MX2011001637A - Composiciones de nisina liquida. - Google Patents

Abstract

La presente invención se relaciona con composiciones de nisina líquida que tienen una alta actividad antimicrobiana. La invención se relaciona adicionalmente con un método para preparar las composiciones de nisina líquida así como también su uso como un conservante en productos alimenticios.

Description

COMPOSICIONES DE NISINA LÍQUIDA CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona con composiciones de nisina líquida, con métodos para preparar las composiciones, con su uso como un conservante y con métodos para preservar los alimentos en donde se utilizan las composiciones.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La necesidad de métodos mejorados para la conservación de alimentos es grande. Se ha estimado que una gran parte del suministro mundial de alimentos se pierde como resultado de la descomposición microbiana y las infecciones microbianas transmitidas por los alimentos representan una amenaza constante y seria para la salud humana.

Varias especies bacterianas que pueden contaminar y crecer en los alimentos y cultivos son patogénicas o producen toxinas y generan un rango de enfermedades de intoxicación alimentaria. A pesar del mejoramiento sustancial en la tecnología e higiene, los productos alimenticios se pueden exponer al deterioro y a bacterias patogénicas en el medio en el que se manipulan los alimentos y el número de intoxicación por alimentos aún se incrementa en la mayoría de países. Las técnicas de conservación de alimentos, por ejemplo el procesamiento por calor, congelamiento, ultrasonido, irradiación, y tratamiento a alta presión, reducen significativamente la carga antimicrobiana pero es de particular interés la evidencia de que los alimentos procesados se contaminan con microorganismos luego del procesamiento y antes del empaque. Son de creciente preocupación en la industria de los alimentos los problemas microbianos relacionados con varios alimentos tal como productos lácteos y cárnicos, alimentos frescos y refrigerados y alimentos de mar.

Especialmente los productos alimenticios en el rango de pH de 4.5 a 7.0 se sabe que son susceptibles al deterioro microbiano por microorganismos, que incluyen patógenos y bacterias formadoras de esporas. En niveles de pH inferiores, las levaduras, mohos y bacterias tolerantes al ácido son más relevantes. Sobre todo, los alimentos procesados no se consumen directamente después de procesamiento, permitiendo por lo tanto que las bacterias sobrevivan al proceso de producción o se introduzcan y crezcan mediante post-contaminación. Debido a que puede ocurrir el consumo de alimentos sin el racalentamiento de los alimentos procesados a temperaturas suficientes y durante el tiempo suficiente, existe un riesgo de intoxicación por alimentos o deterioro de los alimentos.

Adicionalmente , la reciente tendencia de alimentos mínimamente procesados con las cualidades nutricionales y sensoriales intrínsecas de materias primas y alimentos frescos ha elevado el riesgo. Los tratamientos de conservación moderados, tal como alta presión hidrostática y técnicas de campo eléctrico pulsado han probado ser exitosos, pero frecuentemente se basan en obstáculos efectivos, es decir cadena de frío y la adición de antimicrobianos naturales .

Se ha hecho una investigación exhaustiva eh el campo de la seguridad alimenticia para desarrollar diseños de productos antimicrobianos efectivos, que resulten en una combinación de composiciones, procesamiento y conservación.

La nisina es una sustancia antibacteriana similar a péptido producida por Lactococcus lactis subsp. lactis. Esta comprende 34 aminoácidos y es activa contra las bacterias principalmente gram-positivas . La nisina no es tóxica y está libre de efectos colaterales. La nisina es Generalmente Reconocida como sustancia Segura y se utiliza ampliamente en una variedad de alimentos. Ejemplos de tales productos son queso procesado, leche, crema cuajada, postres lácteos, mezclas para helado, huevo líquido, productos de harina horneados, aderezos y cerveza. La nisina es estable al calor y sobrevive a temperaturas de pasteurización con pérdida mínima de actividad.

Usualmente, la nisina se obtiene mediante la fermentación de una especie de Lactococcus lactis y se formula adicionalmente como un polvo seco que se puede utilizar como un conservante como tal o después de haberse resuelto primero en un disolvente adecuado. Delvoplus® y Nisaplin® son nombres comerciales para el polvo de nisina que contiene 1 millón IU por gramo. Ellos se distribuyen por DSM y Danisco, respectivamente. Estos productos de nisina en polvo tienen varias desventajas: el polvo se genera luego de manipulación, y es difícil la dosificación y mezcla de cantidades pequeñas de polvos en los productos. Por lo tanto, se prefieren comercialmente las composiciones de nisina líquida que no tienen las desventajas descritas anteriormente.

Las composiciones de nisina líquida como tal se conocen en la técnica. Aunque se ha reportado que las composiciones de nisina líquida tienen actividad contra bacterias gram-positivas (ver Mota-Meira et al. (2000), Montville et al. (1999) , US 5,584,199 y US 4,597,972) y aún bacterias gram-negativas (ver EP 0 453 860, US 5,260,271 y US 5,559,096) , existen aún composiciones de nisina líquida que tienen una actividad antimicrobiana mejorada, particularmente contra bacterias gram-positivas encontradas en la industria de los alimentos.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN De forma sorprendente, ahora se han encontrado composiciones de nisina que tienen una actividad muy alta contra bacterias gram-positivas . Debido a su alta actividad antimicrobiana, solo se necesitan bajas cantidades de las composiciones para la acción efectiva contra bacterias, por ejemplo bacterias gram-positivas. Las composiciones tienen buena estabilidad microbiológica que en combinación con su buena estabilidad física y química hacen adecuadas las composiciones para almacenamiento prolongado y por consiguiente les da una larga vida útil. Adicionalmente , las composiciones de la' invención pueden tener una baja turbidez, que las hace adecuadas para uso en aplicaciones alimenticias, en donde es de importancia la adición de aditivos de baja turbidez. En- claridad de las características anteriores, las composiciones .de. la invención se pueden emplear ventajosamente como conservantes de alimentos.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN De acuerdo con un primer aspecto la invención proporciona un método para preparar una composición de nisina líquida, preferiblemente una composición acuosa de nisina líquida. El método comprende las etapas de: a) preparar una primera nisina líquida que contiene la composición que tiene un pH de aproximadamente 1.5 a aproximadamente 12, preferiblemente aproximadamente 3 a aproximadamente 10, preferiblemente aproximadamente 3.5 a aproximadamente 9.5, más preferiblemente aproximadamente 4 a aproximadamente 9, todavía más preferiblemente aproximadamente 4.5 a aproximadamente 8.5, aún más preferiblemente aproximadamente 5 a aproximadamente 8, más preferiblemente aproximadamente 5.5 a aproximadamente 7.5, y en particular aproximadamente 5.5 por debajo de 7, b) aislar los compuestos sólidos de la primera nisina líquida preparada que contiene la composición, c) poner en contacto los compuestos sólidos aislados con una solución^ que tiene un pH de aproximadamente 0 a aproximadamente 5, preferiblemente aproximadamente 0.5 a aproximadamente 4.5, más preferiblemente aproximadamente 1 a aproximadamente 4, aún más preferiblemente aproximadamente 1.5 a aproximadamente 3.5, más preferiblemente aproximadamente 1.5 a aproximadamente 3 y en particular aproximadamente 2 a aproximadamente 3 para preparar una segunda' composición de nisina líquida, y d) remover los compuestos sólidos de la segunda composición de nisina líquida. La etapa d es opcional, pero en una realización preferida esta se desarrolla en el método de la invención.

En una ' realización adicional el método de la invención comprende la etapa de: e) ajustar el pH de la segunda composición de nisina líquida a un valor de pH deseado tal como un pH entre 2 y 6, por ejemplo un pH entre 2 y 3 o a pH entre 5 y 6.

