MX2011001121A - Composiciones de particulas con modo de incorporacion preseleccionado en la celula. - Google Patents

Abstract

Un método para formular una composición de partículas que tiene un modo de incorporación preseleccionado en la célula, implica seleccionar una célula objetivo que tiene receptores de superficie, y obtener partículas que tienen i) porciones de superficie que tienen una afinidad por, o son capaces de unirse a, los receptores de superficie de la célula, y ii) una forma preseleccionada, en donde una distribución de superficie de las porciones de superficie en las partículas y la forma de las partículas, son efectivas para el modo de incorporación preseleccionado en la célula.

Description

COMPOSICIONES DE PARTÍCULAS CON MODO DE INCORPORACIÓN PRESELECCIONADO EN LA CÉLULA DECLARACIÓN PARA INVESTIGACIÓN FEDERALMENTE PATROCINADA Cierta investigación que sustenta las invenciones, ha sido sustentada por fondos federales del Departmento de la Defensa de los Estados Unidos bajo la concesión No. W81XWH-04-2-0035, y de la NASA a través de la concesión No. SA23-06-017. El gobierno de los Estados Unidos puede tener ciertos derechos en estas invenciones.

CAMPO DE LA INVENCIÓN Las invenciones se refieren generalmente a composiciones de partículas de tamaño micrométrico y nanométrico y sus aplicaciones y, más particularmente, a composiciones de partículas de tamaño micrométrico y nanométrico que tienen un modo de incorporación preseleccionado particular en la célula.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La endocitosis es un término general que define procesos por los cuales una célula puede introducir y/o exportar especies extracelulares seleccionadas, tales como moléculas, virus, partículas y microorganismos, y dirigirlos hacia organelos específicos dentro de un citoplasma. La endocitosis puede ocurrir a través de una variedad de vías que incluyen endocitosis mediada por cavéolas y mediada por clatrina; fagocitosis; y endocitosis independiente de cavéolas y clatrina. Una vía de endocitosis particular puede depender del tamaño y la naturaleza de la carga extracelular; véase, por ejemplo, Conner S. D. y S. L. Schmid. 2003. Nature 422: 37-44. Por ejemplo, la endocitosis mediada por cavéolas es asistida por la activación de las cavéolas, invaginaciones de la membrana plasmática, con un tamaño característico de 50 a 60 nm; la endocitosis mediada por clatrina requiere la concentración de receptores de transmembrana y sus ligandos unidos sobre la membrana plasmática, llevando a la formación de celdas vesiculares con un tamaño característico de hasta unos cuantos cientos de mieras (100-500 nm); la fagocitosis implica cascadas de señalización y receptores de la superficie de la célula específicos con la formación de proyecciones de la membrana celular que finalmente envuelven la carga externa de tamaño micrométrico (>1 µ??). La endocitosis independiente de cavéolas y clatrina puede estar asociada con la formación de vesículas de invaginación menores de 100 nm.

La endocitosis de partículas puede ser de importancia fundamental en varios campos, tales como la virología, el suministro de fármacos y genes y en nanotoxicología; véase, por ejemplo, Marsh M. y A. Helenius. 2006. Cell 124: 729-40; Vasir J. K. y V. Labhasetwar. 2006. Expert Opin. Drug Deliv. 3: 325-344; Oberdorster G., E. Oberdorster, J. Oberdorster. 2005. 113: 823-39.

Para las partículas de tamaño nanométríco tanto naturales, tales como virus cubiertos, o artificiales tales como materia en partículas biomiméticas, el mecanismo de incorporación más efectivo puede ser una endocitosis mediada por receptores, en la cual moléculas (ligandos) distribuidas sobre la superficie de las partículas se unen a contramoléculas (receptores) expresada sobre la membrana celular, la cual puede doblarse finalmente para invaginar la carga extraña; véase, por ejemplo, Marsh M. y A. Helenius. 2006. Cell 124: 729-40; Smith A. E., A. Helenius. 2004. Science 304: 237-42. Estos receptores pueden ser colectados en el sitio de la invaginación por difusión de la superficie, sin la cual la endocitosis no ocurriría u ocurriría sobre una escala de tiempo mucho más larga.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Una modalidad provee un método para formular una composición de partículas que tiene un modo de incorporación preseleccionado en la célula, el cual comprende a) seleccionar una célula que tenga receptores de superficie; y b) obtener partículas que tengan i) porciones de superficie que tengan una afinidad por, o sean capaces de unirse a, los receptores, y ii) una forma, en donde una distribución de superficie de las porciones de superficie y la forma sean efectivas para el modo de incorporación preseleccionado en la célula por la célula seleccionada.

Otra modalidad es un método para tratar o monitorear una condición fisiológica, que comprende administrar a un sujeto que necesita del mismo, una cantidad efectiva de una composición de partículas que tiene un modo de incorporación preseleccionado en la célula.

Otra modalidad es una composición de partículas que tiene un modo de incorporación preseleccionado en la célula.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La figura 1 describe esquemáticamente una partícula que tiene una sección transversal elíptica. La partícula tiene moléculas de ligando sobre su superficie que pueden interactuar con moléculas receptoras sobre una superficie de la membrana de la célula.

La figura 2 ilustra la evolución de la partícula cilindrica elíptica que presenta el tiempo de semienvoltura 0.5TW, y la relación de la extensión de la envoltura Xmáx/R como una función de la relación entre dimensiones G, variando de 0.9 a 4, para R2 fijo a 50 nm.

La figura 3 muestra una gráfica de rmm, que es un valor de G para un R2 fijo que corresponde al mínimo para el tiempo de semienvoltura, como una función de R2. La figura 3 muestra también una gráfica del tiempo de semienvoltura para rmm como una función de R2.

La figura 4 ilustra la evolución de la partícula cilindrica elíptica que presenta el tiempo de semienvoltura 0.5 ½, y la relación de la extensión de la envoltura x, Ri, como una función de la relación entre dimensiones G, variando de 0.9 a 4, para un volumen fijo (Rs = 50 nm).

