.

En muchos casos, se utilizan grupos protectores durante la preparación de los compuestos de la invención. Tal como se usa aquí, el término "protegido" significa que la porción indicada posee un grupo protector unido. En algunas modalidades preferibles de la invención, los compuestos contienen uno o más grupos protectores. Se puede emplear una amplia variedad de grupos protectores en los métodos de la < » invención. En general, los grupos protectores dejan las funcionalidades químicas inertes en afecciones de reacción específicas, y pueden anexarse a y eliminarse de las funcionalidades en una molécula sin dañar sustancialmente el resto de la molécula.

Los grupos protectores hidroxilo representativos, así como otros grupos protectores representativos, se describen en Greene y Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, Capítulo 2, 2a ed. , John Wiley & Sons, New York, 1991, y Oligonucleotides and Analogues A Practical Approach, Ekstein, F. Ed., IRL Press, N.Y, 1991.

Los grupos protectores amino estables al tratamiento ácido se eliminan selectivamente con tratamiento básico, y se utilizan para hacer grupos amino reactivos selectivamente disponibles para sustitución. Ejemplos de los grupos son los Fmoc (E. Atherton y R. C. Sheppard en The Peptides, S. Udenfriend, J. Meienhofer, Eds . , Academic Press, Orlando, 1987, volumen 9, p.l) y varios sulfoniletil carbamatos sustituidos ejemplificados por el grupo Nsc (Samukov et al., Tetrahedron Lett . , 1994, 35:7821.

Otros grupos protectores amino incluyen, pero no se limitan a, grupos protectores carbamato, como 2- trimetilsililetoxicarbonilo (Teoc) , 1-metil-l- (4- bifenilil) etoxicarbonilo (Bpoc) , t-butoxicarbonilo (BOC) , • aliloxicarbonilo (Alloc) , 9-fluorenilmetiloxiearbcnil-o (Fmoc) , y benciloxicarbonilo (Cbz) ; grupos protectores amida, como formilo, acetilo, trihaloacetilo, benzoilo, y nitrofenilacetilo; grupos protectores sulfonamida, como 2- nitrobencenosulfonilo; y grupos protectores imina e imida cíclica, como ftalimido y ditiasuccinoilo . También están abarcados por los compuestos y métodos de la invención los equivalentes de estos grupos protectores amino.

Muchos soportes sólidos están comercialmente disponibles y un experto en la materia puede seleccionar fácilmente un soporte sólido a utilizar en los pasos de síntesis en fase sólida. En ciertas modalidades, se utiliza un soporte universal . Un soporte universal permite la preparación de oligonucleótidos con nucleótidos inusuales o modificados localizados en el extremo 3 'del oligonucleótido. Para más detalles sobre soportes universales véase Scott et al., Innovations and Perspectives in solid-phase Synthesis, 3rd International Symposium, 1994, Ed. Roger Epton, Mayflower Worldwide, 115-124] . Además, se ha descrito que los oligonucleótidos pueden escindirse del soporte universal bajo afecciones de reacción suaves cuando el oligonucleótido está unido al soporte sólido mediante un grupo syn-1,2-acetoxifosfato que sufre más fácilmente hidrólisis básica. Véase Guzaev, A. I.; Manoharan, M. J. Am. Chem. Soc . 2003, 125, 2380.

Los nucleósidos están unidos mediante enlaces internucleósidos covalentes que contienen fósforo o sin fósforo. Con el propósito de identificar, los nucleósidos conjugados pueden caracterizarse como nucleósidos portadores de ligando o ligandos de nucleósido conjugados. Los nucleósidos unidos con un ligando aralquilo conjugado a un nucleósido dentro de su secuencia mostrará una actividad ARNds aumentada cuando se compara con compuestos ARNds similares que no están conjugados.

Los oligonucleótidos conjugados a ligandos de aralquilo de la invención también incluyen conjugados de oligonucleótidos y nucleósidos unidos en los que el ligando está unido directamente al nucleósido o nucleótido sin la mediación de un grupo enlazadora. El ligando puede estar preferiblemente unido, mediante grupos enlazadoras, a un grupo carboxilo, amino u oxo del ligando. Los grupos enlazadoras típicos pueden ser grupos éster, amida o carbamato .

Ejemplos específicos de oligonucleótidos modificados preferibles contemplados para utilizar en oligonucleótidos conjugados a ligandos de la invención incluyen oligonucleótidos que contienen estructuras modificadas o enlaces internucleósido no naturales. Como se define aquí, los oligonucleótidos con estructuras modificadas o enlaces internucleósido incluye aquellos que retienen un átomo de fósforo en la estructura y aquellos que no tienen un átomo de fósforo en la estructura. Para los propósitos de la invención, los oligonucleótidos modificados que no tienen un átomo de fósforo en su estructura interazúcar pueden también considerarse como oligonucleósidos .

Las modificaciones químicas de oligonucleótidos específicos se describen a continuación. No es necesario para todas las posiciones en un compuesto determinado modificar de forma uniforme. Al contrario, más de una modificación puede incorporarse en un compuesto ARNds único o incluso en un único nucleótido del mismo.

Enlaces internucleósido modificados o estructuras preferibles incluyen, por ejemplo, fosforotioatos , fosforotioatos quirales, fosforoditioatos , fosfotriésteres , aminoalquilfosfotriésteres , metilo y otros fosfonates de alquilo incluyendo 3 '-alquilen fosfonatos y fosfonatos quirales, fosfinatos, fosforamidatos incluyendo 3 ' -amino fosforamidato y aminoalquilfosforamidatos , tionofosforamidatos , tionoalquilfosfonatos , tionoalquilfosfotriésteres , y boranofosfatos con enlaces 3'-5' normales, análogos unidos en 2' -5' de estos, y aquellos con polaridad invertida en la que los pares adyacentes de las unidades de nucleósido están unidas en 3' -5' a 5' -3' o 2 '-5' a 5' -2'. También se incluyen varias sales, mezcla de sales y formas libres de ácidos.

Patentes Estadounidenses representativas relacionadas con la preparación de los enlaces que contienen átomos de fósforo anteriormente mencionados incluyen, pero no se limitan a, Patente Estadounidense No. 4,469,863; 5,023,243; 5,264,423; 5,321,131; 5,399,676; 5,405,939; 5,453,496; 5,455,233 y 5,466,677, cada una de ellas se incorpora aquí por referencia.

Los enlaces internucleósido o estructuras modificadas preferibles que no incluyen un átomo de fósforo en ellos (es decir, oligonucleósidos) poseen estructuras que están formadas por enlaces interazúcar de alquilo de cadena corta o cicloalquilo, heteroátomos mezclados y enlaces interazúcar alquilo o cicloalquilo, o uno o más enlaces interazúcar de heteroátomos de cadena corta o enlaces interazúcar heterocíclicos . Estos incluyen aquellos con enlaces morfolino (formados en parte a partir de la porción de azúcar de un nucleósido) ; estructuras siloxano; estructuras sulfuro, sulfóxido y sulfona; estructuras formacetilo y tioformacetilo; estructuras metilenformacetilo y tioformacetilo; estructuras que contienen alqueno; estructuras sulfamato; estructuras metilenimino y metilenhidrazino; estructuras sulfonato y sulfonamida; estructuras amida; y otras con partes de componentes mezclados de N, O, S y CH2.

Patentes Estadounidenses representativas relacionadas con la preparación de los oligonucleósidos anteriores incluyen, pero no se limitan a, Patente Estadounidense No. 5,034,506; 5,214,134; 5,216,141; 5,264,562; 5,466,677; 5,470,967; 5,489,677; 5,602,240 y 5,663,312, cada una de ellas se incorpora aquí por referencia .

En otras imitaciones de oligonucleótido preferibles, ambos enlaces azúcar e internucleósido, es decir, la estructura, de las unidades de nucleósido están sustituidas por nuevos grupos. Las unidades de nucleobase se mantienen para la hibridación con un compuesto objetivo de ácido nucleico adecuado. Uno de estos oligonucleótidos , un imitador de oligonucleótido, que ha demostrado tener excelentes propiedades de hibridación, es referido como un péptido de ácido nucleico (PNA) . En los compuestos PNA, la estructura de azúcar de un oligonucleótido se sustituye con una estructura que contiene amida, en particular una estructura aminoetilglicina . Las nucleobases se retienen y están unidas directamente o indirectamente a átomos de la porción amida de la estructura. Indicaciones de compuestos PNA pueden encontrarse en por ejemplo la Patente Estadounidense No. 5,539,082.

Algunas modalidades preferibles de la invención emplean oligonucleótidos con enlaces fosforotioato y oligonucleósidos con estructuras de heteroátomo, y en particular - -CH2- -NH- -O- -CH2- - , - -CH2- -N (CH3) --0--CH2-- [conocido como metileno (metilimino) o estructura MMI] , CH2--0--N(CH3) --CH2--, --CH2--N(CH3) --N(CH3) --CH2-- , y --0--N (CH3) - -CH2- -CH2- - [en la que la estructura nativa fosfodiéster está representada como - -0- -P- -0- -CH2- -] de la Patente Estadounidense No. 5,489,677 referenciada anteriormente, y las estructuras amida de la Patente Estadounidense No. 5,602,240 referenciada anteriormente. También son preferibles los oligonucleótidos con estructuras morfolino de la Patente Estadounidense No. 5,034,506 referenciada anteriormente .

Los oligonucleótidos empleados en los oligonucleótidos conjugados a ligando de la invención pueden adicionalmente o alternativamente comprender una nucleobase (a menudo referida simplemente como "base") modificaciones o substituciones. Tal como se usa aquí, nucleobases "sin modificar" o "naturales" incluye las bases purínicas adenina (A) y guanina (G) , y las bases pirimidínicas timina (T) , citosina (C) , y uracilo (U) . Las nucleobases modificadas incluyen otras nucleobases naturales y sintéticas, como 5-metilcitosina (5-me-C) , 5-hidroximetil citosina, xantina, hipoxantina, 2-aminoadenina, 6-metilo y otros derivados alquilo de adenina y guanina, 2 -propilo y otros derivados alquilo de adenina y guanina, 2-tiouracilo, 2-tiotimina y 2-tiocitosina, 5-halouracilo y citosina, 5-propinil uracilo y citosina, 6-azo uracilo, citosina y timina, 5-uracilo (pseudouracilo) , 4-tiouracilo, 8-halo, 8-amino, 8-tiol, 8-tioalquilo, 8-hidroxilo y otras adeninas y guaninas8-sustituidas, 5-halo particularmente 5-bromo, 5- trifluorometilo y otros uracilos y citosinas 5-sustituidas , 7-metilguanina y 7-metiladenina, 8-azaguanina y 8-azaadenina, 7-deazaguanina y 7-deazaadenina y 3-deazaguanina y 3-deazaadenina .

Otras nucleobases incluyen aquellas descritas en la Patente Estadounidense No. 3.687.808, aquellas descritas en la Concise Enciclopedia Of Polimer Science and Engineeríng, páginas 858-859, Kroschwitz, J. I., ed. John Wiley & Sons, 1990, aquellas descritas en Englisch et al., Angewandte Chemie, Edición Internacional, 1991, 30, 613, y aquellas descritas en Sanghvi, Y. S., Capítulo 15, Antisense Research and Applications, páginas 289-302, Crooke, S. T. y Lebleu, B., ed., CRC Press, 1993. Algunas de estas nucleobases son particularmente útiles para aumentar la afinidad de unión de los oligonucleótidos de la invención. Estos incluyen pirimidinas 5-sustituidas, 6 -azapirimidinas y purinas N-2, N-6 y 0-6 sustituidas, incluyendo 2-aminopropiladenina, 5-propiniluracilo y 5-propinilcitosina . Las sustituciones de 5-metilcitosina han mostrado aumentar la estabilidad del dúplex de ácido nucleico en 0.6-1.2°C. (Id., páginas 276-278) y son en la actualidad sustituciones de base preferibles, aún más particularmente cuando se combinan con modificaciones de azúcar 21 -metoxietilo .

Patentes Estadounidenses representativas relacionadas con la preparación de algunas nucleobases modificadas anteriormente mencionadas así como otras nucleobases modificadas incluyen, pero no se limitan a, la Patente Estadounidense No. 3,687,808 anteriormente mencionada, así como las Patentes Estadounidenses No, 5,134,066; 5,459,255; 5,552,540; 5,594,121 y 5,596,091 cada una de ellas se incorpora aquí por referencia.

