MX2010011846A - Composiciones y métodos para el tratamiento de la esclerosis multiple. - Google Patents

Abstract

Se proporcionan fluidos alterados por electrocinética (fluidos electrocinéticos enriquecidos con gas) que comprenden una solución acuosa iónica de nanoestructuras que contienen oxígeno estabilizadas por carga en una cantidad suficiente para proporcionar la modulación de al menos un potencial de membrana celular y conductividad de la membrana celular, y las composiciones terapéuticas y los métodos para su uso en el tratamiento de afecciones o enfermedades inflamatorias neurodegenerativas o al menos un síntoma de éstas. Las composiciones terapéuticas y los fluidos alterados por electrocinética y los métodos incluyen los fluidos acuosos iónicos alterados por electrocinética opcionalmente en combinación con otros agentes terapéuticos. Aspectos particulares proporcionan la regulación o la modulación de la transducción de la señal intracelular asociada con dicha respuesta inflamatoria por la modulación de al menos una de las membranas celulares, potencial de membrana, proteínas de la membrana tales como los receptores de membrana, que incluyen pero no se limitan a los receptores acoplados a las proteínas G (GPCR), y uniones intercelulares (por ejemplo, uniones herméticas, uniones comunicantes, unión adherente y desmosomas). Otras modalidades incluyen las rutas particulares de administración o las formulaciones de los fluidos alterados por electrocinética (por ejemplo, los fluidos y soluciones enriquecidos con gas alterados por electrocinética) y las composiciones terapeúticas.

Description

COMPOSICIONES Y METODOS PARA EL TRATAMIENTO DE LA ESCLEROSIS MULTIPLE CAMPO DE LA INVENCION Los aspectos particulares se relacionan, generalmente, con las enfermedades inflamatorias neurodegenerativas (por ejemplo, esclerosis múltiple, esclerosis lateral amiotrófica, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, isquemia/derrame cerebral, traumatismo craneal, daño del cordón espinal, enfermedad de Huntington, migraña, angiopatía amiloide cerebral, afección inflamatoria neurodegenerativa asociada con el SIDA, disminución cognitiva relacionada con la edad; deterio cognitivo leve y enfermedades por priones en un mamífero) , que incluyen, pero no se limitan a, la esclerosis múltiple y la regulación o la modulación de la neuroinflamación, y más particularmente a las composiciones y métodos para el tratamiento o prevención de la esclerosis múltiple o, al menos, un síntoma de una enfermedad inflamatoria neurodegenerativa en un individuo mediante la administración de una composición terapéutica que comprende al menos uno dé los fluidos generados por electrocinética (por ejemplo, fluidos enriquecidos con oxígeno generados por electrocinética) de la presente invención. El tratamiento de aspectos particulares se relaciona" con la modulación de la señal de transducción intracelular asociada con las respuestas inflamatorias mediante la modulación de al menos una de las membranas celulares, potencial de membrana, proteínas de membrana tales como los receptores de membrana, que incluyen, pero no se limitan a, los receptores acoplados a la proteína G, y las uniones intercelulares (por ejemplo, uniones herméticas, uniones comunicantes, unión adherente y desmosomas) mediante la administración de una composición terapéutica que comprende al menos un fluido generado por electrocinética (que incluye los fluidos generados por electrocinética enriquecidos con gas (por ejemplo, enriquecidos con oxígeno) ) como el descrito en este documento. Aspectos adicionales se relacionan con las terapias de combinación.

ANTECEDENTES DE LA INVENCION Las enfermedades neurodegenerativas son un grupo de enfermedades caracterizadas por el deterioro de las neuronas o su revestimiento de mielina. Esta destrucción eventualmente conduce a la disfunción y discapacidad. A menudo, la inflamación se encuentra como un componente de las enfermedades neurodegenerativas y se adiciona a la patogénesis de la neurodegeneración (Minagar, y otros (2002) J. Neurological Sci . 202:13-23; Antel y Owens (1999) J. Neuroimmunol . 100: 181-189; Elliott (2001) Mol. Brain. Res. 95:172-178; Nakamura (2002) Biol. Pharm. Bull. 25:945-953; Whitton PS. (2007) Br J Pharmacol . 150:963-76). En conjunto, estas enfermedades comprenden las enfermedades neurodegenerativas reconocidas en la técnica. La neuroinflamación puede ocurrir años anteriores a cualquier pérdida considerable de neuronas en algunos trastornos neurodegenerativos (Tansey y otros, Fron Bioscience 13:709-717, 2008) . Muchos tipos diferentes de células inmunes, que incluyen los macrófagos, neutrófilos, células T, astrocitos, y microglia, pueden contribuir a la patología de las enfermedades relacionadas con la inmunidad, similares a la Esclerosis Múltiple (MS) , enfermedad de Parkinson, amiloidosis (por ejemplo, enfermedad de Alzheimer) , esclerosis lateral amiotrófica (ALS) , enfermedades por priones, y demencia asociada a VIH. Más específicamente, los grupos de investigación han notado que en MS el daño a la mielina es mediado por una repuesta inflamatoria (Ruffini y otros, (2004) A J Pathol 164:1519-1522) y que la patogénesis de MS se exacerba cuando los leucocitos infiltran el CNS (Dos Santos y otros, (2008) J Neuroinflan ation 5:49) . Un grupo de investigación desarrolló modelos genéticos para probar la inflamación del CNS y sus efectos en la MS (a través del modelo experimental animal de la encefalomielitis autoimmune (EAE) . Además, las citoquinas pro- inflamatorias (en especial TNF-alfa) se encontraron elevadas en la enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, y esclerosis lateral amiotrófica (ALS) . (Greig y otros, (2006) Ann NY Acad of Sci 1035:290-315). Estas enfermedades inflamatorias neurodegenerativas pueden, por lo tanto, tratarse con efectividad mediante fármacos anti-inflamatorios .

Las enfermedades neurodegenerativas inflamatorias incluyen, pero no se limitan a: esclerosis múltiple (MS) , enfermedad de Parkinson, amiloidosis (por ejemplo, enfermedad de Alzheimer) , esclerosis lateral amiotrófica (ALS) , demencia asociada con el VIH, isquemia/derrame cerebral, traumatismo craneal, daño del cordón espinal, enfermedad de Huntington, migraña, angiopatía amiloide cerebral, SIDA, disminución cognitiva relacionada con la edad; deterio cognitivo leve y enfermedades por priones en un mamífero.

La esclerosis múltiple (MS) es una enfermedad neurodegenerativa inflamatoria crónica del sistema nervioso central (CNS) que afecta aproximadamente a 1,100,000 personas en todo el mundo, en particular afecta a los adultos jóvenes (Pugliatti y otros (2002) Clin. Neurol . Neuros. 104:182-191). La MS se caracteriza patológicamente por la desmielización del te ido neural, el cual resulta clínicamente en una de muchas formas de la enfermedad, en el intervalo de patrones benignos a progresivos crónicos del estado de la enfermedad. Más específicamente, se han descrito cinco formas principales de esclerosis múltiple: 1) esclerosis múltiple benigna 2) esclerosis múltiple con recaída y remisiones (RRMS) ; 3) esclerosis múltiple progresiva secundaria (SPMS) ; 4) esclerosis múltiple progresiva primaria (PPMS) ; y 5) esclerosis múltiple con recaída progresiva (PRMS) . La esclerosis múltiple crónica progresiva es un término que se usa para referir de manera conjunta la SPMS, PPMS, y PRMS. Las formas de recaída de esclerosis múltiple son SPMS con recaídas superimpuestas , RRMS y PRMS.

A lo largo del curso de la enfermedad existe una progresiva destrucción del revestimiento de mielina alrededor de los axones. Ya que la mielina intacta es esencial en la preservación de la integridad axonal (Dubois-Dalcq y otros, Neuron. 48, 9-12 (2005)) la destrucción sistemática eventualmente conduce, en clínica, a varias disfunciones neurológicas que incluyen el entumecimiento y dolor, problemas con la coordinación y el balance, ceguera, y deterioro cognitivo general. Es interesante recalcar que, la progresión de la MS puede diferir considerablemente en los pacientes que tienen alguna ligera discapacidad aún después de algunas décadas de vivir con la enfermedad, mientras otros se vuelven dependientes de sillas de ruedas solamente a pocos años de ser diagnosticados.

La etiología de la MS en la actualidad se desconoce, pero los estudios que analizan la evidencia genética, la base molecular, y los factores inmunológicos están comenzando a explicar el curso de la enfermedad y el mecanismo por el cual ocurre la desmielinización . En análisis genéticos, algunos reportes han indicado que individuos relacionados tienen la más alta incidencia de MS cuando se comparan con la población normal (0.1% prevalencia de MS) : un gemelo idéntico tiene una oportunidad de 30% de desarrollar la enfermedad si el otro gemelo tiene MS y los gemelos fraternales y hermanos tienen una oportunidad de 1 a 2% si el otro hermano se afecta por MS . Algunos grupos han utilizado estudios de asociación y enlace para descubrir los genes responsables de esta herencia y encontraron que el riesgo relativo de ser afectado por MS es de 3 a 4 veces más alto en aquellos que portan un alelo clase II del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) del alelo DR2 del antígeno leucocitario humano (HLA) . Se han identificado otros genes que se asocian con la MS, pero en un riesgo mucho menor. La relación entre la suceptibilidad de MS y MHC Clase II sugiere fuertemente un papel para las células T CD4+ en las patogénesis de MS (Oksenberg y otros, JAMA 270:2363-2369 (1993); Olerup y otros, Tissue Antigens 38:1-3 (1991) ) .

Además, se ha intentado la identificación de los genes que se expresan diferencialmente en los pacientes MS que sufren de MS comparados con los individuos sanos . Se usaron los microarreglos de genes 1) para examinar la transcripción de tipos de placas MS (aguda contra crónica) y regiones de placas (activa contra inactiva) (Lock y Heller (2003)); 2) para comparar los mononucleocitos de sangre periférica (PBMC) en pacientes RRMS contra los controles, de pacientes con o sin tratamiento de interferon-ß ( Sturzebecher y otros, (2003)); y 3) para examinar células del CNS en etapas de encefalomielitis alérgica experimental (EAE) en ratones, en un modelo animal de MS (Lock y otros, (2002) ) . Gran parte de lo que se descubrió con estos experimentos se esperaba, incluyendo el hallazgo de que los genes anti-apoptóticos , anti-inflamatorios , están subregulados y los genes de proliferación, pro- inflamatorios , están sobreregulados . Los resultados sorprendentes incluyen la identificación de blancos novedosos potenciales para la aplicación terapéutica tal como osteopontina (Chabas y otros, 2001) y TRAIL (Wandinger y otros, 2003)) . Sin embargo, muchos de los genes que tienen regulación diferencial cuando se compara su expresión en pacientes MS con los de individuos sanos tienen una significación desconocida en el desarrollo de MS, debido a que cualquiera de los genes que pueden afectar la suceptibilidad y/o progreso de la MS son todavía desconocidos.

Investigaciones adicionales determinaron que la respuesta inflamatoria iniciada por células T CD4+ autoreactivas pueden mediar el daño a la mielina (Bruck y otros, J". Neurol . Sci . 206:181-185 (2003)). En general, se cree que mucha de la incidencia del daño al revestimiento de mielina y los axones durante un episodio de MS sucede a través de la respuesta de células T autoreactivas que produce una respuesta inflamatoria que incluye la secreción de citoquinas proinflamatorias (por ejemplo Thl y Thl7) (Prat y otros, J. Rehabil. Res. Dev. 39:187-199 (2002); Hemmer y otros, 2Vat. Rev. Neurosci. 3:291-301 (2002)).

Los tratamientos que están disponibles en la actualidad para la MS incluyen acetato de glatiramer, interferon- ß , natalizumab, y mitoxantrona . En general, estos fármacos suprimen el sistema imune en un modo no específico y solo limitan ligeramente la progresión global de la enfermedad. (Lubetzki y otros (2005), Curr. Opin. Neurol . 18:237-244). De este modo, existe una necesidad para el desarrollo de estrategias terapéuticas para mejorar el tratamiento de la MS .

El acetato de glatiramer está compuesto por ácido glutámico, lisina, alanina, y tirosina como un polímero al azar. El acetato de glatiramer tiene efectividad limitada y efectos secundarios significativos, por ejemplo, abultamiento en el sitio de la inyección, escalofríos, fiebre, dolor, dificultad para respirar, latidos rápidos del corazón y ansiedad. En un estudio clínico importante usando 943 pacientes con MS primaria progresiva, el acetato de glatiramer falló al detener el progreso de la discapacidad y la enfermedad (Wolinsky, y otros, (2007) Ann Neurol 61:13-24) .

El Interferon-ß es una proteína de origen natural que se produce por los fibroblastos y es parte de la respuesta inmune innata. Como un fármaco para la MS, el interferon-ß es aproximadamente de 18 a 38% efectivo en la reducción de la velocidad de los episodios de la MS . Los efectos secundarios incluyen síntomas similares a una gripe ligera y reacciones en el sitio de la inyección y algunos más serios (por ejemplo, depresión, ataques, y problemas del hígado).

La mitoxantrona es un tratamiento para la MS . Ésta se desarrolló como un tratamiento de quimioterapia para usar en el combate contra el cáncer por la interferencia con la síntesis y reparación de ADN y no es específica para las células cancerígenas. Los efectos secundarios de la mitoxantrona pueden ser completamente graves e incluyen náusea, vómitos, pérdida del cabello, daño al corazón, e inmunosupresión .

El natalizumab es un anticuerpo monoclonal humanizado que se dirige a la alfa 4-integrina, que es una molécula de adhesión celular. El natalizumab se cree que trabaja manteniendo las células inmunes que causan la inflamación a partir del cruzamiento de la barrera hematoencefálica (BBB) . Los efectos secundarios incluyen fatiga, dolor de cabeza, náusea, resfríos, y reacciones alérgicas.

La enfermedad de Parkinson, otra enfermedad neurodegenerativa inflamatoria, se caracteriza por trastornos del movimiento, que incluyen rigidez muscular y movimientos físicos lentos. Una investigación reciente respecto a la enfermedad de Parkinson observó que debido a la expresión mejorada de citoquinas y antígenos DR-HLA es probable que la respuesta imune contribuya al daño neuronal (Czlonkowska y otros (2002) Med Sci Monit 8:RA165-77) .

La amiloidosis se desarrolla cuando ciertas proteínas tienen alterada la estructura y tienden a unir y bloquear el funcionamiento del tejido normal. Estas proteínas de estructuras alteradas se llaman amiloides. A menudo, la amiloidosis se divide en dos categorías: primaria o secundaria. La amiloidosis primaria ocurre a partir de una enfermedad con función celular inmune innadecuada. La amiloidosis secundaria normalmente se origina a partir de una complicación de algunas de otras infecciones crónicas o enfermedades inflamatorias. Los ejemplos incluyen la enfermedad de Alzheimer y la artritis reumatoidea. Ya que el problema subyacente en la amiloidosis secundaria es la inflamación, el tratamiento de la inflamación será igualmente beneficioso .

La enfermedad de Alzheimer es otro tipo de enfermedad neurodegenerativa inflamatoria. Se ejemplifica por el aumento del deterioro del aprendizaje y la memoria, aunque la enfermedad se puede automanifestar en otras vías indicando una capacidad cognitiva alterada. A lo largo de la enfermedad, la pérdida progresiva de las neuronas y la sinapsis en la corteza cerebral conducen a la atrofia grave del tejido neural . Aunque la causa de la enfermedad de Alzheimer se desconoce, muchos creen que la inflamación desempeña un papel importante y los estudios clínicos han demostrado que la inflamación contribuye considerablemente a la patogénesis de la enfermedad (Akiyama, y otros (2000) Neurobiol Aging. 21:383-421.

En la esclerosis lateral amiotrófica, se ha sugerido una relación entre la inflamación y la enfermedad (Centonze y otros, (2007) Trends Pharm Sci. 28:180-7). Además, se encontró que el ARNm de TNF-alfa se expresa en la médula espinal de un modelo para la esclerosis lateral amiotrófica en ratón transgénico. Curiosamente, la transcripción se detectó ya antes de la aparición de las dificultades motoras hasta la muerte causada por la ELA (Elliot (2001) Brain Res Mol Brain Res. 95:172-8).

Inflamación La inflamación puede ser una respuesta vascular y/oinmune aguda o crónica, localizada o sistémica a un traumatismo o una infección por microbios, tales como bacterias o virus. Las reacciones inflamatorias normalmente destruyen, diluyen o limitan al agente agresor y al tejido I lesionado en el individuo. La inflamación se caracteriza, en particular, en la forma aguda, por los signos clásicos de dolor, calor, enrojecimiento, hinchazón y posiblemente pérdida de la función. A nivel histológico, la inflamación involucra unas series de eventos complejos, que incluyen la dilatación de las arteriolas, capilares y vénulas, y un aumento de la permeabilidad y el flujo sanguíneo, exudación de fluidos, incluyendo las proteínas del plasma, y la migración de leucocitos en el área de la inflamación, en particular con una reacción localizada.

Los tratamientos terapéuticos para la inflamación incluyen una amplia gama de fármacos administrados por vía intravenosa, subcutánea, tópica o por vía oral, dependiendo de la afección inflamatoria particular, y el resultado buscado. Sin embargo, la mayoría de los tratamientos anti-inflamatorios disponibles en la actualidad tienen desventajas considerables, que incluyen reacciones severas en el lugar de la inyección, aumento de la susceptibilidad a la infección, erupción, u otros efectos secundarios. De este modo, existe una necesidad de mejorar los métodos de tratamiento y terapéuticos .

Linfopoyetina estromal tímica (TSLP) . La linfopoyetina estromal tímica (TSLP) es una citoquina similar a IL-7 que desencadena las respuestas inflamatorias de tipo Th2 mediadas por células dendríticas, y se considera como un interruptor principal para la inflamación alérgica. La TSLP es un factor de crecimiento integral tanto para el desarrollo y la maduración de células B y T. En particular, la TSLP murina apoya la linfopoyesis B y se requiere para la proliferación de células B. La TSLP murina desempeña un papel crucial en el control de la reorganización del locus del receptor-gamma de las células T (TCR gamma) y tiene un efecto estimulante sustancial en los timocitos y células T maduras. Véase, por ejemplo, Friend y otros, Exp. Hematol . , 22:321-328, 1994; Ray y otros, Eur. J. Iwmunol . , 26:10-16, 1996; Candeias y otros, Immunology Letters, 57:9-14, 1997.

La TSLP posee una actividad de citoquinas similar a la IL-7. Por ejemplo, la TSLP puede sustituir a IL-7 en la estimulación de las respuestas a la proliferación de células B, (Friend y otros, supra) . Aunque la TSLP e IL-7 median efectos similares en las células diana, éstas parecen tener diferentes vías de señalización y es probable que varíen en su respuesta biológica. Por ejemplo, aunque la TSLP modula la actividad de STAT5 , esta falla para activar cualquiera de los miembros de la tirosina quinasa de la familia Jano (Levin y otros, J. Immunol., 162:677-683, 1999).

Efectos de TSLP sobre las células dendriticas y la producción de TNF. Después de que la TSLP humana y el receptor TSLP humano se clonaron en el año 2001, se descubrió que la TSLP humana activa potentemente las células dendríticas mieloides inmaduras CDllc + (mDC) (véase, por ejemplo, Reche y otros, J. Immunol . , 167:336-343, 2001 y Soumelis y otros Nat. Immunol., 3:673-680, 2002). Las células Th2 se definen, en general, en los libros de inmunología y en la literatura como las células T CD4+ que producen IL-4, IL-5, IL-13 e IL-10. Y las células Thl , como las células T CD4+ producen IFN-? y algunas veces TNF. Cuando TSLP-DC se usan para estimular las células T CD4+ alogénicas vírgenes, in vitro, se induce un tipo único de células Th2 que produce las citocinas Th2 clásicas IL-4, IL-5 e IL-13, y grandes cantidades de TNF, pero poco o nada de IL-10 o el interferón-? (Reche y otros, Supra) (véase también, por ejemplo, Soumelis y otros, Nat. Immunol., 3:673-680, 2002). El TNF no suele considerarse una citocina Th2. Sin embargo, el TNF es prominente en las vías respiratorias de asmáticos y los genotipos que se correlacionan con la secreción de TNF aumentada se asocian con un riesgo de asma aumentado. Véase Shah y otros, Clin. Exp. Alergia. , 25:1038-1044, 1995 y Moffatt, M.F. y Cookson, .O., Hum. Mol. Genet . , 6:551-554, 1997.

La TSLP induce a que los mDC humanos expreses la proteína 0X OL de la superfamilia de TNF, tanto a nivel de ARNm como proteínas (Ito y otros, J. Exp. Med. , 202:1213-1223) . La expresión de OX40L por la TSLP-DC es importante para la elaboración de las células inflamatorias Th2. De este modo, las DC activadas por TSLP crean un microambiente permisible a Th2 por sobreregulación de 0X4 OL sin la inducción de la producción de citocinas que polarizan Thl . Id.

Expresión de la TSLP, respuestas alérgeno-específicas y asma. En los primeros estudios se demostró que el ARNm de la TSLP era altamente expresado en los queratinocitos primarios de piel humana, las células epiteliales bronquiales, las células musculares lisas y fibroblastos de pulmón (Soumelis y otros, Nat. Immunol . , 3:673-680, 2002). Debido a que la TSLP se expresa principalmente en los queratinocitos de las capas apicales de la epidermis, esto sugiere que la producción de la TSLP es una característica de los queratinocitos completamente diferenciados. La expresión de la TSLP en pacientes con dermatitis atópica se asoció con la migración de las células de Langerhans y la activación in situ, lo que sugiere que la TSLP puede contribuir directamente a la activación de estas células que posteriormente podrían migrar hacia los ganglios linfáticos de drenaje y primar en las respuestas alérgeno-específicas. Id. En un estudio más reciente, se mostró por hibridación in situ, que la expresión de la TSLP se incrementó en las vías respiratorias de asmáticos y se correlacionó tanto con la expresión de quimiocinas que atraen Th2 como con la severidad de la enfermedad, lo que proporcionó una relación entre la TSLP y el asma (Ying y otros, J. Immunol . , 174:8183-8190, 2005).

Receptor TSLP (TSLPR) y alergia, asma. El receptor TSLP (TSLPR) es una proteína de aproximadamente 50 kDa y tiene similitud significativa con la cadena común ?. El TSLPR es un novedoso receptor de citoquinas tipo 1, que, combinado con la IL-7Ra (CD127), constituye un complejo receptor de TSLP como se describió, por ejemplo, en Pandey y otros, Nat . Immunol., 1:59-64, 2000. El TSLPR tiene un residuo de tirosina cerca de su extremo carboxilo, que se puede asociar con STAT5 fosforilada y mediar múltiples funciones biológicas cuando se vincula con TSLP (Isaksen y otros, J. Immunol., 168:3288-3294 , 2002) .

El TSLPR humano se expresa en los monocitos y células dendríticas CDllc +, y la unión a TSLP induce la expresión de las quimiocinas CCL17 y CCL22 que atraen células TH2. Además, como se indicó anteriormente, la activación inducida por TSLPR de las células dendríticas resulta indirectamente en el aumento de la secreción de citoquinas de TH2 IL-4, IL-5 e IL-13, lo que puede ser necesario para la regulación de la homeostasis de células T CD4+. En los ratones, la deficiencia del TSLPR no tiene efecto sobre el número de linfocitos. Sin embargo, una deficiencia del TSLPR y de la cadena ? común resulta en un menor número de linfocitos en comparación con los ratones deficientes en solo la cadena ? común. Véase Reche y otros, J". Immunol . , 167:336-343, 2001 y Soumelis y otros, Nat. Immunol., 3:673-680, 2002.

Los estudios encontraron que la TSLP y el TSLPR desempeñan un papel crítico en la iniciación de las enfermedades alérgicas en los ratones. En un estudio, se demostró que los ratones modificados para sobreexpresar la TSLP en la piel desarrollaron dermatitis atópica, la cual se caracteriza por lesiones eccematosas en la piel que contienen infiltrados inflamatorios, un dramático aumento en la circulación de las células Th2 y la IgE sérica elevada (Yoo y otros, J". Exp . Med. , 202:541-549, 2005). El estudio sugiere que la TSLP puede activar las DC directamente en los ratones. En otro estudio, realizado por Li y otros, el grupo confirmó que los ratones transgénicos que sobreexpresan la TSLP en la piel desarrollaron dermatitis atópica que solidifica la relación entre la TSLP y el desarrollo de la dermatitis atópica .

Otra serie de estudios demostraron que la TSLP se requiere para la iniciación, in vivo, de la inflamación alérgica de las vías respiratorias en ratones. En un estudio, Zhou y otros demostraron que la expresión específica en la comida de un transgén TSLP indujo la inflamación alérgica de las vías respiratorias (asma) , que se caracteriza por la infiltración masiva de leucocitos (que incluyen las células Th2) , hiperplasia de células caliciformes, y la fibrosis subepitelial , y el aumento de los niveles séricos de IgE (Zhou y otros, Nat . Immunol . , 6:1047-1053, 2005). Sin embargo, en contraste, los ratones que carecen del TSLPR dejaron de contraer asma en respuesta a los antígenos inhalados (Zhou y otros, supra y Al-Shami y otros, J. Exp. Med. , 202:829-839, 2005). De este modo, estos estudios, en conjunto, demuestran que se requiere la TSLP para la iniciación de la inflamación alérgica de las vías respiratorias en ratones.

Además, en un estudio realizado por Yong-Jun y otros, se demostró que la TSLP derivada de las células epiteliales desencadena las respuestas inflamatorias Th2 mediadas por DC en los seres humanos, lo que sugiere que la TSLP representa un interruptor principal de la inflamación alérgica en la interfase DC-célula epitelial (Yong-Jun y otros, J. Exp. Med. , 203:269-273, 2006).

En un estudio reciente, se demostró que la modulación de la función DC por la inhibición del TSLPR disminuye la gravedad en los ratones (Liyun al Shi y otros, Clin. Imm nol. , 129:202-210, 2008). En otra serie de estudios, se demostró que el TSLPR no se expresó sólo en DC, sino también en los macrófagos, mastocitos y células T CD4+ (Rocha y otros, J. Immunol., 178:6720-6724, 2007 y Omori M. y S. Ziegler, J. Immunol., 178:1396-1404, 2007). Con el fin de descartar los efectos directos de la neutralización del TSLPR en las células T CD4+ u otras células efectoras en la inflamación alérgica, Liyun Shi y otros, realizaron experimentos donde las DC cargadas con OVA se trataron in vitro con anti-TSLPR antes de la transferencia adoptiva de las vías respiratorias de los ratones vírgenes . Previamente se encontró que las DC-OVA desencadenó una fuerte inflamación eosinofílica en la vía respiratoria y se acompañó con la producción masiva de citocinas Th2 tales como la IL-4 e IL-5 (Sung y otros, J. Immunol . , 166:1261-1271 y Lambrecht y otros, J. Clin. Invest . , 106:551-559, 2000). Sin embargo, el pretratamiento de las DC-OVA con anti-TSLPR resultó en una reducción significativa de los eosinófilos y la infiltración de linfocitos, así como los niveles de IL-4 e IL-5, además muestra el papel que el TSLPR desempeña en la enfermedad alérgica principal por la DC. Este resultado también apoya que el bloqueo del TSLPR en la DC ayudaría en el control de la inflamación de las vías respiratorias (Liyun Shi y otros, supra) .

Ha habido un creciente número de experimentos que implican el papel de TSLP /TSLPR en diversos procesos fisiológicos y patológicos. Los papeles fisiológicos de las TSLP incluyen la modulación del sistema inmune, particularmente en la estimulación de la proliferación, desarrollo y maduración de células B y T. La TSLP juega un papel vital en la patobiología del asma alérgica y el bloqueo mediado por anticuerpos locales de la función del receptor TSLP para aliviar las enfermedades alérgicas. De este modo, se cree que la interacción entre la TSLP y el receptor TSLP es importante en muchos procesos de la enfermedad fisiológica y podría reducir significativamente la inflamación en muchas enfermedades neurodegenerativas,, tales co o: la esclerosis múltiple, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Alzheimer, isquemia/derrame cerebral, isquemia cerebral, traumatismo craneoencef lico, lesión de la médula espinal, enfermedad de Huntington, migraña, angiopatía amiloide cerebral, SIDA, disminución cognitiva relacionada con la edad, deterioro cognitivo leve y las enfermedades por priones en un mamífero.

SUMARIO DE LA INVENCION Los aspectos particulares proporcionan métodos para el tratamiento de una afección o enfermedad neurodegenerativa inflamatoria, que comprende la administración de una cantidad terapéuticamente efectiva de un fluido acuoso alterado por electrocinética a un individuo que necesite ésta, que comprende una solución acuosa iónica de nanoestructuras que contienen oxígeno estabilizadas por carga, que tienen sustancialmente un diámetro promedio de menos que aproximadamente 100 nanómetros y configuradas establemente en el fluido acuoso iónico en una cantidad suficiente para proporcionar, bajo el contacto de una célula viva con el fluido, la modulación de al menos un potencial de membrana celular y conductividad de membrana celular, donde se trata una enfermedad neurodegenerativa inflamatoria o al menos un síntoma de ésta. En ciertos aspectos, las nanoestructuras que contienen oxígeno estabilizadas por carga son las principales especies de nanoestructuras que contienen gas con estabilizadas por carga en el fluido.

De acuerdo con aspectos adicionales, el porcentaje de las moléculas de oxígeno disueltas en el fluido como nanoestructuras que contienen oxígeno estabilizadas por carga a es un porcentaje seleccionado del grupo que consiste en mayores que: 0.01%, 0.1%, 1%, 5%, 10% , un 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60% y 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, y 95%. En ciertos aspectos, el oxígeno total disuelto se presenta sustancialmente en las nanoestructuras que contienen oxígeno estabilizadas por carga. En aspectos adicionales, las nanoestructuras que contienen oxígeno estabilizadas por carga sustancialmente tienen un diámetro promedio menor que un tamaño seleccionado del grupo que consiste en: 90 nm, 80 nm, 70 nm, 60 nm, 50 nm, 40 nm, 30 nm; 20 nm, 10 nm, y menos de 5 nm. De acuerdo con ciertos aspectos, la solución acuosa iónica comprende una solución salina. En aspectos adicionales, el fluido es superoxigenado . En ciertos aspectos el fluido comprende una forma de electrones solvatados .

De acuerdo con ciertos aspectos, la alteración del fluido acuoso alterado por electrocinética comprende la exposición del fluido a los efectos electrocinéticos localizados, inducidos por hidrodinámica. En aspectos adicionales, la exposición a los efectos electrocinéticos localizados comprende la exposición a al menos uno de los pulsos de voltaje y pulsos de corriente. En ciertos aspectos, la exposición del fluido a los efectos electrocinéticos localizados, inducidos por hidrodinámica, comprende la exposición del fluido a elementos estructurales que inducen el efecto electrocinético de un dispositivo usado para generar el fluido.

De acuerdo con ciertos aspectos, la afección o enfermedad neurodegenerativa inflamatoria comprende al menos una seleccionada del grupo que consiste en la esclerosis múltiple, esclerosis lateral amiotrófica, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, isquemia/derrame cerebral, traumatismo craneal, lesión de la médula espinal, enfermedad de Huntington, migraña, angiopatía amiloide cerebral, afección neurodegenerativa inflamatoria asociada al SIDA, disminución cognitiva relacionada con la edad, deterioro cognitivo leve y enfermedades por priones en un mamífero. De acuerdo con aspectos adicionales, la afección o enfermedad inflamatoria neurodegenerativa comprende al menos una de estas, esclerosis múltiple, esclerosis lateral amiotrófica, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson. En aspectos adicionales, la afección o enfermedad inflamatoria neurodegenerativa comprende la esclerosis múltiple .

De acuerdo con ciertos aspectos, al menos un síntoma de la inflamación se relaciona con al menos una afección seleccionada del grupo que consiste en: inflamación crónica de los nervios centrales y el cerebro, e inflamación aguda en los los nervios centrales y el cerebro. En otros aspectos, el fluido acuoso alterado por electrocinética modula los niveles localizados o celulares del óxido nítrico. De acuerdo con aspectos adicionales, el fluido acuoso alterado por electrocinética promueve una disminución localizada en el sitio de administración de al menos una citoquina seleccionada del grupo que consiste en: IL-lbeta, IL-8, TNF-alfa, y TNF-beta. Los aspectos adicionales comprenden una inhibición sinérgica o no sinérgica o la reducción en la inflamación por el tratamiento del individuo con otro agente anti- inflamatorio de forma simultánea o como adyuvante.

De acuerdo con ciertos aspectos, otro agente antiinflamatorio comprende un esteroide o esteroide glucocorticoide . En aspectos adicionales, el esteroide glucocorticoide comprende budesonida o un derivado activo de ésta. Los aspectos adicionales comprenden la terapia de combinación, donde al menos un agente terapéutico adicional se administra al paciente. En los aspectos adicionales, al menos un agente terapéutico adicional se selecciona del grupo que consiste en: acetato de glatiramer, interferón- ß , mitoxantrona, natalizumab, inhibidores de MMP incluyendo los inhibidores de MMP-9 y MMP-2, los agonistas ß2 de acción corta, agonistas ß2 de acción prolongada, anticolinérgicos , corticoides, corticoides sistémicos, estabilizadores de los mastocitos, modificadores de leucotrienos , metilxantinas , agonistas ß2, albuterol, levalbuterol , pirbuterol, artformoterol , formoterol, salmeterol, anticolinérgicos incluyendo ipratropio y tiotropio; corticosteroides incluyendo beclometasona, budesonida, flunisolida, fluticasona, mometasona, triamcinolona, metiprednisolona, prednisolona, prednisona; modificadores de leucotrienos incluyendo montelucast, zafirlucast y zileuton; estabilizadores de mastocitos incluyendo cromolin y nedocromil; metilxantinas incluyendo la teofilina; fármacos de combinación incluyendo ipratropio y albuterol, fluticasona y salmeterol, budesonida y formoterol; antihistamínicos incluyendo hidroxicina, difenhidramina, loratadina, cetirizina, e hidrocortisona ; fármacos que modulan el sistema inmune incluyendo tacrolimus y pimecrolimus ; ciclosporina, azatioprina; micofenolatemofetil ; y combinaciones de éstos.

De acuerdo con aspectos adicionales, al menos un agente terapéutico adicional es una TSLP y/o antagonista del TSLPR. De acuerdo con ciertos aspectos, la TSLP y/o el antagonista del TSLPR se selecciona del grupo que consiste en los anticuerpos neutralizantes específicos para TSLP y el receptor TSLP, moléculas del receptor TSLP soluble, y las proteínas de fusión del receptor TSLP, que incluyen las moléculas Fe de inmunoglobulina del TSLPR o los polipéptidos que codifican los componentes de más de una cadena del receptor.

De acuerdo con aspectos adicionales, la alteración de la estructura o función de la membrana celular comprende alterar una conformación, actividad unida a ligando, o una actividad catalítica de una proteína asociada a la membrana. En ciertos aspectos, la proteína asociada a la membrana comprende al menos uno seleccionado del grupo que consiste en los receptores, los receptores transmembrana, las proteínas de los canales iónicos, las proteínas de anclaje intracelulares , las proteínas de adherencia celular, las integrinas, etc. En aspectos adicionales, el receptor transmembrana comprende un receptor acoplado a la proteína G (GPCR) . En ciertos aspectos, el receptor acoplado a la proteína G (GPCR) interactúa con la subunidad de la proteína G. De acuerdo con aspectos adicionales, la subunidad a de la proteína G comprende al menos uno seleccionado del grupo que consiste en Goíg, GOÍÍ, Gaq y GOÍI2. En algunos aspectos adicionales, la menos una subunidad a de la proteína G es Gaq.

Los aspectos adicionales se relacionan con la alteración de la estructura o función de la membrana celular que comprende alterar la conductividad de la membrana o el potencial de membrana. En ciertos aspectos, la modulación de la conductividad de la membrana celular comprende la modulación de la conductancia de las células enteras. Los aspectos adicionales se relacionan con la modulación de la conductancia de las células enteras, que comprende la modulación de al menos una contribución dependiente de voltaje de la conductancia de las células enteras. En ciertos aspectos, la modulación de las señales de transducción intracelular comprende la modulación de una ruta o sistema del mensajero celular dependiente de calcio. En aspectos adicionales, la modulación de la señal de transducción intracelular comprende la modulación de la actividad de la fosfolipasa C.

En ciertos aspectos, la modulación de las señales de transducción intracelular comprende la modulación de la actividad de la adenilato ciclasa (AC) . Los aspectos adicionales se relacionan con la modulación de la señal de transducción intracelular que comprende la modulación de la señal de transducción intracelular asociada con al menos una afección o síntoma seleccionado del grupo que consiste en: inflamación crónica, en los nervios centrales y cerebro, y la inflamación aguda en los nervios centrales y el cerebro. Los aspectos adicionales comprenden la administración a una red o capa celular, y además comprende la modulación de la unión intercelular allí. En aspectos adicionales, la unión intracelular comprende al menos uno seleccionado del grupo que consiste en uniones herméticas, uniones comunicantes, unión adherente y desmasomas . En ciertos aspectos, la red celular o capas comprenden al menos una seleccionada del grupo que consiste en la célula endotelial y las uniones herméticas de astrocitos con el endotelio de los vasos del SNC, uniones o barreras herméticas de líquido cefalorraquídeo con la sangre, las uniones tipo de epitelio pulmonar, las uniones tipo epitelio bronquial, y las uniones de tipo epitelio intestinal.

En un aspecto adicional, el fluido acuoso alterado por electrocinética se oxigena, y donde el oxígeno en el fluido está presente en una cantidad de al menos 8 ppm, al menos 15 ppm, al menos 25 ppm, al menos 30 ppm, al menos 40 ppm, al menos 50 ppm, o al menos 60 ppm de oxígeno a presión atmosférica. En ciertos aspectos, el fluido acuoso alterado por electrocinética comprende al menos una forma de electrones solvatados y especies de oxígeno cargadas o modificadas por electrocinética. En aspectos adicionales, los electrones solvatados o modificados por electrocinética o las especies de oxígeno cargadas están presentes en una cantidad de al menos 0.01 ppm, al menos 0.1 ppm, al menos 0.5 ppm, al menos 1 ppm, al menos 3 ppm, al menos 5 ppm, al menos 7 ppm, al menos 10 ppm, al menos 15 ppm, o de menos 20 ppm. En aspectos adicionales, el fluido acuoso oxigenado alterado por electrocinética comprende electrones solvatados estabilizados, al menos en parte, por el oxígeno molecular. En ciertos aspectos adicionales, la capacidad de alterar la estructura o función de la membrana celular es suficiente para proporcionar que la modulación de la señal de transducción intracelular persista durante al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco, al menos 6, al menos 12 meses, o períodos más largos, en un recipiente de gas herméticamente cerrado.

Los aspectos adicionales proporcionan una composición terapéutica, que comprende un fluido o solución acuosa oxigenada alterada por electrocinética como se describe en este documento y que incluye las composiciones descritas anteriormente (y, opcionalmente , en combinación con al menos otro agente terapéutico) , donde el oxígeno en el fluido o la solución está presente en una cantidad de al menos 8 ppm, al menos 15 ppm, al menos 25 ppm, al menos 30, al menos 40, al menos 50, o al menos 60 ppm de oxígeno. En ciertas modalidades, los fluidos o las soluciones acuosas oxigenadas alteradas por electrocinética comprenden especies de oxígeno cargadas o modificadas por electrocinética. En determinados aspectos, las especies de oxígeno cargadas o modificadas por electrocinética están presentes en una cantidad de al menos 0.5 ppm, al menos 1 ppm, al menos 3 ppm, al menos 5 ppm, al menos 7 ppm, al menos 10 ppm, al menos 15 ppm, o al menos 20 ppm. En ciertas modalidades, el fluido acuoso o solución iónica oxigenada alterada por electrocinética comprende electrones solvatados estabilizados por el oxígeno molecular. En determinados aspectos, los electrones solvatados están presentes en una cantidad al menos de 0.01 ppm, al menos 0.1 ppm, al menos 0.5 ppm, al menos 1 ppm, al menos 3 ppm, al menos 5 ppm, al menos 7 ppm, al menos 10 ppm, al menos 15 ppm, o al menos 20 ppm.

Otras modalidades se relacionan con composiciones terapéuticas que comprenden un fluido enriquecido con gas generado por electrocinética como se describe en este documento, donde dicho fluido contiene gas disuelto o difuso en un nivel superior que 30 partes por millón a presión atmosférica, y donde el fluido enriquecido con gas contiene electrones solvatados . En algunas de estas modalidades, el fluido enriquecido con gas comprende agua enriquecida con oxígeno iónico alterado por electrocinética.

Los aspectos particulares proporcionan una composición, que comprende un fluido o solución acuosoa iónica oxigenada alterada por electrocinética, donde el oxígeno en el fluido o solución está presente en una cantidad de al menos 25 ppm, al menos 30, al menos 40, al menos 50, o al menos 60 ppm de oxígeno. En las modalidades particulares, el fluido acuoso o la solución oxigenada alterada por electrocinética comprende especies de oxígeno cargadas o modificados por electrocinética. En ciertos aspectos, las especies de oxígeno cargadas o' modificadas por electrocinética están presentes en una cantidad de al menos 0.5 ppm, al menos 1 ppm, al menos 3 ppm, al menos 5 ppm, al menos 7 ppm, al menos 10 ppm, al menos 15 ppm, o al menos 20 ppm. En las modalidades particulares, el fluido acuoso o la solución oxigenada alterada por electrocinética comprende electrones solvatados estabilizados por el oxígeno molecular. En ciertos aspectos, los electrones solvatados están presentes en una cantidad de al menos 0.01 ppm, al menos 0.1 ppm, al menos 0.5 ppm, al menos 1 ppm, al menos 3 ppm, al menos 5 ppm, al menos 7 ppm, al menos 10 ppm, al menos 15 ppm, o al menos 20 ppm.

En ciertos aspectos, la solución o fluido acuoso oxigenado comprende electrones solvatados estabilizados por el oxígeno molecular. En las modalidades particulares, los electrones solvatados están presentes en una cantidad de al menos 0.01 ppm, al menos 0.1 ppm, al menos 0.5 ppm, al menos 1 ppm, al menos 3 ppm, al menos 5 ppm, al menos 7 ppm, al menos 10 ppm, al menos 15 ppm, o al menos 20 ppm.

BREVE DESCRIPCION DE LAS FIGURAS La Figura 1 es un diagrama de bloque parcial, sección transversal parcial, de un dispositivo de mezcla de la técnica anterior.

La Figura 2 es un diagrama de bloque de una modalidad ejemplar de un dispositivo de mezcla.

La Figura 3 es una ilustración de un sistema ejemplar para la entrega de un primer material al dispositivo de mezcla de la Figura 2.

La Figura 4 es una vista en sección transversal parcial fragmentada de una parte superior del dispositivo de mezcla de la Figura 2.

La Figura 5 es una vista en sección transversal parcial fragmentada de una primera parte lateral del dispositivo de mezcla de la Figura 2.

La Figura 6 es una vista en sección transversal parcial fragmentada de una segunda parte lateral del dispositivo de mezcla de la Figura 2.

La Figura 7 es una vista en sección transversal parcial fragmentada de una parte lateral del dispositivo de mezcla de la Figura 2, localizada entre la primera parte lateral de la Figura 5 y la segunda parte lateral de la Figura 6.

La Figura 8 es una vista en perspectiva de un rotor y un estator del dispositivo de mezcla de la Figura 2.

La Figura 9 es una vista en perspectiva de un interior de una primera cámara del dispositivo de mezcla de la Figura 2.

La Figura 10 es una vista en sección transversal parcial fragmentada del interior de una primera cámara del dispositivo de mezcla de la Figura 2 que incluye una modalidad alternativa de la bomba 410.

La Figura 11 es una vista en perspectiva del interior de una segunda cámara del dispositivo de mezcla de la Figura 2.

La Figura 12 es una vista en sección transversal parcial fragmentada de una parte lateral de una modalidad alternativa del dispositivo de mezcla.

La Figura 13 es una vista en perspectiva de una modalidad alternativa de una sección central del alojamiento para usar con una modalidad alternativa del dispositivo de mezcla .

La Figura 14 es una vista en sección transversal parcial fragmentada de una modalidad alternativa del alojamiento del rodamiento para usar' con una modalidad alternativa del dispositivo de mezcla.

La Figura 15 es una vista en sección transversal de la cámara de mezcla del dispositivo de mezcla de la Figura 2, tomada a través de un plano ortogonal al eje de rotación, que representa un patrón de flujo rotatorio provocado por las burbujas de cavitación cuando un agujero de paso del rotor se aproxima a (pero no está alineado) una abertura del estator.

La Figura 16 es una vista en sección transversal de la cámara de mezcla del dispositivo de mezcla de la Figura 2, tomada a través de un plano ortogonal al eje de rotación que representa un patrón de flujo rotatorio provocado por las burbujas de cavitación cuando el agujero de paso del rotor se alinea con la abertura del estator.

La Figura 17 es una vista en sección transversal de la cámara de mezcla del dispositivo de mezcla de la Figura 2, tomada a través de un plano ortogonal al eje de rotación que representa un patrón de flujo rotatorio provocado por las burbujas de cavitación cuando un agujero de paso del rotor que se alineó anteriormente con la abertura del estator ya no está alineado con éste.

La Figura 18 es una vista lateral de una modalidad alternativa de un rotor.

La Figura 19 es una vista en sección transversal fragmentada ampliada, tomada a través de un plano ortogonal a un eje de rotación del rotor que representa una configuración alternativa de los agujeros de paso formados en el rotor y los agujeros de paso formados en el estator.

La Figura 20 es una vista en sección transversal fragmentada ampliada tomada a través de un plano que pasa a través, y se extiende a lo largo del eje de rotación del rotor que representa una configuración de los agujeros de paso formados en el rotor y los agujero de paso formados en el estator.

La Figura 21 es una vista en sección transversal fragmentada ampliada tomada a través de un plano que pasa a través, y se extiende a lo largo del eje de rotación del rotor que representa una configuración alternativa de desplazamiento de los agujeros de paso formados en el rotor y los agujero de paso formados en el estator.

La Figura 22 es una ilustración de un molde que se puede usar para construir los agujeros de paso del rotor y/o las aberturas del estator.

La Figura 23 es una ilustración de un molde que se puede usar para construir los agujeros de paso del rotor y/o las aberturas del estator.

La Figura 24 es una ilustración de un molde que se puede usar para construir los agujeros de paso del rotor y/o las aberturas del estator.

La Figura 25 es una ilustración de un molde que se puede usar para construir los agujeros de paso del rotor y/o las aberturas del estator.

La Figura 26 es una ilustración de una capa doble eléctrica ("EDL") formada cerca de la superficie.

La Figura 27 es una vista en perspectiva de un modelo del interior de la cámara de mezcla.

La Figura 28 es una vista en sección transversal del modelo de la Figura 27.

La Figura 29 es una ilustración de un montaje experimental .

La Figura 30 ilustra los niveles de oxígeno disuelto en el agua procesada con el oxígeno en el dispositivo de mezcla de la Figura 2 y almacenada en una botella plástica de pared delgada de 500 mi y una botella de vidrio de 1,000 mi cada una tapada a 18.33° C (65° Fahrenheit) .

La Figura 31 ilustra los niveles de oxígeno disuelto en el agua procesada con el oxígeno en el dispositivo de mezcla de la Figura 2 y almacenada en una botella de plástico de pared delgada de 500 mi y una botella de vidrio de 1,000 mi, ambas refrigeradas a 3.9° C (39° Fahrenheit).

La Figura 32 ilustra la retención de oxígeno disuelto de un fluido de bebida de 500 mi procesado con el oxígeno en el dispositivo de mezcla de la Figura 2.

La Figura 33 ilustra la retención de oxígeno disuelto de una solución salina balanceada de Braun de 500 mi procesada con el oxígeno en el dispositivo de mezcla de la Figura 2.

La Figura 34 ilustra un experimento adicional donde el dispositivo de mezcla de la Figura 2 se usa para rociar el oxígeno del agua mediante el procesamiento del agua con nitrógeno en el dispositivo de mezcla de la Figura 2.

La Figura 35 ilustra el rociamiento de oxígeno del agua por el dispositivo de mezcla de la Figura 2 a temperatura y presión normales.

La Figura 36 es una ilustración de una nanocaja ej emplar .

Las Figuras 37A y B ilustran los efectos de dispersión de Rayleigh de un fluido enriquecido con oxígeno.

La Figura 38 ilustra el perfil de citocinas de un' ensayo mitogénico en presencia de un fluido enriquecido con gas y el fluido control desionizado.

La Figura 39 ilustra la diferencia en las velocidades de crecimiento de la bacteria Pseudomonas a diferentes relaciones de saturación de oxígeno disuelto.

Las Figuras 40A y 40B ilustran la cicatrización in vitro de la herida que usa un medio de cultivo celular enriquecido con oxígeno y un medio no enriquecido con gas .

Las 41A a la Figuras 41F muestran las secciones transversales histológicas de la cicatrización de la herida in vivo de la dermis y la epidermis.

La Figura 42 ilustra la expresión de la tinción de Hale en la cicatrización de heridas tratadas y control, que se usa para detectar mucopolisacáridos ácidos, como el ácido hialurónico .

La Figura 43 describe la expresión de la tinción del Factor de von illebrand que se usa para detectar la angiogénesis en la cicatricaión de heridas tratadas y control .

La Figura 44 ilustra la detección de tinción de Luna que se usa para detectar la elastina en la cicatricaión de heridas tratadas y control .

La Figura 45 ilustra el número de mastocitos por campo visual para la cicatricaión de heridas tratadas y control .

La Figura 46 ilustra el porcentaje de células muertas en intervalos de tiempo separados en un ensayo de fibroblasto corneal usando medios de cultivo de la invención enriquecidos con gas y medios de cultivo control.

La Figura 47 ilustra la vida útil del fluido de gas enriquecido de la invención en una bolsa de polímero.

La Figura 48 ilustra los resultados de poner en contacto los esplenocitos con MOG en presencia de fluido oxigenado en recipiente presurizado (1) , el fluido enriquecido con gas de la invención (2) , o el fluido desionizado control (3) .

Las Figuras 49-58 muestran los resultados de las evaluaciones de las citoquinas en la muestra de sangre completa .

Las Figuras 59-68 muestran los resultados de las citoquinas correspondientes a las evaluaciones de la muestra del esputo broncoalveolar (BAL) .

Las Figuras 69-75 muestran los estudios donde el receptor de membrana B2 de la bradiquinina se inmovilizó sobre el biosensor de aminopropilsilano (APS) . La placa de muestra se dispuso como se designó en la Figura 69 y la unión de la bradiquinina al receptor inmovilizado se evaluó de acuerdo a la muestra dispuesta como se designó en la Figura 71. Los resultados de la unión de la bradiquinina se muestran en la Figura 72. La unión de la bradiquinina al receptor se tituló, además, de acuerdo a lo dispuesto como se designó en la Figura 73. Como se indicó en la Figura 74, la unión de la bradiquinina al receptor B2 fue dependiente de la concentración, y la afinidad de unión aumentó en el fluido salino enriquecido con gas registrado de la presente descripción, en comparación con la solución salina normal. La estabilización de la unión bradiquinina al receptor B2 se muestra en la Figura 75.

Las Figuras 76-83 muestran los datos que muestran la capacidad de las modalidades particulares divulgadas en este documento para afectar a las células T reguladoras . El estudio involucró la irradiación a las células presentadoras de antígeno, y la introducción de antígeno y células T.

La Figura 84 muestra que los fluidos de la invención generados por electrocinética disminuyeron la captación sérica de la calcitonina de salmón y un modelo animal. Los resultados son consistentes con la mejoría de las uniones herméticas .

Las Figuras 85-89 muestran los niveles de expresión de proteínas relacionadas con uniones herméticas en el tejido pulmonar en el modelo animal usado para generar los datos de la Figura 8 .

Las Figuras 90-94 muestran los datos obtenidos a partir de queratinocitos de prepucio humano expuestos a RDC1676-01 (solución salina estéril procesada a través del presente dispositivo registrado, con oxígeno adicional añadido; el fluido enriquecido con gas generado por electrocinética (Rev) de la presente descripción) que muestra la regulación ascendente de NOS1 y 3, y Nostrin, NOS3.

Las Figuras 95 y 96 muestran los datos que apoyan los efectos electrocinéticos localizados (voltaje/corriente) que ocurren en un dispositivo de mezcla que comprende los elementoscaracterísticas del rotor y el estator aislados, para permitir la detección de los efectos del voltaje/corriente durante la generación de fluido por electrocinética .

Las Figuras 97A-C muestran los resultados de los estudios de resonancia magnética nuclear (RMN) conducidos para caracterizar, además, la naturaleza fundamental de los fluidos de la invención generados por electrocinética. Los fluidos generados por electrocinética aumentaron las amplitudes de líneas 13C-RMN del soluto reportero de Trehalosa.

Las Figuras 98 y 99 muestran los resultados de los estudios voltimétricos (es decir, voltametría de onda cuadrada (Figura 98) y polarografía de redisolución (Figura 99)) que se llevaron a cabo para caracterizar, además, la naturaleza fundamental de los fluidos generados por electrocinética de la invención. Las únicas diferencias en los picos de voltimetría por onda cuadrada (con respecto al control) para los fluidos generados por electrocinética se observaron a -0.14V, -0.47V, -1.02V y -1.36V. Los picos polaragráficos pronunciados se observaron a -0.9 voltios para los fluidos Revera y Solas generados por electrocinética, y los espectros de los fluidos control salino y blanco no generados por electrocinética muestran picos característicos a -0.19 y -0.3 voltios que están ausentes en el espectro de los fluidos generados por electrocinética .

Las Figuras 100-106 muestran los resultados de las técnicas de fijación de parches en las que se evaluaron los efectos del fluido generado por electrocinética probado sobre la polaridad de la membrana de células epiteliales y la actividad de canal iónico. Los resultados indican que los fluidos generados por electrocinética de la invención afectan a una contribución dependiente de voltaje de la conductancia de las células enteras.

Las Figuras 107A-D y 108A-D muestran los datos que indican que los fluidos generados por electrocinética de la invención (por ejemplo, RDC1676-00, RDC1676-01, RDC1676-02 y RDC1676-03) protegieron contra la broncoconstriccion inducida por la metacolina cuando se administró sola o como diluyentes del sulfato de Albuterol en los conejillos de indias machos.

Las Figuras 109-114 muestran los resultados de los experimentos con la budesonida realizados para evaluar las propiedades anti- inflamatorias de la vía respiratoria de los fluidos generados por electrocinética de la invención en un modelo de sensibilización con ovoalbúmina a las ratas Brown Norway. Los fluidos generados por electrocinética de la invención disminuyeron el conteo de eosinófilos, mostraron una fuerte sinergia con la Budesonida en la disminución del conteo de eosinófilos, disminuyeron los valores Penh, aumentaron el Volumen Tidal, disminuyron los niveles sanguíneos de Eotaxina, mejoraron significativamente los niveles sanguíneos de los dos tipos principales de citoquinas anti- inflamatorias, IL-10 e interferón gamma a las 6 horas después de la exposición como resultado del tratamiento con el fluido generado por electrocinética de la invención (por ejemplo, RNS-60) , solo o en combinación con la Budesonida, y disminuyeron los niveles sistémicos de Rantes. Los datos muestran que existe un efecto sinérgico importante de la budesonida 750 ug/kg y los fluidos generados por electrocinética de la invención (por ejemplo, RNS-60) La Figura 115 muestra que el fluido generado por electrocinética de la invención (por ejemplo, RNS-60 y Solas) redujo la expresión del receptor TSLP inducido por DEP en las células epiteliales bronquiales (BEC) en aproximadamente 90% y 50%, respectivamente, mientras que una solución salina normal (NS) sólo tuvo un efecto marginal.

La Figura 116 muestra que el fluido generado por electrocinética de la invención (por ejemplo, RNS-60 y Solas) inhibió los niveles de la unión MP-9 a la superficie celular inducido por DEP, en las células epiteliales bronquiales en aproximadamente 80%, y 70%, respectivamente, mientras la solución salina normal (NS) sólo tuvo un efecto marginal.

Las Figuras 117 A-C demuestran los resultados de una serie de experimentos de fijación de parches que evaluaron los efectos del fluido generado por electrocinética (por ejemplo, RNS-60 y Solas) sobre la polaridad de la membrana celular epitelial y la actividad del canal iónico a dos intervalos de tiempos (15 minutos (paneles de la izquierda) y 2 horas (paneles de la derecha) ) y a diferentes protocolos de voltaje.

Las Figuras 118 A-C muestran, en relación a los experimentos que refieren las Figuras 117 A-C, los gráficos resultantes de la sustracción de los datos corrientes de Solas a partir de los datos corrientes de RNS-60 en tres protocolos de voltaje (A. escalonado desde cero mV; B. escalonado desde -60 mV; C. escalonado desde -120 mV) y dos intervalos de tiempo (15 minutos (círculos abiertos) y 2 horas (círculos cerrados) ) .

Las Figuras 119 A-D demuestran los resultados de una serie de experimentos de fijación de parches que evaluaron los efectos del fluido generado por electrocinética (por ejemplo, Solas (paneles A. y B.) y RNS-60 (panels C. y D.)) sobre la polaridad de la membrana celular epitelial y la actividad de canal iónico usando diferentes soluciones salinas externas y a diferentes protocolos de voltaje (paneles A. y C. muestran el escalonado desde cero mV; paneles B. y D. muestran el escalonado desde -120 mV) .

Las Figuras 120 A-D muestran, en relación a los experimentos relativos a las Figuras 119 A-D, los gráficos resultantes de la sustracción de los datos corrientes de CsCl (se muestran en la Figura 119) a partir de los datos presentes de CaCl2 20 mM (diamantes) y CaCl2 40 mM (cuadrados llenos) en dos protocolos de voltaje (paneles A. y C. escalonado desde cero mV; B. y D. escalonado desde -120 mV) para Solas (paneles A. y B.) y Revera 60 (paneles C. y D.) .