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Documentos relacionados Los siguientes artículos de investigación y los documentos de patente, los cuales se incorporan en su totalidad en la presente como referencia, pueden ser útiles para el entendimiento de las presentes invenciones: 1 ) publicación del PCT No. WO 2007/120248, publicada en octubre 25 de 2007; 2) publicación del PCT No. WO 2008/041970, publicada en abril 10 de 2008; 3) publicación del PCT No. WO 2008/021908, publicada en febrero 21 de 2008; < 4) solicitud de patente de E.U.A. publicación No. 2008/0102030, publicada en mayo 1 de 2008; 5) solicitud de patente de E.U.A. publicación No. 2003/01 14366; 6) solicitud de patente de E.U.A. No. 12/034,259, presentada en febrero 20 de 2008; 7) solicitud de patente de E.U.A. No. 12/1 10,515, presentada en abril 28 de 2008; 8) Tasciotti er a/., Nature Nanotechnology, vol. 3, 151-158, 2008; 9) Decuzzi y Ferrari, Biomaterials 28, 2007, 2915-2922; 10) Decuzzi y Ferrari, Biophysical Journal, 94, 2008, 3790-3797.

Definiciones A menos que se especifique de otra manera, los términos "un" o "una" significan uno o más.

A menos que se especifique de otra manera, los términos "endocitosis" y "endocitótico" significan, respectivamente, endocitosis mediada por receptores y endocitótico mediado por receptores.

El término "micropartícula" se refiere a una partícula que tiene una dimensión máxima de 1 micrómetro a 1000 micrómetros o, en algunas modalidades, de 1 miera a 100 mieras, según se especifica.

El término "nanopartícula" se refiere a una partícula que tiene una dimensión máxima de menos de 1 miera.

El término "fagocitosis" se refiere a una absorción de grandes partículas (tamaño característico de más de 2 mieras) por células fagocíticas especializadas, que incluyen macrófagos, monocitos y neutrófilos. La fagocitosis implica la formación de prominencias en la membrana celular que envuelven finalmente a la partícula externa.

El término "endocitosis mediada por receptores" o RME, se refiere a una incorporación, por una célula, de una partícula que tiene porciones, tales como ligandos, distribuidas sobre su superficie, los cuales pueden unirse a contraporciones (receptores) expresadas sobre la membrana de la célula. La RME implica flexión de la membrana de la célula, lo cual resulta en una envoltura completa de la partícula por la membrana, y la incorporación final de la partícula por la célula. Las partículas que son incorporadas por medio de RME, pueden tener un tamaño característico más pequeño que las partículas que sufren incorporación por medio de fagocitosis. La RME no se limita a células fagocíticas.

El término "biodegradable" se refiere a un material que puede disolverse o degradarse en un medio fisiológico, o un material polimérico biocompatible que puede ser degradado bajo condiciones fisiológicas por enzimas y/o condiciones químicas fisiológicas.

Descripción ( Los presentes inventores reconocieron una importancia de una forma de una partícula para una endocitosis mediada por receptores. Por consiguiente, la presente invención provee un método para formular una composición de partículas con un modo de incorporación preseleccionado en la célula, el cual puede implicar seleccionar una célula objetivo y obtener partículas que tengan sobre sus superficies porciones de superficie que tengan afinidad por, o sean capaces de unirse a, receptores de superficie de la superficie de la célula objetivo. La distribución de superficie de las porciones de superficie en las partículas y una forma de las partículas, son tales que son efectivas para el modo de incorporación preseleccionado en la célula por la célula seleccionada.

El modo de incorporación preseleccionado en la célula puede seleccionarse de un modo de "endocitosis" o "sin endocitosis". El término "endocitosis" se refiere a un modo, cuando una partícula puede ser completamente envuelta por la membrana de la célula por medio de una endocitosis mediada por receptores y finalmente incorporada, y el término "sin endocitosis" se refiere a un modo cuando la partícula puede ser cuando mucho parcialmente envuelta por la membrana de la célula.

En algunas modalidades, el modo de incorporación preseleccionado en la célula puede ser una endocitosis frustrada o parcial. El término "endocitosis frustrada" se refiere a un modo cuando la partícula es sólo parcialmente envuelta por la membrana de célula, y no es incorporada por la célula.

Las partículas con un modo de incorporación preseleccionado en la célula pueden usarse para tratar y/o monitorear una condición fisiológica. En dicho caso, puede seleccionarse un sitio objetivo, el cual es afectado con la condición fisiológica y tiene células que tienen receptores de superficie sobre su superficie, en un cuerpo de un sujeto, tal como un mamífero, de preferencia un humano, y administrando al sujeto una cantidad efectiva de una composición que comprende partículas con un modo de incorporación preseleccionado para las células del sitio objetivo. La condición fisiológica puede ser, por ejemplo, una enfermedad, tal como cáncer o una inflamación.

En general, la célula seleccionada puede ser cualquier tipo de célula que tenga receptores de superficie sobre su superficie. En muchas modalidades, las células seleccionadas pueden ser una célula de mamífero, tal como una célula humana.

Un modo de incorporación seleccionado particular puede depender de la aplicación destinada para las partículas. Por ejemplo, el modo de endocitosis puede preferirse cuando la partícula contiene una carga, tal como un agente de formación de imágenes o un agente terapéutico, el cual se desea que sea suministrado dentro de la célula. Por otra parte, los modos de sin endocitosis o de endocitosis frustrada pueden preferirse cuando la partícula contiene una carga, la cual no es destinada para suministro dentro de la célula. Un ejemplo de dicha situación puede ser un vehículo de suministro de etapas múltiples descrito en la publicación del PCT WO 2008/021908, en donde una partícula de primera etapa del vehículo, la cual contiene dentro partículas de segunda etapa, está destinada para reconocer y adherirse a un sitio objetivo en el endotelio, sin que sea incorporada por las células endoteliales. Después de la adherencia, la partícula de la primera etapa puede liberar las partículas de la segunda etapa.