En ciertas modalidades, el oligonucleótidos utilizado en los oligonucleótidos conjugados a ligando de la invención pueden adicionalmente o alternativamente comprender una o más porciones de azúcar sustituidas . Los oligonucleótidos preferibles comprenden uno de los siguientes en la posición 2' : OH; F; 0-, S-, o N-alquilo, O-, S-, o N-alquenilo, o 0, S- o N-alquinilo, en el que el alquilo, alquenilo y alquinilo pueden ser alquilo de Ci a Ci0 sustituido o sin sustituir o alquenilo y alquinilo C2 a C10. Particularmente preferibles son 0 [ (CH2) n0] mCH3 , 0(CH2)n0CH3, 0(CH2)nNH2, 0(CH2)nCH3, 0(CH2)nONH2, y 0 (CH2) n0N [ (CH2) nCH3) ] 2 , en los que n y m son de 1 a alrededor de 10. Otros oligonucleótidos preferibles comprenden uno de los siguientes en la posición 2' : alquilo inferior Ci a Ci0, alquilo inferior sustituido, alcarilo, aralquilo, 0-alcarilo o O-aralquilo, SH, SCH3, OCN, Cl, Br, CN, CF3 , 0CF3, S0CH3 , S02 CH3 , ON02, N02, N3, NH2, heterocicloalquilo, heterocicloalcarilo, aminoalquilamino, polialquilamino, sililo sustituido, un grupo de escisión de ARN, un grupo marcador, un intercalador , un grupo para mejorar las propiedades farmacocinéticas de un oligonucleótido, o un grupo para mejorar las propiedades farmacodinámicas de un oligonucleótido, y otros sustituyentes con propiedades similares. Un modificación preferible incluye 21 -metoxietoxi [21 -0- -CH2CH2OCH3 , también conocida como 21 -0-(2 -metoxietil) o 21 -M0E] , es decir, un grupo alcoxialcoxi . Otra modificación preferible incluye 2 ' -dimetilaminooxietoxi , es decir, un grupo 0 (CH2) 20N (CH3) 2 , también conocida como 2'-DMAOE, como se describe en la Patente Estadounidense No. 6,127,533, depositada el 30 de enero de 1998, cuyo contenido se incorpora aquí por referencia.

Otras modificaciones preferibles incluyen 21 -metoxi (2'-0--CH3), 2 ' -aminopropoxi (2 ' -OCH2CH2CH2NH2) y 2'-fluoro (21 -F) . También pueden realizarse modificaciones similares en otras posiciones en el oligonucleótido, particularmente la posición 31 del azúcar en el nucleótido 3 ' terminal o en los oligonucleótidos 2' -5' enlazados.

Tal como se usa aquí, el término "grupo sustituyente del azúcar" o "grupo 2 ' -sustituyente" incluye grupos unidos en la posición 21 - de la porción ribofuranosilo con o sin un átomo de oxígeno. Los grupos sustituyentes de azúcar incluyen, pero no se limitan a, fluoro, 0-alquilo, O-alquilamino, O-alquilalcoxi , O-alquilamino protegido, O-alquilaminoalquilo, O-alquil imidazol y poliéteres de la fórmula (O-alquil) m, en la que m es de 1 a alrededor de 10.

Entre estos poliéteres son preferibles los polietilenglicoles lineales y cíclicos (PEG) , y grupos que contienen (PEG) , como los éteres en corona y, inter alia, aquellos descritos en Delgardo et . al. (Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems 1992, 9:249), que se incorpora aquí por referencia en su totalidad. Otras modificaciones de azúcar se describen en Cook {Anti-fibrosis Drug Design, 1991, 6:585-607) . Las sustituciones fluoro, 0-alquilo, O-alquilamino, 0-alquil imidazol, O-alquilaminoalquilo, y alquil amino se describen en la Patente Estadounidense No. 6.166.197, titulada "Compuestos oligoméricos con Nucleótido (s) de Pirimidina con sustituciones en 2' y 5'" que se incorpora aquí por referencia en su totalidad.

Otros grupos sustituyentes de azúcar adecuados para la invención incluyen grupos 2'-SR y 2'-NR2, en los que cada R es, independientemente, hidrógeno, un grupo protector o alquilo, alquenilo, o alquinilo sustituido o sin sustituir. Los nucleósidos 21 -SR se describen en la Patente Estadounidense No. 5,670,633, que se incorpora aquí por referencia en su totalidad. La incorporación de sintones monoméricos 21 -SR se describe en Hamm et al. (J. Org. Chem. , 1997, 62:3415-3420). Los nucleósidos 2 ' -NR se describen en Goettingen, M . , J. Org. Chem., 1996, 61, 6273-6281; y Polushin et al., Tetra edron Lett . , 1996, 37, 3227-3230. Otros grupos sustituyentes 21 representativos adecuados para la invención incluyen aquellos de la fórmula I o II: en donde, E es alquilo de Ci -C10, N(Q3)(Q4) o N=C (Q3) (Q4) ; cada Q3 y Q4 es, independientemente, H, alquilo de Ci-Ci0, dialquilaminoalquilo, un grupo protector de nitrógeno, un grupo conjugado unido o no unido, un enlace a un soporte sólido; o Q3 y Q4, juntos, forman un grupo protector de nitrógeno o una estructura en anillo que opcionalmente incluye al menos un Heteroátomo adicional seleccionado de entre N y O; qi es un número entero de 1 a 10; q2 es un número entero de 1 a 10; q3 es 0 ó 1; q es 0 , 1 ó 2 ; cada uno de Z1# Z2 y Z3 es, independientemente, cicloalquilo de C4-C7, arilo de C5-C14 o heterociclilo de C3-Ci5, en la que el heteroátomo en el grupo heterociclilo se selecciona de oxígeno, nitrógeno y azufre; Z4 es OMi, SMi, o N(Mi)2; cada Mx es, independientemente, H, alquilo de Ci-C8, haloalquilo de Ci-C8, C (=NH)N(H)M2, C(=0)N(H)M2 o OC (=0) N (H) M2 ; M2 es H o alquilo Cx-C8; y Z5 es alquilo de Ci-Ci0, haloalquilo de C1-C10, alquenilo de C2-C10, alquinilo de C2-Ci0, arilo de C6-C14, N(Q3) (Q4) , 0Q3, halo, SQ3 o CN.

Grupos sustituyentes de 2'-0-azúcar representativos de fórmula I se describen en la Patente Estadounidense No. 6,172,209, titulada "Oligonucleótidos 21 -Oxietoxi capsulados" que se incorpora aquí por referencia en su totalidad. Grupos sustituyentes de 2'-0-azúcar representativos cíclicos de fórmula II se describen en la Patente Estadounidense No. 6.271.358, titulada "Oligonucleótidos Modificados en 2' dirigidos a ARN que están Conformacionalmente Preorganizados" que se incorpora aquí por referencia en su totalidad.

Los azúcares con sustituciones 0- en el anillo ribosilo son también adecuadas para la invención. Sustituciones representativas para el anillo O incluyen, pero no se limitan a, S, CH2, CHF, y CF2.

Oligonucleótidos pueden también tener imitadores de azúcar, como las porciones ciclobutilo, en lugar del azúcar pentofuranosilo . Patentes Estadounidenses representativas relacionadas con la preparación di los azúcares modificados incluyen, pero no se limitan a, la Patente Estadounidense No. 5,359,044; 5,466,786; 5,519,134; 5,591,722; 5,597,909; 5,646,265 y 5,700,920, todas ellas se incorporan aquí por referencia .

Pueden también realizarse modificaciones adicionales en otras posiciones del oligonucleótido, particularmente en la posición 31 del azúcar en el nucleótido31 terminal. Por ejemplo, una modificación adicional de los oligonucleótidos conjugados a ligando de la invención implica la unión química al oligonucleótido de uno o más porciones o conjugados adicionales sin ligando que aumentan la actividad, distribución celular o captación celular del oligonucleótido. Tales porciones incluyen pero no se limitan a porciones lipídicas, como una porción de colesterol (Letsinger et al., Proc . Nati. Acad. Sci. USA, 1989, 86, 6553), ácido cólico (Manoharan et al., Bioorg. Med. Che . Lett . , 1994, 4, 1053), un tioéter, por ejemplo, hexil-S-tritiltiol (Manoharan et al., Ann. N.Y. Acad. Sci., 1992, 660, 306; Manoharan et al., Bioorg. Med. Chem. Let . , 1993, 3, 2765), un tiocolesterol (Oberhauser et al., Nucí. Acids Res., 1992, 20, 533), una cadena alifática, por ejemplo, residuos dodecandiol o undecilo (Saison-Behmoaras et al . , EMBO J. , 1991, 10, 111; Kabanov et al., FEBS Lett., 1990, 259, 327; Svinarchuk et al., Biochimie, 1993, 75, 49), un fosfolípido, por ejemplo, di-hexadecil-rac-glicerol o trietilamonio 1,2-di-O-hexadecil-rac-glicero-3-H-fosfonato (Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36, 3651; Shea et al., Nucí. Acids Res., 1990, 18, 3777), una poliamina o una cadena de polietilenglicol (Manoharan et al . , Nucleosides & Nucleotides, 1995, 14, 969), o ácido acético adamantano (Manoharan et al., Tetrahedron Lett . , 1995, 36, 3651), una porción palmitilo (Mishra et al., Biochim. Biophys . Acta, 1995, 1264, 229), o una porción octadecilamina .o hexilamino-carbonil-oxicolesterol (Crooke et al., J". Pharmacol . Exp. Ther. , 1996, 277, 923) .

La invención también incluye composiciones que emplean oligonucleótidos que son casi quiralmente puros respecto a las posiciones particulares dentro de los oligonucleótidos. Ejemplos de oligonucleótidos casi quiralmente puros incluyen, pero no se limitan a, aquellos con enlaces fosforotioato que son al menos un 75% Sp o Rp (Cook et al., Patente Estadounidense No. 5.587,361) y aquellos que son casi quiralmente puros (Sp o Rp) enlaces alquilfosfonato, fosforamidato o fosfotriéster (Cook, Patente Estadounidense No. 5,212,295 y 5,521,302).

En ciertos ejemplos, el oligonucleótido puede estar modificado por un grupo sin ligando. Se han conjugado una serie de moléculas sin ligando a oligonucleótidos para aumentar la actividad, distribución celular o captación celular del oligonucleótido, y los procesos para realizar las conjugaciones están disponibles en la literatura científica. Tales porciones sin ligando incluyen porciones lipídicas, como colesterol (Letsinger et al., Proc. Nati. Acad. Sci.

USA, 1989, 86:6553), ácido cólico (Manoharan et al., Bioorg. Med. Chem. Lett . , 1994, 4:1053), un tioéter, por ejemplo, hexil-S-tritiltiol (Manoharan et al., Ann. N.Y. Acad. Sci . , 1992, 660:306; Manoharan et al., Bioorg. Med. Chem. Let . , 1993, 3:2765), un tiocolesterol (Oberhauser et al., Nucí. Acids Res., 1992, 20:533), una cadena alifática, por ejemplo, residuos dodecandiol o undecilo (Saison-Behmoaras et al., EMBO J., 1991, 10:111; Kabanov et al., FEBS Lett., 1990, 259:327; Svinarchuk et al., Biochimie, 1993, 75:49), un fosfolípido, por ejemplo, di-hexadecil-rac-glicerol o trietilamonio 1 , 2-di-0-hexadecil-rac-glicero-3-H-fosfonato (Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36:3651; Shea et al., Nucí. Acids Res., 1990, 18:3777), una poliamina o una cadena de polietilenglicol (Manoharan et al., Nucleosides & Nucleotides, 1995, 14:969), o ácido acético adamantano (Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36:3651), una porción palmitilo (Mishra et al., Biochim. Biophys . Acta, 1995, 1264:229), o uná porción octadecilamina o hexilamino-carbonil-oxicolesterol (Crooke et al., J. Pharmacol . Exp. Ther. , 1996, 277:923). Los protocolos de conjugación típicos implican la síntesis de oligonucleótidos portadores de un enlace amino en una o más posiciones de la secuencia. El grupo amino reacciona entonces con la molécula que se va a conjugar usando reactivos de acoplamiento o activación apropiados. La reacción de conjugación puede realizarse con el oligonucleótido aún unido al soporte sólido o tras la escisión del oligonucleótido en la fase en solución. La purificación del conjugado de oligonucleótido mediante HPLC, normalmente proporciona el conjugado pu o. El uso de un conjugado de colesterol es particularmente preferible ya que la porción puede aumentar la detección de tejidos en el hígado, un sitio de producción de la proteína del Factor VII.

Alternativamente, la molécula a conjugar puede convertirse en un bloque de construcción, como una fosforamidita, mediante un grupo alcohol presente en la molécula o mediante la unión de un enlazadora portador de un grupo alcohol que puede ser fosforilado.

De gran importancia, cada una de estas aproximaciones puede utilizarse para la síntesis de oligonucleótidos conjugados a ligando. Los oligonucleótidos unidos a amino pueden acoplarse directamente con un ligando a través del uso de reactivos de acoplamiento o tras la activación del ligando como NHS o éster de pentfluorofenolato . Los ligandos fosforamiditas pueden sintetizarse a través de la unión de un enlazadora aminohexanol a uno de los grupos carboxilo tras la fosfitilación de la funcionalidad alcohol terminal. Otros enlazadores, como la cisteamina, pueden también utilizarse para la conjugación a un enlazadora cloroacetilo presente en un oligonucleótido sintetizado.