La Figura 121 A muestra la imagen AFM 1 mm2 para R S60-1 (rns60-l Ipm 3D.jpg). Los picos pequeños ("1") representan nanoburbujas hidrofóbicas que son ~20 nm de ancho y -1.5 nm de altura o más pequeñas.

La Figura 121 B muestra la imagen de 1 mm2 para PNS60-1 (pp60-l lum 3d.jpg). Esta imagen revela los picos ("2") (nanoburbujas hidrofóbicas) que son sustancialmente más grandes (-60 nm de ancho y -5 nm de altura) que aquellas visibles RNS60-1.

La Figura 122 muestra que el fluido por electrocinética de la invención (RHS-60) fue sustancialmente eficaz en un modelo de esclerosis múltiple (MS) en rata con encef lomielitis experimental autoinmune (EAE) reconocido en la técnica La Figura 123 muestra una descripción esquemática de la inducción de EAE y los regímenes de tratamiento usados en el experimento que se muestra en la Figura 122.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Ciertas modalidades divulgadas en este documento se relacionan con proporcionar composiciones y métodos de tratamiento de al menos un síntoma de una enfermedad inflamatoria neurodegenerativa y/o esclerosis múltiple al contactar el sitio o al administrar a un individuo una ¦composición terapeútica que comprende un fluido novedoso generado por electrocinética . En ciertas modalidades específicas, los fluidos generados por electrocinética comprenden el fluido generado por electrocinética enriquecido con gas, que comprende agua enriquecida con oxígeno.

Esclerosis Múltiple y afecciones Ciertas modalidades de este documento se relacionan con composiciones terapeúticas y métodos de tratamiento de un individuo para prevenir o aliviar al menos un síntoma de esclerosis múltiple y/o una enfermedad o afección asociada.

En modalidades adicionales, la presente se relaciona con composiciones terapeúticas y métodos de tratamiento de un individuofor para prevenir o aliviar las complicaciones relacionadas con la esclerosis múltiple y/o una afección asociada, que incluye, por ejemplo, el alivio de los síntomas del deterioro cognitivo.

Fluidos generados por electrocinética : El "fluido generado por electrocinética," como se usa en este documento, se refiere a los candidatos de fluidos generados por electrocinética de la invención generados para los propósitos de los ejemplos de trabajo en este documento, con el dispositivo de mezcla ejemplar descrito en detalle en este documento (veáse también US200802190088 y WO2008/052143 , ambos incorporados en este documento en su totalidad como referencia) . Los fluidos electrocinéticos , como se demostró con los datos divulgados y presentados en este documento, representan fluidos novedosos y fundamentalmente distintos con respecto a la técnica anterior ' a los fluidos no-electrocinéticos , incluyendo los relativos a los fluidos no electrocinéticos oxigenados de la técnica anterior (por ejemplo, los fluidos oxigenados en recipientes presurizados y similares) . Como se divulga en varios aspectos de este documento, los fluidos generados por electrocinética tienen propiedades físicas y biológicas únicas y novedosas que incluyen, pero no se limitan, a las siguientes: En aspectos particulares, el fluido acuoso alterado por electrocinética comprende una solución acuosa iónica de nanoestructuras que contienen oxígeno estabilizadas por carga, con un diámetro promedio de aproximadamente menos que 100 nanómetros y establemente configuradas en el fluido acuoso iónico en una cantidad suficiente para proporcionar al contacto de una célula viva con el fluido, la modulación de al menos el potencial de membrana celular o la conductividad de la membrana celular.

En aspectos particulares, los fluidos generados por electrocinética se refieren a los fluidos generados en presencia de efectos electrocinéticos , localizados, inducidos por hidrodinámica (por ejemplo, no uniformidad en relación al volumen de fluido total), (por ejemplo, pulsos de voltaje/corriente) tales como efectos con dispositivos de función localizada como se describe en este documento. En aspectos particulares, dichos efectos electrocinéticos localizados e inducidos por hidrodinámica se combinan con una capa doble asociada a la superficie y/o con efectos de la corriente de flujo como se divulgan y discuten en este documento .

En aspectos particulares, los fluidos acuosos alterados por electrocinética son adecuados para modular las amplitudes de línea de 13C-RMN de los solutos reporteros (por ejemplo, Trehalosa) disueltos en él. Los efectos en las amplitudes de línea RMN están en el método indirecto de medición, por ejemplo, el soluto (que se mueve' en un fluido de prueba como se describe en este documento en los ejemplos de trabajo particulares .

En aspectos particulares, los fluidos acuosos alterados por electrocinética se caracterizan por al menos una de: diferencias distintivas en el pico voltimétrico de onda cuadrática a uno cualquiera de -0.14V, -0.47V, -1.02V y -1.36V; picos polarográficos a -0.9 voltios,; y ausencia de picos polarográficos a -0.19 y -0.3 voltios, que son únicos para los fluidos generados por electrocinética como se describe en este documento, en los ejemplos de trabajo particulares.

En aspectos particulares, los fluidos acuosos alterados por electrocinética son adecuados para alterar la conductividad de la membrana celular (por ejemplo, una contribución dependiente del voltaje de la conductividad de una célula completa según se midió en los estudios de fijación de parches divulgados en este documento.

En aspectos particulares, los fluidos acuosos alterados por electrocinética son oxigenados, donde el oxígeno en el fluido está presente en una cantidad de al menos 15, ppm, al menos 25 ppm, al menos 30 ppm, al menos 40 ppm, al menos 50 ppm, o al menos 60 ppm de oxigeno disuelto a presión atmosférica. En aspectos particulares, los fluidos acuosos alterados por electrocinética tienen menos que 15 ppm, menos que 10 ppm de oxigeno disuelto a presión atmosférica, o aproximadamente niveles de oxígeno ambiental.

En aspectos particulares, los fluidos acuosos alterados por electrocinética son oxigenados, donde el oxígeno en el fluido está presente en una cantidad entre aproximadamente 8 ppm y aproximadamente 15 ppm, y en este caso algunas veces se refiere en este documento como "Solas" .

En aspectos particulares, el fluido acuoso alterado por electrocinética comprende al menos uno de los electrones solvatados (por ejemplo, estabilizado por la molécula de oxígeno) , y modificado por electrocinética y/o especies de oxígeno cargadas, y donde, en ciertas modalidades, los electrones solvatados y/o modificados por electrocinética o especies de oxígeno cargadas están presentes en una cantidad de al menos 0.01 ppm, al menos 0.1 ppm, al menos 0.5 ppm, al menos 1 ppm, al menos 3 ppm, al menos 5 ppm, al menos 7 ppm, al menos 10 ppm, al menos 15 ppm, o al menos 20 ppm.

En aspectos particulares, los fluidos acuosos alterados por electrocinética son adecuados para alterar la estructura o función de la membrana celular (por ejemplo, la alteración de una conformación, la actividad de unión al ligando, o una actividad catalítica de una proteína asociada a la membrana) suficientes para proporcionar la modulación de la señal de transducción intracelular , donde en aspectos particulares, la . proteína que se asocia a la membrana comprende al menos uno seleccionado del grupo consistente de receptores, receptores de transmembrana (por ejemplo, el receptor acoplado a la proteína G (GPCR) , receptor TSLP, receptor beta 2 adrenérgico, receptor de la bradiquinina, entre otros) , proteínas de canales iónicos, proteínas de anclaje intracelular, proteínas de adherencia celular, e integrinas . En ciertos aspectos, el receptor acoplado a la proteína G (GPCR) efectúa la interacción con una subunidad de la proteína G (por ejemplo, Ga3, GOÍÍ, Gaq, y G i2) .

En aspectos particulares, los fluidos acuosos alterados por electrocinética son adecuados para modular la señal de transducción intracelular, que comprende la modulación de un sistema o vía del mensajero celular dependiente de calcio (por ejemplo, la modulación de la actividad de la fosfolipasa C, o la modulación de la actividad de la adenilato ciclasa (AC) ) .

En aspectos particulares, los fluidos acuosos alterados por electrocinética se caracterizan por varias actividades biológicas (por ejemplo, la regulación de citoquinas, receptores, enzimas y otras proteínas y vías de señalización intracelular) descritas en los ejemplos de trabajo y en otras partes de este documento.

En aspectos particulares, los fluidos acuosos alterados por electrocinética exhiben sinergia con el acetato de glatiramer, interferon- ß, mitoxantrona, y/o natalizumab. En aspectos particulares, los fluidos acuosos alterados por electrocinética reducen la expresión del receptor TSLP inducido por DEP en células epiteliales bronquiales (BEC) , como se muestra en los ejemplos de trabajo de este documento.

En aspectos particulares, los fluidos acuosos alterados por electrocinética inhiben los niveles de MMP-9 unidos a la superficie celular inducidos por DEP en las células epiteliales bronquiales (BEC) , como se muestra en los ejemplos de trabajo de este documento.

En aspectos particulares, los efectos biológicos de los fluidos acuosos alterados por electrocinética se inhiben por la toxina diftérica, lo que indica que los betabloqueadores , los bloqueadores GPCR y el bloqueador del canal de Ca afectan la actividad de los fluidos acuosos alterados por electrocinética (por ejemplo, sobre la función de la célula T reguladora), como se muestran en los ejemplos de trabajo de este documento.

En aspectos particulares, los efectos físicos y biológicos (por ejemplo, la capacidad para alterar la función o estructura de la membrana celular suficiente para proporcionar la modulación de la señal de transducción intracelular) , de los fluidos acuosos alterados por electrocinética persisten durante al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco, al menos 6 meses, o por periodos más largos, en un recipiente cerrado (por ejemplo, un recipiente de gas herméticamente cerrado) .

Por consiguiente, los aspectos adicionales proporcionan dichas soluciones generadas por electrocinética y los métodos para la producción de un fluido o solución acuosa oxigenada alterada por electrocinética, que comprenden: proporcionar un flujo de un material fluido entre dos superficies espaciadas en movimiento relativo y definir un volumen de mezcla entre ellas, en donde el tiempo de permanencia de un sólo pase del material fluido que fluye dentro y a través del volumen de mezcla es mayor que 0.06 segundos o mayor que 0.1 segundos; e introducir oxígeno (02) en el material fluido que fluye dentro del volumen de mezcla bajo condiciones adecuadas para disolver al menos 20 ppm, al menos 25 ppm, al menos 30, al menos 40, al menos 50, o al menos 60 ppm de oxígeno en el material, y alterar el fluido o solución por electrocinética . En ciertos aspectos, el oxígeno se infunde en el material en menos de 100 milisegundos , menos de 200 milisegundos , menos de 300 milisegundos, o menos de 400 milisegundos. En modalidades particulares, la relación del área superficial al volumen es de al menos 12, al menos 20, al menos 30, al menos 40, o al menos 50.

Aún en aspectos adicionales, se proporciona un método para producir un fluido o solución acuosa oxigenada alterada por electrocinética, que comprende: suministrar un flujo de un material fluido entre dos superficies espaciadas que definen un volumen de mezcla entre ellas; e introducir oxígeno en el material que fluye dentro del volumen de mezcla bajo condiciones adecuadas para infundir al menos 20 ppm, al menos 25 ppm, al menos 30, al menos 40, al menos 50, o al menos 60 ppm de oxígeno en el material en menos de 100 milisegundos , menos de 200 milisegundos , menos de 300 milisegundos , o menos de 400 milisegundos. En ciertos aspectos, el tiempo de permanencia del material que fluye dentro del volume de mezcla es mayor que 0.06 segundos o mayor que 0.1 segundos. En modalidades particulares, la relación del área superficial al volumen es al menos 12, al menos 20, al menos 30, al menos 40, o al menos 50.

Las modalidades adicionales proporcionan un método de producción de un fluido o solución acuosa oxigenada alterada por electrocinética, que comprende el uso de un dispositivo de mezcla para crear una mezcla de salida al mezclar un primer material y un segundo material, el dispositivo comprende: una primera cámara configurada para recibir el primer material de una fuente de primer material; un estator; un rotor que tiene un eje de rotación, el rotor se dispone dentro del estator y se configura para girar en torno al eje de rotación, al menos uno del rotor y estator tiene una pluralidad de agujeros de paso; una cámara de mezcla definida entre el rotor y el estator, la cámara de mezcla está en comunicación fluida con la primera cámara y configurada para recibir el primer material, y el segundo material se proporciona a la cámara de mezcla a través de la pluralidad de agujeros de paso formados en uno del rotor y del estator; una segunda cámara en comunicación fluida con la cámara de mezcla y configurada para recibir el material de salida; y una primera bomba interna situada dentro de la primera cámara, la primera bomba interna está configurada para bombear el primer material desde la primera cámara a la cámara de mezcla. En ciertos aspectos, la primera bomba interna se configura para impartir una velocidad circunferencial en el primer material antes de que entre a la cámara de mezcla.

Las modalidades adicionales proporcionan un método para producir un fluido o solución acuosa oxigenada alterada por electrocinética, que comprende el uso de un dispositivo de mezcla para crear una mezcla de salida al mezclar un primer material y un segundo material, el dispositivo comprende: un estator; un rotor que tiene un eje de rotación, el rotor se dispone dentro del estator y se configura para girar en torno al eje de rotación; una cámara de mezcla definida entre el rotor y el estator, la cámara de mezcla tiene un primer extremo abierto a través del cual entra el primer material a la cámara de mezcla y un segundo extremo abierto a través del cual sale el material de salida de la cámara de mezcla, el segundo material entra a la cámara de mezcla a través de al menos uno del rotor y el estator; una primera cámara en comunicación con al menos una porción mayoritaria del primer extremo abierto de la cámara de mezcla; y una segunda cámara en comunicación con el segundo extremo abierto de la cámara de mezcla.

Los aspectos adicionales proporcionan un fluido o solución acuosa oxigenada, alterada por electrocinética, obtenidos de acuerdo con cualquiera de los métodos anteriores .

Inflamación La inflamación puede ocurrir como una respuesta defensiva a la invasión del individuo por material extraño, en particular de origen microbiano. Además, el trauma mecánico, las toxinas, y la neoplasia pueden inducir respuestas inflamatorias. La acumulación y posterior activación de los leucocitos, son eventos centrales en la patogénesis de la mayoría de las formas de inflamación. Las deficiencias en la inflamación pueden comprometer al huésped, dejándolo susceptible al empeoramiento de la infección o trauma. La inflamación excesiva, tal como la respuesta inflamatoria prolongada, puede conducir a enfermedades inflamatorias, que incluyen, pero no se limitan a, la diabetes, arteriosclerosis, cataratas, trastornos crónicos de la piel, daño por perfusión, y cáncer, a síndromes post-infecciosos como la meningitis infecciosa, fiebre reumática, y a enfermedades reumáticas tales como lupus eritematoso sistémico y artritis reumatoide. Estas enfermedades afectan a millones de personas de todo el mundo cada año, y conducen a una morbilidad y mortalidad aumentada. La concepción común de la respuesta inflamatoria en estos diferentes procesos de enfermedad hacen de su regulación un elemento trascendental en la prevención o el tratamiento de las enfermedades humanas .

La sobreproducción de citoquinas pro- inflamatorias se ha implicado en la patogenésis de numerosas enfermedades inflamatorias y autoinmunes. La secreción de TNF es un evento primario en el inicio de la cascada inflamatoria (Brennan F. M. , y otros, Lancet, 1989, 2:244-7; Haworth C, y otros, Eur. J. Im unol . 1991, 21:2575-2579) y contribuye directamente al inicio y mantenimiento de estas enfermedades . Otras citoquinas también juegan un papel, incluyendo la interleuquina 1ß (IL-?ß), IL-6, IL-8, IL-12, el óxido nítrico (NO) , IFN-?, factor estimulante de la colonia de granulocito (G-CSF) , factor estimulante de la colonia de granulocito macrófago (GM-CSF) , e IL-10. Algunas de estas citoquinas (por ejemplo IL-8) pueden aumentar o exacerbar una respuesta inflamatoria, mientras otras (por ejemplo IL-10) pueden disminuir o alivar la respuesta inflamatoria.

Las células del sistema inmune, los macrófagos, en particular, secretan muchas de estas citoquinas en respuesta al estímulo de activación. Las células dianas de las citocinas se puede localizar en cualquier compartimento del cuerpo y pueden actuar mediante mecanismos de larga distancia, o pueden actuar en las células vecinas. De ese modo, las citoquinas pueden regular la inflamación de una forma localizada o sistémica.

Metaloproteinasas Las metaloproteinasas son una superfamilia de proteinasas (enzimas) clasificadas en familias y subfamilias como se describe, por ejemplo, en N. M. Hooper FEBS Letters 354:1-6, 1994. Los ejemplo de mataloproteinasas incluyen las metaloproteinasas de la matriz (M P) tales como las colagenasas (MMP1, MMP8 , MMP13) , gelatinasas (MMP2, MMP9) , estromielinas (MMP3, MMP10, MMP II), matrilisina (MMP7), metaloelastasa (MMP12), enamelisina (MMP19) , MT-MMP (MMP14 , MMP15, MMP16, MMP17); reprolisina o adamalisina o la familia MDC la cual incluye las secretasas y shedasas tales como las enzimas de conversión del TNF (ADAM10 y TACE) ; la familia astacina que incluye las enzimas tales como la proteinasa que procesa el procolágeno (PCP) ; y otras metaloproteinasas tales como agrecanasa, la familia de la enzima de conversión de la endotelina y la familia de la enzima de conversión de la angiotensin . En conjunto, las metaloproteinasas se conocen por clivar un amplio intervalo de sustratos matrices tales como colágeno, proteoglicano y fibronectina . Las metaloproteinasas se implican en el proceso, o secreción de mediadores celulares de importancia biológica, tales como el factor de necrosis tumoral (TNF) ; y el proceso de proteolisis post-traduccional , o pérdida de proteínas de membrana de importancia biológica, tales como el CD23 receptor de baja afinidad para la IgE (veáse, por ejemplo, N. M. Hooper y otros, Biochem. J. 321:265-279, 1997).

Sin ser una sorpresa, se cree, por lo tanto, que las metaloproteinasas son importantes en muchos procesos fisiológicos de enfermedades que involucran la remodelación del tejido (por ejemplo, el desarrollo embrionario, la formación ósea, la remodelación uterina durante la menstruación, etc.) . Además, la inhibición de la actividad de una o más metaloproteinasas bien puede ser de beneficio en estas enfermedades o afecciones, por ejemplo: diferentes enfermedades inflamatorias y alérgicas tales como, la inflamación de las articulaciones (en especial la artitris reumatoide, la osteoartritis y la gota) , la inflamación del tracto gastro-intestinal (en especial la enfermedad inflamatoria intestinal, la colitis ulcerativa y la gastritis) , la inflamación de la piel (en especial la soriasis, el eczema, la dermatitis); en la metástasis o invasión del tumor,- en las enfermedades asociadas con la degradación descontrolada de la matriz extracelular tales como la osteoartritis; en la enfermedad resortiva ósea (tales como la osteoporosis y la enfermedad de Paget) ; en las enfermedades asociadas con la angiogénesis aberrante; la remodelación mejorada del colágeno asociada con la diabetes, la enfermedad periodontal (tal como la gingivitis) , la úlcera de córnea, la ulceración de la piel, las afecciones post-operatorias (tal como la anastomosis de colón) y la cicatrización de heridas dérmicas; las enfermedades de desmielinización de los sistemas nervioso central y periférico (tal como la esclerosis múltiple) ; la enfermedad de Alzheimer; la remodelación de la matriz extracelular observada en las enfermedades cardiovasculares tales como la restenosis y la aterosclerosis ; el asma; la rinitis; y las enfermedades crónicas de obstrucción pulmonar (COPD) .

La MMP12, también conocida como la elastasa o metaloelastasa del macrófago, se clonó inicialmente en el ratón (Shapiro y otros, Journal of Biological Chemistry 267: 4664, 1992) y se clonó en el hombre por el mismo grupo desde 1995. La MMP12 se expresa, preferentemente, en macrófagos activados, y se ha mostrado que pueden ser secretadas de los macrófagos alveolares de fumadores (Shapiro y otros, 1993, Journal of Biological Chemistry, 268: 23824) así como en las células espumosas , de las lesiones ateroescleróticas (Matsumoto y otros, Am. J. Pathol . 153: 109, 1998). Un modelo de COPD en ratón se basó en el reto de los ratones con humo de cigarro durante seis meses, dos cigarros al día, seis días a la semana. Los ratones de tipo salvaje desarrollaron efisema pulmonar después de este tratamiento. Cuando las MMP12 se probaron en ratones nuligénicos en este modelo, desarrollaron un efisema no significativo, lo que indica fuertemente que la MMP12 es una enzima clave en la patogénesis de COPD. El papel de las MMP tal como la MMP12 en COPD (efisema y bronquitis) se discutió por Anderson y Shinagawa, 1999, Current Opinión in Anti-inflammatory and Immunomodulatory Investigational Drugs 1(1): 29-38. Recientemente se descubrió que fumar aumenta la infiltración de macrófago y la expresión de MMP- 12 derivada de macrófago en las placas de la arteria carótida humana ( atetzky S, Fishbein C y otros Circulation 102: (18), 36-39 Suppl . S, Oct . 31, 2000) .

La MMP9- (Gelatinasa B; Colagenasa Tipo IV de 92 kDa; Gelatinasa de 92 kDa) es una proteína secretada que primero se purificó, después se clonó y secuenció, en 1989 (S. M. Wilhelm y otros, J. Biol . Chem. 264 (29): 17213-17221, 1989; fé de erratas publicadas en J. Biol. Chem. 265 (36): 22570, 1990) (para la revisión de información detallada y referencias de esta proteasa veáse T. H. Vu & Z . Werb (1998) (En: Matrix Metalloproteinases , 1998, editado por W. C. Parks & R. P. Mecham, págs . 115-148, Academic Press. ISBN 0-12-545090-7) . La expresión de la MMP9 se limita normalmente a pocos tipos de células, que incluyen trofoblastos , osteoclastos , neutrófilos y macrófagos (Vu & Werb, arriba) . Sin embargo, la expresión se puede inducir en estas mismas células y en otros tipos de células mediante diferentes mediadores, incluyendo la exposición de las células a los factores de crecimiento y citoquinas . Estos son los mismos mediadores que con frecuencia se implican en el inicio de la respuesta inflamatoria. Como con otras MMP secretadas, la MMP9 se libera como una Pro-enzima inactiva, que es posteriormente clivada para formar la enzima enzimáticamente activa. Las proteasas requeridas para la activación in vivo se desconocen. El balance de la MMP9 activa contra la enzima inactiva se regula, además, in vivo, mediante la interación con el TIMP-1 (inhibidor' tisular de metaloproteinasas-1) , un proteína de origen natural. El TIMP-1 se une a la región C-terminal de la M P9, conduciendo a la inhibición del dominio catalítico de la M P9. El balance de la expresión inducida de la ProMMP9, el clivaje de la MMP9 de la forma Pro a la activa y la presencia del TIMP-1 se combinan para determinar la cantidad de MP9 catalíticamente activa que está presente en un sitio localizado. La MMP9 proteolíticamente activa ataca los sustratos que incluyen la gelatina, la elastina, y los colágenos nativos Tipo IV y Tipo V; no tiene actividad contra el colágeno Tipo I nativo, proteoglicanos o lamininas . Existe un número creciente de datos que implican los papeles de la MMP9 en diversos procesos fisiológicos y patológicos. Los papeles fisiológicos incluyen la invasión de los trofoblastos embrionarios a través del epitelio uterino en las etapas tempranas de implantación embrionaria; algún papel en el crecimiento y desarrollo de los huesos; y la migración de células inflamatorias de la vasculatura en los tejidos.

La liberación de la MMP9, medida usando un inmunoensayo enzimático, mejoró significamente en los fluidos y en los sobrenadantes de AM de los asmáticos no tratados comparado con aquellos de otras poblaciones (Am. J. Resp. Cell & Mol. Biol . , 5:583-591, 1997). También, se observó que en ciertas otras afecciones patológicas, aumentó la expresión de MMP9, implicando así la MMP9 en procesos de enfermedades tales como la COPD, artritis, metástasis de tumor, enfermedad de Alzheimer, esclerosis múltiple, y ruptura de placa en la aterosclerosis que conducen a afecciones coronarias agudas tales como el infarto del miocardio (veáse también WO07087637A3 , incorporado en este documento en su totalidad como referencia) .

Recientemente, se demostró que los niveles de la MMP-9 aumentaron significativamente en los pacientes con asma estable, e incluso más altos en pacientes con asma aguda en comparación con individuos saludables como control. La MMP-9 juega un papel crucial en la infiltración de las células inflamatorias de las vías respiratorias y la inducción de hipersensibilidad de las vías respiratorias, indicando que la MMP-9 puede tener un papel importante en la inducción y el mantenimiento del asma (Vignola y otros, Sputum metalloproteinase- 9/tissue inhibitor of metalloproteinase- 1 ratio correlates with airflow obstruction in asthma and chronic bronchitis, Am J Respir Crit Care Med 158:1945-1950, 1998; Hoshino y otros, Inhaled corticosteroids decrease subepithelial collagen deposition by modulation of the balance between matrix metalloproteinase- 9 and tissue inhibitor of metalloproteinase-1 expression in asthma, J Allergy Clin Immunol 104:356-363, 1999; Simpson y otros, Differential proteolytic enzyme activity in eosinophilic and neutrophilic asthma, Am J Respir Crit Care Med 172:559-565,2005; Lee y otros, A murine model of toluene diisocyanate-induced asthma can be treated with matrix metalloproteinase inhibitor, J Allergy Clin Immunol 108:1021-1026, 2001; y Lee y otros, Matrix metalloproteinase inhibitor regulates inflammatory cell migration by reducing ICAM-1 and VCAM-1 expression in a murine model of toluene diisocyanate-induced asthma, J Allergy Clin Immunol 2003;111:1278-1284).

Inhibidores de MMP: Se conoce un número de inhibidores de metaloproteinasas (veáse, por ejemplo, las revisiones de los inhibidores de MMP hecha por Beckett R. P. y Whittaker . , 1998, Exp. Opin. Ther. Patents, 8 (3) : 259-282 ; y por Whittaker M. y otros, 1999, Chemical Reviews 99 (9) : 2735-2776) . WO 02/074767 divulga los derivados de hidantoina de la fórmula que son útiles como inhibidores de MMP, en particular, como inhibidores potentes de MMP12. La solicitud de patente de los Estados Unidos núm. serie 11/721,590 (publicada como 20080032997) divulga otro grupo de derivados de hidantoína que son inhibidores de las metaloproteinasas y son de interés particular en la inhibición de las MMP tales como MMP12 y MMP9. Los nuevos derivados de triazolona para la inhibición de las MMP tales como MMP12 y MMP9 se divulgan en la solicitud de patente de los Estados Unidos núm. serie 10/593543 (publicada como 20070219217) . Los inhibidores adicionales de MMP12 y MMP9 se divulgan en 11/509,490 (publicada como 20060287338) (veáse también 10/831265 (publicada como 20040259896) ) .

Ejemplos adicionales de inhibidores de MMP se resumen en la Tabla 1 a continuación: Tabla 1. Ejemplos de Inhibidores de la Metaloproteinasa de la Matriz (MMP) (por ejemplo, obtenidos de EMD Biosciences) . 10 15 5 10 15 10 1 5 5 10 15 5 15 15 15 5 10 15 5 10 15 5 10 15 5 10 15 5 10 15 5 10 15 5 10 5 15 5 10 15 5 10 15 5 10 15 5 10 15 5 10 15 5 15 15 5 10 15 Los Titulada BIPHENYL compuestos de SULFONAMIDES USEFUL la patente de AS MATRIX los Estados METALLOPROTEINASE Unidos núm. INHIBITORS, 6, 686, 355, publicada por incorporada a Barvian y otros, el este 3 de febrero de documento 2004 como referencia 5 10 15 5 10 5 10 5 15 5 10 15 5 10 15 Además, se mostraron dos componentes, 4- (4-fenoxifenilsulfonil) utano-1, 2-ditiol (1) y 5- (4-fenoxifenilsulfpnil) pentano-1 , 2 -ditiol (2), para unir selectivamente e inhibir potentemente la MMP-2 y MMP-9 (Bernardo, y otros, (2002) J. Biol . Chem. 277:11201-11207). Estos dos compuestos pueden tener un uso significativo en la clínica para inhibir la MMP-2 y -9 y por lo tanto disminuir la inflamación. Además, se mostró el uso de ciertos antibióticos de tetraciclina (por ejemplo, Minociclina y Doxiciclina) a niveles sub-antibióticos para inhibir eficazmente la actividad de MMP. Ciertos aspectos de esta invención incluyen el uso de los fluidos de la invención en combinación con los niveles sub-antibióticos útiles para inhibir la MMP.

Métodos de Tratamiento El término "tratar" se refiere a, e incluye, revertir, aliviar, inhibir el proceso de, o prevenir una enfermedad, alteración o afección, o de uno o más síntomas de ésta; y "tratamiento" y "terapéuticamente" se refiere a la acción de tratar, como se define en este documento.

Una "cantidad terapéuticamente eficaz" es cualquier cantidad de cualquiera de los compuestos utilizados en el transcurso de la práctica de la invención proporcionados en este documento, que es suficiente para revertir, aliviar, inhibir el proceso de, o prevenir una enfermedad, trastorno o afección, o uno o más síntomas de ésta Ciertas modalidades de este documento se refieren a las composiciones terapéuticas y a los métodos de tratamiento para un sujeto mediante la prevención o el alivio de al menos un síntoma de inflamación asociado con ciertas afecciones o enfermedades, como la enfermedad neurodegenerativa inflamatoria. Por ejemplo, las composiciones terapéuticas y/o los métodos descritos en este documento pueden ser útiles para el tratamiento o prevención de una o más afecciones o enfermedades seleccionadas del grupo que consiste en esclerosis múltiple (MS) , enfermedad de Parkinson, amiloidosis (por ejemplo la enfermedad de Alzheimer) , la esclerosis lateral amitrófica (ALS) , las enfermedades de priones, y la demencia asociada a HIV.

Muchas de las afecciones o enfermedades asociadas con la inflamación se han tratado con esteroides, metotrexato, fármacos inmunosupresivos que incluyen la ciclofosfamida, la ciclosporina, la azatioprina y la leflunomida, agentes antiinflamatorios no esteroideos tales como la aspirina, el acetaminofen y los inhibidores de COX-2, agentes de oro y tratamientos anti-malaria . Estos fármacos tienen una variedad de desventajas, y reacciones adversas incluyendo las reacciones en el sitio de inyección, erupción, infecciones respiratorias superiores, trastornos autoinmunes y susceptibilidad aumentada a las infecciones. Además, muchos fármacos anti-inflamatorios requieren de la administración por vía intravenosa (IV) o subcutánea (SC) , a diferencia de las rutas oral y dérmica tópica, más convenientes y adaptables. En consecuencia, existe aún una necesidad de desarrollar nuevos medicamentos y métodos de tratamiento para las afecciones y enfermedades que se relacionan con la inflamación.

Los tratamientos actuales para MS incluyen el acetato de glatiramer, el interferón- ß , la mitoxantrona, y el natalizumab. El acetato de glatiramer está compuesto por ácido glutámico, lisina, alanina, y tirosina como un polímero al azar. El acetato de glatiramer tiene eficacia limitada y efectos secundarios significativos, por ejemplo, abultamiento en el sitio de la inyección, escalofríos, fiebre, dolor, dificultad para respirar, latidos rápidos del corazón y ansiedad. En un importante estudio clínico usando 943 pacientes con MS primaria progresiva, el acetato de glatiramer falló al detener el progreso de la discapacidad y la enfermedad (Wolinsky, y otros, (2007) Ann Neurol 61:13-24) .

El Interferón-ß es una proteína de origen natural que se produce por los fibroblastos y es parte de la respuesta inmune innata. Como un fármaco para la MS, el interferón-ß es aproximadamente de 18 a 38% eficaz en la reducción de la tasa de los episodios de la MS . Los efectos secundarios incluyen síntomas similares al de una gripe ligera y las reacciones en el sitio de la inyección y algunos más serios (por ejemplo, depresión, ataques, y problemas del hígado) .

La mitoxantrona es un tratamiento para la MS . Ésta se desarrolló como un tratamiento de quimioterapia para usar en el combate contra el cáncer. Trabaja por la interferencia con la reparación y la síntesis del ADN y no es específica para las células cancerígenas . Los efectos secundarios de la mitoxantrona pueden ser completamente graves e incluyen náusea, vómitos, pérdida del cabello, daño del corazón, e inmunosupresión .

El natalizumab es un anticuerpo monoclonal humanizado que acciona a la alfa 4-integrina, que es una molécula de adhesión celular. Se cree que el natalizumab trabaja cuidando que las células inmunes que causan la inflamación crucen la barrera hematoencef lica (BBB) . Los efectos secundarios incluyen fatiga, dolor de cabeza, náusea, resfríos, y reacciones alérgicas.

En general, estos fármacos suprimen el sistema inmune en un modo no específico y solo limitan ligeramente la progresión global de la enfermedad. (Lubetzki y otros, (2005), Curr. Opin. Neurol . 18:237-244). De ese modo, existe una necesidad de desarrollar estrategias terapéuticas para mejorar el tratamiento de la MS .

Terapia de combinación: Aspectos adicionales proporcionan los métodos de esta invención descritos en este documento, que comprenden, además, la terapia de combinación, en donde al menos un agente terapéutico adicional se administra al paciente. En ciertos aspectos, el al menos agente terapéutico adicional se selecciona del grupo que consiste en el acetato de glatiramer, interferón-ß, mitoxantrona, y natalizumab y/o los inhibidores de las MMP como se mostró anteriormente en la Tablal .

Actividad anti-inflamatoria de soluciones y fluidos enriquecidos con gas generados por electrocinética : De acuerdo con ciertos aspectos de la presente invención, los fluidos y soluciones enriquecidos con gas, descritos en este documento, tienen efectos y propiedades anti-inflamatorias y se pueden usar como agentes antiinflamatorios para el tratamiento de sujetos afligidos por enfermedades o trastornos relacionados con la neurodegeneracion inflamatoria. La Figura 38 muestra los resultados experimentales de los perfiles de citoquinas en linfocitos estimulados de un donante de sangre saludable. Como se puede obsevar en la Figura 38, el fluido (agua) enriquecido con oxígeno de esta invención afectó una regulación descendente de citoquinas particulares, en especial, IL-6, IL-8, y IL-1 ß.

La producción aumentada de las citoquinas pro-inflamatorias se ha implicado en la patogénesis de numerosas enfermedades inflamatorias y autoinmunes . La secreción de TNFOÍ es un evento primario en la iniciación de la cascada inflamatoria (Brennan F. M. , y otros, Lancet, 1989, 2:244-7; Haworth C, y otros, Eur. J. Inmuno1. 1991, 21:2575-2579) y contribuye directamente a la iniciación y el mantenimiento de las enfermedades inflamatorias y autoinmunes . Otras citoquinas pro- inflamatorias también juegan un papel, incluyendo la interleuquina 1ß (IL-?ß), IL-6, IL-8, IL-12, Óxido nítrico, IFN-? y GM-CSF, mientras que citoquinas anti-inflamatorias tales como IL-10 pueden reducir la enfermedad. Las células del sistema inmune, los macrófagos en particular, secretan muchas de estas citoquinas en respuesta al estímulo de activación.

Una variedad de tipos de células están involucradas en el proceso inflamatorio. La sobreproducción de TNFOÍ por los monocitos, los macrófagos y otras células inmunológicas es un elemento clave en la patogénesis de una multitud de enfermedades. Los macrófagos y las células T en particular, juegan un papel central en la iniciación y el mantenimiento de la respuesta inmune. Una vez activados por el estímulo patológico o inmunológico, los macrófagos responden mediante la liberación de un montón de citoquinas, que incluyen TNF-a, IL-?ß, IL-8, IL-12, óxido nítrico (NO), IL-6, GM-CSF, G-CSF, M-CSF y otras. Las células T liberan IL-2, IL-4, INF-?, y otras citoquinas inflamatorias. Estas citoquinas activan otras células inmunológicas y algunas también se pueden activar como agentes citotóxicos independientes. La liberación excesiva de mediadores inflamatorios derivados del macrófago y la célula T pueden, en particular, conducir al daño de las células normales y los tejidos circundantes.

Las citoquinas pro- inflamatorias se han implicado en el HIV-sida, y otras infecciones virales que incluyen los citomegalovirus , el virus de la influenza, y la familia de los herpes virus. El TNFa mejora la actividad basal del promotor/intensificador principal inmediato y precoz del citomegalovirus humano y puede jugar un papel en la reactivación de la infección latente de HCMV en las células premonocíticas (Prosch S., y otros, Virology 1995, 208:197-206) .

Además, un número de citoquinas inflamatorias contribuye a la mortalidad en pacientes que sufren de sepsis o shock endotóxico. Por ejemplo, la TNFa y la IL-?ß tienen bien establecido el papel central en la sepsis, shock séptico y shock endotóxico. Los niveles aumentados de estas citoquinas se asocian con la fiebre, hipotensión y shock (Smith J. W. y otros, J". Clin. Oncol . 1992, 10:1141-1152; Chapman P. B., et . al. J". Clin. Oncol. 1987, 5:1942-1951) junto con la inducción de la expresión génica para la fosfolipasa A2 (Gronich J.( y otros,. J. Clin. Invest. 1994, 93:1224-1233) y la NO sintasa.

La inducción de NO en las células de músculo liso media la disminución de la presión arterial media y la resistencia vascular sistémica durante el shock séptico, lo que sugiere un papel fundamental para la NO. De este modo, las terapias que accionan los efectos de subregulación sobre IL-8, IL-?ß, y NO podrían ser beneficiosas en el tratamiento de las enfermedades y trastornos inflamatorios, que incluyen la sepsis, el shock séptico y el shock endotóxico.

La sobreproducción de TNFOÍ contribuye a las características de numerosas enfermedades autoinmunes tales como diabetes y artritis reumatoide . El lupus eritematoso sistémico (SLE) también se precipita por el aumento de los niveles de IL-?ß y TNF . Entre los pacientes con lupus, los niveles de la proteína C reactiva sérica, la IL-lbeta y el TNFa fueron más altos que en los controles, lo que sugiere que un aumento de la respuesta inflamatoria juega un papel en la enfermedad (Liou L. B. Clin. Exp. Rheumatol . 2001, 19:515-523) . Un estudio en pacientes con una forma de SLE, el lupus eritematoso neurosiquiátrico (NPLE) , mostró que el número de células periféricas mononucleares sanguíneas que expresan el ARNm para TNFa, así como el nivel de metabolitos de NO en el fluido cerebroespinal, se correlacionaron con la enfermedad grave de NPLE (Svenungsson E., y otros, Ann. Rheum. Dis. 2001, 60 : 372-9) .

La IL-1 y el TNFcx juegan un papel central en diversas respuestas agudas así como crónicas, en los modelos de animales. Además, la IL-11, 1 IFNa y el ???ß también pueden regular ascendentemente las reacciones inflamatorias. Inversamente, varias citoquinas se pueden involucrar en la regulación descendente de las respuestas inflamatorias (es decir, IL-4, IL-10, IL-13, entre otras). Como se expuso en el Ejemplo 1, las células que contactaron el fluido enriquecido con gas de la invención mostraron un aumento en los niveles de IFN-? con el antígeno T3 que en el medio de cultivo control con el antígeno T3 , mientras que la IL-8 fue menor en el medio de cultivo enriquecido con gas de la invención con el antígeno T3 que en el medio de cultivo control con el antígeno T3. Además, los niveles de IL-6, IL-8, y TNF-OÍ fueron menores en los medios enriquecidos con gas de la invención con PHA, que en los medios controles con PHA, mientras que los niveles de IL-?ß fueron menores en el fluido enriquecido con gas de la invención con PHA que cuando se compararon con el medio control con PHA. En el medio enriquecido con gas de la invención solo, los niveles de IFN-? fueron más altos que en el medio control. Estos resultados son consistentes con un microambiente anti-inflamatorio.

La NO se reconoce como un mediador y regulador de las respuestas inflamatorias. Ésta posee propiedades citotóxicas hacia los patógenos, pero también puede tener efectos destructivos en los propios tejidos del individuo (Korhonen y otros, Curr Drug Targets Infla m Allergy 4(4) : 471-9, 2005) . La NO reacciona con la guanilato ciclasa soluble para formar el monofosfato de guanosina cíclico (cGMP) , que media muchos de los efectos de la NO. La NO también puede interactuar con el oxígeno molecular y el anión superóxido para producir las especies reactivas de oxígeno que pueden modificar diversas funciones celulares. Estos efectos indirectos de la NO tienen un papel significativo en la inflamación, donde la NO se produce en altas cantidades por la NO sintasa inducible (iNOS) y las especies reactivas de oxígeno se sintetizan por las células inflamatorias activadas.

La NO se puede producir por los queratinocitos , los fibroblastos, las células endoteliales , y posiblemente otras. Algunas de las acciones vasculares de la NO incluyen la vasodilatación, la inhibición de la adhesión plaquetaria al endotelio vascular, la eliminación de los superóxidos. (Shah y otros, Env. Health Persp. V.-106 (5): 1139-1143.) Además, se ha demostrado que la inhibición de la síntesis de NO retarda la contracción de la herida, altera la organización del colágeno, y altera el espesor de la neoepidermis . (Amadeu y Costa, J. Cutan. Pathol . 33: 465-473, 2006.) La migración de los mastocitos y la angiogénesis en las heridas también se afectan por la inhibición de la NO. (Id.) Sin estar atados a niguna teoría de mecanismo en particular, en ciertas modalidades los fluidos enriquecidos con gas de la invención pueden estar modulando la producción de NO localizada y/o celular, o la degradación, consistente con el espectro de efectos de cicatrización de heridas ilustrados en la sección de Ejemplos descritos en este documento. Debido a las vías variables de regulación, en algunas modalidades, el fluido enriquecido con gas de la invención puede aumentar la producción de NO y/o retardar la degradación de NO, mientras que en otras modalidades, el fluido enriquecido con gas de la invención puede disminuir la producción de NO y/o acelerar la degradación de NO.

Específicamente, las heridas tratadas con la solución salina enriquecida con oxígeno mostró un aumento en la cicatrización de las heridas en los días 4 a 11, y entre los días 3 y 11, la nueva epidermis en las heridas tratadas con la solución salina enriquecida con oxígeno migró de dos a cuatro veces más rápido que la epidermis de las heridas tratadas con la solución salina normal, como se expone en el Ejemplo 9 de este documento. El estudio también mostró que entre los días 15 y 22, las heridas tratadas con la solución salina enriquecida con oxígeno se diferenciaron a una tasa más rápida según se evidenció por la formación más temprana de capas epidérmicas más maduras. En todas las etapas, el engrosamiento que ocurre en la epidermis asociado con la cicatrización normal no ocurrió dentro de las heridas tratadas con la solución salina enriquecida con oxígeno.

De este modo, de acuerdo con este espectro de efectos de cicatrización de heridas, pero sin el deseo de estar atados a ninguna teoría en particular, se cree que la solución salina enriquecida con oxígeno puede modular el nivel de NO localizado y/o celular dentro de las heridas. La NO modula los factores de crecimiento, la deposición del colágeno, la migración de los mastocitos, el engrosamiento epidérmico, y la neovascularización en la cicatrización de las heridas. Además, el óxido nítrico se produce por una enzima inducible que es regulada por el oxígeno.

En el caso de la migración del mastocito, también ocurren diferencias en la migración temprana y tardía para la solución enriquecida con oxígeno. Esto es consistente con lo que se conoce en la técnica relacionado con la inhibición de la síntesis de NO (Amadeu y Costa, J. Cutan Pathol 33: 465-473 , 2006) .

Con referencia ahora a la Figura 41A a 41F, varias ilustraciones comparan los resultados de la cicatrización de heridas en los tejidos epidérmicos porcinos con o sin solución salina enriquecida con oxígeno. Como se puede observar, la cicatrización de la herida control y de la herida que usa la solución salina enriquecida con oxígeno se siguió durante los días 1, 4 y 16.

La Figura 41A describe la cicatrización de heridas para la herida control el día 1. Como se puede observar, la herida muestra engrosamiento epidérmico/dérmico y una pérdida del contorno. La Figura 41B describe la cicatrización de la herida el día 1 para la herida tratada que usa la solución salina enriquecida con oxígeno. La herida muestra el engrosamiento epidérmico/dérmico normal y el contorno normal es típico en una nueva herida.

Con referencia ahora a las Figuras 41C y 41D, se describe la cicatrización de la herida para la herida control el día 4 y la cicatrización de la herida para la herida tratada con la solución salina enriquecida con oxígeno el día 4. Para la herida control descrita en la Figura 41C, la herida muestra una espuela epidérmica de 600 mieras. En la herida tratada con la solución salina enriquecida con oxígeno en la Figura 41D, se describe una espuela epidérmica de 1200 mieras. De este modo, en los primeros 4 días del experimento, la espuela epidérmica creada en la herida tratada que usa la solución salina enriquecida con oxígeno muestra una tasa de crecimiento epidérmico de dos veces aquella de la herida que no se trató con la solución salina enriquecida con oxígeno.

Con referencia ahora a la Figura 41E, se describé la herida control el día 16. La herida muestra la epidermis menos diferenciada con pérdida del contorno epidérmico/dérmico que aquella de la herida tratada con la solución salina enriquecida con oxígeno descrita en la Figura 41F. La Figura 41F muestra la epidermis más diferenciada y el contorno epidérmico/dérmico más normal en la herida.

En las primeras dos fases del proceso inflamatorio, cualquier cuerpo extraño es destruido, por ejemplo, si el cuerpo extraño es un organismo, o el tejido alrededor se afloja, por ejemplo, si es una astilla. En la fase de cicatrización la inflamación comienza a bajar; los patrones vasculares y vasos sanguíneos del individuo se tornan normales otra vez, y comienza la reparación de la herida. Los tres eventos principales en el proceso de reparación son (1) la formación del nuevo tejido conectivo por la proliferación de los fibroblastos; (2) la regeneración del epitelio; y (3) la proliferación de nuevos capilares.

Incluso antes de que baje la inflamación, los fibroblastos comienzan a moverse en el área dañada del tejido normal circundante, donde usualmente existen en una condición inactiva. Éstos migran con un movimiento ameboideo a lo largo de las hebras de la fibrina y se distribuyen a todo lo largo del área de cicatrización. Una vez fijados en la posición del tejido dañado, comienzan a sintetizar el colágeno y secretan esta proteína, que se auto dispone en las fibras. Las fibras se orientan con sus ejes longitudinales en la dirección del estrés máximo. Como los manojos de colágeno crecen firmes, los fibroblastos gradualmente se degeneran y se adhieren estrechamente a los manojos, y el área dañada se transforma en el tejido de la cicatriz.

Simultáneamente con la formación del tejido de la cicatriz, las células epidérmicas intactas en el borde de la herida comienzan a proliferar y a moverse, como una hoja, hacia el centro del área dañada. Como la inflamación baja, surge la necesidad de un suministro directo de sangre, y ocurre la angiogénesis en el sitio de la herida.

La inflamación es un proceso complejo que involucra múltiples tipos de células. Por ejemplo, los mastocitos liberan mediadores que accionan una fase temprana de vasodilatación, acompañada por la separación de las células endoteliales y la exposición de las fibras de colágeno en la capa subendotelial . Las fibras en las hendiduras intracelulares que se forman en los vasos sanguíneos atrapan las plaquetas y accionan la liberación de mediadores desde estas células.

Además de las plaquetas, las fibras de colágeno expuestas también interactúan con las proteínas del plasma que se filtran a través de los poros de la pared dilatada del vaso, incluyedo la activación del factor de la cascada de coagulación sanguínea, la vasodilatación aumentada, la permeabilidad de vaso sanguíneo aumentada, y la quimiotaxis.

Además, la cascada del complemento se puede activar por diversos estímulos: los vasos sanguíneos dañados, las enzimas proteolíticas liberadas por las células dañadas, los componentes de membrana de cualquier bacteria que participa, y los complejos antígeno- nticuerpo . Algunos de los componentes del complemento activados actúan como factores quimiotácticos, responsables del influjo de leucocitos en el área inflamada, mientras que otros facilitan la fagocitosis y participan en la lisis celular.

Además, se cree que las soluciones y los fluidos enriquecido con gas de la invención también pueden regular al menos una citoquina involucrada en al menos un aspecto de la inflamación, la(s) citoquina(s) que incluye (n) , pero no se limita(n) a MAF (factor de activación del macrófago), MMIF (factor de inhibición de la migración del macrófago) , MCF (factor quimiotáctico de macrófago) , LMIF (factor de inhibición de la migración del leucocito) , HRF (factores de liberación de la histamina) , TF (factores de transferencia) , interleuquinas (IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, entre otras), TNF-OÍ , TNF-ß, interferones (IFN-a, IFN-ß, IFN-?, IFN-?, IFN-d, entre otros), G-CSF (factor estimulante de la colonia de granulocitos) , GM-CSF (CSF granulocito-macrófago) , M-CSF (CSF de macrófago) , multi-CSF (IL-3) , factor de crecimiento del fibroblasto (aFGF, bFGF) , EGF (factor de crecimiento epidérmico) , NGF (factor de crecimiento del nervio) , PDGF (factor de crecimiento derivado de plaqueta) , VEGF (factor de crecimiento del endotelio vascular) , factores de crecimiento transformantes (TGF-a, TGF-ß, entre otros) , NAP-2 (proteína 2 activadora de neutrófilo) , PF-4 (factor 4 plaquetario) , tromboglobulina, MCP-1 (proteína 1 quimioatrayente de monocito) , MCP-3, ???-?a, ???-1ß-+ (proteínas inflamatorias de macrófago) , RA TES (quimioquina regulada presumiblemente secretada y expresada bajo la activación normal de T) , HSP (proteínas de choque térmico) , GRP (proteínas reguladas por la glucosa) , ubiquitina, y otras .

De este modo, en ciertas modalidades, los fluidos enriquecidos con gas y/o composiciones terapéuticas pueden aumentar la producción y/o secreción de moléculas anti-inflamatorias o citoquinas o disminuir la degradación de moléculas anti-inflamatorias o citoquinas, y por consiguiente aliviar o prevenir al menos un síntoma de la inflamación y/o de la neurodegeración inflamatoria. En otras modalidades, los fluidos enriquecidos con gas y/o las composiciones terapéuticas de la presente invención pueden disminuir la producción y/o secreción de las moléculas pro- inflamatorias o citoquinas o aumentar la degradación de las moléculas pro-inflamatorias o citoquinas, y por consiguiente aliviar o prevenir al menos un síntoma de la inflamación y/o de la neurodegeración inflamatoria.

Los estudios previos demostraron un papel crítico de anticuerpos anti-MOG en el aumento de la desmielinización y el agravamiento de la EAE (encefalomielitis autoinmune experimental) , en un sistema de modelo animal para el trastorno autoinmune humano de la artritis reumatoide . (Linington, y otros, 1992. J. Neuroimmunol . 40:219-224) . Además, los anticuerpos contra MOG se han implicados en la patogénesis de la esclerosis múltiple (Berger y otros, iV. EngL.J. Med. 2003 Jul 10 ; 349 (2) : 139-45) .

Como se expone en la Figura 48 y el Ejemplo 12, el fluido enriquecido con gas de la presente invención amplifica la respuesta linfocitaria ante un antígeno con el que un animal se cebó anteriormente. Como se indica en la Figura 48, la proliferación linfocitaria fue mayor en respuesta al reto con MOG cuando se cultivó en el fluido reconstituido con el fluido enriquecido con gas de la invención que comprende los electrones solvatados, que cuando se comparó con el fluido oxigenado, comprimido (recipiente presurizado) o el control de fluido desionizado.

Soluciones y fluidos enriquecidos con gas generados; por electrocinética de la invención.

La difusión o enriquecimiento de un fluido con otro puede resultar en una solución o suspensión de los dos fluidos. En particular, el enriquecimiento de un líquido con un gas (por ejemplo, el oxígeno) puede ser beneficioso para ciertas aplicaciones, incluyendo los tratamientos terapéuticos. Como se utiliza en este documento, la palabra "fluido", en general, se puede referir a un líquido, un gas, un vapor, una mezcla de líquidos y/o gases, o cualquier combinación de éstos, para cualquier modalidad divulgada en particular. Además, en ciertas modalidades un "líquido" se puede referir en general a un líquido puro, o puede referirse a un gel, solución, emulsión, fluido, coloide, dispersión o mezcla, así como cualquier combinación de éstos, que pueden variar en viscosidad.

En modalidades particulares descritas en este documento, el gas disuelto comprende el aire ambiental. En una modalidad preferida, el gas disuelto comprende el oxígeno. En otra modalidad, el gas disuelto comprende el óxido nítrico.

Existen varios métodos de líquidos enriquecidos con gas reconocidos en la técnica (tales como el agua enriquecida con oxígeno) . Por ejemplo, un sistema de aireación por turbinas puede liberar aire cerca de un conjunto de aspas que giran, que mezclan el aire o el oxígeno con el agua, o el agua se puede rociar en el aire para aumentar su contenido de oxígeno. Además, otros sistemas en el mercado inyectan aire u oxígeno en el agua y someten el agua y el gas a un vórtice de gran escala. Los niveles de origen natural del oxígeno en el agua no son típicamente más que 10 ppm (partes por millón) , lo cual se considera un nivel de 100% de oxígeno disuelto. Las pruebas con ciertos dispositivos han mostrado que, bajo condiciones ideales, el dispositivo puede alcanzar aproximadamente por encima de unos 20 ppm, o dos veces los niveles naturales de oxígeno del agua. En ciertas modalidades, el nivel de oxígeno puede ser aún más alto.

En ciertas modalidades descritas en este documento, un fluido enriquecido con gas de la presente invención proporciona un beneficio anti-inflamatorio . Ciertas modalidades descritas en este documento se refieren a una composición terapéutica que comprende un fluido enriquecido con gas de la presente invención y, opcionalmente, al menos un agente terapéutico adicional, tal como un producto farmacéutico, un metal, un péptido, un polipéptido, una proteína, un nucleótido, un carbohidrato o proteína glicosilada, una grasa (que incluyen los aceites o las ceras) , u otro agente que previene o alivia al menos un síntoma de una afección o enfermedad asociada con la inflamación .

Además, ciertas modalidades descritas en este documento incluyen las composiciones terapéuticas y métodos relacionados con la inflamación de las heridas. El cuidado de la herida es deseable para mejorar la salud y la apariencia de los tejidos dérmicos subyacentes. Las heridas o daños inducidos, tales como cortes, abrasiones o ampollas; o las inducidas quirúrgicamente, como incisiones quirúrgicas u ostomías, requieren el tratamiento localizado para curar la zona afectada y prevenir más daños dérmicos. Si las heridas no se tratan debidamente, pueden resultar en la irritación dérmica adicional, tal como la inflamación, y pueden resultar en infecciones secundarias y malestar adicional para el individuo .

Las modalidades particulares proporcionadas en este documento se refieren a un fluido terapéutico procesado en el difusor como se define en este documento, que comprende: un material huésped fluido, un material de infusión difundido en el material huésped, y, opcionalmente, al menos un agente terapéutico disperso en el material huésped, donde el material de infusión comprende micro-burbujas de oxígeno en el fluido huésped, donde la mayoría de las micro-burbujas son inferiores a 0.2 mieras, o de preferencia menores que 0.1 mieras de tamaño. En ciertas modalidades, el nivel de oxígeno disuelto en el material huésped de fluido infundido se puede mantener aproximadamente a más de 30 ppm de presión atmosférica por al menos 13 horas. En otras modalidades particulares, el nivel de oxígeno disuelto en el material huésped de fluido infundido se puede mantener a más de 40 ppm de presión atmosférica por al menos 3 horas.

En las modalidades adicionales, el material huésped de fluido infundido comprende, además, una solución salina. En modalidades adicionales, el material huésped de fluido infundido mantiene un nivel de oxígeno disuelto de al menos aproximadamente 20 ppm a aproximadamente 40 ppm durante un período de al menos 100 días, de preferencia al menos 365 días dentro de un recipiente sellado a presión atmosférica. En ciertas modalidades, el material huésped de fluido infundido puede tener un nivel de oxígeno disuelto dé al menos 50 ppm a la presión atmosférica.

En ciertas modalidades, el material huésped de fluido infundido exhibe la dispersión de Rayleigh en un rayo láser que brilla a través del mismo durante un periodo de tiempo seleccionado después que el oxígeno se ha difundido allí.

La Tabla 2 describe diversas mediciones parciales de las presiones tomadas en una cicatrización de herida tratada con una solución salina enriquecida con oxígeno y en muestras de solución salina enriquecida con oxígeno enriquecido con gas de la presente invención.

TABLA 2 MEDICIONES DEL OXIGENO EN EL TEJIDO Detector Z082BO En el aire: 23° C Columna Presión Parcial (mmHg) Bl 32-36 B2 169-200 B3 20-180* B4 40-60 *Profundidad mínima de la herida, mayoría >150, MEDICIONES DEL TAMAÑO DE LA BURBUJA La experimentación se realizó para determinar un tamaño de las burbujas de gas difundidas dentro del fluido por el dispositivo de mezcla 100. Aunque los experimentos no se realizaron para medir directamente el tamaño de las burbujas, se realizaron experimentos que establecieron que el tamaño de la burbuja de la mayoría de las burbujas de gas en el fluido era menor que 0.1 mieras. En otras palabras, los experimentos determinaron un valor umbral de tamaño por debajo del cual caen los tamaños de la mayoría de las burbujas.

Este valor umbral de tamaño o límite de tamaño se estableció por el paso del material de salida 102 formado mediante el procesamiento de un fluido y un gas en el dispositivo de mezcla 100 a través de un filtro de 0.22 y un filtro de 0.1 mieras. En la realización de estas pruebas, un volumen del primer material 110, en este caso, un fluido, y un volumen del segundo material 120, en este caso, un gas, se pasaron a través del dispositivo de mezcla 100 para generar un volumen del material de salida 102 (es decir, un fluido que tiene un gas difuso en él) . Sesenta mililitros del material de salida 102 se vaciaron en una jeringuilla de 60 mi. El nivel de OD del fluido dentro de la jeringuilla se midió después usando una Orion 862a. La Orion 862a es capaz de medir los niveles de OD dentro de un fluido. El fluido dentro de la jeringuilla se inyectó a través de un filtro de 0.22 mieras en un vaso de precipitados de 50 mi. El filtro comprendió el filtro Milipor Millex GP50. Después se midió el nivel de OD del material en el vaso de precipitados de 50 mi. El experimento se realizó tres veces para lograr los resultados descritos en la Tabla 3 a continuación.