En muchas modalidades, la célula seleccionada puede ser una célula no fagocítica, es decir, una célula que no puede realizar fagocitosis. Ejemplos de células fagocíticas, es decir, células que realizan fagocitosis, incluyen neutrófilos, monocitos y macrófagos.

En algunas modalidades, la célula seleccionada puede ser una célula endotelial, tal como una célula de la vasculatura endotelial, y el sitio objetivo puede ser un sitio de la vasculatura, tal como una vasculatura coelegida, una vasculatura angioténsica o una vasculatura renormalizada. Para células de la vasculatura co-elegida, los receptores de superficie pueden ser receptores de angiopoyetina 2; para células de la vasculatura angiogénica, los receptores de superficie pueden ser factores de crecimiento endotelial vascular (VEGF), factores de crecimiento de fibroblastos básico o marcadores endoteliales tales como integrinas a?ß3; para células de la vasculatura renormalizada, los receptores de superficie pueden ser moléculas de adhesión celular 1 relacionadas con carcinoma embrionario (CEACAM1), receptor B de endotelina (ET-B), inhibidores del factor de crecimiento endotelial vascular gravin/AKAP12, y proteínas de andamiaje para proteína cinasa A y proteína cinasa C.

Las porciones de superficie de la superficie de la partícula pueden ser complementarias a los receptores en la superficie de la célula seleccionada. Las porciones de superficie pueden ser, por ejemplo, anticuerpos, aptámeros o ligandos con afinidad por, o capaces de unirse a, los receptores en la superficie de la membrana de la célula seleccionada. En algunas modalidades, las porciones de superficie pueden incluir porciones específicas para los receptores en la superficie de la membrana de la célula seleccionada. En algunas modalidades, las porciones de superficie pueden incluir porciones no específicas para los receptores en la superficie de la membrana de la célula seleccionada. Todavía en otras modalidades, las porciones de superficie pueden incluir porciones específicas y no específicas.

Las partículas con un modo de incorporación preseleccionado pueden ser parte de una composición que puede incluir también partículas sin el modo de incorporación preseleccionado. Las partículas con un modo de incorporación preseleccionado pueden constituir por lo menos 10% o por lo menos 25% o por lo menos 50% o por lo menos 75% o por lo menos 90% en número, del número total de partículas en la composición.

En muchas modalidades, la partícula puede ser una partícula no esférica. En algunas modalidades, la partícula puede ser una partícula con una sección transversal circular. En algunas modalidades, la partícula puede ser una partícula elipsoidal. En otras modalidades, la partícula puede ser una partícula cilindrica con una sección transversal elíptica en una dirección perpendicular al eje del cilindro.

En algunas modalidades, el tamaño característico más grande de la partícula, tal como una longitud de su eje principal para una partícula con una sección transversal elíptica, puede ser menor de 2 mieras, o menor de 1 miera, o menor de 800 nm, o de 5 nm a 500 nm, o de 5 nm a 800 nm, o de 5 nm a 1 miera, o de 10 nm a 1 miera, o de 10 nm a 800 nm, o de 10 nm a 500 nm, o de 20 nm a 1 miera, o de 20 nm a 800 nm, o de 20 nm a 500 nm, o de 50 nm a 1 miera, o de 50 nm a 800 nm, o de 50 nm a 500 nm.

De preferencia, el tamaño característico más grande de la partícula es sustancialmente menor que un tamaño característico de la célula seleccionada. El tamaño característico más grande de la partícula puede ser por lo menos 3 veces más pequeño, o por lo menos 5 veces más pequeño, o por lo menos 10 veces más pequeño, o por lo menos 20 veces más pequeño, o por lo menos 30 veces más pequeño, o por lo menos 50 veces más pequeño, o por lo menos 100 veces más pequeño, o por lo menos 200 veces más pequeño, o por lo menos 300 veces más pequeño, o por lo menos 500 veces más pequeño, o por lo menos 1000 veces más pequeño, que el tamaño característico de la célula seleccionada. Un tamaño característico de la célula seleccionada puede variar de aproximadamente 5 mieras a aproximadamente 40 mieras, o de aproximadamente 10 mieras a aproximadamente 30 mieras.

En algunas modalidades, las partículas obtenidas pueden ser partículas que tienen una subsuperficie convexa con una curvatura local y una densidad de superficie local de las porciones, tales como ligandos, que son efectivas para la incorporación de las partículas por medio de una endocitosis mediada por receptores, lo cual significa que la curvatura local ? es más pequeña que una curvatura de endocitosis máxima Kméx para la densidad de superficie local de las porciones. La curvatura de endocitosis máxima puede depender de una energía de unión entre las porciones en la superficie de la partícula y los receptores en la superficie de la membrana de la célula seleccionada, un factor de energía de flexión de la membrana de la célula seleccionada y densidades de superficie de las porciones de la partícula y de los receptores en la membrana de la célula seleccionada. Se describen a continuación métodos para evaluar la curvatura de endocitosis máxima.

En algunas modalidades, la densidad de superficie local de las porciones en la superficie convexa puede ser mayor que una densidad de superficie de las porciones en otras partes de la superficie de la partícula, haciendo de esta manera que una distribución de superficie de las porciones de superficie en la superficie de la partícula, sea no uniforme.

Para partículas con una sección transversal elíptica, la obtención de partículas con un modo de incorporación preseleccionado en la célula puede implicar obtener partículas que tengan una relación entre dimensiones que corresponda al modo seleccionado.

Por ejemplo, la figura 1 ilustra una sección transversal elíptica de una partícula cilindrica elíptica que interactúa con una membrana por medio de enlaces específicos del receptor del ligando. Una densidad de superficie de los ligandos en la superficie de la partícula es mi, mientras que densidad de superficie de los receptores en una superficie de la membrana de la célula es mr.

La sección transversal elíptica puede ser caracterizada por Ri y R2, que son semilongitudes de los ejes de la elipse. Una relación entre dimensiones de la elipse, puede definirse como G = Ri/R2. El área en sección transversal de la partícula es A = nRiR2 = nYR2 = nRs2, en donde Rs es un radio de una partícula con una sección transversal circular que tiene la misma área que la partícula elíptica.