Uno de los principales aspectos de la presente invención es la provisión de composiciones farmacéuticas que comprenden las moléculas de ARNds de esta invención. Dicha composición farmacéutica puede también comprender cadenas individuales de la molécula de ARNds o (a) vector (es) que comprende (n) una secuencia reguladora unida de forma operativa a una secuencia de nucleótidos que codifica al menos uno de una cadena sentido o una cadena antisentido comprendidas en las moléculas de ARNds de esta invención. También pueden utilizarse como composiciones farmacéuticas, las células y tejidos que expresan o comprenden las moléculas de ARNds aquí definidas. Tales células o tejidos pueden ser útiles en particular en las aproximaciones de trasplantes. Estas aproximaciones pueden también comprender xenotrasplantes .

En una modalidad, la invención proporciona composiciones farmacéuticas que comprende un ARNds, como se describe aquí, y un transportador farmacéuticamente aceptable. La composición farmacéutica que comprende el ARNds es útil para tratar una enfermedad o trastorno asociado con la expresión o actividad de un gen del FVII, como trastornos tromboembólicos .

Las composiciones farmacéuticas de la invención se administran en dosificaciones suficientes para inhibir la expresión de un gen del FVII. Los presentes inventores han encontrado que, debido a su eficiencia mejorada, las composiciones que comprenden el AR ds de la invención pueden administrarse en dosificaciones bajas.

En general, una dosis adecuada de ARNds estará en el intervalo de 0.01 a 5.0 miligramos por kilogramo de peso corporal del receptor por día, preferiblemente en el intervalo de 0.1 a 200 microgramos por kilogramo de peso corporal por día, más preferiblemente en el intervalo de 0.1 a 100 microgramos por kilogramo de peso corporal por día, aún más preferiblemente en el intervalo de 1.0 a 50 microgramos por kilogramo de peso corporal por día, y lo más preferible en el intervalo de 1.0 a 25 microgramos por kilogramo de peso corporal por día. La composición farmacéutica puede administrarse una vez al día, o el ARNds puede administrarse como dos, tres, cuatro, cinco, seis o más subdosis a intervalos apropiados durante el día o incluso utilizando infusión continua. En este caso, el ARNds contenido en cada subdosis debe ser correspondientemente menor para lograr la dosificación total diaria. La unidad de dosificación puede también estar compuesta para la liberación durante varios días, por ejemplo, utilizando una formulación de liberación sostenida convencional que proporciona liberación sostenida del ARNds durante periodos de varios días. Las formulaciones de liberación sostenida son bien conocidas en la técnica. En esta modalidad, la unidad de dosificación contiene el múltiplo correspondiente a la dosis diaria.

El experto en la materia apreciará que ciertos factores pueden influir en la dosificación y el tiempo necesario para tratar de forma efectiva al sujeto, lo que incluye pero no se limita a la gravedad de la enfermedad o trastorno, tratamientos previos, salud general y/o edad del sujeto, y otras enfermedades presentes. Además, el tratamiento de un sujeto con una cantidad terapéuticamente efectiva de una composición puede incluir un tratamiento único o una serie de tratamientos. Las estimaciones de dosificaciones efectivas y vidas medias in vivo para el ARNds individual abarcado por la invención puede realizarse utilizando metodologías convencionales o en base de los ensayos in vivo con un modelo animal adecuado.

La toxicidad y eficacia terapéutica de los compuestos puede determinarse mediante procedimientos farmacéuticos estándar en cultivos celulares o animales experimentales, por ejemplo, para determinar la DL50 (la dosis letal del 50% de la población) y la ED50 (la dosis terapéuticamente efectiva en el 50% de la población) . La proporción de dosis entre los efectos tóxicos y terapéuticos es el índice terapéutico y puede expresarse como la proporción DL50/ED50. Los compuestos que presentan altos índices terapéuticos son preferibles.

Los datos obtenidos de los ensayos de cultivos celulares y estudios con animales pueden utilizarse en la formulación de un intervalo de dosificación para su uso en humanos. La dosificación de las composiciones de la invención permanece preferiblemente dentro de un intervalo de concentraciones en circulación que incluye la ED50 sin o con baja toxicidad. La dosificación puede variar dentro de este intervalo dependiendo de la forma de dosificación empleada y de la ruta de administración utilizada. Para cualquier compuesto utilizado en el método de la invención, la dosis efectiva puede estimarse inicialmente a partir de ensayos de cultivos celulares. Puede formularse una dosis en modelos animales para lograr un intervalo de concentración del compuesto circulante en plasma o, cuando sea apropiado, del producto polipeptídico de una secuencia objetivo (por ejemplo, logrando una disminución de la concentración del polipéptido) que incluye la IC50 (es decir, la concentración del compuesto prueba que alcanza la inhibición media-máxima de los síntomas) como se determina en los cultivos celulares. Dicha información puede utilizarse para determinar dosis útiles más precisas en humanos. Los niveles en plasma pueden medirse, por ejemplo, mediante cromatografía líquida de alta resolución.

Además de su administración individualmente o como una pluralidad, como se ha discutido antes, el ARNds de la invención puede administrarse en combinación con otros agentes conocidos. En cualquier evento, el médico que lo administra puede ajustar la cantidad y tiempo de administración de ARNds basándose en los resultados observados utilizando las mediciones estándar de eficacia conocida en la técnica o descritas aquí.

Las composiciones farmacéuticas abarcadas por la invención pueden administrarse mediante cualquier método conocido en la técnica incluyendo, pero sin limitarse a las rutas oral o parenteral, incluyendo la administración intravenosa, intramuscular, intraperitoneal , subcutánea, transdérmica, aérea (aerosol), nasal, rectal, vaginal y tópica (incluyendo la administración bucal y sublingual) , y administración epidural . En modalidades preferibles, las composiciones farmacéuticas se administran por vía intravenosa mediante infusión o inyección.

A no ser que se defina de otra manera, todas las técnicas y términos científicos utilizados aquí, poseen el mismo significado que entiende habitualmente un experto en la materia. Aunque pueden utilizarse métodos y materiales similares o equivalentes a los descritos aquí, en la práctica o ensayo de la invención, los métodos y materiales adecuados se describen a continuación. Todas las publicaciones, solicitudes de patente, patentes, y otras referencias mencionadas aquí se incorporan por referencia en su totalidad. En caso de conflicto, la presente especificación, incluyendo las definiciones, prevalece. Además, los materiales, métodos, y ejemplos son sólo ilustrativos y no pretenden ser limitantes.

Las modalidades anteriormente mencionadas y elementos de la presente invención se ilustrarán a continuación con ejemplos no limitantes.

Figuras la y Ib- Efecto del ARNds dirigido contra el FVII ("ARNds del FVII") sobre los niveles del FVII en plasma en conejillos de indias tras una inyección i. v. de ARNds del FVII que comprende el par de SEC ID NO: 259/260 (Figura la) y ARNds que comprende par de SEC ID NO: 253/254 (Figura Ib) a 4 mg/kg en una formulación de liposomas LNPOl (1:14) . Los controles son ARNds luciferasa (pares de SEC ID NO: 411/412)/ LNPOl y PBS . Los resultados son de animales individuales.

Figuras 2a y 2b - Efecto del ARNds del FVII en conejillos de indias sobre los niveles del ARNm del FVII en hígado (Figura 2a) y los niveles del FVII en plasma (Figura 2b) tras una inyección i. v. de ARNds del FVII que comprende el par de SEC ID NO: 259/260 ("ARNsi del FVII") a l, 2, 3, 4 y 5 mg/kg en una formulación de liposomas LNPOl (1:14) . Todas las medidas se realizaron 48 horas o 72 horas tras la inyección. Los resultados de ARNm se expresan en porcentaje sobre el grupo tratado con PBS; los resultados del zimógeno del FVII se expresan en porcentaje sobre el valor previo al tratamiento. Los controles son A ds luciferasa (pares de SEC ID NO: 411/412; "ARNsi Luc")/ LNPOl y PBS. Estadística: media ± sem; *ANOVA, prueba post-hoc de Dunnett; t prueba-t múltiple .

Figura 3 - Efecto del ARNds del FVII sobre el tiempo de protrombina (PT) en conejillos de indias tras la inyección i. v. del ARNds del FVII que comprende el par de SEC ID NO: 259/260 ("ARNsi FVII") a l, 2, 3, 4, 5 mg/kg en una formulación de liposomas LNPOl (1:14) . La sangre se recogió inmediatamente antes de la inyección i.v. del ARNds del FVII (línea basal) y 48 horas o 72 horas post - inyección . Los resultados se expresan en una proporción de prolongación frente a los valores pretratamiento (media ± sem) . Los controles son ARNds luciferasa (pares de SEC ID NO: 411/412; "ARNsi Luc")/ LNPOl y PBS.

Figura 4 - Efectos antitrombóticos del ARNds del FVII en el modelo de trombosis arterial del conejillo de indias tras una inyección i.v. de ARNds del FVII que comprende el par de SEC ID NO: 259/260 ("ARNds del FVII") a 1, 2, 3, 4 y 5 mg/kg en una formulación de liposomas LNPOl (1:14) . Todas las medidas se realizaron en animales anestesiados 48 horas o 72 horas post -inyección (véanse los métodos) . Los resultados se expresan como porcentaje del grupo tratado con PBS. Los controles son ARNds luciferasa (pares de SEC ID NO: 411/412; "ARNds Luc")/ LNPOl y PBS.

Estadística: media + sem; *ANOVA, prueba post-hoc de Dunnett; t prueba-t múltiple.

Figuras 5a y 5b - Efecto del ARNds del FVII en conejillos de indias sobre los niveles del ARNm del FVII en hígado (Fig. 5a) y los niveles del FVII en plasma (Fig. 5b) tras una inyección i.v. del ARNds del FVII que comprende el par de SEC ID NO: 259/260 ("FVIIsi") a l, 2, 3, 4 y 5 mg/kg en una formulación SNALP-L. Los controles son ARNds luciferasa (pares de SEC ID NO: 411/412; "Lucsi")/ SNALP-L y PBS.

Figuras 6a y 6b - Efecto del ARNds del FVII sobre (Fig. 6a) pérdida de sangre quirúrgica y (Fig. 6b) tiempo de sangrado de la cutícula de la uña en conejillos de indias tras inyección i.v. del ARNds del FVII que comprende el par de SEC ID NO: 259/260 en una formulación SNALP-L. Los resultados se expresaron como una proporción de aumento (pérdida de sangre quirúrgica) y una proporción de la prolongación (tiempo de sangrado de la cutícula de la uña) frente al grupo tratado con PBS. Todas las medidas se realizaron 72 horas post-inyección . Los controles son ARNds luciferasa (pares de SEC ID NO: 411/412) en una formulación SNALP-L (ARNds Luc) y PBS. Con hasta un 95% de regulación negativa del FVII (de 0,05 mg/kg a 2 mg/kg de ARNds del FVII) , no se observó un aumento en la propensión al sangrado en ambos modelos .

Figura 7 -Correlación entre la actividad del FVII en plasma y la prolongación del PT. La actividad del FVII reducida tras la inyección i.v. del AR ds del FVII (datos combinados del ARNds del FVII formulado en LNP01 y SNALP-L) correlaciona bien con el parámetro de coagulación PT dependiente de FVII.

Figura 8 - Actividad del FVII en plasma de mono cynomolgus medida mediante un ensayo cromogénico tres veces antes de la dosificación y a las 24 horas y 48 horas tras la inyección de bolo i.v. única de ARNds luciferasa (par SEC ID 411/412) o ARNds del FVII (SEC ID NO 19/20) . La dosis respecto al ARNds se proporciona para cada grupo en mg/kg. N = 2 monos cynomolgus hembra. Los valores están normalizados respecto a la media de los valores de actividad del FVII previos a la dosificación de cada mono individual, con barras de error que indican la desviación estándar.

Figura 9 - Tiempo de protrombina (PT) en plasma de cynomolgus medida tres veces previo a la dosificación y a las 24 horas y 48 horas tras la inyección única de bolo i.v. de ARNds luciferasa en una formulación SNALP (LUCsi) (par de SEC ID NO: 411/412) o ARNds del FVII en una formulación SNALP (FVIIsi) (SEC ID NO 19/20) . La dosis respecto a ARNds se proporciona para cada grupo en mg/kg. N = 2 monos cynomolgus hembras . Los valores se proporcionan como una proporción normalizada respecto a la media del PT previo a la dosificación de cada mono individual, con barras de error que indican la desviación estándar.

Figura 10 - Actividad del FVII en plasma de mono cynomolgus medida mediante un ensayo cromogénico tres veces antes de la dosificación y a las 24 horas y 48 horas tras la inyección única de bolo i.v. de ARNds luciferasa en una formulación SNALP (LUCsi) (par de SEC ID NO: 411/412) o ARNds del FVII en una formulación SNALP (FVIIsi) (SEC ID NO 19/20) . La dosis respecto al ARNds se proporciona para cada grupo en mg/kg. N = 2 monos cynomolgus macho, excepto para el grupo con 1 mg/kg de ARNds del FVII en el que n = 3 monos cynomolgus macho y el grupo con 3 mg/kg de ARNds luciferasa en el que n = 2 monos cynomolgus hembra. Los valores están normalizados respecto a la media de los valores de actividad del FVII previos a la dosificación de cada mono individual, fijados a 100%. Las barras de error indican los valores mín./máx. en los monos de cada grupo.

