MX2010012275A - Metodo para detectar agentes virales respiratorios en una muestra de ensayo. - Google Patents

Abstract

Se describe un método y equipo o kit para la detección e identificación en una muestra de ensayo de hMPV, como es un conjunto de secuencias y su uso como cebadores de amplificación para hMPV. La amplificación del hMPV de acuerdo con la presente invención es compatible con la detección de otros virus que causan infecciones del tracto respiratorio, así como con la genotipificación del hMPV presente en la muestra. Después de someter la muestra de ensayo a amplificación con cebadores específicos para cada virus, se obtiene ADN de una sola hebra de los productos de amplificación, y se hibridiza con sondas de objetivo específico.

Description

MÉTODO PARA DETECTAR AGENTES VIRALES RESPIRATORIOS EN UNA MUESTRA DE ENSAYO CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a un método y equipo para la detección del hMPV en una muestra de ensayo, el método y kit permiten además la detección de los virus respiratorios Influenza A, Influenza B, Influenza C, PIV 1, PIV 2, PIV 3, PIV 4?, 4B, Adenovirus, hRSV A, hRSV B, Coronavirus 229, Echovirus 30, Rinovirus y hBoV.

La presente invención también se refiere a un conjunto de secuencias de ácido nucleico, asi como a su uso como cebadores de amplificación para el hMPV presente en una muestra de ensayo. La amplificación del hMPV con las secuencias de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención, es compatible con la determinación del genotipo del hMPV presente en la muestra de ensayo.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Las infecciones del tracto respiratorio son una causa importante de morbidez y mortalidad en grupos de todas las edades aunque especialmente en niños pequeños, sujetos ancianos, y pacientes con deficiencias inmunitarias . La mayoría de estas infecciones son causadas por virus.

Además de los virus más comunes que causan infecciones respiratorias, estudios recientes sugieren que el metapneumovirus humano (hMPV) debe agregarse a la lista de patógenos virales respiratorios humanos en grupos de todas las edades (van den Hoogen et al., 2001, Nat. Med. 7:719-724; Peret et al., 2002, J. Infect. Dis. 185:1660-1663; Boivin et al., 2002, J. Infect. Dis. 186:1330-1334).

Como un ejemplo de un estudio prospectivo, en un análisis de 1,322 infantes hospitalizados < 2 años de edad en España durante 5 años, se encontró que el hMPV es el virus más común después del hRSV y rinovirus (Garcia-Garcia et al., 2006, Pediatr. Pulmonol. 41 ( 9 ) : 863-71 ) . Las co-infecciones fueron frecuentes y clínicamente similares a infecciones simples e infecciones con hRSV. Se pueden encontrar datos adicionales en Garcia-Garcia et al., 2006, Arch Dis Child. 91 (4) :290-5.

Recientemente, se ha sugerido una virulencia más alta del genotipo A del hMPV con respecto al B (Vicente et al., 2006, Clin Infect Dis. 42 ( 12) : elll-3) . El espectro clínico de 69 episodios de infección pediátrica con metapneumovirus (55 episodios causados por el genotipo A y 14 episodios causados por el genotipo B) se analizó, y se encontró que el diagnóstico de neumonía fue más común y el índice de severidad de enfermedad (determinado en base a la necesidad de hospitalización, saturación de oxígeno <90%, y estancia en unidad de cuidados intensivos) fue más alta para pacientes con infección del genotipo A de hMPV. La severidad diferente observada podría ser atribuible a una virulencia más alta del genotipo A de hMPV (hMPV-A) con respecto al B (hMPV-B) .

Los intentos de la detección simultánea de hMPV y otros agentes virales que afectan al tracto respiratorio ya se han descrito (WO 2005/038427 y WO 2006/070034 constituyen ejemplos representativos) . Una lista completa de virus respiratorios incluye: Influenza A y B, virus sincitial respiratorio humano (hRSV) A y B, los cuatro serotipos del virus de parainfluenza humana (PIV), y adenovirus, rinovirus, coronavirus, Influenza C, asi como enterovirus. Además, el conocimiento de virus que causan infecciones del tracto respiratorio mínimas recientemente se ha enriquecido con la caracterización de un nuevo miembro, Bocavirus Humano (HboV) (Allander et al., 2005, PNAS 102: 12891-12896) .

Los cebadores de amplificación clásicos para hMPV son L6 y L7, primero se describen en Van den Hoogen et al., 2003, J. Infect. Dis. 188:1571-1577. Algunos otros ejemplos del estado de la técnica donde L6 y L7 se han utilizado para la amplificación del hMPV son WO 2005/038427 and WO 2006/070034.

En particular, WO 2005/038427 provee un método para la amplificación de secuencias objetivo de virus del tracto respiratorio superior, el método incluye la amplificación PCR utilizando múltiples pares de cebadores PCR. Como cebadores de amplificación para hMPV, se utilizan los cebadores L6 y L7.

Además, en WO 2006/070034, la amplificación de virus respiratorios presentes en una muestra puede llevarse a cabo antes de la hibridización de los productos de amplificación con sondas de virus específicos. Los cebadores utilizados para la amplificación del hMPV de nuevo son L6 y L7.

Las solicitudes de patente adicionales del estado de la técnica, dirigidas a la detección simultánea de patógenos virales respiratorios son: La US 2007/092871, que describe microarreglos que tienen una pluralidad de secuencias de sondas de oligonucleótidos para la identificación genética de patógenos respiratorios superiores. Con respecto a los cebadores dados a conocer en la solicitud, se proveen solamente secuencias que corresponden a una acumulación de cebadores PCR para amplificar muestras de influenza A.

La CA2418004, que describe un ensayo para la detección en una muestra de ensayo de ácidos nucleicos de patógenos virales respiratorios, clínicamente importantes, en un formato múltiplex. La mayoría de las secuencias de cebadores de amplificación mostradas en la solicitud de patente se han descrito previamente por otros, con la excepción de aquéllas de hMPV, las cuales primero se describen en la solicitud de patente. Sin embargo, estas secuencias correspondientes a los cebadores de amplificación de hMPV difieren de las descritas en la presente.

La WO 2005/005658, que da a conocer un método de detección para el coronavirus que causa el síndrome respiratorio agudo severo (SARS-CoV) , el método se basa en un chip que comprende un soporte en donde se inmovilizan sondas de oligonucleotidos. Además del chip, la solicitud de patente da a conocer además algunos cebadores de oligonucleotidos para amplificar otros virus respiratorios, que incluyen algunos para la amplificación del metapneumovirus humano. Sin embargo, ninguno de los cebadores de amplificación de la solicitud de patente WO 2005/005658 corresponde a los descritos en la presente .

La WO 2004/057021, que da a conocer composiciones y métodos para la detección de virus respiratorios por medio del uso de secuencias de ácido nucleico especificas.

Ninguno de los cebadores de amplificación de hMPV dados a conocer en WO 2004/057021 corresponde a los dados ' a conocer dentro de la invención descrita en la presente.

La WO 2006/102695, que da a conocer el uso de reacción en cadena de polimerasa (PCR) en tiempo real para la detección de organismos infecciosos respiratorios. Algunas secuencias que corresponden a los cebadores asi como a sondas de ancla y sensor se proveen en la misma. Con respecto a los cebadores de amplificación correspondientes al HMPV, las secuencias provistas difieren de las de la presente invención.

La WO 2004/096993, que provee métodos para detectar un metapneumovirus de mamífero en una muestra, en donde el método comprende ya sea poner en contacto la muestra con una sonda de ácido nucleico, o ya sea poner en contacto la muestra con un anticuerpo, o alternativamente, la amplificación del ácido nucleico MPV de la muestra. Con respecto a este último método de detección, generalmente se establece que los cebadores de amplificación pueden hibridizarse específicamente con la secuencia de ácido nucleico del ADN del metapneumovirus , sin la provisión de secuencias de cebadores específicos.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN El problema a resolverse por la presente invención es la provisión de un método que permita una detección alternativa e incluso más eficiente del hMPV en una muestra de ensayo que los métodos del estado de la técnica. Preferiblemente, el método deberá ser compatible con la subsecuente tipificación del hMPV presente, y con la detección de otros virus respiratorios presentes en la muestra.