La geometría de la partícula puede ser completamente definida por muchos pares de parámetros tales como Ri y R2; G y R^ G y R2, G y Rs o G y V, en donde V es el volumen de la partícula.

En un caso, cuando la geometría de la partícula se define a través de G y R?, un parámetro de forma que determina un modo de incorporación preseleccionado puede ser una relación entre dimensiones G para un R2 particular.

La partícula con una sección transversal elíptica puede estar en un modo de "sin endocitosis", si la relación entre dimensiones de la partícula para una semilongitud particular de un eje menor es menor que un primer valor crítico ? = {R2Kmáx)'V2, en donde Kméx es una curvatura de endocitosis máxima, la cual se define a continuación.

La partícula puede estar en un modo de endocitosis frustrada, si la relación entre dimensiones de la partícula para una semilongitud particular de su eje menor es no mayor que un segundo valor crítico, G" = f?2*má - La partícula puede estar en un modo de endocitosis, si la relación entre dimensiones de la partícula para una semilongitud particular de su eje menor es mayor que el primer valor crítico, G, y menor que el segundo valor crítico, G".

La curvatura de endocitosis máxima Kmáx puede definirse como un radio endocitótico mínimo inverso calculado para la célula seleccionada para una partícula esférica o una partícula con una sección transversal circular que tiene los mismos ligandos sobre su superficie, que la partícula no esférica.

El radio endocitótico mínimo y de esta manera la curvatura endocitótica máxima, puede evaluarse usando la fórmula (1 ): En la ecuación anterior, C es la energía de unión entre el ligando y el receptor respecto a kBT, en donde kB es la constante de Bolzmann, y T es una temperatura de la célula o el sitio objetivo expresada en grados Kelvin (temperatura absoluta). C depende de un par particular de ligando-receptor. En particular, = lo [tfj0], K]D es una constante de disociación en equilibrio para el ligando y el receptor que interactúan en la ¡nterfaz célula/partícula. Kd2D puede calcularse a partir de la siguiente relación Kd2D = Kc h, en donde Kd es una constante de disociación en equilibrio para el mismo par de ligando-receptor determinada, por ejemplo, experimentalmente en solución, y h es un espesor de una región de confinamiento, a la cual los sitios de ligando-receptor son restringidos. En muchos casos, h puede ser aproximadamente igual a 10 nm.

B es un factor de energía de flexión de la membrana de la célula, el cual puede determinarse como se detalla en Hochmuth, R. M., J. Biomech., 33: 15-22, 2000. mr, que es una densidad de superficie promedio en los receptores, cuando la partícula no está interactuando con la célula, puede determinarse usando métodos conocidos por los expertos en la técnica. Por ejemplo, puede determinarse mr in vivo usando anticuerpos monoclonales radiomarcados complementarios a los receptores, como se detalla para los receptores de la molécula de adhesión intercelular 1 en Panes J., et al., Am. J. Physiol. 1995; 269(6, parte 2): H 1955-64. En forma alternativa, mr puede determinarse usando anticuerpos monoclonales marcados por fluorescencia complementarios a los receptores. Dichos anticuerpos monoclonales marcados por fluorescencia pueden ser anticuerpos marcados con ficoeritrina, como se describe en la patente de E.U.A. No. 4,520,1 10. mi es una densidad de superficie local de los ligandos m¡, la cual puede hacerse variar controlando las condiciones de funcionalización de superficie para la partícula, y/o haciendo variar un tamaño de la molécula de ligando. La densidad de superficie real de los ligandos en la partícula, puede verificarse experimentalmente usando citofluometría o contramoléculas radiomarcadas en radioensayos.

Para una partícula con una distribución de superficie uniforme de los ligandos, la densidad de superficie local y la densidad de superficie promedio pueden ser iguales.

En ciertas modalidades, el radio endocitótico mínimo y de esta manera la curvatura endocitótica máxima pueden evaluarse como se describe en la solicitud de patente de E.U.A. No. 12/034,259 titulada "Endocytotic particles", presentada en febrero 20 de 2008, la cual se incorpora en su totalidad en la presente como referencia.

La figura 2 ilustra la evolución de la partícula cilindrica elíptica que presenta el tiempo de semienvoltura 0.5 TW y la relación de la extensión de la envoltura xméx/Ri como una función de la relación entre dimensiones G, variando de 0.9 a 4, para R2 = 50 nm evaluada usando un modelo teórico descrito en Decuzzi y Ferrari, Biophysical Journal, 94, 2008, 3790-3797, cita incorporada en su totalidad en la presente como referencia. xmáx es una proyección de la extensión de la envoltura de la partícula sobre el eje x en la figura 1. Para xmáx/Ri = 1 , ocurre envoltura completa en el tiempo TW. En la figura 2, para G < r'Cr, la cual es aproximadamente 0.9 en este caso, la envoltura no puede iniciar incluso, llevando a un ½ infinitamente grande y una relación nula xmáx/Ri. Para valores intermedios de G, r'cr < G < r"cr, la relación Xmáx/Ri. es siempre la unidad, significando que ocurre incorporación completa de la partícula, y 0.5½ crece con G casi linealmente. Para G > r"cr, Xmá Ri disminuye, alcanza un mínimo, y aumenta entonces rápidamente conforme aumenta G.

La figura 3 muestra una gráfica de rmin, que es un valor de G para un R2 fijo que corresponde al mínimo para el tiempo de semienvoltura, como una función de R2. La figura 3 muestra también una gráfica del tiempo de semienvoltura para Tmln como una función de R2. Los mismos datos se muestran en el cuadro 1 , junto con r'Cr y r"cr.

CUADRO 1 Conforme el tamaño de la partícula ¾ aumenta, la relación entre dimensiones rm/n, para la cual el tiempo de incorporación es el más pequeño, se reduce de 1 (R2 = Rmin) a 0.3 (R2 = 500 nm).