Opcionalmente, por lo menos uno de los compuestos funcionales adicionales mencionados adelante se pueden agregar antes, durante o después de por lo menos una de las etapas del método de la invención. Por ejemplo, un crioprotector, por ejemplo glicerol, se puede agregar durante la etapa c, de tal manera que la segunda composición de nisina líquida comprende 35% a 60% p/p de crioprotector. En otro ejemplo, un compuesto que reduce o disminuye la formación de espuma y/o un compuesto antimicrobiano adicional, por ejemplo un ácido orgánico o una sal del mismo, se puede agregar antes de la etapa b. En una realización preferida sin embargo por lo menos un compuesto funcional adicional se agrega después de la etapa d y antes de la etapa e, o durante o después de la etapa e.

En una etapa de la realización comprende mezclar nisina con una solución acuosa para preparar una primera nisina líquida que contiene la composición que tiene una sal inorgánica final (por ejemplo NaCl) en concentración de 1.5 o menor, preferiblemente 0.05 M a 1.5 M y más preferiblemente 0.1 a 1.5 M. La primera nisina líquida que contiene la composición tiene un pH de aproximadamente 1.5 a aproximadamente 12, preferiblemente aproximadamente 3 a aproximadamente 10, preferiblemente aproximadamente 3.5 a aproximadamente 9.5, más preferiblemente aproximadamente 4 a aproximadamente 9, aún más preferiblemente aproximadamente 4.5 a aproximadamente 8.5, todavía aún más preferiblemente aproximadamente 5 a aproximadamente 8 y más preferiblemente aproximadamente 5.5 a aproximadamente 7.5 y en particular aproximadamente 5.5 por debajo de 7. Cualquier fuente de nisina se puede suspender y/o disolver en la solución acuosa. En una realización preferida la nisina es un polvo, preferiblemente un polvo seco. Por ejemplo, se pueden utilizar las composiciones en polvo de nisina disponibles comercialmente tal como Delvoplus® y Nisaplin®. La fuente puede comprender nisina A, nisina Z o una combinación de las mismas. La solución acuosa puede ser una solución amortiguadora, por ejemplo un amortiguador de fosfato tal como NaH2P04/Na2HP0 . También se pueden utilizar otros amortiguadores adecuados frecuentemente. Estos incluyen, pero no se limitan a, amortiguadores de acetato, amortiguadores de lactato, amortiguadores de citrato, amortiguadores de glicina/HCl y cualquier combinación de los mismos.

Los compuestos sólidos se pueden separar/aislar desde la primera nisina liquida que contiene la composición mediante técnicas de aislamiento bien conocidas. En una realización preferida la etapa b se desarrolla por medio de centrifugación, filtración o cualquier combinación de los mismos.

Posteriormente, se puede preparar una segunda composición de nisina líquida al por ejemplo poner en contacto, por ejemplo disolver o mezclar o suspender, los compuestos sólidos aislados con/en una solución, preferiblemente una solución acuosa, que tiene un pH de aproximadamente 0 a aproximadamente 5, preferiblemente aproximadamente 0.5 a aproximadamente 4.5, más preferiblemente aproximadamente 1 a aproximadamente 4, aún más preferiblemente aproximadamente 1.5 a aproximadamente 3.5, más preferiblemente aproximadamente 1.5 a aproximadamente 3 y en particular aproximadamente 2 a aproximadamente 3. En una realización un compuesto funcional adicional mencionado adelante se agrega durante esta etapa.

Luego, la segunda composición de nisina líquida se puede purificar al remover por ejemplo los residuos restantes y/o las proteínas sin nisina o partes de las mismas. Esta etapa de purificación se puede desarrollar mediante técnicas de aislamiento bien conocidas. En una realización preferida la etapa d se desarrolla por medio de centrifugación, filtración o cualquier combinación de los mismos.

El método descrito anteriormente resulta en una composición de nisina líquida que tiene una actividad mucho mayor contra los microorganismos, particularmente bacterias gram-positivas , que las composiciones de nisina líquida descritas en la técnica anterior. En otras palabras, el método de la presente invención resulta en composiciones de nisina líquida que tienen una concentración inhibidora mucho menor (MIC) contra microorganismos, particularmente bacterias gram-positivas, que las composiciones de nisina líquida descritas en la técnica anterior.

Por lo tanto, una composición de nisina que se puede obtener mediante un método de acuerdo con la invención es otra parte de la presente invención. La composición de nisina puede ser sólida, pero preferiblemente esta es una composición líquida.

En una realización las composiciones de nisina de la invención tienen un MIC de 1.0 g/mL o menos contra por lo menos una bacteria gram-positiva . El MIC se refiere a la concentración mínima de un compuesto o composición necesaria para inhibir el crecimiento del organismo probado. Preferiblemente, el MIC es un promedio de por lo menos tres repeticiones independientes. Las composiciones de la presente invención tienen un MIC de 1.0 pg/mL o menos cuando se prueba para el crecimiento de la inhibición de por lo menos una bacteria gram-positiva en el ensayo descrito anteriormente. En una realización las composiciones de la invención tienen un MIC de 0.5 pg/mL o menos, preferiblemente un MIC de 0.1 yg/mL o menos, más preferiblemente un MIC de 0.05 pg/mL o menos, aún más preferiblemente un MIC de 0.01 pg/mL o menos, todavía aún más preferiblemente un MIC de 0.005 pg/mL o menos, particularmente un MIC de 0.001 pg/mL o menos, más particularmente un MIC de 0.0005 pg/mL o menos contra por lo menos una bacteria gram-positiva y más particularmente un MIC de 0.0001 pg/mL o menos contra por lo menos una bacteria gram-positiva. Las bacterias gram-positivas incluyen, pero no se limitan a, Micrococcus sp. , Listeria sp. , Bacillus sp. , Staphylococcus sp. , Clostridium sp.,, Streptococcus sp. , Lactobacillus sp. y Lactococcus sp. En una realización la bacteria gram-positiva se selecciona del grupo que consiste de Bacillus , Lactococcus , Staphylococcus , Listeria y Micrococcus . Las especies adecuadas dentro del género Bacillus , Lactococcus, Staphylococcus , Listeria y Micrococcus incluyen, pero no se limitan a, B . subtilis, L. lactis, S. aureus, L. innocua y M. luteus, respectivamente. Dentro de las especies que dan cepas adecuadas incluyen, pero no se limitan a, Bacillus subtilis ATCC 31578, Lactococcus lactis ATCC 19257, Staphylocoocus aureus ATCC 27661, Listeria innocua LMD 92.20 y Micrococcus luteus B212, respectivamente.

En una realización preferida las composiciones de la presente invención tienen un MIC de 0.5 yg/mL o menos, preferiblemente un MIC de 0.1 yg/mL o menos, más preferiblemente un MIC de 0.05 yg/mL o menos, aún más preferiblemente un MIC de 0.01 yg/mL o menos, todavía aún más preferiblemente un MIC de 0.005 yg/mL o menos, particularmente un MIC de 0.001 yg/mL o menos y más par icularmente un MIC de 0.0005 yg/mL o menos contra por lo menos una cepa de luteus, preferiblemente M. luteus B212.

Se puede medir la actividad de nisina utilizando el siguiente bioensayo bien conocido por la persona experta (ver Pongtharangkul and Demirci, 2004), que incluye pretratar la composición de nisina en pH bajo. En resumen, el M. luteus B212 que contiene placas agar (agar Iso-sensitest ) se prepara utilizando un cultivo que ha crecido recientemente. Después del secado, se utiliza una bomba de vacío para crear agujeros pequeños en el agar. Las muestras y sus diluciones (10 µ?) se transfieren a los agujeros y se les permite difundir dentro del agar durante 18 horas a 5°C. Posteriormente, se incuban las placas de agar durante 24 horas a 30 °C y se miden las zonas de inhibición alrededor de la muestra que contiene los agujeros. Paralelo a las muestras, se incluyen los controles con cantidades conocidas de nisina (0 - 1600 IU/mL) . Sus zonas de inhibición se utilizan para preparar una curva de calibración requerida para determinar los niveles de nisina de las muestras. Todas las etapas se llevan a cabo asépticamente. El IU para nisina ya se ha definido como sigue. El The World Health Organization Committee on Biological Standardization, vigésimo segundo informe. Informe Técnico de la Organización Mundial de la Salud serie, No. 444 en 1970, ha establecido una preparación de nisina de referencia internacional, y la unidad internacional (de aquí en adelante IU) se define como 0.001 mg de esta preparación. Delvoplus® y Nisaplin®, nombres comerciales para productos en polvo de nisina qué contiene 1 millón IU por gramo, se distribuyen por DSM y Danisco, respectivamente. Por medio del ensayo anterior se puede determinar la concentración de nisina en las muestras.