Figura 11 - Tiempo de protrombina (PT) en plasma de mono cynomolgus medida tres veces previamente a la dosificación y a las 24 y 48 horas tras la inyección única de bolo i.v. de ARNds luciferasa en una formulación SNALP (LUCsi) (par de SEC ID NO: 411/412) o ARNds del FVII en una formulación SNALP (FVIIsi) (SEC ID NO 19/20) . La dosis respecto a ARNds se proporciona para cada grupo en mg/kg. N = 2 monos cynomolgus machos, excepto para el grupo con 1 mg/kg de ARNds del FVII en el que n = 3 monos cynomolgus macho y el grupo con 3 mg/kg de ARNds luciferasa en el que n = 2 monos cynomolgus hembra. Los valores se proporcionan como una proporción del cambio del PT normalizada respecto a la media de los valores de PT previos a la dosificación de cada mono individual, fijados a 1. Las barras de error indican los valores mín./máx. en los monos de cada grupo.

Figura 12 - Actividad del FVII en suero de cynomolgus seguida a lo largo del tiempo antes y después de la inyección única de bolo i.v. de ARNds luciferasa en una formulación SNALP (LUCsi) (par de SEC ID NO: 411/412) o ARNds del FVII en una formulación SNALP (FVIIsi) (SEC ID NO 19/20) . La actividad del FVII se midió mediante un ensayo cromogénico tres veces antes de la dosificación y a intervalos temporales indicados tras la dosificación. La dosis con respecto al ARNds se proporciona para cada animal como mg/kg y los números indican la Id. individual del animal en este estudio. Las curvas están normalizadas respecto a la media previa a la dosificación de cada animal fijada en el 100% el día de la inyección.

Figura 13 - Tiempo de protrombina (PT) en plasma de cynomolgus seguido a lo largo del tiempo antes y después de la inyección única de bolo i.v. de ARNds luciferasa en una formulación SNALP (LUCsi) (par de SEC ID NO: 411/412) o ARNds del FVII en una formulación SNALP (FVIIsi) (SEC ID- NO 19/20).

El PT se midió tres veces previamente a la dosificación y a intervalos temporales indicados tras la dosificación. La dosis respecto a ARNds se proporciona en mg/kg para cada animal y los números indican la Id. de cada animal individual del estudio. Los valores se proporcionan como la proporción del cambio del PT y las curvas están normalizadas respecto a la media previa a la dosificación de cada animal, fijada a 1 el día de la inyección.

Figura 14 - Actividad del FVII en plasma de mono cynomolgus seguida a lo largo del tiempo antes y después de inyecciones repetidas de bolo i.v. de ARNds del FVII en una formulación SNALP (FVIIsi) (SEC ID NO 19/20) a 3 mg/kg. La actividad del FVII se midió mediante un ensayo cromogénico tres veces antes de la dosificación y a intervalos temporales indicados tras la dosificación. Las curvas están normalizadas respecto a la media previa a la dosificación de cada animal fijada en el 100% el día de la primera inyección.

Figura 15 - Tiempo de protrombina (PT) en plasma de mono cynomolgus seguido a lo largo del tiempo antes y después de inyecciones repetidas de bolo i.v. de ARNds del FVII en una formulación SNALP (FVIIsi) (SEC ID NO 19/20) . El PT se midió tres veces previamente a la dosificación y a intervalos temporales indicados tras la dosificación con 3 mg/kg. Los valores se proporcionan como la proporción de cambio del PT y las curvas están normalizadas respecto a la media previa a la dosificación de cada animal, fijada a 1 el día de la inyección.

Figura 16- Efecto del ARNds del FVII que comprende el par de SEC ID NO: 13/14 sobre el silenciamiento de secuencias no objetivo.. Expresión de la proteína luciferasa de renilla tras la transfección de células C0S7 que expresan construcciones de luciferasa dual, representativas de una objetivo del A Nm del FVII 19-mero . ("on") o de secuencias predecibles in silico no objetivo (de "off 1" a "off 10"; siendo de "off 1" a "off 8" secuencias no objetivo de cadena antisentido y de "off 9" a "off 10" secuencias no objetivo de cadena sentido) , con ARNds del FVII 50 nM. Los ARNds con secuencias no objetivo con hibridación perfecta son controles positivos del silenciamiento funcional de la objetivo correspondiente.

Figura 17- Efecto del ARNds del FVII que comprende el par de SEC ID NO: 19/20 sobre el silenciamiento de secuencias no objetivo. Expresión de la proteína luciferasa de renilla tras la transfección de células C0S7 que expresan construcciones de luciferasa dual, representativas de una objetivo del ARNm del FVII 19-mero ("on") o de secuencias predecibles in silico no objetivo (de "off 1" a "off 17"; siendo de "off 1" a "off 14" secuencias no objetivo de cadena antisentido y de "off 15" a "off 17" secuencias no objetivo de cadena sentido) , con ARNds del FVII 50 nM. Los ARNds con secuencias no objetivo con hibridación perfecta son controles positivos del silenciamiento funcional de la objetivo correspondiente. El objetivo del ARNm del factor VII se clonó con los mismos 10 nucleótidos anteriores y posteriores que la off 11 para generar una objetivo funcional.

Figura 18- Efecto del AR ds del FVII que comprende el par de SEC ID NO: 11/12 sobre el silenciamiento de secuencias no objetivo. Expresión de la proteína luciferasa de renilla tras la transfección de células C0S7 que expresan construcciones de luciferasa dual, representativas de una objetivo del ARNm del FVII 19-mero ( "on" ) o de secuencias predecibles in silico no objetivo (de "off 1" a "off 16"; siendo de "off 1" a "off 13" secuencias no objetivo de cadena antisentido y de "off 14" a "off 16" secuencias no objetivo de cadena sentido) , con ARNds del FVII 50 nM. Los ARNds con secuencias no objetivo con hibridación perfecta son controles positivos del silenciamiento funcional de la objetivo correspondiente. El objetivo del ARNm del factor VII se clonó con los mismos 10 nucleótidos anteriores y posteriores que la off 11 del par de SEC ID para generar un objetivo funcional.

Tabla 1 - ARNds dirigido contra el gen humano del Factor VII. Las letras en mayúsculas representan los nucleótidos de ARN, las letras en minúsculas "c" , "g" , "a" y "u" representan nucleótidos O-metilo modificados en 2', "s" representa fosforotioato y "dT" desoxitimidina .

Tabla 2 - Caracterización del ARNds dirigido contra el factor VII humano: ensayo de actividad en respuesta a dosis en células Huh7. CI 50: concentración inhibidora en un 50%.

Tabla 3 - Caracterización del ARNds dirigido contra el factor VII humano: estabilidad e inducción de citocinas. t½: vida media de una cadena como la definida en los ejemplos, PBMC: células mononucleares de sangre periférica humana .

Tabla 4 - ARNds dirigido contra el gen del factor VII del conejillo de indias. Las letras en mayúsculas representan los nucleótidos de ARN, las letras en minúsculas "c" , "g" , "a" y "u" representan nucleótidos O-metilo modificados en 2', "s" representa fosforotioato y "dT" desoxitimidina . "f" representa una modificación fluoro en 2 ' del nucleótido precedente.

Tabla 5 - Caracterización de ARNds dirigido contra el factor VII del conejillo de indias. CI 50: concentración inhibidora en un 50%. PBMC: células mononucleares de sangre periférica humana.

Tabla 6 - ARNds dirigido contra el gen del factor VII humano. Las letras en mayúsculas representan los nucleótidos de ARN y "T" representa desoxitimidina.

Tabla 7 - ARNds dirigido contra el factor VII del conejillo de indias. Las letras en mayúsculas representan los nucleótidos de ARN y "T" representa desoxitimidina .

Tabla 8 - Secuencias no objetivo seleccionadas del ARNds dirigido contra el FVII humano que comprende el par de SEC ID NO: 13/14.

Tabla 9 - Secuencias no objetivo seleccionadas del ARNds dirigido contra el FVII humano que comprende el par de SEC ID NO: 19/20.

Tabla 10 - Secuencias no objetivo seleccionadas del ARNds dirigido contra el FVII humano que comprende el par de SEC ID NO: 11/12.

EJEMPLOS Identificación de los ARNds para uso terapéutico El diseño de ARNds se realizó para identificar los ARNds específicamente dirigidos frente al factor VII humano para su uso terapéutico. En primer lugar, las secuencias de ARNm humanas (Homo sapiens) conocidas del factor VII (NM 019616 y NM 000131.3 listadas como SEC ID NO: 406 y SEC ID NO: 407) se examinaron mediante un análisis computarizado para identificar secuencias homologas de 19 nucleótidos que resulta en agentes de ARN de interferencia ( iARN) reactivos con estas secuencias.

En la identificación de agentes de iARN, la selección se limitó a secuencias de 19 -mero con al menos 2 desparej amientos con cualquier otra secuencia de la base de datos de humano RefSeq (versión 25) , que se asume que representa el transcriptoma humano completo, utilizando el algoritmo fastA.

La CDS (secuencia codificante) del gen del factor VII del mono cynomolgus (Macaca fascicularis) se secuenció tras una amplificación con RT-PCR a partir de 16 monos. Esta secuencia junto complemento inverso del NCBI EST/EMBL BB885059 EST (SEC ID No. 408) se utilizó para generar una secuencia consenso representativa (véase el SEC ID NO: 409) del factor VII del mono cynomolgous .

Se definieron los ARNds reactivos frente al factor VII humano así como frente al del mono cynomolgous como los más preferibles para su uso terapéutico. Todas las secuencias que contienen 4 o más G consecutivas (secuencias poli-G) se excluyeron de la síntesis.

Las secuencias así identificadas forman la base de la síntesis de los agentes de iARN de las Tablas 1 y 6.

Identificación de los ARNds para la evidencia in vivo de estudios conceptuales Se realizó un diseño de ARNds para identificar los ARNds dirigidos a conejillo de indias (Cavia porcellus) para los experimentos in vivo de comprobación del concepto así como del factor VII humano con el propósito de un cribado precedente in vi tro. En primer lugar, el transcrito que se predice en ENSEMBL para el factor VII de conejillo de indias (ENSCPOT00000005353 , SEC ID NO: 410) y las dos secuencias de ARNm conocidas del factor VII humano ( M 019616 y NM 000131.3 listadas como SEC ID NO: 406 y SEC ID NO: 407) se examinaron mediante análisis computarizado para identificar las secuencias homologas de 19 nucleótidos que resultan en un agente de iARN reactivo con estas secuencias.

Todas las secuencias que contienen cuatro o más G consecutivas (secuencias poli-G) se excluyeron de la síntesis. Las secuencias así identificadas forman la base para la síntesis de los agentes de iARN de las Tablas 4 y 7.

Síntesis de ARNds Cuando aquí no se proporciona específicamente el origen de un reactivo, este reactivo se puede obtener de cualquier distribuidor de reactivos para biología molecular con un estándar de calidad/ pureza para aplicación en biología molecular.

Los ARN de cadena sencilla se obtuvieron mediante síntesis en fase sólida en una escala de 1 µ???? utilizando un sintetizador Expedite 8909 (Applied Biosystems, Applera Deutschland GmbH, Darmstadt, Alemania) y como soporte sólido vidrio de poro controlado (CPG, 500 Á, Proligo Biochemie GmbH, Hamburgo, Alemania) . El ARN y el ARN que contiene nucleótidos 2'-0-metilo se generaron mediante síntesis en fase sólida utilizando las correspondientes fosforamiditas y fosforamiditas 2'-0-metilo, respectivamente (Proligo Biochemie GmbH, Hamburgo, Alemania) . Estos bloques de construcción se incorporaron en puntos seleccionados de la secuencia de la cadena oligoribonucleótido utilizando química de nucleósidos fosforamidita estándar como la descrita en Current protocols in nucleic acid chemistry, Beaucage, S.L. et al. (Ed.), John Wiley & Sons, Inc., New York, NY, EEUU. Se introdujeron las uniones fosforotioato mediante reemplazo de la solución oxidante de yodo por una solución del reactivo de Beaucage (Chruachem Ltd, Glasgow, UK) en acetonitrilo (1%) . Otros reactivos auxiliares se obtuvieron de Mallinckrodt Baker (Griesheim, Alemania) .

La desprotección y purificación de los oligoribonucleótidos brutos mediante HPLC de intercambio de aniones se realizó de acuerdo con procedimientos establecidos. Los rendimientos y concentraciones se determinaron mediante absorción de UV de una solución del respectivo ARN a una longitud de onda de 260 nm utilizando un espectrofotómetro (DU 640B, Beckman Coulter GmbH, UnterschleiSheim, Alemania) . El ARN de doble cadena se generó mezclando una solución equimolar de cadena complementaria en tampón de hibridación (fosfato sódico 20 mM, pH 6.8; cloruro sódico 100 mM) , se calentó en un baño de agua a 85-90°C durante 3 minutos y se enfrió hasta temperatura ambiente durante un periodo de 3-4 horas. La solución de ARN hibridada se guardó a -20°C hasta su utilización.