La solución, que corresponde a un primer aspecto de la presente invención, se basa en una o más secuencias de ácido nucleico que comprenden una secuencia seleccionada del grupo que comprende la SEC. ID. NO. 1-6, sus complementos y equivalentes de los mismos, y a su uso como cebadores de amplificación en la amplificación de hMPV. Por equivalentes se entiende secuencias que pueden diferir de la secuencia dada, por ejemplo por al menos uno, preferiblemente, uno, dos, tres, cuatro mutaciones que incluyen alteraciones, eliminaciones e inserciones. Otros equivalentes pueden ser cebadores que incorporen nucleótidos alternativos o modificados en lugar de nucleótidos canónicos; siempre que la secuencia equivalente pueda actuar come? cebadores de amplificación en la amplificación del hMPV. El ácido nucleico incluye, por ejemplo, ADN, ARN y APN y cualquier otra forma o modificación.

Preferiblemente, las secuencias de ácido nucleico que comprenden las secuencias SEC. ID. NO. 1 y 2, y/o las secuencias SEC. ID. NO. 3 y 4, y/o SEC. ID. NO. 5 y 6, o sus complementos y equivalentes de las mismas, constituyen pares de cebadores de amplificación para hMPV. En una modalidad más preferida, las secuencias de ácido nucleico consisten de la SEC. ID. NO. 1-6, sus complementos o equivalentes de las mismas constituyen cebadores de amplificación para la amplificación de hMPV.

Otro aspecto de la presente invención se refiere a un método para la detección del hMPV en una muestra de ensayo que comprende poner en contacto la muestra de ensayo con una u más secuencias de ácido nucleico que comprenden una secuencia seleccionada del grupo que comprende la SEC. ID. NO. 1-6, sus complementos y equivalentes de las mismas, y someter la mezcla a una reacción de amplificación de ácido nucleico, se pretende que la reacción de amplificación amplifique las secuencias objetivo presentes en la muestra.

La amplificación de las muestras de ensayo con cebadores de acuerdo con la presente invención da como resultado una detección más sensible del hMPV que la del estado de la técnica, tanto en electroforesis con gel de agarosa, asi como en sistemas de detección basados en hibridización con sondas de objetivo especifico.

El estado de la técnica muestra un amplio interés en métodos de detección de virus respiratorios por medio de la amplificación del ácido nucleico. Una persona especializada que utiliza métodos conocidos en la técnica para generar cebadores de amplificación para el hMPV podría producir muchas secuencias, la efectividad de las cuales podría ser desconocida e imposible de analizar dentro de un margen de tiempo razonable con recursos razonables.

El método de la presente invención permite una detección más eficiente que los métodos del estado de la técnica del hMPV presente en una muestra de ensayo. Por consiguiente, la amplificación con los cebadores L6.2 y L7.2 de la presente invención (SEC. ID. NO. 1 y 2, respectivamente) permite la detección del hMPV en muestras donde la amplificación con L6 y L7 del estado de la técnica (SEC. ID. NO. 7 y 8, respectivamente) proporcionó un resultado negativo.

Además, la amplificación con los cebadores SA, AA, SB, y AB (SEC. ID. NO. 3 a 6, respectivamente) de la presente invención, seguida por hibridización con una secuencia-sonda específica, tal como las sondas F249B, F256B ó F256A (SEC. ID. NO. 11, 12 y 13, respectivamente) , complementó la capacidad de detección de un método de detección que comprende la amplificación con los cebadores L6 y L7 y L6.2 y L7.2, seguida por hibridización con las sondas HMNVA-S37 y HMNVB-S38 (SEC. ID. NO. 9 y 10, respectivamente) hasta la detección de casi el 100% de muestras positivas al hMPV.

Además, el método de amplificación con los cebadores L6.2 y L7.2 de la presente invención ya sea en la presencia o ausencia de los cebadores L6 y L7 es compatible con la amplificación en la presencia de pares de cebadores de amplificación para Influenza A, Influenza B, Influenza C, PIV 1, PIV 2, PIV 3, PIV 4A, 4B, Adenovirus, hRSV A, hRSV B, Coronavirus 229, Echovirus 30, Rinovirus y hBoV.

Una ventaja de la presente invención es que la amplificación del hMPV con los pares de cebadores de la invención, es compatible con la genotipificación del hMPV por medio de la hibridización de los productos de amplificación, previamente transformados en oligo- o polinucleótidos de una sola hebra, con las sondas de la presente invención. Por lo tanto, no se requiere una amplificación anidada para la genotipificación .

Otro aspecto de la presente invención corresponde a un kit para la detección e identificación en una muestra de ensayo de hMPV, en donde dicho equipo o kit comprende una o más mezclas de amplificación de ácido nucleico, en donde al menos una de las mezclas de amplificación comprende una' o más secuencias de ácido nucleico que comprenden una secuencia seleccionada del grupo que comprende la SEC. ID. NO. 1-6, sus complementos y equivalentes de las mismas.

En una modalidad preferida, el equipo o kit de la presente invención comprende dos o más mezclas de amplificación : - Una primera mezcla que comprende una primera y segunda secuencias de ácido nucleico que comprenden las secuencias SEC. ID. NO. 1 y 2 respectivamente, o sus complementos y equivalentes de las mismas, como componentes de un par de cebadores de amplificación para hMPV; - Una segunda mezcla que comprende la primera y segunda secuencias de ácido nucleico que comprenden las secuencias SEC. ID. NO. 3 y 4 respectivamente, y/o tercer y cuarta secuencias de ácido nucleico que comprenden las secuencias SEC. ID. NO. 5 y 6 respectivamente, o sus complementos y equivalentes de los mismos, como componentes de otros pares de cebadores de amplificación para hMPV. Preferiblemente la segunda mezcla comprende la primera a cuarta secuencias de ácido nucleico que comprenden la SEC. ID. NO. 3 a 6 respectivamente .

La primera mezcla de cebadores de amplificación adicionalmente puede comprender los cebadores L6 (SEC. ID. NO. 7) y L7 (SEC. ID. NO. 8) .

Adicionalmente, el equipo o kit de la presente invención puede permitir además la detección de Influenza A, Influenza B, Influenza C, PIV 1, PIV 2, PIV 3, PIV 4A, 4B, Adenovirus, hRSV A, hRSV B, Coronavirus 229, Echovirus 30, Rinovirus y hBoV, en una muestra de ensayo, el kit preferiblemente comprende: - Pares de cebadores de la SEC. ID. NO. 14-24 para PIV 1, PIV 2, PIV 3, PIV 4A, 4B, hRSV A y Coronavirus tipo 229, dentro de la primera mezcla de amplificación; - y pares de cebadores de la SEC. ID. NO. 25-38 para Influenza A, Influenza B, Influenza C, hRSV B, Adenovirus, Echovirus 30, Rinovirus y hBoV, dentro de la segunda mezcla de amplificación .

Además de las mezclas de amplificación, el kit puede comprender además: i) un recipiente de arreglos o conjunto de recipientes de arreglos, cada uno comprende un microarreglo o micromatriz en donde se proveen sondas de objetivo especifico; y ii) reactivos para su uso en la visualización de la hibridización de ácidos nucleicos con las sondas del microarreglo.

Un aspecto adicional de la presente invención corresponde al uso del método y equipo o kit antes mencionados, para la detección e identificación, si está presente en una muestra de ensayo, de uno o más agentes virales seleccionados del grupo que comprende hMPV, Influenza A, Influenza B, Influenza C, PIV 1, PIV 2, PIV 3, PIV 4A, 4B, Adenovirus, hRSV A, hRSV B, Coronavirus 229, Echovirus 30, Rinovirus y hBoV.

Los aspectos adicionales de la presente invención corresponden a (i) una mezcla de amplificación de ácido nucleico que comprende, como 'cebadores de amplificación, ácidos nucleicos que comprenden la SEC. ID. NO. 1 y 2, y/o ácidos nucleicos que comprenden la SEC. ID. NO. 3 y 4, y/o ácidos nucleicos que comprenden la SEC. ID. NO. 5 y 6, o sus complementos y equivalentes de las mismas. Preferiblemente la mezcla comprende como cebadores de amplificación el primero a cuarto ácidos nucleicos que comprenden la SEC. ID. NO. 3-6 respectivamente. La mezcla también puede comprender el quinto y sexto ácidos nucleicos que comprenden la SEC. ID. NO. 1 y 2 respectivamente, aunque en las modalidades preferidas, el quinto y sexto ácidos nucleicos no se incluyen en la misma mezcla como el primero a cuarto. (ii) Los fraqmentos de amplificación obtenibles con los pares de cebadores de la SEC. ID. NO. 1 y 2; 3 y 4; y 5 y 6; y (iii) Un método para producir secuencias de ácido nucleico que comprenden la SEC. ID. NO. 1-6, sus complementos y equivalentes de los mismos, en donde las secuencias de ácido nucleico pueden etiquetarse. Preferiblemente esta etiqueta es biotina.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS Figura 1. Visualización con gel de agarosa de los productos de amplificación obtenidos por medio de reacción de amplificación RT-PCR con el par de cebadores de amplificación L6 (SEC. ID. NO. 7) y L7 (SEC. ID. NO. 8), en la ausencia (Trayectorias 2-5) o presencia (Trayectorias 6-9) del par de cebadores de amplificación L6.2 (SEC. ID. NO. 1) y L7.2 (SEC. ID. NO. 2) .