Las composiciones MIC de nisina se pueden medir por medio del siguiente ensayo MIC. La actividad de nisina se mide utilizando el ensayo de caldo de cultivo de microdilución estándar, bien conocido por la persona experta. En resumen, un Micrococcus luteus B212 que contiene el caldo de cultivo Iso-sensitest se prepara utilizando un cultivo que ha crecido recientemente. El número de células por mL se determina utilizando una cámara de conteo. Preferiblemente, se utiliza un conteo celular de 103. Se agrega 100 L de inoculo a cada pozo de "una placa de microtítulo de 96 pozos.

Se agrega 100 de una composición de nisina al primer pozo (Al) y se mezcla apropiadamente al pipetear hacia arriba y hacia abajo tres veces. Se hace una dilución en serie al transferir 100 \iL del primer pozo al siguiente pozo (A2) y se diluye apropiadamente. Esto se repite hasta que cada componente se diluye en serie en 36 pozos. Luego, las placas se incuban a 30 °C durante 7 días y se leen cada día para el crecimiento bacteriano. Las concentraciones MIC son la concentración más baja que inhibe completamente el crecimiento.

En una realización las composiciones de la invención tienen un pH de aproximadamente 0 a aproximadamente 5, preferiblemente aproximadamente 0.5 a aproximadamente 4.5, más preferiblemente aproximadamente 1 a aproximadamente 4, aún más preferiblemente aproximadamente 1.5 a aproximadamente 3.5, más preferiblemente aproximadamente 1.5 a aproximadamente 3 y en particular aproximadamente 2 a aproximadamente 3. En tales condiciones de pH, la estabilidad microbiológica de las composiciones de la invención es buena y el MIC de las composiciones es baja y estable durante almacenamiento .

En una realización adicional las composiciones de acuerdo con la invención comprenden 0.01 a 5%, preferiblemente 0.05 a 2.5%, más preferiblemente 0.1 a 1.0%, más preferiblemente 0.15 a 0.5% y en particular 0.2 a 0.3 % (p/p) de nisina.

Las composiciones de nisina de la invención pueden comprender una cantidad baja de sales tal como sales inorgánicas por ejemplo NaCl . Se entiende que no significa que los compuestos funcionales adicionales mencionados adelante (por ejemplo compuestos antimicrobianos tal como ácidos orgánicos o sus sales) se incluyan dentro de la definición de "sal" . En una realización las composiciones de la invención comprenden una sal, por ejemplo sal inorgánica, para la relación de nisina de 100:1 a 1:100, preferiblemente 50:1 a 1:100, más preferiblemente 25:1 a 1:100 y en particular 10:1 a 1:100. En una realización las composiciones de nisina de la invención son esencialmente libres de sales, preferiblemente sales inorgánicas tal como por ejemplo NaCl . La sal inorgánica puede ser cualquiera adecuada, sal inorgánica de grado alimenticio. Ejemplos de sales inorgánicas son NaCl, Na2S04, (Ca)3(P04)2, K 03, KC1 y MgC03. La concentración de estas sales en las composiciones es 100 mg/mL o menos, preferiblemente 50 mg/mL o menos, más preferiblemente 25 mg/mL o menos y en particular 15 mg/mL o menos. La concentración de sal se puede medir mediante análisis catiónico separado, mediante análisis aniónico de absorción atómica, mediante HPLC o preferiblemente mediante la determinación del contenido de ceniza mediante ignición (550+/- 25°C) . Las composiciones de nisina que tienen una baja concentración de sales inorgánicas son muy atractivas, debido a que ellas no interferirán con la matriz de alimentos para dar reacciones indeseadas " y alteraciones de sabor y/o estructura.

Las composiciones de nisina de la invención pueden comprender bajas cantidades de componentes diferentes de nisina y sal. Estos componentes pueden ser proteínas o sus partes. Se entiende que no significa que los compuestos funcionales adicionales mencionados adelante [por ejemplo compuestos antimicrobiános , agentes antiespumantes , tensoactivos , etc.) se incluyan dentro de la definición de "componentes diferentes a nisina y sal" . En una realización las composiciones de la invención comprenden un componente diferente de nisina para la relación de nisina de 100:1 a 1:100, preferiblemente 10:1 a 1:100 y más preferiblemente 2:1 a 1:100. En una realización las composiciones de nisina de la invención están esencialmente libres de estos componentes. Los componentes se pueden originar de la biomasa producida durante el proceso de fermentación de nisina utilizando Lactococcus lactis. La concentración de nisina se puede medir primero mediante el ensayo descrito anteriormente . Posteriormente, la concentración de proteína total se puede estimar utilizando ensayos clásicos conocidos por la persona experta. La concentración de proteina sin nisina se puede estimar al sustraer la concentración de nisina de la concentración de proteína total.

En todavía otra realización las composiciones de la invención. son composiciones líquidas claras. Las composiciones claras de nisina líquida se pueden utilizar en y/o en cualquier tipo de producto. En vista de su claridad, ellas se pueden utilizar ventajosamente en productos en donde la claridad es de importancia tal como productos con base en gelatina por ejemplo postres, jugos de frutas, bebidas y aplicaciones de superficie sobre los productos alimenticios. Las composiciones líquidas claras como se utiliza aquí son las composiciones líquidas que tienen una turbidez de 0 a 100 FNU, preferiblemente 0 a 50 FNU, más preferiblemente 0 a 25 FNU y particularmente 0 a 10 FNU. Las composiciones líquidas turbias son composiciones líquidas que tienen una turbidez por encima de 100 FNU. La turbidez en FNU (Unidad Nefelométrica de Formazina) se puede determinar con un método de dispersión de luz y se puede medir utilizando un fotómetro de turbidez Nephla con el método DIN medido EN 27027/ISO 7027. Las composiciones claras así como también composiciones turbias de nisina líquida se pueden preparar por medio del método de acuerdo con la invención. Se prepara una composición líquida clara, si se prepara una nisina líquida que contiene la composición que tiene un pH de aproximadamente 5 o más, preferiblemente un pH de aproximadamente 5 a aproximadamente 9, en la etapa a del método de la invención. Se prepara una composición líquida turbia, si una nisina líquida que contiene la composición que tiene un pH por debajo de aproximadamente 5, preferiblemente un pH de aproximadamente 1.5 por debajo de aproximadamente 5, o un pH por encima de aproximadamente 9, preferiblemente a un pH por encima de aproximadamente 9 a aproximadamente 12 se prepara en la etapa a del método de la invención. Las composiciones claras y turbias de nisina líquida tienen alta actividad descrita anteriormente contra los microorganismos, en particular bacterias gram-positivas .