En algunos casos, los dos parámetros que describen la geometría de la partícula cilindrica elíptica pueden ser G y Rs.

En dicho caso, un parámetro de forma que determina un modo de incorporación preseleccionado en la célula puede ser una relación entre dimensiones G para un valor particular de Rs.

La partícula con una sección transversal elíptica puede estar en un modo de "sin endocitosis", si la relación entre dimensiones de la partícula para una semilongitud particular de un eje menor es menor que un primer valor crítico G? = (Rsx„áx)'2 3, en donde Kméx es una curvatura de endocitosis máxima, la cual se define más adelante.

La partícula puede estar en un modo de endocitosis frustrada, si la relación entre dimensiones de la partícula para una semilongitud particular de su eje menor es mayor que un segundo valor crítico, G'? = (RsKmáx)213¦ La partícula puede estar en un modo de endocitosis, si la relación entre dimensiones de la partícula para una semilongitud particular de su eje menor es mayor que el primer valor crítico, G?, y menor que el segundo valor crítico, G'?.

La figura 4 ilustra la evolución de la partícula cilindrica elíptica que presenta el tiempo de semienvoltura 0.5½ y la relación de la extensión de la envoltura xmáx/Ri como una función de la relación entre dimensiones G, variando de 0.9 a 4, para Rs = 50 nm evaluada usando un modelo teórico descrito en Decuzzi y Ferrari, Biophysical Journal, 94, 2008, 3790-3797, cita incorporada en su totalidad en la presente como referencia.

Tipos de partículas Un tipo de una partícula con un modo de incorporación preseleccionado, no es particularmente limitativo. Por ejemplo, la partícula puede ser un liposoma, una partícula basada en polímero, una partícula basada en sílice y silicio, un punto cuántico, una nanocubierta de oro, un dendrímero o una partícula viral.

En algunas modalidades, pueden fabricarse partículas con una forma efectiva para un modo de incorporación preseleccionado. En algunas modalidades, pueden seleccionarse partículas que tengan una forma efectiva para un modo de incorporación preseleccionado de un grupo de partículas, las cuales pueden tener una amplia distribución de formas y/o tamaños. La selección del grupo de partículas puede realizarse, por ejemplo, usando el instrumento de la serie Zetasizer™ Nano de Malvern Instruments, Worcestershire, Reino Unido, el cual permite medir dimensiones geométricas de las partículas.

Pueden fabricarse partículas usando muchos métodos. En general, pueden preferirse métodos de fabricación que provean un control del tamaño y la forma de las partículas.

En algunas modalidades, las partículas pueden fabricarse por métodos de nanofabricación o microfabricación de arriba abajo, tales como fotolitografía, litografía de haz de electrones, litografía de rayos X, litografía de luz UV profunda o litografía de nanoimpresión. La ventaja del uso de métodos de fabricación de arriba abajo, puede ser que dichos métodos pueden proveer una producción ampliada en proporción de partículas que son uniformes en dimensiones.

Las partículas pueden tener sobre sus superficies porciones de determinación del blanco, tales como ligandos, aptámeros o anticuerpos. Por ejemplo, los ligandos pueden estar enlazados químicamente a grupos reactivos adecuados sobre la superficie de las partículas. Los ligandos de proteínas pueden estar enlazados a grupos reactivos a tiol y amino bajo condiciones efectivas para formar, respectivamente, enlaces de tioéter o amida. Métodos para unir agentes de unión a anticuerpos u otros polímeros a un soporte polimérico o inorgánico se detallan, por ejemplo, en Taylor, R., ed., Protein Immobilization Fundamentáis and Applications, pp. 1091 10 (1991 ).

La distribución de superficie no uniforme de porciones de superficie puede lograrse, por ejemplo, cuando se obtienen partículas por métodos de nanofabricación o microfabricación de arriba abajo. Por ejemplo, un substrato, del cual las partículas se obtienen, puede ser modelado usando un recubrimiento que resista a la deposición de ligandos, de modo que la partícula tenga por lo menos dos áreas de superficie diferentes: una que sea resistente a la deposición del ligando y una que no lo sea. La exposición subsiguiente del substrato a una solución que contiene un ligando, puede resultar en partículas que tengan una distribución no uniforme de ligandos tras su liberación del substrato.

En algunas modalidades, la partícula puede tener uno o más canales que conectan un depósito con la superficie. En algunas modalidades, el depósito y los canales pueden ser poros en el cuerpo de la partícula. En dicho caso, la partícula puede comprender un material poroso o nanoporoso. Los poros del material poroso o nanoporoso pueden ser controlados para lograr una carga deseada del agente activo y/o una velocidad de liberación deseada. El material nanoporoso con tamaño de poro controlable puede ser un material de óxido, tal como Si02, Al203 o Ti02. La fabricación de partículas de óxido nanoporosas, conocidas también como partículas de sol gel se detalla, por ejemplo, en Paik J. A. et. al. J. Mater. Res., Vol. 17, agosto de 2002. El material nanoporoso con tamaño de poro controlable puede ser también silicio nanoporoso. Para detalles de la fabricación de partículas de silicio nanoporosas véase, por ejemplo, Cohén M. H. et. al. Biomedical Microdevices 5:3, 253-259, 2003.

En algunas otras modalidades, la partícula puede no tener canales en lo absoluto. Dicha partícula puede comprender, por ejemplo, un material biodegradable. Por ejemplo, la partícula puede formarse de metales tales como hierro, titanio, oro, plata, platino, cobre, y aleaciones y óxidos de los mismos. El material biodegradable puede ser también un polímero biodegradable tal como poliortoésteres, polianhídridos, poliamidas, polialquilcianoacrilatos, polifosfazenos y poliésteres. Ejemplos de polímeros biodegradables se describen, por ejemplo, en las patentes de E.U.A. Nos. 4,933,185, 4,888,176 y 5,010,167. Ejemplos específicos de dichos materiales de polímero biodegradables incluyen ácido poli(láctico), ácido poliglicólico, policaprolactona, polihidroxibutirato, éster de poli(N-palmitoil-trans-4-hidroxi-L-prolina) y poli(carbonato de DTH).