Figura 2. Resultados de los Tubos de Arreglos correspondientes a la muestra S7 (positiva al h PV-A) , sometida a condiciones de amplificación de acuerdo con el últiplex 1 (Panel A) y Múltiplex 2 (Panel B) , y a la muestra S2 (positiva al hMPV-B) , sometida a condiciones de amplificación de acuerdo con el Múltiplex 1 (Panel C) y Múltiplex 2 (Panel D) .

Definiciones. Los siguientes términos tienen los significados indicados en la especificación a menos que expresamente se indique que tienen un significado diferente: - Cebadores de Amplificación: Ácidos nucleicos que se unen a y permiten la amplificación de una o más secuencias objetivo.

- Tubo de arreglos: Un recipiente individual de arreglos que tiene una forma y tamaño típicos de un recipiente de reacción de laboratorio (por ejemplo, un tubo Eppendorf de 1.5 mi) con un microarreglo acomodado dentro del mismo en la cual se pueden llevar a cabo pruebas a base de microarreglos.

- Recipiente de arreglos: Un recipiente de reacción con fondo plano que comprende un microarreglo. Las moléculas sonda del microarreglo pueden estamparse o grabarse en un soporte sólido en donde este soporte sólido puede ser el fondo de un recipiente de arreglos, o un soporte sólido diferente anexado al fondo de un recipiente de arreglos.

- Equivalente: Secuencia de nucleótidos correspondiente a la de una secuencia dada de ADN, en donde uno o más de los nucleótido son ribonucleótidos, o nucleótido modificados tales como inosina, la cual esencialmente no altera las características de hibridización .

- Etiquetado: Introducción de un grupo de modificación dentro de una secuencia de ácido nucleico.

- Microarreglo o Micromatriz : Arreglo de sondas moleculares en una superficie, en donde la posición de cada sonda se determina por separado.

- PCR Múltiplex y reacciones RT-PCR: Reacciones PCR y RT-PCR que permiten la amplificación de dos o más secuencias de ácido nucleico si están presentes.

Sondas: Ácido nucleico con la capacidad de unirse específicamente a una secuencia de ácido nucleico objetivo. Este incluye ADN, ARN, APN, y cualquier otra forma o modificación .

Sensibilidad de detección: Número mínimo de copias detectadas. "Sensibilidad superior o mejorada" aquí significa que existe un número inferior mínimo de copias detectables.

- Tira de recipientes: Un conjunto de recipientes de arreglo,- usualmente 8, cada uno con un microarreglo acomodado en el mismo, en el cual se pueden llevar a cabo análisis a base de microarreglos .

- Secuencias objetivo: Secuencias a detectarse.

- Sondas de objetivo especifico: Sondas que se hibridizan específicamente con las secuencias objetivo amplificables en las reacciones de amplificación.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a una secuencia de ácido nucleico que comprende una secuencia seleccionada del grupo que comprende la SEC. ID. NO. 1-6 (Tabla I), sus complementos y equivalentes de las mismas.

Tabla I SEC. ID. NO. Nombre del Cebador Secuencia (5'-3') 1 L6.2 TATG C CTACTATAAAAG GTC A 2 L7.2 CACCCCAGTCTTTCCTAAAG 3 SA GAGAATCCCAGACAATCTAG 4 AA ACTYTCAAGCCGGATGGTT 5 SB GAAAATCCCAGACAATCAAG 6 AB ACTCTCAAGCCTTATRGTT 7 L6 CATGCCCACTATAAAAGGTCAG 8 L7 CACCCCAGTCTTTCTTGAAA Los nucleótidos de las secuencias se designan como sigue: G para Guanina, A para Adenina, T para Tiamina, C para Citosina, R para G ó A, Y para T ó C, M para A ó C, K para G ó T, S para G ó C, W para A ó T, H para A ó C ó T, B para G ó T ó C, V para G ó C ó A, D para G ó A ó T, y finalmente, N para G ó A ó T ó C.

En una modalidad preferida, los ácidos nucleicos de la presente invención comprenden secuencias seleccionadas del grupo que comprende la SEC. ID. NO. 1-6 de la Tabla I, sus complementos y equivalentes de las mismas, que comprenden además 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ó 10 nucleótidos extra, ya sea en los extremos 5' , 3' ó ambos 5' y 3' . En otra modalidad preferida, los mismos consisten de las secuencias SEC. ID. NO. 1-6 de la Tabla I.

Los nucleótidos que se utilizan en la presente invención pueden ser desoxirribonucleótidos, no sólo ribonucleótidos , nucleótido modificados tales como inosina, y grupos de modificación que contienen nucleótidos, siempre y cuando las características de hibridización no se alteren de manera esencial. Todas estas variaciones se incluyen en el término "equivalente". Preferiblemente un equivalente incluye uno o más nucleótidos modificados. Alternativamente, o además, un equivalente incluye uno o más nucleótidos de origen no natural. En otras modalidades un equivalente es ARN.

En una modalidad preferida se etiquetan las secuencias de ácido nucleico de la presente invención. En una modalidad más preferida, las mismas se etiquetan con biotina.

La presente invención se refiere además al uso de una o más secuencias de ácido nucleico que se describen previamente, como cebadores de amplificación en la amplificación de hMPV. En una modalidad preferida de la presente invención, las secuencias de ácido nucleico que comprenden las secuencias SEC. ID. NO. 1 y 2, y/o secuencias SEC. ID. NO. 3 y 4, y/o SEC. ID. NO. 5 y 6, o sus complementos y equivalentes de las mismas, constituyen pares de cebadores de amplificación para hMPV. En otra modalidad preferida, se etiqueta uno o ambos cebadores de cada par de cebadores de amplificación.

Los productos de amplificación de diferentes muestras de ensayo, obtenidos con el par de cebadores de amplificación del L6 y L7 del estado de la técnica (SEC. ID. NO. 7 y 8, respectivamente, de la Tabla I), en la ausencia o presencia del par de cebadores de amplificación L6.2 y L7.2 (SEC. ID. NO. 1 y 2, respectivamente, de la Tabla I), se compararon como en el Ejemplo 1 más adelante. La visualización de los productos de amplificación se determinó mediante electroforesis con gel de agarosa. Como se puede observar en la Figura 1, la amplificación con los cebadores L6.2 y L7.2 dio como resultado la detección del hMPV presente en la muestra, mientras que en su ausencia, no se detectó la presencia de hMPV.

Un aspecto de la presente invención se refiere a un método para la detección de hMPV en una muestra de ensayo, el método comprende poner en contacto la muestra de ensayo con una o más secuencias de ácido nucleico que comprenden una secuencia seleccionada del grupo que comprende la SEC. ID. NO. 1-6, sus complementos y equivalentes de las mismas, y someter la mezcla a una reacción de amplificación de ácido nucleico, se pretende que la reacción de amplificación amplifique las secuencias objetivo presentes en la muestra.

Una modalidad particular corresponde a un método en donde las secuencias de ácido nucleico que comprende las secuencias SEC. ID. NO. 1 y 2, y/o las secuencias SEC. ID. NO. 3 y 4, y/o SEC. ID. NO. 5 y 6, o sus complementos y equivalentes de las mismas, constituyen pares de cebadores de amplificación para hMPV.

La amplificación de un cierto número de muestras de ensayo se llevó a cabo con los conjuntos de cebadores de amplificación : - L6 y L7, en la ausencia de L6.2 y L7.2; - L6 y L7, en la presencia de L6.2 y L7.2; y - SA, AA, SB y AB (de la respectiva SEC. ID. NO. 3, 4, 5, y 6) .

Un ejemplo representativo de condiciones de amplificación adecuadas correspondientes a este estudio comparativo se encuentra en el Ejemplo 2.