Un método- en donde la concentración de sal inorgánica final {por ejemplo NaCl) de la primera nisina líquida que contiene la composición (es decir la composición de nisina líquida preparada en la etapa a del método de acuerdo con la invención, ver anterior) que está por encima de 1.5 M tiene varias desventajas comparado con un método en donde la concentración de sal inorgánica final de la primera' nisina líquida que contiene la composición es 1.5 o menos. Primero, la primera composición de nisina líquida que tiene una concentración de sal inorgánica final por encima de 1.5 M muestra un desempeño de separación reducido en centrifugación (es decir tiene bajo índice de sedimentación) en comparación con las composiciones de nisina líquida con una concentración de sal inorgánica final de 1.5 M o menos. Segundo, la composición de nisina líquida final resultante que se prepara al desarrollar el método de acuerdo con la presente invención (es decir etapas a hasta c y opcionalmente etapas d y e, ver anterior) , en donde la primera nisina líquida que contiene la composición tiene una concentración de sal inorgánica final por encima de 1.5 M, tiene varias desventajas: es turbia; tiene una pureza inferior de las composiciones de nisina líquida finales que se han hecho por medio de un método de acuerdo con la presente invención en donde la primera nisina líquida que contiene la composición contiene un concentración de sal inorgánica final de 1.5 o menos ; tiene una actividad antimicrobiana inferior que la de las composiciones de nisina líquida finales que se han hecho por medio de un método de acuerdo con la presente invención en donde la primera nisina líquida que contiene la composición contiene una concentración de sal inorgánica final de 1.5 o menos; y tiene un riesgo mayor de precipitarse que las composiciones de nisina líquida finales que se han hecho por medio de un método de acuerdo con la presente invención en donde la primera nisina líquida que contiene la composición contiene un concentración de sal inorgánica final de 1.5 M o menos Las composiciones de nisina líquida de la invención tienen por lo menos una de las desventajas mencionadas adelante comparada con las preparaciones de nisina líquida conocidas en la técnica: - las composiciones de la invención tienen una mejor eficacia antimicrobiana comparado con composiciones de nisina líquida de la técnica anterior, y/o - las composiciones de la invención están esencialmente libres de sales tal como por ejemplo sales inorgánicas por ejemplo NaCl y esencialmente libres de otros componentes diferentes de nisina. Como un resultado de esto, en las aplicaciones alimenticias, se evita el uso de las composiciones de la invención que no interfieren con la matriz de alimentos para dar las reacciones y alteraciones indeseadas de sabor y/o estructura, y/o - las composiciones de la invención pueden ser claras, es decir tienen una baja turbidez (entre 0 y 100 FNU) . Tales composiciones no interfieren con el color y/o la claridad de los productos a los que ellos se aplican.

- De acuerdo con otra realización, las composiciones de la invención comprenden adicionalmente por lo menos un compuesto funcional adicional que incluye, pero no se limita a, un compuesto antimicrobiano adicional tal como un ácido por ejemplo ácido sórbico, ácido propiónico, ácido benzoico, ácido acético, ácido láctico, ácido cítrico, ácido cinámico, o una sal de cualquiera de estos ácidos, una oxidasa glucosa, natamicina, lisozima, poli-L-lisina, nistatina, lucensomicina, amfotericina B, filipina, pediocina; un tensoactivo por ejemplo SDS, Tween, ácidos grasos; un agente que ajusta el pH tal como HC1 o NaOH o un agente amortiguante por ejemplo una sal de fosfato o sal de acetato; un crioprotector tal como glicerol o propanodiol ; agentes espesantes por ejemplo goma xantano, goma guar, goma Arábiga, goma tragacanto, goma gelano, -goma garrofín, goma carragenano, goma ramxano, alginato, almidón, carboximetilcelulosa, carboxietilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, hidroxipropilcelulosa, metilcelulosa, alcohol polivinílico, polietilenglicol, polipropilenglicol . Más aún, las composiciones de la invención pueden comprender agentes que reducen o disminuyen la formación de espuma.

Se pueden agregar compuestos adicionales a las composiciones de la invención en forma líquida o sólida y se pueden mezclar con bastante antelación o directamente antes de uso. Utilizar por lo menos un compuesto/conservante antimicrobiano adicional en las composiciones de nisina de la invención se espera que lo estabilice adicionalmente microbiológicamente y por lo tanto puede ser benéfico para su vida útil.

La actividad de nisina presente en una composición líquida acuosa se puede incrementar sustancialmente al remover las impurezas. Más aún, el índice de solubilización de nisina en las composiciones acuosas se incrementa mediante la remoción de impurezas tal como por ejemplo sales inorgánicas. La nisina se puede vincular parcialmente a impurezas que resultan en nisina que no está disponible para su actividad conservante. En otras palabras, la nisina tiene una biodisponibilidad limitada en la presencia de impurezas. Como se utiliza aquí, el término "biodisponibilidad" se refiere a la disponibilidad, cantidad (por ejemplo, concentración) , o actividad de nisina en una formulación sólida, semisólida o líquida. Las impurezas tal como proteínas sin nisina u otros componentes diferentes de nisina, los residuos de pared celular y las sales pueden tener un efecto negativo en el índice de solubilización de nisina. Se encuentra que aproximadamente menos del 50% de la nisina presente en tal formulación líquida está disponible como un conservante en caso que estén presentes estas impurezas. Se ha encontrado que las impurezas están presentes en productos de nisina disponibles comercialmente . La nisina disponible comercialmente contiene en general 5-25% de proteína sin nisina o residuos celulares. Estas impurezas se originan del proceso de producción de la nisina. Se utiliza frecuentemente la recuperación, purificación o reformulación luego de la fermentación de las sales que aún están presentes en la formulación de nisina final.

En un aspecto adicional la invención se relaciona con una suspensión acuosa de nisina que comprende agentes espesantes. Por supuesto, también se pueden utilizar dos o más agentes espesantes diferentes. Las suspensiones de la invención comprenden 0.01 a 5%, preferiblemente 0.05 a 2.5%, más preferiblemente 0.1 a 1%, más preferiblemente 0.15 a 0.5% y en particular 0.2 to 0.3% (p/p) de nisina. Las suspensiones de la invención comprenden 0.01 a 5%, preferiblemente 0.05 a 5%, más preferiblemente 0.1 a 5%, más preferiblemente 0.2 a 5% y en particular 0.5 a 5% (p/p) de agente espesante. El agente espesante se selecciona del grupo que consiste de goma xantano, goma guar, goma Arábiga, goma tragacanto, goma gelano, goma garrofín, goma carragenano, goma ramxano, alginato, almidón, carboximetilcelulosa, carboxietilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, hidroxipropilcelulosa, metilcelulosa, alcohol polivinílico, polietilenglicol y polipropilenglicol . En una realización preferida el agente espesante es una goma tal como goma xantano. El pH de la suspensión de acuerdo con la invención es aproximadamente 2 a aproximadamente 12, preferiblemente aproximadamente 2 a aproximadamente 11, más preferiblemente aproximadamente 2 a aproximadamente 10, aún más preferiblemente aproximadamente 2 a aproximadamente 9, todavía aún más preferiblemente aproximadamente 2 a aproximadamente 8, más preferiblemente aproximadamente 2 a aproximadamente 7 y en particular aproximadamente 2 a aproximadamente 6. La suspensión de la invención es estable. "Suspensión estable" como se utiliza aquí significa una suspensión físicamente estable, es decir una suspensión que muestra 50% o menos, preferiblemente 40% o menos, más preferiblemente 30% o menos, aún más preferiblemente 20% o menos, más preferiblemente 10% o menos y en particular 0% de sedimentación después de almacenamiento a temperatura ambiente durante 9 días a pH 5. La estabilidad física de las suspensiones se puede medir mediante los métodos conocidos en la técnica tal como el ensayo de sedimentación como se muestra aquí (ver Ejemplo 9) .