Análisis de la actividad La actividad del ARNds del factor VII descrita anteriormente se analizó in células Huh7.

Las células Huh7 en cultivo se utilizaron para la cuantificación del ARNm del factor VII mediante el ADN ramificado en ARNm total derivado de células incubadas con ARNds específicos del factor VII.

Las células Huh7 se obtuvieron de la American Type Culture Collection (Rockville, Md., No. cat . HB-8065) y se cultivaron en DMEM/F-12 sin rojo fenol (Gibco Invitrogen, Germany, No. cat. 11039-021) suplementado para que contenga un 5% de suero fetal bovino (FCS) (Gibco Invitrogen No. cat. 16250-078) , penicilina/estreptomicina al 1% (Gibco Invitrogen, No. cat. 15140-122) a 37°C en una atmósfera con C02 al 5% en una incubadora humidificada (Heraeus HERAcell, Kendro Laboratory Products, Langenselbold, Alemania) .

La siembra de las células y la transfección de ARNds se realizaron al mismo tiempo. Para la transfección con ARNds, las células Huh7 se sembraron a una densidad de 2.5 x 104 células/ cavidad en placas de 96 cavidades. La transfección de ARNds se realizó con lipofectamina 2000 (Invitrogen GmbH, Karlsruhe, Alemania, No. cat. 11668-019) como describe el fabricante. En un primer experimento de dosis única, los ARNds se transfectaron a una concentración de 30 nM en células Huh7. Cada punto se determinó por cuadruplicado. Se realizaron dos experimentos independientes. Los ARNds más efectivos que muestran una supresión de ARNm superior al 70% en un cribado de dosis única a 30 nM se caracterizaron posteriormente mediante curvas de respuesta a la dosis. Para estas curvas de respuesta a la dosis, las transfecciones se realizaron como se describe para el cribado de dosis única anterior, pero con las siguientes concentraciones de ARNds (nM) : 24, 6, 1.5, 0.375, 0.0938, 0.0234, 0.0059, 0.0015, 0.0004 y 0.0001 nM. Tras la transfección las células se incubaron durante 24 h a 37°C y al 5% de C02 en una incubadora humidificada (Heraeus GmbH, Hanau, Alemania) . Para medir el ARNm del factor VII se utilizó el equipo más sensible para la cuantificación mediante ADNb de ARNm, QuantiGene 2.0 Assay Kit (Panomics, Fremont, Calif., USA, No. cat . QS0011) mientras que para la medida del ARNm de GAP-DH se utilizó el equipo QuantiGene 1.0 Assay Kit (Panomics, Fremont, Calif., USA, No. Cat. QG0004) . Las células Huh7 transfectadas se recogieron y lisaron a 53 °C siguiendo los procedimientos recomendados por el fabricante. Se incubaron 50 µ? de lisado con los juegos de sondas específicos del ARNm del factor VII humano, o del factor VII de conejillo de indias respectivamente (véase las secuencia de los juegos de sondas a continuación) y se procesaron de acuerdo con el protocolo del fabricante mediante QuantiGene. Para la medida del ARNm de GAP-DH se analizaron 10 µ? del lisado celular con el juego de sondas específico de GAP-DH. Se midió la quimioluminiscencia en un Victor2 -Light (Perkin Elmer, Wiesbaden, Alemania) en ULR (unidades de luz relativa) y los valores obtenidos con el juego de sondas del factor VII humano se normalizaron respecto a sus respectivos valores de GAPDH humano para cada cavidad. Como control negativo se utilizaron ARNds de control no relacionados. Los datos de inhibición se proporcionan en las tablas 2 y 5.

Secuencias de las sondas de AD b para la determinación del factor VII humano Nombre SEC ID FPL Función Secuencia NO.

F71 LE TCGGGCAGGCAGAGGGTTTTTGAAGTTACCGTTTT 349 F72 LE CGTCCTCTCAGAGAACGTCCGTTTTTTCTGAGTCAAAGCAT 350 F73 CE AAGCGCACGAAGGCCAGTTTTTCTCTTGGAAAGAAAGT 351 F74 CE CCAGCCGCTGACCAATGAGTTTTTCTCTTGGAAAGAAAGT 352 F75 LE CGGTCCAGCAGCTGGCCTTTTTGAAGTTACCGTTTT 353 F76 LE GGGCCGTGGCGCCATTTTTCTGAGTCAAAGCAT 354 F77 CE CGTTGAGGACCATGAGCTCCATTTTTCTCTTGGAAAGAAAGT 355 F78 BL GGTCATCAGCCGGGGCA 356 F79 BL GACTGCTGCAGGCAGTCCTG 357 F710 LE GGGAGTCTCCCACCTTCCGTTTTTTGAAGTTACCGTTTT 358 F711 LE CAGAACATGTACTCCGTGATATTTGTTTTTCTGAGTCAAAGCAT 359 F712 CE CCATCCGAGTAGCCGGCATTTTTCTCTTGGAAAGAAAGT 360 F713 LE CCTTGCAGGAGTCCTTGCTGTTTTTGAAGTTACCGTTTT 361 F714 LE GTGGGCCTCCACTGTCCCTTTTTCTGAGTCAAAGCAT 362 F715 CE CCCGGTAGTGGGTGGCATTTTTTCTCTTGGAAAGAAAGT 363 F716 LE CCCGTCAGGTACCACGTGCTTTTTGAAGTTACCGTTTT 364 F717 LE TGGCCCCAGCTGACGATGTTTTTCTGAGTCAAAGCAT 365 F718 CE CACGGTTGCGCAGCCCTTTTTCTCTTGGAAAGAAAGT 366 Nombre SEC ID FPL Función Secuencia NO.

F719 LE GTGTACACCCCAAAGTGGCCTTTTTGAAGTTACCGTTTT 367 F720 LE TCGATGTACTGGGAGACCCTGTTTTTCTGAGTCAAAGCAT 368 Secuencias de las sondas de AD b para determinación de GAPDH humano LE= extensor de la marca, CE= extensor de la captura, BL= sonda de bloqueo Estabilidad de los ARNds La estabilidad de los ARNds se determinó en ensayos in vi tro con suero o plasma humano de mono cynomolgous mediante la mediada de la vida media de cada cadena sencilla.

Las medidas se realizaron por triplicado para cada punto temporal, utilizando 3 µ? de muestra de ARNds 50 µ? mezclada con 30 µ? de suero humano o plasma de cynomolgous (Sigma Aldrich) . Las mezclas se incubaron durante 0 min, 30 min, 1 h, 3 h, 6 h, 24 h o 48 h a 37°C. Como control de la degradación inespecífica, el ARNds se incubó con 30 µ? de PBS lx pH 6.8 durante 48h. Las reacciones se detuvieron mediante la adición de 4 µ? de proteinasa K (20 mg/ml) , 25 µ? de "solución de lisis tisular y celular" (Epicentre) y 38 µ? de agua Millipore durante 30 min a 65°C. A continuación las muestras se filtraron por centrifugación a través de una placa de filtración de 96 cavidades de 0.2 µp? a 1400 rpm durante 8 min, se lavaron dos veces con 55 µ? de agua Millipore y se filtraron por centrifugación de nuevo.

Para la separación de cadenas sencillas y el análisis del producto de longitud completa restante (FPL) , las muestras se sometieron a HPLC de intercambio iónico Summit Dionex bajo afecciones desnaturalizantes utilizando como eluyente A Na3P04 20 mM en ACN al 10% pH=ll y como eluyente B NaBr 1 M en eluyente A.

Se aplicó el siguiente gradiente: Tiempo %A %B -1.0 min 75 25 1.00 min 75 25 19.0 min 38 62 19.5 min 0 100 21.5 min 0 100 22.0 min 75 25 24.0 min 75 25 Para cada inyección, los cromatogramas se integraron automáticamente mediante el programa Chromeleon 6.60 de HPLC Dionex, y se ajustaron manualmente en caso de ser necesario. Todas las áreas de los picos se corrigieron con el pico del estándar interno (IS, por sus siglas en inglés) y se normalizaron respecto a la incubación a t=0 min. El área bajo el pico y el FPL resultante restante se calculó para cada cadena sencilla y por triplicado de forma separada. La vida media (ti/2) de una cadena se definió como la media del punto temporal [h] de los triplicados en el que .la mitad del FPL se degrada. Los resultados se proporcionan en las tablas 3 y 5.

Inducción de citocinas La potencial inducción de citocinas por los AR ds se determinó midiendo la liberación de INF-a y TNF-a en un ensayo in vitro con PBMC.

Las células mononucleares de sangre periférica humana (PBMC) se aislaron a partir de la capa leucoplaquetar de la sangre de dos donantes mediante centrifugación en Ficoll el día de la transfección. Las células se transfectaron por cuadruplicado con ARNds y se cultivaron •durante 24 h a 37°C a una concentración final de 130 nM en Opti-MEM, utilizando Gene Porter 2 (GP2) o DOTAP . Como controles positivos se utilizaron secuencias de ARNds que se sabe que inducen INF-a y TNF- en este ensayo, así como un oligo CpG. Los AR ds conjugados químicamente u oligonucleótidos CpG que no necesitan un un reactivo de transfección para la inducción de citocinas, se incubaron a una concentración de 500 nM en medio de cultivo. Al final de la incubación, los cuatro sobrenadantes del cultivo se agruparon .

Entonces se midió el INF-a y TNF-a en estos sobrenadantes agrupados mediante un ELISA estándar en sándwich con dos puntos de datos por grupo. El grado de inducción de las citocinas se expresó con relación a los controles positivos utilizando una puntuación de 0 a 5, en la que 5 indica una inducción máxima. Los resultados se proporcionan en las tablas 3 y 5.

Efectos in vivo del ARNds dirigido frente al FVII (de conejillo de indias) Efectos antitrombóticos La actividad del ARNds del FVII descrito anteriormente se analizó en un modelo de trombosis arterial validado en conejillo de indias, previamente desarrollado para la valoración de la eficacia in vivo de nuevos fármacos antitrombóticos (Himber J. et al., Thromb Haemost . (2001); 85:475-481) .

Se anestesiaron conejillos de indias macho (350-450 g, CRL: (HA) BR, Charles River (Alemania) mediante inducción i. m. con quetamina-HCl 90 mg/kg y Xilazina 10 mg/kg al 2%, seguido de anestesia continua con gas. Se liberó isofluorano 1-3% en Vol en 02/aire 40:60 a través de un vaporizador mediante una máscara de doble inhalación que proporciona el anestésico y elimina el exceso de vapores de forma simultánea (Provet AG, Suiza) . La temperatura corporal se mantuvo termostáticamente a 38°C.

El conejillo de indias se situó en posición dorsal y se introdujo un catéter (TriCath In 22G, 0.8 mm x 30 mm, Codan Steritex ApS, Espergaerde, Dinamarca) en la arteria femoral derecha para el muestreo de sangre. La arteria carótida derecha se se expuso mediante disección y se situó una sonda de flujo ultrasónica perivascular (Transonic 0.7 PSB 232) acoplada a un módulo de medida del flujo Transit Time (TS420, Transonic Systems Inc. Ithaca, NY, USA) alrededor de la arteria carótida para monitorizar la velocidad del flujo sanguíneo. La velocidad del flujo sanguíneo en la carótida se registró con un Graphtec Linear recorder VII (Modelo WR 3101, Hugo Sachs, March-Hugstetten, Alemania) .

Tras un periodo de estabilización del flujo sanguíneo de 5 a 15 minutos, se indujo daño del subendotelio dos milímetros distal de la sonda de flujo pellizcando un segmento de 1 mm de la arteria carótida diseccionada con unas pinzas cubiertas de goma durante 10 segundos. Tras el daño aparece un descenso gradual del flujo sanguíneo que resulta en una oclusión completa del vaso. Cuando el flujo alcanza el cero, una suave agitación de la arteria carótida en la zona dañada desaloja el trombo oclusivo y restaura el flujo, lo que resulta en variaciones cíclicas del flujo (CFV, por sus siglas en inglés) . Si no se observaban CFV durante 8 minutos, el pellizcado se repetía en el lugar de primer daño. Si no aparecía CFV entonces se repetía el mismo procedimiento cada 8 minutos. Finalmente, se contaron el número de pellizcos necesarios para producir las CFV a lo largo del periodo de observación de 40 minutos. Utilizando este protocolo, la periodicidad media de cada CFV fue aproximadamente de 3 a 5 min/ciclo en los animales control . Se calculó un índice de trombosis como l proporción entre el número de CFV y el número de pellizcos.

Se inyectó el ARNds del FVII descrito anteriormente en la vena yugular de los conejillos de indias anestesiados 48 ó 72 horas previamente al daño en la pared vascular. Se recogió sangre en una solución de citrato sódico 108 mM (volumen 1:10) antes del inicio de la inyección de fármacos y antes del daño en la pared vascular.