Los productos de amplificación asi obtenidos, se transformaron en oligo- o polinucleótidos de una sola hebra, seguido por hibridización con sondas de objetivo especifico correspondientes a los fragmentos de amplificación, y visualización de los resultados. Algunas imágenes ilustrativas se muestran en la Figura 2. La sensibilidad de los valores de detección de esta metodología usualmente es un orden de magnitud más alto que los de la electroforesis con gel de agarosa .

La Tabla II muestra los resultados correspondientes a un cierto número de muestras analizadas de acuerdo con las condiciones experimentales describas en el Ejemplo 2.

Tabla II Los productos de amplificación obtenidos con el par de cebadores de amplificación L6 y L7, ambos en la ausencia y en la presencia de L6.2 y L7.2, se desnaturalizaron e hibridizaron con las sondas recién diseñadas HMNVA-S37 y HMNVB-S38, las cuales respectivamente detectan los genotipos A y B del hMPV.

Los nucleótidos de las secuencias se designan como sigue: G para Guanina, A para Adenina, T para Tiamina, C para Citosina, R para G ó A, Y para T ó C, M para A ó C, K para G ó T, S para G ó C, W para A ó T, H para A ó C ó T, B para G ó T ó C, V para G ó C ó A, D para G ó A ó T, y finalmente, N para G ó A ó T ó C.

La hibridización de los productos de amplificación con una sonda genérica del estado de la técnica para hMPV, tal como (TGGTGTGGGATATTAACAG) , no provee un resultado diferente.

Los productos de amplificación obtenidos con los pares de cebadores de amplificación SA/AA y SB/AB, se desnaturalizaron e hibridizaron con sondas recién diseñadas: Los nucleótidos de las secuencias se designan como sigue: G para Guanina, A para Adenina, T para Tiamina, C para Citosina, R para G ó A, Y para T ó C, M para A ó C, K para G ó T, S para G ó C, W para A ó T, H para A ó C ó T, B para G ó T ó C, V para G ó C ó A, D para G ó A ó T, y finalmente, N para G ó A ó T ó C.

Como se puede inferir a partir de la Tabla II, el método de la presente invención permite una detección más eficiente del hMPV presente en una muestra de ensayo que los métodos del estado de la técnica. Por consiguiente, la amplificación con los cebadores L6.2 y L7.2 permite la detección de hMPV en muestras cuando la amplificación con L6 y L7 proveen un resultado negativo.

Además, la amplificación con los cebadores SA, AA, SB y AB, y la hibridización con las sondas F249B, F256B y F256A, complementó la capacidad de detección de los cebadores L6.2 y L7.2, hasta la detección de casi el 100% de las muestras positivas al hMPV.

Otra ventaja del método de la presente invención sobre los métodos existentes del estado de la técnica, es que él mismo puede distinguir entre los tipos A y B de hMPV sin secuenciación y/o análisis con enzimas de restricción. Además, la amplificación del hMPV es compatible con la presencia de cebadores de amplificación para los virus respiratorios adicionales Influenza A, Influ.enza B, Influenza C, PIV 1, PIV 2, PIV 3, PIV 4A, 4B, Adenovirus, hRSV A, hRSV B, Coronavirus 229, Echovirus 30, Rinovirus y hBoV (ver el Ejemplo 2 más adelante como un ejemplo representativo) .

Por consiguiente, en una modalidad preferida, el método de la presente invención comprende: a) dividir la muestra de ensayo en dos o más muestras; b) poner en contacto una muestra con una primera mezcla de cebadores de amplificación, dicha mezcla comprende una o más secuencias de ácido nucleico que comprenden las secuencias SEC. ID. NO. 1 y 2, o sus complementos y equivalentes de las mismas; c) poner en contacto otra muestra con una segunda mezcla de cebadores de amplificación, dicha mezcla comprende una o dos secuencias de ácido nucleico que comprenden las secuencias SEC. ID. NO. 3 y 4 y/o una o dos secuencias de ácido nucleico que comprenden las secuencias SEC. ID. NO. 5 y 6, o sus complementos y equivalentes de las mismas; y d) someter los diferentes conjuntos de muestras de ensayo mezcladas con cebadores de amplificación a reacciones de amplificación que se pretende amplifiquen las secuencias objetivo presentes en la muestra.

En una modalidad preferida de la presente invención, la primera mezcla de cebadores de amplificación comprende además cebadores de la SEC. ID. NO. 7 y 8.

En otra modalidad preferida, el método de la presente invención comprende además poner en contacto la muestra con uno o más cebadores de amplificación para uno o más agentes virales seleccionados del grupo que comprende Influenza A, Influenza B, Influenza C, PIV 1, PIV 2, PIV 3, PIV 4A, 4B, Adenovirus, hRSV A, hRSV B, Coronavirus 229, Echovirus 30, Rinovirus y hBoV.

En una modalidad más preferida de la presente invención, los cebadores de amplificación correspondientes a Influenza A, Influenza B, Influenza C, PIV 1, PIV 2, PIV 3, PIV 4A, Adenovirus , hRSV A, hRSV B, Coronavirus 229, Echovirus Rinovirus y hBoV, son como sigue : SEC. ID. NO. Nombre del Cebador Secuencia (5'-3') 14 1 PIV13 AGG WTG YSM RGA TAT AGG RAA RTC ATA 15 Piv1-A-218 CAC AGT GGG CAR GGA GCA TAA 16 3PIV24 CYM AYG GRT GYA YTM GAA TWC CAT CAT T 17 4PIV4 TGA CTA TRC TCG ACY TTR AAA TAA GG 18 4PIV2 GCT AGA TCA GTT GTG GCA TAA TCT 19 Piv3-S-118 CAA TAG RAA GTC ATG TTC TCT 20 P¡v-3-A-313 TGG TCC AAC AGA TGG GTA TAA TGC C 21 RSVA-S-15 CCT CAA ARC AAA TGC AAT TAC CG 22 RSVA (2) 3? TAT ACC AAC CAG TTC TÍA GAG C 23 1 HCoV TGT GCC ATA GAR GAY WTA CTT TTT 24 Cor229-A-214 GTA TTG AAR CGG CTG ATG TTA G 25 NPAC11 GAA CTC RTC CYW WAT SWC AAW GRR GAA AT 26 FluA-A-241 AAC TCC AWY ACC ATT GTC CC 27 NPB1 ACA GAG ATA AAG AAG AGC GTC TAC AA 28 FluB-A-136 TGT CAT CAG TGG CAG CCA ATA G 29 RSVB-541 TCC AYA GRT CAA GTG CAA TCT TCC T 30 RSVB 3? AAA GCA CTA AAA TAA CCT CTG C 31 ADV1 F+ CAA CAC CTA YGA STA CAT GAA 32 ADV2R- ACA TCC TTB CKG AAG TTC CA 33 HER1 CTC CGG CCC CTG AAT RYG GCT AA 34 HER4 CTG TGT TGA WAC YTG AGC ICC CA 35 FluC-S-122 CGC AGC AAG AAG AAA CGG TT 36 FluC-A-217 GCG TCA GCT ATA AGA ACY CCA ATT C 37 NS1-1545S TAT GGC CAA GGC AAT CGT CCA AG 38 NS1-A1835 GCC GCG TGA ACA TGA GAA ACA GA Los nucleótidos de las secuencias se designan como sigue: G para Guanina, A para Adenina, T para Tiamina, C para Citosina, R para G ó A, Y para T ó C, M para A ó C, K para G ó T, S para G ó C, W para A ó T, H para A ó C ó T, B para G ó T ó C, V para G ó C ó A, D para G ó A ó T, y finalmente, N para G ó A ó T ó C.

En una modalidad preferida de la presente invención, el método comprende: a) dividir la muestra de ensayo en dos o más muestras; b) poner en contacto una muestra con una primera mezcla de cebadores de amplificación, dicha mezcla comprende ambas secuencias de ácido nucleico que comprenden las secuencias SEC. ID. NO. 1 y 2, o sus complementos o equivalentes de las mismas, y los cebadores de la SEC. ID. NO. 7 y 8, como cebadores de amplificación para hMPV, y pares de cebadores de amplificación de la SEC. ID. NO. 14-24 como cebadores de amplificación para PIV 1, PIV 2, PIV 3, PIV 4A, 4B, hRSV A, y Coronavirus tipo 229; c) poner en contacto otra muestra con una segunda mezcla de cebadores de amplificación que comprenden las secuencias de ácido nucleico que comprenden las secuencias SEC. ID. NO. 3 y 4, y SEC. ID. NO. 5 y 6, o sus complementos y equivalentes, de las mismas, como cebadores de amplificación para hMPV, y pares de cebadores de amplificación de la SEC. ID. NO. 25-38 como cebadores de amplificación para Influenza A, Influenza B, Influenza C, hRSV B, Adenovirus, Echovirus 30, Rinovirus y hBoV; y d) someter los diferentes conjuntos de muestras de ensayo mezcladas con cebadores de amplificación a reacciones de amplificación que se pretende amplifiquen las secuencias objetivo presentes en la muestra.