En ciertas modalidades, la partícula puede ser un agente activo per se.

Agente activo El agente activo puede ser un compuesto terapéutico y/o un agente de formación de imágenes. La selección de un agente activo particular, depende de la aplicación deseada.

El agente terapéutico puede ser una sustancia fisiológicamente o farmacológicamente activa que puede producir un efecto biológico deseado en la vasculatura fenestrada del sujeto, tal como un mamífero o un humano. El agente terapéutico puede ser un compuesto orgánico o inorgánico, que incluye péptidos, proteínas, ácidos nucleicos y pequeñas moléculas. El agente terapéutico puede estar en varias formas, tales como una molécula no cambiada, complejo molecular, sal farmacológicamente aceptable tal como clorhidrato, bromhidrato, sulfato, laurato, palmitato, fosfato, nitrito, nitrato, borato, acetato, maleato, tartrato, oleato, salicilato, y similares. Para un agente terapéutico ácido, pueden usarse sales de metales, aminas o cationes orgánicos, por ejemplo, amonio cuaternario. Derivados de fármacos tales como bases, ésteres y amidas, pueden usarse también como un agente terapéutico. Un agente terapéutico que sea insoluble en agua puede usarse en una forma que sea un derivado soluble en agua del mismo, o como un derivado de base del mismo, el cual en cualquier caso, o por su suministro, es convertido por enzimas, hidrolizado por el pH del cuerpo o por otros procesos metabólicos, a la forma terapéuticamente activa original.

El agente terapéutico puede ser un agente quimioterapéutico, un agente inmunosupresor, una citocina, un agente citotóxico, un compuesto nucleolítico, un isótopo radiactivo, un receptor y una enzima activadora de profármacos, la cual puede ser de ocurrencia natural o puede producirse por métodos de síntesis o recombinantes, o cualquier combinación de los mismos.

Fármacos que sean afectados por la resistencia clásica a fármacos múltiples, tales como alcaloides de vincapervinca (por ejemplo, vinblastina y vincristina), las antraciclinas (por ejemplo, doxorrubicina y daunorrubicina), inhibidores de la transcripción del ARN (por ejemplo, actinomicina D) y fármacos estabilizadores de los microtúbulos (por ejemplo, paclitaxel), pueden tener una utilidad particular como el agente terapéutico.

Un agente para la quimioterapia del cáncer puede ser también un agente terapéutico preferido. Fármacos para la quimioterapia del cáncer útiles incluyen mostazas de nitrógeno, nitrosoureas, etilenimina, alcansulfonatos, tetrazina, compuestos de platino, análogos de pirimidina, análogos de purina, antimetabolitos, análogos de folato, antraciclinas, taxanos, alcaloides de vincapervinca, inhibidores de topoisomerasa y agentes hormonales. Ejemplos de agentes para quimioterapia son actinomicina D, AIkeran, Ara-C, anastrozol, asparaginasa, BiCNU, bicalutamida, bleomicina, busulfán, capecitabina, carboplatino, carmustina, CCNU, clorambucilo, cisplatino, cladribina, CPT-11 , ciclofosfamida, citarabina, arabinósido de citosina, citoxán, dacarbazina, dactinomicina, daunorrubicina, dexrazoxano, docetaxel, doxorrubicina, DTIC, epirrubicina, etilenimina, etopósido, floxuridina, fludarabina, fluorouracilo, flutamida, fotemustina, gemcitabina, Herceptin, hexametilamina, hidroxiurea, idarrubicina, ifosfamida, irinotecan, lomustina, mecloretamina, melfalán, mercaptopurina, metotrexato, mitomicina, ^ mitotano, mitoxantrona, oxaliplatino, paclitaxel, pamidronato, pentostatina, plicamicina, procarbazina, rituximab, esteroides, estreptozocina, STI-571 , estreptozocina, tamoxifeno, temozolomida, tenipósido, tetrazina, tioguanina, tiotepa, tomudex, topotecan, treosulfán, trimetrexato, vinblastina, vincristina, vindesina, vinorelbina, VP-16 y Xeloda.