Tiempo de sangrado y pérdida de sangre El tiempo de sangrado de la cutícula de la uña (NCBT, por sus siglas en inglés) se realizó como se ha descrito previamente (Himber J. et al., Thromb Haemost. (1997) 78:1142-1149). El NCBT se valoró en el mismo animal en el que se indujo una trombosis arterial mediante daño mecánico. En el conejillo de indias anestesiado, se realizó un corte estándar con una tijera para uñas en el ápice de la cutícula de la uña de las patas delanteras y la pata se mantuvo en contacto con una superficie de agua a 37°C a la que la sangre fluía. El tiempo de sangrado se define como el tiempo tras el corte transversal de la cutícula en el que el sangrado se detiene completamente. En el caso de re-sangrado a lo largo de dos minutos el tiempo de sangrado se añade al tiempo desangrado inicial. Este procedimiento se realizó de forma simultánea por triplicado inmediatamente tras el periodo de trombosis experimental de 40 minutos. Los resultados se expresan como una proporción de prolongación del valor del grupo control .

La pérdida de sangre quirúrgica (SBL, por sus siglas en inglés) también se midió en el mismo animal inmediatamente tras el NCBT. El conejillo de indias anestesiado se sitúa en posición ventral, se afeita el cuello y se practica una incisión media (longitud de 40 a 50 mm, profundidad de 5 mm) desde las orejas a la escápula con un bisturí (AESCULAP BB 524) . Inmediatamente tras la incisión la sangre se empapó con un rollo de algodón dental (N°l-14 111 00, 0 8 mm, longitud 40 mm, Internationale Verbandstoff Fabrik, Neuhausen, Suiza) situado longitudinalmente en la herida. El rollo de algodón dental se pesó antes y tras 5 minutos situado en la herida y la diferencia entre el peso se definió como la pérdida de sangre (en mg) en 5 minutos. La pérdida de sangre total valorada durante 1 hora se corresponde al sumatorio de sangre empapada en los 12 rollos de algodón dental situados en la herida a lo largo del periodo de medida de una hora.

El animal se sacrificó posteriormente mediante una inyección i.v. de pentobarbital (100 mg/kg) y se separo el hígado rápidamente. Un gramo de hígado se congeló inmediatamente en nitrógeno líquido para la determinación del ARNm del FVII como se ha descrito anteriormente.

Ensayos con plasma Los niveles del FVII en plasma de conejillo de indias se determinaron mediante la utilización de un ensayo cromogénico comercial (BIOPHEN FVII kit; ref . 221304, HYPHEM BioMed, Francia) . Los niveles del FVII se expresaron como un porcentaje de los valores previos al tratamiento. El tiempo de protrombina (PT) se utilizó como marcador de la coagulación y tendencia de sangrado y se determinó utilizando factor tisular humano recombinante (Dade Innovin, Dade Behring, Marburg, Alemania) como activador y el tiempo de tromboplastina parcial activada (aPTT, por sus siglas en inglés) se determinó mediante la utilización de fosfolípidos como activador (Dade Actin, Dade Behring, Marburg, Alemania) . Los PT y aPTT se midieron en un ACL3000plus Coagulation Systems Analyzer y se expresan como la proporción de la prolongación respecto a los valores previos al tratamiento.

La aminotransferasa de alanina (ALT) y la aminotransferasa de aspartato (AST) se midieron utilizando un Analizador Automático Hitachi 912 (Boehringer Mannheim, Alemania) y los equipos ALT Kit No. 10851132216, AST (Asat/Got) Kit n° 10851124216, Roche Diagnostics, Suiza) .

También se recogieron muestras de sangre en EDTA para las medidas de contaje de células sanguíneas, plaquetas y hematocrito (Cobas Helios VET, F. Hoffmann-La Roche, Basel, Suiza) .

Los ARNds se formularon en LNP01 como se ha descrito previamente (Akinc, A. et al., Nature Biotech 2008, 26(5) :561-9.). Además, se probaron ARNds formulados en SNALP-L (Judge A.D. et al., J. Clinic. Invest . 2009, 119 (3) : 661-73.) .

Secuencias de las sondas de ADNb para la determinación del factor VII de conejillo de indias Nombre SEC ID FPL Función Secuencia NO. cpoFak7 001 CE ggttcctccatgcattccgtTTTTTctcttggaaagaaagt 380 cpoFak7 002 CE ggcctcctcgaatgtgcatTTTTTctcttggaaagaaagt 381 cpoFak7 003 CE ggcaggtgcctccgttctTTTTTctcttggaaagaaagt 382 cpoFak7 004 CE ttcgggaggcagaagcagaTTTTTctcttggaaagaaagt 383 Nombre SEC ID FPL Función Secuencia NO. cpoFak7 005 CE cagttccggccgctgaagTTTTTctcttggaaagaaagt 384 cpoFak7 006 CE agtgcgctcctgtttgtctcaTTTTTctcttggaaagaaagt 385 cpoFak7 ggtggtcctgaggatctcccTTTTTaggcataggacccgtgtc 007 LE t 386 cpoFak7 cccagaactggttcgtcttctcTTTTTaggcataggacccgtg 008 LE tct 387 cpoFak7 caccattctcattgtcacagatcagcTTTTTaggcataggacc 009 LE cgtgtct 388 cpoFak7 010 LE gcgcgtgtctcccttgcgTTTTTaggcataggacccgtgtct 389 cpoFak7 011 LE gcgtggcaccggcagatTTTTTaggcataggacccgtgtct 390 cpoFak7 012 BL tggtccccgtcagtatatgaag 391 cpoFak7 013 BL ggcaagggtttgaggcacac 392 cpoFak7 014 BL tgtacagccggaagtcgtctt 393 cpoFak7 015 BL gtcactgcagtactgctcacagc 394 Secuencias de las sondas de ADNb para determinación de GAPDH de rata Nombre SEC ID FPL Función Secuencia NO. rGAPDOOl CE ccagcttcccattctcagccTTTTTctcttggaaagaaagt 395 rGAPD002 CE tctcgctcctggaagatggtTTTTTctcttggaaagaaagt 396 rGAPD003 CE cccatttgatgttagcgggaTTTTTctcttggaaagaaagt 397 rGAPD004 CE cggagatgatgacccttttggTTTTTctcttggaaagaaagt 398 rGAPD005 LE gatgggtttcccgttgatgaTTTTTaggcataggacccgtgtct 399 rGAPD006 LE gacacacccagcaccagcaccaci'i'iu'iaggcacaggacccgtgcct 400 Nombre SEC ID FPL Función Secuencia NO. rGAPD007 LE cccagccttctccatggtggTTTTTaggcataggacccgtgtct 401 rGAPD008 BL ttgactgtgccgttgaacttg 402 rGAPD009 BL tgaagacgccagtagactccac 403 rGAPDOlO BL ccccacccttcaggtgagc 404 rGAPDOll BL ggcatcagcggaagggg 405 5 Medición del ARNm del FVII en tejido hepático de conejillo de indias: Las mediciones de ARNm del FVII se realizaron a partir de tejido hepático utilizando el equipo QuantiGene 1.0 JO branched ADN (ADNb) Assay Kit (Panomics, Fremont, Calif., EEUU, No. Cat. QG0004) .

En la necropsia se congelaron súbitamente 1-2 g de tejido hepático en nitrógeno líquido. El tejido congelado se pulverizó con un mortero y una mano de mortero sobre hielo J5 seco. Se transfirieron 15-25 mg de tejido a un tubo de reacción de 1.5 mi frío, se añadieron 1 mi de mezcla de lisis 1:3 prediluída en agua MilliQ y 3.3 µ? de Proteinasa K (50 µg/µl) y el tejido se lisó mediante varios segundos de sonicado con ultrasonidos a una potencia de 30-50% (HD2070, 20 Bandelin, Berlín, Alemania) . Los lisados se almacenaron a -80°C hasta su análisis. Para el análisis de ARNm los lisados se descongelaron y se digirieron con proteinasa K durante 15 min a 1000 rpm y 65°C (Thermomixer comfort, Eppendorf , Hamburgo, Alemania) . Los niveles de los ARNm del FVII y de «r GAPDH se determinaron utilizando los reactivos del equipo QuantiGene 1.0 ADNb Assay Kit y de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. La expresión del FVII se analizó utilizando 20 µ? de lisado y el juego de sondas del FVII de Cavia porcellus y la expresión de GAPDH se analizó utilizando 40 µ? de lisado y los juegos de sondas de rattus norwegicus que tienen reacción cruzada con conejillo de indias (véanse las secuencias de los juegos de sondas a continuación) . La señal quimioluminiscente al final del ensayo se midió en un contador de luminiscencia Víctor 2 Light (Perkin Elmer, Wiesbaden, Alemania) como unidades de luz relativa (ULR) . La señal del FVII se dividió por la señal de GAPDH del mismo lisado y los valores se muestran como la expresión del FVII normalizada respecto a GAPDH.

Como ejemplo (Figuras la y Ib) , se siguió a lo largo del tiempo el comportamiento de los niveles en plasma del FVII durante 3 y 5 días tras la inyección del ARNds del FVII que comprende los pares de SEC ID NO: 259/260 y del ARNds del FVII que comprende los pares de SEC ID NO: 253/254 a 4 mg/kg en una formulación de liposomas LNP01 [proporción lípido :ARNds (p/p) de 14:1, insuflación del 96%, tamaño de 80-85 nm] en la vena yugular del conejillo de indias. Se alcanzó una supresión máxima del FVII 24 horas tras la inyección y duró durante al menos 72 horas .

El ARNds FVII que comprende los pares de SEC ID NO: 259/ 260/ LNP01 (1:14) se probó en el modelo de trombosis arterial de conejillo de indias a l, 2, 3, 4 y 5 mg/kg, con una dosis i.v. única. Se utilizaron como controles la salina tamponada con fosfato (PBS) y el ARNds de luciferasa (pares de SEC ID NO: 411/412 ) /LNP01 (1:14). Los niveles del ARNm del FVII en hígado (Figura 2a) y los niveles de zimógeno del FVII en plasma (Figura 2b) disminuyen de forma dependiente de la dosis, mientras que el PT se prolonga de acuerdo con esto (Figura 3 ) .

Una supresión del FVII en plasma superior al 80% se asoció con una inhibición significativa de la formación de trombos en el modelo de trombosis arterial del conejillo de indias. La IC50 observada estaba entre 1 y 2 mg/kg de ARNds del FVII que comprende los pares de SEC ID NO: 259/260/ LNP01 (1:14) . A 3, 4 y 5 mg/kg de ARNds del FVII que comprende los pares de SEC ID NO: 259/260/ LNP01 (1:14) se asoció una supresión similar del FVII en plasma (alrededor del 95%) y una supresión del ARNm en hígado (alrededor del 80%) con efectos antitrombóticos similares (alrededor del 90% de inhibición de la formación de trombos) (Figura 4) . - 1 mg/kg indujo una supresión del 56% del ARNm del FVII en el hígado, una supresión del 62% del FVII en plasma, PT prolongado en 1.3 veces, inhibición de la generación de trombina (altura de pico) en un 4% e inhibición de la formación de trombos en alrededor de un 26%. - 2 mg/kg indujo una supresión del 73% del ARNm del FVII en el hígado, una supresión del 84% del FVII en plasma, PT prolongado en 1.6 veces, inhibición de la generación de trombina (altura de pico) en un 22% e inhibición de la formación de trombos en alrededor de un 62%. - 3 mg/kg indujo una supresión del 81% del ARNm del FVII en el hígado, una supresión del 93% del FVII en plasma, PT prolongado en 2.0 veces, inhibición de la generación de trombina (altura de pico) en un 27% e inhibición de la formación de trombos en, alrededor de un 82%. - 4 mg/kg indujo una supresión del 80% del ARNm del FVII en el hígado, una supresión del 93% del FVII en plasma, PT prolongado en 2.3 veces, inhibición de la generación de trombina (altura de pico) en un 43% e inhibición de la formación de trombos en alrededor de un 91%. - 5 mg/kg indujo una supresión del 80% del ARNm del FVII en el hígado, una supresión del 95% del FVII en plasma, PT prolongado en 2.4 veces, inhibición de la generación de trombina (altura de pico) en un 40% e inhibición de la formación de trombos en alrededor de un 92%.

El sangrado se evaluó mediante el tiempo de sangrado de la cutícula de la uña y la pérdida de sangre por cirugía no se vio significativamente afectada por las dosis (1, 2, 3 , 4, 5 mg/kg) de los pares de SEC ID NO: 259/260/LNP01 (1:14) de ARNds del FVII probados, lo que sugiere que se mantuvo una hemostasia normal hasta alrededor del 95% de supresión del FVII en plasma.

Las Figuras 5a y 5b muestran los niveles de ARNm del FVII en el hígado (Figura 5a) y los niveles de zimógeno del FVII en plasma (Figura 5b) cuando el AR ds del FVII que comprende los pares de SEC ID NO: 259 /260 se formuló en SNALP-L .

Las Figuras 6a y 6b muestran el efecto de ARNds del FVII en (Figura 6a) pérdida de sangre por cirugía y (figura 6b) tiempo de sangrado de la cutícula de la uña en conejillos de indias tras la inyección i.v. de ARNds del FVII que comprende el par SEC ID 259/260 en una formulación SNALP-L (FVIIsi) .