Tabla 3. Niveles de OD.

OD DESPUÉS DEL OD EN LA FILTRO DE 0.22 JERINGUILLA MICRAS 2.1 ppm 39.7 ppm 43.4 ppm 42.0 ppm 43.5 ppm 39.5 ppm Como se puede observar, los niveles de OD medidos dentro de la jeringuilla y los niveles de OD medidos dentro del vaso de precipitados de 50 mi no se modificaron drásticamente por el paso del material de salida 102 a través de un filtro de 0.22 mieras. La implicación de este experimento es que las burbujas de gas disueltas dentro del material de salida 102 no son más grandes que 0.22 mieras, de otro modo habría una reducción significativamente mayor en los niveles de OD en el material de salida 102 pasado a través del filtro de 0.22 mieras.

Se realizó una segunda prueba en la que el filtro de 0.1 mieras se sustituyó por el filtro de 0.22 mieras. En este experimento, la solución salina se procesó con el oxígeno en el dispositivo de mezcla 100 y una muestra del material de salida 102 se colectó en un estado sin filtrar. El nivel de OD de la muestra sin filtrar fue de 44.7 ppm. El material de salida 102 se filtró usando el filtro de 0.1 mieras y se colectaron dos muestras adicionales. El nivel de OD de la primera muestra fue de 43.4 ppm. El nivel de OD de la segunda muestra fue de 41.4 ppm. Después, el filtro se retiró y se tomó una muestra final a partir del material de salida 102 sin filtrar. La muestra final tuvo un nivel de OD de 45.4 ppm. Estos resultados fueron consistentes con los observados usando el filtro Millipore de 0.2 mieras. Estos resultados conducen a la conclusión de que existe una reducción insignificante en los niveles de OD del material de salida 102 pasado a través del filtro de 0.1 mieras, lo que proporciona una indicación de que la mayoría de las burbujas en la solución salina procesada no son mayores a 0.1 mieras de tamaño. Los resultados de la prueba del nivel de OD descritos anteriormente se lograron usando la titulación de inkler .

Como se' aprecia en la técnica, la doble capa (interfase) (DL) aparece sobre la superficie de un objeto cuando éste se coloca dentro de un líquido. Este objeto, por ejemplo, podría ser el de una superficie sólida (por ejemplo, las superficies del rotor y el estator), partículas sólidas, burbujas de gas, gotas de líquido o cuerpo poroso. En el dispositivo de mezcla 100, las superficies de las burbujas representan una parte significativa del área de superficie total presente dentro de la cámara de mezcla que puede estar disponible para los efectos electrocinéticos de la doble capa. Por lo tanto, además de los aspectos de área superficial y del tiempo de retención discutidos en otra parte de este documento, los tamaños relativamente pequeños de la burbuja generadas dentro del mezclador 100 en comparación con los dispositivos de la técnica anterior 10, también pueden contribuir, al menos en cierta medida, a los efectos electrocinéticos totales y a las propiedades del fluido de salida divulgadas en este documento. En concreto, en las modalidades preferidas, como es ilustrado por el mezclador 100, todo el gas se introduce mediante aberturas en el rotor (ningún gas se introduce a través de las aberturas del estator. Debido a que el rotor gira a una velocidad alta (por ejemplo, 3.400 rpm) generando fuerzas de corte sustanciales en, y cerca de la superficie del rotor, el tamaño de burbuja de las burbujas introducidas a través, y adyacentes a las aberturas de la superficie del rotor que gira, podría esperarse que sean sustancialmente más pequeñas (por ejemplo, de 2 a 3 veces más pequeñas) que las introducidas a través de, y cerca del estator estático. El tamaño de burbuja promedio del dispositivo de la técnica anterior 10 puede ser, por lo tanto, sustancialmente más grande, porque por lo menos la mitad del gas se introduce en la cámara de mezcla desde las aberturas del estator estático. Debido a que el área superficial de una superficie esférica varía con r2, cualquier componente de burbuja del área de superficie electrocinética del dispositivo de mezcla 100 puede ser sustancialmente mayor que aquel del dispositivo de difusión de la técnica anterior 10.

Por lo tanto, sin estar atados por la teoría, no sólo la cámara de mezcla del dispositivo de mezcla 100 tiene (i) una superficie substancialmente superior a la relación de volumen que la del dispositivo de la técnica anterior 10 (el dispositivo de la técnica anterior 10 tiene una relación de superficie a volumen de 10.9, mientras que el mezclador presente 100 tiene una relación de superficie a volumen de 39.4), junto con (ii) un tiempo de permanencia 7 veces mayor, pero (iii) las propiedades únicas de las soluciones de salida correintes pueden reflejar, adicionalmente , una contribución del área de superficie de la burbuja sustancialmente más grande en el dispositivo de mezcla 100. Estos aspectos distintivos reflejan características distintivas del presente mezclador 100, y es probable que cada uno contribuya a las propiedades electrocinéticas únicas de los materiales/fluidos de salida de la invención.

Con referencia ahora a la Figura 30, se ilustran los niveles de OD en el agua enriquecida con oxígeno en el dispositivo de mezcla 100 y almacenados una botella plástica con la pared delgada de 500 mi y una botella de cristal de 1000 mi por más de al menos 365 días. Cada una de las botellas se selló y se almacenó a 18.33° C (65° Fahrenheít) . Como se puede observar en la figura, los niveles de OD del fluido enriquecido con oxígeno permanecieron equitativamente constantes por más de al menos 365 días.

Con referencia ahora a la Figura 31, se ilustran los niveles de OD en el agua enriquecida con oxígeno en el dispositivo de mezcla 100 y almacenados en una botella plástica con la pared delgada de 500 mi y una botella de cristal de 1000 mi. Ambas botellas se enfriaron a 3.9° C (39° Fahrenheit) . Un vez más, los niveles de OD del fluido enriquecido con oxígeno permanecieron estables y disminuyeron sólo ligeramente más allá de al menos 365 días.

Composiciones que comprenden formas de electrones hidratados (solvatados) impartidas a las composiciones de la invención mediante los procesos de la invención En ciertas modalidades, como se describe en este documento (veáse abajo en "Doble capa"), el fluido enriquecido con gas se genera mediante los procesos electromecánicos descritos en los que el oxígeno molecular se difunde o se mezcla en el fluido y puede operar para estabilizar las cargas (por ejemplo, electrones hidratados (solvatados)) impartidas al fluido. Sin estar atados por la teoría o el mecanismo, ciertas modalidades de la presente invención se refieren a un fluido enriquecido con oxígeno (material de salida) que comprende las cargas (por ejemplo, electrones hidratados (solvatados) ) que se adicionan a los materiales como el primer material se mezcla con el oxígeno en el dispositivo de mezcla de la invención para proporcionar el material de salida combinado. De acuerdo con aspectos particulares, estos electrones hidratados (solvatados) (alternativamente referidos en este documento como 'electrones solvatados') se estabilizaron en las soluciones de la invención según se evidencia por la persistencia de los efectos ensayables mediados por estos electrones hidratados (solvatados) . Ciertas modalidades pueden relacionar a los electrones hidratados (solvatados) y/o estructuras del electrón de agua, agrupamientos , entre otros., {Veáse, por ejemplo, Lee y Lee, Bull. Kor. Chem. Soc. 2003, v.24, 6; 802-804; 2003) .

Efectos de la peroxidasa de rábano picante (HRP) . La peroxidasa de rábano picante (HRP) se aisla de las raíces del rábano picante (Amoracia rusticana) y pertenece al grupo de la ferroprotoporfirina (grupo Hemo) de las peroxidasas . La HRP se combina fácilmente con el peróxido de hidrógeno u otros donadores de hidrógeno para oxidar el sustrato de pirogalol. Además, como se reconoce en la técnica, la HRP facilita la degradación auto-oxidativa del ácido indol-3-acético en ausencia de peróxido de hidrógeno (veáse, por ejemplo, Heme Peroxidases, H. Brian Dunford, iley-VCH, 1999, Capitulo 6, páginas 112-123, que describe que la auto-oxidación involucra un mecanismo de cadena ramificada altamente eficiente, incorporado a este documento como referencia en su totalidad) . La reacción de HRP se puede medir en unidades de actividad enzimática, en el qué la actividad específica se expresa en términos de unidades de pirogalol. Una unidad de pirogalol formará 1.0 mg de purpurogalina a partir del pirogalol en 20 segundos a pH 6.0 a 20°C. Esta unidad de purpurogalina (20 segundos) equivale a aproximadamente 18 µ? unidades por minuto a 25 °C.

Pirogalol Purpurogalina Se conoce que la enzima peroxidasa de rábano picánte cataliza la autooxidación del pirogalol al facilitar la reacción con el oxígeno molecular en un fluido (Khajehpour y otros, PROTEINS: Struct, Funct, Genet . 53: 656-666 (2003)) .

Se conoce también que el oxígeno se une al bolsillo hemo de la enzima peroxidasa a través de una región hidrofóbica del poro de la enzima (entre Fe68 y Fel42) , cuya conformación probablemente determina el acceso del oxígeno al interior. De acuerdo con aspectos particulares, y sin estar atados por el mecanismo, debido a que se conoce en la técnica de las proteínas que las cargas superficiales en las proteínas influencian la estructura de ésta, los electrones solvatados presentes en el fluido enriquecido con gas de la invención pueden actuar para alterar la conformación de la peroxidasa de rábano picante de manera que esto pueda resultar en una mayor accesibilidad para el oxígeno. La mayor accesibilidad del oxígeno al bolsillo hemo prostético de la enzima peroxidasa de rábano picante puede, a su vez, permitir una reactividad aumentada de HRP, cuando se compara con los fluidos oxigenados de la técnica anterior (recipiente presurizado, burbujeo fino) .

En cualquier evento, de acuerdo con aspectos particulares, la producción de material de salida usando los métodos y dispositivos de la invención comprende un proceso que involucra: una doble capa interfacial que proporciona un gradiente de carga; el movimiento de los materiales en relación con la carga de tracción superficial (por ejemplo, electrones) lejos de la superficie en virtud de un efecto triboeléctrico, donde el flujo de material produce un flujo de electrones solvatados . Además, de acuerdo con aspectos adicionales, sin estar atados por el mecanismo, la estructura orbital del oxígeno diatómico crea desequilibrio de carga (por ejemplo, los dos electrones no pareados que afectan el puente de hidrógeno del agua) en el arreglo del puente de hidrogeno dentro del material fluido (agua) , donde los electrones se solvatan y estabilizan dentro de los desequilibrios.

Se realizaron diversas pruebas químicas del fluido enriquecido con oxígeno de la invención, en presencia del peróxido de hidrógeno como se describe a continuación, y ninguna de estas pruebas fue positiva (sensibilidad del peróxido de hidrógeno de 0.1 ppm) . De este modo, el fluido enriquecido con oxígeno de la invención en la presente solicitud no contiene peróxido de hidrógeno, o contiene menos que 0.1 ppm.

De acuerdo con aspectos particulares, a pesar de la ausencia de peróxido de hidrógeno, la combinación del enriquecimiento con oxígeno y los electrones solvatados de la invención impartida por los efectos de la doble capa y la configuración de los dispositivos ahora reivindicados pueden actuar para modificar la conformación y/o accesibilidad del grupo hemo de la peroxidasa de rábano picante .

Estudio de la glutatión peroxidasa El material de salida fluido enriquecido con oxígeno de la invención se probó para la presencia de peróxido de hidrógeno mediante la prueba de la reactividad con la glutatión peroxidasa usando un ensayo estándar (Sigma) . Brevemente, el cóctel de enzima glutatión peroxidasa se reconstituyó en agua desionizada y los tampones apropiados. Las muestras de agua se probaron mediante la adición del cóctel enzimático y viceversa. La determinación del índice espectrofotométrico se hizo a A340 nm, y temperatura ambiente (25 grados centígrados). Las muestras probadas fueron: l. agua desionizada (control negativo), 2. fluido enriquecido con oxígeno de la invención a una baja concentración, 3. fluido enriquecido con oxígeno de la invención a una alta concentración, 4. peróxido de hidrógeno (control positivo). El control positivo de peróxido de hidrógeno mostró una fuerte reactividad, mientras que ninguno de los otros fluidos probados reaccionaron con el glutatión.

Dispositivo para la generación de soluciones o fluidos enriquecidos con gas Descripción de la técnica relacionada La Figura 1 proporciona una vista de la sección transversal parcial, diagrama de bloque parcial de un dispositivo de la técnica anterior 10 para difundir o emulsificar uno o dos materiales gaseosos o líquidos ("materiales de infusión") en otro material gaseoso o líquido ( "material huésped" ) reproducidos de la patente de los Estados Unidos núm. 6,386,751, incorporada a este documento como referencia en su totalidad. El dispositivo 10 incluye un alojamiento configurado para alojar un estator 30 y un rotor 12. El estator 30 incluye al rotor 12. Un canal tubular 32 se define entre el rotor 12 y el estator 30. El rotor 12, cilindricamente moldeado, tiene un diámetro de aproximadamente 7.500 pulgadas y una longitud de aproximadamente 6.000 pulgadas que proporcionan una relación de longitud a diámetro de aproximadamente de 0.8.

El rotor 12 incluye un cilindro hueco, generalmente cerrado en ambas extremidades. Existe un espacio entre las primeras y segundas extremidades del rotor 12 y una parte de alojamiento 34. Un eje de rotación 14 accionado por un motor 18 se acopla a la segunda extremidad del rotor 12. La primera extremidad del rotor 12 se acopla a una entrada 16. Un primer material de infusión pasa a través de la entrada 16 y al interior del rotor 12. El primer material de infusión pasa desde el interior del rotor 12 y al canal 32 a través de una pluralidad de aberturas 22 formadas en el rotor 12.

El estator 30 también tiene aberturas 22 formadas alrededor de su circunsferencia . Una entrada 36 pasa un segundo material de infusión a un área 35 entre el estator 30 y el alojamiento 34. El segundo material de infusión pasa fuera del área 35 y al canal 32 a través de las aberturas 22.

Una bomba externa (no mostrada) se usa para bombear el material huésped a un puerto de entrada simple 37. El material huésped pasa a través de un puerto de entrada simple 37 y del canal 32 donde se encuentran los materiales de infusión primero y segundo, que entran al canal 32 a través de las aberturas 22. Los materiales de infusión se pueden presurizar en su fuente para prevenir que el material huésped pase a través de las aberturas 22.

El puerto de entrada 37, se configura y se posiciona de manera que éste se localice a lo largo de sólo una parte relativamente pequeña (< aproximadamente 5%) del canal de entrada anular 32, y es sustancialmente paralelo al eje de rotación del rotor 12 para impartir un flujo axial a una parte del canal 32 en el material huésped.

Desafortunadamente, antes de entrar al canal tubular 32, el material huésped debe viajar en direcciones tortuosas distinta de aquella del flujo axial (por ejemplo, incluyendo las direcciones sustancialmente ortogonales) y hacia y entre el espacio formado entre la primera extremidad del rotor 12 y el alojamiento 34 (es decir, hacia una parte de la primera extremidad del rotor adyacente a la entrada 16 entre la extremidad del rotor 12 y el alojamiento 34) . El flujo no axial y ortogonal, y la presencia del material huésped en el espacio entre la primera extremidad del rotor 12 y el alojamiento 34 provoca una fricción indeseable e innecesaria. Además, es posible que una parte del material huésped se quede atrapado en las corrientes parásitas que se arremolinan entre la primera extremidad del rotor y el alojamiento. Además, en el dispositivo 10, el material huésped deberá sortear al menos dos ángulos rectos para entrar en cualquiera de las orientaciones de la entrada anular del canal tubular 32.

Un puerto de salida simple 40 se forma en el alojamiento 34. El material huésped combinado y el (los) material (es) de infusión salen del canal 32 a través de la salida 40. El puerto de salida 40, que también se localiza a lo largo de sólo una parte limitada (< aproximadamente 5%) de la salida anular del canal tubular 32, es sustancialmente. paralelo al eje de rotación del rotor 12 para impartir o permitir un flujo axial de los materiales combinados alejados de la parte limitada de la salida anular del canal tubular 32 en el puerto de salida 40. Una bomba externa 42 se usa para bombear el fluido de salida a través del puerto de salida 40.

Desafortunadamente, antes de la salida del canal 32, una parte sustancial del material de salida debe viajar en una dirección tortuosa distinta de aquella del flujo axial (por ejemplo, incluyendo las direcciones sustancialmente ortogonales) y hacia y entre el espacio formado entre la segunda extremidad del rotor 12 y el alojamiento 34 (es decir, hacia una parte de la segunda extremidad del rotor adyacente al eje 14 entre la extremidad del rotor 12 y el alojamiento 34) . Como se mencionó anteriormente, el flujo no axial y ortogonal, y la presencia del material huésped en el otro espacio entre la extremidad (en este caso, la segunda extremidad) del rotor 12 y el alojamiento 34 provoca una fricción adicional indeseable e innnecesaria . Además, es posible que una parte del material huésped se quede atrapado en las corrientes parásitas que se arremolinan entre la segunda extremidad del rotor y el alojamiento. Además, en el dispositivo 10, una parte sustancial del material combinado saliente deberá sortear al menos dos ángulos rectos cuando éste sale desde la salida anular del canal tubular 32 hacia el puerto de salida 40.

Como es apreciable por aquellas personas con conocimiento ordinario en la técnica, el puerto de entrada 37 sólo imparte un flujo axial al material huésped. Sólo, el rotor 21 imparte un flujo circunferencial en el material huésped. Además, el puerto de salida 40 imparte o proporciona sólo un flujo axial en el material de salida. Además, el vector de velocidad del flujo circunferencial se imparte al material sólo después que éste entra en la entrada anular 37 del canal tubular 32, y posteriormente el vector de flujo circunferencial deberá ser degradado o eliminado cuando el material entra al puerto de salida 40. Existe, por lo tanto, una necesidad de una aceleración circunferencial progresiva del material cuando éste pasa en la dirección axial a través del canal 32, y una desaceleración circunferencial tras la salida del material del canal 32. Estos aspectos, en combinación con la trayectoria tortuosa que toma el material desde el puerto de entrada 37 hasta el puerto de salida 40, crean una fricción sustancial y una resistencia al flujo sobre la trayectoria que se acompaña de una diferencia de presión sustancial (26 psi, a una tasa de flujo de 60 galones/min) entre los puertos de entrada 37 y de salida 40, y estos factores, entre otros, se combinan para reducir la eficiencia total del sistema.

Soluciones y fluidos acuosos enriquecidos con oxígeno por eleetrocinética La Figura 2 proporciona un diagrama en bloque que ilustra algunos de los components de un dispositivo de mezcla 100 y el flujo del material en, dentro, y fuera del dispositivo. El dispositivo de mezcla 100 combina dos o más materiales de entrada para formar un material de salida 102, que se puede recibir por tanto en un recipiente de almacenamiento 104. El dispositivo de mezcla 100 agita los dos o más materiales de entrada de una manera novedosa para producir un material de salida 102 que tiene características novedosas. El material de salida 102 puede incluir no sólo una suspensión de al menos uno de los materiales de entrada en al menos uno de los otros materiales de entrada (por ejemplo, las emulsiones) sino también una combinación novedosa (por ejemplo, las combinaciones electrostáticas) de los materiales de entrada, un compuesto químico resultante de las reacciones químicas entre los materiales de entrada, combinaciones que tienen características electrostáticas novedosas, y combinaciones de éstas.

Los materiales de entrada pueden incluir un primer material 110 proporcionado por una fuente 112 del primer material, un segundo material 120 proporcionado por una fuente 122 del segundo material, y opcionalmente un tercer material 130 proporcionado por una fuente 132 del tercer material. El primer material 110 puede incluir un líquido, tal como agua, solución salina, suspensiones químicas, líquidos polares, líquidos no-polares, suspensiones coloidales, medios de crecimiento celular, y similares. En algunas modalidades, el primer material 110 puede incluir el material de salida 102 reciclado en el dispositivo de mezcla 100. El segundo material 120 puede consistir en, o incluir un gas, tal como oxígeno, nitrógeno, dióxido de carbono, monóxido de carbono, ozono, gas de azufre, óxido nitroso, óxido nítrico, argón, helio, bromuro, y combinaciones de éstos, y similares. En modalidades preferidas, el gas es, o comprende, el oxígeno. El tercer material opcional 130 puede incluir tanto un líquido como un gas. En algunas modalidades, el tercer material 130 puede ser, o incluir el material de salida 102 reciclado en el dispositivo de mezcla 100 (por ejemplo, por una o más de las bombas 210, 220 ó 230, y/o en la cámara 310, y/o 330) .

Opcionalmente , el primer material 110, el segundo material 120, y el tercer material opcional 130 pueden ser bombeados en el dispositivo de mezcla 100 por una bomba externa 210, una bomba externa 220, y una bomba externa 230, respectivamente. Alternativamente, uno o más del primer material 110, el segundo material 120, y el tercer material opcional 130 pueden ser almacenados bajo presión en la fuente 112, la fuente 122, y la fuente 132, respectivamente, y pueden ser forzados dentro del dispositivo de mezcla 100 por la presión. La invención no se limita al método usado para transferir el primer material 110, el segundo material 120, y opcionalmente, el tercer material 130 en el dispositivo de mezcla 100 de la fuente 112, la fuente 122, y la fuente 132, respectivamente .

El dispositivo de mezcla 100 incluye una primera cámara 310 y una segunda cámara 320 que flanquean una cámara de mezcla 330. Las tres cámaras 310, 320, y 330 se interconectan y forman un volumen continuo.

El primer material 110 se transfiere a la primera cámara 310 y fluye de ahí a la cámara de mezcla 330. El primer material 110 en la primera cámara 310 se puede bombear en la primera cámara 310 por una bomba interna 410. El segundo material 120 se transfiere a la, cámara de mezcla 330. Opcionalmente , el tercer material 130 puede transferirse a la cámara de mezcla 330. Los materiales en la cámara de mezcla 330 se mezclan allí para formar el material de salida 102. Después, el material de salida 102 fluye a la segunda cámara 320 de la cual el material de salida 102 sale del dispositivo de mezclalOO. El material de salida 102 en la cámara de mezcla 330 se puede bombear en la segunda cámara 320 por una bomba interna 420. Opcionalmente, el material de salida 102 en la segunda cámara 320 se puede bombear de ahí hacia el recipiente de almacenamiento 104 por una bomba externa 430 (por ejemplo, sola o en combinación con una bomba interna 410 y/o 420) .

En aspectos particulares, un eje de trasmisión común 500 potencia tanto la bomba interna 410 como la bomba interna 420. El eje de trasmisión 500 pasa a través de la cámara de mezcla 330 y proporciona la fuerza rotacional, que se usa para mezclar el primer material 110, el segundo material 120, y opcionalmente, el tercer material 130. El eje de trasmisión 500 se potencia por un motor 510 acoplado a éste.

La Figura 3 proporciona un sistema 512 para el suministro del primer material 110 al dispositivo de mezcla 100 y eliminar el material de salida 102 desde el dispositivo de mezcla 100. En el sistema 512, se combinan el recipiente de almacenamiento 104 del material de salida 102 y la fuente 112 del primer material 110. La bomba externa 210 se acopla al recipiente de almacenamiento combinado 104 y la fuente 112 por un conducto de fluido 514 tal como manguera, tubería, y similares. La bomba externa 210 bombea el primer material combinado 110 y el material de salida 102 desde el recipiente de almacenamiento combinado 104 y la fuente 112 a través del conducto de fluido 514 y en un conducto de fluido 516 que conecta la bomba externa 210 al dispositivo de mezcla 100. El material de salida 102 sale del dispositivo de mezcla .100 a través del conducto de fluido 518. El conducto de fluido 518 se acopla a un recipiente de almacenamiento combinado Í04 y la fuente 112 y transporta el material de salida 102 que sale del dispositivo de mezcla 100 hacia el recipiente de almacenamiento combinado 104 y la fuente 112. El conducto de fluido 518 incluye una válvula 519 que establece una presión de operación o contrapresión dentro del dispositivo de mezcla 100.

Con referencia a las Figuras 2, 4-9, y 11, se proporcionará una descripción más detallada de varios componentes de una modalidad del dispositivo de mezcla 100.

El dispositivo de mezcla 100 es escalable. Por lo tanto, las dimensiones proporcionadas con relación a diversos componentes pueden ser usadas para construir una modalidad del dispositivo o se pueden escalar para construir un dispositivo de mezcla del tamaño seleccionado.

Retornando a la Figura 4, el dispositivo de mezcla 100 incluye un alojamiento 520 que aloja una primera cámara 310, la cámara de mezcla 330, y la segunda cámara 320. Como se mencionó anteriormente, el dispositivo de mezcla 100 incluye el eje de trasmisión 500, que rota durante la operación del dispositivo. Por lo tanto, el dispositivo de mezcla 100 puede vibrar o moverse de otra forma. Opcionalmente , el dispositivo de mezcla 100 se puede acoplar a una base 106, que se puede fijar a la superficie tal como el piso para mantener el dispositivo de mezcla 100 en una posición sustancialmente estática .

El alojamiento 520 se puede ensamblar a partir de dos o más secciones de alojamientos. A manera de ejemplo, el alojamiento 520 puede incluir una sección central 522 flanqueada por un primer alojamiento de cierre mecánico 524 y un segundo alojamiento de cierre mecánico 526. Un alojamiento del cojinete 530 se puede acoplar al primer alojamiento de cierre mecánico 524 opuesto a la sección central 522. Un alojamiento del cojinete 532 se puede acoplar a un segundo alojamiento de cierre mecánico 526 opuesto a la sección central 522. Opcionalmente , una sección de alojamiento 550 se puede acoplar al alojamientos del cojinete 530.

Cada uno de los alojamientos del cojinete 530 y 532 pueden alojar un ensamblaje de cojinete 540 (veáse las Figuras 5 y 6) . El ensamblaje de cojinete 540 puede incluir cualquier ensamblaje para cojinete adecuado conocido en la técnica que incluye un modelo número "202SZZST" fabricado por SKF USA Inc, de Kulpsville, Pensilvania, que opera un sitio web (en www. skf . com) .

Los cierres se pueden proporcionar entre las secciones de alojamiento adyacentes. Por ejemplo, el anillo en "O" 560 (veáse la Figura 5) se puede situar entre la sección de alojamiento 550 y el alojamiento del cojinete 530, el anillo en "O" 562 (veáse la Figura 5) se puede situar entre el primer alojamiento de cierre mecánico 524 y la sección central 522, y el anillo en "0" 564 (veáse la Figura 6) se puede situar entre el segundo alojamiento de cierre mecánico 526 y la sección central 522.

CAMARA DE MEZCLA 330 Regresando ahora a la Figura 7, la cámara de mezcla 330 se dispone dentro de la sección central 522 del alojamiento 520 entre la primera cubierta de cierre mecánico 524 y la segunda cubierta de cierre mecánico 526. La cámara de mezcla 330 se forma entre dos componentes del dispositivo de mezcla 100, un rotor 600 y un estator 700. El rotor 600 puede tener una pared lateral 604 con una superficie interna 605 que define una parte generalmente interna hueca 610 y una superficie externa 606. La pared lateral 604 puede ser de aproximadamente 0.20 pulgadas a aproximadamente 0.75 pulgadas de grueso. En algunas modalidades, la pared lateral 604 es de aproximadamente 0.25 pulgadas de grueso. Sin embargo, debido a que el dispositivo de mezcla 100 se puede escalar para corresponder a una solicitud en particular, las modalidades del dispositivo que tienen una pared lateral 604 que es más gruesa o más delgada que los valores proporcionados están dentro del alcance de las presentes enseñanzas. La pared lateral 604 incluye una primera extremidad 612 y una segunda extremidad 614 y una pluralidad de agujeros de paso 608 formados entre la primera extremidad 612 y una segunda extremidad 614. Opcionalmente , la superficie externa 606 de la pared lateral 604 puede incluir otras características tales como aberturas, proyecciones, texturas, y similares. La primera extremidad 612 tiene una parte a relieve 616 configurada para recibir un collar 618 y la segunda extremidad 614 tiene una parte a relieve 620 configurada para recibir un collar 622.

El rotor 600 se dispone dentro del estator 700. El estator 700 tiene una pared lateral 704 con una superficie interna 705 que define una parte generalmente interna hueca 710 en la que se dispone el rotor 600. La pared lateral 704 puede ser de aproximadamente 0.1 pulgadas a aproximadamente 0.3 pulgadas de grueso. En algunas modalidades, la pared lateral 604 es de aproximadamente 1.5 pulgadas de grueso. El estator 700 se puede acoplar sin rotación al alojamiento 520 en una posición sustancialmente estática. Alternativamente, el estator 700 se puede formar integralmente con el alojamiento 520. La pared lateral 704 tiene una primera extremidad 712 y una segunda extremidad 714. Opcionalmente , una pluralidad de aberturas 708 se forma en la pared lateral 704 del estator 700 entre la primera extremidad 712 y la segunda extremidad 714. Opcionalmente , la superficie interna 705 ' de la pared lateral 704 puede incluir otras características tales como agujeros de paso, proyecciones, texturas, y similares.

El rotor 600 rota en relación al estator estático 700 alrededor de un eje de rotación "a" en una dirección indicada por la flecha "C3" en la Figura 9. Cada uno del rotor 600 y el estator 700 pueden ser, en general, de forma cilindrica y tienen un eje longitudinal. El rotor 600 tiene un diámetro externo "DI" y el estator 700 puede tener un diámetro interno "D2. " El diámetro "DI" puede estar en el intervalo, por ejemplo, de aproximadamente 0.5 pulgadas a aproximadamente 24 pulgadas. En algunas modalidades, el diámetro "DI" es aproximadamente 3.04 pulgadas. En algunas modalidades, el diámetro "DI" es de aproximadamente 1.7 pulgadas. El diámetro "D2 , " que es más grande que el diámetro "DI," puede estar en el intervalo de aproximadamente 0.56 pulgadas a aproximadamente 24.25 pulgadas. En algunas modalidades, el diámetro "D2" es de aproximadamente 4 pulgadas. Por lo tanto, la cámara de mezcla 330 puede tener una sección transversal en forma anular que es de aproximadamente 0.02 pulgadas a aproximadamente 0.125 pulgadas de grueso (es decir, la diferencia entre el diámetro "D2" y el diámetro "DI"). En modalidades particulares, la cámara de mezcla 330 es de aproximadamente 0.025 pulgadas de grueso. El canal 32 entre el rotor 12 y el estator 34 del dispositivo de la técnica anterior 10 (véase la Figura 1) tiene una sección transversal de forma anular que es de aproximadamente 0.09 pulgadas de grueso. Por lo tanto, en modalidades particulares, el grueso de la cámara de mezcla 330 es menos que aproximadamente un tercio del canal 32 del dispositivo 10 de la técnica anterior .

El eje longitudinal del rotor 600 se puede alinear con su eje de rotación "a." El eje longitudinal del rotor 600 se puede alinear con el eje longitudinal del estator 700. El rotor 600 puede tener una longitud de aproximadamente 3 pulgadas a aproximadamente 6 pulgadas a lo largo del eje de rotación "a." En algunas modalidades, el rotor 600 puede tener una longitud de aproximadamente 5 pulgadas a lo largo del eje de rotación "a." El estator 700 puede tener una longitud de aproximadamente 3 pulgadas a aproximadamente 6 pulgadas a lo largo del eje de rotación "OÍ." En algunas modalidades, el estator 700 puede tener una longitud de aproximadamente 5 pulgadas a lo largo del eje de rotación "a." Mientras se ha descrito que el rotor 600 y el estator 700 tienen una forma generalmente cilindrica, aquéllas personas con conocimiento ordinario en la técnica aprecian que se pueden usar las formas alternativas. Por ejemplo, el rotor 600 y el estator 700 pueden ser de forma cónica, esférica, arbitraria y similar. Además, el rotor 600 y el estator 700 no necesitan tener una forma idéntica. Por ejemplo, el rotor 600 puede ser de forma cilindrica y el estator 700 de forma rectangular o viceversa.

Las aberturas 708 del estator 700 y los agujeros de paso 608 descritos en las Figuras 4—7 son de forma cilindrica, en general. El diámetro de los agujeros de paso 608 puede estar en el intervalo de aproximadamente 0.1 pulgadas hasta aproximadamente 0.625 pulgadas. El diámetro de las aberturas 708 puede estar en el intervalo de aproximadamente 0.1 pulgadas a aproximadamente 0.625 pulgadas. Una o más aberturas 708 del estator 700 pueden tener un diámetro que difiere de los diámetros de otras aberturas 708. Por ejemplo, las aberturas 708 pueden aumentar en diámetro desde la primera extremidad 712 del estator 700 hasta la segunda extremidad 714 del estator 700, las aberturas 708 pueden disminuir en diámetro desde la primera extremidad 712 del estator 700 hasta la segunda extremidad 714 del estator 700, o los diámetros de las aberturas 708 pueden variar, de otra manera, a lo largo del estator 700. Uno o más agujeros de paso 608 del rotor 600 pueden tener un diámetro que difiere de los diámetros de los otros agujeros de paso 608. Por ejemplo, los agujeros de paso 608 pueden aumentar en diámetro desde la primera extremidad 612 del rotor 600 hasta la segunda extremidad 614 del rotor 600, los agujeros de paso 608 pueden disminuir en diámetro desde la primera extremidad 612 del rotor 600 hasta la segunda extremidad 614 del rotor 600, o los diámetros de los agujeros de paso 608 pueden variar, de otra manera, a lo largo del rotor 600.

Como se describe a continuación con relación a las modalidades alternativas, las aberturas 708 y los agujeros de paso 608 pueden tener formas distintas de las generalmente cilindricas y tales modalidades están dentro del alcance de la presente invención. Por ejemplo, los agujeros de paso 608 pueden incluir una parte más estrecha, una parte arqueada, una parte cónica, y similares. Con referencia a la Figura 7, cada uno de los agujeros de paso 608 incluyen una parte externa 608A, una parte estrecha 608B, y una parte cónica 608C que proporciona una transición entre la parte externa 608A y la parte estrecha 608B. Del mismo modo, las aberturas 708 pueden incluir una parte estrecha, una parte arqueada, una parte cónica, y similares.

La Figura 8 proporciona un ejemplo no limitativo de un ordenamiento adecuado de las aberturas 708 del estator 700 y de los agujeros de paso 608 del rotor 600. Las aberturas 708 del estator 700 se pueden ordenar en filas laterales sustancialmente paralelas "SLAT-1" a través de las "SLAT-6" sustancialmente ortogonales al eje de rotación "ex." Las aberturas 708 del estator 700 también pueden ser ordenadas en filas longitudinales sustancialmente paralelas "SLONG-1" a través de las "SLONG-7" sustancialmente paralelas al eje de rotación " ." En otras palabras, las aberturas 708 del estator 700 se pueden ordenar en un patrón similar al cuadriculado de filas ortogonales (es decir, las filas laterales son ortogonales a las filas longitudinales) que tienen filas longitudinales "SLONG-1" a través de las "SLONG-7" sustancialmente paralelas al eje de rotación "a." Al igual que las aberturas 708 del estator 700, los agujeros de paso 608 del rotor 600 se pueden ordenar en filas laterales sustancialmente paralelas "RLAT-1" a través de las "RLAT-6" sustancialmente ortogonales al eje de rotación"a." Sin embargo, en lugar de ser ordenados en un patrón similar al cuadriculado de filas ortogonales, los agujeros de paso 608 del rotor 600 también pueden ser ordenados en filas sustancialmente paralelas "RLONG-1" a través de las "RLONG-7" que se extienden longitudinalmente a lo largo de un camino helicoidal. Alternativamente, los agujeros de paso 608 del rotor 600 también pueden ser ordenados en filas sustancialmente paralelas "RLONG-1" a través de "RLONG-7" que se extienden longitudinalmente en un ángulo distinto al paralelo con el eje de rotación "a." Las aberturas 708 del estator 700 y los agujeros de paso 608 del rotor 600 se pueden configurar de tal modo que cuando el rotor 600 se dispone dentro del estator 700 las filas laterales "SLAT-1" a "SLAT-6" , al menos parcialmente, se alinean con las filas laterales "RLAT-1" a "RLAT-6," respectivamente. De esta manera, como el rotor 600 rota dentro del estator 700, los agujeros de paso 608 pasan por las aberturas 708.

Los agujeros de paso 608 en cada una de las filas laterales "RLAT-1" a . las "RLAT-6" se pueden separar lateralmente de manera que todos los agujeros de paso 608 en la fila lateral se alinean, al menos parcialmente, con las aberturas 708 en correspondencia con una de las filas laterales "SLAT-1" a las "SLAT-6" del estator 700 al mismo tiempo. Las filas longitudinalmente extendidas "RLONG-1" a través de "RLONG-6" se pueden configurar de manera que los agujeros de paso 608 en la primera fila lateral "RLAT-1" en cada una de las filas longitudinalmente extendidas pasen completamente por las aberturas 708 de la fila lateral correspondiente "SLAT-1" delante de los agujeros de paso 608 en la última fila lateral "RLAT-6" que se alinean parcialmente con las aberturas 708 de la última fila lateral correspondiente "SLAT-6" del estator 700.

Mientras que, en la Figura 8, seis filas laterales y seis filas longitudinalmente extendidas se han descrito en relación al rotor 600 y seis filas laterales y siete filas longitudinalmente extendidas se han descrito en relación al estator 700, se aprecia por aquellas personas con conocimiento ordinario en la técnica que los números alternativos de las filas laterales y/o filas longitudinales se pueden usar en relación al rotor 600 y/o estator 700 sin apartarse de las presentes enseñanzas.

Para asegurar que sólo un par de aberturas entre las filas laterales correspondientes serán coincidentes a la vez, los números de aberturas 708 en cada una de las filas laterales "SLAT-1" a las "SLAT-6" sobre el estator 700 pueden diferir por un número predeterminado (por ejemplo, uno, dos, y similares) los números de agujeros de paso 608 en cada una de las filas laterales correspondientes "RLAT-1" a las "RLAT-6" sobre el rotor 600. De este modo, por ejemplo, si la fila lateral "RLAT-1" tiene veinte agujeros de paso 608 espaciados equitativamente alrededor de la circunferencia del rotor 600, la fila lateral "SLAT-1" puede tener veinte aberturas 708 espaciadas equitativamente alrededor de la circunferencia del estator 700.

Retornando a la Figura 7, la cámara de mezcla 330 tiene una primera extremidad abierta 332 y una segunda extremidad abierta 334. Los agujeros de paso 608 formados en la pared lateral 604 del rotor 600 conectan la parte interna 610 del rotor 600 con la cámara de mezcla 330.

El rotor 600 rota dentro del estator 700 por el eje de transmisión 500 alineado con el eje de rotación "a" del rotor 600. El eje de transmisión 500 se puede acoplar a la primera extremidad 612 y la segunda extremidad 614 del rotor 600 y extenderse a través de su parte interna hueca 610. En otras palabras, una parte 720 del eje de transmisión 500 se dispone en la parte interna hueca 610 del rotor 600.

El collar 618 se configura para recibir una parte 721 del eje de transmisión 500 dispuesto en la parte interna hueca 610 y el collar 622 se configura para recibir una parte 722 del eje de transmisión 500 dispuesto en la parte interna hueca 610.

La parte 721 tiene un diámetro externo "D3" que puede estar en el intervalo de aproximadamente 0.5 pulgadas a aproximadamente 2.5 pulgadas. En algunas modalidades, el diámetro "D3" es de aproximadamente 0.625 pulgadas. La parte 722 tiene un diámetro externo "D4" que puede ser sustancialmente similar al diámetro "D3 , " aunque, esto no se requiere. El diámetro "D4" puede estar en el intervalo de aproximadamente 0.375 pulgadas a aproximadamente 2.5 pulgadas .

El rotor 600 se puede fijar sin rotación a la parte 721 y la parte 722 del eje de transmisión 500 por el collar 618 y el collar 622, respectivamente. A manera de ejemplo, cada uno de los collares 618 y 622 se puede instalar dentro de las partes a relieve 616 y 620, respectivamente. Después, el rotor combinado 600 y los collares 618 y 622 se pueden calentar para expandirse. A continuación, el eje de transmisión 500 se inserta a través de los collares 618 y 622 y el ensamblaje se deja enfriar. Como los collares 618 y 622 se contraen durante el enfriamiento, ellos se cierran alrededor de las partes 722A y 722B del eje de transmisión 500, respectivamente, agarrándolo suficientemente apretado para prevenir que el eje de transmisión 500 rote con respecto al rotor 600. El collar 618, que no rota con relación a la parte 721 ni a la parte a relieve 616, traslada la rotación del eje de transmisión 500 a la primera extremidad 612 del rotor 600. El collar 622, que no rota con relación a la parte 722 ni a la parte a relieve 620, traslada la rotación del eje de transmisión 500 a la segunda extremidad 614 del rotor 600.

El eje de transmisión 500 y el rotor 600 rotan juntos como una unidad única.

El eje de transmisión 500 puede tener una primera extremidad 724 (véase la Figura 5) y una segunda extremidad 726 (véase la Figura 6) . La primera extremidad 724 puede tener un diámetro "D5" de aproximadamente 0.5 pulgadas a aproximadamente 1.75 pulgadas. En modalidades particulares, el diámetro "D5" puede ser aproximadamente 1.25 pulgadas. La segunda extremidad 726 puede tener un diámetro "D6" que puede ser sustancialmente similar al diámetro "D5. " El segundo material 120 se puede transportar dentro de la cámara de mezcla 330 a través de una primera extremidad 724 y la segunda extremidad 726 del eje de transmisión que rota 500. La otra primera extremidad 724 y la segunda extremidad 726 del eje de transmisión 500 se pueden acoplar al motor 510. En la modalidad descrita en las Figuras 5 y 6, el segundo material 120 se transporta dentro de la cámara de mezcla 330 a través de la primera extremidad 724 y la segunda extremidad 726 del eje de transmisión 500 se acopla al motor 510.

Regresando a la Figura 5, el eje de transmisión 500 puede tener un canal 728 formado en ese lugar que se extiende desde la primera extremidad 724 dentro de la parte 720 dispuesta en la parte interna 610 del rotor 600. El canal 728 tiene una abertura 730 formada en la primera extremidad 724. Cuando el dispositivo de mezcla 100 está funcionando, el segundo material 120 se introduce dentro del canal 728 a través de la abertura 730.

Una válvula 732 se puede disponer dentro de una parte del canal 728 localizado en la primera extremidad 724 del eje de transmisión 500. La válvula 732 puede restringir, o de otra manera, controlar el retroceso del flujo del segundo material 120 desde dentro de la parte interna hueca 610 a través del canal 728 y/o el flujo hacia adelante del segundo material 120 dentro del canal 728. La válvula 732 puede incluir cualquier válvula conocida en la técnica que incluye una válvula de retención. Una válvula de retención adecuada incluye un número de pieza "CKFA1876205A, " válvula de retención libre de flujo de avance, fabricada por la compañía Lee de Estados Unidos que tiene una oficina en Bothell, WA y opera un sitio web en www.theleeco.com.

El eje de transmisión 500 puede incluir una abertura 740 localizada en la parte interna 610 del rotor 600 que conecta el canal 728 con la parte interna 610 del rotor 600. Mientras que sólo una única apertura 740 se describe en la Figura 5, se aprecia por aquellas personas con conocimiento ordinario en la técnica que múltiples aberturas se pueden usar para conectar el canal 728 con la parte interna 610 del rotor 600.

Con referencia a la Figura 2, opcionalmente , la bomba externa 220 puede bombear el segundo material 120 dentro del dispositivo de mezcla 100. La bomba 220 puede incluir cualquier bomba adecuada conocida en la técnica. A manera de ejemplo no limitativo la bomba 220 puede incluir cualquier bomba adecuada conocida en la técnica que incluye una bomba de diafragma, una bomba química, una bomba peristáltica, una bomba de alimentación por gravedad, una bomba pistón, una bomba de engranaje, una combinación de cualquiera de las bombas antes mencionadas, y similares. Si el segundo material 120 es un gas, el gas se puede presurizar y forzar dentro de la abertura 730 formada en la primera extremidad 724 del eje de transmisión 500 por la liberación del gas de la fuente 122.

La bomba 220 o la fuente 122 se acoplan al canal 728 mediante la válvula 732. El segundo material 120 transportado dentro del canal 728 sale del canal 728 por la parte interna 610 del rotor 600 a través de la abertura 740. El segundo material 120 sale posteriormente de la parte interna 610 del rotor 600 a través de los agujeros de paso 608 formados en la pared lateral 608 del rotor 600.

Con referencia a la Figura 5, el dispositivo de mezcla 100 puede incluir un ensamblaje de sellado 750 acoplado a la primera extremidad 724 del eje de transmisión 500. El ensamblaje de sellado 750 se mantiene dentro de una cámara 752 definida en el alojamiento 520. La cámara 752 tiene una primera extremidad 754 espaciada a través de la cámara de una segunda extremidad 756. La cámara 752 también incluye un puerto de entrada 758 y un puerto de salida 759 que proporciona el acceso dentro de la cámara 752. La cámara 752 se puede definir por la sección de alojamiento 550 y el alojamiento del cojinete 530. La primera extremidad 754 se puede formar en la sección de alojamiento 550 y la segunda extremidad 756 puede estar adyacente al alojamiento del cojinete 530. El puerto de entrada 758 se puede formar en el alojamiento del cojinete 530 y el puerto de salida 759 se puede formar en la sección de alojamiento 550.

El ensamblaje de sellado 750 incluye un primer sello estático 760 instalado en la primera extremidad 754 de la cámara 752 en la sección de alojamiento 550 y el alojamiento del cojinete 530. El primer sello estático 760 se extiende alrededor de una parte 762 de la primera extremidad 724 del eje de transmisión 500. El ensamblaje de sellado 750 también incluye un segundo sello estático 766 instalado en la segunda extremidad 756 de la cámara 752 en el alojamiento del cojinete 530. El segundo sello estático 766 se extiende alrededor de una parte 768 de la primera extremidad 724 del eje de transmisión 500.

El ensamblaje de sellado 750 incluye un ensamblaje de rotación 770 que se acopla sin rotación a la primera extremidad 724 del eje de transmisión 500 entre la parte 762 y la parte 768. El ensamblaje de rotación 770 rota como una unidad. El ensamblaje de rotación 770 incluye un primer sello 772 opuesto a un segundo sello 774. Un miembro de presión 776 (por ejemplo, un resorte) se localiza entre el primer sello 772 y el segundo sello 774. El miembro de presión 776 presiona el primer sello 772 contra el primer sello estático 760 y presiona el segundo sello 774 contra el segundo sello estático 766.

Un lubricante de enfriamiento se suministra a la cámara 752 y alrededor del ensamblaje de rotación 770. El lubricante entra en la cámara 752 a través del puerto de entrada 758 y sale de la cámara 752 a través puerto de salida 759. El lubricante puede lubricar al ensamblaje de cojinete 540 alojado por el alojamiento del cojinete 530. Una cámara 570 puede estar dispuesta entre el alojamiento del cojinete 530 y la cubierta de cierre mecánico 524. El alojamiento del cojinete 530 también puede incluir un segundo puerto de entrada 759 conectado a la cámara 570 en la que el lubricante puede ser bombeado. El lubricante bombeado en la cámara 570 puede lubricar el ensamblaje de cojinete 540. El ensamblaje de sellado 750 puede significativamente, cuando no grandemente, reducir las fuerzas de fricción dentro de esta parte del dispositivo causadas por la rotación del rotor 600 y puede aumentar la vida activa de los sellos 770. Los sellos pueden incluir las superficies construidas usando carburo de silicio .

Con referencia a la Figura 9, como el rotor 600 rota alrededor del eje de rotación "a" en la dirección indicada por la flecha "Cl," el rotor expele el segundo material 120 en la cámara de mezcla 330. Las burbujas, gotas, partículas y similares expelidos del segundo material 120 salen del rotor 600 y son impartidas con una velocidad circunferencial (en una dirección indicada por la flecha "C3") por el rotor 600. El segundo material 120 se puede forzar desdé la cámara de mezcla 330 por la bomba 220 (véase la Figura 2) , la fuerza centrífuga de rotación del rotor 600, la flotación del segundo material 120 con relación al primer material 110, y una combinación de éstos.

MOTOR 510 Retornando la Figura 6, la segunda extremidad 726 del eje de transmisión 500 se puede acoplar a un eje de rotación 780 de un motor 510 por un acoplador 900. El eje 780 puede tener una forma de sección transversal generalmente circular con un diámetro "D7" de aproximadamente 0.25 pulgadas a aproximadamente 2.5 pulgadas. En modalidades particulares, el diámetro "D7" puede ser de aproximadamente 0.25 pulgadas a aproximadamente 1.5 pulgadas. Mientras que en la modalidad descrita en la Figura 6, el diámetro "D5" de la primera extremidad 724 del eje de transmisión 500 es sustancialmente igual al diámetro "D7" y al eje 780, las modalidades en las que un diámetro "D5" o diámetro "D7" es más grande que el otro están dentro del alcance de la presente invención.

Con referencia también a la Figura 4, puede ser deseable cubrir o esconder el acoplador 900. En la modalidad descrita en las Figuras 4 y 6, un cárter de la transmisión 910 cubre el acoplador 900. El cárter de la transmisión 910 puede ser generalmente en forma de U con una parte curva 914 flanqueada por un par de partes sustancialmente lineales 915 y 916. La extremidad distal de cada una de las partes sustancialmente lineales 915 y 916 del cárter de la transmisión 910 puede tener una. pestaña 918 y 919, respectivamente. El cárter de la transmisión 910 se puede sujetar a la base 106 por cada una de sus pestañas 918 y 919.

El motor 510 puede estar apoyado sobre la base 106 por un miembro de apoyo 920. El miembro de apoyo 920 puede estar acoplado al motor 510 cerca del eje 780. En la modalidad descrita, el miembro de apoyo 920 incluye un agujero de paso a través del cual pasa el eje 780. El miembro de apoyo 920 se puede acoplar al motor 510 usando cualquier método conocido en la técnica, incluyendo atornillar el miembro de apoyo 920 al motor 510 con uno o más tornillos 940.

El acoplador 900 puede incluir cualquier acoplador adecuado para transmitir una cantidad suficiente de torque desde el eje 780 al eje de transmisión 500 para rotar el rotor 600 dentro del estator 700. En la modalidad descrita en las Figuras 4 y 6, el acoplador 900 es un acoplador flexible. Un acoplador flexible puede ser beneficioso si el eje 780 y el eje de transmisión 500 se desalinean. Además, el acoplador flexible puede ayudar a absorber las fuerzas axiales ejercidas sobre el eje de transmisión 500 que podrían, de otra manera, ser trasladadas al eje 780. Un acoplador flexible adecuado incluye un modelo "BC32-8-8-A, " fabricado por la Ruland Manufacturing Company, S.A. de Marlborough, MA, que opera un sitio web en www.ruland.com.

El motor 510 puede rotar el rotor 600 a aproximadamente 0.1 revoluciones por minuto ("rpm") a aproximadamente 7200 rpm. El motor 510 puede incluir cualquier motor adecuado para rotar el rotor 600 dentro del estator 700 de acuerdo con las presentes enseñanzas. A manera de ejemplo no limitativo, un motor adecuado puede incluir un motor eléctrico de medio caballo de fuerza, que opera a 230/460 voltios y 3450 por minuto ("rpm") . Un motor adecuado incluye un modelo "C4T34NC4C" fabricado por la LEESON Electric Corporation de Grafton, WI , que opera un sitio web en www.leeson.com.

PRIMERA CAMARA 310 Regresando a las Figuras 4 y 7, la primera cámara 320 se dispone dentro la sección central 522 del alojamiento 520 entre la primera cubierta de cierre mecánico 524 y las primeras extremidades 612 y 712 del rotor 600 y el estator 700, respectivamente. La primera cámara 310 se puede anular y tiene una forma de sección transversal sustancialmente circular. La. primera cámara 310 y la cámara de mezcla 330 forman un volumen continuo. Una parte 1020 del e e de transmisión 500 se extiende a través de la primera cámara 310.

Como mejor se puede ver en la Figura 4, la primera cámara 310 tiene un puerto de entrada 1010 a través del cual el primer material 110 entra al dispositivo de mezcla 100, El primer material 110 se puede bombear dentro la primera cámara 310 por la bomba externa 210 (véase la Figura 2) . La bomba externa 210 puede incluir cualquier bomba conocida en la técnica para bombear el primer material 110 a una velocidad suficiente para suministrar a la primera cámara 310.

El puerto de entrada 1010 se orienta sustancialmente ortogonal al eje de rotación "a." Por lo tanto, el primer material 110 entra a la primera cámara 310 con una velocidad tangencial a la parte 1020 del eje de transmisión 500 que se extiende a través de la primera cámara 310. La dirección tangencial del flujo del primer material 110 que entra a la primera cámara 310 se identifica por la flecha "TI." En la modalidad descrita en las Figuras 4 y 7, el puerto de entrada 1010 se puede compensar a partir del eje de rotación "a." Como se aprecia por aquellas personas con conocimiento ordinario en la técnica, la dirección de rotación del eje de transmisión 500 (identificada por la flecha "Cl" en la Figura 9), tiene un componente tangencial. El puerto de entrada 1010 se posiciona de tal modo que el primer material 110 entra a la primera cámara 310 viajando sustancialmente en la misma dirección que el componente tangencial de la dirección de rotación del eje de transmisión 500.

El primer material 110 entra a la primera cámara 310 y se desvía por dentro de la primera cámara 310 alrededor de la parte 1020 del eje de transmisión 500. En las modalidades donde la primera cámara 310 tiene una forma de sección transversal sustancialmente circular, el interior de la primera cámara 310 puede desviar el primer material 110 en un paso sustancialmente circular (identificado por la flecha "C2" en la Figura 9) alrededor de la parte 1020 del eje de transmisión 500. En tal modalidad, la velocidad tangencial del primer material 110 puede provocar que viaje alrededor del eje de rotación "a" a una velocidad circunferencial, determinada al menos en parte por la velocidad tangencial.

Una vez dentro de la primera cámara 310, el primer material 110 se puede bombear desde la primera cámara 310 a la cámara de mezcla 330 por la bomba 410 que se aloja dentro de la primera cámara 310. En las modalidades que incluyen la bomba externa 210 (véase la Figura 2), la bomba externa 210 se puede configurar para bombear el primer material 110 a la primera cámara 310 a una tasa al menos tan alta como la tasa a la cual la bomba 410 bombea el primer material 110 desde la primera cámara 310.

La primera cámara 310 está en comunicación con la primera extremidad abierta 332 de la cámara de mezcla 330 y el primer material 110 dentro la primera cámara 310 puede fluir libremente en la primera extremidad abierta 332 de la cámara de mezcla 330. De esta manera, el primer material 110 no sortea ninguna de las esquinas o curvaturas entre la cámara de mezcla 330 y la primera cámara 310. En la modalidad descrita, la primera cámara 310 está en comunicación con la primera extremidad abierta completa 332 de la cámara de mezcla 330. La primera cámara 310 se puede llenar completamente con el primer material 110.

La bomba 410 es energizada por la parte 1020 del eje de transmisión 500 que se extiende a través de la primera cámara 310. La bomba 410 puede incluir cualquier bomba conocida en la técnica que tenga un miembro de bomba rotatorio 2022 alojado dentro de una cámara (es decir., la primera cámara 310} definida por una cubierta estática (es decir, el alojamiento 520) . Los ejemplos no limitativos de bombas adecuadas incluyen las bombas rotatorias de desplazamiento positivo tales como las bombas de cavidad progresiva, las bombas de tornillo sencillas (por ejemplo, la bomba de tornillo de Arquímides) , y similares.

La bomba 410 descrita en las Figuras 7 y 9, se refiere generalmente a una bomba de tornillo sencilla. En esta modalidad, el miembro de bomba 2022 incluye . una parte del collar 2030 dispuesta alrededor de la parte 1020 del eje de transmisión 500. La parte del collar 2030 rota con la parte 1020 del eje de transmisión 500 como una unidad. La parte del collar 2030 incluye uno o más miembros de desplazamiento de fluidos 2040. En la modalidad descrita en las Figuras 7 y 9, la parte del collar 2030 incluye un miembro de desplazamiento de fluido simple 2040 que tiene una forma helicoidal que circunscribe la parte del collar 2030 a lo largo de un paso helicoidal.

Con referencia a la Figura 9, se ilustra el interior de la primera cámara 310. La bomba 410 imparte un flujo axial (identificado por la flecha "Al" y la flecha "A2" ) en el primer material 110 dentro la primera cámara 310 hacia la primera extremidad abierta 332 de la cámara de mezcla 330. El flujo axial del primer material 110 impartido por la bomba 410 tiene una presión que puede exceder la presión obtenida por la bomba externa del dispositivo 10 de la técnica anterior (véase la Figura 1) .

La bomba 410 también puede estar configurada para impartir un flujo circunferencial (identificado por la flecha "C2") en el primer material 110 cuando este viaja hacia la primera extremidad abierta 332 de la cámara de mezcla 330. El flujo circunferencial impartido en el primer material 110 antes de que éste entre a la cámara de mezcla 330 provoca que el primer material 110 entre a la cámara de mezcla 330 viajando ya en la dirección deseada a una velocidad circunferencial inicial. En el dispositivo 10 de la técnica anterior representado en la Figura 1, el primer material 110 entró en el canal 32 del dispositivo 10 de la técnica anterior sin una velocidad circunferencial. Por lo tanto, el rotor 12 del dispositivo 10 de la técnica anterior solo tuvo que impartir un flujo circunferencial en el primer material 110. Debido a que el primer material 110 se mueve axialmente, en el dispositivo 10 de la técnica anterior, el primer material 110 atraviesa al menos una parte del canal 32 formado entre el rotor 12 y el estator 30 a una velocidad circunferencial más lenta que la primer material 110 atravesando la cámara de mezcla 330 del dispositivo de mezcla 100. En otras palabras, si la velocidad axial del primer material 110 es la misma tanto en el dispositivo 10 de la técnica anterior como en el dispositivo de mezcla 100, el primer material 110 puede completar más revoluciones alrededor del eje de rotación "a" antes de que atraviese la longitud axial de la cámara de mezcla 330, que podría completar antes de que atraviese la longitud axial del canal 32. Las revoluciones adicionales exponen el primer material 110 (y el primer material 110 y segundo material 120 combinados) a una parte sustancialmente más grande de la superficie interior eficaz 706 (véase la Figura 7) del estator 700.