Fármacos para la quimioterapia del cáncer útiles incluyen también agentes alquilantes, tales como tiotepa y ciclofosfamida; J alquilsulfonatos, tales como busulfán, improsulfán y piposulfán; aziridinas, tales como benzodopa, carboquona, meturedopa y uredopa; etileniminas y metilamelaminas, incluyendo altretamina, trietilenmelamina, trietllenfosforamida, trietilentiofosforamida y trimetilolmelamina; mostazas de nitrógeno, tales como clorambucilo, clornafazina, colofosfamida, estramustina, ifosfamida, mecloretamina, clorhidrato de óxido de mecloretamina, melfalán, novembiehina, fenesterina, prednimustina, trofosfamida, mostaza de uracilo; nitroureas, tales como canustina, clorozotocina, fotemustina, lomustina, nimustina y ranimustina; antibióticos tales como aclacinomisinas, actinomicina, autramicina, azaserina, bleomicinas, cactinomicina, calicheamicina, carabicina, carminomicina, carzinofilina, cromoinicinas, dactinomicina, daunorrubicina, detorrubicina, 6-diazo-5-oxo-L-norleucina, doxorrubicina, epirrubicina, esorrubicina, idambicina, marcelomicina, mitomicinas, ácido micofenólico, nogalamicina, olivomicinas, peplomicina, potfiromicina, puromicina, quelamicina, rodorrubicina, estreptonigrina, estreptozocina, tubercidina, ubenimex, zinostatina y zorrubicina; antimetabolitos tales como metotrexato y 5-fluorouracilo (5-fu); análogos de ácido fólico, tales como denopterina, metotrexato, pteropterina y trimetrexato; análogos de purina, tales como fludarabina, 6-mercaptopurina, tiamiprina y tioguanina; análogos de pirimidina, tales como ancitabina, azacitidina, 6-azauridina, carmofur, citarabina, didesoxiuridina, doxifluridina, enocitabina, floxuridina y 5-FU; andrógenos, tales como calusterona, propionato de dromostanolona, epitiostanol, rnepitiostano y testolactona; anti-adrenales, tales como amlnoglutetimlda, mitotano y trilostano; un regenerador de ácido fólico, tal como ácido frolínico; aceglatona; glucósido de aldofosfamida; ácido aminolevulínico; amsacrina; bestrabucilo; bisantreno; edatraxato; defofamina; demecolcina; diaziquona; elfornitina; acetato de eliptinio; etoglucid; nitrato de galio; hidroxiurea; lentinan; lonidamina; mitoguazona; mitoxantrona; mopidamol; nitracrina; pentostatina; fenamet; pirarrubicina; ácido podofilínico; 2-etilhidrazida; procarbazina; PSK®; razoxano; sizofran; espirogermanio; ácido tenuazónico; triaziquona; 2,2',2"-triclorothetilamina; uretán; vindesina; dacarbazina; manomustina; mitobronitol; mitolactol; pipobromano; gacitosina; arabinósido ("Ara-C"); ciclofosfamida; tiotepa; taxoides, por ejemplo, paclitaxel (TAXOL®, Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, NJ) y doxetaxel (TAXOTERE®, Rhone-Poulenc Rorer, Antony, Francia); clorambucilo; gemcitabina; 6-tioguanina; mercaptopurina; metotrexato; análogos de platino, tales como cisplatino y carboplatino; vinblastina; platino; etopósido (VP-16); ifosfamida; mitomicina C; mitoxantrona; vincristina; vinorelbina; navelbina; novantrona; tenipósido; daunomicina; aminopterina; xeloda; ibandronato; CPT-11 ; el inhibidor de topoisomerasa RFS 2000; difluorometilornitina (DMFO); ácido retinoico; esperamicinas; capecitabina; y sales, ácidos o derivados farmacéuticamente aceptables de cualquiera de los anteriores. Incluidos también, son agentes antihormonales que actúan para regular o inhibir la acción hormonal sobre los tumores, tales como ánti-estrógenos que incluyen, por ejemplo, tamoxifeno, raloxifeno, 4(5)-imidazoles inhibidores de aromatasa, 4 hidroxitamoxifeno, trioxifeno, keoxifeno, onapristona y toremifeno (Fareston); y anti-andrógenos, tales como flutamida, nilutamida, bicalutamida, leuprolida y goserelina; y sales, ácidos o derivados farmacéuticamente aceptables de cualquiera de los anteriores.

Pueden usarse también citocinas como el agente terapéutico. Ejemplos de dichas citocinas son linfocinas, monocinas y hormonas polipeptídicas tradicionales. Incluidas entras las citocinas, son las hormonas de crecimiento, tales como la hormona de crecimiento humano, hormona de crecimiento humano de N-metionilo y hormona de crecimiento bovino; hormona paratiroidea; tiroxina; insulina; proinsulina; relaxina; pro-relaxina; hormonas de glucoproteínas, tales como la hormona foliculoesti mulante (FSH), hormona tiroideoestimulante (TSH) y hormona luteinizante (LH); factor de crecimiento hepático; factor de crecimiento de fibroblastos; prolactina; lactógeno placentario; factor de necrosis tumoral a y ß; sustancia inhibidora de Müller; péptido asociado con gonadotropina de ratón; ¡nhibina; activina; factor de crecimiento endotelial vascular; integrina; trombopoyetina (TPO); factores de crecimiento nervioso, tales como NGF-ß; factor de crecimiento de plaquetas; factores de crecimiento transformante (TGFs), tales como TGF-a y TGF-ß; factor de crecimiento tipo insulina I y II; eritropoyetina (EPO); factores osteoinductores; interferones tales como interferón a, ß y ?; factores estimuladores de colonias (CSFs), tales como factores estimuladores de macrófagos-CSF ( -CSF); de granulocitos-macrófagos-CSF (G -CSF); y de granulocitos-CSF (GCSF); ¡nterleucinas (ILs), tales como IL-1 , IL-1a, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-11 , IL-12, IL-15; un factor de necrosis tumoral, tal como FNT-a o FNT-ß; y otros factores polipeptídicos que incluyen el ligando LIF y kit (KL). Como se usa en la presente, el término citocina incluye proteínas de fuentes naturales o del cultivo de células recombinantes y equivalentes biológicamente activos de las citocinas de secuencia nativa.

El agente de formación de imágenes puede ser una sustancia que puede proveer información de la formación de imágenes acerca de un sitio elegido como objetivo en un cuerpo de un animal, tal como un mamífero o un ser humano. El agente de formación de imágenes puede comprender material magnético, tal como óxido de hierro, para la formación de imágenes de resonancia magnética. Para la formación de imágenes ópticas, el agente activo puede ser, por ejemplo, un nanocristal semiconductor o punto cuántico. Para la formación de imágenes de tomografía de coherencia óptica, el agente de formación de imágenes puede ser un metal, por ejemplo, oro o plata, o partícula de nanocelda. El agente de formación de imágenes puede ser también un agente de contraste de ultrasonido, tal como una microburbuja o nanoburbuja o micropartícula o nanopartícula de óxido de hierro.

Composiciones Las partículas que tienen un modo de incorporación preseleccionado en la célula para un tipo particular de células, pueden ser parte de una composición, tal como una composición farmacéutica. Dicha composición puede ser una suspensión que comprenda las partículas descritas anteriormente para su uso en la administración de un agente terapéutico o de formación de imágenes. Para formar la suspensión, las partículas pueden ser suspendidas en un medio acuoso a una concentración seleccionada. La concentración óptima puede depender de las características (por ejemplo, propiedades de solubilización) de la partícula, el tipo de aplicación terapéutica y el modo de administración. Por ejemplo, las composiciones para administración oral pueden ser relativamente viscosas, y pueden contener por lo tanto una mayor concentración (por ejemplo, >50%) de la partícula. Las soluciones para inyecciones de bolo contienen de preferencia una suspensión relativamente concentrada dé las partículas (por ejemplo, 10-50%), pero no tan concentrada que tenga una viscosidad apreciablemente mayor que la solución salina (para reducir al mínimo la necesidad de agujas de gran diámetro). La solución usada para infusión intravenosa continua, puede contener típicamente una concentración relativamente baja (por ejemplo, suspensión de 2 a 10%) de las partículas, debido a los volúmenes relativamente grandes de fluido que se administran.