En una realización la suspensión de acuerdo con la invención comprende adicionalmente por lo menos un compuesto funcional adicional seleccionado del grupo que consiste de un compuesto antimicrobiano adicional, un tensoactivo, un agente que ajusta el pH, y un crioprotector . Ejemplos de compuestos antimicrobianos adicionales adecuados son ácidos tal como ácido sórbico, ácido propiónico, ácido benzoico, ácido acético, ácido láctico, ácido cítrico, ácido cinámico, ácido o sales de cualquiera de estos ácidos, una oxidasa glucosa, natamicina, lisozima, poli-L-lisina, nistatina, lucensomicina, amfotericina B, filipina, pediocina. Ejemplos de tensoactivos adecuados son SDS, Tween, ácidos grasos, por mencionar solo unos pocos. Ejemplos de pH adecuado que ajustan los agentes están entre otros HC1 o NaOH o agentes amortiguadores tal como sales fosfato y sales de acetato. Ejemplos de - crioprotectores adecuados son glicerol y propanediol. Más aún, las suspensiones de la invención pueden comprender agentes que reducen o disminuyen la formación de espuma. Se pueden agregar compuestos adicionales a las suspensiones de la invención en forma líquida o sólida y se pueden mezclar bien previamente o directamente antes de uso.

En una realización adicional la invención se relaciona con un método para preparar una suspensión de acuerdo con la invención, el método que comprende las etapas de: a) agregar nisina y agentes espesantes, separadamente o como una composición en polvo, a una solución acuosa {por ejemplo agua) , y b) mezclar para obtener una suspensión. Si es necesario, se puede ajustar el pH de la suspensión a pH de aproximadamente 2 a aproximadamente 12, preferiblemente aproximadamente 2 a aproximadamente 11, más preferiblemente aproximadamente 2 a aproximadamente 10, aún más preferiblemente aproximadamente 2 a aproximadamente 9, todavía aún más preferiblemente aproximadamente 2 a aproximadamente 8, más preferiblemente aproximadamente 2 a aproximadamente 7 y en particular aproximadamente 2 a aproximadamente 6.

El agente espesante y la nisina se pueden agregar separadamente a la solución acuosa. Ellos pueden estar en forma de polvo o en forma líquida. Alternativamente, la nisina y el agente espesante pueden estar presentes en una composición de polvo y esta composición de polvo se puede agregar a la solución acuosa. En una realización adicional la invención se relaciona con una composición el polvo que comprende nisina y agentes espesantes. La nisina y/o el agente espesante se puede agregar junto con un compuesto funcional adicional descrito anteriormente para la solución acuosa y luego se mezclan para obtener una suspensión. Alternativamente, se pueden agregar compuestos funcionales adicionales después de la suspensión que comprende nisina y se ha obtenido el agente espesante. En una realización adicional se agrega primero nisina a la solución acuosa, seguido por un compuesto funcional adicional y después se agrega el agente espesante y la solución de mezcla para obtener una suspensión. En todavía una realización adicional se agregan primero agentes espesantes a la solución acuosa, seguido por un compuesto funcional adicional y después se agrega nisina y se mezcla la solución para obtener una suspensión. De nuevo en una realización adicional el compuesto funcional adicional se agrega primero a la solución acuosa, seguido por la adición de agentes espesantes y/o nisina .

Otro aspecto de la invención se relaciona con el uso de una suspensión acuosa de acuerdo con la invención para la preparación de un líquido de tratamiento para el tratamiento de un alimento, concentrado o producto agrícola. El tratamiento líquido se puede preparar al mezclar una solución acuosa con la suspensión de acuerdo con la invención. El tratamiento del alimento, concentrado o producto agrícola se puede hacer mediante pulverización, inmersión, inmersión, cepillado por mencionar unos pocos .

De acuerdo con un aspecto adicional, la invención proporciona el uso de una composición o suspensión de acuerdo con la invención como un conservante en y/o sobre el alimento, concentrado o producto agrícola. De aquí en adelante, el término "suspensión" también incluye un líquido de tratamiento preparado de una suspensión de acuerdo con la invención. Las composiciones y suspensiones de la invención no tienen desventajas asociadas con formulaciones de polvo: ellos son más fáciles de utilizar (fácil dosificación) y no existe formación de polvo cuando se utilizan. Adicionalmente , se evitan la formación de espuma y los problemas de disolución que ocurren cuando se solubiliza el polvo de nisina en un solvente. Los niveles efectivos de nisina para conservar los productos alimenticios varían de 1 a 1500 IU/g o 0.025 a 37.5 ppm de nisina. Las composiciones y suspensiones de acuerdo con la invención se pueden utilizar solas, pero también en combinación con otras composiciones antimicrobianas, por ejemplo las composiciones comprenden ácidos orgánicos o sus sales, lisozima. Las composiciones antimicrobianas se pueden aplicar al alimento, concentrado o producto agrícola, antes, durante o después de la aplicación de las composiciones o suspensiones de acuerdo con la invención.

En un aspecto adicional la invención es pertinente a un contenedor que comprende 1 a 1000 litro de una composición o suspensión de acuerdo con la invención. El contenedor puede ser una botella, bolsa o tanque, por mencionar solo unos i pocos .

De acuerdo con un aspecto adicional, la invención proporciona un método para preservar el alimento, concentrado o producto agrícola, en donde se utilizan las composiciones de nisina o suspensiones de la invención, por ejemplo aplicadas en y/o en los productos respectivos. Las composiciones de nisina y las suspensiones se pueden aplicar mediante pulverización, inmersión, inmersión, cepillado, por mencionar solo unos pocos métodos. En el caso que el sustrato/producto sea un líquido o semilíquido, se puede agregar directamente. Las composiciones o suspensiones aún pueden- tener un recubrimiento, por ej mplo un recubrimiento antimicrobiano, un sustrato a/en el cual se aplican. Opcionalmente , en una etapa adicional, el producto también se puede pasteurizar/esterilizar . Esta etapa por supuesto también se puede desarrollar antes de aplicación de las composiciones de nisina o suspensiones de la invención. Todos los tipos de los productos alimenticios se pueden tratar con las composiciones o suspensiones de la invención. Los productos alimenticios pueden ser productos alimenticios lácteos; productos alimenticios que contienen o que son derivados de huevos, carnes, especialmente pollo por ejemplo pollo frescamente sacrificado, vegetales, crustáceos y pescados; productos de arroz tal como productos de arroz 3 O hervido; productos alimenticios de panadería; bebidas; productos alimenticios congelados; productos alimenticios claros tal como productos alimenticios con base en jalea tal como postres; jugos; pastas para untar; mermelada; frutas enlatadas y otros productos enlatados; los productos alimenticios en donde las composiciones o suspensiones de la invención se aplican sobre la superficie. Los productos alimenticios lácteos incluyen, pero no se limitan a, leche procesada, leche, crema, postres de leche, mezclas de crema para helado, aderezos y yogures. Las composiciones y suspensiones de acuerdo con la invención también se pueden utilizar en el tratamiento de empaques de alimentos y equipo de manipulación y se pueden incluir en/sobre los materiales de empaque utilizados para empacar el alimento, alimentos o productos agrícolas. Las composiciones y suspensiones de la invención también se pueden utilizar como un desinfectante para limpiar superficies y cocinar utensilios en las plantas de procesamiento de alimentos y cualquier área en la que los alimentos se preparan o sirven tal como hospitales, clínicas, restaurantes, especialmente restaurantes de comida rápida, delicatessen y similares. Las composiciones y suspensiones de acuerdo con la invención son capaces de inhibir el crecimiento bacteriano en productos durante un periodo extendido, por ejemplo por lo menos aproximadamente 1 día, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 150, 200, 250, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 días y preferiblemente por lo menos aproximadamente 1000 días. Se pueden utilizar composiciones y suspensiones de acuerdo con la invención para evitar el crecimiento bacteriano, por ejemplo el crecimiento de bacterias gram-positivas tal como Staphylococcus , Streptococcus , Listeria, y Coryneform bacteria. Estas aún se pueden utilizar para evitar el crecimiento de bacterias gram-negativas tal como bacterias Gram negativas tal como Salmonella, Shigella, Escherichia Coli, Klebsiella, Pseudomonas, Bacterioides , y Actinobacillus bacteria.