En las modalidades que incluyen la bomba externa 210 (véase la Figura 2) , la velocidad circunferencial impartida por la bomba externa 210 en combinación con el puerto de entrada 1010 que se orienta de acuerdo con las presentes enseñanzas, puede solo aumentar suficientemente las revoluciones del primer material 110 (y el primer material 110 y segundo material 120 combinados) alrededor del eje de rotación "OÍ." Además, en algunas modalidades, la velocidad circunferencial impartida por la bomba 210 y la velocidad circunferencial impartida por la bomba 410 se combinan para alcanzar un número suficiente de revoluciones del primer material 110 (y el primer material 110 y segundo material 120 combinados) alrededor del eje de rotación "OÍ. " Como se aprecia por aquellas personas con conocimiento ordinario en la técnica, otros elementos estructurales tales como la forma de la sección transversal de la primera cámara 310 pueden contribuir a la velocidad circunferencial impartida por la bomba 210, la bomba 410, y una combinación de éstas .

En una modalidad alternativa descrita en la Figura 10, la bomba 410 puede incluir una o más aspas 2042 configuradas para impartir un flujo circunferencial en el primer material 110 cuando este viaja hacia la primera extremidad abierta 332 de la cámara de mezcla 330.

SEGUNDA CAMARA 320 Retornando ahora las Figuras 4 y 7, la segunda cámara 320 se dispone dentro de la sección central 522 del alojamiento 520 entre la segunda cubierta de cierre mecánico 526 y las segundas extremidades 614 y 714 del rotor 600 y el estator 700, respectivamente. La segunda cámara 320 puede ser sustancialmente similar a la de la primera cámara 310. Sin embargo, en lugar del puerto de entrada 1010, la segunda cámara 320 puede incluir un puerto de salida 3010.

Una parte 3020 del eje de transmisión 500' se extiende a través de la segunda cámara 320.

La segunda cámara 320 y la cámara de mezcla 330 forman un volumen continuo. Además, la primera cámara 310, la cámara de mezcla 330, y la segunda cámara 320 forman un volumen continuo. El primer material 110 fluye a través del dispositivo de mezcla 100 desde la primera cámara 310 a la cámara de mezcla 330 y finalmente a la segunda cámara 320. Mientras, en la cámara de mezcla 330 el primer material 110 se mezcla con, el segundo material 120, para formar el material de salida 102. El material de salida 102 sale del dispositivo de mezcla 100 a través del puerto de salida 3010. Opcionalmente , el material de salida 102 se puede retornar al puerto de entrada 1010 y mezclarse con una cantidad adicional del segundo material 120, el tercer material 130, o una combinación de éstos .

El puerto de salida 3010 se orienta sustancialmente de manera ortogonal al eje de rotación "a" y se puede localizar opuesto al puerto de entrada 1010 formado en la primera cámara 310. El material de salida 102 entra a la segunda cámara 320 desde la cámara de mezcla 330 que tiene una velocidad circunferencial (en la dirección indicada por la flecha "C3" en la Figura 9) impartida a éste por el rotor 600. La velocidad circunferencial es tangencial a la parte 3020 del eje de transmisión 500 que se extiende a través de la segunda cámara 320. En la modalidad representada en las Figuras 4, 6, y 7, el puerto de salida 3010 se puede desviar del eje de rotación "a." El puerto de salida 3010 se posiciona de tal modo que el material de salida 102, que entra a la segunda cámara 320 que viaja sustancialmente en la misma dirección en la que rota el eje de transmisión 500 (identificada en la Figura 9 por la flecha "Cl" ) , está viajando hacia el puerto de salida 3010.

El material de salida 102 entra a la segunda cámara 320 y se desvía por el interior de la segunda cámara 320 alrededor de la parte 3020 del eje de transmisión 500. En modalidades, donde la segunda cámara 320 tiene una forma de sección transversal sustancialmente circular, el interior de la segunda cámara 320 puede desviar el material de salida 102 por un paso sustancialmente circular alrededor de la parte 3020 del eje de transmisión 500.

Con referencia a la Figura 2, opcionalmente , el material de salida 102 se puede bombear desde el interior de la segunda cámara 320 por la bomba externa 430. La bomba externa 430 puede incluir cualquier bomba conocida en la técnica para bombear el material de salida 102 a una tasa suficiente que evite limitar el rendimiento- del dispositivo de mezcla 100. En tal modalidad, la bomba externa 430 puede introducir una velocidad tangencial (en una dirección indicada por la flecha "T2" en la Figuras 4 y 11) a al menos una parte del material de salida 102 cuando la bomba externa 430 bombea el material de salida 102 desde la segunda cámara 320. La velocidad tangencial de la parte del material de salida 102 puede provocar que éste viaje alrededor del eje de rotación "a" a una velocidad circunferencial, determinada en parte, por la velocidad tangencial.

BOMBA 420 Retornando a las Figuras 6 y 7, la bomba 420 situada dentro la segunda cámara 320 puede bombear el material de salida 102 desde la segunda cámara 320 al puerto de salida 3010 y/o desde la cámara de mezcla 330 a la segunda cámara 320. En modalidades que incluyen la bomba externa 430, la bomba externa 430 se puede configurar para bombear el material de salida 102 desde la segunda cámara 320 a una tasa al menos tan alta como una velocidad a la que la bomba 420 bombea el material de salida 102 en el puerto de salida 3010.

La segunda cámara 320 está en comunicación con la segunda extremidad abierta 334 de la cámara de mezcla 330 y el material de salida 102 dentro la cámara de mezcla 330 puede fluir libremente desde la segunda extremidad abierta 334 a la segunda cámara 320. De esta manera, el material de salida 102 no sortea ninguna de las esquinas o curvaturas entre la cámara de mezcla 330 y la segunda cámara 320. En la modalidad descrita, la segunda cámara 320 está en comunicación con la segunda extremidad completamente abierta 334 de la cámara de mezcla 330. La segunda cámara 320 se puede llenar completamente con el material de salida 102.

La bomba 420 es energizada por la parte 3020 del eje de transmisión 500 que se extiende a través de la segunda cámara 320. La bomba 420 puede ser sustancialmente idéntica a la bomba 410. Cualquier bomba descrita anteriormente como adecuada para el uso como la bomba 410 se puede usar por la bomba 420. Mientras que la bomba 410 bombea el primer material 110 a la cámara de mezcla 330, la bomba 420 bombea el material de salida 102 desde la cámara de mezcla 330. Por lo tanto, tanto la bomba 410 como la bomba 420 se pueden orientar para bombear en la misma dirección.

Como se aprecia por aquellas personas con conocimiento ordinario en la técnica, el primer material 110 puede diferir del material de salida 102. Por ejemplo, el primer material 110 o el material de salida 102 pueden ser más viscosos que otros. Por lo tanto, la bomba 410 puede diferir de la bomba 420. La bomba 410 se puede configurar para acomodar las propiedades del primer material 110 y la bomba 420 se puede configurar para acomodar las propiedades del material de salida 102.

La bomba 420 descrita en las Figuras 6 y 7, se refiere generalmente a una bomba de tornillo simple. En esta modalidad, el miembro de bomba 4022 incluye una parte del collar 4030 dispuesta alrededor de la parte 3020 del eje de transmisión 500. La parte del collar 4030 rota con la parte 3020 del eje de transmisión 500 como una unidad. La parte del collar 4030 incluye uno o más miembros de desplazamiento de fluido 4040. La parte del collar 4030 incluye un miembro de desplazamiento de fluido simple 4040 que tiene una forma helicoidal que circunscribe la parte del collar 4030 a lo largo de un paso helicoidal.

Con referencia a la Figura 11, se ilustra el interior de la segunda cámara 320. La bomba 420 imparte un flujo axial (identificado por la flecha "A3" y la flecha "A4") en el material de salida 102 dentro de la segunda cámara 320 lejos de la segunda extremidad abierta 334 de la cámara de mezcla 330.

La bomba 420 se puede configurar para impartir un flujo circunferencial (identificado por la flecha "C4") en el material de salida 102 cuando este viaja fuera de la segunda extremidad abierta 334 de la cámara de mezcla 330. El flujo circunferencial impartido en el material de salida 102 puede ayudar a reducir una cantidad de trabajo requerida por el rotor 600. El flujo circunferencial también direcciona el material de salida 102 hacia el puerto de salida 3010.

En una modalidad alternativa, la bomba 420 sustancialmente puede tener la misma configuración de la bomba 410 descrita en la Figura 10. En tal modalidad, una o más aspas 2042 están configuradas para impartir un flujo circunferencial en el material de salida 102 cuando este viaja fuera de la segunda extremidad abierta 334 de la cámara de mezcla 330.

Como se aprecia por aquellas personas con conocimiento en la técnica, diversos parámetros del dispositivo de mezcla 100 se pueden modificar para obtener características de mezclas diferentes. Los parámetros ejemplos que se pueden modificar incluyen el tamaño de los agujeros de paso 608, la forma de los agujeros de paso 608, el ordenamiento de los agujeros de paso 608, el número de agujeros de paso 608, el tamaño de las aberturas 708, la forma de las aberturas 708, el ordenamiento de las aberturas 708, el número de aberturas 708, la forma del rotor 600, la forma del estator 700, el ancho de la cámara de mezcla 330, la longitud de la cámara de mezcla 330, la velocidad de rotación del eje de transmisión 500, la velocidad axial impartida por la bomba interna 410, la velocidad circunferencial impartida por la bomba interna 410, la velocidad axial impartida por la bomba interna 420, la velocidad circunferencial impartida por la bomba interna 420, la configuración de las alteraciones (por ejemplo, textura, proyecciones, depresiones, aberturas, y similares) formadas sobre la superficie externa 606 del rotor 600, la configuración de las alteraciones (por ejemplo, textura, proyecciones, depresiones, aperturas, y similares) formadas sobre la superficie internas 706 del estator 700, y similares.

MODALIDAD ALTERNATIVA Con referencia a la Figura 12, se representa un dispositivo de mezcla 5000. El dispositivo de mezcla 5000 es una modalidad alternativa del dispositivo de mezcla 100. En este documento se han usado numerosas referencias idénticas para identificar los componentes del dispositivo de mezcla 5000 que son sustancialmente similares a los componentes correspondientes del dispositivo de mezcla 100. Sólo serán descritos los componentes del dispositivo de mezcla 5000 que difieren de los componentes del dispositivo de mezcla 100.

El dispositivo de mezcla 5000 incluye un alojamiento 5500 para alojar el rotor 600 y el estator 5700. El estator 5700 se puede acoplar sin rotación por su primera extremidad 5712 y su segunda extremidad 5714 a la alojamiento 5500. Una cámara 5800 se define entre la alojamiento 5500 y una parte 5820 del estator 5700 flanqueada por la primera extremidad 5712 y la segunda extremidad 5714. El alojamiento 5500 incluye un puerto de entrada 5830 que proporciona el acceso a la cámara 5800. El puerto de entrada 5830 se puede orientar sustancialmente ortogonal al eje de rotación "ót" sin embargo, esto no es un requerimiento.

El estator 5700 incluye una pluralidad de agujeros de paso 5708 que se conectan a la cámara 5800 y la cámara de mezcla 330 (definida entre el rotor 600 y el estator 5700) . Una bomba externa 230 se puede usar para bombear el tercer material 130 (que puede ser idéntico al segundo material ; 120) en la cámara 5800 mediante el puerto de entrada 5830;. El tercer material 130 bombeado en la cámara 5800 puede entrar a la cámara de mezcla 330 mediante los agujeros de paso 5708 formados en el estator 5700. El tercer material 130 se puede forzar desde el canal 5800 por la bomba 230, la flotación del tercer material 130 en relación al primer material 110, y una combinación de éstos. Como el rotor 600 rota, éste también puede atraer el tercer material 130 desde el canal 5800 a la cámara de mezcla 330. El tercer material 130 puede entrar a la cámara de mezcla 330 como burbujas, gotas, partículas, y similares, que se imparten con una velocidad circunferencial por el rotor 600.

MODALIDAD ALTERNATIVA Una modalidad alternativa del dispositivo de mezcla 100 se puede construir usando una sección central 5900 representada en la Figura 13 y un alojamiento del cojinete 5920 representado en la Figura 14. La Figura 13 representa la sección central 5900 que tiene en su interior el estator 700 (véase la Figura 7) . En este documento se han usado numerosas referencias idénticas para identificar los componentes asociados con la sección central 5900, que son sustancialmente similares a los componentes correspondientes del dispositivo de mezcla 100. Solamente serán descritos los componentes de la sección central 5900 que difieren de los componentes de la sección central 522. La sección central 5900 y el estator 700 están fabricados de un material conductivo tal como un metal (por ejemplo, acero inoxidable) . El puerto de entrada 1010 y el puerto de salida 3010 se construyen de un material no conductivo tal como el plástico (por ejemplo, PET, Teflón, nylon, PVC, policarbonato, ABS, Delrin, polisulfona, etc.).

Un contacto eléctrico 5910 se acopla a la sección central 5900 y se configura para entregar una carga a esta. La sección central 5900 conduce una carga eléctrica aplicada por el contacto eléctrico 5910 al estator 700. En modalidades adicionales, la sección central 5900 se puede fabricar de material no conductivo. En tales modalidades, el contacto eléctrico 5910 puede pasar a través de la sección central 5900 y acoplarse al estator 700. La carga eléctrica aplicada por el contacto eléctrico 5910 al estator 700 puede ayudar a facilitar las reacciones químicas redox u otras dentro la cámara de mezcla 330.

Opcionalmente, el aislante (no mostrado) se puede disponer alrededor de la sección central 5900 para aislar eléctricamente el ambiente. Además, el aislante se puede , usar entre la sección central 5900 y los sellos mecánicos primero 524 y segundo 526 que lo flanquean para aislarlo eléctricamente de otros componentes del dispositivo de mezcla .

Retornando ahora a la Figura 14 , será descrito el alojamiento del cojinete 5920. El alojamiento del cojinete 5920 se dispone circunferencialmente alrededor de la parte 726 del eje de transmisión 500. Un contacto eléctrico 5922 se acopla al alojamiento del cojinete 5920. Un contacto de escobilla rotativo 5924 proporciona una conexión eléctrica entre el eje de transmisión 500 y el contacto eléctrico 5922.

En esta modalidad, el eje de transmisión 500 y el rotor 600 se construyen de un material conductivo tal como un metal (por ejemplo, acero inoxidable) . El alojamiento del cojinete 5920 se puede construir tanto de un metal conductivo como no conductivo. Una carga eléctrica se aplica al eje de transmisión 500 por el contacto eléctrico 5922 y el contacto de escobilla rotativo 5924. La carga eléctrica se conduce por el eje de transmisión 500 al rotor 600.

La modalidad alternativa del dispositivo de mezcla 100 construido usando la sección central 5900 representado en la Figura 13 y el alojamiento del cojinete 5920 representado en la Figura 14 se puede operar en al menos dos maneras . Primero, los contactos eléctricos 5910 y 5922 se pueden configurar para no proporcionar una carga eléctrica al estator 700 y al rotor 600, respectivamente. En otras palabras, ninguno de los contactos eléctricos 5910 y 5922 se conectan a una fuente de corriente, una fuente de voltaje, y similares.

Alternativamente, los contactos eléctricos 5910 y 5922 se pueden configurar para proporcionar una carga eléctrica al estator 700 y al rotor 600, respectivamente. Por ejemplo, los contactos eléctricos 5910 y 5922 pueden estar acoplados a una fuente de voltaje DC (no mostrada) que suministra un voltaje estable o constante a través de los contactos eléctricos 5910 y 5922. El terminal negativo de la fuente de voltaje DC puede estar acoplado a cualquiera de los contactos eléctricos 5910 y 5922 y el terminal positivo de la fuente de voltaje DC puede estar acoplado a otros contactos eléctricos 5910 y 5922. El voltaje suministrado a través de los contactos eléctricos 5910 y 5922 puede estar en el intervalo de aproximadamente 0.0001 voltios a aproximadamente 1000 voltios. En modalidades particulares, el voltaje puede estar en el intervalo de aproximadamente 1.8 voltios a aproximadamente 2.7 voltios. A manera de otro ejemplo, se puede usar un voltaje DC pulsado que tiene un ciclo de trabajo entre aproximadamente 1% a aproximadamente 99%.

Mientras que los ejemplos anteriores de métodos de operación del dispositivo de mezcla aplican un voltaje DC a través de los contactos eléctricos 5910 y 5922, como se aprecia por aquellas personas con conocimiento ordinario en la técnica, un voltaje AC simétrico o un voltaje AC asimétrico con diversas formas y magnitudes se puede aplicar a través de los contactos eléctricos 5910 y 5922 y tales modalidades están dentro del alcance de la presente invención.

MEZCLA DENTRO DE LA CAMARA DE MEZCLA 330 Como se mencionó anteriormente, en el dispositivo 10 de la técnica anterior (mostrado en la Figura 1) , el primer material 110 entró al canal 32 entre el rotor 12 y el estator 30 a través de un puerto de entrada limitado 37 situado a lo largo solamente de una parte de la segunda extremidad abierta del canal 32. Asimismo, el material de salida 102 salió del canal 32 mediante un puerto de salida simple limitado 40 situado a lo largo solamente de una parte de la primera extremidad abierta del canal 32. Este ordenamiento provocó una fricción indeseable e innecesaria. l reemplazar el puerto de entrada limitado simple 37 y el puerto de salida limitado simple 40 con las cámaras 310 y 320, respectivamente, se redujo la fricción. Además, el primer material 110 no sortea una esquina antes de entrar a la cámara de mezcla 330 y el material de salida 102 no sortea una esquina antes de salir a la cámara de mezcla 330. Además, las cámaras 310 y 320 mantienen la velocidad circunferencial del material antes de entrar, y después de salir del canal 32.

Como consecuencia, la caída de presión a través del dispositivo de mezcla 100 se redujo sustancialmente . En las modalidades representadas en las Figuras 2, 4-9, y 11, la caída de presión entre el puerto de entrada 1010 y el puerto de salida 3010 es de sólo aproximadamente 12 psi cuando el dispositivo de mezcla 100 se configura para producir aproximadamente 60 galones del material de salida 102 por minuto. Esto es un progreso sobre el dispositivo 10 de la técnica anterior representado en la Figura 1, que cuando produjo aproximadamente 60 galones del material de salida por minuto fue de al menos 26 psi. En otras palabras, la caída de presión a través del dispositivo de mezcla 100 es menos de la mitad que la experimentada por el dispositivo 10 de la técnica anterior.

De acuerdo con aspectos adicionales, la inclusión de las bombas 410 y 420, que se energizan por el eje de transmisión 500, proporcionan una configuración que es sustancialmente más eficaz en los materiales de mezcla y que requiere menos energía que las bombas externas usadas en la técnica anterior.

MICRO-CAVITACION Durante la operación del dispositivo de mezcla 100, los materiales de entrada pueden incluir el primer material 110 (por ejemplo, un fluido) y el segundo material 120 (por ejemplo, un gas) . El primer material 110 y el segundo material 120 se mezclan dentro de la cámara de mezcla 330 formada entre el rotor 600 y el estator 700. La rotación del rotor 600 dentro el estator 700 agita el primer material 110 y el segundo material 120 dentro la cámara de mezcla 330. Los agujeros de paso 608 formados en el rotor 600 y/o las aberturas 708 formadas en el estator 700 imparten turbulencia en el flujo del primer material 110 y el segundo material 120 dentro la cámara de mezcla 330.

Sin estar limitados por la teoría, la eficacia y persistencia de la difusión del segundo material 120 en el primer material 110 se cree que sea provocada, en parte, por la micro-cavitación, que se describe en relación con las Figuras 15-17. Siempre que un material fluye sobre una superficie lisa, se establece un flujo relativamente laminar con una capa delgada límite que_ es estática o se mueve muy lento debido a la tensión superficial entre el fluido en movimiento y la superficie estática. Los agujeros de paso 608 y opcionalmente , las aberturas 708, interrumpen el flujo laminar y pueden provocar compresión y descompresión localizada del primer material 110. Si la presión durante los ciclos de descompresión es suficientemente baja, se formarán vacíos (burbujas por cavitación) en el material. Las burbujas formadas por cavitación generan un patrón de flujo rotatorio 5990, similar a un tornado, debido a que el área de baja presión localizada atrae el material huésped y el material de infusión, como se muestra en la Figura 15. Cuando las burbujas formadas por cavitación se desploman, se producen presiones extremadamente altas. Como dos aberturas alineadas (por ejemplo, una de las aberturas 708 y uno de los agujeros de paso 608) pasan mutuamente, ocurre una sucesión (onda de choque), generando una energía significativa. La energía asociada con la cavitación y la sucesión mezcla el primer material 110 y el segundo material 120 juntos, a un grado extremadamente alto, quizás a nivel molecular.

La velocidad tangencial del rotor 600 y el número de aberturas que pasan mutuamente por rotación pueden dictar la frecuencia del dispositivo de mezcla 100. Se ha determinado que la operación del dispositivo de mezcla 100 dentro del intervalo de frecuencia ultrasónica puede ser beneficiosa en muchas aplicaciones. Se cree que la operación del dispositivo de mezcla 100 en la región ultrasónica de frecuencias proporciona la energía máxima de choque sucesivo para intercambiar el ángulo de enlace de la molécula de fluido, que es capaz de transportar una cantidad adicional del segundo material 120 el cual normalmente no sería capaz de retener. Cuando el dispositivo de mezcla 100 se usa como difusor, la frecuencia a la que opera el dispositivo de mezcla 100 parece afectar el grado de difusión, conduciendo a la persistencia mucho más larga del segundo material 120 (material de infusión) en el primer material 110 (material huésped) .

Con referencia ahora a la Figura 15, se proporciona una modalidad alternativa del rotor 600, el rotor 6000. Las cavitaciones creadas dentro del primer material 110 en la cámara de mezcla 330 pueden estar configuradas para ocurrir a diferentes frecuencias a lo largo de la longitud de la cámara de mezcla 330. Las frecuencias de las cavitaciones se pueden alterar mediante la alteración del número y/o la ubicación de los agujeros de paso 6608 a lo largo de la longitud del rotor 600. Cada uno de los agujeros de paso 6608 puede ser sustancialmente similar a los agujeros de paso 608 (discutidos anteriormente) .

A manera de ejemplo no limitativo, el rotor 6000 se puede subdividir en tres secciones de ejemplos separadas 6100, 6200, y 6300. Los agujeros de paso 6608 aumentan en densidad desde la sección 6100 a la sección 6200, siendo el número de agujeros en la sección 6100 mayor que el número de agujeros en la sección 6200. Los agujeros de paso 6608 también aumentan en densidad desde la sección 6200 a la sección 6300, siendo el número de agujeros en la sección 6200 mayor que el número de agujeros en la sección 6300. Cada una de las secciones 6100, 6200, y 6300 crea las sucesiones dentro de su área en particular a una frecuencia diferente debido a la diferencia de números de agujeros de paso 6608 formados en ese lugar.

Al fabricar el rotor 6000 con un número de agujeros de paso 6608 deseado apropiadamente ordenados en un área en particular, se puede determinar la frecuencia deseada de las sucesiones dentro de la cámara de mezcla 330. Del mismo modo, la frecuencia deseada de las cavitaciones se puede determinar por un deseado número de aberturas 708 apropiadamente ordenadas en un área en particular bajo el estator 700 dentro del cual el rotor 600 rota. Además, la frecuencia deseada (o frecuencias) de las sucesiones dentro de la cámara de mezcla 330 se pueden alcanzar por la selección tanto de un número particular, como por el ordenamiento de las aberturas 708 formadas en el estator 700, y un número y ordenamiento particular de los agujeros de paso 608 formados en el rotor 600.

Las Figuras 19-21, representan diversos ordenamientos alternativos de las aberturas 708 formadas en el estator 700 y los agujeros de paso 608 formados en el rotor 600 configurados para alcanzar diferentes resultados en relación a las cavitaciones creadas. La Figura 16 ilustra una configuración en la que las aberturas 708 y los agujeros de paso 608 se alinean a lo largo de un eje 7000 que no es paralelo a ninguna linea (por ejemplo, la línea 7010) dibujada a través del eje de rotación "a" del rotor 600. En otras palabras, si el rotor 600 tiene una forma cilindrica, el eje 7000 no pasa a través del centro del rotor 600. De este modo, el primer material 110 dentro de la cámara de mezcla 330 no se orientará perpendicular a las compresiones y descompresiones creadas por las aberturas 708 y los agujeros de paso 608. Las compresiones y descompresiones tendrán, en su lugar, un vector de fuerza que tiene al menos un componente paralelo al flujo circunferencial (en la dirección de la flecha "C3" de la Figura 9) del primer material 110 dentro de la cámara de mezcla 330.

Con relación a la alineación de las aberturas 708 y los agujeros de paso 608 también pueden afectar la creación de cavitaciones en la cámara de mezcla 330. La Figura 17 ilustra una modalidad en la que las aberturas 708 están en registro a través de la cámara de mezcla 330 con los agujeros de paso 608. En esta modalidad, la rotación del rotor 600 pone los agujeros de paso 608 del rotor en alineación directa con las aberturas 708 del estator 700. Cuando están en alineación directa con cada uno, las fuerzas compresoras y descompresoras creadas por las aberturas 708 y los agujeros de paso 608 están directamente alineadas mutuamente.

En la modalidad descrita en la Figura 18, las aberturas 708 y los agujeros de paso 608 se desplazan por una cantidad de desplazamiento "X" a lo largo del eje de rotación "a" . A manera de ejemplo no limitativo, la cantidad de desplazamiento "X" se puede determinar en función del tamaño de las aberturas 708. Por ejemplo, la cantidad de desplazamiento "X" puede ser aproximadamente igual a la mitad del diámetro de las aberturas 708. Alternativamente, la cantidad de desplazamiento "X" se puede determinar en función del tamaño de los agujeros de paso 608. Por ejemplo, la cantidad de desplazamiento "X" puede ser aproximadamente igual a la mitad del diámetro de los agujeros de paso 608. Si las características (por ejemplo, depresiones, proyecciones, etc.) distintas de, o adicionales a los agujeros de paso 608 y las aberturas 708 se incluyen en el rotor 600 o en el estator 700, la cantidad de desplazamiento "X" se puede determinar en función del tamaño de tales características. De esta manera, las fuerzas compresoras y descompresoras causadas por las aberturas 708 del estator 700 y los agujeros de paso 608 del rotor 600 colisionan con un desplazamiento ligero provocando fuerzas adicionales de rotación y torsión dentro de la cámara de mezcla 330. Estas fuerzas adicionales aumentan la mezcla (por ejemplo, acción difusiva) del segundo material 120 en el primer material 110 dentro la cámara de mezcla 330.

Con referencia ahora a las Figuras 22-25, se proporcionan ejemplos no limitativos de las formas de sección transversal adecuadas para las aberturas 708 y los agujeros de paso 608. La forma de sección transversal de las aberturas 708 y/o los agujeros de paso 608 pueden ser cuadradas como se describe en la Figura 22, circulares como se describe en la Figura 23, y similares.

Varias formas de sección transversal de las aberturas 708. y/o agujeros de paso 608 se pueden usar para alterar el flujo del primer material 110 cuando el rotor 600 rota dentro del estator 700. Por ejemplo, la Figura 24 representa una forma de sección transversal en lágrima que tiene una parte estrecha 7020 opuesta a una parte ancha 7022. Si los agujeros de paso 608 tienen esa forma de lágrima, cuando el rotor 600 rota (en la dirección generalmente indicada por la flecha "F"), las fuerzas ejercidas sobre el primer material 110, el segundo material 120, y opcionalmente el tercer material 130 dentro la cámara de mezcla 330 aumentan cuando los materiales pasan desde la parte ancha 7022 de la lágrima a la parte estrecha 7020.

Fuerzas de rotación adicionales pueden ser introducidas en la cámara de mezcla 330 por la formación de las aberturas 708 y/o los agujeros de paso 608 con una configuración en espiral como se ilustra en la Figura 25. El material que fluye dentro y fuera de las aberturas 708 y/o de los agujeros de paso 608 con la configuración en espiral experimenta una fuerza de rotación inducida por la configuración en espiral. Los ejemplos descritos en las Figuras 22-25 se proporcionan como descripciones no limitativas de las modalidades alternativas que se pueden emplear dentro del dispositivo de mezcla 100. Al aplicar los conocimientos ordinarios en la técnica, las aberturas 708 y/o los agujeros de paso 608 pueden estar configurados de numerosas maneras para alcanzar diversas fuerzas sucesivas y de agitación adecuadas para mezclar los materiales dentro de la cámara de mezcla 330., EFECTO DE DOBLE CAPA El dispositivo de mezcla 100 puede estar configurado para crear el material de salida 102 por la interacción dinámica fluida no lineal, compleja, del primer material 110 y el segundo material 120 con turbulencia dinámica compleja, proporcionando una mezcla compleja que favorece, además, los efectos electrocinéticos (descritos a continuación) . El resultado de estos efectos electrocinéticos se puede observar dentro del material de salida 102 como redistribución de cargas y reacciones redox, incluyendo la forma de los electrones solubilizados que se estabilizan dentro del material de salida.

La ionización o disociación de los grupos de superficies y/o la adsorción de iones de un líquido provocan que muchas superficies sólidas en contacto con el líquido se carguen. Con referencia a la Figura 26, una doble capa eléctrica ("EDL") 7100 se forma alrededor de una superficie ejemplo 7110 en contacto con un líquido 7120. En la EDL 7100, los iones 7122 de una carga (en este caso, iones cargados negativamente) se adsorben a la superficie 7120 y forman una capa de superficie 7124 normalmente denominada como una capa de Stern. La capa de superficie 7124 atrae los contraiones 7126 (en este caso, iones cargados positivamente) de carga opuesta e igual magnitud, que forman una capa de contraión 7128 debajo de la capa de superficie 7124 normalmente denominada como una capa difusa. La capa de contraión 7128 se distribuyea más difusamente que la capa de superficie 7124 y se coloca sobre una distribución uniforme e igual de ambos iones en el material a granel/ 7130 a continuación. Para los iones OH- y H+ en agua neutral, el modelo Gouy-Chapman podría sugerir que la capa de contraión difusa se extiende aproximadamente una miera en el agua.

De acuerdo con aspectos particulares, los efectos electrocinéticos mencionados anteriormente se producen por el movimiento del líquido 7120 próximo a la superficie cargada 7110. Dentro del líquido 7120 (por ejemplo, agua, solución salina, y similares) , los iones adsorbidos 7122 que forman la capa de superficie 7124 se fijan a la superficie 7120 incluso cuando el líquido 7120 está en movimiento (por ejemplo, fluyendo en la dirección indicada por la flecha "G" ) ; sin embargo, existe un plano de corte 7132 adentro de la capa de contraión difusa 7128 espaciada de la superficie 7120. De este modo, como el líquido 7120 se mueve, algunos de los contraiones difusos 7126 se transportan lejos de la superficie 7120, mientras que los iones adsorbidos 7122 permanecen en la superficie 7120. Esto produce la llamada 'corriente de flujo' .

Dentro de la cámara de mezcla 330, el primer material 110, el segundo material 120, y opcionalmente , el tercer material 130 están sujetos a un campo electromagnético creado por la superficie interna 705 del estator 700 y/o la superficie externa 606 del rotor 600, un voltaje entre la superficie interna 705 y la superficie externa 606, y/o un efecto electrocinético (por ejemplo, corriente de flujo) provocado por al menos una EDL formada en el primer material 110. Al menos una EDL se puede introducir en el primer material 110 por al menos una de la superficie interna 705 del estator 700 y la superficie externa 606 del rotor 600.

El movimiento del primer material 110 a través de la cámara de mezcla 330 en relación a las alteraciones de superficie (por ejemplo, los agujeros de paso 608 y aberturas 708) crean cavitaciones en el primer material 110 dentro de la cámara de mezcla 330,' que puede difundir el segundo material 120 en el primer material 110. Estas cavitaciones pueden mejorar el contacto entre el primer material 110 y/o el segundo material 120 con la doble capa eléctrica formada sobre la superficie interna 705 del estator 700 y/o la doble capa eléctrica formada sobre la superficie externa 606 del rotor 600. Las relaciones de superficie mayor a volumen de la cámara de mezcla, un mayor tiempo de permanencia de los materiales combinados dentro de la cámara de mezcla, y además en combinación con un tamaño de burbuja promedio pequeño (y por ello sustancialmente mayor al área de superficie de burbuja) previenen impartir eficazmente los efectos mediados por EDL a los materiales de salida de la invención.

En las modalidades en las que la superficie interna 705 y la superficie externa 606 se construyen de un material metálico, tal como acero inoxidable,, el movimiento del líquido 7120 y/o la(s) corriente (s) de flujo facilitan las reacciones redox que involucran H20, OH-, H+, y 02 en la superficie interna 705 y la superficie externa 606.

Con referencia a la Figura 27, sin estar limitado por la teoría, se cree que una sección 7140 de la cámara de mezcla 330 entre la superficie interna 705 y la superficie externa 606 puede ser modelada como un par de platos paralelos 7142 y 7144. Si el primer material 110 es un líquido, el primer material 110 entra a la sección 7140 a través de una entrada "IN" y sale de la sección 7140 a través de una salida "OUT." La entrada "IN" y la salida "OUT" limitan el flujo de entrada y de salida de la sección 7140.

Con referencia a la Figura 28, el área entre los platos paralelos 7142 y 7144 tiene una relación área de superficie a volumen más alta. Por ello, una parte sustancial de la capa de contraión 7128 (y de contraiones 7126) puede estar en movimiento cuando el primer material 110 se mueve entre los platos 7142 y 7144. El número de contraiones 7126 en movimiento puede exceder el número permitido para entrar a la sección 7140 por la entrada "IN" y el número permitido para salir de la sección 7140 por la salida "OUT" . La entrada "IN" y la salida "OUT" alimentan y extraen el primer material 110 de la sección 7140, respectivamente, tienen mucho menos área de superficie (y una relación área de superficie a volumen inferior) que los platos paralelos 7142 y 7144 y por consiguiente reducen la parte de los contraiones 7126 en movimiento en el primer material 110 que entran y abandonan la sección 7140. Por lo tanto, la entrada y salida de la sección 7140 aumenta localmente la corriente de flujo.

Mientras que una corriente de flujo de fondo (identificada por la flecha "BSC" ) provocada por el primer material que fluye 110 sobre cualquier superficie está siempre presente en el interior del dispositivo de mezcla 100, los platos 7142 y 7144 introducen una corriente de flujo aumentada en "exceso" (identificada por la flecha "ESC") dentro de la sección 7140.

Sin una corriente conductora de retorno (identificada por la flecha "RC" ) en los platos 7142 y 7144 en dirección opuesta al flujo del primer material 110, un exceso de carga 7146 con el mismo signo de los iones de absorción 7122 podría ^ acumularse cerca de la entrada "IN", y un exceso de carga 7148 con el mismo signo que el contraión 7126 podría acumularse cerca de la salida "OUT" . Debido a que tales cargas acumuladas 7146 y 7148, son opuestas y por lo tanto se atraen unas a otras, las cargas acumuladas no se pueden generar indefinidamente con el objetivo de combinarlas; por los medios conductores. Si los platos 7142 y 7144 están perfectamente aislados eléctricamente, las cargas acumuladas 7146 y 7148 se pueden reubicar solamente a través del propio primer material 110. Cuando la corriente conductora de retorno (identificada por la flecha "RC" ) es sustancialmente equivalente al exceso de corriente de "flujo (identificada por la flecha "ESC" ) en la sección 7140, se alcanza un estado estable con una corriente de flujo en exceso neta de cero, y una diferencia en el potencial electrostático entre el exceso de carga 7146 cerca a la entrada "IN" , y el exceso de carga 7148 cerca a la salida "OUT" creando una separación de carga en estado estable entre ellos.

La cantidad de la separación de carga, y por ello la ' diferencia de potencial electrostático ' entre el exceso de carga 7146 cerca a la entrada "IN", y el exceso de carga 7148 cerca a la salida "OUT" , depende de la energía adicional por unidad de carga suministrada por una bomba (por ejemplo, el rotor 600, la bomba interna 410, y/o la bomba externa 210) para "empujar" la carga contra el campo eléctrico opuesto (creado por la separación de carga) para producir una tasa de flujo líquido que se aproxima a la tasa de flujo obtenida por un líquido sin iones (es decir, los iones 7122 y 7126) . Si los platos 7142 y 7144 son aislantes, la diferencia de potencial electrostático es una medida directa de la EMF que la bomba (por ejemplo, el rotor 600, la bomba interna 410 y/o la bomba externa 210) puede generar. En este caso, se podría medir la diferencia de potencial electrostático usando un voltímetro con un par de plomos al colocar uno de los plomos en el primer material 110 cerca de la entrada "IN" , y el otro plomo en el primer material 110 cerca de la salida "OUT" .

Con el aislamiento de los platos 7142 y 7144, cualquier corriente de retorno es puramente una corriente iónica (o flujo de iones) , en la que la corriente de retorno sólo involucra la conducción de iones a través del primer material 110. Si otros mecanismos conductores a través de vías más conductoras están presentes entre el exceso de carga 7146 cerca a la entrada "IN", y el exceso de carga 7148 cerca a la salida "OUT" , la corriente de retorno puede usar aquellas vías más conductoras. Por ejemplo, los platos metálicos conductores 7142 y 7144 pueden proporcionar las vías más conductoras; sin embargo, estas vías más conductoras sólo trasmiten una corriente de electrones y no la corriente iónica.

Como se. aprecia por aquellas personas con conocimiento ordinario en la técnica, para transferir la carga portada por un ion a uno o más electrones en el metal, y viceversa, deberán ocurrir una o más reacciones de oxidación-reducción en la superficie del metal, produciendo los productos de reacción. Asumiendo que el primer material 110 es agua (H20) y el segundo material 120 es oxígeno (02) , un ejemplo no limitativo de una reacción redox, que podría inyectar la carga negativa en los platos de conducción 7142 y 7144 incluyen la siguiente reacción de seraicelda conocida: 02 + H20 -> 03+2H+ +2e", Nuevamente, asumiendo que el primer material 110 es agua (H20) y el segundo material 120 es oxígeno (02) , un ejemplo no limitativo de una reacción redox incluye la siguiente reacción de semicelda conocida, que podría eliminar la carga negativa de los platos de conducción 7142 y 7144 incluye la siguiente reacción de semicelda conocida: 2H+ +e~ -> H2, Con los platos metálicos de conducción 7142 y 7144, se cree que la mayor parte de la corriente de retorno sea una corriente de electrones, debido a que los platos de conducción 7142 y 7144 son más conductores que el primer material 110 (que las reacciones redox sean suficientemente rápidas no es un factor limitante) . Para los platos metálicos de conducción 7142 y 7144, se acumula una separación de carga más pequeña entre la entrada "IN" y la' salida "OUT" , y un potencial electrostático mucho más pequeño existe entre ellos. Sin embargo, esto no significa que la EMF es más pequeñ .

Como se describió anteriormente, la EMF se relaciona a la energía por unidad de carga que proporciona la bomba para facilitar el flujo del primer material 110 contra el campo eléctrico opuesto creado por la separación de carga. Debido a que el potencial electrostático es más pequeño, la bomba puede suministrar menos energía por unidad de carga para provocar que el primer material 110 fluya. Sin embargo, en el ejemplo anterior las reacciones redox necesariamente no ocurren de manera espontánea, y de este modo pueden requerir una entrada de trabajo, que se puede proporcionar por la bomba. Por lo tanto, una parte de la EMF (que no se refleja en la diferencia del potencial electrostático más pequeña) se puede usar para proporcionar la energía necesaria para conducir a las reacciones redox.

En otras palabras, los mismos diferenciales de presión proporcionados por la bomba para empujar en contra del campo eléctrico creado por la separación de carga par el aislamiento de los platos 7142 y 7144, se pueden usar tanto para "empujar" la carga a través de los platos conductores 7142 y 7144 como para accionar las reacciones redox .

Con referencia a la Figura 29, los inventores proporcionan una instalación experimental para un experimento. El experimento incluyó un par de frascos Erlenmeyer estándares de 500 mi separados sustancialmente idénticos 7150 y 7152, cada uno contiene un volumen de agua desionizada 7153. Un tapón de goma '7154 se insertó en la extremidad abierta de cada uno de los frascos 7150 y 7152. El tapón 7154 incluyó tres vías, una de ellas para un tubo hueco 7156, un electrodo positivo 7158, y un electrodo negativo 7160. Con respecto a cada uno de los frascos 7150 y 7152, cada tubo hueco 7156, el electrodo positivo 7158, y el electrodo negativo 7160 se extienden todos desde el exterior del frasco, a través del tapón 7154, y hacia el agua desionizada 7153 dentro del frasco. El electrodo positivo 7158 y el electrodo negativo 7160 se construyeron de acero inoxidable. Los tubos huecos 7156 en ambos frascos 7150 y 7152 tenían una parte terminal abierta 7162 acoplada a un suministro de oxígeno común 7164. El electrodo positivo 7158 y el electrodo negativo 7160 se insertaron en el frasco 7152 donde se acoplaron a un extremo positivo y un extremo negativo, respectivamente, de un suministrador de fuerza DC 7168. Exactamente el mismo aspersor se usó en cada frasco.

El oxígeno fluyó a través de los tubos huecos 7156 en ambos frascos 7150 y 7152 a una tasa de flujo (alimento) de aproximadamente 1 SCFH a aproximadamente 1.3 SCFH (tasa de flujo combinada) . El voltaje aplicado a través del electrodo positivo 7158 y el electrodo negativo 7160 insertado en el frasco 7152 fue de aproximadamente 2.55 voltios. Este valor se seleccionó debido a que se cree que sea un valor de voltaje electroquímico suficiente para afectar todas las especies de oxígeno. Este voltaje se aplicó continuamente de tres a cuatro horas durante las cuales el oxígeno del suministrador 7164 se burbujeó en el agua desionizada 7153 en cada uno de los frascos 7150 y 7152.

La prueba del agua desionizada 7153 en el frasco 7150 con HRP y pirogalol dio una actividad de reacción del pirogalol mediada por HRP, consistente con las propiedades de los fluidos producidos con las modalidades alternativas de rotor/estator descritas en este documento. La densidad óptica de la HRP fue aproximadamente 20% superior con relación a las soluciones presurizadas o de burbujeo fino de contenido de oxígeno equivalente. Los resultados de este experimento indican que la mezcla dentro de la cámara de mezcla 330 involucra una reacción redox. De acuerdo con aspectos particulares, las cámaras de mezcla de la invención se tienen en cuenta para los materiales de salida que comprenden electrones adicionales que se estabilizan ya sea con la estructura de agua rica en oxígeno dentro de las soluciones de salida de la invención o por alguna forma de especies de oxígeno presentes debido a los efectos eléctricos en el proceso .

Además, el agua desionizada 7153 en ambos frascos 7150 y 7152 se probó para el ozono y el peróxido de hidrógeno empleando ampollas de prueba colorimétricas estándares en la industria con una sensibilidad de 0.1 ppm para el peróxido de hidrógeno y 0.6 ppm para el ozono. No hubo indicación positiva de ninguna de las especies hasta de los límites de detección de esas ampollas.

TIEMPO DE PERMANENCIA El tiempo de permanencia es una cantidad de tiempo del primer material 110, el segundo material 120, y opcionalmente el tercer material 130 consumido en la cámara de mezcla 330. La relación entre la longitud de la cámara de mezcla 330 y el diámetro de la cámara de mezcla 330 pueden afectar significativamente el tiempo de permanencia. Mientras mayor sea la relación, mayor es el tiempo de permanencia. Como se mencionó en la Sección de Antecedentes, el rotor 12 del dispositivo 10 de la técnica anterior (véase la Figura 1) tenía un diámetro de aproximadamente 7.500 pulgadas y una longitud de aproximadamente 6.000 pulgadas que proporcionan una relación longitud a diámetro de aproximadamente 0.8. En contraposición, en modalidades particulares, la longitud de la cámara de mezcla 330 del dispositivo de mezcla 100 es aproximadamente 5 pulgadas y el diámetro "DI" del rotor 600 es aproximadamente 1.69 pulgadas lo que produce una relación entre la longitud y el diámetro de aproximadamente 2.95.

El tiempo de permanencia representa la cantidad de tiempo que el primer material 110, el segundo material 120, y opcionalmente el tercer material 130 son capaces de interactuar con el fenómeno electrocinético descrito en este documento. El dispositivo 10 de la técnica anterior se configura para producir aproximadamente 60 galones del material de salida 102 por minuto y el dispositivo de mezcla 100 se configura para producir aproximadamente 0.5 galones del material de salida 102 por minuto, el dispositivo 10 de la técnica anterior (véase la Figura 1) tenía un tiempo de permanencia del fluido de aproximadamente 0.05 segundos, mientras que . las modalidades del dispositivo de mezcla 100 tienen un tiempo de permanencia sustancialmente mayor (aproximadamente 7 veces mayor) de aproximadamente 0.35 segundos. Este tiempo de permanencia más largo permite al primer material 110, al segundo material 120, y opcionalmente al tercer material 130 interactuar mutuamente y con las superficies 606 y 705 (véase la Figura 7) dentro la cámara de mezcla 330 por un tiempo aproximadamente 7 veces mayor que el tiempo posible en el dispositivo 10 de la técnica anterior. En modalidades adicionales, el tiempo de permanencia es al menos 1.5 veces, al menos 2 veces, al menos 3 veces, al menos 4 veces, al menos 5 veces, al menos 6 veces, al menos 7 veces o mayor, que el tiempo posible en el dispositivo 10 de la técnica anterior.

Como referencia a la Tabla 4 a continuación, los tiempos de permanencia anteriores se calcularon primero por la determinación de la tasa de flujo para cada dispositivo en galones por segundo. En el caso del dispositivo 10 de la técnica anterior se configuró para operar a aproximadamente 60 galones del material de salida por minuto, mientras que el dispositivo de mezcla 100 se configuró para operar en un intervalo más amplio de tasa de flujo, que incluye a un intervalo óptimo de aproximadamente 0.5 galones del material de salida por minuto. La tasa de flujo se convirtió después a pulgadas cúbicas por segundo multiplicando la tasa de flujo en galones por segundo por el número de pulgadas cúbicas en un galón (es decir, 231 pulgadas cúbicas) . Después, el volumen (12.876 pulgadas cúbicas) del canal 32 del dispositivo 10 de la técnica anterior se dividió por la tasa de flujo del dispositivo (231 pulgadas cúbicas/segundo) para obtener el tiempo de permanencia (en segundos) y el volumen (0.673 pulgadas cúbicas) de la cámara de mezcla 330 del dispositivo de mezcla 100 se dividió por la tasa de flujo (1.925 pulgadas cúbicas/segundo) del dispositivo (en pulgadas cúbicas por segundo) para obtener el tiempo de permanencia (en segundos) .

Tabla 4. El dispositivo de la invención puede acomodar un intervalo de los tiempos de permanencia, incluyendo un tiempo de permanencia sustancialmente aumentado (por ejemplo, 7 veces) en relación con los dispositivos de la técnica anterior .

Volumen Tasa de Tasa de de Tiempo de Tasa de Flujo Flujo Muestra Permanenc Disposi Flujo Pulgadas Galones en la ia tivo Galones/ Cúbicas / Cámara (Segundos Segundo Minuto / (Pulgadas ) Segundo Cúbicas) Disposi tivo de la 60 1.000 231.000 12.876 0.056 técnica anterio r 10 Disposi tivo de 2 0.033 7.700 0.673 0.087 Mezcla 100 Disposi tivo de 0.5 0.008 1.925 0.673 0.350 Mezcla 100 VELOCIDAD DE INFUSION Aspectos particulares del dispositivo de mezcla 100 proporciona una tasa mejorada de infusión de oxígeno por encima de la técnica anterior, incluyendo una tasa por encima del dispositivo 10 de la técnica anterior (véase la Figura 1) . Cuando el primer material 110 es agua y el segundo material 120 es oxígeno, ambos se procesan por el dispositivo de mezcla 100 en un paso único (es decir, el bloque de retorno de la Figura 2 se fija en "NO") a o cerca de 20°centígrados, el material de salida 102 tiene un nivel de oxígeno disuelto de aproximadamente 43.8 partes por millón. En ciertos aspectos, un material de salida con aproximadamente 43.8 ppm de oxígeno disuelto se crea en aproximadamente 350 milisegundos mediante el flujo de la invención a través de los métodos no presurizados (recipiente no presurizado) de la invención. En contraposición, cuando el primer material 110 (agua) y el segundo material 120 (oxígeno) se procesaron ambos en un único paso a o cerca de 20° centígrados por el dispositivo 10 de la técnica anterior, el' material de salida tuvo un nivel de oxígeno disuelto de solamente 35 partes por millón en un paso único de 56 milisegundos .

MATERIAL DE SALIDA 102 Cuando el primer material 110 es un líquido (por ejemplo, agua dulce, salina, GATORADE®, y similares) y el segundo material 120 es un gas (por ejemplo, oxígeno, nitrógeno, y similares) , el dispositivo de mezcla 100 puede difundir el segundo material 120 en el primer material 110. Lo siguiente discute los resultados de los análisis realizados en el material de salida 102 para caracterizar una o más propiedades del material de salida 102 derivado del que se procesaó por el dispositivo de mezcla 100.

Cuando el primer material 110 es la solución salina y el segundo material 120 es gas oxígeno, los experimentos indicaron que la inmensa mayoría de burbujas de oxígeno producidas dentro de la solución salina no son mayores que 0.1 mieras en tamaño.

DISMINUCIÓN DE LOS NIVELES DE OXIGENO DISUELTO Con referencia ahora a la Figura 30, se describen los niveles de OD en agua procesada con oxígeno en el dispositivo de mezcla 100 y almacenada en una botella plástica de 500 mi con pared delgada y una botella de vidrio de 1000 mi. Cada una de botellas se tapó y almacenó a 65 grados Fahrenheit. El punto 7900 es el nivel de OD en el embotellado. La línea 7902 describe el estado de equilibrio de la Ley de Henry (es decir, la cantidad de oxígeno disuelto que debe estar dentro del agua a 65 grados Fahrenheit) , que es un nivel de OD de ligeramente menor que 10 ppm. Los puntos 7904 y 7906 representan los niveles de OD dentro del agua en la botella plástica a los 65 días y 95 días respectivamente. Como se aprecia en un punto 7904, cuando la botella plástica se abre aproximadamente 65 días después del embotellado, el nivel de OD dentro del agua es aproximadamente 27.5 ppm. Cuando la botella se abre aproximadamente 95 días después del embotellado, como se indica en el punto 7906, el nivel de OD es aproximadamente 25 ppm. Asimismo, para la botella de vidrio, el nivel de OD es de aproximadamente 40 ppm a los 65 días como se indica en el punto 7908 y es de aproximadamente 41 ppm a los 95 días como se describe en el punto 7910. De este modo, la Figura 30 indica que los niveles de OD dentro de la botella plástica como de la botella de vidrio permanecen relativamente altos a 65 grados Fahrenheit.

Con referencia ahora a la Figura 30, se describen los niveles de OD en el agua enriquecida con oxígeno en el dispositivo de mezcla 100 y almacenada en una botella plástica de 500 mi con pared delgada y una botella de vidrio de 1000 mi por al menos 365 días. Cada una de las botellas se tapó y almacenó a 65 grados Fahrenheit. Como se puede observar en la Figura, los niveles de OD del fluido enriquecido con oxígeno permanecieron bastante constantes por al menos 365 días.

Con referencia a la Figura 31, se describen los niveles de OD en el agua enriquecida con oxígeno en el dispositivo de mezcla 100 y almacenada en una botella plástica de 500 mi con pared delgada y una botella de vidrio de 1000 mi. Ambas botellas se refrigeraron a 39 grados Fahrenheit. Nuevamente, los niveles de OD del fluido enriquecido con oxígeno permanecieron estables y disminuyeron sólo ligeramente en al menos 365 días.

INTERACCIONES MOLECULARES Tradicionalmente , se piensa que las propiedades cuánticas forman parte de las partículas elementales menores de 10"10 metros, mientras que el mundo macroscópico de nuestra vida cotidiana se refiere como clásico, porque se comporta según las leyes de movimiento de Newton.

Recientemente, se ha descrito que las moléculas forman agrupamientos que aumentan de tamaño con la dilución. Estos agrupamientos miden varios micrómetros de diámetro, y se ha reportado que aumentan de tamaño de manera no lineal con la dilución. Se ha postulado que los dominios coherentes cuánticos que miden 100 nanómetros de diámetro surgen en el agua pura, y las vibraciones colectivas de las moléculas de agua en el dominio coherente pueden eventualmente engancharse en fase a las fluctuaciones del campo electromagnético, estableciendo oscilaciones estables en el agua, proporcionando una forma de 'memoria' en forma de excitación de las oscilaciones coherentes de laraga duración específicas para disolver sustancias en el agua que cambian la estructura colectiva del agua, lo que a su vez determina las oscilaciones coherentes específicas que se desarrollan. Donde estas oscilaciones se establicen por el acoplamiento de fase en el campo magnético, el agua, tras la dilución, aún puede portar las oscilaciones coherentes 'semillas'. Cuando un agrupamiento de moléculas aumenta de tamaño, su identificación electromagnética es correspondientemente amplificada, reforzando las oscilaciones coherentes portadas por el agua.

A pesar de las variaciones en el tamaño de agrupamiento de las moléculas disueltas y la estructura microscópica detallada del agua, puede existir, no obstante, una especificidad de las oscilaciones coherentes. Un modelo para considerar los cambios en las propiedades del agua se basa en las consideraciones involucradas con la cristalización.

Como referencia de la Figura 36, se muestra un agrupamiento simplificado de agua protonada formando una jaula a nanoescala 8700. Un agrupamiento de agua protonada toma normalmente la forma de H+(H20)n. Algunos agrupamientos de agua protonada se originan naturalmente, tales como en el ionósforo. Sin estar limitado por la teoría, y de acuerdo con aspectos particulares, otros tipos de agrupamientos de agua o estructuras (agrupamientos, nanojaulas, etc) son posibles, incluyendo las estructuras que comprenden oxígeno y los electrones estabilizados impartidos a los materiales de salida de la invención. Los átomos de oxígeno 8704 se pueden atrapar en las estructuras resultantes 8700. La química de la nanojaula de medio enlace permite al oxígeno 8704 y/o electrones estabilizados permanecer disueltos durante periodos de tiempo extendidos. Otros átomos o moléculas, tales como los compuestos medicinales, se pueden encapsular para propósitos de entrega sostenida. La química específica del material de la solución y los compuestos disueltos dependen de las interacciones de esos materiales.

Se ha demostrado mediante los experimentos que los fluidos procesados por el dispositivo de mezcla 100 exhiben características estructurales diferentes que son consistentes con un análisis de fluido en el contexto de una estructura agrupada .

Se ha demostrado que el agua procesada a través del dispositivo de mezcla 100 tiene diferencias estructurales detectables cuando se compara con el agua normal sin procesar. Por ejemplo, se ha demostrado que el agua procesada tiene más dispersión de Rayleigh que la que se observa en el agua sin procesar. En los experimentos que se llevaron a cabo, las muestras de agua procesada y sin procesar se prepararon (mediante el sellado de cada una en botellas separadas) , se codificaron (para la identificación posterior de la muestra procesada y de la muestra sin procesar) , y se enviaron a un laboratorio independiente de prueba para el análisis. Sólo después que las pruebas se completaron, se interpretaron los códigos para revelar qué muestra se había procesado por el dispositivo de mezcla 100.

En el laboratorio, las dos muestras se colocaron en un rayo láser con una longitud de onda de 633 nanómetros. El fluido se había sellado en botellas de vidrios durante aproximadamente una semana de prueba. Con relación a la muestra procesada, la Muestra B dispersó la luz a pesar de su posición relativa a la fuente de láser. Sin embargo, la Muestra A no lo hizo. Después de dos o tres horas posteriores a la abertura de la botella, el efecto de dispersión de la Muestra B desapareció. Estos resultados implican que el agua exhibió una memoria que provoca que el agua retenga sus propiedades y las disipe con el paso del tiempo. Estos resultados también implican que la estructura del agua procesada es ópticamente diferente a la estructura del fluido sin procesar. Finalmente, estos resultados implican qué el efecto óptico no está directamente relacionado con el nivel de OD debido a que el nivel de OD al inicio fue de 45 ppm y al final del experimento se estimó que era de aproximadamente 32 ppm .

Nanoestructuras estabilizadas por carga (por ejemplo, nanoestructuras que contienen oxigeno estabilizadas por carga) : Como se describió en este documento anteriormente bajo "Efecto de Doble Capa," "Tiempo de Permanencia," "Tasa de Infusión," y "Medidas del tamaño de las burbujas," el dispositivo de mezcla 100 crea en materia de milisegundos , una interacción dinámica del fluido no lineal única del primer material 110 y el segundo material 120 con turbulencia dinámica, compleja, proporcionando un mezcla compleja en contacto con un área de superficie efectivamente enorme (incluyendo aquellas del dispositivo y de las burbujas de gas excepcionalmente pequeñas de menos de 100 nm) que garantiza los nuevos efectos electrocinéticos descritos en este documento. Además, los efectos electrocinéticos (voltaje/corriente) de los elementos localizados se demostraron en este documento (véase el Ejemplo de trabajo 20) usando un dispositivo de mezcla especialmente diseñado que comprende los elementos del rotor y estator aislados.