En una modalidad preferida, la muestra de ensayo consiste de material genético extraído de la muestra original. La extracción del material genético se puede llevar a cabo mediante técnicas de extracción automática asi como extracción manual del estado de la técnica.

En una modalidad más preferida, el sistema de extracción automática es el NucliSENS easyMAG de BioMerieux (EP1694813) , que utiliza partículas magnéticas en combinación con la tecnología BOOM® de BioMerieux para aislamiento universal del ácido nucleico total de un amplio rango de volúmenes y tipos de muestras.

La persona especializada conocerá técnicas y métodos para el procesamiento manual de muestras para extraer ácidos nucleicos de una muestra; y puede utilizarse cualquiera de tales métodos adecuados .

En un ejemplo particular, los ácidos nucleicos se extraen de 50 µ? de la muestra de ensayo. Después de la etapa de extracción, un precipitado se re-suspende en 20-25 µ? de agua libre de RNasa.

En una modalidad preferida/particular, 5 µ? de los 20-25 µ? que comprenden el material genético extraído de la muestra de ensayo, se agregan al recipiente que contiene los reactivos de amplificación, en un volumen final de 50 µ?.

Un problema inherente de los PCRs múltiplex es que la presencia de varios cebadores en la misma reacción de amplificación podría llevar a una interacción entre los cebadores presentes, que podría impedir su hibridización con sus secuencias objetivo y correspondiente amplificación. Este obstáculo técnico se superó mediante la combinación específica de cebadores de amplificación de los Múltiplex 1 y 2.

En una modalidad preferida de la presente invención, la reacción de amplificación es RT-PCR.

En otra modalidad preferida, se etiquetan uno o más cebadores de amplificación de cada par de cebadores de amplificación. En particular, con biotina.

Alternativamente, se introduce una etiqueta en el producto de amplificación durante la amplificación.

En una modalidad preferida, el método de la presente invención comprende además obtener oligo- o polinucleótidos de una sola hebra de cualquier producto de amplificación, permitir que tales oligo- o polinucleótidos de una sola hebra se hibridicen con una pluralidad de sondas de objetivo específico, y detectar oligo- o polinucleótidos hibridizados . Más preferiblemente, se obtienen oligo- o polinucleótidos de una sola hebra desnaturalizando cualquier oligo- o polinucleótidos de doble hebra presente.

En una modalidad preferida de la presente invención, los productos RT-PCR obtenidos con los cebadores de amplificación de acuerdo con la presente invención, se pueden caracterizar por medio de tecnología de microarreglos . La tecnología de microarreglos provee la detección simultánea de múltiples marcadores moleculares para su uso como diagnóstico, mientras que provee los controles necesarios para asegurar la conflabilidad de los resultados.

En una modalidad preferida de la presente invención, puede producirse una etiqueta en el producto amplificado durante su amplificación para permitir una detección adicional, preferiblemente una etiqueta que proporcione una señal que pueda detectarse mediante métodos colorimétricos . En la modalidad más preferida, la etiqueta es biotina. Sin embargo, puede utilizarse cualquier tipo de etiqueta conocida en la técnica (por ejemplo digoxigenina) . Pueden utilizarse etiquetas radioactivas, o fluoróforos, en ciertas modalidades. En una modalidad preferida, puede lograrse el etiquetado del producto amplificado agregando nucleótidos modificados que porten una etiqueta (por ejemplo derivados biotinilados o de digoxigenina dUTP) en la mezcla de amplificación. En otra modalidad aún más preferida, la etiqueta está contenida en los cebadores de amplificación.

En una modalidad preferida de la presente invención, el producto amplificado previamente desnaturalizado se hibridiza con sondas de objetivo específico para minimizar el problema del PCR múltiplex, lo cual frecuentemente da como resultado la producción de fragmentos de amplificación no específicos, debido a la presencia de varios cebadores.

En una modalidad preferida, la desnaturalización del ADN amplificado se puede realizar mediante calentamiento. Otras maneras para preparar ADN de una sola hebra después de la amplificación pueden utilizarse en vez de o adicionalmente; por ejemplo, medios químicos.

En una modalidad preferida de la presente invención, el ADN de una sola hebra se incuba con una pluralidad de sondas de objetivo específico provistas en un microarreglo . En al menos una, aunque preferiblemente más de una sonda con la capacidad de hibridizarse con cada secuencia objetivo, se proveen en el microarreglo. En ciertas modalidades de la invención, el ADN de una sola hebra puede incubarse con sondas de objetivo específico provistas en solución. Sin embargo, se prefiere que las sondas se provean en un soporte sólido.

En una modalidad preferida de la presente invención, las sondas están contenidas en un microarreglo, que puede colocarse en un portaobjetos o estar contenidas en un recipiente de reacción, el cual entonces se denomina un recipiente de arreglos. Los recipientes de arreglos pueden tener diferentes formatos de presentación, que incluyen recipientes de arreglos individuales, en particular, tubos de arreglos, o conjuntos de recipientes de arreglos acomodados en tiras o placas planas. Usualmente, las placas consisten de conjuntos de tiras de recipientes de arreglos. Por consiguiente, un microarreglo de la presente invención puede estar contenido en un recipiente de arreglos individual. Alternativamente, dos o más microarreglos pueden estar contenidos en una tira de recipientes. En una modalidad preferida, la tira de recipientes está constituida por 8 recipientes. Además, pueden acomodarse tres o más recipientes de arreglos en un conjunto de tiras de recipientes. En otra modalidad preferida, el conjunto de tiras de recipientes es una placa de microtitulacion.

En modalidades preferidas, las moléculas sonda del microarreglo pueden estamparse o grabarse en un soporte sólido en donde este soporte sólido puede ser el fondo de un recipiente de arreglos o un soporte sólido diferente anexado al fondo de un recipiente de arreglos. Esto significa que la superficie del microarreglo puede ser el fondo plano del recipiente de arreglos. Alternativamente, la superficie del microarreglo puede ser un soporte sólido anexado al fondo del recipiente de arreglos.

En una modalidad de la presente invención, el recipiente de reacción tiene un tamaño típico para un recipiente de reacción de laboratorio. Los volúmenes de llenado típicos se encuentran en el rango de 100 µ? a 2.5 mi, aunque también pueden ser más altos o más bajos en modalidades especiales.

Especialmente de manera preferible el recipiente de reacción es un tubo de arreglos es decir un recipiente de arreglos con un volumen de llenado normal para un tubo Eppendorf estándar de hasta 1.5 mi. Los volúmenes de llenado preferidos, adicionales, son de hasta 0.4 mi, hasta 0.5 mi, hasta 0.7 mi, hasta 1.0 mi o hasta 2.0 mi.

Debido al etiquetado del ADN amplificado, dondequiera que las moléculas muestra interactúen con moléculas sonda sobre la superficie del microarreglo, un reactivo reportero une la etiqueta y produce señales visibles que pueden detectarse mediante un dispositivo de detección. La sonda de interacción y las moléculas muestra se identifican mediante la localización de la señal sobre la superficie del microarreglo. En el caso particular cuando las moléculas de ADN muestra se etiquetan con biotina, el agente reportero puede ser peroxidasa de rábano covalentemente unido a estreptavidina . La última se une específicamente a la biotina, y la peroxidasa activa la precipitación de substratos como la tetrametilbencidina (TMB) . Puede utilizarse cualquier otra reacción que de como resultado un precipitado en elementos de arreglo, y que se pueda utilizar para detectar la interacción entre las moléculas sonda y objetivo de acuerdo con la presente invención.

La presente invención se refiere además a un equipo o kit para la detección e identificación en la muestra de ensayo del hMPV, en donde dicho equipo o kit comprende una o más mezclas de amplificación de ácido nucleico, en donde al menos una de las mezclas de amplificación comprende una o más secuencias de ácidos nucleicos que comprenden una secuencia seleccionada del grupo que comprende la SEC. ID. NO. 1-6, sus complementos y equivalentes de las mismas.

