MX2009013602A - Dispositivo para recuperacion continua de bioparticulas mediante sistemas de dos fases acuosas y metodo de operacion. - Google Patents

Abstract

La presente invención es un dispositivo para recuperación continua de biopartículas mediante sistemas de dos fases acuosa y método de operación, el cual es llevado a cabo en marcha permanente o intermitente y se relacionaron la partición, separación y/o recuperación de proteínas y compuestos biológicos y no biológicos, de interés alimenticio, farmacéutico e industrial, mediante el uso de sistemas de dos fases acuosas en sistemas continuos. El dispositivo está caracterizado porque, además de todos los beneficios que poseen los sistemas de dos fases acuosas en su uso para recuperación primaria de biocompuestos , el presente invento permite permite un flujo continuo. No requiere de una fase dispersa y una fase continua y no presenta problemas de sobre flujo, ya que las velocidades pueden ser variadas fácilmente. La conformación es ergonómica, por lo que puede emplear la misma cantidad de volúmenes, en menor cantidad de espacio. El sistema no cambia con respecto al tipo de polímeros o sales empleados y es más selectivo, y permite la recirculación de las fases dentro del dispositivo. Con el presente dispositivo, se prescinde de operaciones unitarias como centrifugación, agitación y decantación, lo que permite una recuperación biopartículas con mayor eficiencia que los procesos de recuperación mediante sistemas de dos fases acuosas conocidos. Que llevan a cabo cada operación unitaria en dispositivos o equipos independientes, y además facilita la recuperación de cada una de las fases del sistema de dos fases acuosas, ahorra energía y reduce el tiempo de operación.

Description

DISPOSITIVO PARA RECUPERACION CONTINUA DE BIOPARTICULAS MEDIANTE SISTEMAS DE DOS FASES ACUOSAS Y METODO DE OPERACION DESCRIPCIÓN CAMPO DE LA INVENCIÓN La invención se relaciona con la partición, separación y/o recuperación de proteínas y compuestos biológicos y no biológicos, de interés alimenticio, farmacéutico o industrial, mediante el uso de sistemas de dos fases acuosas en sistemas continuos.

OBJETO DE LA INVENCIÓN Corresponde a un dispositivo para recuperación continua de bioparticulas mediante sistemas de dos fases acuosas; y el método de operación del mencionado dispositivo, caracterizado por ser de operación continua.

ANTECEDENTES Actualmente los bioprocesos se caracterizan por tener un gran número de etapas, lo cual provoca una considerable pérdida del producto de interés y un aumento en los costos de operación. Por ello, es necesaria la implementación de técnicas eficientes, efectivas y económicas a gran escala, que permitan alta pureza y recuperación, que mantenga además, la actividad biológica del producto de interés y que a su vez, sean económicamente factibles (Cunha y Aires-Barros, 2002).

Entre dichos procesos de separación no convencionales se encuentran los sistemas de dos fases acuosas (SDFA), un método eficiente para recuperar, purificar y concentrar productos de interés comercial. A partir de los años 50 's se ha demostrado su potencial para separar componentes celulares (Albertson, 1956), y a la fecha se han realizado numerosos estudios acerca del comportamiento de diversas partículas en estos sistemas (Rito-Palomares, 2004; Cunha y Aires-Barros, 2002; Johansson and Walter, 2000). El empleo de SDFA en el desarrollo de procesos para la recuperación de productos biológicos, ya ha sido caracterizada, en cuanto al efecto de los parámetros del sistema y del proceso sobre el comportamiento de partición del producto de interés (Rito-Palomares, 2004).

Unas de las principales ventajas de los SDFA es que están compuestos principalmente por agua (alrededor del 90% de cada fase), tienen baja tensión interfacial y requieren un mínimo de energía, lo cual los hace compatibles con los sistemas biológicos y que la recuperación de estos sea en su forma nativa, es decir, conservando sus estructuras y funciones específicas (Cueto, 1999). Adicionalmente los SDFA son procesos fáciles de operar y factibles de escalar, generan gran rendimiento del producto, lo cual a su vez reduce el número de operaciones unitarias del proceso, produce bajos costos de inversión y operación, y pueden ser llevados en forma continua (Huddleston, et al, 1991).

Un SDFA se forma al mezclar determinadas concentraciones de dos sustancias inmiscibles, dando lugar a una fase superior y otra inferior, separadas por una interfase.

Por lo general, en una mezcla de compuestos, el producto de interés tiene preferencia por una de las fases que componen al SDFA, mientras que el resto de los componentes, denominados contaminantes, la tiene por la otra fase, o bien son concentrados en la interfase. La presencia de estos últimos, sin embargo, afecta el comportamiento del producto de interés ya sea interactuando directamente con éste o saturando al sistema (Benavides, 2006). Por lo anterior, existen parámetros de los SDFA que juegan un papel clave durante la partición del producto de interés por alguna de las fases. Benavides y Rito-Palomares (2008), proponen 4 pasos principales para la formación de SDFA: A) Caracterización fisicoquímica del producto y los contaminantes principales a. Peso molecular b. Punto isoeléctrico c. Características hidrofóbicas B) Selección del tipo de SDFA a. Polímero-sal b. Polímero-polímero c. SDFA alternativos C) Selección de los parámetros del sistema a. Peso molecular b. LLC c VR d. pH D) influencia de los parámetros del proceso sobre la recuperación/pureza del producto a. Tamaño de carga b. Adición de sales neutras c. Adición de químicos d. Etapas consecutivas de SDFA e. Geometría del sistema Existen sistemas formados por dos sustancias poliméricas como Polietilénglicol (PEG) -Dextrano o PEG - Polivinil, éstos han sido utilizados para separar células vegetales (Edahiro et al, 2005) y para la recuperación in situ de enzimas (I vánova et al, 2001). Sin embargo, desde el punto de vista económico estos sistemas son desfavorables a escala industrial debido a los altos costos de los polímeros, por lo que preferentemente se emplean sales como componentes del sistema.