Como es bien conocido en la técnica, las redistribuciones de carga y/o electrones solvatados se sabe que son altamente inestables en solución acuosa. De acuerdo con aspectos particulares, los efectos electrocinéticos de los solicitantes (por ejemplo, las redistribuciones de carga, que incluyen, en aspectos particulares, los electrones solvatados) sorprendentemente se estabilizan dentro del material de salida (por ejemplo, soluciones salinas, soluciones iónicas) . De hecho, tal como se describe en este documento, la estabilidad de las propiedades y la actividad biológica de los fluidos electrocinéticos de la invención (por ejemplo, R S-60 o Solas) se pueden mantener durante meses en un contenedor hermético para gas, lo que indica la participación del gas disuelto (por ejemplo, el oxígeno) como ayuda para generar y/o mantener, y/o mediar las propiedades y actividades de las soluciones de la invención. Significativamente, como se describió en los ejemplos de trabajo en este documento, las redistribuciones de carga y/o electrones solvatados se configuran de forma estable" en los fluidos electrocinéticos acuosos iónicos de la invención en una cantidad suficiente para proporcionar, en contacto con una célula viva (por ejemplo, células de mamíferos) por el fluido, la modulación de al menos el potencial de membrana celular y la conductividad de membrana celular (véase, por ejemplo, la fijación de parche celular de los Ejemplos de trabajo 23 y 24) .

Como se describe en este documento bajo "Interacciones Moleculares", para explicar la estabilidad y la compatibilidad biológica de los fluidos electrocinéticos de la invención (por ejemplo, soluciones salinas electrocinéticas) , los solicitantes han propuesto que las interacciones entre las moléculas de agua y las moléculas de las sustancias (por ejemplo, el oxígeno) disueltas en agua, cambien la estructura colectiva del agua y garanticen los agrupamientos en jaula de nanoescala, incluyendo las nanoestructuras que comprenden oxígeno y/o electrones estabilizados impartidos a los materiales de salida de la invención. Sin estar limitado por el mecanismo, y de acuerdo con las propiedades y actividades descritas en este documento, la configuración de las nanoestructuras en aspectos particulares es tal que: comprenden (al menos para la formación y/o la estabilidad y/o actividad biológica) el gas disuelto (por ejemplo, oxígeno) ,· permiten a los fluidos electrocinéticos (por ejemplo, RNS-60 o fluidos de solución salina Solas) modular (por ejemplo, impartir o recibir) las cargas y/o efectos de cargas en contacto con una membrana celular o el componente relacionado de ésta, y en particular, los aspectos garantizan la estabilidad (por ejemplo, la transportación, el hospedaje, la captura) de electrones solvatados en una forma biológicamente relevante.

De acuerdo con aspectos particulares, y como es soportado por la presente descripción, en las soluciones iónicas o salinas (por ejemplo, la solución salina estándar, NaCl) , las nanoestructuras de la invención comprenden las nanoestruturas estabilizadas por carga (por ejemplo, el diámetro promedio menor que 100 nm) , que pueden comprender al menos una molécula de gas disuelto (por ejemplo, oxígeno) dentro de una capa de hidratación estabilizada por carga. De acuerdo con aspectos adicionales, y como se describió en otras partes de este documento, la capa de hidratación estabilizada por carga puede comprender una jaula o puerto vacío de al menos una molécula de gas disuelto (por ejemplo, oxígeno) . De acuerdo con aspectos adicionales, en virtud del suministro de capas de hidratación adecuadas estabilizadas por carga, la nanoestructura estabilizada por carga y/o las nanoestructuras que contienen el oxígeno estabilizado por carga, pueden comprender, además, un electrón solvatado (por ejemplo, electrón solvatado estabilizado).

Sin estar limitado por el mecanismo o la teoría en particular, después de la fecha de prioridad presente, se propusieron las microburbuj as estabilizadas por carga estabilizadas con iones en el líquido acuoso en equilibrio con el gas del ambiente (atmosférico) (Bunkin y otros, -Journal of Experimental y Theoretical Physics, 104:486-498, 2007; incorporado en este documento como referencia en su totalidad) . De acuerdo con aspectos particulares de la presente invención, los fluidos electrocinéticos novedosos de los solicitantes comprenden una forma novedosa, biológicamente activa de las nanoestructuras que contienen oxígeno estabilizadas por carga, y pueden comprender, además, nuevos arreglos, agrupamientos o asociaciones de tales estructuras .

De acuerdo con el modelo de microburbuj as estabilizadas por carga, el orden molecular de intervalo corto de la estructura del agua se destruye por la presencia de una molécula de gas (por ejemplo, una molécula de gas disuelto que forma un complejo inicialmente con un ión no adsorbente, proporciona un defecto de orden de intervalo corto) , garantizando la condensación de las gotas iónicas, donde el defecto está rodeado por primeras y segundas esferas de coordinación de las moléculas de agua, las cuales se llenan alternativamente por los iones de adsorción (por ejemplo, la adquisición de una 'capa de selección de iones Na+ para formar una doble capa eléctrica) e iones no adsorbentes (por ejemplo, los iones Cl" que ocupan la segunda esfera de coordinación) ocupando seis y 12 lugares, respectivamente, en las esferas de coordinación. En las soluciones iónicas de baja saturación (por ejemplo, soluciones salinas de baja saturación), este 'núcleo' hidratado permanece estable hasta que la primera y segunda esferas se llenan con seis iones adsorbentes y cinco no adsorbentes, respectivamente, y después se somete a una explosión de Coulomb creando un vacío interno que contiene la molécula de gas, en donde los iones adsorbentes (por ejemplo, los iones Na+) se adsorben a la superficie del vacío resultante, mientras que los iones no adsorbentes (o alguna parte de éstos) se difunden en la solución (Bunkin y otros, supra) . En este modelo, el vacío en la nanoestructura se prevé a partir del colapso por la repulsión coulómbica entre los iones (por ejemplo, los iones Na+) adsorbidos a su superficie. Se postuló que la estabilidad de las nanoestruturas que contienen vacío se debe a la adsorción selectiva de iones disueltos con cargas iguales sobre la superficie de vacío/burbuja y el equilibrio difuso entre el gas disuelto y el gas dentro de la burbuja, donde el negativo (la presión electrostática hacia el exterior ejercida por la doble capa eléctrica resultante proporciona la compensación estable de la tensión superficial, y la presión del gas dentro de la burbuja se equilibra con la presión ambiental. De acuerdo con el modelo, la formación de tales microburbuj as , requiere de un componente iónico, y en ciertos aspectos las asociaciones mediada por la colisión entre las partículas puede garantizar la formación de agrupamientos (arreglos) de mayor orden (Id) .

El modelo de microburbuj as estabilizadas por carga sugiere que las partículas pueden ser microburbuj as de gas, pero sólo contempla la formación espontánea de tales estructuras en una solución iónica en equilibrio con el aire del ambiente, no está caracterizado y no dice nada en cuanto a si el oxígeno es capaz de formar tales estructuras, y tampoco dice nada en cuanto a si los electrones solvatados podrían ser asociados y/o estabilizados por tales estructuras .

De acuerdo con aspectos particulares, los fluidos electrocinéticos de la invención que comprenden las nanoestructuras estabilizadas por carga y/o nanoestructuras que contienen oxígeno estabilizadas por carga son nuevos y fundamentalmente distintos de los fluidos no electrocinéticos postulados, de las estructuras de microburbujas estabilizadas por carga atmosférica de acuerdo con el modelo de microburbujas. Significativamente, esta conclusión es inevitable, derivada, al menos en parte, del hecho de que las soluciones salinas control no tienen las propiedades biológicas escritas en este documento, mientras que las nanoestructuras estabilizadas por carga del solicitante proporcionan una nueva forma biológicamente activa de nanoestructuras que contienen oxígeno estabilizadas por carga.

De acuerdo con aspectos particulares de la presente invención, el novedoso dispositivo electrocinético del solicitante y los métodos que se proporcionan para los nuevos fluidos alterados por electrocinética comprenden cantidades significativas de nanoestructuras estabilizadas por carga en exceso de cualquier cantidad, que puede o no estar presente de forma espontánea en los fluidos iónicos en equilibrio con el aire, o en cualquiera de los fluidos no generados por electrocinética . En aspectos particulares, las nanoestructuras estabilizadas por carga comprenden las nanoestructuras que contienen oxígeno estabilizadas por carga. En aspectos adicionales, las nanoestructuras estabilizadas por carga son todas, o sustancialmente todas las nanoestructuras que contienen oxígeno estabilizadas por carga, o las nanoestructuras que contienen oxígeno estabilizadas por carga de las mayores especies de nanoestructuras que contienen gas estabilizado por carga en el fluido electrocinético .

De acuerdo con otros aspectos, las nanoestructuras estabilizadas por carga y/o las nanoestructuras que contiene oxígeno, estabilizadas por carga pueden comprender u hospedar un electrón solvatado, y por consiguiente proporcionar un novedoso portador de electrón solvatado estabilizado. En aspectos particulares, las nanoestructuras estabilizadas por carga y/o las nanoestructuras que contienen oxígeno estabilizadas por carga proporcionan un nuevo tipo de electrodo (o electrodo invertido) , que a diferencia de los electrodos convencionales para soluto que tienen un único catión orgánicamente coordinado, tienen una pluralidad de cationes arreglados establemente alrededor de un vacío o un vacío que contiene un átomo de oxígeno, donde los iones de sodio arreglados son coordinados por las capas de hidratación de agua, en vez de por moléculas orgánicas. De acuerdo con aspectos particulares, un electrón solvatado se puede acomodar por la capa de hidratación de las moléculas de agua, o acomodar preferiblemente dentro del vacío de la nanoestructura distribuido sobre todos los cationes. En ciertos aspectos, las nanoestructuras de la invención proporcionan una novedosa estructura ' super electrodo' en la solución, que no sólo proporciona la distribución/estabilización de los electrones solvatados sobre varios cationes de sodio arreglados, sino que proporciona también la asociación o asociación parcial del electrón solvatado con la(s) molécula (s) de oxígeno enjaulad (s) en el vacío, el electrón solvatado se distribuye sobre un arreglo de átomos de sodio y al menos un átomo de oxígeno. De acuerdo con aspectos particulares, por lo tanto, 'los electrones solvatados' tal como los descritos en la presente, en asociación con los fluidos electrocinétícos de la invención, no pueden ser solvatados en el modelo tradicional que comprende la hidratación directa por las moléculas de agua. Alternativamente, en analogía limitada con las sales electrolíticas secas, los electrones solvatados en los fluidos electrocinéticos de la invención se pueden distribuir sobre múltiples nanoestructuras estabilizadas por carga para proporcionar un "pegamento reticulado" que estabilice los arreglos de orden superior en la solución acuosa .

En aspectos particulares, las nanoestructuras de la invención estabilizadas por carga y/o nanoestructuras que contienen oxígeno estabilizadas por carga son capaces de interactuar con las membranas celulares o los componentes de ésta, o proteínas, etc., para mediar en las actividades biológicas. En aspectos particulares, las nanoestructuras de la invención estabilizadas por carga y/o las nanoestructuras que contienen oxígeno estabilizadas por carga que hospedan un electrón solvatado son capaces de interactuar con las membranas celulares o los componentes de ésta, o proteínas, etc., para mediar en las actividades biológicas.

En aspectos particulares, las nanoestructuras de la invención estabilizadas por carga y/o las nanoestructuras que contienen oxígeno estabilizadas por carga interactúan con las membranas celulares o los componentes de ésta, o proteínas, etc . , como una carga y/o donante del efecto de la carga (entrega) y/o como una carga y/o receptor del efecto de la carga para mediar en las actividades biológicas . En determinados aspectos, las nanoestructuras estabilizadas por carga de la invención y/o las nanoestructuras que contiene oxígeno estabilizadas por carga que albergagan un electrón solvatado interactúan con las membranas celulares como una carga y/o donante del efecto de la carga (entrega) y/o como una carga y/o receptor del efecto de la carga para mediar en las actividades biológicas En aspectos particulares, las nanoestructuras de la invención estabilizadas por carga y/o las nanoestructuras que contienen oxígeno estabilizadas por carga son consistentes con, y dan cuenta de la estabilidad observada y las propiedades biológicas de los fluidos electrocinéticos de la invención, y proporcionan, además, un novedoso electrodo (o electrodo invertido) que garantiza los electrones solvatados estabilizados en soluciones iónicas acuosas (por ejemplo, las soluciones salinas, NaCl, etc.) .

En aspectos particulares, las nanoestructuras que contienen oxígeno estabilizadas por carga sustancialmente comprendidas, toman la forma de, o pueden dar lugar a, las nanoburbujas que contienen oxígeno estabilizadas por carga. En aspectos particulares, los agrupamientos que contienen oxígeno estabilizado por carga garantizan la formación de arreglos relativamente más grandes de nanoestructuras que contienen oxígeno estabilizadas por carga, y/o de nanoburbujas que contienen oxígeno estabilizadas por carga o arreglos de éstos. En aspectos particulares, las nanoestructuras que contienen oxígeno estabilizadas por carga pueden garantizar la formación de nanoburbujas hidrofóbicas en contacto con una superficie hidrofóbica (véase en otra parte de este documento el EJEMPLO 25) .

En aspectos particulares, las nanoestructuras que contienen oxígeno estabilizadas por carga comprenden sustancialmente al menos una molécula de oxígeno. En ciertos aspectos, las nanoestructuras que contienen oxígeno estabilizadas por carga comprenden sustancialmente al menos 1, al menos 2, al menos 3, al menos 4, al menos 5, al menos 10 al menos 15, al menos 20, al menos 50, al menos 100 o más moléculas de oxígeno. En aspectos particulares, las nanoestructuras que contienen oxígeno estabilizadas por carga comprenden o dan lugar a nanoburbujas (por ejemplo, las nanoburbujas hidrofóbicas) de aproximadamente 20 nm x 1.5 nm, que comprenden aproximadamente 12 moléculas de oxígeno (por ejemplo, en función del tamaño de una molécula de oxígeno (aprox. 0.3 nm por 0.4 nm) , la suposición de un gas ideal y la aplicación de n=PV/RT, donde P=l atm, R= 0.082 057 1. atm/mol . K; T=295K, V=pr2h=4.7xlC 22 L, donde r=10xl0-9 m, h=1.5xl0~9 m, y n=1.95xl0~22 moles).

En ciertos aspectos, el porcentaje de moléculas de oxígeno presentes en el fluido que están en tales nanoestructuras , o arreglos de éstas, que tienen una configuración estabilizada por carga en el fluido iónico acuoso es una cantidad en por ciento seleccionada del grupo consistente de mayores que: 0.1%, 1%, 2%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60% y 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, y mayor que 95%. Preferiblemente, este porcentaje es mayor que aproximadamente 5%, mayor que aproximadamente 10%, mayor que aproximadamente 15%, o mayor que aproximadamente 20%. En aspectos adicionales, el tamaño sustancial de las nanoestructuras que contienen oxígeno estabilizadas por carga, o los arreglos de éstas, que tienen una configuración estabilizada por carga en el fluido iónico acuoso es un tamaño seleccionado del grupo consistente de menos de 100 nm, 90 nm; 80 nm, 70 nm, 60 nm, 50 nm, 40 nm, 30 nm, 20 nm, 10 nm, 5 nm, 4 nm; 3 nm; 2 nm y 1 nm. Preferiblemente, este tamaño es aproximadamente menor que 50 nm, aproximadamente menor que 40 nm, aproximadamente menor que 30 nm, aproximadamente menor que 20 nm, o aproximadamente menor que 10 nm.

En ciertos aspectos, los fluidos electrocinéticos de la invención comprenden los electrones solvatados . En aspectos adicionales, los fluidos electrocinéticos de la invención comprenden las nanoestructuras estabilizadas por carga y/o las nanoestructuras que contienen oxígeno estabilizadas por carga, y/o arreglos de éstas, que comprenden al menos uno de: electrón(es) solvatado (s) , y las distribuciones de carga únicas (distribución de carga polar, simétrica, asimétrica) . En ciertos aspectos, las nanoestructuras estabilizadas por carga y/o las nanoestructuras que contienen oxígeno estabilizadas por carga, y/o arreglos de éstas, tienen propiedades paramagnéticas .

Por el contrario, en relación con los fluidos electrocinéticos de la invención, los fluidos control oxigenados en un recipiente presurizado (fluidos no electrocinéticos) y similares, no comprenden tales nanoestructuras estabilizadas por carga biológicamente activas y/o las nanoestructuras que contiene oxígeno estabilizadas por carga biológicamente activas y/o los arreglos de éstas, capaces de modular al menos el potencial de la membrana celular o la conductividad de membrana celular .

Sistemas para generar los fluidos enriquecidos con gas , El sistema y los métodos actualmente descritos permiten que el gas (por ejemplo, el oxígeno) se enriquezca de forma estable a una alta concentración con la pérdida pasiva mínima. Este sistema y los métodos se pueden usar eficazmente para enriquecer una amplia variedad de gases a porcentajes elevados en una amplia variedad de fluidos. A modo de ejemplo solamente, el agua desionizada a temperatura ambiente, que normalmente tiene niveles de alrededor de 2-3 ppm (partes por millón) de oxígeno disuelto puede alcanzar niveles de oxígeno disuelto en el intervalo de al menos aproximadamente 5 ppm, al menos aproximadamente 10 ppm, al menos aproximadamente 15 ppm, al menos aproximadamente 20 ppm, al menos aproximadamente 25 ppm, al menos aproximadamente 30 ppm, al menos aproximadamente 35 ppm, al menos aproximadamente 40 ppm, al menos aproximadamente 45 ppm, al menos aproximadamente 50 ppm, al menos aproximadamente 55 ppm, al menos aproximadamente 60 ppm, al menos aproximadamente 65 ppm, al menos aproximadamente 70 ppm, al menos aproximadamente 75 ppm, al menos aproximadamente 80 ppm, al menos aproximadamente 85 ppm, al menos aproximadamente 90 ppm, al menos aproximadamente 95 ppm, al menos aproximadamente 100 ppm, o cualquier valor mayor o entre éstos usando los sistemas y/o métodos descritos.. De acuerdo con una modalidad de ejemplo particular, el agua enriquecida con oxígeno se puede generar con niveles de aproximadamente 30- 60 ppm de oxígeno disuelto.

La Tabla 5 ilustra diversas mediciones parciales de presión tomadas en una cicatrización de herida tratada con una solución salina enriquecida con oxígeno (Tabla 5) y en muestras de la solución salina enriquecida con oxígeno enriquecido con gas de la presente invención.

TABLA 5 Reducción de la enfermedad del injerto contra el huésped La aplicación inmediata de los fluidos generados por electrocinética (por ejemplo, el fluido generado por electrocinética rico en oxígeno es posible para reducir la enfermedad del injerto contra el huésped (EICH) de las células trasplantables , líneas celulares, tejidos y órganos. Una solución electrocinética rica en oxígeno se puede usar en la sangre artificial y los procedimientos medicinales de perfusión sanguínea, tales como la cirugía de derivación coronaria y los procedimientos de trauma shock. Del mismo modo, las soluciones electrocinéticas ricas en oxígeno se pueden usar para la perfusión de órganos sólidos, tales como hígados, ríñones, corazón, etc., en tránsito para el trasplante y en el momento de la cirugía. De acuerdo con aspectos particulares, el uso de soluciones electrocinéticas enriquecidas con oxígeno producidas de acuerdo con las modalidades descritas conduce a tiempo de almacenamiento mayor y mejores resultados de los trasplantes, incluyendo la reducción de la GVHD. Esto puede aplicarse a los materiales frescos, congelados criopreservados , descongelados, deshidratados, conservados, o procesados que se pueden usar o implantar en un sujeto vivo.

En ciertas modalidades, el almacenamiento, transporte, mezcla, entrega, y/o trasplante de órganos con el fluido enriquecido con gas de la invención puede garantizar más éxito en la conservación y/o el trasplante de órganos y/o tejidos, debido a la disminución de la inflamación, disminución de la necrosis, y/o aumento de la función celular. Además, el fluido enriquecido con gas de la presente invención puede administrarse por vía intravenosa a un sujeto, incluyendo un paciente humano. Es posible oxigenar el plasma para el uso en un sujeto (cuerpo humano u otro animal) , lo que puede tener aplicación en el tratamiento de cáncer u otras afecciones o trastornos médicos. También puede ser útil para oxigenar el plasma para su conservación cuando se almacena por largos períodos de tiempo.

Como se usa en este documento, "sujeto," se puede referir a cualquier criatura viva, de preferencia un animal, más preferiblemente un mamífero, y aún más preferiblemente un humano .

Rutas y formas de administración En modalidades de ejemplos particulares, el fluido enriquecido con gas de la presente invención puede funcionar como una composición terapéutica sola o en combinación con otro agente terapéutico, de manera que la composición terapéutica previene o alivia al menos un síntoma de la inflamación. Las composiciones terapéuticas de la presente invención incluyen las composiciones que son capaces de administrarse a un sujeto que lo necesite. En ciertas modalidades, la formulación de la composición terapéutica también puede abarcar, al menos, un agente adicional seleccionado del grupo que consiste en: portadores, adyuvantes, agentes emulsionantes, agentes de suspensión, edulcorantes, aromas, perfumes, y aglutinantes.

Como se usa en este documento, "portador farmacéuticamente aceptable" y "portador" se refieren generalmente a un relleno sólido inerte, semisólido o líquido, no tóxico, diluyente, material de encapsulación o auxiliar de formulación de cualquier tipo. Algunos ejemplos no limitativos de los materiales que pueden servir como portadores farmacéuticamente aceptables son los azúcares como la lactosa, glucosa y sacarosa; almidones tales como almidón de maíz y fécula de patata, celulosa y sus derivados tales como carboximetilcelulosa de sodio, etil celulosa y acetato de celulosa, tragacanto en polvo; malta; - gelatina; talco; excipientes tales como la manteca de cacao y ceras de supositorio; aceites tales como el aceite de maní, aceite de algodón, aceite de cártamo, aceite de sésamo, aceite de oliva, aceite de maíz y aceite de soja; glicoles, tales como propilenglicol ; ésteres tales como oleato de etilo y laurato de etilo; agar; agentes tampones como el hidróxido de magnesio e hidróxido de aluminio; ácido algínico,- agua libre de pirógenos; solución salina isotónica; solución de Ringer; alcohol etílico, y las soluciones de tampón fosfato, así como otros lubricantes compatibles no-tóxicos tales como el lauril sulfato de sodio y estearato de magnesio, así como agentes colorantes, agentes de liberación, agentes de recubrimiento, agentes edulcorantes, saborizantes y aromatizantes, conservantes y antioxidantes también pueden estar presentes en la composición, de acuerdo con el criterio del formulador. En aspectos particulares, tales portadores y excipientes pueden ser soluciones o fluidos enriquecidos con gas de la presente invención.

Los portadores farmacéuticamente aceptables descritos en este documento, por ejemplo, los portadores, adyuvantes, excipientes o diluyentes, son bien conocidos por aquellas personas con conocimiento' en la técnica. Normalmente, el portador farmacéuticamente aceptable es químicamente inerte a los agentes terapéuticos y no tiene efectos secundarios perjudiciales o toxicidad bajo las condiciones de uso. Los portadores farmacéuticamente aceptables pueden incluir los polímeros y las matrices de polímeros, nanopartículas , microburbu as , y similares.

Además de los fluidos terapéuticos enriquecidos con gas de la presente invención, la composición terapéutica puede comprender, además, diluyentes inertes como el agua adicional no enriquecida con gas u otros disolventes, agentes solubilizantes y emulsionantes, tales como alcohol etílico, alcohol isopropílico, carbonato de etilo, acetato de etilo, alcohol bencílico, benzoato de bencilo, propilenglicol , 1,3-butilenglicol , dimetilformamida, aceites (en particular, los aceites de algodón, maní, maíz, germen, oliva, ricino y sésamo) , glicerol, alcohol de tetrahidrofurfurilo, polietilenglicoles y ácidos grasos de ásteres de sorbitán y mezclas de éstos. Como se aprecia por aquellas personas con conocimiento ordinario en la técnica, una formulación novedosa y mejorada de una composición terapéutica particular, un novedoso fluido terapéutico enriquecido con gas, y un novedoso método de entrega del nuevo fluido terapéutico enriquecido con gas, se puede obtener mediante la sustitución de uno o más diluyentes inertes con un fluido enriquecido con gas de composición idéntica, similar o diferente. Por ejemplo, el agua convencional se puede sustituir o suplementar por un fluido enriquecido con gas producido por la mezcla de oxígeno en agua o en agua desionizada, para proporcionar el fluido enriquecido con gas.

En ciertas modalidades, el fluido enriquecido con gas de la invención se puede combinar con uno o más agentes terapéuticos y/o usarse solo. En modalidades particulares, la incorporación del fluido enriquecido con gas puede incluir el reemplazo de una o más soluciones conocidas en la técnica, tales como el agua desionizada, solución salina, y similares, con uno o más fluidos enriquecidos con gas, proporcionando de esta forma una composición terapéutica mejorada para la entrega al sujeto.

Ciertas modalidades proporcionan composiciones terapéuticas que comprenden un fluido enriquecido con gas de la presente invención, una composición farmacéutica o de otro agente terapéutico o una sal farmacéuticamente aceptable o el solvato de ésta, y al menos un portador farmacéutico o diluyente. Estas composiciones farmacéuticas se pueden usar en la profilaxis y el tratamiento de las enfermedades o afecciones precedentes y en las terapias como se mencionó anteriormente. Preferiblemente, el portador deberá ser farmacéuticamente aceptable y deberá ser compatible con, es decir, no tener un efecto nocivo sobre los otros ingredientes de la composición. El portador puede ser un sólido o líquido y se formula preferiblemente como una formulación de dosis unitaria, por ejemplo, una tableta que puede contener de 0.05 a 95% por peso del ingrediente activo.

Las posibles rutas de administración incluyen la oral, sublingual, bucal, parenteral (por ejemplo, por vía subcutánea, intramuscular, intra-arterial , intraperitoneal , intracisternal , intravesical , intratecal o intravenosa) , rectal, tópica incluyendo la vía transdérmica, intravaginal , intraocular, intraótica, intranasal, inhalación, e inyección o inserción de los dispositivos o materiales de implantables . Rutas de administración La mayoría de los medios adecuados de administración para un sujeto en particular dependerá de la naturaleza y la gravedad de la enfermedad o afección de que se trate o la naturaleza de la terapia que se usa, así como la naturaleza de la composición terapéutica o agente terapéutico adicional. En ciertas modalidades, se prefiere la administración oral o tópica .

Las formulaciones adecuadas para la administración oral pueden ser proporcionadas como unidades discretas, tales como tabletas, cápsulas, sellos, jarabes, elixires, goma de mascar, formulaciones en "pirulí", microemulsiones , soluciones, suspensiones, pastillas, ampollas revestidas con gel, cada una conteniendo una determinada cantidad del componente activo; como polvos o granulos; como soluciones o suspensiones en los líquidos acuosos y no acuosos; o como las emulsiones de agua en aceite o de aceite en agua.

Las formulaciones adicionales adecuadas para la administración oral pueden proporcionarse para incluir nieblas o polvos de partículas finas que se pueden generar por medio de varios tipos de aerosoles presurizados dosificadores , atomizadores, nebulizadores , o insufladores . En particular, los polvos u otros compuestos de los agentes terapéuticos se pueden disolver o suspender en un fluido enriquecido con gas de la presente invención.

Las formulaciones adecuadas para los métodos transmucosa, tales como la administración sublingual o bucal incluyen pastillas, parches, tabletas, y similares comprenden el compuesto activo y, típicamente, una base saborizante, tales como azúcar y acacia o tragacanto y pastillas que comprenden el compuesto activo en una base inerte, tales como la gelatina y glicerina o sacarosa de la acacia.

Las formulaciones adecuadas para la administración parenteral comprenden típicamente las soluciones acuosas estériles que contienen una concentración predeterminada del fluido activo enriquecido con gas y posiblemente otro agente terapéutico; la solución es, de preferencia, isotónica con la sangre del receptor deseado. Las formulaciones adicionales adecuadas para la administración parenteral incluyen las formulaciones que contienen co-solventes fisiológicamente adecuados y/o agentes de complexión tales como surfactantes y ciclodextrinas . Las emulsiones de aceite en agua también pueden ser adecuadas para las formulaciones para la administración parenteral del fluido enriquecido con gas. Aunque tales soluciones se administran preferiblemente por vía intravenosa, también se pueden administrar por inyección subcutánea o intramuscular.

Las formulaciones adecuadas para la administración uretral, rectal o vaginal incluyen geles, cremas, lociones, suspensiones acuosas u oleosas, polvos o gránulos dispersables , emulsiones, materiales sólidos solubles, duchas, etc. Las formulaciones se proporcionan preferiblemente como supositorios de dosis única que comprenden el ingrediente activo en uno o más portadores sólidos que forman la base del supositorio, por ejemplo, la manteca de cacao. Alternativamente, los lavados de colón con los fluidos enriquecidos con gas de la presente invención se pueden formular para la administración al colón o recto.

Las formulaciones adecuadas para la aplicación tópica, intraocular, intraótica, o intranasal incluyen las pomadas, cremas, pastas, lociones, pastas, geles (tales como los hidrogeles) , atomizadores, polvo y granulos dispersables , emulsiones, atomizadores o aerosoles que usan propulsores de fluido (tales como los atomizadores liposomales, gotas nasales, atomizadores nasales, y similares) y los aceites. Los portadores adecuados para tales formulaciones incluyen vaselina, lanolina, polietilenglicoles , alcoholes, y las combinaciones de éstos. La entrega nasal o intranasal puede incluir dosificadores de cualquiera de estas formulaciones u otras. Asimismo, la administración intraótica o intraocular puede incluir gotas, pomadas, fluidos contra la irritación y similares.

Las formulaciones de la invención se pueden preparar por cualquier método adecuado, típicamente por la mezcla uniforme e íntima del fluido enriquecido con gas opcionalmente con un compuesto activo con portadores líquidos o sólidos finamente divididos o ambos, en las proporciones requeridas y, después, si es necesario, conformando la mezcla resultante en la forma deseada.

Por ejemplo, una tableta se puede preparar por la compresión de una mezcla íntima que comprende un polvo o gránulos del ingrediente activo y uno o más ingredientes opcionales, tales como un aglutinante, lubricante, dilüyente inerte, o agente de dispersión activo de superficie, o por el moldeado de una mezcla íntima de ingrediente activo en polvo y un fluido enriquecido con gas de la presente invención.

Las formulaciones adecuadas para la administración por inhalación incluyen polvos o nieblas de partículas finas que se pueden generar por medio de varios tipos de aerosoles dosificadores presurizados , atomizadores, nebulizadores , o insufladores . En particular, los polvos u otros compuestos de los agentes terapéuticos se pueden disolver o suspender en un fluido enriquecido con gas de la presente invención.

Para la administración pulmonar a través de la boca, el tamaño de partícula del polvo o gotas está normalmente en el intervalo de 0.5 a 10 µ?, preferiblemente 1.5 µ?, para asegurar la entrega en el árbol bronquial . Para la administración nasal, se prefiere un tamaño de partícula en el intervalo de 10 a 500 µ? para asegurar la retención en la cavidad nasal .

Los inhaladores dosificadores son los dispensadores de aerosoles presurizados, típicamente contienen una formulación en suspensión o solución de un agente terapéutico en un propulsor licuado. En ciertas modalidades, como se describe en este documento, los fluidos enriquecidos con gas de la presente invención se pueden usar además de, o en lugar del propulsor licuado estándar. Durante el uso, estos dispositivos descargan la formulación a través de una válvula adaptada para entregar un volumen dosificado, típicamente de 10 a 150 µ?, para producir un atomizado de partículas finas que contiene el agente terapéutico y el fluido enriquecido con gas. Los propulsores adecuados incluyen ciertos compuestos de clorofluorocarbonos , por ejemplo, diclorodifluorometano, triclorofluorometano, diclorotetrafluoroetano y mezclas de éstos.

La formulación puede contener, además, uno o más co-solventes, por ejemplo, surfactantes de etanol, tales como el ácido oleico o trioleato de sorbitán, antioxidantes y agentes aromatizantes adecuados. Los nebulizadores son dispositivos comercialmente disponibles que transforman las soluciones o suspensiones del ingrediente activo en una niebla aerosol terapéutica, ya sea por medio de la aceleración de un gas comprimido (típicamente aire u oxígeno) o a través de un orificio venturi estrecho, o por medio de agitación ultrasónica. Las formulaciones apropiadas para el uso en los nebulizadores consisten en otro agente terapéutico en un fluido enriquecido con gas y comprenden hasta 40% p/p de la formulación, de preferencia menos que 20% p/p. Además; se pueden utilizar otros portadores, tales como el agua destilada, el agua estéril, o una solución acuosa de alcohol diluido, preferiblemente hecha isotónica con los fluidos corporales por la adición de sales, tales como el cloruro de sodio. Los aditivos opcionales incluyen los conservantes, en especial si la formulación no se prepara estéril, y pueden incluir el metil hidroxi-benzoato, antioxidantes, agentes aromatizantes, aceites volátiles, agentes tampones y surfactantes .

Las formulaciones apropiadas para la administración por insuflación incluyen los polvos finamente divididos que se pueden entregar por medio de un insuflador o administrados en la cavidad nasal a modo de inspiración. En el insuflador, el polvo está contenido en cápsulas o cartuchos, hechos típicamente de gelatina o de plástico, los cuales se perforan o se abren in situ y el polvo se entrega por el aire extraído a través del dispositivo después de la inhalación o por medio de una bomba operada manualmente. El polvo empleado en el insuflador consiste ya sea sólo del ingrediente activo o de una mezcla de polvo que comprende el ingrediente activo, un diluyente para polvo adecuado, tal como lactosa, y un surfactante adicional. El ingrediente activo típicamente comprende de 0.1 a 100 p/p de la formulación.

Además de los ingredientes específicos anteriormente mencionados, las formulaciones de la presente invención pueden incluir otros agentes conocidos por aquellas personas con conocimiento en la técnica, teniendo en cuenta el tipo de formulación en cuestión. Por ejemplo, las formulaciones adecuadas para la administración oral pueden incluir los agentes saborizantes y las formulaciones adecuadas para la administración intranasal pueden incluir los perfumes.

Las composiciones terapéuticas de la invención se pueden administrar por cualquier método convencional disponible para el uso en conjunto con los compuestos farmacéuticos, ya sea como agentes terapéuticos individuales o en una combinación de agentes terapéuticos.

La dosificación administrada, por supuesto, variará en dependencia de los factores conocidos, tales como las características farmacodinámicas del agente particular y su modo y ruta de administración; la edad, salud y peso del receptor; la naturaleza y la extensión de los síntomas; el tipo de tratamiento concurrente; la frecuencia de tratamiento; y el efecto deseado. Se puede esperar que una dosificación diaria de ingrediente activo sea de aproximadamente 0.001 a 1000 miligramos (mg) por kilogramo (kg) de peso corporal, siendo la dosis preferida de 0.1 a aproximadamente 30 mg/kg. De acuerdo con ciertos aspectos, la dosificación diaria de ingrediente activo puede ser de 0.001 litros a 10 litros, siendo la dosis preferida de aproximadamente 0.01 litros a 1 litro.

Las formas de dosificación (composiciones adecuadas para la administración) contienen desde aproximadamente 1 mg a aproximadamente 500 mg de ingrediente activo por unidad. En estas composiciones farmacéuticas, el ingrediente activo estará presente ordinariamente en una cantidad de aproximadamente 0.5-95% de peso basado en el peso total de la composición.

Las pomadas, pastas, espumas, oclusiones, cremas y geles también pueden contener excipientes, tales como almidón, tragacanto, derivados de celulosa, siliconas, bentonitas, ácido silícico, y talco, o las mezclas de éstos. Los polvos y atomizadores también pueden contener excipientes tales como lactosa, talco, ácido silícico, hidróxido de aluminio, y silicatos de calcio, o mezclas de estas sustancias. Las soluciones de metales antimicrobianas nanocristalinas se pueden convertir en aerosoles o atomizadores por cualquiera de los medios conocidos que se usan de rutina para hacer los aerosoles farmacéuticos. En general, tales métodos comprenden la presurización o proporcionan un medio para presurizar un recipiente de la solución, usualmente con un portador de gas inerte, y pasando el gas presurizado a través de un orificio pequeño. Los atomizadores pueden contener, además, los propulsores convencionales tales como nitrógeno, dióxido de carbono, y otros gases inertes. Además, las microesferas o nanopartículas se pueden emplear con las composiciones o fluidos terapéuticos enriquecidos con gas de la presente invención en cualquiera de las rutas requeridas para administrar los compuestos terapéuticos a un sujeto.

Las formulaciones para usar como inyección se pueden presentar en recipientes sellados con dosis única o dosis múltiples, tales como ámpulas y viales, y se pueden almacenar en un estado seco por congelación ( liofilizado) que requiere sólo de la adición del excipiente líquido estéril, o fluido enriquecido con gas, inmediatamente antes del uso. Las soluciones y suspensiones para inyección extemporáneas se pueden preparar a partir de polvos, gránulos, y tabletas estériles . Los requerimientos para los portadores farmacéuticos efectivos para las composiciones inyectables se conocen bien por aquellas personas con conocimiento ordinario en la técnica. Veáse, por ejemplo, Pharmaceutics y Pharmacy Practice, J. B. Lippincott Co., Filadelfia, Pa. , Banker y Chalmers, Eds . , 238-250 (1982) y ASHP Handbook on Injectable Drugs, Toissel, 4ta edición, 622-630 (1986) .

Las formulaciones adecuadas para la administración tópica incluyen pastillas que comprenden un fluido enriquecido con gas de la invención y, opcionalmente, un agente terapéutico adicional y un saborizante, usualmente sacarosa y acacia o tragacanto; pastillas que comprenden un fluido enriquecido con gas y un agente terapéutico adicional opcional en una base inerte, tal como gelatina y glicerina, o sacarosa y acacia; y lavados bucales o enjuagues orales que comprenden un fluido enriquecido con gas y un agente terapéutico adicional opcional en un portador líquido adecuado; así como cremas, emulsiones, geles y similares.

Además, las formulaciones adecuadas para la administración rectal se pueden presentar como supositorios mezclando con una diversidad de bases tales como bases de emulsificación o bases hidrosolubles . Las formulaciones adecuadas para la administración vaginal se pueden presentar como pesarios, tampones, cremas, geles, pastas, espumas, o atomizadores que contienen, además del ingrediente activo, esos portadores que se conocen en la técnica como apropiados.

Los portadores farmacéuticos apropiados se describen en Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, una referencia de texto estándar en este campo.

La dosis administrada a un sujeto, especialmente un animal, en particular, un humano, en el contexto de la presente invención debe ser suficiente para provocar una respuesta terapéutica en el animal en un marco de tiempo razonable. Una persona con conocimiento en la técnica reconocerá que la dosificación dependerá de una diversidad de factores que incluyen el estado del animal, el peso corporal del animal, así como la afección a ser tratada. Una dosis adecuada es aquella que resultará en una concentración de la composición terapéutica en un sujeto conocida para provocar la respuesta deseada.

El tamaño de la dosis también será determinado por la ruta, el tiempo y la frecuencia de administración así como la existencia, naturaleza, y extensión de cualquiera de los efectos colaterales adversos que podrían acompañar la administración de la composición terapéutica y el efecto fisiológico deseado.

Será apreciado que los compuestos de la combinación se pueden administrar: (1) simultáneamente por la combinación de los compuestos en una co- formulación, o (2) por alteración, es decir, la entrega de compuestos de manera seriada, secuencial, en paralelo o simultánea en formulaciones farmacéuticas por separado. En las terapias alternativas, el retardo en la administración del segundo, y opcionalmente el tercer ingrediente activo, no debe ser tal que se pierda el beneficio de un efecto terapéutico sinérgico de la combinación de los ingredientes activos. De acuerdo con ciertas modalidades por cualquier método de administración (1) ó (2) , se debe administrar la combinación ideal para alcanzar los resultados de máxima eficacia. En ciertas modalidades por cualquier método de administración (1) ó (2), se debe administrar la combinación ideal para alcanzar las concentraciones del pico plasmático de cada uno de los ingredientes activos. Un régimen de una pildora una vez por día mediante la administración de una co- formulación combinada puede ser factible para algunos pacientes que sufren de enfermedades inflamatorias neurodegenerativas. De acuerdo con ciertas modalidades, las concentraciones plasmáticas pico efectivas de los ingredientes activos de la combinación podrán estar en el intervalo de aproximadamente 0.001 a 100 µ?. Las concentraciones plasmáticas pico óptimas se pueden alcanzar para una formulación y un régimen de dosificación prescrito para un paciente en particular.

También se entenderá que los fluidos de la invención y el acetato de glatiramer, el interferón-beta, la mitoxantrona, y/o el natalizumab o los derivados fisiológicamente funcionales de cualquiera de éstos, si se presentan simultánea o secuencialmente , se pueden administrar individualmente, en múltiplos, o en cualquier combinación de éstos. En general, durante la terapia alternativa (2), se administra una dosificación efectiva de cada compuesto de manera seriada, donde en la terapia de la co- formulación (1) , las dosificaciones efectivas de dos o más compuestos se administran juntas.

Las combinaciones de la invención se pueden presentar convenientemente como una formulación farmacéutica en una forma de dosificación unitaria. Una formulación de dosificación unitaria conveniente contiene los ingredientes activos en cualquier cantidad desde 1 mg a 1 g cada una, pero, por ejemplo, no se limita a, 10 mg a 300 mg. Los efectos sinérgicos del fluido de la invención en combinación con el acetato de glatiramer, el interferón-beta, la mitoxantrona, y/o el natalizumab se pueden llevar a cabo en una amplia relación, por ejemplo 1:50 a 50:1 (fluido de la invención: acetato de glatiramer, interferón-beta, mitoxantrona, y/o natalizumab) . En una modalidad la relación puede estar en el intervalo de aproximadamente 1:10 a 10:1. En otra modalidad, la relación peso/peso del fluido de la invención con respecto al acetato de glatiramer, interferón-beta, mitoxantrona, y/o natalizumab en una forma co-formulada de dosificación combinada, tales como una pildora, tableta, comprimido o cápsula será aproximadamente 1, es decir una cantidad aproximadamente igual de un fluido de la invención y de acetato de glatiramer, interferón-beta, mitoxantrona, y/o natalizumab. En otras co- formulaciones ejemplos, puede existir más o menos fluido de la invención y acetato de glatiramer, interferón-beta, mitoxantrona, y/o natalizumab. En una modalidad, cada compuesto será empleado en la combinación con una cantidad a la cual exhiba la actividad antiinflamatoria cuando se use sólo. Otras relaciones y cantidades de los compuestos de dichas combinaciones se contemplan dentro del alcance de la invención.

Una forma de dosificación unitaria puede comprender, además, el fluido de la invención y acetato de glatiramer, interferón-beta, mitoxantrona, y/o natalizumab, o los derivados fisiológicamente funcionales de éstos, y un portador farmacéuticamente aceptable.

Será apreciado por aquellos con conocimiento en la técnica que la cantidad de los ingredientes activos en las combinaciones de la invención que se requieren para el uso en el tratamiento, variará de acuerdo a una diversidad de factores que incluyen, la naturaleza de la afección a ser tratada y la edad y estado del paciente, y será finalmente a criterio del médico o del profesional de la salud que atiende al paciente. Los factores a ser considerados incluyen la ruta de administración y la naturaleza de la formulación, el peso corporal de los animales, la edad y el estado general y la naturaleza y gravedad de la enfermedad a ser tratada.

También es posible combinar cualquiera dos de los ingredientes activos en una forma de dosificación unitaria para la administración simultánea o secuencial con un tercer ingrediente activo. La combinación de tres partes se puede administrar simultáneamente o secuencialmente . Cuando se administra secuencialmente, la combinación se puede administrar en dos o tres administraciones. De acuerdo con ciertas modalidades, la combinación de tres partes del fluido de la invención y el acetato de glatiramer, interferón-beta, mitoxantrona, y/o natalizumab se puede administrar en cualquier orden.

Se entiende que los siguientes ejemplos son sólo ilustrativos y en ningún sentido limitativos.

EJEMPLOS EJEMPLO 1 Estabilidad del oxígeno disuelto Como se indica en la Figura 30, se ilustran los niveles de oxígeno disuelto en una botella plástica de 500 mi de pared delgada y una botella de vidrio de 1000 mi que se taparon cada una y se almacenaron a 65 grados Fahrenheit.

Como se puede observar, cuando la botella plástica se abrió aproximadamente 65 días después del embotellado, el nivel de oxígeno disuelto en el agua es de aproximadamente 27.5 ppm. Cuando una segunda botella se abrió a aproximadamente 95 días después del embotellado, el nivel de oxígeno disuelto es de aproximadamente 25 ppm. Asimismo, para la botella de vidrio, el nivel de oxígeno disuelto es de aproximadamente 40 ppm a los 65 días y de aproximadamente 41 ppm a los 95 días. De este modo, este gráfico indica que los niveles de oxígeno disuelto dentro de la botella de plástico y la botella de vidrio se mantienen a tasas relativamente elevadas a 65° Fahrenheit cuando el oxígeno se difunde dentro del fluido usando el sistema y el método descritos.

EJEMPLO 2 Disminución del contenido de oxígeno en la solución salina balanceada La Figura 33 ilustra la retención del oxígeno disuelto de una solución salina balanceada de 500 mi que originalmente tenía un nivel de oxígeno disuelto de 5 ppm. Después del enriquecimiento de la solución a la temperatura y presión estándar con el difusor de la presente invención, el nivel de oxígeno disuelto fue de aproximadamente 41 ppm. La solución se mantuvo en un frasco de vidrio ámbar. Después de una hora, el nivel de oxígeno disuelto fue de 40 ppm, 36 ppm después de dos horas, 34 ppm después de tres horas, y ligeramente más de 30 ppm después de aproximadamente cuatro horas y media. La medición final fue tomada brevemente antes de las seis horas, momento en el que el nivel de oxígeno disuelto fue de aproximadamente 28 ppm.

EJEMPLO 3 Tamaño de la microburbuja Los experimentos se realizaron con un fluido enriquecido con gas con el uso del difusor de la presente invención, para determinar un límite de tamaño de las microburbuj s de gas. El límite de tamaño de las microburbuj as se estableció al pasar fluido enriquecido con gas a través de los filtros de 0.22 y 0.1 mieras. En la realización de estas pruebas, se pasó un volumen de líquido a través del difusor de la presente invención y se generó un fluido enriquecido con gas.

Sesenta mililitros de este fluido se vaciaron en una jeringuilla de 60 mi. El nivel de oxígeno disuelto del fluido dentro de la jeringuilla se midió después por la titulación de Winkler. El fluido dentro de la jeringuilla se inyectó a través de un filtro Millipore Millex GP50 de 0.22 mieras y en un vaso de precipitados de 50 mi. Después se midió la tasa del oxígeno disuelto del material en el vaso de precipitados de 50 mi. El experimento se realizó tres veces para alcanzar los resultados ilustrados en la Tabla 6 a continuación.

Tabla 6 Como se puede observar, los niveles de OD que se midieron dentro de la jeringuilla y los niveles de OD medidos dentro del vaso de precipitados de 50 mi no se modificaron significativamente por el paso del material difuso a través de un filtro de 0.22 mieras, lo que implica que las microburbuj as de gas disueltas dentro del fluido no son mayores que 0.22 mieras.

Una segunda prueba se realizó en la que un lote de solución salina se enriqueció con el difusor de la presente invención y una muestra de la solución de salida se recogió en un estado sin filtrar. El nivel de oxígeno disuelto de la muestra sin filtrar fue de 44.7 ppm. Un filtro de 0.1 mieras se usó para filtrar la solución enriquecida con oxígeno del difusor de la presente invención y se recogieron dos muestras adicionales. Para la primera muestra, el nivel de oxígeno disuelto fue de 43.4 ppm. Para la segunda muestra, el nivel de oxígeno disuelto fue de 41.4 ppm. Finalmente, el filtro se retiró y se tomó una muestra final de la solución sin filtrar. En este caso, la muestra final tuvo un nivel de oxígeno disuelto de 45.4 ppm. Estos resultados fueron consistentes con aquellos donde se usó el filtro Millipore de 0.22 mieras. De este modo, la mayoría de las microburbujas o burbujas de gas en la solución salina son de aproximadamente 0.1 mieras de tamaño.

EJEMPLO 4 Efectos de la aspersión Las Figuras 34 y 35 ilustran los efectos de la aspersión del difusor de la presente invención en un fluido que pasa a través del mismo. La aspersión de agua enriquecida con oxígeno se produjo en un tanque de 8 litros a temperatura y presión estádares. Como se indicó, inicialmente el agua enriquecida con oxígeno tuvo un nivel de oxígeno disuelto de aproximadamente 42 ppm. Después de 2 minutos de corrida a través del difusor, el nitrógeno se roció en el agua enriquecida con oxígeno de manera que el nivel de oxígeno disuelto después fue ligeramente mayor que 20 ppm. A los 6 minutos, el nivel de oxígeno disuelto fue de aproximadamente 6 ppm. El nivel de oxígeno disuelto en el agua enriquecida con oxígeno llegó a un valor mínimo ligeramente mayor que cero (0) a aproximadamente 14 minutos después del inicio del proceso. Estas cifras ilustran la manera en que el nitrógeno se puede difundir en el agua para la aspersión del oxígeno del agua. Sin embargo, se podría usar cualquier gas dentro de cualquier fluido para la aspersión de un gas a partir de otro y difundir el otro gas en el líquido. El mismo experimento podría utilizar cualquier material fluido huésped, y cualquier material de infusión fluido.

EJEMPLO 5 Efectos Rayleigh Los fluidos procesados a través del dispositivo de difusión descrito en este documento presentan diferencias dentro de la estructura del agua cuando se compararon con el agua normal sin procesar. El agua enriquecida con gas obtenida por las modalidades descritas en este documento ha demostrado que tiene más dispersión de Rayleigh comparado con el agua sin procesar.

En los experimentos conducidos, las muestras de agua enriquecida con gas y no enriquecida con gas se prepararon y se enviaron para el análisis óptico. El propósito de estas pruebas fue determinar si existe alguna diferencia óptica burda entre el agua desionizada normal (sin procesar) y el agua enriquecida por el dispositivo de difusión de la presente invención.

Las dos muestras se codificaron para mantener sus identidades en secreto, y sólo después que se completaron las pruebas, se identificaron las muestras. Las dos muestras se colocaron en un rayo láser de 633 nanómetros de acuerdo con el diagrama que se ilustra en la Figura 37A. La muestra B, que fue el fluido enriquecido con gas de acuerdo a ciertas modalidades descritas en este documento, presentó la luz dispersada, independientemente de su posición respecto a la fuente láser. El fluido de la muestra B se había sellado en botellas de vidrio durante aproximadamente una semana. Después de dos a tres horas de abierta la botella, el efecto de dispersión desapareció. De este modo, la estructura del fluido enriquecido con gas es ópticamente diferente de la estructura del fluido sin procesar. El efecto óptico no está directamente relacionado con los niveles de oxígeno disuelto, ya que el nivel de oxígeno disuelto al inicio fue de aproximadamente 45 ppm y al final del experimento se estimó en aproximadamente 32 ppm. Los resultados se muestran en la Figura 37B.

EJEMPLO 6 Generación de electrones solvatados La evidencia adicional también ha sugerido que el proceso de enriquecimiento generado por el dispositivo de difusión de la presente invención resulta en electrones solvatados dentro del fluido enriquecido con gas. Debido a los resultados de las sondas polarográficas de oxígeno disuelto, se cree que el fluido difuso presenta un efecto de captura de electrones y, de ese modo, el fluido puede incluir electrones solvatados dentro del material enriquecido con gas .

Existen dos técnicas fundamentales para la medición de niveles de- oxígeno disuelto eléctricamente: técnicas de medición galvánica y medición polarográfica . Cada proceso usa un sistema de electrodos, donde los niveles de oxígeno disuelto dentro de la solución que se prueba reaccionan con un cátodo de la sonda para producir una corriente. Los sensores de nivel de oxígeno disuelto consisten en dos electrodos, un ánodo y un cátodo, que están ambos inmersos en electrolitos en el cuerpo del sensor. Una membrana permeable al oxígeno separa el ánodo y el cátodo de la solución que se prueba. El oxígeno se difunde a través de la membrana e interactúa con los componentes internos de la sonda para producir una corriente eléctrica. El cátodo es un electrodo de hidrógeno y porta el potencial negativo con respectó al ánodo. La solución de electrolito rodea al par de electrodos y está contenida en la membrana. Cuando no hay oxígeno presente, el cátodo se polariza por el hidrógeno y resiste la corriente de flujo. Cuando el oxígeno pasa a través de la membrana, el cátodo se despolariza y los electrones se consumen. El cátodo reduce electroquímicamente el oxígeno a iones hidroxilo de acuerdo con la siguiente ecuación: 02 +2?20+4?~ =40hf- Al realizar las mediciones del nivel de oxígeno disuelto de una solución enriquecida con gas de acuerdo a los sistemas de la presente invención, se experimentó repetidamente una condición de sobreflujo donde el medidor de oxígeno disuelto muestra una lectura superior que la que el medidor es capaz de leer. Sin embargo, la evaluación de la solución enriquecida con gas por la titulación de inkler indica el nivel inferior de oxígeno disuelto (OD) para la solución que se indica por la sonda. Típicamente, una sonda de OD (tal como Orion 862 usado en estps experimentos) tiene una lectura máxima de 60 ppm. Sin embargo, cuando el medidor se deja en agua enriquecida con gas de la presente invención, ésta se desborda .

Sin deseos de estar atados a cualquier mecanismo de acción en particular, el mecanismo del medidor responde a los electrones donde reacciona el oxígeno. Sin embargo, de acuerdo a la resonancia de giro del electrón, los iones libres no están presentes en el fluido. De este modo, el fluido presumiblemente contiene electrones solvatados estabilizados por las especies de oxígeno que también están presentes en el fluido.

EJEMPLO 7 Cicatrización de heridas in vitro Los efectos de un fluido enriquecido con gas (enriquecido con oxígeno) se probaron para la habilidad de los queratinocitos epidérmicos humanos cultivados de sellar una herida.

Los queratinocitos epidérmicos humanos se aislaron de prepucios de recién nacidos que se obtuvieron de la circuncisión de rutina y no idenficados. Los prepucios se lavaron dos veces en PBS y se incubaron con 2.4 U/ml de Dispasa II para separar la dermis de la epidermis. La epidermis se incubó con 0.25% de tripsina/EDTA 1 mM, se neutralizó con inhibidor de tripsina de soja, se agitó, y se pasó a través de un tamiz de 70 µ?t? para separar las células. A continuación, la suspensión celular se centrifugó y se resuspendió en medio de cultivo celular (M154) suplementado con 0.07 mM de CaCl2, y suplementos de crecimiento de queratinocitos humanos (0.2% de hidrocortisona, 0.2 ng/ml de factor de crecimiento epidérmico humano) y el cóctel de antibióticos penicilina/estreptomicina, anfotericina . Las suspensiones celulares de queratinocitos se sembraron en placas de cultivo de 12 pocilios sin recubrimiento y el medio se reemplazó después de 24 horas, y cada 48 horas después de la siembra inicial.

Al alcanzar la confluencia celular, se hicieron arañazos lineales con una punta de pipeta estéril P1000, que resultó en una herida uniforme libre de células. Las monocapas se lavaron varias veces con PBS de Dulbecco para eliminar cualquiera de los residuos celulares. Las monocapas heridas se incubaron después en los medios siguientes: i) medio de crecimiento completo (como se describió anteriormente en este ejemplo), ii) medio de crecimiento completo diluido 1:1 con una versión cortada de solución salina sin oxígeno (el fluido control que se procesó usando el dispositivo de difusión descrito, pero sin la adición de un gas) , y iii) medio de crecimiento completo diluido 1:1 con solución salina enriquecida con oxígeno. Cada estudio se realizó 1 por triplicado .

Antes de la incubación, los pocilios se llenaron con el medio respectivo y se sellaron colocando cubreobjetos de cristal de 25 x 25 mm en la parte superior de cada pocilio. A las 6, 12, 24 y 48 horas después de la herida, se realizaron las mediciones de oxígeno, y se tomaron imágenes de los cultivos.

Seis horas después de la herida, los bordes de las heridas en la solución salina y los medios enriquecidos con gas se irritaron más que aquellos en el medio control que se procesó con el dispositivo de difusión descrito en este documento, pero sin la adición de un gas. Doce horas después de las heridas, los bordes de las heridas en los tres medios aparecieron irregulares, con queratinocitos a lo largo de los bordes que migran hacia el centro de la herida. La cuantificación de la migración de queratinocitos reveló aproximadamente el mismo nivel de migración de queratinocitos en la solución salina y en el medio enriquecido con gas. Los resultados del experimento se muestran en las Figuras 40A y 44B.

EJEMPLO 8 Cicatrización mejorada de las heridas Se realizó un estudio para determinar las características de cicatrización mejorada de las heridas que se expusieron a una solución salina enriquecida con oxígeno que se procesó de acuerdo con la modalidad descrita en este documento. En este experimento, las vendas se colocaron sobre las heridas de la biopsia por escisión dérmica porcina. Los vendas embebidas en solución salina enriquecida con oxígeno o un grupo control de vendas embebidas en una solución salina que no fue enriquecida con oxígeno. Varios factores se evaluaron microscópicamentepor el estudio incluyendo: 1) epidermalización; 2) neovascularización, 3) diferenciación epidérmica, 4) migración de los mastocitos, y 5) mitosis.

Externamente, las heridas parecieron cicatrizar a tasas variables. Las heridas tratadas con la solución salina enriquecida con oxígeno mostraron un aumento en la cicatrización de las heridas en los días 4 al 11. Sin embargo, ambas heridas parecían completar la cicatrización aproximadamente al mismo tiempo. El estudio mostró que entre los días 3 y 11, la núeva epidermis de las heridas tratadas con la solución salina enriquecida con oxígeno migró de dos a cuatro veces más rápido que la epidermis de las heridas tratadas con la solución salina normal. El estudio también mostró que entre los días 15 y 22, la herida tratada con la solución salina enriquecida con oxígeno se diferenció a una tasa más rápida como se evidenció por la formación temprana de más capas epidérmicas maduras. En todas las etapas, el engrosamiento que ocurre en la epidermis asociada con la cicatrización normal no ocurrió dentro de las heridas tratadas con la solución salina enriquecida con oxígeno.