En una modalidad preferida, el equipo o kit de la presente invención comprende dos o más mezclas de amplificación : - Una primera mezcla comprende la primera y segunda secuencias de ácido nucleico que comprenden las secuencias SEC. ID. NO. 1 y 2 respectivamente, o sus complementos y equivalentes de las mismas, como componentes de un par de cebadores de amplificación para hMPV; y Una segunda mezcla que comprende la primera y segunda secuencias de ácido nucleico que comprenden las secuencias SEC. ID. NO. 3 y 4 respectivamente, y/o tercera y cuarta secuencias de ácido nucleico que comprenden las secuencias SEC. ID. NO. 5 y 6 respectivamente, o sus complementos y equivalentes de las mismas, como componentes de otros pares de cebadores de amplificación para hMPV.

La primera mezcla de cebadores de amplificación puede comprender adicionalmente los cebadores L6 (SEC. ID. NO. 7) y L7 (SEC. ID. NO. 8) .

Adicionalmente, el equipo o kit de la presente invención puede permitir además la detección de Influenza A, Influenza B, Influenza C, PIV 1, PIV 2, PIV 3, PIV 4A, 4B, Adenovirus, hRSV A, hRSV B, Corpnavirus 229, Echovirus 30, Rinovirus y hBoV, en una muestra de ensayo, el kit preferiblemente comprende : - Pares de cebadores de la SEC. ID. NO. 14-24 para PIV 1, PIV 2, PIV 3, PIV 4A, 4B, hRSV A y Coronavirus tipo 229, dentro de la primera mezcla de amplificación; y - pares de cebadores de la SEC. ID. NO. 25-38 para Influenza A, Influenza B, Influenza C, hRSV B, Adenovirus, Echovirus 30, Rinovirus y hBoV, dentro de la segunda mezcla de amplificación .

Además de las mezclas de amplificación, el kit puede comprender además: i) un recipiente de arreglos o conjunto de recipientes de arreglos, cada uno comprendiendo un microarreglo en donde se proveen sondas de objetivo especifico; y ii) reactivos para su uso en la visualización de hibridización de ácidos nucleicos con las sondas del microarreglo.

En una modalidad preferida de la presente invención, uno o más tubos de amplificación comprenden además uno o más controles internos. En una modalidad preferida, el protocolo de la presente invención incluye un control interno del paso de extracción de ácidos nucleicos. En otra modalidad preferida, el protocolo de la presente invención incluye un control interno de la etapa de amplificación de ácidos nucleicos .

Un control interno preferido podría ser un plásmido de ADN que podría ser amplificable con un par de cebadores de amplificación. En una modalidad más preferida de la presente invención, uno o más tubos Multiplex comprenden un ADN de Control Interno en la forma de un plásmido de ADN, y cebadores RTS (GCTTGGGCGTGTCTCAAAATCT, SEC. ID. NO. 39) y RTA (GTCGCCACGGTTGATGAGAGCT, SEC. ID. NO. 40) para su amplificación. Las condiciones particularmente preferidas son: En un volumen de reacción final de 50 µ? .

Las condiciones particularmente preferidas, adicionales, son : En un volumen de reacción final de 50 µ? .

Pueden etiquetarse ya sea uno o ambos cebadores de amplificación RTS/RTA .

El producto de amplificación correspondiente al ADN de control interno es un fragmento de ADN de 885 bp (pares de base) .

En una modalidad particular, el microarreglo comprende sondas para la detección específica del control interno amplificable con los cebadores de amplificación RTS Y RTA. En particular, pueden utilizarse Cl 1 5' (CAGCTGGCACGACAGGTTTCCCGACTGG, SEC. ID. NO. 41), Cl 1 3' (TTGAAGTGGTGGCCTAACTACGG, SEC. ID. NO. 42) y Cl 2 5' (CGTTCCACTGAGCGTCAGACCC, SEC. ID. NO. 43).

Un control interno preferido, adicional, de la presente invención podría ser un fragmento de ARN que preferiblemente podría agregarse a la muestra de ensayo antes de la extracción de ácido nucleico. Otro control interno preferido podría ser un fragmento de ARN que preferiblemente podría agregarse a los ácidos nucleicos después de la extracción de la muestra de ensayo. En una modalidad más preferida, el fragmento de ARN podría estar presente dentro del recipiente que contiene los reactivos de amplificación, antes de su incubación con los ácidos nucleicos obtenidos de la muestra de ensayo.

En una modalidad más preferida, el fragmento de ARN podría obtenerse mediante la transcripción de ARN de un plásmido. En otra modalidad preferida el fragmento de ARN podría obtenerse mediante síntesis química.

Las sondas de objetivo específico particularmente preferidas correspondientes a los productos de amplificación de hMPV de la presente invención comprenden secuencias seleccionadas del grupo que comprende la SEC. ID. NO. 9 a 13, sus complementos y equivalentes de las mismas. En una modalidad más preferida, las sondas de objetivo especifico correspondientes a los productos de amplificación de hMPV consisten de la SEC. ID. NO. 9 a 13.

Las sondas de la presente invención se pueden obtener mediante métodos diferentes, tales como síntesis química (por ejemplo mediante el método de fosfotriéster convencional) o técnicas de ingeniería genética, por ejemplo mediante la clonación molecular de plásmidos recombinantes en los cuales las correspondientes secuencias de nucleótidos se han insertado y se pueden obtener por último mediante digestión con nucleasas.

Las sondas específicas pueden diseñarse utilizando el programa de alineación de ácidos nucleicos Oligo 6. Los parámetros de Tm y relación G/C se analizan en todos los casos, y se evitó la formación de estructura secundaria. Las sondas preferidas de la presente invención son aquéllas con el mismo Tm bajo la concentración de sal que se utiliza en la etapa de hibridizacion. En una modalidad preferida, las sondas se seleccionan para unirse a sus correspondientes secuencias objetivo, bajo las mismas condiciones de hibridizacion. La persona especializada conocerá otras maneras en las qué pueden diseñarse sondas específicas.

En una modalidad particular de la presente invención, las sondas se seleccionan de modo que las mismas no se hibridicen con ADN genómico, y que no se hibridicen de una manera no especifica con fragmentos amplificados correspondientes a otros virus.

En una modalidad preferida, una o más sondas de la presente invención se proporcionan en un soporte sólido.

En otra modalidad preferida, dos o más sondas de objetivo especifico para la misma secuencia objetivo se proveen en el soporte sólido, con el fin de mejorar la detección de los agentes virales de interés.

Dichas sondas o mezclas de sondas pueden inmovilizarse en una sola ubicación del soporte sólido, preferiblemente en dos distintas ubicaciones del soporte sólido y más preferiblemente en tres distintas ubicaciones del soporte sólido .

En una modalidad preferida, las sondas de la presente invención se proveen sobre un soporte sólido ubicado dentro de un recipiente de arreglos.

En otra modalidad, las sondas de la presente invención se proveen sobre un soporte sólido ubicado dentro de la tira de arreglos.

En una modalidad más preferida, la tira de arreglos de la presente invención tiene 8 recipientes de arreglos.

En una modalidad preferida, el soporte sólido es un portaobjetos de vidrio revestido.

En otra modalidad preferida, el soporte sólido es el fondo de un recipiente de arreglos, el recipiente de arreglos es ya sea un tubo de arreglos individual, o un componente de una tira de recipientes o conjunto de tiras de recipientes, tal como una placa de microtitulación .

En una modalidad preferida, las interacciones que tienen lugar entre el ADN amplificado con los pares de cebadores de la presente invención, y correspondientes sondas de detección, tiene lugar en un recipiente de arreglos individual, en una tira de recipientes, o en un conjunto de tiras de recipientes.

En una modalidad preferida, la visualización de tales interacciones consiste de las siguientes etapas: ¦ Primero, la imagen del arreglo es capturada utilizando un dispositivo óptico, ¦ Luego la imagen se analiza, ¦ Finalmente, se provee un reporte que contiene una interpretación del resultado.

Preferiblemente, la imagen se analiza por medio de un programa informático apropiado.

Se puede utilizar cualquier dispositivo adecuado para este procesamiento.