Las partículas pueden ser suspendidas en muchos vehículos acuosos adecuados. Un vehículo farmacéutico adecuado, puede ser un vehículo que sea no tóxico para el receptor a las dosificaciones y concentraciones usadas, y que sea compatible con otros ingredientes en la formulación. Ejemplos de vehículos adecuados incluyen, pero no están limitados a, agua, solución salina, solución de Ringer, solución de dextrosa y albúmina de suero humano a 5%. Las suspensiones para su uso en formulaciones inyectables son de preferencia isotónicas con la sangre del sujeto. En general, el vehículo puede contener cantidades menores de aditivos, tales como sustancias que aumenten la isotonicidad y la estabilidad química, por ejemplo, reguladores de pH y conservadores, así como polipéptidos de bajo peso molecular (menos de aproximadamente 10 residuos), proteínas, aminoácidos, carbohidratos que incluyen glucosa o dextranos, agentes quelantes tales como EDTA, u otros excipientes.

Antes de su administración al sujeto, la suspensión de partículas puede ser esterilizada por un método de esterilización adecuado. Las partículas fabricadas de un material termoestable pueden ser esterilizadas con calor, por ejemplo, usando una autoclave. Las partículas fabricadas de un material no termoestable pueden ser esterilizadas por pasaje a través de un filtro de esterilización disponible comercialmente. De hecho, puede usarse filtración sólo en casos en donde las partículas sean más pequeñas que los poros del filtro de esterilización.

Las partículas pueden ser administradas a un sujeto que necesita de intervención terapéutica por medio de muchos métodos de administración adecuados. El método particular usado para una aplicación específica puede ser determinado por el médico a cargo. Por ejemplo, las partículas pueden ser administradas por una de las siguientes vías: tópica, parenteral, por inhalación, oral, vaginal y anal. La administración intravascular, que incluye inyección intravenosa (i.v.), intramuscular (i.m.) y subcutánea (s.c), puede ser particularmente preferida. La administración intravascular puede ser local o sistémica. El suministro intravascular local puede usarse para poner las partículas en la vecindad de un sitio del cuerpo que tenga un tumor o inflamación conocido por el uso de un sistema de catéter guiado, tal como un catéter guiado por exploración en CAT. La inyección general, tal como una inyección i.v. de bolo o infusión i.v. de alimentación continua/por goteo, es típicamente sistémica.

Las partículas pueden ser inyectadas en el torrente sanguíneo, y puede permitirse que circulen y se localicen hacia su sitio objetivo. De preferencia, las partículas son inyectadas en una vasculatura del sitio objetivo.

Aunque lo anterior se refiere a modalidades preferidas particulares, se entenderá que la presente invención no es limitada de esta manera. Se les ocurrirá a los expertos en la técnica que pueden hacerse varias modificaciones a las modalidades descritas, y se pretende que dichas modificaciones estén dentro del alcance de la presente invención.

Todas las publicaciones, solicitudes de patente y patentes citadas en esta especificación, se incorporan en su totalidad en la presente como referencia.

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Claims (22)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES

1.- Un método para formular una composición de partículas que tiene un modo de incorporación preseleccionado en la célula, que comprende a) seleccionar una célula que tenga receptores de superficie; y b) obtener partículas que tengan i) porciones de superficie que tengan una afinidad por, o sean capaces de unirse a, los receptores, y ii) una forma, en donde una distribución de superficie de las porciones de superficie y la forma sean efectivas para el modo de incorporación preseleccionado en la célula por la célula seleccionada.

2 - El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque el modo de incorporación preseleccionado se selecciona de una endocitosis completa, una endocitosis frustrada y sin endocitosis.

3. - El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque la célula es una célula endotelial.

4. - El método de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado además porque la célula endotelial es una célula de la vasculatura endotelial.

5. - El método de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado además porque los receptores son receptores de la vasculatura de angiogénesis, receptores de la vasculatura co-elegidos o receptores renormalizados.

6.- El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque la célula es una célula no fagocítica.

7.- El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque las porciones de superficie son ligandos que son capaces de unirse a los receptores.

8.- El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque la obtención comprende fabricar las partículas.

9.- El método de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado además porque la fabricación comprende fabricación por un procedimiento de arriba abajo.

10. - El método de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado además porque la fabricación comprende depositar las porciones sobre una superficie de las partículas.

11. - El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque la obtención comprende seleccionar las partículas de una población de partículas.

12. - El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque las partículas comprenden un agente activo.

13. - El método de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado además porque el agente activo comprende un agente de formación de imágenes o un agente terapéutico.

14. - El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque dichas partículas son nanopartículas.

15. - El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque las partículas son partículas no esféricas.

16.- El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque las partículas son partículas que no tienen una sección transversal circular.

17.- El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque las partículas son partículas elipsoidales.

18.- El método de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado además porque dichas partículas elipsoidales tienen una relación entre dimensiones que es efectiva para el modo de incorporación preseleccionado en la célula para la célula seleccionada.

19. - El método de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado además porque comprende adicionalmente determinar la relación entre dimensiones, basada en una densidad de superficie de las porciones de superficie y una densidad de superficie de los receptores de superficie.

20. - El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque una superficie de las partículas comprende una superficie convexa que tiene una curvatura y una densidad de superficie local de las porciones, que son efectivas para el modo de endocitosis preseleccionado.

21. - El uso de una composición de partículas de acuerdo con el método de la reivindicación 12, para la elaboración de un medicamento para tratar o monitorear una condición fisiológica.

22. - Una composición formulada de acuerdo con el método de la reivindicación 1.