Por consiguiente, un alimento, alimentos, o producto agrícola que comprende una composición de nisina o suspensión de acuerdó con la invención es otra parte de la invención.

En todavía otro aspecto, la invención pertenece a un método para producir un sólido, por ejemplo polvo, la composición de nisina que comprende la etapa de someter la composición de nisina líquida de acuerdo con la invención a por ejemplo una etapa de secado, etapa de liofilización, etapa de cristalización (si es necesario seguido por filtración o centrifugación) o una etapa de precipitación (si es necesario seguido por filtración o centrifugación) , por mencionar solo unos pocos. Las etapas se pueden desarrollar inmediatamente después de la etapa c, d o e del método para preparar las composiciones de nisina de la invención como se describió anteriormente. Ellas también se pueden hacer después que se han almacenado las composiciones de nisina líquida de la invención durante un periodo. Las composiciones de nisina sólida/en polvo resultantes se pueden mezclar con composiciones en. polvo que comprenden otros compuestos adecuados tal como por ejemplo los compuestos funcionales adicionales descritos anteriormente.

La invención se ilustra adicionalmente mediante los siguientes ejemplos, que no se deben construir como limitantes del alcance de la invención.

EJEMPLOS Ejemplo 1 Preparación de composiciones de nisina líquida Se preparan las siguientes composiciones de nisina líquida : Composición A: Diez gramos de polvo de nisina - Nisaplin® (Danisco, Dinamarca) que contiene 2.5% p/p de nisina y por lo menos 50% p/p de NaCl se disuelve en una solución de HC1 acuosa (pH 2.0-3.0; volumen total 100 mi).

Composición B: Diez gramos de polvo de nisina Nisaplin® (Danisco, Dinamarca) que contiene 2.5% p/p de nisina y por lo menos 50% p/p de NaCl se disuelve en una solución de HC1 acuosa ( H 5.5-6.5; volumen total 100 mi) .

Composiciones C y D: Diez gramos de polvo de nisina Nisaplin® (Danisco, Dinamarca) que contiene 2.5% p/p de nisina y por lo menos 50% p/p de NaCl se disuelve en una solución acuosa amortiguada de 0.2 M de dihidrogenfosfato de sodio y hidrogenfosfato de disodio (pH 7.0; volumen total 100 mi; en adición a la composición que tiene un pH de 6 y se hacen las composiciones que tienen un pH de 6.5) . La mezcla se mezcla posteriormente durante aproximadamente 15 minutos. La mezcla se centrifuga a 4,500xg durante 15 minutos a 10 °C y se obtiene un glóbulo que contiene nisina. Posteriormente, el glóbulo se disuelve en una solución de ácido cítrica acuosa (pH 2.0 a 3.0; volumen total 100 mi). La mezcla se agita durante 15 minutos. La solución obtenida que contiene nisina se centrifuga a 4,500xg durante 15 minutos a 10°C para remover los componentes sólidos restantes. Las composiciones líquidas obtenidas se mantienen en un pH de 2.0 a 3.0 (Composición C) o el pH se ajusta a un pH entre 5.5 y 6.5 mediante la adición de NaOH (Composición D) .

Composiciones E y F: La preparación de las composiciones E y F es idéntica a la preparación de las composiciones C y D con la condición que el glóbulo se disuelve en una solución de HCl acuosa que tiene un pH de 2.0 a 3.0.

Composiciones G y H: Diez gramos de polvo de nisina Nisaplin® (Danisco, Dinamarca) que contiene 2.5% p/p de nisina y por lo menos 50% p/p de NaCl se disuelve en una solución de HC1 acuosa (pH 2.0-3.0; volumen total 100 mi) . La mezcla obtenida se dializa durante 24 horas en una solución de HC1 acuosa de pH 2.0 a 3.0. Luego, la mezcla dializada se centrifuga a 4,500xg durante 15 minutos a 10 °C. Las composiciones líquidas obtenidas se mantienen en un pH de 2.0 a 3.0 (composición G) o el pH se ajusta a un pH entre 5.5 y 6.5 mediante la adición de NaOH (Composición H) . Las composiciones obtenidas se utilizan en los siguientes experimentos .

Ejemplo 2 Ensayo MIC Para el ensayo MIC se obtienen células Micrococcus luteus recientemente cultivadas (B212) y células Pseudomonas aeruginosa (ATCC 9027) de un crecimiento de cultivo durante la noche en Caldo de Cultivo Iso Sensitest (Oxoide) y Caldo de Cultivo de Conteo de Placas (Difco) , respectivamente, a 30°C. Una suspensión madre de 4.3 x 105 y 2.5 x 104 unidades formadoras de colonia CFU/mL, respectivamente, se prepara en solución salina fisiológica. Se agregan 30 L de la solución madre respectiva a 30 mL del Caldo de Cultivo Iso Sensitest (suspensión A) y Caldo de Cultivo de Conteo de Placas (suspensión B) , respectivamente. Luego, se transfiere 100 L de la suspensión A a cada pozo de una primera placa de microtítulo de 96 pozos y se transfiere 100 de la suspensión B a cada pozo de una segunda placa de microtítulo de 96 pozos. Las composiciones de nisina se preparan de acuerdo con Ejemplo 1. Se utiliza 100 yL de una composición de en un ensayo de caldo de cultivo de microdilusión estándar para determinar la Concentración de Inhibición Mínima (MIC) de cada composición, de nisina. Los resultados, presentados en la Tabla 1, muestran que las composiciones de nisina C, D, E y F muestran la actividad mayor (es decir MIC menor) contra ambos microorganismos (un microorganismo gram-positivo , es decir M. luteus, y un microorganismo gram-negativo, es decir P. aeruginosa) en pH 2.5 y pH 6.0. El MIC de las composiciones C y E está entre aproximadamente 40- a aproximadamente 100 -veces menos que el MIC de las composiciones A y G (todas las composiciones tienen un pH de 2.5), aunque el MIC de las composiciones D y F es significativamente menor que el MIC de las composiciones B y H (todas las composiciones tienen un pH de 6.0). El MIC de las composiciones C y D preparadas con 0.1 M de amortiguador de fosfato a pH 7 es comparable con el MIC de las composiciones C y D preparadas con 0.2 M de amortiguador de fosfato a pH 6 o pH 6.5.

En un experimento separado las concentraciones de MIC de las composiciones A y C se comparan con Bacíllus subtilis frescamente cultivados (ATCC 31578) , Staphylococcus aureus (ATCC 27661), Lactococcus lactis (ATCC 19257) y Listeria innocua (LMD92.20). El experimento se hace idénticamente al experimento descrito anteriormente, con la condición que la suspensión madre preparada contiene l.OxlO6, 1.3xl06, 7.7xl04, y 2.8xl05 CFU/mL del microorganismo respectivo, respectivamente. Los resultados muestran que el MIC de la composición C para los microorganismos gram-positivos probados está entre aproximadamente 5 -a aproximadamente 300-veces menores que el MIC de la composición A (datos no mostrados) . El MIC de la composición C preparada con 0.1 M de amortiguador de fosfato a pH 7 es comparable con el MIC de la composición C preparada con 0.2 M de amortiguador de fosfato a pH 6 o pH 6.5.

Ejemplo 3 Uso de composiciones de nisina líquida en una aplicación de levadura Se preparan dos tortas. Para cada torta se mezcla 1000 gramos de Moscovisch Powder Damco con 800 gramos de huevos líquidos y 100 gramos de agua. Una torta se prepara al agregar 120 mg de polvo de nisina Nisaplin® (Danisco, Dinamarca) para los huevos líquidos. Se prepara una segunda torta al agregar 1.2 gramos de la composición C a los huevos líquidos. Las mismas cantidades de nisina se utilizan en ambas tortas (150 mg nisina/1 huevo) . La mezcla se mezcla durante 10 minutos en un mezclador Hobart en el tercer equipo, y se hace hornea en un horno a 170 °C durante 25 minutos. Ambas tortas se hornean de la misma forma.