La Figura 7 muestra la correlación entre la actividad del FVII en plasma y la prolongación del PT. La actividad del FVII disminuye tras la inyección i.v. del ARNds del FVII (datos combinados de ARNds del FVII formulado en LNP01 y SNALP-L) correlaciona bien con el parámetro de coagulación del PT dependiente de FVII.

Efectos in vivo del ARNds dirigido contra FVII (Macaca fascicularis) Para los siguientes estudios se utilizó una formulación estéril de ARNds en partículas lipídicas en tecnología de tampón isotónico ("partículas estables de ácido nucleico-lípido" (SNALP) , Tekmira Pharmaceuticals Corporation, Canadá) .

Estudio de titulación de dosis única en monos (Macaca fascicularis) Los monos recibieron inyecciones únicas en bolo i.v. de ARNds del FVII (SEC ID NO 19/20) en un intervalo de 0.3 mg/kg a 10 mg/kg. Los grupos control recibieron una dosis alta de 10 mg/kg de ARNds de luciferasa (SEC ID NO: 411/412) para discriminar entre los efectos causados por la partícula lipídica y los efectos mediados por el iARN. Los monos se sacrificaron 48 horas tras la inyección.

Los efectos farmacológicos se monitorizaron en plasma e hígado. La actividad del FVII y los valores del PT se midieron en plasma a las 24 y 48 horas tras la inyección. Los niveles de ARNm del FVII se midieron en hígado 48 horas tras la inyección en el momento del sacrificio.

Los grupos tratados con ARNds del FVII (SEC ID NO 19/20) mostraron una disminución dependiente de la dosis en la actividad del FVII entre alrededor del 50% a 1 mg/kg de ARNds y alcanzaron una disminución >90% en la actividad del FVII a 3 mg/kg de ARNds del FVII (SEC ID NO 19/20) a las 24 y 48 horas tras la inyección i.v. (Figura 8) . En dosis de 6 mg/kg y 10 mg/kg, el descenso en la actividad del FVII fue similar a la observada para 3 mg/kg de ARNds del FVII (SEC ID NO 19/20) . Se observó la prolongación de PT comenzando con 3 mg/kg (Figura 9) . Se observaron prolongaciones en el PT adicionales a medida que la dosis aumentaba a 6 mg/kg y 10 mg/kg. La prolongación del PT estuvo entre 1.2 veces a 3 mg/kg y 1.4 veces a 10 mg/kg.

Estudio Exploratorio en Monos para Evaluar la Duración del Efecto y Dosificación Repetida Se estudiaron las dosis únicas y repetidas en monos cynomolgous macho utilizando ARNds del FVII (SEC ID NO 19/20) . Los objetivos del estudio fueron para tener una mayor visión sobre la duración y cinética del efecto farmacológico del ARNds del FVII (SEC ID NO 19/20) , así como evaluar la seguridad y eficacia de la dosificación múltiple.

Los monos recibieron una dosis única o una dosis repetida de ARNds del FVII (SEC ID NO 19/20) . El objetivo de las dosis únicas fue examinar la duración del efecto. Los monos en los grupos de dosis única recibieron inyecciones en bolo de 3 mg/kg y 6 mg/kg de ARNds del FVII (SEC ID NO 19/20) . Se utilizó un grupo de 6 mg/kg de ARNds de luciferasa (SEC ID NO: 411/412) para controlar el silenciamiento dependiente de la secuencia de ARNds y para evaluar los efectos relacionados con las partículas de lípidos. El objetivo de las dosis repetidas fue el estudio del efecto aditivo de la dosis e identificar la dosis máxima tolerada, definido por la toxicidad de partículas lipídicas o potenciales episodios de sangrado debido al exceso de fármaco. Los monos en los dos grupos de dosis repetida se programaron para recibir tres inyecciones en un régimen de una inyección en bolo por semana de ARNds del FVII (SEC ID NO 19/20) a 3 mg/kg y 10 mg/kg.

Como seguimiento de los hallazgos en el estudio en monos en régimen de dosis única descrito anteriormente, se incluyó un grupo de monos hembra con 3 mg/kg de ARNds de luciferasa (SEC ID NO: 411/412) para caracterizar en profundidad los efectos mediados por las partículas de lípidos a una dosis inferior. Los efectos farmacológicos (actividad del FVII y PT) se monitorizaron a partir de muestras de plasma tomadas a diferentes tiempos durante el estudio y en el momento del sacrificio.

Los datos recogidos de la actividad del FVII a las 24 y 48 horas fueron similares a los datos del estudio en dosis única descritos anteriormente (Figura 10) . El ARNds del FVII (SEC ID NO 19/20) redujo la actividad del FVII en alrededor de un 50% a 1 mg/kg y en alrededor del 85% al 95% para dosis de 3, 6 y 10 mg/kg. Los grupos control de ARNds de luciferasa a 3 y 6 mg/kg confirmaron que la particular lipídica de ARNds posee un impacto inespecífico transitorio en la actividad del FVII a las 24 horas. Los valores se restablecieron a la normalidad a las 48 horas. Por lo tanto, la actividad vista a las 48 horas en los grupos de 3 y 6 mg/kg de ARNds del FVII (SEC ID NO 19/20) puede atribuirse totalmente a la actividad farmacológica del ARNds de FVII.

Los valores de PT se muestran en la Figura 11. La prolongación de PT en 1.2 veces se observó a 3 rag/kg y aumentó de una forma dependiente de la dosis hasta 1.7 veces a 10 mg/kg.

La duración del efecto farmacológico en monos fue de alrededor de 6 semanas, basado en la extrapolación de los niveles de actividad del FVII en plasma seguidos durante >1 mes (Figura 12) . La reducción total de la actividad del FVII persistió durante alrededor de 1 semana tras la cual la actividad del FVII se restituyó progresivamente. Se observaron cinéticas de silenciamiento similares a 3 y 6 mg/kg, sugiriendo que no hubo efecto de depósito y que el ARNds del FVII dado a dosis más altas que las necesarias para la inhibición total de la actividad del FVII no prolongaba necesariamente el efecto farmacológico.

La prolongación del PT se observó durante 4 semanas con los valores más altos en la primera semana tras el tratamiento, seguido por un descenso lineal entre las semanas 2 y 4 (Figura 13) . Los datos indican que >70% de la reducción de la actividad del FVII fue necesaria para observar algún efecto en este biomarcador dependiente de FVII.

La dosificación múltiple a 3 mg/kg en intervalos semanales se muestra en la Figura 14. Los intervalos entre la segunda y la tercera dosis se ampliaron de una semana a dos semanas para explorar una situación estacionaria y para evitar una eficacia exagerada y los efectos toxicológicos .

Los datos de actividad del FVII indican que es factible bloquear los niveles del FVII en un intervalo de estado estacionario .

La dosificación a 3 mg/kg en intervalos de dos o tres semanas parece ser óptima para mantener la reducción de la actividad del FVII entre un 80% y un 95%. Los valores de PT pueden mantenerse en una prolongación entre 1.2 y 1.8 veces .

La dosificación a 3 mg/kg en intervalos de dos o tres semanas parece óptima para mantener la reducción de la actividad del FVII entre un 80% y un 95%. Los valores de PT pueden mantenerse en una prolongación entre un intervalo de 1.2 y 1.8 veces (Figura 15), con picos marcados de PT vistos unos días después de la inyección. Estos picos se debieron probablemente a los efectos aditivos de la actividad farmacológica del ARNds del FVII y al efecto inespecífico de la particular lipídica.

Análisis in vítro de secuencias no objetivo del ARNds dirigido contra el FVII humano El vector psiCHECK™- (Promega) contiene dos genes marcadores para monitorizar la actividad del iARN: una versión sintética del gen de la luciferasa de Renilla (hRluc) y un gen sintético de la luciferasa de luciérnaga (hluc+) . El gen de la luciferasa de luciérnaga permite la normalización de los cambios en la expresión de la luciferasa de Renilla en la expresión de la luciferasa de luciérnaga. Se midieron las actividades de la luciferasa de Renilla y de luciérnaga utilizando el Sistema de Ensayo de Luciferasa Dual-Glo® (Promega) . Para utilizar los vectores psiCHECK™ para analizar los efectos no objetivo de los ARNds de la invención, la secuencia no objetivo pronosticada se clonó en múltiples regiones de clonación localizadas en 3' del gen sintético de la luciferasa de Renilla y de su codón de detención de la traducción. Tras el clonaje, el vector se transfectó en una línea celular de mamífero, y posteriormente se co-transfectó con ARNds dirigido contra FVII . Si el ARNds inicia de forma efectiva el proceso de iARN en el ARN objetivo de la secuencia no objetivo predecible, la secuencia de ARNm del gen objetivo de Renilla fusionada será degradada, lo que resulta en una actividad reducida de la luciferasa de Renilla.

Predicción in silico de las secuencias no objetivo Se ha buscado en el genoma humano mediante análisis computacional secuencias homologas de los ARNds de la invención. Las secuencias homologas que presentan menos de 5 desparejamientos con el ARNds de la invención se definieron como posibles secuencias no objetivo. Las secuencias no objetivo seleccionadas mediante el análisis in vitro de secuencias no objetivo se proporcionan en las tablas anexas 8, 9 y 10.

Generación de vectores psiCHECK que contienen las secuencias no objetivo pronosticadas La estrategia de análisis de los efectos no objetivo para un candidato principal de ARNsi incluye el clonaje de los sitios no objetivo predichos en el vector psiCHECK2 (Dual Glo®-system, Promega, Braunschweig, Alemania No. cat. C8021) mediante las objetivos de restricción Xhol y Notl. Por lo tanto, el sitio no objetivo se extiende 10 nucleótidos arriba y abajo del sitio objetivo del A Nsi. Adicionalmente, se integra un objetivo de restricción Nhel para probar la inserción del fragmento mediante análisis por restricción. Los oligonucleótidos de cadena única hibridaron de acuerdo a un protocolo estándar (por ejemplo, protocolo por Metabion) en un Mastercycler (Eppendorf) y después se clonaron en psiCHECK (Promega) previamente digerido con Xhol y Notl. La inserción exitosa se verificó mediante análisis por restricción con Nhel y la posterior secuenciación de los clones positivos. El cebador seleccionado para secuenciar (SEC ID NO 761) se une a la posición 1401 del vector psiCHECK. Tras la producción de clones se analizaron los plásmidos mediante secuenciación y después se usaron en experimentos de cultivo celular.

Análisis de los efectos no objetivo del ARNds Cultivo celular: Se obtuvieron células Cos7 a partir del Deutsche Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ, Braunschweig, Alemania, No. cat. ACC-60) y se cultivaron en DMEM (Biochrom AG, Berlín, Alemania, No. cat. F0435) suplementado para contener 10% suero fetal bovino (FCS) (Biochrom AG, Berlín, Alemania, No. cat. S0115) , Penicilina 100 U/ml, y estreptomicina 100 ug/ml (Biochrom AG, Berlín, Alemania, No. cat. A2213) y L-Glutamina 2 mM (Biochrom AG, Berlín, Alemania, No. cat. K0283) así como 12 ug/ml de bicarbonato sódico a 37°C en una atmósfera con C02 al 5% en una incubadora humidificada (Heraeus HERAcell, Kendro Laboratory Products, Langenselbold, Alemania) .

Transfección y cuantificación de Luciferasa: Para la transfección con plásmidos, las células Cos-7 se sembraron a una densidad de 2.25 x 104 células/cavidad en placas de 96 cavidades y se transfectaron directamente. La transfección de plásmidos se llevó a cabo con lipofectamina 2000 (Invitrogen GmbH, Karlsruhe, Alemania, No. cat. 11668-019) como describe el fabricante a una concentración de 50 ng/cavidad. 4 horas tras la transfección, se desecha el medio y se añade medio fresco. Ahora se transfectan los ARNsi en una concentración de 50 nM utilizando lipofectamina 2000 como se ha descrito antes. 24h tras la transfección con ARNsi, se lisaron las células usando reactivo de luciferasa descrito por el fabricante (Sistema de Ensayo de luciferasa Dual-GloTM, Promega, Mannheim, Alemania, No. cat. E2980) y las luciferasas de luciérnaga y Renilla se cuantificaron de acuerdo al protocolo del fabricante. Los niveles de la proteína luciferasa de Renilla se normalizaron a los niveles de luciferasa de luciérnaga. Para cada ARNsi, se recogieron doce datos individuales en tres experimentos independientes. Se utilizó un ARNsi no relacionado para todos los sitios objetivo como control para determinar los niveles relativos de la proteína luciferasa de Renilla en las células tratadas con ARNsi .

Los resultados se proporcionan en las Figuras 16, 17 y 18.