Un aspecto adicional de la presente invención corresponde al uso del método y kit antes mencionados para la detección e identificación, si están presentes en una muestra de ensayo, de uno o más agentes virales seleccionados del grupo que comprende hMPV, Influenza A, Influenza B, Influenza C, PIV 1, PIV 2, PIV 3, PIV 4A, 4B, Adenovirus, hRSV A, hRSV B, Coronavirus 229, Echovirus 30, Rinovirus y hBoV.

Se ha confirmado, como en los Ejemplos provistos en la presente invención, que los ácidos nucleicos de la SEC. ID. NO. 1 a 6, cuando se utilizan como cebadores de amplificación en la amplificación de hMPV, proveen mejores valores de sensibilidad de detección de hMPV que el par de cebadores L6/L7 del estado de la técnica. Esto es de esta manera, incluso en la presencia de cebadores de amplificación correspondientes a otros virus respiratorios.

Los aspectos adicionales de la presente invención corresponden a (i) una mezcla de amplificación de ácidos nucleicos que comprende, como cebadores de amplificación, los ácidos nucleicos que comprenden la SEC. ID. NO. 1 y 2, y/o ácidos nucleicos que comprenden la SEC. ID. NO. 3 y 4, y/o ácidos nucleicos que comprenden la SEC. ID. NO. 5 y 6, o sus complementos y equivalentes de las mismas; (ii) Fragmentos de amplificación obtenibles con los pares de cebadores de la SEC. ID. NO. I y 2, 3 y 4; y 5 y 6; y (iii) Un método para producir secuencias de ácido nucleico que comprenden la SEC. ID. NO. 1-6 sus complementos y equivalentes de las mismas, en donde pueden etiquetarse las secuencias de ácido nucleico. Preferiblemente esta etiqueta es biotina.

Aún otro aspecto de la presente invención corresponde a sondas para la detección de hMPV, que comprenden una secuencia seleccionada del grupo que comprende la SEC. ID. NO. 9 a 13, sus complementos y equivalentes de las mismas.

Ejemplos Los ejemplos provistos más adelante simplemente ilustran la invención y de ninguna manera limitan el alcance de las reivindicaciones acompañantes.

EJEMPLO 1. 200 µ? de una muestra de ensayo de lavado nasofaríngeo, se sometieron al sistema de extracción automática NucliSENS easyMAG de BioMerieux, seguido por una re-suspensión en 20 µ? de agua libre de RNasa.

Se agregaron 5 µ? del total de 20 µ? a dos diferentes recipientes, cada uno conteniendo reactivos de amplificación, en un volumen final de 50 µ? . Los reactivos de amplificación incluyeron cebadores de amplificación de los L6 y L7 del estado de la técnica (SEC. ID. NO. 7 y 8) en la ausencia ("Tubo -") o la presencia ("Tubo +") del par de cebadores de amplificación L6.2 y L7.2 (SEC. ID. NO. 1 y 2, respectivamente, de la Tabla I) .

La mezcla de amplificación correspondiente al "Tubo +" fue como sigue: MEZCLA 1X Volumen (µ?) Agua libre de RNasa 7,6 Amortiguador QUIAGEN 5X 10 Mezcla de dNTP 10 mM 2 Solución Q 5X 10 Mezcla de enzimas QUIAGEN 2 B-L6 (40 µ?) 1 B-L7 (40 µ?) 1 B-L6.2 (40 µ?) 1 B-L7.2 (40 µ?) 1 B-3PIV24 (40 µ?) 1 B-4PIV4 (40 µ?) 0,8 B-4PIV2 (40 µ?) 0,8 ?-?5?? 515 (40 µ?) 0,7 B-RSVA (2) 3' (40 µ?) 0,7 B-1 PIV13+ (40) 1 B-PIV1 ?218 (40 µ?) 1 B-I HCoV (40 µ?) 0,5 B-Cor229-214 (40 µ?) 0,5 B-PIV3 e? 18 (40 µ?) 0,7 B-PIV3 A3 3 (40 µ?) 0,7 B-RTS 6/9/07 (20 µ?) 0,5 B-RTA 6/9/07 (20 µ?) 0,5 Control interno (10e4 copias/µ?) 1 Muestra 5 Prefijo "B-" significa etiquetado con biotina.

La mezcla de amplificación correspondiente a "Tubo -" fue exactamente como la de "Tubo +", con la excepción de que los cebadores de amplificación L6.2 y L7.2 se sustituyeron por agua libre de RNasa.

Las condiciones de amplificación fueron: La visualización de los productos de amplificación correspondientes a cuatro diferentes muestras de ensayo amplificadas tanto con "Tubo -" y "Tubo +", por medio de electroforesis con gel de agarosa, se muestra en la Figura 1.

Las condiciones experimentales previamente descritas han probado ser igualmente eficientes para el análisis de muestras constituidas por exudados faríngeos, exudados nasofaríngeos, o lavados bronco-alveolares .

EJEMPLO 2 . 5 µ? de un total de 20 µ?, obtenidos de las muestras de ensayo S7 (positivas al hMPV-A) y S2 (positivas al hMPV-B) , siguiendo el mismo procedimiento que en el EJEMPLO 1, se agregaron a reactivos de Múltiplex 1 ó Múltiplex 2, en un volumen final de 50 µ? .

Las condiciones del Multiplex 1 y 2 fueron como sigue: Prefijo "?-" significa etiquetado con biotina.

Reactivos Múltiplex 2 Concentración inicial Volumen (µ?) Agua libre de RNasa Hasta 50 µ? AMORTIGUADOR RT-PCR DE UNA ETAPA 5X 10 QIAGEN 5X SOLUCIÓN Q 5X 10 B-SA 40 µ? 0.1 B-SB 40 µ? 0.1 B-AA 40 µ? 0.1 B-AB 40 µ? 0.1 B-NPAC11 + 40 µ? 1 B-FluA-A-241 40 µ? 0.8 B-NPB1 + 40 µ? 0.5 B-FluB-A-136 40 µ? 0.5 B-FluC-S-122 40 µ? 0.3 B-FluC-A-217 40 µ? 0.3 B-ADV1 F+ 40 µ? 0.8 B-ADV2R- 40 µ? 0.8 B-HER1 40 µ? 0.2 HER4 40 µ? .0.2 B-RSVB-541 40 µ? 0.5 B-RSVB 3' 40 µ? 0.5 B-NS1 S-1545 40 µ? 0.25 B-NS1 A-1835 40 µ? 0.25 B-RTS 20 µ? 0.5 B-RTA 20 µ? 0.5 MEZCLA dNTPs 10 mM 10 mM 2 Control Interno 10e4 copias/µ? 1 Enzima 2 Muestra 5 TOTAL 50 Prefijo "?-" significa etiquetado con biotina.

Las condiciones de amplificación fueron las mismas tanto para ambos Múltiplex 1 y 2: 1 ciclo 45°C 45 min 95°C 15 min 45 ciclos 95°C 30 min 50°C 1 :30 min 68°C 1 min 1 ciclo 68°C 10 min Final 4°C (opcional) Se obtuvieron oligo- o polinucleótidos de una sola hebra de los correspondientes productos de amplificación, y se dejaron hibridizar con una pluralidad de sondas de objetivo especifico provistas en un soporte sólido, comprendido dentro de un Tubo de Arreglo. Los productos de amplificación obtenidos con un par de cebadores de amplificación L6 y L7 en la ausencia y presencia de L6.2 y L7.2, se desnaturalizaron e hibridizaron con las sondas recién diseñadas HMNVA-S37 y HMNVB-S38 (SEC. ID. NO. 9 y 10, respectivamente), que respectivamente detectan los genotipos A y B del hMPV.

La hibridizacion de los productos de amplificación antes mencionados con una sonda genérica para hMPV provee el mismo resultado .

Los productos de amplificación obtenidos con los pares de cebadores de amplificación SA/AA y SB/AB, se desnaturalizaron e hibridizaron con las sondas recién diseñadas F249B, F256B y F256A (SEC. ID. NO. 11, 12 y 13, respectivamente) , que respetivamente detectan los genotipos B, B y A del hMPV.

Los ejemplos representativos de las imágenes correspondientes a una muestra positiva al hMPV-A (Muestra S7 de la Tabla II) y a una muestra positiva al hMPV-B (Muestra S2 de la Tabla II), se muestran en la Figura 2. Las condiciones de amplificación fueron aquéllas del Múltiplex 1 y 2, y las sondas de hibridización fueron: HMNVA-S37 y HMNVB-S38, en el caso de productos de amplificación obtenidos en el Múltiplex 1; y F249B, F256B y F256A, en el caso de productos de amplificación obtenidos en el Múltiplex 2.