La torta horneada que comprende la composición C muestra una estructura de migajas lanosas, finas, mientras que la que comprende polvo de nisina muestra una estructura de migajas irregular dura. Esto muestra claramente que los productos horneados en donde se utilizan las composiciones de la invención tienen una mejor estructura que los productos horneados en donde se utiliza polvo de nisina. La estructura de un producto horneado se mejora al agregar una composición de nisina de acuerdo con la invención cuando se compara con agregar polvo de nisina. El ejemplo también muestra que las composiciones de acuerdo con la invención se pueden agregar al producto antes de horneado.

Ejemplo 4 Uso de composiciones de nisina líquida en una aplicación de bebida En este experimento la composición A y C se prueban por su capacidad de reducir el conteo viable de diferentes microorganismos contaminantes en una aplicación de bebida. Las composiciones A y C se preparan de acuerdo con el Ejemplo 1, utilizando polvo de nisina de Silver Elephant, China. La bebida utilizada es ,una bebida de malta, Pony de Bavaria, Colombia. Para el experimento se obtienen células Listeria monocytogenes recientemente cultivadas (LMD 92.20), células Leuconostoc oenos (ML-34) y células Leuconostoc mesenteroides aisladas de un producto contaminado de un cultivo que crece durante la noche a 30°C en Caldo de Cultivo de Conteo de Placas (Difco) . Las suspensiones madre de 3.8xl05, 5.7?10e y 7.2xl05 CFU/mL, respectivamente, se preparan en solución salina fisiológica. Se agrega 25 µL de la solución madre respectiva a 25 mL de espiga de bebida con la composición A o C. La concentración de nisina probada es 0.5 ppm para células Listeria monocytogenes , 4 ppm para células Leuconostoc oenos y 2 ppm para células Leuconostoc mesenteroides . Un control que no comprende nisina se incluye para cada microorganismo. Las muestras se incuban a temperatura ambiente y el conteo total de los microorganismos (en CFU/mL) se mide en diferentes intervalos de tiempo utilizando métodos bien conocidos.

Los resultados se muestran en la Tabla 2. Ellos demuestran claramente que para cada uno de los tres microorganismos diferentes probados de la composición C reduce el conteo celular viable por debajo del límite de detección de 1 CFU/mL en menos de un día, mientras que la composición A necesita dos o tres días para llevar a cabo esto. La composición C es por lo menos 24-48 horas más rápida que la composición A.

Ejemplo 5 Uso de composiciones de nisina líquida en un modelo de aplicación de alimentos En este experimento las composiciones A y C se prueban por su capacidad de reducir el conteo viable de Listeria monocytogenes en un modelo de aplicación de alimentos. Después de la reducción del conteo celular viable por debajo del límite de detección de 10 CFU/mL las composiciones de nisina también se prueban por su capacidad de mantener este nivel bajo y evitar la extensión de las células sobrevivientes. Las composiciones A y C se preparan de acuerdo con el Ejemplo 1, utilizando nisina de Silver Elephant, China. El modelo de aplicación se prepara utilizando Caldo de Cultivo de Conteo de. Placas (Difco) . El pH del medio se- fina a un pH 7.0 con HC1 y se lleva a autoclave durante 15 minutos a 121 °C. Para el experimento se obtienen células Listeria monocytogenes recientemente cultivadas ' (LMD 92.20) de un cultivo que crece durante la noche en el Caldo de Cultivo de Conteo de Placas (Difco) a 30°C. Se prepara una suspensión madre de 3.4xl07 de CFU/mL en solución salina fisiológica. Se agrega 250 pL de la solución madre a 25 mL del medio modelo en punta con la composición A o C. La concentración de nisina probada es 2.5 yg/mL para el experimento a 10°C y 6.25 y 12.5 yg/mL para el experimento a temperatura ambiente, un control que no comprende nisina se incluye para cada temperatura probada. Las muestras se incuban a 10 °C y a temperatura ambiente y el conteo total de microorganismos (en CFU/mL) se mide en intervalos de tiempo diferentes utilizando métodos bien conocidos.

Los resultados demuestran claramente que la composición C inhibe la extensión de histeria, monocytogenes en un modelo de aplicación de alimento a 10°C durante más de 25 días, mientras que la composición A solo inhibe la extensión durante cuatro días (ver Tabla 3) . Los resultados muestran adicionalmente que la composición C inhibe la extensión de Listeria monocytogenes en un modelo de aplicación de alimento a temperatura ambiente durante más de 25 días, mientras que la composición A solo inhibe la extensión durante dos o tres días (ver Tabla 4) .

Ejemplo 6 Preparación de composiciones de nisina líquida en escala piloto utilizando centrifugación Se disuelve 100 kg de polvo de nisina (Silver Elephant, China) que contiene 2.5% p/p de nisina y por lo menos 50% p/p de NaCl en agua. El pH se fija en 7.0 con NaOH . La mezcla se mezcla posteriormente durante aproximadamente una hora. Un agente antiespumante (Clerol FBA 3107) se agrega a una mezcla 1.5 g/kg. La mezcla se somete a centrifugación continua a 10°C a 12,000xg con un índice de alimentación de 200 1/h. Se recupera el concentrado que contiene sólidos de nisina. Posteriormente, el concentrado se disuelve en una solución de HC1 acuosa (pH 2.0 a 3.0; masa de mezcla completa: 1000 kg) . La mezcla se agita durante por lo menos una hora. La solución obtenida que contiene nisina se somete de nuevo a centrifugación continua en 10°C a 12,000xg con un índice de alimentación de 200 1/h seguido por filtración profunda (con un filtro que tiene un tamaño de poro de 3 mieras) y filtración estéril para remover los componentes sólidos restantes. La composición líquida obtenida se mantiene a un pH de 2.0 a 3.0. La túrbidez del producto final es 21 FNU, es decir se obtiene una composición líquida clara. La composición de nisina líquida obtenida tiene una buena actividad antimicrobiana, es decir un MIC comparable con el MIC de la composición C (ver Ejemplo 2) .

El proceso anterior también se desarrolla sin desarrollar la segunda etapa de centrifugación continua. El producto final tiene las mismas propiedades como el producto final descrito anteriormente.

Adicionalmente , el proceso se desarrolla sin la segunda etapa de centrifugación continua y sin la etapa de filtración profunda. El producto resultante también tiene las mismas propiedades como el producto final descrito anteriormente.

Ejemplo 7 Preparación de composiciones de nisina líquida en escala piloto utilizando filtración Se disuelve 100 kg de polvo de nisina (Silver Elephant, China) que contiene 2.5% p/p de nisina y por lo menos 50% p/p de NaCl en una solución acuosa amortiguada de 0.2 M de dihidrogenfosfato' de sodio y hidrogenfosfato de disodio (pH 7.0; masa de mezcla completa: 1000 kg) . La mezcla se mezcla posteriormente durante aproximadamente una hora. La mezcla se filtra mediante filtración sin salida a 10°C utilizando una ayuda de filtro Dicalite BF. Se recupera la torta de filtro que contiene sólidos de nisina. Posteriormente, la torta de filtro se disuelve en una solución de ácido cítrica acuosa (pH 2.0 a 3.0; masa de mezcla completa: 1000 kg) . La mezcla se agita durante por lo menos una hora. La solución obtenida que contiene nisina se somete a filtración sin salida, filtración profunda y filtración estéril a 10 °C para remover los componentes sólidos restantes. La composición líquida obtenida se mantiene a un pH de 2.0 a 3.0. La turbidez del producto final es25 FNU, es decir se obtiene una composición liquida clara. La composición de nisina liquida obtenida tiene una buena actividad antimicrobiana, es decir un MIC comparable con el MIC de la composición C (ver Ejemplo 2) .