Sin deseos de estar atados a ninguna teoría en particular, se cree que la solución salina enriquecida con oxígeno puede aumentar el nivel localizado de NO dentro de las heridas. El NO modula los factores de crecimiento, la deposición del colágeno, la inflamación, la migración de los mastocitos, el engrosamiento de la epidermis, y la neovascularización en la cicatrización de heridas. Además, el óxido nítrico se produce por una enzima inducible que es regulada por el oxígeno.

De este modo, aunque o se desea estar atados a ninguna teoría en particular, el fluido enriquecido con gas de la invención puede estimular la producción de NO, lo que está acorde con el espectro de los efectos de cicatrización de las heridas observados en estos experimentos.

La epidermis cicatrizada de los cerdos experimentó la diferenciación temprana en el grupo de solución salina enriquecida con oxígeno los días 15 a 22. En el caso de la migración de los mastocitos, las diferencias ocurrieron también en la migración temprana y tardía para la solución enriquecida con oxígeno. Un resultado concluyente para el nivel de mitosis fue indescifrable debido a la dificultad en la tinción.

Con referencia ahora a las Figura 41A a 41F, varias ilustraciones comparan los resultados de la cicatrización de las heridas de los tejidos epidérmicos porcinos, con o sin solución salina enriquecida con oxígeno. De este modo, la cicatrización de la herida control y de la herida que usa la solución salina enriquecida con oxígeno fue seguida durante los días 1, 4 y 16. La Figura 41A describe la cicatrización de la herida para la herida control el día 1. Como se observa, la herida muestra engrosamiento epidérmico/dérmico y una pérdida del contorno. La Figura 41B describe la cicatrización de la herida el día 1 para la herida tratada que usa la solución salina enriquecida con oxígeno. La herida muestra engrosamiento epidérmico/dérmico normal y el contorno normal es típico en una nueva herida.

Con referencia ahora a las Figuras 41C y 41D, se ilustra la cicatrización de la herida control el día 4 y la cicatrización de la herida tratada con la solución salina enriquecida con oxígeno el día . Para la herida control que se describió en la Figura 41C, la herida muestra una espuela epidérmica de 600 mieras. En la herida tratada con la solución salina enriquecida con oxígeno en la Figura 41D, se describe una espuela epidérmica de 1200 mieras. De este modo, en los primeros 4 días del experimento, la espuela epidérmica creada en la herida tratada usando la solución salina enriquecida con oxígeno muestra una velocidad de crecimiento de dos veces el crecimiento de la herida que no fue tratada con la solución salina enriquecida con oxígeno.

Con referencia ahora a la Figura 41E, se ilustra la herida control el día 16. La herida muestra una epidermis menos diferenciada con pérdida del contorno epidérmico/dérmico que aquella ilustrada por la herida tratada con la solución salina enriquecida con oxígeno ilustrada en la Figura 1F. La Figura 41F muestra la epidermis más diferenciada y un contorno epidérmico/dérmico más normal en la herida.

Así, como se ilustra con respecto a las Figuras 41A a 41F, la herida tratada con la solución salina enriquecida con oxígeno muestra características de cicatrización mucho mayores que la herida sin tratar y muestra una epidermis más diferenciada con un contorno epidérmico/dérmico más normal.

EJEMPLO 9 Estudio de la glutación peroxidasa El fluido enriquecido con oxígeno de la invención se probó para la presencia de peróxido de hidrógeno mediante pruebas de la reactividad con la glutatión peroxidasa usando un ensayo estándar (Sigma) . Las muestras de agua se probaron mediante la adición de un cóctel de enzimas e inversión. La determinación de la tasa espectrofotométrica continua se realizó a A340 nm, y a temperatura ambiente (25 grados centígrados). Las muestras analizadas fueron: 1. agua desionizada (control negativo), 2. fluido enriquecido con oxígeno de la invención a baja concentración, 3. fluido enriquecido con oxígeno de la invención a alta concentración, 4. peróxido de hidrógeno (control positivo). El control positivo de peróxido de hidrógeno mostró una fuerte reactividad, mientras que ninguno de los otros fluidos probados reaccionó con la glutatión peroxidasa.

EJEMPLO 10 (Los fluidos superoxigenados generados por electrocinética y Solas se mostraron para proporcionar los efectos de prolongación sinérgicos (por ejemplo, la supresión de la broncoconstricción) con albuterol in vivo en un modelo animal reconocido en la técnica de la broncoconstricción humana (modelo de asma humano) ) Experimento 1 : En un experimento inicial, dieciséis conejillos de indias se evaluaron para los efectos de los broncodilatadores sobre la función de las vías respiratorias en conjunto con la broncoconstricción inducida por metacolina. ' Después de determinar la dosis óptima, cada animal se dosificó con 50 pg/ml para entregar la dosis objetivo de 12.5 pg de sulfato de albuterol en 250 µ? por animal.

El estudio fue un diseño en bloques aleatorio para los valores de peso y línea base Penh. Los dos grupos (A y B) recibieron una instilación intratraqueal de 250 µ? de 50 ug/ml de sulfato de albuterol en una o dos diluciones: el Grupo A fue agua desionizada que había pasado a través del dispositivo de la invención, sin la adición de oxígeno, mientras que el Grupo B fue agua de la invención enriquecida con gas. Cada grupo se administró por vía intratraqueal con soluciones usando un microaspersor Penn Century. Además, los animales se estratificaron a través de unidades del pletismografo BUXCO para que cada grupo de tratamiento sea igualmente representado dentro de los nebulizadores que alimentan los pletismografos y las unidades de registro.

Los animales que mostraron al menos 75% de su línea base Penh valorados a las 2 horas después de la administración del albuterol no se incluyeron en el análisis de datos.. Este criterio de exclusión se basó en estudios anteriores donde el fallo de la broncoprotección con broncodilatadores se puede asociar con errores de dosificación. Como resultado, uno de los animales del grupo control se rechazó de los análisis de datos.

Una vez que el animal tenía una broncoconstriccion mayor que 50%, se consideró que el animal no estaba protegido. Como se indica en laTabla 7, el 50% de los animales del grupo B (sombreado) se protegieron de la broncoconstriccion a las 10 horas (momento en que terminó la prueba) .

Tabla 7 Protección de la broncoconstriccion medida con reto con metacolina Grupo A Por ciento de protección de la broncoconstriccion por número de animales Grupo B Por ciento de protección de la broncoconstriccion por número de animales Tiempo 1 2 3 4 5 6 7 8 (horas) 0 100.0 100.0 100.0 100.0 100.0 100.0 100.0 100.0 0 0 0 0 0 0 0 0 2 15.85 18.03 17.88 24.09 18.59 15.18 21.33 13.33 6 211.5 10.96 68.79 23.72 11.09 99.00 118.2 6.95 7 6 10 174.5 12.87 88.16 20.40 21.45 31.60 123.4 8.46 4 7 Experimento 2 : Evaluación de la broncoconstricción de RDC1676 con sulfato de albuterol en conejillos de indias machos Hartley: Un conjunto adicional de experimentos se llevaron a cabo usando un número mayor de animales para evaluar los efectos protectores de los fluidos de la invención generados por electrocinética (por ejemplo, RDC1676-00, RDC1676-01, RDC1676-02 y RDC1676-03) frente a la broncoconstricción inducida por metacolina cuando se administran solos o como diluyentes para el sulfato de albuterol en conejillos de indias machos .

Materiales : Los conejillos de indias (Cavia porcellus) eran Hartley albinos, Crl : (HA) BR de Charles River Canadá Inc. (St. Constant, Quebec, Canadá) . Peso: Aproximadamente 325 ± 50 g al inicio del tratamiento. El número de grupos fue 32, con 7 animales machos por grupo (más otros 24 forman el mismo lote de animales) . Dieta; Todos los animales tuvieron libre acceso a una dieta granulada estándar de laboratorio comercial certificada (conejillos de indias 5026 certificada por el PMI; PMI Nutrition International Inc.), excepto durante los procedimientos designados.

Métodos : La ruta de administración fue la instilación intratraqueal a través de un microaspersor Penn Century y el reto con metacolina a través de la inhalación corporal completa. La vía intratraqueal se seleccionó para maximizar la exposición del pulmón al artículo de prueba/solución de control. El reto de la inhalación corporal se seleccionó para retar con metacolina y provocar una respuesta de hipersensibilidad de las vías respiratorias superiores (es decir, broncoconstricción) .

La duración del tratamiento fue de un día.

La Tabla 8 muestra el diseño experimental. Todos los animales se sometieron a la exposición por inhalación de metacolina (500 g/ml) , 2 horas después de la administración del TA/control. Todos los animales recibieron un volumen de dosis de 250µ1. Por lo tanto, el sulfato de albuterol se diluyó (en el artículo de control y los 4 artículos de prueba) a las concentraciones de 0, 25, 50 y 100 pg/ml .

Treinta minutos antes de la administración, las soluciones de sulfato de albuterol de 4 concentraciones diferentes (0, 25, 50 y 100ug/ml) se prepararon en una solución madre Ox (500ug/ml) en cada una de estas cuatro soluciones de artículos de prueba (RDC1676-00, RDC1676-01, RDC1676-02, y RDC1676-03). Estas concentraciones de sulfato de albuterol también se prepararon en un fluido de control no generado por electrocinética (control 1) . Las soluciones de dosificación se prepararon por la dilución apropiada de cada solución madre. Todas las soluciones madres y las soluciones de dosificación se mantuvieron en hielo una vez preparadas. Las dosis se completaron en una hora después de que los artículos de la prueba/control se prepararon. Una solución de metacolina (500pg/ml) se preparó el día de la administración.

Cada animal recibió una instilación intratraqueal del artículo de prueba o de control con una microaspersor Penn Century. Los animales se privaron de alimentos durante toda la noche y se anestesiaron usando isoflurano, la laringe se visualizó con la ayuda de un laringoscopio (o alternativa adecuada) y la punta del microaspersor se insertó en la tráquea. Se administró un volumen de dosis de 250 µ?/animal del artículo de prueba o de control.

El aerosol de metacolina se generó en la entrada de aire de una cámara de mezcla con nebulizadores ultrasónicos Aeroneb suministrados con el aire de una bomba de flujo regulado Buxco. Esta cámara de mezcla, a su vez alimenta cuatro pletismógrafos individuales por todo el cuerpo sin límites, cada uno opera bajo una ligera presión negativa mantenida por medio de una válvula de compuerta situada en la línea de salida. Una bomba de vacío se usó en la cámara para el escape de la cámara de inhalación a la tasa de flujo requerida.

Antes del comienzo de la fase principal del estudio, 12 animales de más se asignaron a tres grupos (n = 4/grupo) para determinar el período máximo de exposición al que se pueden exponer los animales a la metacolina para provocar una broncoconstricción aguda grave pero no mortal . Los cuatro animales se expusieron a la metacolina (500 g/ml) durante 30 segundos y los parámetros respiratorios se midieron hasta 10 minutos después del comienzo del aerosol. La concentración del nebulizador de metacolina y/o el tiempo de exposición al aerosol se ajustó adecuadamente para inducir una broncoconstricción aguda/reversible, grave, pero no mortal, que se caracteriza por un aumento transitorio en el pene.

Una vez antes de la administración del artículo de prueba (día -1) y de nuevo a los 2, 6, 10, 14, 18, 22 y 26 horas después de la dosis, los animales se colocaron en la cámara y los parámetros ventilatorios (volumen tidal, frecuencia respiratoria, volumen minuto derivado) y la pausa de Penh mejorada se midieron durante un período de 10 minutos usando el sistema XA de Buxco Electronics BioSystem, a continuación del comienzo del reto con aerosol de metacolina.

Una vez que los animales se encontraban dentro de las cámaras de referencia, los valores se registraron durante 1 minuto, seguido por el suminsitro de metacolina, a una concentración en el nebulizador de 500ug/ml durante 30 segundos, los animales se expusieron al aerosol por más de 10 minutos, tiempo durante el cual se evaluaron los parámetros de ventilación de forma continua. Penh se usó como indicador de la broncoconstricción; Penh es un valor derivado obtenido a partir del flujo de inspiración pico, el flujo de expiración pico y el tiempo de expiración. Penh = (flujo de expiración pico/flujo de inspiración pico) * (Tiempo de expiración/tiempo para expirar el 65% del volumen tidal -1) .

Los animales que no mostraron una broncoconstricción aguda, grave, durante el reto con una dosis previa de metacolina se reemplazaron. Cualquier animal que muestra al menos el 75% de su valor PenhPenes de línea base a las 2 horas después de la dosis no se incluyeron en el análisis de datos . Los parámetros ' respiratorios se registraron como medias de 20 segundos.

Los datos considerados como no fisiológicos se excluyeron del análisis posterior.

Los cambios en Penh se trazaron en un período de 15 minutos y el valor Penh se expresó como el área bajo la curva. Los datos numéricos se sometieron al cálculo de los valores medios del grupo y las desviaciones estándares (según corresponda) .

Tabla 8. Diseño del experimento; 7 conejillos de indias machos por grupo.

ID Grupo Albuterol Albuterol Albuterol Albutero (0 (6/25 (12.5 1 g/animal) g/animal) g/animal) (25 pg/anima 1) 1 (control 7 machos 7 machos 7 machos 7 machos 1) (oxígeno ambiental) 5 7 machos 7 machos 7 machos 7 machos (RDC1676- 00 (Solas) 6 7 machos 7 machos 7 machos 7 machos (RDC1676- 01 (20 ppm oxígeno) ID Grupo Albuterol Albuterol Albuterol Albutero (0 (6/25 (12.5 1 µg/animal) µg/animal) (25 g/anima 1) 7 7 machos 7 machos 7 machos 7 machos (RDC1676- 02 (40 ppm oxígeno) 8 7 machos 7 machos 7 machos 7 machos (RDC1676- 03 ( 60 ppm oxígeno) Resultados : Como se muestra en las Figuras 107A-D, en ausencia de albuterol, la administración de los fluidos de la invención generados por electrocinética no tuvo ningún efecto aparente sobre los valores PenH de línea base medios porcentuales, cuando se midieron en un período de 26 horas.

Sorprendentemente, sin embargo, como se muestra en las Figuras 108A-D, la administración de albuterol (se muestran los datos representativos para los grupos de 25 xg albuterol/animal) formulado en los fluidos generados por electrocinética de la invención (en todos los niveles de oxígeno probados; ambiental (Figura 108 -A ) , 20 ppm (Figura 108-B) , 40 ppm (Figura 108-C) y 60 ppm (Figura 108-D) ) resultó en una prolongación notable de los efectos anti-broncoconstrictivos del albuterol, en comparación con el fluido control. Es decir, los resultados de la metacolina mostraron una prolongación de la broncodilatación del albuterol por al menos 26 horas. Las Figuras 108A-D muestran que existían diferencias consistentes en todos los niveles de oxígeno entre RDC1676 y el control de solución salina normal. Al combinar los 4 fluidos RDC1676, el valor p para la diferencia del tratamiento general a partir de solución salina normal fue de 0.03.

De acuerdo con los aspectos particulares de la presente invención, por lo tanto, las soluciones de la invención generadas por electrocinética proporcionan efectos de prolongación sinérgica con albuterol, proporcionando de este modo una disminución en el uso de albuterol en un paciente, lo que permite un uso del fármaco más eficiente, rentable, con menos efectos secundarios, y con aumento del período durante el cual un paciente se puede tratar y responder al tratamiento con albuterol .

EJEMPLO 11 (Se determinó un perfil de citoquinas) Los linfocitos mixtos se obtuvieron de un donante voluntario sano. Muestras de capas leucocitarias se lavaron de acuerdo con los procedimientos estándares para eliminar las plaquetas. Los linfocitos se sembraron a una concentración de 2 x 106 por placa en medio RPMI (+ 50 mm HEPES) diluido, ya sea con el fluido de la invención enriquecido con gas o agua destilada (control) . Las células se estimularon con 1 microgramo/ml de antígeno T3 , o 1 microgramo/ml de lectina fitohemaglutinina (PHA) (activador de células pan- T) , o sin estimular (control negativo) . Después de 24 horas de incubación, se comprobó la viabilidad de las células y los sobrenadantes se extrajeron y congelaron.

Los sobrenadantes se descongelaron, se centrifugaron, y se probaron para la expresión de citoquinas usando un protocolo y plataforma de microesferas XMAP® (Luminex) .

Dos millones de células se sembraron en 6 pocilios de una placa de 24 pocilios en RPMI completo + 50 mm Hepes, ya sea con el fluido enriquecido con oxígeno de la invención (agua) (pocilios 1, 3, y 5) o agua destilada (2, 4 y 6) (10X RPMI diluido en agua para hacer 1 x) . Las células se estimularon con 1 pg/ml de antígeno T3 (pocilios 1 y 2) o PHA (pocilios 3 y 4) . Los pocilios de control 5 y 6 no se estimularon. Después de 24 horas, las células se verificaron para la viabilidad y los sobrenadantes se recogieron y congelaron. A continuación, los sobrenadantes se descongelaron y se centrifugaron a 8,000 g para granularse. Los sobrenadantes clarificados se ensayaron para las citoquinas enumeradas usando un protocolo y plataforma de LUMINEX BEAD LITE™. Los datos numéricos se tabularon en la Tabla 9, y los gráficos de barra correspondientes se representan en la Figura 38. En particular, el nivel de IFN-? fue superior en el medio de cultivo enriquecido con gas de la invención con el antígeno T3 que en el medio de cultivo de control con el antígeno T3 , mientras que la IL-8 fue inferior en el medio de cultivo enriquecido con gas de la invención con el antígeno T3 que en el medio de cultivo de control con el antígeno T3. Además, la IL-6, IL-8, y los niveles de TNF-a- fueron inferiores en el medio enriquecido con gas de la invención con la PHA, que en el medio de control con la PHA, mientras que los niveles de IL-?ß fueron inferiores en el fluido enriquecido con gas de la invención con PHA, en comparación con el medio de control con la PHA. En el medio enriquecido con gas de la invención solo, los niveles de IFN-? fueron superiores que en el medio de control .

TABLA 9 Mués IFN 11 11 11- 11 11- 11- 11 11 11- IP TNFa tra - - 12p -2 4 5 -6 -8 ib - 10 12 70 10 p4 0 1 0 0 0 2.8 0 0 7.9 20 13 7.5 11 15.5 5 8 .3 50 6 50 0 2 0 0 0 3.0 0 0 8 15 89 3.6 42 7.94 8 .2 40 8 80 3 0 58 16 3.1 0 0 8 16 22 328 86 1370 1 8 5 40 00 0 2 0 0 4 0 37 56 4.2 0 0 8.0 23 22 336 55 1620 7 .3 2 8 80 10 00 8 0 0 0 5 0 0 0 2.5 0 0 7.9 24 13 7.3 59 8.55 1 9 30 3 00 6 0 0 0 2.7 0 0 8 5. 32 4.6 33 0 7 98 10 8 30 EJEMPLO 12 Glicoproteína de la mielina de los oligodendrocitos (MOG) Como se indica en la Figura 48, la proliferación de linfocitos en respuesta a los péptidos antigénicos MOG aumentó cuando se cultivaron en la presencia del fluido enriquecido con gas de la invención cuando se comparó con el fluido oxigenado presurizado, (recipiente de presión) o el fluido control desionizado. De este modo, el fluido de la invención enriquecido con gas amplifica la respuesta proliferativa de los linfocitos a un antígeno con el cual las células fueron previamente estimuladas.

El péptido de la glicoproteína de la mielina de los oligodendrocitos 35-55 (MOG 35-55) (M-E-V-G-W-Y-R-S-P-F-S-R-O-V-H-L-Y-R-N-G-K) . (SEQ ID NO: 1; véase la publicación US20080139674 , incorporada como referencia en este documento, incluida para los propósitos de esta SEQ ID NO: 1) que corresponde a la secuencia del ratón conocida se sintetizó. A continuación, 5 x 105 células del bazo se eliminaron del receptor de células T MOG de ratones transgénicos previamente inmunizados con MOG, y se cultivaron en 0.2 mi de fluido TCM reconstituido con el fluido enriquecido con gas de la invención, agua oxigenada presurizada (agua del recipiente presurizado) o con agua desionizada control. Los esplenocitos se cultivaron con MOG p35-55 durante 48 ó 72 horas, respectivamente. Los cultivos se pulsaron con ICi [3H] -timidina y se cosecharon 16 horas más tarde. El cpm medio de la incorporación de la timidina [3H] se calculó para los cultivos por triplicado. Los resultados se muestran en la Figura 48.

EJEMPLO 13 Expresión de Citoquinas En los aspectos particulares, los linfocitos mixtos humanos se estimularon con antígeno T3 o PHA en el fluido electrocinético de la invención, o fluidos de control, y los cambios en la IL-?ß, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-10, IL-12(p40), IL-12 (p70) , IL-13, IL-17, Eotaxina, IFN-?, GM-CSF, ???-?ß, MCP-1, G-CSF, FGFb, VEGF, TNF-OÍ , RANTES , Leptina, TNF-ß, TFG-ß, y NGF se evaluaron. Como se puede observar en la Figura 38, las citoquinas pro- inflamatorias (IL-?ß, TNF-a, IL-6, y GM-CSF) , las guimiocinas (IL-8, MIP-IOÍ, RA TES y eotaxina) , las enzimas inflamatorias (iNOS, COX-2 y MP-9) , respuestas al alérgeno (MHC de clase II, CD23, B7-1 y B7-2) , y las citoquinas Th2 (IL-4, IL-13 e IL-5) probadas se redujeron en el fluido de prueba frente al fluido de control. Por el contrario, las citoquinas antiinflamatorias (por ejemplo, ILlR-a, TIMP) probadas aumentaron en el fluido de prueba frente a fluido de control. Para ampliar estos datos, los solicitantes usaron un sistema modelo reconocido por la técnica que involucra la sensibilización con ovoalbúmina, para evaluar las reacciones de hipersensibilidad alérgica. Los puntos finales estudiados fueron los componentes citológicos y celulares particulares de la reacción, asi como las mediciones serológicas de proteínas y LDH. Se realizó el análisis de las citoquinas, incluyendo el análisis de Eotaxina, la IL-1A, IL-1B, KC, MCP-1, MCP-3, MIP-1A, RANTES, TNF-A, y VCA .

En resumen, las ratas machos Brown Norway se inyectaron por vía intraperitoneal con 0.5 mi de Ovoalbúmina (OVA) Grado V (A5503-1G, Sigma) en una solución (2.0 mg/ml) que contenía hidróxido de aluminio (Al (OH) 3) (200 mg/ml) una vez los días 1, 2 y 3. El estudio fue un arreglo factorial 2 x 2 aleatorio de tratamientos (4 grupos) . Después de un período de espera de dos semanas para permitir que se produjera una reacción inmune, las ratas se expusieron o se trataron durante una semana, ya sea con RDC1676-00 (solución salina estéril procesada a través del dispositivo Revalesio registrado) , y RDC1676-01 (solución salina estéril procesada a través del dispositivo Revalesio registrado con oxígeno adicional añadido) . Al final de la semana 1 de tratamiento por una vez al día, los dos grupos se dividieron a la mitad y el 50% de las ratas en cada grupo recibió solución salina o reto con OVA por inhalación.

En concreto, catorce días después de la serialización inicial, 12 ratas se expusieron a RDC 1676-00 por inhalación durante 30 minutos cada día durante 7 días consecutivos. La tasa de flujo de aire a través del sistema se fijó en 10 litros/minuto. Un total de 12 ratas se alinearon en la cámara circular, con un único puerto para introducir y distribuir equitativamente el material nebulizado a las 12 sub-cámaras del Aeroneb.

Quince días a continuación de la sensibilización inicial, 12 ratas. se expusieron a RDC 1676-01 por nebulización ultrasónica durante 30 minutos cada día durante 7 días consecutivos. El flujo de aire se fijó también en 10 litros/minuto, usando el mismo nebulizador y la cámara. La RDC 1676-00 se nebulizó primero y la cámara Aeroneb se secó por completo antes de que RDC 1676-01 fuera nebulizado.

Aproximadamente 2 horas después del último tratamiento de nebulización, las 6 ratas del grupo RDC 1676-00 se retaron de nuevo con OVA (1% en solución salina) entregado por la instilación intratraqueal usando un microaspersor Penn Century (modelo 1A-1B) . Las otras 6 ratas del grupo RDC 1676-00 se retaron con solución salina como el grupo de control, entregada por medio de la instilación intratraqueal. Al día siguiente, se repitió el procedimiento con el grupo RDC 1676-01.

Veinticuatro horas después del reto, todas las ratas en cada grupo se sacrificaron por sobredosis con pentobarbital sódico. Las muestras de sangre completa se tomaron de la vena cava inferior, y se colocan en dos tubos diferentes para la recogida de sangre : tubo para ARN de la sangre Qiagen PAXgene™ y tubo para ADN de la sangre Qiagen PAXgene™. Los pulmones se procesaron para obtener fluido del lavado broncoalveolar (BAL) y tejido pulmonar para RT-PCR para evaluar los cambios en los marcadores de la expresión de citoquinas conocidos por estar asociados con la inflamación pulmonar en este modelo. Una técnica de lavado unilateral se empleó para preservar la integridad de los cuatro lóbulos en el lado derecho del pulmón. El lóbulo "grande" de la Izquierda se lavó, mientras que los cuatros lóbulos de la derecha se unieron y se colocaron inmediatamente en TRI-zol™, se homogenizaron y se enviaron al laboratorio para su posterior procesamiento.

Análisis de BAL. El lavado de pulmón se colectó y se centrifugó durante 10 minutos a 4 °C a 600-800 g para granular las células. Los sobrenadantes se transfirieron a tubos limpios y se congelaron a -80 C°. El fluido de lavado bronquial ( "BAL" ) se separó en dos alícuotas . La primera alícuota se centrifugó y el sobrenadante se congeló rápidamente en hielo seco fraccionado, se colocó a -80°C, y se envió al laboratorio para su posterior procesamiento. La cantidad de proteínas y LDH presente indican el nivel de proteína en el suero de la sangre (la proteína es un componente del suero que se filtra a través de las membranas cuando es retada como en este experimento) y la muerte celular, respectivamente. La parte de la prueba registrada mostró ligeramente menos proteína que el control.

La segunda alícuota del fluido de lavado ' bronquial se evaluó para el contenido de proteína total y LDH, así como se sometió a un exámen citológico. El grupo tratado mostró que las células totales son mayores que el grupo control con solución salina. Además, hubo un aumento de los eosinófilos en el grupo tratado frente al grupo control. También hubo células polimorfonucleares ligeramente diferentes para la parte tratada frente al control .

Análisis de sangre. La sangre completa se analizó mediante la transferencia de 1.2 a 2.0 mi de sangre en un tubo, y se permitió que coagulara durante al menos 30 minutos. La muestra de sangre restante (aproximadamente 3.5-5.0 mi) se guardó para la extracción de ARN usando TRI-zol™ o PAXgene™. A continuación, la muestra de sangre coagulada se centrifugó durante 10 minutos a 1200 g a temperatura ambiente. El suero (sobrenadante) se eliminó y se colocó en dos tubos limpios, y el suero se almacenó a -80°C.

Para la extracción de ARN usando el Tri-reactivo (TB-126, Molecular Research Center, Inc.), 0.2 mi de sangre completa o plasma se añadieron a 0.75 mi de reactivo TRI BD suplementado con 20 µ? de ácido acético 5N por cada 0.2 mi de sangre completa o plasma. Los tubos se agitaron y se almacenaron a -80°C usando PAXgene™, los tubos se incubaron durante aproximadamente dos horas a temperatura ambiente . Los . tubos se colocaron en su posición y se almacenaron en el congelador -20°C durante 24 horas, y luego se transfirieron a -80°C para un almacenamiento por largo tiempo.

Análisis de Luminex. Por la plataforma Luminex, un análisis de microperlas se utilizó como sustrato para una reacción de unión relacionada con anticuerpos la cual se lee en unidades de luminosidad y se puede comparar con los estándares cuantificados . Cada muestra de sangre se procesó como dos muestras al mismo tiempo. Las unidades de medición son unidades de luminosidad y los grupos se dividen hasta en controles retados con OVA, tratamiento retado con OVA y tratamiento retado con la solución salina con el fluido registrado .

Para la generación de datos con arreglos de genes Agilant, se aisló tejido pulmonar y se sumergió en el reactivo TRI (TR118, Molecular Research Center, Inc.) . En resumen, se añadió aproximadamente 1 mi de reactivo TRI a 50-100 mg de tejido en cada tubo. Las muestras se homogenizaron en el reactivo TRI, usando un homogeneizador de vidrio-TefIon™ o Polytron™. Las muestras se almacenaron a -80C°.

Muestras de sangre: Las Figuras 49-58 muestran los resultados de las evaluaciones de muestras de sangre completa.

La Figura 49 ejemplo muestra el formato de presentación de datos básicos de la luminosidad para los datos de la muestra de sangre. Las cartas que designan la identidad de la citoquina medida (en este caso KC) se encuentran en la parte superior derecha de cada figura de datos. Los datos se presentan tanto como puntos de datos (gráfico superior) y gráficos de barras (gráfico inferior) de las muestras individuales. En cualquier caso, los gráficos se dividen, de izquierda a derecha, en cuatro grupos. Los primeros dos grupos (RDC1676-00 OVA y RDC1676-01 OVA, respectivamente) fueron aquellos que se retaron de nuevo con OVA por inhalación, mientras que los dos últimos grupos (RDC1676-00 OVA y RDC1676-01 OVA, respectivamente) fueron aquellos que se retaron de nuevo con la solución salina control solamente. Una vez más, el sufijo 00 representa el tratamiento con solución salina y el sufijo 01 representa los grupos tratados con el fluido electrocinético de la invención.

Cada muestra de sangre se dividió en dos muestras y las muestras se procesaron al mismo tiempo. Las unidades de medida son unidades de la luminosidad y los grupos yendo de izquierda a derecha son: controles retados con OVA; tratamiento con el fluido electrocinético de la invención retado con OVA; seguido por el tratamiento con solución salina retado con la solución salina; y el tratamiento con el fluido electrocinético de la inventiva retado con la solución salina. Para facilitar la revisión, los grupos RDC1676-01 se destacan en gris con fondo sombreado, mientras que los grupos de tratamiento con solución salina control tienen un fondo sin sombreado.

Generalmente, al comparar los dos grupos de la izquierda, mientras que la propagación de los datos del grupo RDC1676-01 es algo mayor, los niveles de citoquina particulares en el grupo RDC1676-01 en su conjunto son menos que las muestras en el grupo control tratado; típicamente aproximadamente un 30% de diferencia numérica entre los 2 grupos. Generalmente, al comparar los dos grupos más a la derecha, el grupo RDC1676-01 tiene un orden numérico ligeramente superior en comparación con el grupo RDC1676-00.

La Figura 50 muestra el análisis de RANTES (super familia IL-8) en los datos de muestras de sangre de acuerdo con aspectos ejemplares particulares. Las unidades de luminosidad para dos grupos más a la izquierda (los grupos retados con OVA) indican que generalmente los valores en el grupo tratado RDC1676-01 fueron menores que el grupo control RDC1676-00 como se muestra por el gráfico de puntos en la parte superior del gráfico que muestra de nuevo un diferencial de 30-35% entre los dos grupos, mientras que en los grupos expuestos solamente a la solución salina, los valores del nivel de citoquina fueron más o menos iguales, o quizás ligeramente aumentados en el grupo tratado con RDC1676-01.

La Figura 51 muestra el análisis de MCP-1 en los datos de muestra de sangre de acuerdo a aspectos ejemplare particulares. Las unidades de luminosidad para los dos grupos más a la izquierda (los grupos retados con OVA) indican que generalmente los valores en el grupo tratado con RDC1676-01 fueron menores que el grupo control RDC1676-00 como se muestra por el gráfico de puntos en la parte superior del gráfico, mientras que en los grupos expuestos solamente a la solución salina, los valores del nivel de citoquina fueron más o menos iguales, o quizás ligeramente aumentados en el grupo tratado con RDC1676-01.

La Figura 52 muestra el análisis de TNF alfa en los datos de muestra de sangre de acuerdo a aspectos ejemplares particulares. Las unidades de luminosidad para los dos grupos más a la izquierda (los grupos retados con OVA) indican que generalmente los valores en el grupo tratado con RDC1676-01 fueron menores que el grupo control RDC1676-00 como se muestra por el gráfico de puntos en la parte superior del gráfico mientras que en los grupos expuestos solamente a la solución salina, los valores del nivel de citoquina fueron más o menos iguales, o quizás ligeramente aumentados en el grupo tratado con RDC1676-01.

La Figura 53 muestra el análisis de MIP-1 alfa en los datos de muestra de sangre de acuerdo a aspectos ejemplares particulares. Las unidades de luminosidad para los dos grupos más a la izquierda (los grupos retados con OVA) indican que generalmente los valores en el grupo tratado con RDC1676-01 fueron menores que el grupo control RDC1676-00 como se muestra por el gráfico de puntos en la parte superior del gráfico, mientras que en los grupos expuestos solamente a la solución salina, los valores del nivel de citoquina fueron más o menos iguales, o quizás ligeramente aumentados en el grupo tratado con RDC1676-01.

La Figura 54 muestra el análisis de IL-1 alfa en los datos de muestra de sangre de acuerdo a aspectos ejemplares particulares. Las unidades de luminosidad para los dos grupos más a la izquierda (los grupos retados con OVA) indican que generalmente los valores en el grupo tratado con RDC1676-01 fueron menores que el grupo control RDC1676-00 como se muestra por el gráfico de puntos en la parte superior del gráfico mientras que en los grupos expuestos solamente a la solución salina, los valores del nivel de citoquina fueron más o menos iguales, o quizás ligeramente aumentados en el grupo tratado con RDC1676-01.

La Figura 55 muestra el análisis de Vcam en los datos de muestra de sangre de acuerdo a aspectos ejemplares particulares. Las unidades de luminosidad para los dos grupos más a la izquierda (los grupos retados con OVA) indican que generalmente los valores en el grupo tratado con RDC1676-01 fueron menores que el grupo control RDC1676-00 como se muestra por el gráfico de puntos en la parte superior del gráfico, mientras que en los grupos expuestos solamente a la solución salina, los valores del nivel de citoquina fueron más o menos iguales, o quizás ligeramente aumentados en el grupo tratado con RDC1676-01.

La Figura 56 muestra el análisis de IL-1 beta en los datos de muestra de sangre de acuerdo a aspectos ejemplares particulares. Las unidades de luminosidad para los dos grupos más a la izquierda (los grupos retados con OVA) indican que generalmente los valores en el grupo tratado con RDC1676-01 fueron menores que el grupo control RDC1676-00 como se muestra por el gráfico de puntos en la parte superior del gráfico mientras que en los grupos expuestos solamente a la solución salina, los valores del nivel de citoquina fueron más o menos iguales, o quizás ligeramente aumentados en el grupo tratado con RDC1676-01.

Las Figuras 57 y 58 muestran el análisis de Eotaxina y MCP-3, repectivamente en los datos de muestra de sangre de acuerdo a aspectos ejemplares particulares. En cada caso, las unidades de luminosidad para los dos grupos más a la izquierda (los grupos retados con OVA) indican que generalmente los valores en el grupo tratado con RDC1676-01 fueron menores que el grupo control RDC 676-00 como se muestra por el gráfico de puntos en la parte superior del gráfico, mientras que en los grupos expuestos solamente a la solución salina, los valores del nivel de citoquina fueron más o menos iguales, o quizás ligeramente aumentados en el grupo tratado con RDC1676-01.

Muestras de lavado bronquial: Las Figuras 59- S8 muestran los resultados correspondientes a las evaluaciones de las muestras de fluido de lavado broncoalveolar (BAL) .

La Figura 59 muestra el análisis de KC en los datos de BAL de acuerdo con aspectos ejemplares particulares. En este caso, el nivel de respuesta, junto con la variabilidad del muestreo, no fue concluyente con respecto a una diferencia entre el RDC1676-01 y grupos tratados con RDC1676-00, es decir, KC mostró una diferencia relativamente pequeña entre los 2 grupos, pero las unidades de luminosidad eran muy pequeñas .

Del mismo modo, la Figura 60 muestra el análisis de RANTES en los datos de BAL de acuerdo con aspectos ejemplares particulares, y mostró una marcada variabilidad en el grupo RDC1676-01 con una lectura que fue marcadamente superior a las demás, desvirtuando los resultados.

Del mismo modo, la Figura 61 muestra el análisis de TNF alfa en los datos de BAL de acuerdo con aspectos ejemplares particulares, y mostró una relevancia relativamente pequeña en la diferencia entre los grupo tratados con RDC1676T00 y RDC1676-01.

La Figura 62 muestra el análisis de MCP-1 en los datos de BAL de acuerdo con aspectos ejemplares particulares, y mostró una relevancia relativamente pequeña en la diferencia entre los grupo tratados con RDC1676-00 y RDC1676-01.

Las Figura 63 a 68 muestran el análisis de MIP1-A, alfa IL-1, VCAM, beta IL-1, MCP-3, y Eotaxina, respectivamente, en los datos de BAL de acuerdo con aspectos ejemplares particulares y una relevancia relativamente pequeña en la diferencia entre los grupo tratados con RDC1676-00 y el RDC1676-01.

En resumen, este ensayo estándar de la reacción inflamatoria a una sensibilización conocida produjo, al menos en las muestras de sangre, una afectación clínica y serológica marcada. Además, mientras que un número significativo de animales de control se estresaron fisiológicamente y casi agonizaron en el proceso, ninguno de los grupos tratados con RDC1676-01 mostró tales efectos clínicos del estrés. Esto se reflejó después en los niveles circulantes de las citoquinas, con aproximadamente 30% de diferencia entre los grupos tratados con RDC1676-01 y el grupo tratado con RDC1676-01 en los grupos retados con OVA. Por el contrario, hubo cambios pequeños y bastante insignificantes en las citoquinas, perfiles serológicos y celulares entre los grupos tratados con RDC1676-01 y los grupos tratados con RDC1676-01 en los grupos no retados con OVA, lo que probablemente sólo representa cambios mínimos de la línea base del propio fluido .

EJEMPLO 14 Afinidad de unión del receptor B2 de la bradiquinina Un biosensor de interferometría de Bicapa, Detección Ampliada Rápida de Octeto (RED) ( forteBio™) ) , se utilizó para examinar la afinidad de unión del receptor de membrana del ligando de bradiquinina con el receptor B2 bradiquinina . El sistema del biosensor consiste en una fibra óptica brillante embebida en un centro de polipropileno con sensor químico específico en la punta. La fijación del biosensor tiene una capa de moléculas unidas a la punta de una fibra óptica que crea un patrón de interferencia en el detector. Cualquier cambio en el número de moléculas unidas provoca un cambio medido en el patrón de la luz .

Como se muestra en la Figura 69, el receptor de membrana B2 de la bradiquinina se inmovilizó en el biosensor de aminopropilsilano (APS) . La fijación de la placa de muestra se designó en la Figura 69 y se analizó en la Figura 70. A continuación, la unión de la bradiquinina al receptor inmovilizado se evaluó de acuerdo con la muestra fijada como se designó en la Figura 71. Los resultados de la unión de la bradiquinina se muestran en la Figura 72. La unión de la bradiquinina al receptor se tituló, además, de acuerdo con la fijación como se designó en la Figura 73.

Como se indica en la Figura 74, la unión de la bradiquinina al receptor B2 fue dependiente de la concentración, y la afinidad de unidad aumentó en el fluido salino enriquecido con gas registrado de la presente descripción en comparación, con la solución salina normal. La estabilización de la unión de la bradiquinina al receptor B2 se muestra en la Figura 75.

EJEMPLO 15 (Un análisis de células T reguladoras se usó para mostrar los efectos de los fluidos generados por electrocinética de la invención en la modulación de la proliferación de células T y la elaboración de citoquinas (IL-10) y otras proteínas (por ejemplo, GITR, Granzima A, XCL1, pStat5, y Foxp3)) en ensayos de células T reguladoras, y de, por ejemplo, triptasa en PBMC) La capacidad de las modalidades particulares descritas en este documento para regular las células T se estudió por la irradiación de las células presentadoras de antígeno, y la introducción de antígeno y las células T. Típicamente, estas células T estimuladas proliferan. Sin embargo, tras la introducción de las células T reguladoras, la proliferación de células T habitual se suprime.

Métodos : En resumen, el anticuerpo conjugado con FITC anti-CD25 (ACT-1) que se usó en la clasificación se adquirió de DakoCytomation (Chicago, IL) . Los otros anticuerpos que se usaron fueron los siguientes: CD3 (HIT3a para condiciones solubles) , GITR (conjugado PE) , CD4 (Cy-5 y conjugado con FITC), CD25 (conjugado con APC) , CD28 (clon CD28.2), CD127-APC, Granzima A (conjugado con PE) , FoxP3 (BioLegend) , IgGlde ratón (control de isotipo), y los anticuerpos XCL1. Todos los anticuerpos se usaron de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Las células T CD4+ se aislaron de sangre completa periférica con Kit de Rosette CD4+ (Stemcell Technologies) . Las células T CD4+ se incubaron con anticuerpos anti-CD127-APC, anti-CD25-PE y anti-CD4-FITC. Las células se clasificaron por citometría de flujo usando un FACS Aria en CD25hiCD1271o/nTreg CD4+ y T células T respondedoras CD4 + CD25.

Los ensayos de supresión se realizaron en placas de microtitulación de 96 pocilios de fondo redondo. 3.75 x 103 células T respondedoras CD4 + CD25neg, 3.75 x 103T reguladoras autólogas T reg, 3.75 x 104 PB C agotado con CD3 irradiado alogénico se adicionaron como se indicó. Todos los pocilios se suplementaron con anti-CD3 (clon HIT3a a 5.0 pg/ml) . Las células T se cultivaron durante 7 días a 37°C en medio RPMI 1640 suplementado con suero fetal bovino al 10%. Dieciséis horas antes del final de la incubación, 1.0 mCi de timidina-3H se adicionó a cada pozo. Las placas se cosecharon con un colector de célula Tomtec y la incorporación de timidina-3H se determinó usando un contador de centelleo Perkin Elmer. Las células presentadoras de antígeno (APC) , consistieron en células mononucleares de sangre periférica (PBMC) agotadas de las células T usando StemSep para el agotamiento de células T humanas CD3 + (stemcell Technologies) , seguido de 40 Gy de radiación.

Las células T reguladoras se estimularon con condiciones anti-CD3 y anti-CD28 y después se tiñeron con J:inte rojo para viabilidad Viva/Muerta (Invitrogen) , y los marcadores de superficie CD4 , CD25 y CD127. Las células se fijaron en el tampón Lyze/Fix PhosFlow™ y se permeabilizaron en Permbuffer III® desnaturalizante. Las células después se tiñeron con anticuerpos contra cada molécula particular seleccionada.

El análisis estadístico se realizó mediante el software GraphPad Prism. Las comparaciones entre los dos grupos se realizaron usando la prueba t de Student no apareada, de dos colas. Las comparaciones entre los tres grupos se realizaron usando un A OVA de un factor. Los valores de P menores que 0.05 se consideraron significativos (dos colas). Se determinó que la correlación entre dos grupos era estadísticamente significativa a través del coeficiente de Spearman si el valor de r era mayor de 0.7 o menor a -0.7 (dos colas) .

Resultados : Como se indicó en la Figura 76, la proliferación de células T reguladoras se estudió por la estimulación de las células con el material particulado de escape diesel (PM, de la EPA) . El eje x de la Figura 76 muestra las células autólogas T CD4+ efectoras activadas (células respondedoras) como una barra negra sólida, y las células T reguladoras solo en la barra gris (mostrada para la confirmación de anergia) , las cuales se mezclaron en una proporción de 1:1 como se muestra en la barra blanca. El eje y muestra la proliferación como una medida del consumo de timidina-3H. Como se muestra de izquierda a derecha a lo largo del eje x, "PM" indica Material Particulado derivado del escape de diesel, "PM + Rev" indica PM más un fluido generado por electrocinética enriquecido con gas (Rev) de la presente descripción, "Solis" indica un fluido generado por electrocinética de la presente descripción y el dispositivo que no es enriquecido solo con gas más allá del de la atmósfera ambiente, solamente (sin PM adicionado) , "Rev" indica Rev solo (sin PM adicionado) , como se definió con anterioridad, "Medio", indica el control solo con medio de cultivo celular (menos PM; sin Rev, sin Solis) , y "Con salina" indica el control de solución salina (menos PM; sin Rev, sin Solis) , "V" indica verapamilo, y "P" indica propanolol, y "DT" es DT390 en 1:50.

Como se muestra en la Figura 77, las células estimuladas con PM (sin Rev, sin Solis) resultaron en una disminución de la IL-10 secretada, mientras que las células expuestas a PM en la presencia de los fluidos de la presente descripción ("PM + Rev") resultaron en una producción mantenida o ligeramente disminuida de la IL-10 respecto a los controles de Solución Salina y los Medios (sin PM) . Además, la toxina diftérica (DT390, una molécula de la toxina diftérica truncada; dilución 1:50 de concentración comercial estándar) se tituló en muestras de fluidos de la invención, y se bloqueó el efecto de aumento en IL-10 mediado por Rev en la Figura 77. Tenga en cuenta que el tratamiento con Rev solo resultó en niveles superiores de IL-10 con respecto a los controles con solución salina y medios.

Asimismo, resultados similares, mostrados las Figuras 78-82, se obtuvieron con GITR, Granzima A, XCL1 , pStat5 y Foxp3 , respectivamente. En la Figuras, "NSC" es lo mismo que "Solis" (sin PM) .

La Figura 83 muestra los datos de AA PBMC, que se obtuvieron a partir de un perfil de asma alérgica (AA) de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) que se evalúa con triptasa. El dato de AA PBMC fue consistente con los datos anteriores de células T-reguladoras , ya que las células estimuladas con el material particulado (PM) mostraron altos niveles de triptasa, mientras que las células tratadas con PM en presencia de los fluidos de la presnete descripción ("PM + Rev") resultaron en niveles de triptasa significativamente inferiores similares a aquellos de los controles con solución salina y medios. Consistente con los datos de las células T-reguladoras, la exposición a DT390 bloqueó el efecto mediado por Rev en los niveles de triptasa, lo que resultó en un elevado nivel de triptasa en las células como se observó para PM solo (menos Rev, sin Rev, sin Solis) . Tenga en cuenta que el tratamiento solo con Rev resultó en niveles inferiores de triptasa con respecto a los controles de solución salina y medios.

En resumen, los datos de la Figura 76, que muestra una disminución de la proliferación en la presencia de PM y Rev con respecto a PM en el fluido de control (sin Rev, sin Solis) , indican que el fluido Rev generado por electrocinética de la invención mejoró la función de las células T reguladoras, como se muestra por la proliferación relativamente disminuida en el ensayo. Además, la evidencia de este Ejemplo y las Figuras de la 76 a la 83, indican que el bloqueo beta, el bloqueo GPCR y el bloqueo de los canales de Ca afectan la actividad de Revera en función de Treg.

EJEMPLO 16 (El tratamiento de células epiteliales bronquiales primarias (BEC) con los fluidos generados por electrocinética de la invención resultó en la expresión y/o actividad reducida de dos proteínas claves de las rutas inflamatorias de las vías . respiratorias, MMP9 y TSLP) Información general. Como se muestra en el Ejemplo 14 anterior (por ejemplo, la Figura 75, que muestra la Estabilización de la unión de bradiquinina al receptor B2 usando el biosensor de Interferometría de Bicapa, Detección Ampliada Rápida de Octeto (RED) (forteBio™) ) , la unión de la bradiquinina al receptor B2 fue dependiente de la concentración, y la afinidad de unión aumentó en el fluido generado por electrocinética (por ejemplo, Rev; fluido generado por electrocinética enriquecido con gas) de la presente descripción, en comparación con la solución salina normal. Además, como se muestra en el Ejemplo 15, en el contexto de las células T-reguladoras estimuladas con el material particulado de escape de diesel (PM, fuente comercial estándar) , los datos mostraron una proliferación disminuida de las células T reguladoras en presencia de PM y Rev respecto al PM en el fluido de control (sin Rev, sin Solis) (Figura 76) , lo que indica que el fluido Rev generado por electrocinética de la invención mejoró la función de células T reguladoras; por ejemplo, como se muestra por la proliferación relativamente disminuida en el ensayo. Además, la exposición a los fluidos de la invención resultó en una producción ligeramente disminuida o mantenida de IL-10 respecto a los controles de solución salina y medios (sin PM) . Del mismo modo, en el contexto de los perfiles de asma alérgica (AA) de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) estimuladas con el material particulado (PM) , los datos mostraron que la exposición a los fluidos de la presente descripción ("PM + Rev") resultaron en niveles de triptasa significativamente inferiores similares a aquellos de los controles de solución salina y medios. Además, los efectos de la toxina de la difteria (DT390, una molécula truncada de la toxina diftérica; dilución 1:50 de concentración comercial estándar) se muestran en el Ejemplo 15 y las Figuras 76-83, indican que el bloqueo beta, el bloqueo GPCR y el bloqueo de los canales de Ca afecta la actividad de los fluidos generados por electrocinética en la función de Treg y PBMC. Además, los datos del Ejemplo 18 muestran que, de acuerdo con los aspectos adicionales, sobre la exposición a los fluidos de la invención, las uniones herméticas relacionadas a las proteínas se sobreregularon en el tejido pulmonar. Las Figuras 85-89 muestran la sobreregulación de las moléculas de adhesión de unión JAM 2 y 3, GJA1, 3, 4 y 5 (adherinas de unión), OCLN (ocludina) , claudinas (por ejemplo, CLDN 3, 5, 7, 8, 9, 10), TJP1 {proteína 1 de unión hermética), respectivamente. Además, como se muestra en los estudios de fijación de parche del Ejemplo 23, los fluidos generados por electrocinética de la invención (por ejemplo, RNS-60) afectan la modulación de la conductancia de la célula entera (por ejemplo, bajo condiciones de hiperpolarización) en las Células Epiteliales Bronquiales (BEC; por ejemplo, Calu-3), y de acuerdo con aspectos adicionales, la modulación de la conductancia de la célula entera refleja la modulación de los canales iónicos.

En este ejemplo, los solicitantes han ampliado estos descubrimientos por la conducción de experimentos adicionales para medir los efectos de la producción de dos proteínas claves de las rutas inflamatorias de las vías respiratorias. En concreto, la MMP9 y la TSLP se analizaron en las células •epiteliales bronquiales primarias (BEC) .

Materiales y Métodos: Las células epiteliales bronquiales humanas primarias (BEC) (HBEpC-c de Promocell, Alemania) disponibles en el comercio se usaron para estos estudios . Aproximadamente 50,000 células se sembraron en cada pocilio de una placa de 12 pocilios hasta que alcanzaron ~ 80% de la confluencia. Después, las células se trataron durante 6 horas con solución salina normal, fluido de control Solas o el fluido de prueba Revera- 60 a una dilución de 1:10 (100 ul en 1 mi de medio de crecimiento epitelial de las vías respiratorias) junto con el material particulado de escape de diesel (DEP o PM) antes que se disipara para el análisis de FACS, como se describió en el Ejemplo 8 de este documento. Ambos anticuerpos de los receptores de MMP9 y de TSLP se obtuvieron de BD Biosciences y se usaron según las especificaciones del fabricante.

Resultados : En las Figuras 115 y 116, DEP representa las células expuestas al material particulado de escape de diesel solo (PM, fuente comercial estándar) , "NS" representa las células expuestas a una solución salina normal solo, "DEP+NS" representa las células tratadas con el material particulado en presencia de solución salina normal, "Revera 60" se refiere a las células expuestas al material de prueba solo, "DEP + Revera 60" se refiere a las células tratadas con el material particulado en presencia del material de prueba Revera 60. Además, "Solas" y "DEP+ Solas" representan las células expuestas al fluido control Solas solo o en combinación con el material particulado, respectivamente.

La Figura 115 muestra que el material de prueba Revera 60 reduce la expresión del receptor TSLP inducido por el DEP en las células epiteliales bronquiales (BEC) en aproximadamente un 90%. Solas resultó en una reducción del 55% en la expresión del receptor de la TSLP, mientras que solución la salina normal falló para producir el nivel similar de reducción en la expresión del receptor TSLP (aproximadamente 20% de reducción) . El efecto de la solución de la invención en la reducción de la expresión del receptor de TSLP es un descubrimiento significativo en vista de lós hallazgos recientes que muestran que la TSLP juega un papel fundamental en la patobiología del asma alérgica y el bloqueo local mediado por anticuerpos de la enfermedad alérgica aliviada en función del receptor TSLP (Liu, YJ, Thymic stromal lymphopoietin : Master switch for allergic inflammation, J Exp Med 203:269-273, 2006, Al-Shami y otros, A role for TSLP in the development of inflammation in an asthma model, J" Exp Med 202:829-839, 2005; y Shi y otros, Local blockade of TSLP receptor alleviated allergic disease by regulating airway dendritic cells, Clin Immunol 2008, 29 de agosto (publicación electrónica antes de la impresión) .

Del mismo modo, la Figura 116 muestra el efecto de Revera 60, Solas y solución salina normal en el aumento en la MMP-9 mediada por DEP. En concreto, el Revera 60 inhibió los niveles de MMP9 unida a la superficie celular inducido por DEP en las células epiteliales bronquiales en aproximadamente un 80%, y Solas tuvo un efecto inhibitorio de aproximadamente 70%, mientras que la solución salina normal (NS) tuvo un efecto marginal de aproximadamente 20% de reducción. La MMP-9 es una de las proteasas principales involucrada en la inflamación de las vías respiratorias y el remodelado bronquial en el asma. Recientemente, se ha demostrado que los niveles de MMP-9 están aumentados de manera significativa en los pacientes con asma estable e incluso superior en los pacientes asmáticos agudos en comparación con los sujetos control sanos. La MMP-9 juega un papel crucial en la infiltración de las células inflamatorias de las vías respiratorias y la inducción de la hiperreactividad de las vías respiratorias lo que indica que la MMP-9 puede tener un papel importante en la inducción y el mantenimiento del asma (Vignola y otros,, Sputum metalloproteinase- 9/tissue inhibitor of metalloproteinase- 1 ratio correlates with airflow obstruction in asthma and chronic bronchitis, Am J Respir Crit Care Med 158:1945-1950, 1998; Hoshino y otros, Inhaled corticosteroids decrease subepithelial collagen deposition by modulation of the balance between matrix metalloproteinase-9 and tissue inhibitor of metalloproteinase-1 expression in asthma, J Allergy Clin Immunol 104:356-363, 1999; Simpson y otros, Differential proteolytic enzyme activity in eosinophilic and neutrophilic asthma, Am J" Respir Crit Care Med 172:559-565,2005; Lee y otros, A murine model of toluene diisocyanate- induced asthma can be treated with matrix metalloproteinase inhibitor, J" Allergy Clin Immunol 108:1021-1026, 2001; y Lee y otros, Matrix metalloproteinase inhibitor regulates inflammatory cell migration by reducing ICAM-1 and VCAM-1 expression in a murine model of toluene diisocyanate-induced asthma, J Allergy Clin Immunol 2003;111:1278-1284).

De acuerdo a los aspectos adicionales, por lo tanto, los fluidos generados por electrocinética de la invención tienen utilidad terapéutica sustancial para modular (por ejemplo, reducir) la expresión del receptor de la TSLP y/o para la inhibición de la expresión y/o actividad de MMP-9, que incluye, por ejemplo, el tratamiento de la inflamación y el asma .

EJEMPLO 17 (Los fluidos generados por electrocinética de la invención mostraron tener un efecto sinérgico antiinflamatorio con la budesonida en un modelo animal reconocido por la técnica para el asma alérgica) Este ejemplo de trabajo describe los experimentos realizados para evaluar las propiedades antiinflamatorias de las vías respiratorias de los fluidos generados por electrocinética de la invención (por ejemplo, RDC-1676-03) en un modelo de sensibilización con ovoalbúmina en rata Brown Norway. La rata Brown Norway es un modelo reconocido por la técnica para la determinación de los efectos de un material de prueba en la función de las vías respiratorias y esta cepa se ha usado ampliamente, por ejemplo, como un modelo del asma alérgica. La patología de la vía respiratoria y los cambios bioquímicos inducidos por la sensibilización con ovoalbúmina en este modelo se asemejan a los observados en el hombre (Elwood y otros, J Allergy Clin Inmuno 88:951-60, 1991; Sirois y Bissonnette, Clin Exp Immunol 126:9-15, 2001). La ruta inhalatoria se seleccionó para maximizar la exposición del pulmón al material de prueba o la solución de control. Los animales sensibilizados con ovoalbúmina se trataron con budesonida sola o en combinación con el material de prueba RDC 1676-1603 durante 7 días antes del reto con la ovoalbúmina. A las 6 y 24 horas a continuación del reto, el conteo de la sangre total y los niveles de varias citoquinas pro y anti- inflamatorias, así como diversos parámetros respiratorios se midieron para estimar cualquier efecto beneficioso de la administración del material de prueba en los diversos parámetros inflamatorios.

Materiales y Métodos: Las ratas Brown Norway de la cepa Bn/Crl se obtuvieron de Charles River Kingston, con un peso aproximado de 275 ± 50 g al inicio del experimento. Todos los estudios de animales se llevaron a cabo con la aprobación por el Comité Institucional de Cuidado y uso de Animales PCS-MTL. Durante el estudio, el uso y cuidado de los animales se llevó a cabo de acuerdo con las directrices del Consejo de Investigación Nacional de los Estados Unidos, así como del Consejo Canadiense de Cuidado de Animales.

Sensibilización. En el día 1 del experimento, los animales (14 animales en cada grupo de tratamiento) se sensibilizaron por la administración de un 1 mi de inyección intraperitoneal de una solución recién preparada de 2 mg de ovoalbúmina/lOOmg de hidróxido de aluminio por 1 mi de cloruro de sodio al 0.9%, a continuación por repetición de la inyección en el día 3.

Tratamiento. Quince días a continuación de la sensibilización inicial, los animales se sometieron a la exposición nebulizada para el control (solución salina normal) o soluciones de prueba (fluidos generados por electrocinética RDC1676-00, RDC1676-02 y¦ RDC-1676-03) , ya sea administrado solo o en combinación con budesonida, una vez al día durante 15 minutos durante 7 días consecutivos. Los animales se dosificaron en una cámara de cuerpo entero de aproximadamente 20 1, y la atmósfera de prueba se generó en la entrada de aire de la cámara usando nebulizadores ultrasónicos aeroneb suministrados con el aire de una bomba de flujo regulado Buxco. La tasa de flujo de aire se fijó en 10 litros/min.