Claims (15)

REIVINDICACIONES

1. - Un método para la detección de hMPV en una muestra de ensayo, caracterizado porque comprende poner en contacto la muestra de ensayo con dos o más pares de cebadores de amplificación, y someter la mezcla a una reacción de amplificación de ácido nucleico, se pretende que la reacción de amplificación amplifique secuencias objetivo presentes en la muestra, en donde cada par de cebadores de amplificación comprende una primera y segunda secuencias que comprenden a) SEC. ID. NO. 3 y 4 respectivamente; y b) SEC. ID. NO. 5 y 6 respectivamente; y/o c) complementos o secuencias que difieren de las secuencias de la SEC. ID. NO. 3, 4, 5 y 6 por 1 mutación, el método comprende además obtener oligo- o polinucleotidos de una sola hebra de cualquier producto de amplificación, permitir que tales oligo- o polinucleotidos de una sola hebra se hibridicen con una pluralidad de sondas de objetivo especifico, y detectar oligo- o polinucleotidos hibridizados .

2. - El método de la reivindicación 1, caracterizado porque la pluralidad de sondas de objetivo especifico comprende una o más secuencias seleccionadas del grupo que comprende la SEC. ID. NO. 11, 12 y 13, sus complementos y secuencias que difieren de las mismas por 1 mutación de la misma .

3. - El método de la reivindicación 1, caracterizado porque dicho método comprende: a) dividir la muestra de ensayo en dos o más muestras; b) poner en contacto una primera muestra con una primera mezcla de cebadores de amplificación, dicha mezcla comprende una primera y segunda secuencias de ácido nucleico que comprenden la SEC. ID. NO. 3 y 4 respectivamente y una tercera y cuarta secuencias que comprenden la SEC. ID. NO. 5 y 6 respectivamente, o sus complementos y secuencias que difieren de las secuencias de la SEC. ID. NO. 3, 4, 5 y 6 por 1 mutación de las mismas; c) poner en contacto una segunda muestra con una segunda mezcla de cebadores de amplificación, dicha mezcla comprende una primera y segunda secuencias de ácido nucleico que comprenden la SEC. ID. NO. 1 y 2 respectivamente, o sus complementos y secuencias que difieren de la secuencias de SEC. ID. NO. 1 y 2 por 1 mutación de las mismas; y d) someter los diferentes conjuntos de muestras de ensayo mezcladas con cebadores de amplificación a reacciones de amplificación que se pretende amplifiquen las secuencias objetivo presentes en la muestra.

4.- El método de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque se obtienen oligo- o polinucleótidos de una sola hebra mediante la desnaturalización de cualquier oligo- o polinucleótido de doble hebra presente en los productos de amplificación, y se hibridizan con sondas de objetivo específico, en donde: - los productos de amplificación obtenidos con la primera mezcla de cebadores de amplificación que comprenden una primera y segunda secuencias de ácido nucleico que comprenden la SEC. ID. NO. 3 y 4 respectivamente y la tercera y cuarta secuencias de ácido nucleico que comprende la SEC. ID. NO. 5 y 6 respectivamente, o sus complementos y secuencias que difieren de las mismas por 1 mutación de la misma, se hibridizan con sondas de objetivo específico que comprenden una o más sondas seleccionadas del grupo que comprende la SEC. ID. NO. 11 a 13, y - productos de amplificación obtenidos con la segunda mezcla de cebadores de amplificación que comprende una primera y segunda secuencias de ácido nucleico que comprenden la SEC. ID. NO. 1 y 2 respectivamente, o sus complementos y secuencias que difieren de las mismas por 1 mutación de las mismas, se hibridizan con sondas de objetivo específico que comprenden una o más sondas seleccionadas del grupo que comprende la SEC. ID. NO. 9 y 10.

5. - El método de la reivindicación 3 y 4, caracterizado porque la segunda mezcla de cebadores de amplificación comprende además cebadores de la SEC. ID. NO. 7 y 8.

6. - El método de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque se obtienen oligo- o polinucleótidos de una sola hebra desnaturalizando cualquier oligo- o polinucleotido de doble hebra presente.

7. - Un equipo p kit para la detección e identificación en una muestra de ensayo de hMPV, caracterizado porque dicho kit comprende dos o más mezclas de amplificación, - una primera mezcla que comprende una primera y segunda secuencias de ácido nucleico que comprenden las secuencias SEC. ID. NO. 3 y 4 respectivamente, y una tercera y cuarta secuencias de ácido nucleico que comprenden las secuencias SEC. ID. NO. 5 y 6 respectivamente, o sus complementos y secuencias que difieren de las secuencias de SEC. ID. NO. 3, 4, 5 y 6 por 1 mutación de las mismas, como los componentes de un par de cebadores de amplificación para hMPV; y - una segunda mezcla que comprende una primera y segunda secuencias de ácido nucleico que comprenden las secuencias SEC. ID. NO. 1 y 2 respectivamente, o sus complementos y secuencias que difieren de las secuencias de la SEC. ID. NO. 1 y 2 por 1 mutación de las mismas, como los componentes de otros pares de cebadores de amplificación para hMPV.

8. - El equipo o kit de la reivindicación 7, caracterizado porque la segunda mezcla de cebadores de amplificación comprende además cebadores que comprenden las secuencias de ácido nucleico de la SEC. ID. NO. 7 y 8.

9. - El equipo o kit de conformidad con las reivindicaciones 7 y 8, que permite además la detección de Influenza A, Influenza B, Influenza C, PIV 1, PIV 2, PIV 3, PIV 4A, 4B, Adenovirus hRSV A, hRSV B, Coronavirus 229, Echovirus 30, Rinovirus y hBoV, en una muestra de ensayo, el equipo o kit caracterizado porque comprende: pares de cebadores que comprenden secuencias de ácido nucleico seleccionado del grupo que comprende la SEC. ID. NO. 25-38 para Influenza A, Influenza B, Influenza C, hRSV B, Adenovirus, Echovirus 30, Rinovirus y hBoV, con la primera mezcla de amplificación; y pares de cebadores que comprenden secuencias de ácido nucleico seleccionadas del grupo que comprende la SEC. ID. NO. 14-24 para PIV 1, PIV 2, PIV 3, PIV 4A, 4B, hRSV A y Coronavirus tipo 229, dentro de la segunda mezcla de amplificación .

10. - El equipo o kit de conformidad con las reivindicaciones 7 a 9, caracterizado porque comprende además: i) un recipiente de arreglos o conjunto de recipientes de arreglos, cada uno comprendiendo un microarreglo o micromatriz en donde se proveen sondas de objetivo especifico; y ii) reactivos para usarse en la visualización de la hibridización de ácidos nucleicos con las sondas del microarreglo .

11. - El equipo o kit de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque las sondas de objetivo especifico comprenden una o más secuencias seleccionadas del grupo que comprende la SEC. ID. NO. 9-13, sus complementos y secuencias que difieren de las mismas por 1 mutación de las mismas, como sondas de objetivo especifico para hMPV.

12. - El equipo o kit de las reivindicaciones 10 y 11, caracterizado porque las sondas de objetivo especifico están comprendidas en un recipiente de arreglos individual, o en un conjunto de recipientes de arreglos.

13. - Un par de cebadores caracterizado porque comprende una primera y segunda secuencias de ácido nucleico SEC. ID. NO. 3 y 4, respectivamente.

14. - Un par de cebadores caracterizado porque comprende una primera y segunda secuencias de ácido nucleico SEC. ID. NO. 5 y 6, respectivamente.

15. - Las sondas para la detección del hMPV, caracterizadas porque consisten de una secuencia seleccionada del grupo que comprende la SEC. ID. NO. 9 a 13, sus complementos y secuencias que difieren de las mismas por 1 mutación de la misma. RESUMEN DE LA INVENCION Se describe un método y equipo o kit para la detección e identificación en una muestra de ensayo de hMPV, como es un conjunto de secuencias y su uso como cebadores de amplificación para hMPV. La amplificación del hMPV de acuerdo con la presente invención es compatible con la detección de otros virus que causan infecciones del tracto respiratorio, asi como con la genotipificación del hMPV presente en la muestra. Después de someter la muestra de ensayo a amplificación con cebadores específicos para cada virus, se obtiene ADN de una sola hebra de los productos de amplificación, y se hibridiza con sondas de objetivo