Ejemplo 8 Preparación de composiciones de nisina líquida utilizando filtración en pH bajo Se disuelve en agua 100 g de polvo de nisina (Silver Elephant, China) que contiene 2.5% p/p de nisina y por lo menos 50% p/p de NaCl . El pH se fija en 4.0 con NaOH. La mezcla se mezcla posteriormente durante aproximadamente una hora. La mezcla se filtra filtración sin salida a 10°C utilizando ayuda de filtro Dicalite BF. Se recupera la torta de filtro que contiene sólidos de nisina. Posteriormente, la torta de filtro se disuelve en una solución de HC1 acuosa (pH 2.0 a 3.0) . La mezcla se agita durante por lo menos una hora. La solución obtenida que contiene nisina se filtra utilizando filtración sin salida, filtración profunda y filtración estéril a 10°C para remover los componentes sólidos restantes. La composición líquida obtenida se mantiene en un de 2.0 a 3.0. La turbidez del producto final es 123 FNU, es decir se obtiene una composición líquida turbia. La • composición de nisina líquida obtenida tiene una buena actividad antimicrobiana, es decir un MIC comparable con el MIC de la composición C (ver Ejemplo 2) .

Ejemplo 9 Preparación de suspensión de polvo de nisina estable El polvo de nisina (Silver Elephant, China) que contiene 2.5% p/p de nisina y por lo menos 50% p/p de NaCl se suspende en agua. Se agregan varios agentes espesantes en varias cantidades. El pH se fija a pH 2 o pH 5 con soluciones de HC1 y NaOH. La estabilidad física de las suspensiones se analiza después de almacenamiento durante 9 días a temperatura ambiente mediante análisis de la altura de la sedimentación frontal en un tubo de 50 mL que contiene 47.5 mL de la suspensión. Los resultados se describen en la Tabla 5. La concentración de nisina en todas las suspensiones es 0.25% p/p. se expresa la sedimentación como el porcentaje de líquido claro que se observa (es decir el líquido que no contiene partículas) . 0% indica que no ha ocurrido sedimentación y que la suspensión por lo tanto tiene una buena estabilidad física. Los resultados muestran que a pH 2 y pH 5 las suspensiones son físicamente estables cuando se utiliza goma xantano en una concentración mayor de 0.05% (p/p) · Los resultados muestran adicionalmente que en pH 2 y pH 5 las suspensiones son físicamente estables cuando se utilizan CMC o alginato en una concentración de 1% (p/p) o mayor, aunque para HPMC una concentración de 3% (p/p) o mayor conduce a suspensiones de nisina estables físicas.

Tabla 1: valores MIC de las composiciones nisina en yg/mL contra M. luteus y P. aeruginosa.

Tabla 2 : Días hasta que se reduce el microorganismo respectivo por debajo del límite de detección de 1 CFU/mL en una aplicación de bebida con diferentes composiciones de nisina.

Tabla 3 : Cantidad de días de extensión de Listeria monocytogenes se inhibe por debajo del límite de detección de 10 CFU/mL en un modelo de aplicación de alimento a 10 °C con diferentes composiciones de nisina.

Tabla 4 : Cantidad de días que se inhibe la extensión Listeria monocytogenes por debajo del límite de detección de 10 CFU/mL en un modelo de aplicación de alimento a temperatura ambiente con diferentes composiciones de nisina.

Cantidad de días que se inhibe la extensión a temperatura ambiente Control <l Composición 2 A (250 pg/mL) Compos ición 3 A (500 pg/mL) Composición >25 C (250 pg/mL) Composición >25 C (500 pg/mL) Tabla 5: Estabilidad física de la suspensión de polvo de nisina con diferentes agentes espesantes.

REFERENCIAS Montville TJ, Chung HJ, Chikindas ML y Chen Y (1999) , Nisina A depletes intracellular ATP y acts in bactericidal manner contra Mycobacteriu smegmatis. Letters in Ap l . Microbiol. 28:189-193. ota-Meira , LaPointe G, Lacroix C y Lavoie MC (2000) , MICs of Mutacin B-NY266, Nisina A, Vancomicina, y Oxacillin contra bacterial pathogens . Antitnicrobial Agents - y Chemotherapy .44 : 24-29.

Pongtharangkul T y Demirci A (2004) . Evaluation of agar diffusión bioassay for nisina quantification, Ap l . Microbiol. Biotechnol . 65:268 -272.

Claims (18)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN Habiendo descrito la presente invención como antecede, se considera como una novedad, y por lo tanto, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes: REIVINDICACIONES

1. Un método para preparar una composición de nisina líquida, que comprende las etapas de: a) Mezclar nisina en polvo con una solución acuosa para preparar una primera composición de nisina líquida que tiene un pH de 3.5 a 12 y un concentración de sal inorgánica ¦ final de 1.5 M o menos, b) aislar los compuestos sólidos de la primera composición preparada que contiene nisina líquida por céntrifugación, filtración o cualquier combinación de las mismas, c) poner en contacto los compuestos sólidos aislados con una solución que tiene un pH de 1 a 3 para preparar una segunda composición de nisina líquida, y opcionalmente d) eliminar los compuestos sólidos de la segunda composición de nisina líquida.

2. El método de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende adicionalmente la etapa de: e) ajustar el pH de la segunda composición de nisina líquida a un valor deseado.

3. Una composición de nisina líquida que se puede obtener mediante el método de acuerdo con la reivindicación 1 o 2.

4. La composición de acuerdo con la reivindicación 3 que tiene una concentración inhibidora mínima (MIC) de 0.001 g/mL o menos contra Micrococcus luteus B212.

5. La composición de acuerdo con la reivindicación 3 o 4 que tiene un pH de 1.5 a 5.

6. La composición de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5, en donde composición comprende una relación de sal a nisina de 100:1 hasta a 1:100.

7. La ' composición de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 6 que tiene una turbidez de 0 a 100 FNU.

8. La composición de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 7, que comprende adicionalmente por lo menos un compuesto seleccionado del grupo que consiste de un compuesto antimicrobiano adicional, un tensoactivo, un agente que ajusta el pH, un crioprotector , un agente antiespumante y un agente espesante .

9. Una suspensión acuosa de nisina que tiene un pH de 2 a 12 y comprende de 0.2 a 5% (p/p) de goma de xantano .

10. La suspensión de acuerdo con la reivindicación 9, que comprend 0.01 a 5%· (p/p) de nisina.

11. La suspensión de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 9 o 10, que comprende adicionalmente por lo menos un compuesto seleccionado del grupo que consiste de un compuesto antimicrobiano adicional, un tensoactivo, un agente 5 que ajusta el pH, un agente antiespumante y un crioprotecto .

12. Un método para preparar una suspensión de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11, comprendiendo el método las etapas de: a) agregar nisina y goma de xantano, bien 0 separadamente o como una composición en polvo, a una solución acuosa, b) mezclar para obtener una suspensión que comprende de 0.2 a 5% (p/p) de goma de xantano, y' c) si es necesario, ajustar el pH de la suspensión 5 de 2 a 12. '

13. Una composición el polvo para uso en un método de acuerdo con la reivindicación 12 que comprende nisina y goma de xantano. '

14. Uso de una suspensión acuosa como se reivindica en Ó una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11 para la preparación de un líquido de tratamiento para el tratamiento de un alimento, concentrado o producto agrícola.

15. Uso de una composición de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 8 o una suspensión de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11 como un conservante en y/o sobre un alimento, concentrado o producto agrícola.

16. Un método para preservar un alimento, concentrado o producto agrícola, en donde una composición de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 8 o una suspensión de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11 se aplica al alimento, concentrado o producto agrícola.

17. Un método para producir una composición de nisina sólida que comprende la etapa de someter una composición de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 8 a una etapa de secado, etapa de liofilización, etapa de cristalización o etapa de precipitación.

18. un alimento, concentrado o producto agrícola que comprende una composición de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 8 o una suspensión de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11.