Desafío con ovoalbúmina . El día 21, dos horas a continuación del tratamiento con las soluciones de prueba, todos los animales se retaron con una solución nebulizada de ovoalbúmina 1% durante 15 minutos (en una cámara de cuerpo entero a un flujo de aire de 21/min) .

Toma de muestras . En los puntos de tiempo de 6 y 24 horas después del reto con ovoalbúmina, se tomaron las muestras de sangre para el conteo total y el conteo diferencial de células sanguíneas, así como para medir los niveles de diversas citoquinas pro y anti-inflamatorios . Además, inmediatamente después de las 6 y 24 horas a continuación del reto con ovoalbúmina, la pausa Penh mejorada y el volumen tidal se midieron durante un período de 10 minutos usando el sistema Buxco Electronics BioSystem XA Resultados : Conteo de eosinófilos: Como se esperaba, y se muestra en la Figura 109, el tratamiento con budesonida ("NS + budesonida 750 g/Kg" ; gráfico de barras densamente sombreado) redujo el conteo total de eosinófilos en los animales retados con respecto al tratamiento con la normal solución salina normal "NS" de control sola (gráfico de barras abiertas) . Además, mientras que el tratamiento con el fluido de la invención "RDC1676-03" solo (gráfico de barras ligeramente sombreadas) no redujo de manera significativa el conteo de eosinófilos, éste no obstante, mostró una sinergia sustancial con la budesonida en la reducción del conteo de eosinófilos ("RDC1676-03 + budesonida 750 mg/kg" , gráfica sólida barra oscura) . Del mismo modo, en la Figura 110, el % de eosinófilos también reflejó una tendencia similar. Mientras el RDC1676-03 (gráfico de barras ligeramente sombreadas) o budesonida solo 750 pg/kg (gráfico de barras densamente sombreadas) no tuvo un efecto significativo en el conteo del % de eosinófilos en los animales retados, los dos en combinación redujeron el % de eosinófilos de manera significativa (gráfico de barras oscuro sólido) .

Por lo tanto, la Figura 109 y 110 muestran, de acuerdo con los aspectos particulares de la presente invención, que los fluidos generados por electrocinética de la invención (por ejemplo, RDC1676-03) demostraron tener una utilidad sinérgica sustancial en combinación con la budesonida para reducir de manera significativa el conteo de eosinófilos para el asma alérgica humana ("% de Eosinófilos" y conteo total) en un modelo de rata reconocido por la técnica.

Parámetros Respiratorios: Las Figuras 111 A-C y 112 A-C demuestran el efecto observado de los fluidos de prueba en el volumen tidal y Penh según se midió inmediatamente, 6 y 24 horas después del reto con ovoalbúmina . Penh es un valor derivado obtenido a partir del flujo de inspiración pico, flujo de expiración pico y el tiempo de expiración y la disminución del valor de pehn refleja un resultado favorable para la función pulmonar.

Penh = (Flujo de expiración pico/Flujo de inspiración pico) * (Tiempo de expiración/ tiempo para expirar el 65% del volumen tidal - 1) .

Como es evidente a partir de las figuras 111 A-C, el tratamiento con budesonida solo (tanto en 500 y 750 g/kg) o en combinación con cualquiera de los fluidos de prueba falló para afectar de manera significativa a los valores Penh inmediatamente después del reto. Sin embargo, 6 horas después del reto, los animales tratados con RDC1676-03 solo o en combinación con budesonida 500 ó 750 pg/kg, demostraron una disminución significativa en los valores de Penh. Aunque la magnitud de esta caída fue menor en 24 horas después del reto, la tendencia de uh efecto sinérgico de la budesonida y el fluido RDC se observó aún en este punto del tiempo.

El volumen tidal es el volumen de aire tomado en los pulmones durante la inspiración desde la posición final de la expiración, que sale de los pulmones pasivamente durante la expiración en el curso de la respiración tranquila. Como se muestra en las Figuras 112 de A a C, los animales tratados con solo budesonida no mostraron cambios en los volúmenes tidal inmediatamente después del reto. Sin embargo, RDC1676-03 solo tuvo un efecto estimulatorio significativo sobre el volumen tidal, incluso en este punto de tiempo inicial. Y de nuevo, RDC1676-03 en combinación con budesonida (ambos 500 y 750 pg/kg) tuvieron un efecto aún más pronunciado en las mediciones del volumen tidal en este punto del tiempo. Seis horas después del reto, el RDC1676-03 solo fue suficiente para provocar un aumento significativo en el volumen tidal y la adición de budesonida al régimen de tratamiento solo o en combinación, no tuvo ningún efecto adicional en el volumen tidal . Cualquier efecto observado en estos primeros puntos de tiempo, sin embargo, se perdieron a las 24 horas.

En conjunto, estos datos demuestran que RDC1676-03 solo o en combinación con budesonida proporcionó un alivio significativo a la inflamación de las vías respiratorias como se evidenció por el aumento del volumen tidal y la disminución en los valores de Pehn a las 6 horas después del reto.

Análisis de Citocina: Para analizar el mecanismo de los efectos observados en los parámetros fisiológicos anteriormente discutidos, un número de pro, así como las citoquinas antiinflamatorias se midieron en muestras de sangre tomadas a las 6 y 24 horas después del reto, inmediatamente a continuación de las mediciones fisiológicas.

Las Figuras 113A y 113B demuestran claramente que Rev 60 (o RDC1676-03) solo bajó el nivel en sangre de eotaxina de manera significativa tanto a las 6 y 24 horas después del reto. La budesonida 750ug/kg también redujo los niveles de eotaxina en sangre en estos dos puntos de tiempo, mientras que la budesonida 250 pg/kg solo tuvo un efecto notable en un punto de tiempo posterior. Sin embargo, la solución de prueba de Rev 60 solo mostró efectos que son significativamente más potentes (en la reducción de los niveles de eotaxina sanguínea) que ambas concentraciones de budesonida, en ambos puntos de tiempo. La Eotaxina es un quimiocina C-C pequeña conocida para acumular en y atraer los eosinófilos a los pulmones de los asmáticos y otros tejidos en las reacciones alérgicas (por ejemplo, el intestino en la enfermedad de Crohn) . La Eotaxina se une a una proteína G acoplada al receptor CCR3. El CCR3 se expresa por un número de tipos de células tales como los linfocitos Th2 , basófilos y mastocitos, pero la expresión de este receptor por los linfocitos Th2 es de particular interés ya que estas células regulan el reclutamiento de los eosinófilos. Varios estudios han demostrado una producción aumentada de eotaxina y CCR3 en el pulmón del asmático, así como el establecimiento de un vínculo entre estas moléculas y la hiperreactividad de las vías respiratorias (revisado en Eotaxin and the attraction of eosinophils to the asthmatic lung, Dolores M Conroy y Timothy J Williams Respiratory Research 2001, 2:150-156). Es de particular interés señalar que estos estudios concuerdan completamente con los resultados en las Figuras 109 y 110 en el conteo de eosinófilos.

En conjunto, estos resultados indican fuertemente que el tratamiento con RDC1676-03 solo o en combinación con budesonida puede reducir de manera significativa el conteo de eosinófilos totales y el % en sangre 24 horas después del reto con ovoalbúmina . Esto se correlaciona con un descenso significativo en los niveles de eotaxina en la sangre observado ya a las 6 horas después del reto.

Los niveles en sangre de las dos principales citoquinas claves anti-inflamatorias , la IL-10 y el Interferón gamma, son también significativamente mejorados a las 6 horas después del reto como resultado del tratamiento con Rev 60 solo o en combinación con la budesonida. Las Figuras 113C y 113D muestran tales efectos en el Interferón gamma e IL-10, respectivamente. Es evidente a partir de estas figuras que el Rev 60 solo o el Rev 60 en combinación con la budesonida 250 pg/kg aumentó significativamente el nivel en sangre de IL-10 en los animales retados hasta 6 horas después del reto. Del mismo modo, el Rev 60 solo o en combinación con budesonida 250 o 750 g/kg aumentó significativamente los niveles sanguíneos de IFN gamma a las 6 horas después del reto. El aumento de estas citoquinas antiinflamatorias se puede explicar bien, al menos en parte, por los efectos beneficiosos observados en los parámetros respiratorios fisiológicos observados 6 horas después del reto. El efecto en estas citoquinas ya no se observó a las 24 horas después del reto (datos no presentados) .

Rantes o CCL5 es una citoquina expresada por las células T y es quimiotáctico para las células T, eosinófilos y basófilos y tiene un papel activo en el reclutamiento de leucocitos en los sitios de inflamación. Rantes también activa los eosinófilos para liberar, por ejemplo, la proteína catiónica eosinofílica . Esto cambia la densidad de los eosinófilos y los hace hipodensos, lo que se cree que representa un estado de activación celular generalizado. Es también un potente activador del metabolismo oxidativo específico para los eosinófilos.

Como se muestra en la Figura 114, el nivel sistémico de Rantes se redujo de manera significativa a las 6 horas, pero no a las 24 horas después del reto en los animales tratados con Rev 60 solo o en combinación con budesonida 250 o 750 pg/kg. Una vez más, existe un efecto sinérgico claro de budesonida 750 pg/kg y Rev 60, que se nota en este conjunto de datos. Una tendencia descendente similar se observó para un número de otras citoquinas pro- inflamatorias , tales como KC o IL8, MCP3, ILlb, GCSF, TGFb, así como NGF, se observó tanto a las 6 ó 24 horas después del reto, en los animales tratados con Rev60 solos o en combinación con budesonida. EJEMPLO 18 (Los fluidos terapéuticos de la invención tienen utilidad sustancial para la modulación de las uniones herméticas intercelulares) De acuerdo con aspectos particulares, los fluidos terapéuticos procesados con el difusor de la invención tienen una utilidad sustancial para la modulación de las uniones herméticas intercelulares, que incluyen aquellas relacionadas con la administración pulmonar y sistémica y la biodisponibilidad de los polipéptidos , incluyendo el polipéptido ejemplo de calcitonina de salmón (sCT) .

Ejemplo general. La calcitonina de salmón (sCT) es un péptido de 32 aminoácidos con un peso molecular de 3,432 Dalton. La administración pulmonar de la calcitonina se ha estudiado ampliamente en los sistemas modelos (por ejemplo, los sistemas de modelo de roedores, los sistemas de modelo de rata, etc.) para investigar los métodos para mejorar la administración de fármacos pulmonares (por ejemplo, la administración intratraqueal de fármacos) . De acuerdo con aspectos ejemplares particulares, el fluido terapéutico procesado con el difusor de la invención tiene utilidad sustancial para modular (por ejemplo, el mejoramiento) las uniones herméticas intercelulares, por ejemplo aquellas asociadas con la administración pulmonar y sistémica y la biodisponibilidad de la sCT en un sistema de modelo de rata.

Métodos : Administración Jntratragrueal del fármaco. De acuerdo con las modalidades particulares, la sCT se formuló en el fluido terapéutico de la invención y se administró a las ratas usando un dispositivo de administración intratraqueal de fármacos. En ciertos aspectos, se usó un dispositivo microaspersor Penn Century diseñado para la administración intratraqueal del fármaco a roedores, permitiendo la administración satisfactoria al pulmón, pero, como se aprecia en la técnica, con relativa baja deposición alveolar que resulta en una escasa biodisponibilidad sistémica de péptidos. De acuerdo con aspectos particulares, este modelo reconocido por la técnica se usó para confirmar que el fluido terapéutico procesado con el difusor de la invención tiene utilidad terapéutica sustancial para modular (por ejemplo, el mejoramiento) las uniones herméticas intercelulares, incluyendo aquellas relacionadas con la administración pulmonar y sistémica y la biodisponibilidad de los polipéptidos .

Grupos de animales y la dosificación . En ciertos aspectos, las ratas son asignadas a uno de los 3 grupos (n = 6 por grupo) : a) una solución salina estéril; b) solución base sin enriquecimiento de 02 ("solución base"), o c) fluido terapéutico procesado con el difusor de la invención ("solución base de la invención enriquecida). La solución base de la invención enriquecida se forma, por ejemplo, por la infusión de oxígeno en solución salina 0.9%. Preferiblemente, la solución base comprende aproximadamente solución salina 0.9% para minimizar las posibilidades de interrupción hipo-osmótica de las células epiteliales. En ciertas modalidades, la sCT se reconstituye por separado en la solución base y la solución base de la invención enriquecida, y las respectivas soluciones se entregan a los respectivos grupos de animales mediante instilación intratraqueal dentro de 60 minutos (10pg sCT mg en 200 µ? por animal) .

Ensayos. En aspectos particulares, las muestras de sangre (por ejemplo, 200 µ?) se tomaron y se colocaron en tubos recubiertos con EDTA antes de la administración y en 5, 10, 20, 30, 60, 120 y 240 minutos a continuación de la dosificación. El plasma se recolecta y almacena a = -70°C hasta que se analice por sCT usando un ELISA.

Para la generación de datos del aggreglo de genes Agilant, el tejido pulmonar se aisló y sumergió en el reactivo TRI (TR118, Molecular Research Center, Inc.). En resumen, aproximadamente 1 mi de reactivo TRI se adicionó a 50-100 mg de tejido en cada tubo. Las muestras se homogenizaron en el reactivo TRI, usando el homogenizador Teflon™ de vidrio o Polytron™. Las muestras se almacenaron a -80°C.

Resultados : Mejora de la uniones herméticas . La Figura 84 muestra que el RDC1676-01 (solución salina estéril procesada a través del presente dispositivo registrado con oxígeno adicional añadido; el fluido generado por electrocinética enriquecido con gas (Rev) de la presente descripción) disminuyó la entrega sistémica y la biodisponibilidad de la sCT. De acuerdo con los aspectos particulares, la entrega sistémica disminuida resulta de la adsorción disminuida de la sCT, muy probablemente como resultado de la mejora de las uniones herméticas pulmonares. El RDC1676-00 representa una solución salina estéril procesada de acuerdo con los métodos descritos actualmente pero sin oxigenación.

Además, de acuerdo con aspectos particulares, las proteínas relacionadas con la unión hermética se sobreregularon en el tejido pulmonar. Las Figuras 85-89 muestran la sobreregulación de las moléculas de adhesión de unión JAM 2 y 3, GJA1, 3, 4 y 5 (adherinas de unión), OCLN (ocludina) , claudinas (por ejemplo, CLDN 3, 5, 7, 8, 9, 10), TJP1 (proteína 1 de unión hermética), respectivamente.

EJEMPLO 19 {Los fluidos terapéuticos de la invención tienen utilidad sustancial para la modulación de los niveles de óxido nítrico) De acuerdo con los aspectos particulares, los fluidos terapéuticos procesados con el difusor de la invención tienen una utilidad sustancial para la modulación de los niveles de óxido nítrico, y/o enzimas relacionadas. Las Figuras 90-94 muestran los datos obtenidos a partir de los queratinocitos de prepucio humano expuestos a RDC1676-01 (solución salina estéril procesada a través del presente dispositivo registrado con oxígeno adicional añadido; el fluido generado por electrocinética enriquecido con gas (Rev) de la presente descripción) que muestra la sobreregulación de N0S1 y 3, y Nostrin, N0S3. Por el contrario, los datos obtenidos a partir del tejido pulmonar de rata (tejido del ejemplo anterior titulado "Expresión de citoquinas") muestran la subregulación de N0S2 y 3, Nostrin y N0S1AP con Rev (Figuras 93, 94) .

EJEMPLO 20 (Los efectos electrocinéticos localizados (voltaje / corriente) se demostraron usando un dispositivo de mezcla especialmente diseñado que comprende los elementos aislados del rotor y el estator) En este ejemplo, los efectos electrocinéticos (voltaje/corriente) localizados en un elementóse demostraron usando un dispositivo de mezcla especialmente diseñado que comprende los elementos aislados del rotor y el estator.

Información general. Como se discutió en detalle anteriormente en este documento bajo el título "Doble efecto de capa" (véase también las Figuras 26 y 28) el dispositivo de mezcla 100 se puede configurar para crear el material de salida 102 por la interacción dinámica compleja y no lineal del fluido y del primer material 110 y el segundo material 120 con la turbulencia dinámica compleja, que proporciona la mezcla compleja que favorece, además, los efectos electrocinéticos . De acuerdo con aspectos particulares, el resultado de estos efectos electrocinéticos se puede presentar dentro del material de salida 102 como las redistribuciones de carga y las reacciones redox, que incluyen la forma de los electrones solubilizados que se estabilizan dentro del material de salida.

Además de los efectos generales de la doble capa relacionados con la superficie en la cámara de mezcla, los solicitantesargumentaron, además, que se pueden impartir efectos electrocinéticos localizados en virtud de la microcavitación inducida por los elementos y la aceleración y desaceleración del fluido en las inmediaciones de los elementos. Los estudios de este ejemplo se realizaron de ese modo para investigar adicionalmente y confirmar dichos aspectos electrocinéticos.

Materiales : Se construyó un dispositivo de prueba similar a los dispositivos de mezcla de la invención descritos en este documento, que comprende un rotor de acero inoxidable 12 que tiene dos elementos 18 (dispuestos a 180 grados) , y un estator 14 con un elemento único 16 colocado para ser oponible rotacionalmente a los elementos del rotor 18 y los elementos del estator 16. De manera significativa, los elementos del rotor y del' estator, en cada caso, están aislados de los respectivos cuerpos del rotor y el estator (Figura 95) . El dispositivo se elaboró para proporcionar una sepaarción rotor : estator consistente 20 de 0.020 pulgadas para cumplir con los dispositivos descritos en otro lugar en este documento. Existe un contacto de rotación (no mostrado) en el extremo del eje del rotor (no mostrado) que proporciona una trayectoria eléctrica para la superficie del rotor y para los elementos aislados del rotor. Del mismo modo, el estator tiene un elemento aislado similar 16 (Figura 95) , donde la superficie interior del estator y el elemento aislado de acero inoxidable están conectados a los contactos respectivos en el exterior del estator.

Un circuito (M) del amplificador operacional (OpAmp) 22 se conecta entre los contactos. El circuito del amplificador operacional (OpAmp) se construyó para proporcionar la recopilación de las mediciones de voltaje muy bajo, tomando ventaja de la alta impedancia de entrada de tales amplificadores. Las salidas del OpAmp se alimentan a las entradas de un osciloscopio (por ejemplo, un ordenador portátil con pilas ejecuta una aplicación de osciloscopio con un Pico Scope 3000™) .

Para eliminar la introducción de cualquier ruido ambiental (por ejemplo, la radiación RF de señales de red inalámbrica y de la línea de alimentación de 60 Hz) durante las pruebas del dispositivo, un compartimento RF- blindado, de malla de cobre fina, (approx. tres por cuatro por cuatro pies) se construyó para proporcionar una caja de Faraday. Esta configuración proporcionó una relación señal a ruido excelente durante las pruebas experimentales, ya que las señales de interferencia de ruido de 60 Hz CA (por ejemplo, de aproximadamente dos voltios) y RF de alta frecuencia se redujo por debajo de las señales de interés. El uso de un ordenador portátil con pilas que ejecuta una aplicación de osciloscopio con un Pico Scope 3000, permitió la detección de las señales de 30 mV (como en la Figura 96) creadas por las características del dispositivo de prueba. Además, un motor DC de velocidad variable se colocó fuera de la caja de Faraday y se acopló al dispositivo de prueba a través de un eje rotativo no metálico para aislar eficazmente el ruido del motor fuera del dispositivo de prueba.

Métodos : El circuito OpAmp se usó para medir el potencial de voltaje entre los contactos que conectan la superficie interior del estator 12 y el elemento aislado del estator 16.

Con el arreglo del circuito en particular, sólo se midió un potencial. La velocidad de rotación del dispositivo podría variar entre aproximadamente 700 a aproximadamente 2800 rpm (con los datos medidos de la Figura 96 con el dispositivo funcionando a aproximadamente 1800 rpm) .

Para evitar cualquier generación de voltaje externo debido a una bomba o una bomba peristáltica, el flujo de fluido a través del dispositivo se realizó con nitrógeno inerte o aire o argón que actúan sobre el fluido en los tanques conectados al dispositivo. No hubo contribución de voltaje perceptible del mecanismo de flujo, y típicamente el aire se usó como la fuerza de bombeo para proporcionar el flujo de fluido a través del dispositivo.

La tasa de flujo del fluido a través del dispositivo fue aproximadamente 11/min.

Un primer conjunto de experimentos no rotacionales se llevó a cabo dirigiendo el flujo de fluido a través de la cámara del dispositivo pero sin rotación del rotor, con el fin de evaluar la presencia de cualquier voltaje entre el cuerpo del estator 12 y el elemento aislado 16. Se realizaron experimentos separados para ambas direcciones del flujo.

Un conjunto adicional de experimentos rotacionales se realizaron después con la misma velocidad de flujo del fluido, y con el rotor del dispositivo rotando a varias velocidades de aproximadamente 300 a aproximadamente 1800 rpm. Para cualquier experimento dado, la tasa de flujo y la velocidad rotacional se mantuvieron constantes.

Resultados : Con respecto a los experimentos no rotacionales, con el fluido fluyendo a través del dispositivo en cualquier dirección, sin ninguna rotación del rotor, sólo hubo un voltaje apenas perceptible (por ejemplo, de 1 a 2 mV) ) entre el cuerpo del estator y el elemento aislado.

Con respecto a los experimentos rotacionales, y con referencia a la Figura 96, se puede observar que los pulsos de voltaje (pulsos de potencial), que se correlacionan temporalmente (en este caso en aproximadamente 1800 rpm) con la alineación rotacional de los elementos opuestos del estator rotor, se midieron con el OpAmp en el dispositivo de prueba operante. Además, tales pulsos de voltaje periódico, que se correlacionan con las alineaciones del elemento, se podrían observar en un rango de aproximadamente de 250 ó 300 rpm a aproximadamente 1800. Además, con o sin flujo de fluido, tales pulsos de voltaje se observaron en los experimentos rotacionales, siempre y cuando la cavidad/cámara de fluido del dispositivo se llenó con fluido. De acuerdo con aspectos particulares, y sin estar atados por el mecanismo, la compresión rápida y violenta (por ejemplo, la cavitación) , la aceleración y la desaceleración del flujo de fluido en las inmediaciones de los elementos alineados rotacionalmente repetitivos crearon los respectivos pulsos de voltaje locales que se corresponden exactamente con el período rotacional, que se proporciona, al menos en parte, para el fluido generado por electrocinética de acuerdo con la presente invención. Los experimentos adicionales revelaron que la amplitud (forma de pico y altura) de los pulsos de voltaje aumentó con el aumento de la velocidad de rotación, observándose inicialmente a aproximadamente 250 a 300 rpm en este dispositivo de prueba particular, y aumentando hasta al menos aproximadamente 2800 rpm. La magnitud de la aceleración y desaceleración violenta, etc., de flujo de fluido en la inmediaciones de los elementos rotacionalmente alineados se podría esperar que aumente en general con el aumento de la velocidad rotacional; al menos hasta que un máximo sea alcanzado reflejando los límites físicos impuestos por la geometría, la configuración y/o la tasa de flujo del dispositivo. De acuerdo con aspectos adicionales, debido a que los picos de voltaje localizados están presentes, se genera la corriente de flujo localizada (por ejemplo, los pulsos de corriente) en las inmediaciones de los elementos, proporcionando, al menos en parte, el fluido generado por electrocinética de acuerdo con la presente invención (por ejemplo, sin estar atados por el mecanismo, que proporciona las reacciones electroquímicas como se discutió en otra parte de este documento) .

De acuerdo con los aspectos adicionales, y sin estar atados por el mecanismo, tales efectos localizados (por ejemplo, los pulsos de voltaje y corriente y/o pulsos de corriente) contribuyen a la generación de los fluidos generados por electrocinética en combinación con la doble capa relacionada con la superficie más general y los efectos de la corriente de flujo que se discuten en otra parte de este documento bajo el título de " Efecto de doble de capa" (véase también las Figuras 26 y 28) .

EJEMPLO 21 (Con respecto a los fluidos de control no generados por electrocinética, los fluidos generados por electrocinética de la invención se mostraron para afectar diferencialmente los anchos de línea en el análisis de NMR 13C del soluto disuelto a,a-Trehalosa) Información general. Los datos de los solicitantes descritos en cualquier otra parte en este documento soportan la utilidad y el mecanismo donde los fluidos generados por electrocinética de la invención median la regulación o modulación de la transduccion de la señal intracelular por la modulación de al menos una de las membranas celulares, el potencial/conductancia de membrana, proteínas de membrana (por ejemplo, receptores de membrana, tales como receptores acoplados a proteínas G) , los sistemas de señalización celular dependientes de calcio, y las uniones intercelulares (por ejemplo, uniones herméticas, uniones comunicantes, unión adherente y desmosomas) . Específicamente al usar una variedad de sistemas y ensayos de pruebas biológicas reconocidos por la técnica, los datos de los solicitantes muestran, con respecto a los fluidos de control, efectos diferenciales del fluido de la invención en, por ejemplo: la proliferación de células T reguladoras; los niveles de citoquinas y proteínas (por ejemplo, IL-10 , GITR, Granzima A, XCL1, pStat5 y Fox 3 , triptasa, las proteínas relacionadas con la unión hermética, el receptor TSLP, MMP9, etc) ; la unión del ligando bradiquinina con el receptor B2 bradiquinina; la expresión del receptor TSLP, la conductancia de la célula entera; etc. Además, los efectos de la toxina de la difteria (DT390) que se muestran en este documento indican que el bloqueó beta (receptor beta-2 adrenérgico) , y/o el bloqueo GPCR y/o el bloqueo de los canales de Ca afectan la actividad de los fluidos generados por electrocinética, por ejemplo, la función Treg y PBMC.

Tomados en conjunto, estos efectos indican que los fluidos generados por electrocinética de la invención no sólo se distinguen fundamentalmente de los fluidos de la técnica anterior, sino que también proporcionan nuevas composiciones y utilidad sustancial como las que actualmente se describen y se reivindican en este documento.

En este ejemplo. tos Solicitantes en este ejemplo realizaron estudios de resonancia magnética nuclear (NMR) para caracterizar, además, la naturaleza fundamental de los fluidos generados por electrocinética de la invención. En especial, los solicitantes analizaron los espectros de NMR 13C de ,a- trehalosa disuelta en el fluido generado por electrocinética, en comparación con la disolución en el fluido no generado por electrocinética. La trehalosa (que se muestra a continuación con átomos de carbono numerados para la referencia) es un soluto cosmotrópico y se conoce, por ejemplo, para la protección contra la desnaturalización de las proteínas, la desecación de la membrana, la viabilidad del organismo al congelarse, etc. Los solicitantes teniendo en cuenta los datos resumidos anteriormente, razonaron que la a,a - trehalosa podría proporcionar una herramienta eficaz para investigar más las propiedades/estructura de los fluidos generados por electrocinética de la invención. Los solicitantes razonaron que los 'cambios químicos' relacionados con al RMN y los efectos sobre los 'anchos de línea' se podrían usar para evaluar las propiedades de los fluidos- de la invención. Para estos estudios, un fluido generado por electrocinética, no superoxigenado, de la invención (referido en este documento como "Solas") se empleó para minimizar la posibilidad de que las impurezas paramagnéticas , tales como el oxígeno disuelto, pudieran actuar para contrarrestar, o de otra manera, enmascarar, los efectos que se analizan.

, -Trehalosa Materiales y métodos: Preparación de soluciones . El fosfato (sal de sodio) y D-(+)- dihidrato de trehalosa (T9531-10G, contenido de metal reducido) y 99.9% de D20 conteniendo 1% de DSS se adquirieron de Sigma. La "solución salina normal" es 0.9% de cloruro de sodio, pH 5.6 (4.5 a 7.0), de Hospira. Las soluciones 0.25 M de a,a- trehalosa se prepararon por la disolución de 0.949 g de trehalosa en 965 µ? de solución salina normal y 35 mide tampón de fosfato salino (100 mM tampón fosfato en 0.9% NaCl preparado de tal manera que cuando 35 µ? de este tampón se añaden a 1.0 mi de solución de trehalosa el pH llega ser 6.93) .

Recopilación de los espectros de resonancia magnética nuclear. Los espectros se recopilaron en las instalaciones de NMR de la Universidad de Washington usando un instrumento de la serie Bruker Avance 500 MHz o 300 MHz equipado con un BBO Bruker: sonda X {1H} y ejecuta XWINNMR 3.5. Los espectros de NMR 13C se recopilaron a 125.7 MHz o 75.46 MHz usando una amplitud de barrido de 14000 Hz o 7900 Hz usando los puntos de datos 64K o 128K y escáner 128 o 256. Los FID resultantes se llenaron de cero dos veces y se procesaron con un factor de ampliación de línea de 1.0 Hz . La temperatura se controló usando la unidad de temperatura variable de Bruker Biospin. La fijación externa con deuterio se empleó colocando 99.9% D20 + 1% DSS + una traza de acetona en un tubo de inserto coaxial NMR, comprado a Wilmad. Los datos de NMR se procesaron usando el software iNMR v. 2.6.4 de Mestrelab Research.

Resultados : Espectros de la muestra. Las Figuras 97 A-C muestran las expansiones de seis espectros N R 13C superpuestos entre ellos en la parte superior de manera que las señales DSS se alinean a -2.04 ppm. Las señales DSS se muestran en el extremo derecho de la figura, y la señal de metil acetona se muestra cerca de 30.9 ppm. Las señales restantes corresponden a los 6 carbonos de la trehalosa como se muestra en la anterior estructura a,a- trehalosa. Como se puede observar, las señales de carbono en las soluciones Solas muestran pequeños cambios químicos (por lo general fuera de campo) en comparación con las soluciones de control.

Mediciones de ancho de línea. La TABLA 10 a continuación muestra los anchos de líneas de NMR 13C medidos para los seis carbonos de la trehalosa y el metil carbono de la acetona a tres temperaturas diferentes para la solución salina Solas (un fluido generado por electrocinética de la invención) . Las muestras de solución salina normal correspondientes representan las soluciones de control no electrocinéticas a cada temperatura. En las soluciones Solas, los anchos de línea son significativamente diferentes de los anchos de línea en la solución de control para cada átomo de carbono. Los anchos de líneas menores en las soluciones Solas a temperaturas inferiores, probablemente resultan de una tasa de caída más rápida de la molécula de trehalosa como un todo (incluyendo cualquier molécula de agua solvatada) en comparación con las soluciones de control.

TABLA 10. Anchos de líneas NMR 13C para trehalosa en Solas y solución salinaa,b normal Fluido de Prueba (Temp . grados K) C-l C-2 C-3 C-4 C-5 . C-6 Acetona Solas (277) 8~4 8.22 {T 8.15 ß? 11.1 5.1 Normal (269.9) 15.4 16.1 15.8 14.9 15.4 21.7 5.1 Solas (293) 9.52 8.7 9.28 9 8.9 11.25 5.63 Normal (292.9) 10.33 10.23 10.23 9.93 10.23 13.13 5.63 Solas (310) 2.28 2.03 2.18 2.19 2 2.55 0.67 Normal (309.9) 1.17 0.99 1.1 1.02 0.97 1.42 0.67 a 1.0 Hz se restó de todos los valores de ancho de línea debido a la ampliación de la línea de 1.0 Hz que se usó durante el procesamiento. Además, los valores de ancho de línea se normalizaron con respecto a la señal de acetona en el tubo de referencia externo para compensar las inhomogeneidades del campo magnético. Esto se hizo al restar de los anchos de línea de la solución salina normal la cantidad por la cual se amplió el pico de acetona en el espectro de solución salina Solas correspondiente. bError en las mediciones de ancho de línea estimado dentro de ±0.30 Hz Los anchos de línea NMR 13C para a,a- trehalosa en Solas y solución salina normal, normalizados en cada caso con respecto a la línea de acetona, se muestran gráficamente en la figura 97A. En conclusión, los datos de NMR para los anchos de línea NMR 13C a,a-trehalosa Solas y solución salina normal indican que la solución de la invención tiene una propiedad que altera la caída del soluto.

Tomado en conjunto con las actividades biológicas resumidas anteriormente y en otras partes de este documento, estos efectos del ancho de línea de NMR 13C indican que los fluidos generados por electrocinética de la invención no sólo se distinguen fundamentalmente de los fluidos de la técnica anterior en términos de las interacciones de soluto, sino que también proporcionan nuevas composiciones y una utilidad sustancial como las que actualmente se describen y reivindican en este documento.

EJEMPLO 22 (Con respecto a los fluidos de control no generados por electrocinética, los fluidos de la invención generados por electrocinética produjeron perfiles diferenciales de volta etría de onda cuadrada y mostraron propiedades electroquímicas únicas en la polarografía de redisolución Información general. Los datos de los solicitantes descritos en cualquier parte de este documento soportan la utilidad y mecanismo donde los fluidos generados por electrocinética de la invención median la regulación o la modulación1 de la transducción intracelular de la señal por la modulación de al menos una de las membranas celulares, el potencia/conductancia de la membrana, las proteínas de membrana (por ejemplo, receptores de membrana, tales como receptores acoplados a la proteína G) , sistemas de señalización celular dependientes de calcio, y las uniones intercelulares (por ejemplo, uniones herméticas, uniones comunicantes, unión adherente y desmosomas) . Específicamente, al usar una variedad de sistemas de pruebas y ensayos biológicos reconocidos por la técnica, los datos de los solicitantes muestran, en relación con los fluidos de control, los efectos diferenciales del fluido de la invención en, por ejemplo: la proliferación de células T reguladoras, los niveles de citoquinas y proteínas (por ejemplo, la IL-10, GITR, Granzima A, XCL1 , pStat5 y Foxp3 , triptasa, proteínas relacionadas con la unión hermética, el receptor TSLP, MP9, etc) ; la unión de ligando de. bradiquinina con el receptor B2 de bradiquinina; la expresión del receptor TSLP, la conductancia de la célula entera, etc. Además, los efectos de la toxina de la difteria (DT390) que se muestran en este documento indican que el bloqueo beta (receptor beta-2 adrenérgico) , y/o el bloqueo GPCR y/o el bloqueo de canales de Ca afecta la actividad de los fluidos generados por electrocinética en, por ejemplo, la función PBMC y Treg .

Tomados en conjunto, estos efectos indican que los fluidos generados por electrocinética de la invención no sólo se distinguen fundamentalmente de los fluidos de la técnica anterior, sino que también proporcionan nuevas composiciones y utilidad tal como las que actualmente se describen y reivindican en este documento.

En este ejemplo. Los solicitantes, en este ejemplo, realizaron estudios de voltametría para caracterizar, además, la naturaleza fundamental de los fluidos generados por electrocinética de la invención. La voltametría se usa con frecuencia para determinar el potencial redox o medir las velocidades cinéticas y constantes de los fluidos. La característica común de todos los métodos voltamétricos es que involucran la aplicación de un potencial a un electrodo y el flujo de corriente resultante se controla a través de una célula electroquímica. El potencial aplicado produce un cambio en la concentración de una especie electroactiva en la superficie del electrodo reduciendo u oxidando electroquímicamente las especies.

Específicamente, los solicitantes utilizaron métodos voltamétricos (es decir, voltametría de onda cuadrada y polarografía de redisolución) para caracterizar adicionalmente las diferencias fundamentales entre el fluido de control de solución salina y ' los fluidos de prueba generados por electrocinética de la invención (por ejemplo, Solas y Revera) . Los solicitantes, teniendo en cuenta los datos de los efectos biológicos y de la membrana resumidos anteriormente, razonaron que la voltametría de onda cuadrada y la polarografía de redisolución podrían proporcionar un medio eficaz para caracterizar, adicionalmente, las propiedades únicas de los fluidos generados por electrocinética de la invención.

Los solicitantes además razonaron que las diferencias en la corriente a voltajes específicos, la producción de diferentes concentraciones de un compuesto redox electroactivo, la creación de nuevos compuestos redox, y la posesión de propiedades electroquímicas únicas, se podrían usar para evaluar y caracterizar las propiedades de los fluidos de la invención. Para estos estudios, se usó un fluido superoxigenado generado por electrocinética (Revera) , y un fluido generado por electrocinética, no superoxigenado de la invención (Solas) .

Materiales y métodos: Materiales y preparación de la solución . Los experimentos se realizaron en un polarografo EG & G SMDE 303A (Princeton Applied Research) . El electrolito, NaOH, que se usó en el experimento de voltametría de onda cuadrada, se compró a Sigma. Una muestra de 10 mi de la solución de fluido de la invención se preparó por la adición de 100 µ? de NaOH a 9.9 mi de solución salina Revera para hacer una solución 0.18 molar. Con respecto al experimento de polarografía de redisolución, no se usaron electrolitos adicionales.

Voltametría de onda cuadrada. Como se indicó anteriormente, la voltametría se usó para determinar el potencial redox o medir las velocidades cinéticas y constantes en los fluidos. En el experimento de voltametría de onda cuadrada, un potencial de 0.0 a aproximadamente -1.75 V se aplicó a un electrodo y se controló la corriente de flujo resultante a través de la celda electroquímica.

Polarografía de redisolución. El método de polarografía de redisolución es similar al método de voltametría de onda cuadrada. Sin embargo, no se usó electrolito como se indicó anteriormente y también involucra una pre-etapa. En la pre-etapa, el electrodo estático de gotas de mercurio se mantuvo durante 30 segundos a -1.1 V para amalgamar cualquier compuesto cuya forma reducida fuera soluble en el mercurio. Después, los potenciales entre -1.1 V y 0.0 V se escanearon y se controló la corriente de flujo resultante a través de la celda electroquímica. Un barrido lineal en los potenciales negativos en esta amalgama proporcionó una medida sensible de estos compuestos.

Resultados : Voltametría de onda cuadrada. Como es evidente de la Figura 98, los perfiles de corriente a -0.14V, -.47V,-1.02V y -1.36V difieren entre los diversos agentes probados. De acuerdo con aspectos particulares, las diferencias en la corriente generada a diversos voltajes específicos indican al menos una de una concentración diferente de un compuesto redox electroactivo y/o un compuesto redox electroactivo nuevo o único, y/o un cambio en la doble capa eléctrica con limitación de la difusión que rodea la gota de mercurio.

Polarografia de redisolución. La Figura 99 muestra que los fluidos generados por electrocinética de la invención, Rever y Solas, muestran espectros únicos, con picos pronunciados a -0.9 voltios que no están presentes en los fluidos blanco no generados por electrocinética y los de control de solución salina. Además, los espectros de los fluidos blancos no generados por electrocinética y los de control de solución salina muestran picos característicos a -0.19 y -0.3 voltios que están ausentes en el espectro de los fluidos generados por electrocinética Solas y Revera.

De acuerdo con los aspectos particulares, por lo tanto, estos resultados muestran propiedades electroquímicas únicas de los fluidos Solas y Revera generados por electrocinética de la invención en comparación con el fluido de control de solución salina no generado por electrocinética. De acuerdo con aspectos adicionales, los resultados indican la presencia o la generación de al menos una concentración diferente de un compuesto redox electroactivo y un compuesto redox electroactivo nuevo y/o único en fluidos generados por electrocinética frente a los no generados por electrocinética .

Además de los diversos datos biológicos presentados en otras partes de este documento, estos datos de voltametría diferencial, en particular cuando se consideran junto con los efectos diferenciales en la conductancia de la célula entera, los análisis de ancho de línea de NMR 13C, y los efectos característicos localizados del dispositivo de mezcla (por ejemplo, los pulsos de voltaje y corriente y/o pulsos de corrientes) indican que los fluidos generados por electrocinética de la invención no sólo se distinguen fundamentalmente de los fluidos de la técnica anterior, sino que también proporcionan nuevas composiciones y utilidad sustancial como las que actualmente se describen y reivindican en este documento.

EJEMPLO 23 (El análisis de fijación de parche conducido en las células epiteliales bronquiales (BEC) perfundidas con el fluido generado por electrocinética de la invención (RNS-60) reveló que la exposición al RNS-60 resultó en una disminución en la conductancia de la célula entera, y la estimulación con un "cóctel" de estimulación cAMP que aumentó dramáticamente la conductancia de la célula entera, y también aumentó la parte sensible a los fármacos de la conductancia de la célula entera, que fue diez veces mayor que la observada en condiciones básales) En este ejemplo, los estudios de fijación de parche se realizaron para confirmar, además, la utilidad de un fluido generado por electrocinética de la invención para modular la transducción intracelular de la señal por la modulación de al menos uno de estructura de la membrana, la conductividad potencial de membrana o conductividad de membrana, receptores o proteínas de membrana, canales iónicos, y sistemas del mensajero celular dependientes de calcio.

Información general. Como se mostró anteriormente en el Ejemplo 14 (por ejemplo, la Figura 75, que muestra la estabilización de la unión de bradiquinina al receptor B2 con el uso de biosensor de interferometría Bio-Layer, Detección Ampliada Rápida de Octeto (RED) (forteBio™) ) , la unión de la bradiquinina al receptor B2 fue dependiente de la concentración, y la afinidad de unión aumentó en el fluido generado por electrocinética (por ejemplo, Rev, el fluido generado por electrocinética enriquecido con gas) de la presente descripción en comparación con la solución salina normal. Además, como se muestra en el Ejemplo 15 en el contexto de las células T-reguladoras estimuladas con el material particulado (PM) , los datos mostraron una disminución de la proliferación de las células T reguladoras en la presencia de PM y Rev con respecto a PM en el fluido de control (sin Rev sin Solis) (Figura 76) , lo que indica que el fluido Rev generado por electrocinética de la invención mejora la función de las células T reguladoras, por ejemplo, como se muestra por la proliferación relativamente disminuida en el ensayo. Además, la exposición a los fluidos de la invención resultó en una producción de la IL-10 mantenida o disminuida sólo ligeramente respecto a los controles de solución salina y medios (sin PM) . Del mismo modo, en el contexto del asma alérgica (AA) , los perfiles de las células mononucleares de sangre periférica (PBMC) estimulada con el material particulado (PM) , los datos mostraron que la exposición a los fluidos de la presente descripción ("PM + Rev") resultaron en niveles de triptasa significativamente inferiores similares a aquellos controles de solución salina y medios. Además, los efectos de la toxina diftérica (DT390) que se muestran en el Ejemplo 15 y Figuras 76-83, indican que el bloqueo beta, el bloqueo GPCR y el bloqueo de los canales de Ca afecta la actividad de los fluidos generados por electrocinética en la función Treg y PBMC. Además, los datos del Ejemplo 18 muestran que, de acuerdo con aspectos adicionales, al exponer los fluidos de la invención, las proteínas relacionadas con las uniones herméticas se sobreregularon en el tejido pulmonar. Las Figuras 85-89 muestran la sobreregulación de las moléculas de adhesión de unión JAM 2 y 3, GJA1, 3,4 y 5 (adherinas de unión), OCLN (ocludina) , claudinas (por ejemplo, CLDN 3, 5, 7, 8, 9, 10), TJPl (proteína 1 de unión hermética), respectivamente.

Los estudios fijación de parche se realizaron para investigar adicionalmente y confirmar dichas utilidades.

Materiales y métodos: La línea epitelial bronquial Calu-3 se usó en los estudios de fijación de parche. Las células epiteliales bronquiales Calu-3 (ATCC # HTB-55) se cultivaron en una mezcla 1:1 de medio F12 de Ham y medio DMEM que se suplemento con FBS al 10% en cubreobjetos de vidrio hasta el momento de los experimentos. En resumen, un dispositivo de fijación de voltaje de célula entera se usó para medir los efectos sobre las células Calu-3 expuestas a los fluidos generados por electrocinética de la invención (por ejemplo, RNS-60; solución salina normal tratada por electrocinética que comprende 60 ppm de oxígeno .disuelto, algunas veces referido como "fármaco" en este ejemplo) .

Se utilizaron técnicas de fijación de parche para evaluar los efectos del material de prueba (R S-60) sobre la polaridad de la membrana de células epiteliales y la actividad del canal iónico. Específicamente, la fijación de voltaje de la célula entera se realizó en la línea epitelial bronquial Calu-3 en una solución de baño que consiste en: 135 mM de NaCl, 5 mM de KCl, 1.2 mM de CaCl2, 0.8 mM de MgCl2, y 10 mM de HEPES (pH ajustado a 7.4 con N-metil D-Glucamina) . Las corrientes básales se midieron después de que RNS-60 fuera perfundido en las células.

Más concretamente, las pipetas de parches se sacaron de vidrio de borosilicato (Garner Glass Co, Claremont, California) con un tirador vertical Narishige PB-7 de dos etapas y después se pulieron al fuego a una resistencia entre 6 a 12 Mohms con un micro- fragua Narishige MF-9 (Narishige International USA, East Meadow, NY) . Las pipetas se llenaron con una solución intracelular que contenía (en mM) : 135 de KCl, 10 de NaCl, 5 de EGTA, 10 de Hepes, el pH se ajustó a 7.4 con NMDG (N-metil-D-Glucamina) .

El cultivo de las células Calu-3 se colocó en una cámara que contenía la siguiente solución extracelular (en mM) : 135 de NaCl, 5 de KCl, 1.2 de CaCl2, 0.5 de MgCl2 y 10 de HEPES (ácido libre), el pH se ajustó a 7.4 con NMDG.

Las células se visualizaron con el objetivo 40X DIC de un microscopio Olympus 1X71 (Olympus Inc., Tokio, Japón) . Después que se estableció un sellaje anclado a una célula, se aplicó una suave succión para entrar, y alcanzar la configuración de la célula completa. Inmediatamente después de entrar, se fijó el voltaje de la célula a -120, -60, -40 y 0 mV, y se estimuló con etapas de voltaje entre ± 100 mV (500 ms/etapa) . Después de recopilar las corrientes de la célula entera en la condición de control, la misma célula se perfundió a través del baño con el fluido de prueba que comprendía los mismos solutos extracelulares y pH, como el fluido control anterior, y las corrientes de célula entera en los diferentes potenciales básales se registraron con los mismos protocolos.

Los datos electrofisiológicos se adquirieron con un amplificador Axon Patch 200B, se filtraron a paso lento hasta 10 kHz y se digitalizaron con 1400A Digidata (Axon Instruments, Union City, CA) . El software pCLAMP 10.0 (Axon Instruments) se usó para adquirir y analizar los datos. Las relaciones Corriente (I) -a-voltaje (V) (conductancia de la célula entera) se obtuvieron mediante la representación del valor de corriente real en aproximadamente 400 mseg en la etapa, frente al potencial basal (V) . La pendiente de la relación I/V es la conductancia de la célula entera.

Fármacos y productos químicos. Siempre que se indicó, las células se estimularon con un cóctel de estimulación cAMP que contenía 8-Br-cAMP (500 mM) , IBMX (isobutil-1-metilxantina, 200 mM) y forskolina (10 mM) . El análogo de cAMP 8-Br-AMPc (Sigma Chem. Co.) se usó a partir de una solución madre 25 mM en solución dé H20. La Forskolina (Sigma) y el IBMX (Sigma) se usaron de una solución DMSO que contenía 10 mM de forskolina y 200 mM de solución madre ???? .

Resultados de la fijación de parche : La Figura 100 muestra las corrientes de la célula entera bajo condiciones básales (sin cAMP) , con un protocolo escalonado de potencial basal desde cero mV a +100 mV. Los trazos representativos son el promedio de n = 12 células. Los trazos de la izquierda son el control, seguido por los trazos de la célula entera, mientras se perfunde la solución de prueba (centro) . Los trazos de la derecha son el compuesto delta obtenido por la resta de los valores promedio de la prueba, de aquellos bajo las condiciones de control. La conductancia de la célula entera, obtenida a partir de las relaciones corriente-a-voltaje es muy lineal en ambas condiciones, y refleja un cambio modesto, aunque significativo, en la conductancia, debido a las condiciones de prueba. La contribución de la conductancia de la célula entera, es decir, el componente inhibido por el fármaco (fluido generado por electrocinética de la invención) también es lineal, y el potencial de inversión es cercano a cero mV. Existe una disminución en la conductancia de la célula entera en condiciones de hiperpolarización .

La Figura 101 muestra las corrientes de la célula entera bajo condiciones básales, con un protocolo escalonado de potencial basal -40 mV a +100 mV. Los trazos representativos son el promedio de n=12 células. Los trazos de la izquierda son el control, seguido por los trazos de la célula entera, mientras se perfunde la solución de prueba (centro) . Los trazos de la derecha son el compuesto delta obtenido por la resta de los valores promedio de la prueba, de aquellos bajo las condiciones de control. La conductancia de la célula entera, obtenida a partir de las relaciones corriente-a-voltaj e es muy lineal en ambas condiciones, y refleja un cambio modesto, aunque significativo, en la conductancia, debido a las condiciones de prueba. La contribución de la conductancia de la célula entera, es decir, el componente inhibido por el fármaco (fluido generado por electrocinética de la invención) también es lineal, y el potencial de inversión es cercano a cero mV. Los valores son comparativamente similares a aquellos obtenidos con el protocolo cero mV.

La Figura 102 muestra las corrientes de la célula entera bajo condiciones básales, con un protocolo escalonado de potencial basal -60 mV a +100 mV. Los trazos representativos son el promedio de n = 12 células. Los trazos de la izquierda son el control, seguido por los trazos de la célula entera, mientras se perfunde ' la solución de prueba (centro). Los trazos de la derecha son el compuesto delta obtenido por la sustracción de los valores promedio de la prueba, de aquellos bajo las condiciones de control. La conductancia de la célula entera, obtenida a partir de las relaciones corriente-a-voltaje es muy lineal en ambas condiciones, y refleja un cambio modesto, aunque significativo, en la conductancia, debido a las condiciones de prueba. La contribución de la conductancia de la célula entera, es decir, el componente inhibido por el fármaco también es lineal, y el potencial de inversión es cercano a cero mV. Los valores son comparativamente similares a aquellos obtenidos con el protocolo cero mV.

La Figura 103 muestra las corrientes de la célula entera bajo condiciones básales, con un protocolo escalonado de potencial basal -120 mV a ±100 mV. Los trazos representativos son el promedio de n = 12 células. Los trazos de la izquierda son el control, seguido por los trazos de las célula entera, mientras se perfunde la solución de prueba (centro) . Los trazos de la derecha son el compuesto delta obtenido por la resta de los valores promedio de la prueba, de aquellos bajo las condiciones de control . La conductancia de la célula entera, obtenidas a partir de las relaciones corriente-a-voltaje es muy lineal en ambas condiciones, y refleja un cambio modesto, aunque significativo, en la conductancia, debido a las condiciones de prueba. La contribución de la conductancia de la célula entera, es decir, el componente inhibido por el fármaco también es lineal, y el potencial de inversión es cercano a cero mV. Los valores son comparativamente similares a aquellos obtenidos con el protocolo cero mV.

La Figura 104 muestra las corrientes de la célula entera bajo condiciones estimuladas por cAMP, obtenidas con protocolos escalonados de varios potenciales básales a ±100 mV. Los trazos representativos son el promedio de n=5 células. Los trazos de la izquierda son el control, seguido por los trazos de la célula entera después de la estimulación con cAMP, seguido por la perfusión con la solución que contiene el fármaco. Los trazos de la derecha son el compuesto delta obtenido por la resta de los valores promedio de la prueba en el fármaco + cAMP, de aquellos bajo las condiciones de control (solo cAMP) . Los trazos en la parte superior son aquellos obtenidos del protocolo de voltaje a cero mV, y el de abajo, a -40 mV. La conductancia de la célula entera, obtenida a partir de las relaciones corriente-a-voltaje es muy .lineal bajo en todas las condiciones, y refleja un cambio en la conductancia, debido a las condiciones de prueba.

La Figura 105 muestra las corrientes de la célula entera bajo las condiciones estimuladas por cAMP, obtenidas con protocolos escalonados de varios potenciales básales a +100 mV. Los trazos representativos son el promedio de n = 5 células. Los trazos de la izquierda son el control, seguido por los trazos de la célula entera después de la estimulación con cAMP, seguido por la perfusión con la solución que contiene el fármaco. Los trazos de la derecha son el compuesto delta obtenido por la resta de los valores promedio de la prueba en el fármaco + cAMP, de aquellos bajo las condiciones de control (solo cAMP) . Los trazos en la parte superior son aquellos obtenidos del protocolo de voltaje a -60 mV, y el de abajo, a -120 mV. La conductancia de la célula entera, obtenida a partir de las relaciones corriente-a-voltaje es muy lineal bajo en todas las condiciones, y refleja un cambio en la conductancia, debido a las condiciones de prueba.

La Figura 106 muestra el efecto del potencial basal en las corrientes activadas con cAMP. El efecto del fármaco (fluidos de la invención generados por electrocinética ; RNS-60; solución salina normal tratada por electrocinética que comprende 60 ppm de oxígeno disuelto) en la conductancia de la célula entera se observó en diferentes protocolos de voltaje (0, -40, -60, -120 mV potenciales basales) En condiciones básales, la corriente de célula entera sensibles al fármaco fue idéntica en todos los potenciales básales (contribución insensible al voltaje, panel superior izquierdo) . En las condiciones activadas con cAMP, sin embargo, las corrientes sensibles a los fármacos fueron muy superiores, y sensibles al protocolo de voltaje aplicado. Las relaciones corriente-a-voltaje no son muy lineales. Esto además se observa en las corrientes sustraídas (panel inferior) , donde se resta, además, la contribución de la conductancia de la célula entera a cero mV para cada protocolo (n = 5) .

Resumen del ejemplo. De acuerdo con los aspectos particulares, por lo tanto, los datos indican que existe un efecto moderado pero constante del fármaco (los fluidos generados por electrocinética de la invención; RNS-60; solución salina normal tratada por electrocinética que comprende 60 ppm de oxígeno disuelto) en condiciones básales. Para mejorar el efecto del fármaco en la conductancia de la célula entera, los experimentos se llevaron a cabo también por la perfusión del fármaco después de la estimulación con un "cóctel" estimulante cAMP, que aumentó dramáticamente la conductancia de la célula entera. Curiosamente, este protocolo también aumentó la parte sensible a los fármacos de la conductancia de la célula entera, que fue diez veces superior que la observada en condiciones básales. Además, en presencia de estimulación cAMP, el fármaco mostró diferentes efectos con respecto a los distintos protocolos de voltaje, lo que indica que los fluidos generados por electrocinética afectan a una contribución dependiente de voltaje de la conductancia de la célula entera. También hubo una disminución de un componente lineal de la conductancia, lo que además sugiere, al menos, una contribución del fármaco a la inhibición de otra ruta (por ejemplo, el canal de iones, canales de cationes gobernados por voltaje, etc.).

En aspectos particulares, y sin estar atados por el mecanismo, los datos de los solicitantes son consistentes con los fluidos generados por electrocinética de la invención (por ejemplo, RNS-60; solución salina normal tratada por electrocinética que comprende 60 ppm de oxígeno disuelto) , que producen un cambio ya sea en un canal (s), que es bloqueado o recuperado de la membrana plasmática.

Tomados en conjunto con otros datos de los solicitantes (por ejemplo, los datos de los ejemplos de trabajo), los aspectos particulares de la presente invención proporcionan composiciones y métodos para la modulación de la señal de transducción intracelular, incluyendo la modulación de al menos uno de la estructura de la membrana, la conductividad de membrana o potencial de membrana, las proteínas de membrana o los receptores, los canales iónicos, y los sistemas de señalización celular dependientes de calcio, que comprenden el uso de las soluciones generadas por electrocinética de la invención para impartir cambios conformacionales y/o electroquímicos en las estructuras membranosas (por ejemplo, la membrana, y/o proteínas de membrana, los receptores u otros componentes) que incluyen pero no se limitan a GPCR y/o proteínas-g. De acuerdo con aspectos adicionales, estos efectos modulan la expresión de genes, y pueden persistir, dependiendo, por ejemplo, de la vida media de los componentes individuales del mensajero, etc Se apreciará que los compuestos de la combinación se pueden administrar: (1) de manera simultánea por la combinación de los compuestos en una co- formulación o (2) por alternancia, es decir, la entrega de los compuestos en serie, de forma secuencial, en paralelo o de manera simultánea en formulaciones farmacéuticas separadas. En la terapia de alternancia, el retraso en la administración del segundo, y, opcionalmente , un tercer ingrediente activo, no deberá ser tal que se pierda el beneficio de un efecto sinérgico terapéutico de la combinación de los ingredientes activos. De acuerdo a ciertas modalidades por cualquiera de los métodos de administración (1) o (2) , idealmente la combinación se debe administrar para lograr resultados más eficaces. En ciertas modalidades por cualquiera de los métodos de administración (1) o (2) , la combinación se debe administrar idealmente para alcanzar el pico de concentraciones plasmáticas de cada uno de los ingredientes activos. Un régimen de una pildora una vez al día por la administración de una combinación de la co-formulación puede ser viable para algunos pacientes que sufren de enfermedades inflamatorias neurodegenerativas. De acuerdo con ciertas modalidades el pico eficaz de concentraciones plasmáticas de los ingredientes activos de la combinación estará en el rango de aproximadamente 0.001 a 100 µ . El pico óptimo de las concentraciones plasmáticas se puede lograr por una formulación y régimen de dosificación prescrito para un paciente en particular. También se entenderá que los fluidos de la invención y el acetato de glatiramer, el interferón-beta, la mitoxantrona , y/o el natalizumab o los derivados fisiológicamente funcionales de cualquiera de éstos, que presentados de manera simultánea o secuencial, se pueden administrar de forma individual, agrupados, o en cualquier combinación de éstos. En general, durante la terapia con alternancia (2), una dosis eficaz de cada compuesto se administra en serie, donde, en la terapia de co- formulación (1) , la dosis efectiva de dos o más compuestos se administran juntas.