TABLA 1 5 10 15 TABLA 2 10 15 TABLA 3 5 15 10 15 TABLA 5 5 15 TABLA 6 5 10 15 5 10 15 5 15 TABLA 7 Tabla 8 AntiAcceso Descripción Puntuación Número de Pos. de Región sentido de especifidesparej . extremo 5' cidad cerno C N400G131.3 Factor VII de coagulación 0.00 0 CDS haiD sapiens (acelerador de conversión de prcitranbina (F7) , variante 1 del transcripto, ARNn OFF-1 N*l_0162260.2 Dedo de zinc 2 de la 11.00 4 131719 OS familia IKARC6 heno sapiens (Helios) (IKZF2) , variante 1 del transcripto, ARNn OFF-2 Nl_002214.2 Beta 8 integrina hoto 11.00 2 512 CDS sapiens (G?3?8) , ARNn QFF-3 tM_173798.2 Dedo de zinc, daninio CCtC 11.00 4 171719 CDS heno sapiens que contiene 12 (3-002) , ARNTI OFF-4 N4_0014716016.1 PRONOSTICADO: proteína 11.25 3 159 as hipotética hemo sapiens IOCL00129238 (1.00.00129238) , AHNn OFF-5 tW_001085437.1 Marco de lectura abierto 12.00 5 151317 3UIR 54 del crcnDscraa 2 heno 19 sapiens (C2orf54) , variante 1 del transcripto, ARNn OFF-6 EM_001723437.1 H DSTICADO: mianbro M, 12.00 5 141417 3UIR familia de historia H2B 19 homo sapiens (H2BFtn) , ARNn OFF-7 G?025248.2 proteína de interacción 12.20 5 141015 3UIR SNAP25 horo sapiens 19 (????) , ARNn OFF-8 tW_00108042.1 Hcnólcg A unc-13 horo 12.20 3 21018 3UIR sapiens (C. elegans) (UN0.3A), ARNn Sentido OFF-9 IW_207372.1 Datiinio SH2 hemo sapiens 2.20 4 1111519 3UIR conteniendo 4B (SH2D4B) , ARNn OFF-10 1M_016368.3 mio-inositol 1- fosfato 11.00 3 51319 as sintasa Al heno sapiens (IS¥NA1), ARNn Tabla 9 AntiAcceso Descripción Puntuación Número de Pos . de Región sentido de desparej . ext emo especificidad 5' como ON NM_000131.3 Factor VII de 0.0 0 3UTR coagulación homo sapiens (acelerador de conversión de protrombina (F7) , variante 1 del transcripto, ARNm OFF-1 XM_01720803.1 PRONOSTICADO: proteína 2.0 3 16 18 19 3UTR hipotética homo sapiens LOC100129236 (LOC100129236) , ARNm OFF-2 NM_0215752.4 Ectonucleótido 3.0 3 13 16 18 3UTR pirofosfatasa/fosfodies terasa 6 (ENPP5) homo sapiens , ARNm OFF-3 NM_020798.1 Peptidasa 35 específica 3.2 5 1 11 12 3UTR de ubiquitina homo 16 19 sapiens (USP35) , ARNm OFF-4 NM_017S44.3 24 de tipo kelch homo 3.3 4 1 9 12 17 3UTR sapiens (Drosófila) (KLHL24) , ARNm OFF-5 NM_02015 .2 Marco de lectura 3.5 5 1 8 15 18 3UTR abierto 24 del 19 cromosoma 15 homo sapiens (C125orf24) , ARNm OFF-6 NM_002903.2 Recoverina homo sapiens 12.0 4 1 2 16 18 3UTR (RCVRN) , ARNm OFF-7 NM_013272.2 Miembro 3Al (SLC03A1) , 12.0 3 2 16 18 3UTR de la familia del transportador de anión orgánico del portador de soluto homo sapiens, ARNm OFF-8 NM_020248.2 Proteína 1 de 12.0 3 2 15 18 3UTR interacción beta, cantenina homo sapiens (CTNNBIP1) , variante de transcripto 1, ARNm OFF-9 NM_001083909.1 Receptor 123 acoplado a 12.0 3 2 15 18 3UTR proteína G homo sapiens (GRP123) , ARNm OFF-10 NM_024779.3 Fosfatidilinositol-5- 12.0 4 1 2 16 17 3UTR fosfato-4-cinasa homo sapiens, tipo II, gama (PIP4K2C) , ARNm OFF-11 NM_01782 .4 Dedo de zinc 5 asociado 12.2 4 1 3 10 17 3UTR con membrana homo sapiens (CSHC4) (MARCH5) , ARNm OFF-12 NM_138731.3 Polidactilílo 1 de 12.0 3 3 16 18 3UTR imagen en espejo homo sapiens (MIP0L1) , ARNm OFF-13 NM_153711.2 Familia de homo sapiens 12.0 3 3 13 18 3UTR con similitud de secuencia 26, miembro E (FAM26E) , ARNm Sentido OFF-14 NM_001012756.1 Proteína 260 de dedo de 12.5 3 4 8 18 3UTR zinc homo sapiens (ZNF260) , ARNm OFF-15 NM_000991.3 Proteína L28 ribosoma 11.00 4 1 7 12 19 3UTR homo sapiens (RPL28) , ARNm 0FF-1S XM_001719251.1 PRONOSTICADO: Proteína 11.00 2 4 17 CDS hipotética homo sapiens LOC100132440 (LOC100132440) , ARNm OFF-17 NM_0163S6.3 Dominio de doble 11.00 3 2 16 19 3UTR cortina homo sapiens conteniendo 2 (DCDC2) , ARNm Tabla 10 hace constar que con relación a esta fecha, mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (24)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones:

1. - Una molécula de ácido ribonucleico de doble cadena caracterizada porque es capaz de inhibir la expresión del gen del factor VII in vitro en al menos un 70%.

2. - La molécula de ácido ribonucleico de doble cadena de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la molécula de ácido ribonucleico de doble cadena comprende una cadena sentido y una cadena antisentido, siendo la cadena antisentido al menos parcialmente complementaria de la cadena sentido, por lo cual la cadena sentido comprende una secuencia, que posee una identidad de al menos un 90% con al menos una porción de un ARNm que codifica el factor VII, en donde la secuencia (i) se localiza en la región de complementariedad de la cadena sentido a la cadena antisentido; y (ii) en donde la secuencia es de menos de 30 nucleótidos de longitud.

3. - La molécula de ácido ribonucleico de doble cadena de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, caracterizada porque comprende los nucleótidos 1-19 de los SEC ID NO: 413, 414, 415, 416, 417, 418, 419, 420, 421, 422, 423, 424, 425, 426, 427, 428, 429, 430, 431, 432, 433, 434, 435, 436, 437 y 438.

4. - La molécula de ácido ribonucleico de doble cadena de conformidad con la reivindicación 3, caracterizada porque la cadena antisentido además comprende un extremo terminal 3' de 1-5 nucleótidos de longitud, preferiblemente de 1-2 nucleótidos de longitud.

5. - La molécula de ácido ribonucleico de doble cadena de conformidad con la reivindicación 3 ó 4, caracterizada porque el extremo terminal de la cadena antisentido comprende uracilo o nucleótidos que son complementarios en al menos un 90% al AR m que codifica el factor VII.

6. - La molécula de ácido ribonucleico de doble cadena de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones de 3 a 5, caracterizada porque la cadena sentido además comprende un extremo terminal 3' de 1-5 nucleótidos de longitud, preferiblemente de 1-2 nucleótidos de longitud.

7. - La molécula de ácido ribonucleico de doble cadena de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones de 3 a 6 caracterizada porque el extremo terminal de la cadena sentido comprende uracilo o nucleótidos que son idénticos en al menos un 90% al ARNm que codifica el factor VII .

8. - La molécula de ácido ribonucleico de doble cadena de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 7, caracterizada porque la cadena sentido se selecciona de entre el grupo que consiste en las secuencias de ácidos nucleicos descritas con SEC ID NO: 413, 415, 417, 419, 4211, 423, 425, 427, 429, 431, 433, 435 y 437, y la cadena antisentido se selecciona de entre el grupo que consiste en las secuencias de ácidos nucleicos descritas con SEC ID NO: 414, 416, 418, 420, 422, 424, 426, 428, 430, 432, 434, 436 y 438, en donde la molécula de ácido ribonucleico de doble cadena comprende los pares de secuencias seleccionados de entre el grupo que consiste en los SEC ID NO: 413/414, 415/416, 417/418, 419/420, 421/422, 423/424, 425/426, 427/428, 429/430, 431/432, 433/434, 435/436 y 437/438.

9. - La molécula de ácido ribonucleico de doble cadena de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 8 , caracterizada porque al menos una cadena de la molécula de ácido ribonucleico de doble cadena posee una vida media de al menos 24 horas.

10. - La molécula de ácido ribonucleico de doble cadena de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 9, caracterizada porque la molécula de ácido ribonucleico de doble cadena no es inmunoestimuladora .

11. - La molécula de ácido ribonucleico de doble cadena de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 10, caracterizada porque la molécula de ácido ribonucleico de doble cadena comprende al menos un nucleótido modificado .

12. - La molécula de ácido ribonucleico de doble cadena de conformidad con la reivindicación 11, caracterizada porque el nucleótido modificado se selecciona de entre el grupo que consiste en un nucleótido modificado 21 -O-metilo, un nucleótido que comprende un grupo 5 ' -fosforotioato, y un nucleótido terminal ligado a un derivado colesterilo o un grupo bisdecilamida del ácido dodecanoico, un nucleótido modificado 21 -desoxi-2 ' -fluoro, un nucleótido modificado 2'-desoxi-, un nucleótido bloqueado, un nucleótido abásico, un nucleótido modificado 2'-amino, un nucleótido modificado 2'-alquilo, un nucleótido morfolino, un fosforamidato, y un nucleótido que comprende una base no natural.

13. - La molécula de ácido ribonucleico de doble cadena de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 11 y 12, caracterizada porque el nucleótido modificado es un nucleótido modificado 2 ' -O-metilo, un nucleótido que comprende un grupo 51 - fosforotioato y una desoxitimidina .

14. - La molécula de ácido ribonucleico de doble cadena de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 13, caracterizada porque la cadena sentido se selecciona de entre el grupo que consiste en las secuencias de ácido nucleico descritas con SEC ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23 y 25, y la cadena antisentido se selecciona de entre el grupo que consiste en las secuencias de ácidos nucleicos descritas con SEC ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24 y 26, en donde la molécula de ácido ribonucleico de doble cadena comprende los pares de secuencias seleccionados de entre el grupo que consiste en los SEC ID NO: 1/2, 3/4, 5/6, 7/8, 9/10, 11/12, 13/14, 15/16, 17/18, 19/20, 21/22, 23/24 y 25/26.

15. - Una secuencia de ácido nucleico caracterizada porque codifica una cadena sentido y/o una cadena antisentido que están comprendidas en la molécula de ácido ribonucleico de doble cadena de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 14.

16. - Un vector caracterizado porque comprende una secuencia reguladora ligada de forma operativa a una secuencia de nucleótidos que codifica al menos una cadena sentido o una cadena antisentido comprendidas en la molécula de ácido ribonucleico de doble cadena como se ha definido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 14 o que comprende la secuencia de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 15.

17.- Una célula, tejido u organismo no humano caracterizados porque que comprenden la molécula de ácido ribonucleico de doble de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 14, la molécula de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 15 o el vector de conformidad con la reivindicación 16.

18. - Una composición farmacéutica caracterizada porque comprende la molécula de ácido ribonucleico de doble cadena de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 14 , la molécula de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 15, el vector de conformidad con la reivindicación 16 o la célula o tejido de conformidad con la reivindicación 17.

19. - La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 18, caracterizada porque además comprende un transportador, estabilizante y/o diluyente farmacéuticamente aceptable.

20. - Un método para inhibir la expresión del gen del factor VII en una célula, un tejido o un organismo caracterizado porque comprende los siguientes pasos: (a) introducir en la célula, tejido u organismo la molécula de ácido ribonucleico de doble cadena de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 14, la molécula de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 15, el vector de conformidad con la reivindicación 16; y (b) mantener la célula, tejido u organismo obtenido en el paso (a) durante un periodo de tiempo suficiente para producir la degradación del transcrito de ARNm del gen del factor VII, inhibiendo así la expresión del gen del factor VII en la célula.

21.- Un método para tratar, prevenir o manejar los estados patológicos y enfermedades causadas por la expresión del gen de FVII, caracterizado porque comprende la administración a un sujeto en necesidad de tal tratamiento, prevención o manejo de una cantidad terapéuticamente o profilácticamente efectiva de la molécula de ácido ribonucleico de doble cadena de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 14, la molécula de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 15, el vector de conformidad con la reivindicación 16 y/o una composición farmacéutica como se ha definido de conformidad con las reivindicaciones 18 ó 19.

22. - El método de conformidad con la reivindicación 21, caracterizado porque el sujeto es un humano.

23. - Una molécula de ácido ribonucleico de doble cadena de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 14 , la molécula de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 15, el vector de conformidad con la reivindicación 16 y/o una composición farmacéutica como se ha definido de conformidad con las reivindicaciones 18 ó 19 caracterizados porque son para su utilización en el tratamiento de trastornos/ enfermedades tromboembólicos , inflamaciones o trastornos proliferativos .

24. - El uso de la molécula de ácido ribonucleico de doble cadena de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 14 , la molécula de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 15, el vector de conformidad con la reivindicación 16 y/o una célula o tejido de conformidad con la reivindicación 17, para la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento de trastornos/ enfermedades tromboembólicas , inflamaciones o trastornos proliferativos .