Las combinaciones de la invención se pueden presentar de manera conveniente como una formulación farmacéutica en forma de dosis unitarias. Una formulación conveniente de dosis unitaria contiene los ingredientes activos en cualquier cantidad de 1 mg a 1 g cada una, por ejemplo, pero no se limita a, 10 mg a 300 mg . Los efectos sinérgicos de los fluidos de la invención en combinación con el acetato de glatiramer, el interferón-beta, la mitoxantrona, y/o el natalizumab se pueden obtener en una amplia relación, por ejemplo, de 1:50 a 50:1 (fluido de la invención : acetato de glatiramer, interferón-beta, mitoxantrona, y/o natalizumab) . En una modalidad, la relación puede variar de 1:10 a 10:1. En otra modalidad, la relación peso/peso de fluido de la invención a acetato de glatiramer, interferón-beta, mitoxantrona, y/o natalizumab en un forma de combinación de dosis co- formulada, tal como una pildora, tableta, comprimido o cápsula será de aproximadamente 1, es decir, una cantidad aproximadamente igual de fluido de la invención y acetato de glatiramer, interferón-beta, mitoxantrona, y/o el natalizumab. En otras co- formulaciones ejemplificantes, puede haber más o menos fluidos de la invención y acetato de glatiramer, interferón-beta, mitoxantrona, y/o natalizumab. En una modalidad, cada compuesto se empleará en la combinación en una cantidad en la que presente actividad antiinflamatoria cuando se usa solo. Otras relaciones y cantidades de los compuestos de dichas combinaciones se contemplan dentro del alcance de la invención.

Una forma de dosis unitaria puede comprender, además, el fluido de la invención y acetato de glatiramer, interferón beta, mitoxantrona, y/o natalizumab, o los derivados fisiológicamente funcionales de éstos, y un portador f rmacéuticamente aceptable.

Será apreciado por los expertos en la técnica que la cantidad de los ingredientes activos en las combinaciones de la invención requerida para el uso en el tratamiento variará de acuerdo con una variedad de factores, que incluyen la naturaleza de la afección que está siendo tratada y la edad y el estado del paciente, y en última instancia, será a criterio del médico o profesional de la salud. Los factores a considerar incluyen la vía de administración y la naturaleza de la formulación, el peso corporal del animal, la edad y el estado general y la naturaleza y gravedad de la enfermedad a tratar. También es posible combinar dos de los ingredientes activos en una forma de dosificación unitaria para la administración simultánea o secuencial con un tercer ingrediente activo. La combinación de las tres partes se puede administrar de manera simultánea o secuencial. Cuando se administra de manera secuencial, la combinación se puede administrar en dos o tres administraciones. De acuerdo con ciertas modalidades, la combinación de tres partes del fluido de la invención y el acetato de glatiramer, el interferón-beta, la mi oxantrona, y/o el natalizumab se pueden administrar en cualquier orden.

EJEMPLO 2 {El análisis de la fijación de parche conducido en las células Calu-3 perfundidas con los fluidos generados por electrocinética de la invención (RNS-60 y Solas) revelaron que (i) la exposición al RNS-60 y Solas resultó en un aumento en, la conductancia de la célula entera, (ii) que la exposición de las células al RNS-60 produjo un aumento en la conductancia no-lineal , evidente a los 15 minutos del tiempo de incubación, y (iii) que la exposición de las células al RNS-60 produjo un efecto de la solución salina RNS-60 eñ los canales permeables de calcio) .

Información general. En este ejemplo, los estudios de fijación de parche se realizaron para confirmar la utilidad, tal como se describe en este documento, de los fluidos salinos de la invención generados por electrocinética (RNS-60 y Solas) , incluyendo la utilidad para modular las corrientes de la célula entera. Se llevaron a cabo dos series de experimentos .

El resumen de los datos de la primera serie de experimentos indica que la conductancia de la célula entera (relación corriente-a-voltaje) obtenida con la solución salina Solas es muy lineal, para los dos tiempos de incubación (15 min, 2 horas) , y para todos los protocolos de voltaje. Sin embargo, es evidente que una incubación más larga (2 horas) con Solas aumentó la conductancia de la célula entera. La exposición de las células al RNS-60 produjo un aumento en la conductancia no lineal, como se muestra en las corrientes delta (resta Rev-Sol) , que sólo es evidente a los 15 minutos del tiempo de incubación. El efecto del RNS-60 en esta corriente no lineal desaparece, y es, en cambio, muy lineal a las dos horas del tiempo de incubación. La contribución de la conductancia no- lineal de célula entera, como ya se observó, fue sensible al voltaje, aunque está presente en todos los protocolos de voltaje.

El resumen de los datos de la segrunda serie de experimentos indica que hay un efecto de la solución salina RNS-60 en una corriente no lineal, que se hizo evidente en la elevación del calcio en la solución externa. La contribución de la conductancia no-lineal de la célula entera, aunque sensible al voltaje, se presenta en ambos protocolos de voltaje, e indica un efecto de la solución salina RNS-60 en los canales permeables de calcio.

Primera serie de experimentos (aumento de la conductancia; y activación de una conductancia no- lineal regulada por voltaj e) Métodos para la primera serie de experimentos : Véase el EJEMPLO 23 para los métodos generales de fijación de parche. En la primera serie de experimentos siguiente, los estudios de fijación de parche se llevaron a cabo para confirmar, además, la utilidad de los fluidos salinos generados por electrocinética de la invención (RNS-60 y Solas) para modular las corrientes de la célula entera, que usan células Calu-3 en condiciones básales, con los protocolos escalonados, desde un potencial basal cero mV, -120 mV, o -60mV.

La conductancia de la célula entera en cada caso se obtuvo de las relaciones corriente-a-voltaje obtenidas de las células que se incubaron durante 15 min o dos horas, para confirmar, además, los resultados del EJEMPLO 23. En este estudio, los grupos se obtuvieron en un momento dado, para las soluciones salinas Solas o RNS-60. Los datos obtenidos se expresan como la media ± SEM corriente de célula entera para 5 a 9 células.

Resultados : Las Figuras 117 A-C muestran los resultados de una serie de experimentos de fijación de parche que evaluaron los efectos del fluido generado por electrocinética (por ejemplo, RNS-60 y Solas) en la polaridad de la membrana de células epiteliales y la actividad del canal iónico en dos puntos de tiempo (15 min (paneles de la izquierda) y 2 horas (paneles de la derecha)) y en los diferentes protocolos de voltaje (A, etapa a etapa desde cero mV; B, etapa a etapa desde -60 mV, y C, etapa a etapa desde -120 mV) . Los resultados indican que el RNS-60 (círculos llenos) tiene un efecto más grande en la conductancia de la célula entera que Solas (círculos abiertos) . En el experimento se observaron resultados similares en los tres protocolos de voltaje y tanto en el minuto 15 y los puntos del tiempo de incubación de dos horas.

Las Figuras 118 A-C muestran los gráficos que resultan de la resta de los datos de la corriente Solas de los datos de la corriente RNS-60 en los tres protocolos de voltaje ("corrientes Delta") (A, escalonado desde cero mV; B, escalonado desde -60 mV, y C, escalonado desde -120 mV) y los dos puntos de tiempo (15 minutos (círculos abiertos) y 2 horas (círculos llenos) ) . Estos datos indicaron que en el punto de tiempo de 15 minutos con RNS-60, existe un componente no lineal dependiente de voltaje que está ausente en el punto de tiempo de 2 horas.

Al igual que en experimentos anteriores, se usaron como referencia los datos con solución salina "Normal" que dieron una conductividad independiente del tiempo y muy consistente . Los presentes resultados se obtuvieron por comparación de los grupos, ya sea con Solas o solución salina RNS-60, e indican que la exposición de las células Calu-3 a la solución salina RNS-60 en condiciones básales (sin cAMP, o cualquier otra estimulación), produce efecto (s) dependiente (s) del tiempo, consistentes con la activación de una conductancia regulada por voltaje a tiempos más cortos de incubación (15 min) . Este fenómeno no fue tan evidente en el punto de incubación de dos horas. Como se describe en otras partes de este documento, el componente lineal es más evidente cuando la conductancia aumenta por la estimulación con el "cóctel" cAMP. Sin embargo, el tiempo de incubación de dos horas mostró una mayor conductancia lineal, tanto para el RNS-60 y la solución salina Solas, y en este caso, la solución salina RNS-60 duplicó la conductancia de la célula entera, en comparación con solo Solas. Esta evidencia indica que al menos dos contribuciones a la conductancia de la célula entera se afectan por la solución salina RNS-60, es decir, la activación de la conductancia no- lineal regulada por voltaje, y una conductancia lineal, que es más evidente en tiempos más largo de incubación.

Segunda serie de experimentos (efecto en los canales de calcio permeables) Métodos para la segunda serie de experimentos : Véase el EJEMPLO 23 para los métodos generales de fijación de parche. En la segunda serie de experimentos siguiente, aún se realizaron estudios de fijación de parche adicionales para confirmar, además, la utilidad de los fluidos salinos generados por electrocinética de la invención (RNS-60 y Solas) para modular las corrientes de célula entera, que usan las células Calu-3 en condiciones básales, con protocolos escalonados, desde un potencial basal cero mV o -120 mV.

La conductancia de las célula entera en cada caso se obtuvo de las relaciones corriente-a-voltaje obtenidas a partir de las células incubadas durante 15 min con cualquier solución salina. Para determinar si existe una contribución de los canales de calcio permeables a la conductancia de la célula entera, y si esta parte de la conductancia de la célula entera se afecta por la incubación con solución salina RNS-60, las células se parchearon en solución salina normal después del período de incubación (conlleva una solución externa con alto NaCl, mientras que la solución interna contiene alto KC1) . La solución salina externa se reemplazó después con una solución donde el NaCl, se reemplazó por CsCl para determinar si existe un cambio en la conductancia por el reemplazo del catión principal externo. En estas condiciones, la misma célula se expuso después al aumento de concentraciones de calcio, de manera que una etapa de entrada de calcio se hace más evidente.

Resultados : Las Figuras 119 A-D muestran los resultados de una serie de experimentos de fijación de parche que evaluaron los efectos del fluido generado por electrocinética (por ejemplo, Solas (paneles A y B) y RNS-60 (paneles C y D) ) sobre la polaridad de la membrana celular epitelial y la actividad del canal iónico usando diferentes soluciones de sales externas y a diferentes protocolos de voltaje (los paneles A y C muestran el escalonado desde cero mV, mientras que los paneles B y D muestran el escalonado desde -120 mV) . En estos experimentos se usó un punto de tiempo de 15 minutos . Para Solas (paneles A y B) los resultados indican que: 1) usando CsCl (símbolos cuadrados) en lugar de NaCl como la solución externa, aumentó la conductancia de la célula entera con un comportamiento lineal cuando se comparó con el control (símbolos de diamantes) y 2) CaCl2 tanto en 20 mM CaCl2 (símbolos círculo) y 40 mM de CaCl2 (símbolos triángulo) aumentó la conductancia de la célula entera de una manera no-lineal. Para RNS-60 (paneles C y D) , los resultados indican que: 1) el uso de CsCl (símbolos cuadrados) en lugar de NaCl como solución externa, tuvo poco efecto en la conductancia de la célula completa, cuando se comparó con el control (símbolos de diamante) ; y 2) CaCl2 a 40 mM (símbolos triángulo) aumentó la conductancia de la célula entera de una manera no- lineal.

Las Figuras 120 A-D muestran los gráficos que resultan de la resta de los datos de corriente de CsCl (mostrados en la Figura 119) de 20 mM de CaCl2 (símbolos diamantes) y los datos de corriente 40 mM de CaCl2 (símbolos cuadrados) a dos protocolos de voltaje (paneles A y C, escalonados desde cero mV; y B y D, escalonados desde -120 mV) para Solas (paneles A y B) y RNS-60 (paneles C y D) . Los resultados indican que tanto las soluciones Solas y RNS-60 activaron una conductancia no lineal de la célula entera inducida por calcio. El efecto fue mayor con RNS-60 (indicando una capacidad de respuesta de dosis) , y con RNS-60 se incrementó sólo en las concentraciones de calcio más altas. Además, la conductancia no lineal de calcio dependiente de la concentración de calcio más alta también aumentó por el protocolo de voltaje.

Los datos de esta segunda serie de experimentos indican, además, un efecto de la solución salina RNS-60 y la solución salina Solas para los datos de la conductancia de la célula entera obtenidos en las células Calu-3. Los datos indican que la incubación durante 15 minutos con cualquier solución salina produce un efecto distinto en la conductancia de la célula entera, lo que es más evidente con RNS-60, y cuando el calcio externo aumenta, y además indica que la solución salina RNS-60 aumenta un componente no lineal dependiente de calcio de la conductancia de la célula entera.

La evidencia acumulada sugiere la activación por la solución salina Revalesio de los canales iónicos, que hace contribuciones diferentes a la conductancia basal de la célula .

Tomado en conjunto con otros datos de los solicitantes (por ejemplo, los datos de los solicitantes de otros ejemplos de trabajo) , los aspectos particulares de la presente invención proporcionan composiciones y métodos para modular la transducción intracelular de la señal, que incluye la modulación de al menos uno de estructura de la membrana, la conductividad de membrana o potencial de membrana, proteínas de la membrana o receptores, canales iónicos, componentes de los lípidos, o componentes intracelulares que son intercambiables por la célula (por ejemplo, las rutas de señalización, tal como los sistemas de señalización celular dependientes del calcio) , que comprende el uso de las soluciones generadas por electrocinética de la invención, para impartir cambios conformacionales y/o electroquímicos en las estructuras membranosas (por ejemplo, la membrana, y/o proteínas de membrana, los receptores u otros componentes de membrana) , que incluyen pero no se limitan a GPCR y/o proteínas-g. De acuerdo con aspectos adicionales, estos efectos modulan la expresión génica, y pueden persistir en dependencia, por ejemplo, de la vida media de los componentes individuales del mensajero, etc.

EJEMPLO 25 (Las mediciones de Microscopía de Fuerza Atómica (AFM) del fluido electrocinético de la invención (RNS-60) indicó la presencia y/o la formación de nanoburhujas hidrofóbicas de superficie que fueron sustancialmente menores que aquellas presentes en el fluido de control en el "recipiente de presión" (PNS-60) ) Información general. Los Solicitantes usaron las mediciones de Microscopía de Fuerza Atómica (AFM) para caracterizar las nanoburbujas hidrofóbicas en el fluido electrocinético de la invención (RNS-60) .

Materiales y métodos: Estudios AFM. Los estudios de AFM se realizaron en una Instalación de Usuario de Nanotecnología (NTUF) reconocida por la técnica. Para los estudios AFM, una aguja muy pequeña y sensible se sumerge en una gota de agua colocada sobre una superficie hidrofóbica. Después, la aguja se explora sobre la interfase agua/superficie a tasas de 1 mm2 en ~ 15 minutos. La aguja registra cualquier imperfección en la geometría de la superficie, y es lo suficientemente sensible para registrar la presencia de pequeñas burbujas.

El sustrato de silicio en el que se colocaron las gotas de agua se preparó usando tricloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctil ) silano) , y la superficie resultante hidrofóbica provoca que el agua se acumule con ángulos de contacto de aproximadamente 95 grados. Este recubrimiento se usa en muchos estudios de AFM, en parte, porque es particularmente duradero.

Preparación de soluciones . Se estudiaron dos soluciones de prueba: R S-60 y PNS-60. El R S-60 es un fluido electrocinético de la invención que comprende 60 ppm de oxígeno, mientras que el PNS-60 es un fluido de control no electrocinético que comprende 60 ppm de oxígeno preparado por la exposición convencional a un cabezal de oxígeno presurizado (es decir, fluido oxigenado en el recipiente presurizado) . Cada solución de la prueba se tamponeó inicialmente por la adición de una pequeña cantidad de solución tampón fosfato neutra (pH 7) , y aproximadamente de 60 a 70 µ? de cada solución tampón de prueba (aproximadamente 22°C) se colocó sobre una placa de sílice previamente preparada.

Resultados : Bajo la AFM, las gotas de RNS-60 mostraron una distribución de aproximadamente 20 nanoburbujas hidrofóbicas en un área de 1 mm2 , con dimensiones de ~ 20 nm de ancho y ~ 1.5 nm de altura o más pequeños (Figura 121 A) . Por el contrario, con AFM, las gotas de PNS-60 mostraron aproximadamente unas 5 nanoburbujas hidrofóbicas en un área de 1 mm2 , con dimensiones de ~ 60 nm de ancho y ~ 5 nm de altura (Figura 121 B) . La gota de PNS-60, por lo tanto, tenía mucho menos y mucho más grandes nanoburbujas hidrofóbicas en comparación con la gota de RNS60.

De acuerdo con aspectos particulares, por lo tanto, existe una diferencia sustancial en el tamaño y la distribución de las nanoburbujas hidrofóbicas de superficie entre las soluciones de prueba RNS-60 y PNS-60, donde las nanoburbujas están ya sea inicialmente presentes en, y/o se forman dentro de los fluidos de prueba durante la medición de la AFM.

Como se discutió en otras partes de este documento, de acuerdo con aspectos particulares de la presente invención, los fluidos alterados por electrocinética de la invención comprenden una solución acuosa iónica de nanoestructuras estabilizadas por carga que contienen oxígeno sustancialmente con un diámetro promedio de menos que aproximadamente 100 nanómetros y establemente configurados en el fluido iónico acuoso en una cantidad suficiente para proporcionar, al entrar en contacto con una célula viva por el fluido, la modulación de al menos uno de la conductividad de la membrana celular y el potencial de membrana celular.

Los solicitantes señalan, sin embargo, que las burbujas hidrofóbicas (que se forman en una superficie hidrofóbica) , tal como aquellas observadas en los experimentos de AFM, son probablemente en esencia diferentes de la nanoestructura estabilizada por carga, biológicamente activa de la invención descrita en este documento. De acuerdo con aspectos particulares, por lo tanto, mientras que los experimentos de AFM en este eemplo de trabajo soportan, en base al tamaño y la distribución de la formación de burbujas hidrofóbicas, que los fluidos electrocinéticos de la invención (por ejemplo, RNS-60) son esencialmente distintos de los fluidos de control no electrocinéticos, las burbujas hidrofóbicas son probablemente distintas de y/o derivadas de las nanoestructuras que contienen oxígeno estabilizado por carga de la invención, descritas en detalle en otras partes de este documento. En cualquier caso, en relación con los fluidos electrocinéticos de la invención, los fluidos de control oxigenados en recipiente presurizado, no comprenden las nanoestruturas que contienen oxígeno estabilizadas por carga capaces de modular al menos un potencial de la membrana celular y la conductividad de la membrana celular.

EJEMPLO 26 (El fluido electrocinético de la invención mostró ser sustancialmente eficaz en un modo de dosis-respuesta en un modelo de rata MBP de encefalo ielitis alérgica experimental (EAE) (autoinmune) aguda reconocido por la técnica de la esclerosis múltiple (MS) ) Información general: En este EJEMPLO de trabajo, el fluido electrocinético de la invención RNS-60 se evaluó en dos dosis, tanto en los regímenes de administración terapéuticos como profilácticos, en un modelo de rata de encefalomielitis alérgica experimental aguda (EAE) inducida por la proteína básica de mielina MBP reconocido por la técnica que. El fluido electrocinético de la invención RNS-60 mostró ser eficaz sustancialmente en un modo dosis-respuesta. Tanto en la terapéutica (la administración diaria de RNS-60 al comienzo, concomitante con la inyección de MBP) y la profiláctica (la administración diaria de RNS-60 al comienzo siete días antes de la inyección de MBP) , los regímenes de dosis RNS-60 mostraron una marcada disminución, así como un retraso en el inicio (en los grupos de dosis alta) de la puntuación clínica. De acuerdo con los aspectos particulares de la presente invención, por lo tanto, las composiciones electrocinéticas de la invención tienen utilidad sustancial para el tratamiento, incluyendo el alivio y la prevención, de los síntomas de la EAE en un modelo de rata de MS humana reconocido por la técnica. De acuerdo con aspectos adicionales de la presente invención, por lo tanto, las composiciones electrocinéticas de la invención tienen utilidad sustancial para el tratamiento, incluyendo el alivio y la prevención, de los síntomas de la MS en los mamíferos afectados (preferentemente los seres humanos) . En otros aspectos adicionales, las composiciones electrocinéticas de la invención cruzan la barrera hematoencefálica (BBB) , y proporcionan de esta forma un método novedoso para el tratamiento de enfermedades inflamatorias del sistema nervioso central.

Esclerosis múltiple (MS) . La esclerosis múltiple (MS) es una enfermedad desmielinizante del sistema nervioso central (CNS) , y es una de las enfermedades más comunes de discapacitad neurológica en adultos jóvenes. Las principales características de esta enfermedad son las áreas focales de desmielinización e inflamación. El curso de la enfermedad es impredecible y de toda la vida, y afecta a las mujeres con más frecuencia que los hombres. La etiología de la enfermedad parece ser dependiente de factores genéticos y ambientales. En la periferia, el antígeno se une por las células presentadoras de antígeno (APC) a través de MCH II. Las células ThO se unen al antígeno y se someten a la activación y diferenciación. Las moléculas de adhesión y las metaloproteasas de la matriz (MMP) ayudan a las células Thl a unirse y a penetrar la barrera hematoencef lica (BBB) . Al cruzar la BBB en el NCS, las células Thl engranan los complejos antígeno-MHC y producen citoquinas pro-inflamatorias que conducen a los daños en el NCS. El sistema auto.inmune reconoce las proteínas de la mielina como ajenas y comienzan a atacar. Históricamente, mientras que las células Thl se cree que juegan un papel predominante en la patología de la enfermedad, la evidencia reciente indica que una cascada proinflamatoria de las células Thl7, IL-6 y TGF-ß juegan un papel fundamental en la patogénesis de la EAE y la MS .

Encefalomielitis autoinmune experimental (EAE) . La encefalomielitis autoinmune experimental (EAE) , también llamada encefalomielitis alérgica experimental, es un modelo animal no humano de la esclerosis múltiple (MS) . Si bien no es la MS, las diferentes formas y etapas de la EAE se asemejan a las diversas formas y etapas de la MS muy de cerca en un gran número de formas. Más concretamente, la EAE es una enfermedad autoinmune inflamatoria y desmielinizante adquirida, crónica-recurrente o aguda. Los animales se inyectaron con la totalidad o parte de varias proteínas (por ejemplo, la proteína básica de mielina (MBP) , proteína proteolipídica (PLP) , glicoproteína de oligodendrocitos y mielina (MOG) ) que forman la mielina, la vaina aislante que rodea las células nerviosas (neuronas) , para inducir una respuesta autoinmune contra la propia mielina del animal que se parece mucho a la MS en los seres humanos . La EAE se indujo en un número de diferentes especies de animales que incluyen los ratones, ratas, conejillos de indias, conejos, macacos, monos rhesus y monos tití. Por diversas razones, incluyendo el número de herramientas inmunológicas , la disponibilidad, la esperanza de vida y la fecundidad de los animales y la semejanza de la enfermedad inducida a la MS, los ratones y las ratas son las especies más comúnmente usadas. El modelo de EAE agudo en rata tiene un fuerte componente inflamatorio y por lo tanto es un modelo adecuado en el que investigar el potencial terapéutico de un agente que se dirige a los eventos inmunes en la MS. ??? inducido por MBP. La MPB en ratas Lewis seguido de una dosis dará lugar a la recaída que se caracteriza principalmente por la parálisis de la pata trasera. Las ratas Lewis se sometieron a la inyección de MBP el día 0. La enfermedad se desarrolla entre los días 12-16, con recuperación completa de la enfermedad entre los días 18-21. El modelo se autolimita y no muestra desmielinización .

Materiales y métodos: Producción y caracterización del fluido de prueba (RNS- 60) . El RNS-60 esterilizado por filtro se preparó por los solicitantes de acuerdo a los métodos descritos en US2008/0219088 (publicado el 11 de septiembre de 2008) , US2008/0281001 (publicado el 11 de noviembre de 2008) y WO2008/052143 (publicado el 02 de mayo de 2008) , los que se incorporan en este documento en su totalidad como referencia y, en particular, para todos los aspectos relacionados con el aparato y/o los métodos para la preparación de los fluidos electrocinéticos de la invención de los solicitantes. El oxígeno disuelto (OD) del RNS-60 usado fue de 59 ppm, según se determinó por el ensayo de titulación de Winkler (Y.C. Wong & C.T. Wong . New ay Chemistry for Hong Kong A- Level volumen 4, página 248 o Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater - ISBN 0-87553-235-7 20aVa edición) . El fluido RNS-60 se marcó con un número de prueba del elemento (TI) , la fecha de recepción, las condiciones de almacenamiento, y la fecha de vencimiento. Las condiciones de almacenamiento y manejo del RNS-60 fueron de acuerdo a la especificación de los solicitantes para garantizar la estabilidad en la Instalación de Pruebas durante la prueba. El fluido se mantuvo refrigerado de 2 a 8 °C cuando no está en uso. Los viales que contienen fluido se usaron como recipientes de un solo uso.

Fluidos Vehículos de control. El fluido vehículo de control fue la solución salina normal para inyección (0.9%) de Hospira.

Dexametasona. La dexametasona se adquirió de Sigma (Cat. No. D1756; núm . de lote 096K1805). Para la administración, la dexametasona (polvo blanco) se diluyó en etanol para lograr una concentración de 1 mg/ml y después se diluyó de nuevo en agua destilada hasta lograr una concentración de la dosis de 0.1 mg /mi .

Elementos de inducciónde EAE: Agente antigénico MBP. La BP fue la proteína básica de mielina de conejillos de indias (Des-Gly-77, Des-His-78) -MBP (68-84); Cat. núm. H-6875, proporcionado por Bioscience MD) .

La MBP se disolvió en solución salina fisiológica a una concentración de 2 mg/ml; Agrente sensibilizante CFA. El adyuvante completo de Freund (CFA) era de MD Biosciences División of Morwell Diagnostics GmbH (Cat. núm. IMAD-4) . La suspensión CFA, que contiene Mycobacterium Tuberculosis H37 Ra muerto por calor a una concentración de 4 mg/ml, se usó como suministro, y Emulsión MBP/CFA (agentes antigénicos/sensibilizantes) . Antes de las inoculaciones individuales llevadas a cabo el día 0 del estudio, un volumen de solución MBP se mezcló con un volumen igual de CFA 4 mg/ml mediante el empleo de dos jeringas conectadas por una conexión Luer para mezclar bien la mezcla emulsionante para igualar el volumen de la dosis total de ???µ?/animal . La dosis se entregó como inyecciones bilaterales 2 x 50 µ? subcutáneas (SC) en la región intraplantar de la pata.

Prueba de los animales; Ratas. Sesenta (60) ratas Lewis (6-7 semanas de edad al inicio del estudio) se obtuvieron de Harían Laboratories Israel, Ltd. La variación del peso de los animales en el momento de inicio del tratamiento no debía exceder el 20% del peso medio. El estado de salud de los animales usados en este estudio se examinó a su llegada. Sólo los animales en buen estado de salud se aclimataron a las condiciones de laboratorio y se usaron en el estudio. Antes de entrar en el estudio, los animales se aclimataron durante al menos 5 días. Durante la aclimatación y a lo largo de la duración del estudio, los animales se alojaron en una instalación para roedores de acceso limitado y se mantuvieron en grupos de 5 ratas como máximo en jaulas de polipropileno provistas de fondos sólidos y llenos de virutas de madera estéril como material de cama. A los animales se les proporcionó, ad libitum, una dieta comercial de roedores y tuvieron libre acceso al agua potable, que se entregó a cada jaula a través de botellas de polietileno con tubos de acero inoxidable para absorber. Un análisis del alimento del lote de dieta usado en el estudio se incluyó en los archivos con los datos del estudio. El agua se controló periódicamente. Las condiciones ambientales se controlaron de manera automática y se fijaron para mantener la temperatura de 20 a 24 °C con una humedad relativa (RH) de 30 a 70%, ciclo de luz : oscuridad 12:12 horas y de 15 a 30 cambios de aire por hora en la sala de estudio. La temperatura y la humedad relativa se controlaron todos los días. El ciclo de luz se controlo mediante un reloj de control . A los animales se les otorgó una única identificación usando marcas en la cola. Este número también apareció en una tarjeta de la jaula, visible en la parte frontal de cada jaula. La tarjeta de la jaula también contenía los números de estudio y del grupo, la vía de administración, el género, la cepa y toda la información relevante en cuanto al grupo de tratamiento.

TABLA 11. Constitución de los Grupos de Prueba y los Niveles de Dosis, enumerandos los 6 grupos experimentales que comprenden el estudio: Nivel de Volumen Númer Tamaño Materi Dosis de o del del al de (mg/kg/ad Dosis Grupo grupo Prueba Ruta min) (ml/kg) Régimen 1F n=10 Vehícu IV 0 2 mi 7 días lo por 350 antes de Contro g de la 1 rata induceió n de la enfermed ad hasta el final del estudio 2F n=10 Dexame IP 1 10 Una vez al día tasona comenzan do el día 0 del estudio 3F n=lQ RNS-60 IV 1 mi 7 días antes de por 350 la inducció g de n de la enfermed rata ad hasta el final del estudio Nivel de Volumen Númer Tamaño Materl Dosis de o del del al de (mg/kg/ad Dosis Grupo grupo Prueba Ruta min) (ml/kg) Régimen 4F n=10 RNS-60 IV 2 mi 7 días antes de por 350 la inducció g de n de la enfermed rata ad hasta el final del estudio 5F n=10 RNS-60 IV 1 mi Una vez al día por 350 comenzan do el g de día 0 del rata estudio 6F n=10 RNS-60 IV 2 mi Una vez al día por 350 comenzan do el g de día 0 del rata estudio Procedimientos de pruebas y los principios del modelo murino de la EAE Aguda. La encefalomielitis alérgica experimental (EAE) es una enfermedad autoinmune desmielinizante del sistema nervioso central (NCS) , que imita muchas de las características clínicas y patológicas de la esclerosis múltiple (MS) . El modelo agudo de rata consiste en un período de sensibilización, inducido por una única inyección subcutánea (SC) de la proteína básica de la mielina (MBP) emulsionada en adyuvante completo de Freund (CFA) el día 0 del estudio.

Una representación esquemática de la inducción de EAE y los regímenes de tratamiento se muestran en la Figura 123) .

Inducción de EAE: MBP/CF ñ. Como se muestra en la descripción esquemática en la FIGURA 123) , todos los animales se sometieron el día 0 del estudio (inicio del estudio) a una única inyección del inoculo que consiste en una mezcla de homogeneizado emulsivo de MBP y CFA (inoculo encefalitogénico emulsivo MBP/CFA (100 ^ig MBP/200 µg CFA) se inyectó en un volumen de dosis total de 100 µ?/animal y se entregó como inyecciones bilaterales subcutáneas (SC) 2 x 50µ1 en la región intraplantar de la pata .

Tratamiento : Procedimiento y régimen de tratamiento . Todos los compuestos frescos se prepararon cada día por una persona diferente de la que marcaba los animales. La persona que marcó los animales recibió los viales marcados sólo con los números de grupo y no estaba al tanto del tratamiento.

Ruta de administración: (i) RNS-60 (IV) ; (ii) controles vehículos: (IV); y (iii) controles positivos: (IP).

Niveles de dosis y el volumen de dosis: (i) RNS-60: dosis baja de 2 mi por 350 g; dosis alta de 4 mi por 350 g; (ii) controles vehículos: 0; y (iii) control positivo (dexametasona) : 1 mg/kg.

Cuidados generales. A menos que se determine durante el curso del estudio, una vez que los efectos experimentales EAE se esperaron y/u observaron (aproximadamente de 8 a 12 días después de la inoculación encefalitogénica única) , o cuando los animales mostraron una disminución del peso corporal mayor del 15% de su determinación anteriores o una disminución mayor del 20% de su medición inicial de peso corporal, los cuidados generales adecuados se llevaron a cabo en base a cada caso.

Alimentación y bebida. Una fuente de agua adicional consistente de la dieta para roedores en astillas harinosas o granuladas, empapadas en agua potable se coloca en la parte inferior de la jaula y frente a los animales que se arrastran/no móviles.

Deshidratación. Los animales se pueden someter a la terapia con fluidos suplementarios por vía subcutánea (SC) con una solución de dextrosa al 5% al menos dos veces al día y hasta 2 ml/animal/día hasta que el peso corporal vuelva a estar dentro del 10% de la determinación inicial.

Micción. La palpación abdominal de los animales se lleva a cabo con el fin de ayudar en la micción y observar si los animales pueden vaciar su vejiga.

Otros cuidados especiales . Las áreas perianales dé los animales y las patas traseras se limpiaron según fue necesario con una gasa humedecida.

OBSERVACIONES Y EXÁMENES: Signos clínicos . A lo largo de todo el estudio de 21 días, se llevaron a cabo exámenes clínicos cuidadosos y se registraron al menos una vez al día, además de la puntuación clínica EAE y la evaluación (ver más abajo) . Las observaciones incluyeron los cambios en la piel, pelo, ojos, membranas mucosas, ocurrencia de secreciones y excreciones (por ejemplo diarrea) y actividad autónoma (por ejemplo, lagrimeo, salivación, piloerección, tamaño de la pupila, patrón respiratorio inusual) , marcha, postura y respuesta a la manipulación, así como la presencia de un comportamiento inusual, temblores, convulsiones, sueño y coma.

Peso corporal . La pérdida de peso corporal puede ser el primer signo del inicio de la enfermedad, mientras que un repentino aumento de peso marcado tiende acompañar la remisión de los síntomas de EAE. Por lo tanto, la determinación de los pesos corporales individuales de los animales se realizó poco antes de la inducción de la EAE el día 0 (inicio del estudio) y a partir de ahí, sobre una base diaria durante todo el periodo de observación de 21 días.

Puntuación clínica y evaluaciones de la EAE. Inicialmente , todos los animales se examinaron en busca de signos de cualquier respuesta y síntomas neurológicos antes de la inducción de la EAE (día 0 del estudio) y a partir de ahí se examinaron sobre una base diaria durante todo el periodo de observación de 21 días. Para evitar desvíos experimentales, las reacciones de la EAE se determinaron a ciega, en la medida de lo posible, por un miembro del personal ajeno al tratamiento específico que se aplica. Las reacciones EAE se anotaron y registraron de acuerdo con una escala convencional clásica de 0 a 5, reconocida en la técnica en orden creciente de gravedad, como se muestra abajo en la Tabla 12 : Tabla 12. Las reacciones EAE se anotaron y registraron de acuerdo con una escala convencional clásica de 0 a 5 reconocida en la técnica en orden creciente de gravedad.

Grado Signos/Síntomas 0 No hay anomalías. 0.5 Debilidad de la mitad distal de la cola. 1 Debilidad de la mitad proximal de la cola . 1.5 Debilidad de una pata trasera. 2 Debilidad de las dos patas traseras. 2.5 Parálisis de una pata delantera. 3 Parálisis de las dos patas delanteras. 4 Parálisis completa. 5 Muerte .

Muestras de sangre. El día de terminación del estudio (día 21) , todos los animales se desangraron una hora después de la inyección. Las muestras se recogieron el día 0 del estudio (grupos de profilaxis únicamente), 7, 14 y 21. El plasma se recogió en viales con heparina y se mantuvo a -20°C. Un volumen de 300 µ? se almacenó para el análisis de recuento sanguíneo y 100 µ? se almacenaron y usaron para los análisis de citoquina posteriores a través de la tecnología Luminex. Los recuentos sanguíneos se analizaron para los días 0, 7, 14 y 21.

Recopilación de tejidos. Al final del ensayo, los animales se perfundieron con 4% de PFA. El cerebro y la médula espinal se recopilaron y conservaron en 4% de PFA.

Punto final humanitario. Los animales que se encontraban en un estado moribundo y/o los animales que mostraron dolor intenso y signos duraderos de sufrimiento intenso se sacrificaron humanitariamente.

ESTADÍSTICAS / EVALUACIÓN DE LOS DATOS: La evaluación se basó principalmente en los cambios relativos registrados tanto en los síntomas neurológicos y los pesos corporales, expresados en valores absolutos, porcentaje de cambio (%) y los valores medios del grupo obtenidos en todos los grupos tratados frente aquellos del control vehículo. Se aplicó el análisis de los datos por los métodos estadísticos apropiados para determinar la significancia de los efectos del tratamiento.

SERVICIO VETERINARIO, DECLARACIONES DE USO: Este estudio se llevó a cabo tras la aprobación de una solicitud presentada al Comité para la Conducta Ética en el Cuidado y Uso de los Animales de Laboratorio que el estudio cumplía con las normas y regulaciones expuestas.

RESULTADOS : Los resultados del estudio se muestran en la FIGURA 122, donde el tiempo (días después de la inyección MBP) se muestra en el eje X, y las "puntuaciones clínicas" (véase anteriormente en "Materiales y métodos") se muestran en el eje de las Y.

La Figura 122 muestra que el fluido electrocinético de la invención (RHS -60) fue sustancialmente eficaz en un modelo de rata con encefalomielitis autoinmune experimental (EAE) reconocido por la técnica de esclerosis múltiple (MS) (véase anteriormente en "Materiales y métodos"). Específicamente, en comparación con el grupo de control vehículo (diamantes llenos) en un período de 17 días, los regímenes de dosis de RNS-60 terapéuticos (administración diaria de RNS-60 de forma concomitante con la inyección de MBP) y profilácticos (administración diaria de RNS-60 comenzando siete días antes de la inyección MBP) mostraron una marcada disminución, así como un retraso en la aparición (en los grupos de dosis alta) de la puntuación clínica.

La puntuación clínica del grupo terapéutico de la dosis baja, de RNS-60 (inyección de un ce al día) fue de aproximadamente la mitad (1/2) que la del grupo de control vehículo, mientras que la puntuación clínica del grupo terapéutico de la dosis alta de RNS -60 (inyección de dos ce al día) no solamente fue de aproximadamente una quinta parte (1/5) a una décima parte (1/10) que la del grupo de control vehículo, sino que también mostró un retraso en la aparición.

La puntuación clínica del grupo . profiláctico de la dosis baja de RNS-60 (inyección de un ce al día) fue de aproximadamente un tercio (1/3) que la del grupo de control vehículo, mientras que la puntuación clínica del grupo profiláctico de la dosis alta de RNS-60 (inyección de dos ce al día) no sólo fue cero (puntuación clínica no detectable) hasta el día 16, mostrando un retraso en la aparición considerable, sino que cuando fue observable el día 17, fue menos de una décima parte (1/10) que la del grupo de control vehículo en el mismo punto de tiempo.

De acuerdo con aspectos particulares de la presente invención, por lo tanto, las composiciones electrocinéticas de la invención tienen utilidad sustancial para el tratamiento, incluyendo el alivio y la prevención, de los síntomas de la EAE en modelos de rata reconocidos por la técnica de la MS humana.

De acuerdo con aspectos particulares, y tal como se describe en otras partes en los ejemplos de trabajo en este documento, las composiciones electrocinéticas de la invención tienen utilidad sustancial para reducir la inflamación. Sin estar atados por el mecanismo, por ejemplo, y como se discutió en otra parte en este documento, la IL7R dimeriza con el gen de factor 2 similar al receptor de citoquina (CRLF2) para formar el receptor TSLP (Al Shami y otros, (2004) J. Exp. Med. 200:159-168). La TSLP es una citoquina similar a IL7 que impulsa el desarrollo de las células B inmaduras in vitro y en células dendríticas mieloides, puede promover células vírgenes T CD4+ para diferenciarse en un fenotipo tipo 2 de T ayuda (Th2) y promover la expansión de las células de memoria CD4 + Th2 ( Huston y otros, (2006) Curr. Asma Alergia Rep . 6:372-376). Se piensa que la TSLP desencadena las respuestas inflamatorias de tipo Th2 mediadas por las células dendríticas, y se considera como un interruptor principal de la inflamación alérgica (Koyama y otros, (2007) Biochem. Biophys . Res. Commun. 357:99-104), la cual es relevante a la etiología de la MS (véase, por ejemplo, Gregory y otros, Nature Genetics, 39:1083-1091; publicado en Internet el 29 de julio 2007 incorporado como referencia en este documento; asociación del alelo IL7Ror con M.S.) . En aspectos adicionales, las composiciones electrocinéticas de la invención tienen utilidad sustancial para la modulación (por ejemplo, la reducción) de la metaloproteinasa de la matriz 9 (MMP-9) . En la esclerosis múltiple (MS) , la actividad en los tejidos de la metaloproteinasa de matriz (MMP) es el resultado de un equilibrio entre ' las MMP y sus inhibidores de tejido (TIMP) . La MMP-9 predomina en las lesiones de la MS aguda y es inhibida por el TIMP-1, mientras que la MMP- 2 probablemente participa en la remodelación de la matriz extracelular (ECM) como en la enfermedad crónica y es inhibida por el TIMP- 2 (véase, por ejemplo, Avolio y otros, J NeuroInmuno1 , 136:46-53, 2003, incorporado como referencia en este documento) .

De acuerdo con aspectos adicionales de la presente invención, por lo tanto, las composiciones electrocinéticas de la invención tienen utilidad sustancial para tratar, incluyendo el alivio y la prevención, los síntomas de la MS en los mamíferos afectados (preferentemente los seres humanos) .

De acuerdo con otros aspectos adicionales, las composiciones electrocinéticas de la invención se pueden administrar junto con al menos un agente terapéutico adicional de la MS tal como se describió en otras partes de este documento.

De acuerdo con aspectos adicionales de la presente invención, por lo tanto, las composiciones electrocinéticas de la invención tienen una utilidad sustancial para tratar, incluyendo el alivio y la prevención, los síntomas de las enfermedades inflamatorias neurodegenerativas (por ejemplo, Alzheimer, Parkinson, trastornos tipo Amiloidosis, tal como se definió en otras partes de este documento) en mamíferos afectados (de preferencia los seres humanos) .

Incorporación como referencia . Todas las patentes de los Estados Unidos anteriores, publicaciones de solicitud de patente de los Estados Unidos, solicitudes de patentes de los Estados Unidos, patentes extranjeras, solicitudes de patentes extranjeras y publicaciones no relacionadas con patentes referidas en esta descripción y/o listadas en la hoja de datos de la solicitud, se incorporan en este documento como referencia, en su totalidad.

Se debe entender que los dibujos y la descripción detallada en este documento deben ser considerados como ilustrativos y no restrictivos, y no se pretende limitar la invención a las formas particulares y ejemplos divulgados. Por el contrario, la invención incluye modificaciones adicionales, cambios, reorganizaciones, sustituciones, alternativas, opciones de diseño, y modalidades evidentes para las personas con conocimiento ordinario en la técnica, sin apartarse del espíritu y el alcance de esta invención, según lo definido por las siguientes reivindicaciones. De este modo, se pretende que las siguientes reivindicaciones se interpreten como que abarcan todas las modificaciones adicionales, los cambios, reorganizaciones, sustituciones, alternativas, opciones de diseño, y modalidades.

Las modalidades descritas anteriormente representan los diferentes componentes contenidos dentro de, o relacionados con, otros componentes diferentes. Se debe entender que tales arquitecturas representadas son simplemente ejemplares, y que, de hecho, muchas otras arquitecturas se pueden implementar lográndose la misma funcionalidad. En un sentido conceptual, cualquier arreglo de los componentes para lograr la misma funcionalidad está efectivamente "asociado" de manera que se logre la funcionalidad deseada. Por lo tanto, dos componentes cualesquiera de este documento combinados para lograr una funcionalidad particular se pueden ver como "asociados con" cada uno de los otros de manera que se logre la funcionalidad deseada, con independencia de las arquitecturas o componentes intermedios. Asimismo, dos componentes cualesquiera así asociados también se pueden ver como "operativamente conectados", u "operativamente acoplados", entre sí para lograr la funcionalidad deseada.

Mientras las modalidades particulares de la presente invención se han demostrado y descrito, será obvio para aquellos con conocimiento en la técnica que, en base a las enseñanzas en este documento, se pueden hacer cambios y modificaciones sin apartarse de esta invención y sus aspectos más amplios y, por tanto, las reivindicaciones adjuntas abarcan dentro de su alcance todos los cambios y modificaciones como si estuvieran dentro del verdadero espíritu y alcance de esta invención. Además, se debe entender que la invención está solamente definida por las reivindicaciones adjuntas. Se entenderá por aquellos dentro de la técnica que, en general, los términos usados en este documento, y especialmente en las reivindicaciones adjuntas (por ejemplo, el cuerpo de las reivindicaciones adjuntas) se consideran en general como términos "abiertos" (por ejemplo, el término "que incluye" debe ser interpretado como, "que incluye pero no se limita a", la expresión "que tiene" se debe interpretar como "que tiene al menos", el término "incluye" debe ser interpretado como "incluye pero no se limita a", etc) . Se entenderá además por aquellos dentro de la técnica que si se intenta un número específico de una declaración de reivindicación introducida, tal intento será declarado explícitamente en la reivindicación, y en ausencia de tal declaración no estará presente tal intento. Por ejemplo, como- ayuda para la comprensión, las siguientes reivindicaciones adjuntas pueden contener el uso de las frases introductorias "al menos uno" y "uno o más" para introducir las delaraciones en la reivindicación. Sin embargo, el uso de tales frases no debe ser interpretado como que implica que la introducción de una declaración de reivindicación por el artículo indeterminado "un" o "uno" limita cualquier reivindicación particular que contiene tal declaración de reivindicación introducida a las invenciones que contienen solamente dicha declaración, incluso cuando la misma reivindicación incluye las frases introductorias "uno o más" o "al menos uno" y los artículos indeterminados tales como "un" o "uno" (por ejemplo, "un" y/o "uno" se deben interpretar típicamente como que significan "al menos uno "o" uno o más"), lo mismo se aplica al uso de artículos definidos usados para introducir declaraciones de reivindicación. Además, incluso si un número específico de una declaración de reivindicación introducida es explícitamente declarado, las personas con conocimiento en la técnica reconocerán que la declaración deberá interpretarse típicamente como que significa al menos el número declarado (por ejemplo, la declaración estricta de "dos declaraciones " , sin otros modificadores, típicamente significa al menos dos declaraciones, o dos o más declaraciones) . En consecuencia, la invención no está limitada, excepto por las reivindicaciones adjuntas.

Claims (45)

NOVEDAD DE LA INVENCION Habiendo descrito el presente invento, se considera como una novedad y, por lo tanto, se reclama como prioridad lo contenido en las siguientes: REIVINDICACIONES

1. Un método para tratar una afección o enfermedad inflamatoria neurodegenerativa, que comprende administrar a un individuo que lo necesite, una cantidad terapéuticamente efectiva de un fluido acuoso alterado por electrocinética que comprende una solución acuosa iónica de nanoestructuras que contienen oxígeno estabilizadas por carga sustancialmente con un diámetro promedio de menos de aproximadamente 100 nanómetros y establemente configuradas en el fluido acuoso iónico en una cantidad suficiente para proporcionar, al contacto de una célula viva con el fluido, la modulación de al menos un potencial de membrana celular y conductividad de la membrana celular, donde se trata una enfermedad inflamatoria neurodegenerativa o al menos un. síntoma de ésta.

2. El fluido electrocinético de la reivindicación 1, donde las nanoestructuras que contienen oxígeno estabilizadas por carga son las principales especies de nanoestructuras que contienen gas estabilizadas por carga en el fluido.

3. El fluido electrocinético de la reivindicación 1, donde el porcentaje de moléculas de oxígeno disuelto presentes en el fluido como las nanoestructuras que contienen oxígeno estabilizadas por carga es un porcentaje seleccionado del grupo que consiste en más que: 0.01%, 0.1%, 1%, 5% , 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60% y 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90 % y 95%

4. El fluido electrocinético de la reivindicación 1, donde el total de oxígeno disuelto está sustancialmente presente en las nanoestructuras que contienen oxígeno estabilizadas por carga.

5. El fluido electrocinético de la reivindicación 1, donde las nanoestructuras que contienen oxígeno estabilizadas por carga sustancialmente tienen un diámetro promedio de menos que un tamaño seleccionado del grupo que consiste en: 90 nm, 80 nm, 70 nm, 60 nm, 50 nm, 40 nm , 30 nm, 20 nm, 10 nm, y menos que 5 nm.

6. El fluido electrocinético de la reivindicación 1, donde la solución acuosa iónica comprende una solución salina.

7. El fluido electrocinético de la reivindicación 1, donde el fluido es superoxigenado .

8. El fluido electrocinético de la reivindicación 1, donde el fluido comprende una forma de electrones solvatados.

9. El método de la reivindicación 1, donde la alteración del fluido acuoso alterado por electrocinética comprende la exposición del fluido a los efectos electrocinéticos localizados, inducidos por hidrodinámica.

10. El método de la reivindicación 9, donde la exposición a los efectos electrocinéticos localizados comprende la exposición a al menos uno de pulsos de voltaje y pulsos de corriente.

11. El método de la reivindicación 9, donde la exposición del fluido a los efectos electrocinéticos localizados, inducidos por hidrodinámica comprenden la exposición del fluido a los elementos estructurales que inducen el efecto electrocinético de un dispositivo usado para generar el fluido.

12. El método de la reivindicación 1, donde la afección o enfermedad inflamatoria neurodegenerativa comprende al menos una seleccionada del grupo que consiste en la esclerosis múltiple, esclerosis lateral amiotrófica, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, isquemia/derrame cerebral, traumatismo craneoencefálico, lesión de la médula espinal, enfermedad de Huntington, migraña, angiopatía amiloide cerebral, afección inflamatoria neurodegenerativa asociada con el SIDA, disminución cognitiva relacionada con la edad, deterioro cognitivo leve y las enfermedades por priones en un mamífero.

13. El método de la reivindicación 12, donde la afección o enfermedad inflamatoria neurodegenerativa comprende al menos uno de esclerosis múltiple, esclerosis lateral amiotrófica, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson.

14. El método de la reivindicación 13, donde la afección o enfermedad inflamatoria neurodegenerativas es la esclerosis múltiple.

15. El método de la reivindicación 1, donde al menos un síntoma de inflamación está relacionado con al menos una afección seleccionada del grupo que consiste en: inflamación crónica del sistema nervioso central y el cerebro, e inflamación aguda en el sistema nervioso central y el cerebro.

16. El método de la reivindicación 1, donde el fluido acuoso alterado por electrocinética modula los niveles localizados o celulares del óxido nítrico.

17. El método de la reivindicación 1, donde el fluido acuoso alterado por electrocinética promueve una disminución localizada en el sitio de administración de al menos una citoquina seleccionada del grupo que consiste en: IL-lbeta, IL-8, TNF-alfa, y TNF-beta.

18. El método de la reivindicación 1, que comprende además una inhibición o reducción sinérgica o no sinérgica de la inflamación por el tratamiento simultáneo o adyuvante del individuo con otro agente anti- inflamatorio.

19. El método de la reivindicación 10, donde dicho otro agente anti-inflamatorio comprende un esteroide o esteroide glucocorticoide .

20. El método de la reivindicación 19, donde el esteroide glucocorticoide comprende la budesonida o un derivado activo de ésta.

21. El método de la reivindicación 1, que comprende además la terapia de combinación, donde al menos un agente terapéutico adicional se administra al paciente.

22. El método de la reivindicación 21, donde al menos un agente terapéutico adicional se selecciona del grupo que consiste en acetato de glatiramer, interferón- ß , mitoxantrona, natalizumab, inhibidores de MMP incluyendo los inhibidores de MMP- 9 y MMP-2, agonistas ß2 de acción corta, agonistas ß2 de acción prolongada, anticolinérgicos , corticoides, corticoides sistémicos , estabilizadores de los mastocitos, modificadores de leucotrienos , metilxantinas , agonistas ß2, albuterol, levalbuterol, pirbuterol, artformoterol , formoterol, salmeterol, anticolinérgicos incluyendo ipratropio y tiotropio; corticosteroides incluyendo la beclometasona, budesonida, flunisolida, fluticasona, mometasona, triamcinolona, metiprednisolona, prednisolona, prednisona; modificadores de leucotrienos incluyendo montelucast, zafirlucast y zileuton; estabilizadores de mastocitos incluyendo cromolin y nedocromil; metilxantinas incluyendo teofilina; fármacos de combinación incluyendo ipratropio y albuterol, salmeterol y fluticasona, budesonida y formoterol; antihistamínicos incluyendo la hidroxicina, difenhidramina, loratadina, cetirizina, y la hidrocortisona; fármacos que modulan el sistema inmune incluyendo tacrolimus y pimecrolimus ; ciclosporina; azatioprina, micofenolatemofetil , y combinaciones de éstos.

23. El método de la reivindicación 21, donde al menos un agente terapéutico adicional es una TSLP y/o antagonista del TSLPR.

24. El método de la reivindicación 23, donde la TSLP y/o antagonista del TSLPR se selecciona del grupo que consiste en anticuerpos neutralizantes específicos para la TSLP y el receptor TSLP, moléculas solubles del receptor TSLP, y las proteínas de fusión del receptor TSLP, incluyendo las moléculas Fe de inmunoglobulina del TSLPR o los polipéptidos que codifican los componentes de más de una cadena del receptor.

25. El método de la reivindicación 1, donde alterar la estructura de la membrana celular o la función comprende la alteración de una conformación, actividad de unión de ligando, o una actividad catalítica de una proteína asociada a la membrana.

26. El método de la reivindicación 25, donde la proteína asociada a la membrana comprende al menos uno seleccionado del grupo que consiste en los receptores, los receptores transmembrana, las proteínas de los canales iónicos, las proteínas intracelulares de anclaje, las proteínas de adhesión celular, integrinas, etc.

27. El método de la reivindicación 26, donde el receptor transmembrana comprende un receptor acoplado a proteína G (GPCR) .

28. El método de la reivindicación 27, donde el receptor acoplado a la -proteína G (GPCR) interactúa con la subunidad a de la proteína G.

29. El método de la reivindicación 28, donde la subunidad OÍ de la proteína G comprende al menos uno seleccionado del grupo que consiste en Gas, Gai, Gaq y Gal2 ,

30. El método de la reivindicación 29, donde al menos una subunidad o¡ de la proteína G es Gaq.

31. El método de la reivindicación 1, donde alterar la estructura de la membrana celular o la función comprende la alteración de la conductividad de la membrana o del potencial de membrana.

32. El método de la reivindicación 31, donde modular la conductividad de la membrana celular, comprende modular la conductancia de la célula entera.

33. El método de la reivindicación 32, donde modular la conductancia de la célula entera, comprende modular al menos una contribución dependiente de voltaje de la conductancia de la célula entera.

34. El método de la reivindicación 1, donde modular la señal de transduccion intracelular comprende modular la vía o sistema del mensajero celular dependiente de calcio.

35. El método de la reivindicación 1, donde modular la señal de transduccion intracelular comprende modular la actividad de la fosfolipasa C.

36. El método de la reivindicación 1, donde modular la señal de transduccion intracelular comprende modular la actividad de la adenilato ciclasa (AC) .

37. El método de la reivindicación 1, donde modular la señal de transduccion intracelular comprende modular la transduccion de la señal intracelular asociada con al menos una afección o síntoma seleccionado del grupo que consiste en: la inflamación crónica en el sistema nervioso central y el cerebro, y la inflamación aguda en el sistema nervioso central y el cerebro.

38. El método de la reivindicación 1, que comprende la administración a una capa o red celular, y comprende, además, la modulación de una unión intercelular dentro de ésta.

39. El método de la reivindicación 38, donde la unión intracelular comprende al menos una seleccionada del grupo que consiste en uniones herméticas, uniones comunicantes, unión adherente y desmosomas .

40. El método de la reivindicación 1, donde las capas o red celular abarcan al menos una seleccionada del grupo que consiste en la célula endotelial y las uniones herméticas de astrocitos con el endotelio de los vasos del NCS, uniones o barreras herméticas de líquido cefalorraquídeo con la sangre, uniones tipo epitelio pulmonar, uniones tipo epitelio bronquial, y las uniones tipo epitelio intestinal.

41. El método de la reivindicación 1, donde el fluido acuoso alterado por electrocinética se oxigena, y donde el oxígeno en el fluido está presente en una cantidad de al menos 8 ppm, al menos 15 ppm, al menos 25 ppm, al menos 30 ppm, al menos 40 ppm, al menos 50 ppm, o al menos 60 ppm de oxígeno a presión atmosférica.

42. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 41, donde el fluido acuoso alterado por electrocinética comprende al menos uno de una forma de electrones solvatados y modificados por electrocinética o especies de oxígeno cargadas .

43. El método de la reivindicación 42, donde los electrones solvatados o modificados por electrocinética o las especies de oxígeno cargadas están presentes en una cantidad de al menos 0.01 ppm, al menos 0.1 ppm, al menos 0.5 ppm, al menos 1, al menos 3 ppm, al menos 5 ppm, al menos 7 ppm, al menos 10 ppm, al menos 15 ppm, o al menos 20 ppm.

44. El método de la reivindicación 43, donde el fluido acuoso oxigenado alterado por electrocinética comprend los electrones solvatados estabilizados, al menos en parte, por el oxígeno molecular.

45. El método de la reivindicación 1, donde la capacidad para alterar la estructura de la membrana celular o la función suficiente para proporcionar la modulación de transducción intracelular de la señal persiste por al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco, al menos 6, al menos 12 meses, o períodos más largos, en un recipiente de gas herméticamente cerrado. RESUMEN DE LA INVENCION Se proporcionan fluidos alterados por electrocinética (fluidos electrocinéticos enriquecidos con gas) que comprenden una solución acuosa iónica de nanoestructuras que contienen oxígeno estabilizadas por carga en una cantidad suficiente para proporcionar la modulación de al menos un potencial de membrana celular y conductividad de la membrana celular, y las composiciones terapéuticas y los métodos para su uso en el tratamiento de afecciones o enfermedades inflamatorias neurodegenerativas o al menos un síntoma de éstas. Las composiciones terapéuticas y los fluidos alterados por electrocinética y los métodos incluyen los fluidos acuosos iónicos alterados por electrocinética opcionalmente en combinación con otros agentes terapéuticos. Aspectos particulares proporcionan la regulación o la modulación de la transducción de la señal intracelular asociada con dicha respuesta inflamatoria por la modulación de al menos una de las membranas celulares, potencial de membrana, proteínas de la membrana tales como los receptores de membrana, que incluyen pero no se limitan a los receptores acoplados a las proteínas G (GPCR) , y uniones intercelulares (por ejemplo, uniones herméticas, uniones comunicantes, unión adherente y desmosomas) . Otras modalidades incluyen las rutas particulares de administración o las formulaciones de los fluidos alterados por electrocinética (por ejemplo, los fluidos y soluciones enriquecidos con gas alterados por electrocinética) y las composiciones terapéuticas.