La formación de un SDFA está descrita por un diagrama del equilibrio donde a la línea que separa la región monofásica de la bifásica se le conoce como curva binodal. Cada punto de la región está compuesto por diferentes concentraciones de polímero-sal, las combinaciones de concentraciones que se ubican por debajo de la curva binodal forman una fase heterogénea, mientras que las que están por arriba forman un sistema de dos fases. Existen numerosos compendios que explican el procedimiento para la obtención de curvas binodales y longitud de línea de corte (Hatti-Kaul, 2001), así como curvas previamente elaboradas, que pueden ser consultadas para ahorro de tiempo (Zaslavsky, 1995).

La longitud de línea de corte (LLC) describe la composición de un SDFA en función de la concentración de los componentes en cada una de las fases. Se pueden encontrar varios sistemas sobre la misma LLC, pues aunque poseen composiciones idénticas en cada una de sus fases (superior e inferior), éstas difieren en su relación de volúmenes. La relación de volúmenes (V ) de un SDFA se define como la relación del volumen de la fase superior entre el volumen de la fase inferior. El VR puede ser igual a uno cuando los volúmenes de ambas fases son iguales, mayor a uno cuando el volumen de la fase superior es mayor, y menor a uno cuando el volumen de la fase inferior es mayor.

El peso molecular del polímero también influye en el comportamiento de partición del producto de interés debido a los fenómenos de hidrofobicidad y volumen excluido. Polímeros de alto peso molecular causan un aumento en la hidrofobicidad, lo cual disminuye la afinidad del polímero por el agua. La mayoría de las proteínas son hidrosolubles, de tal forma que al haber mayor hidrofobicidad en la fase poliméríca éstas migrarán hacia la fase salina (inferior) o a la interface. Un aumento en el peso molecular de polímero aumenta también el volumen excluido, es decir, disminuye el volumen libre, lo cual representa una barrera para las moléculas que intentan particionarse hacia la fase poliméríca (superior) (Huddleston et al, 1991; Benavides, 2006). El pH global del sistema afecta la carga electroquímica superficial de los compuestos a particionarse, lo cual hace posible que los SDFA puedan separar proteínas homologas con carga distinta. En los sistemas PEG-fostato de potasio la fase poliméríca posee carga positiva y por lo tanto aquellos compuestos que tengan mayor carga neta negativa tendrán más afinidad por esta fase.

En los últimos 10 años en el área biotecnológica ha crecido el interés por los SDFA como método de recuperación primaria y de purificación parcial de productos de, interés comercial, entre ellos, enzimas, proteínas, proteínas virales, compuestos aromáticos, pigmentos, entre otros (Benavides, 2006).

En 1998, Salamanca y colaboradores publicaron un estudio en el que emplearon un extracto de cultivo de Bacillus subtilis para caracterizar la cinética de separación de fases en un sistema PEG/sulfato, variando la LLC, investigando además, el comportamiento de dicho sistema de manera batch o continua, con la presencia o ausencia del extracto. Ellos diseñaron tres tipos de entrada al tanque de separación continuo con capacidad para 1400g: cuadrado, cuadrado con deflector y prismático. La velocidad de separación de fases fue menor en el sistema continuo que en el sistema batch, además, con la presencia del extracto, disminuía aún más la velocidad de separación de fases en el sistema continuo (Salamanca et al, 1998).

Argumentando la falta de desarrollo en ingeniería, optimización y diseño de plantas piloto y escalamiento de los SDFA, en 1999, un equipo dirigido por Huenupi y Asenjo publicó otro estudio sobre sistemas continuos. Emplearon el mismo extracto de Bacillus, para extracción de a-amilasa, y establecieron la optimización del sistema en función de la pureza, recuperación y concentración de la proteína de interés, así como el costo generado del proceso completo, compuesto en un 30-70% por la producción, 10-20% de la extracción con SDFA, 10-30% concentración y 10-50% purificación. En éste sistema, los equipos de separación de fases, consistieron en tanques de decantación.

La fase rica en PEG fue recirculada. El estudio resultó en rápidos tiempos de separación de fase, producto de la concentración inicial de NaCl, y el radio entre los flujos de entrada de alimentación y de solvente fresco (fase rica en sal) hacia los tanques de separación, y por lo tanto del VR. Todos los parámetros anteriores, son importantes para el diseño de los equipos empleados (Huenupi y Asenjo, 1999).

El mismo año, Walker y Lyddiatt emplearon los SDFA debido a la relativa simplicidad, alta capacidad y escalabilidad del sistema, para la recuperación de nanopartículas, específicamente de a-glucosidasa contenida en cuerpos de inclusión de 150 nm a partir de homogenizados de E. coli. Comparando positivamente la pureza obtenidá contra otros procesos de purificación como centrifugación diferencial y ultracentrifugación, demostraron el uso potencial de estos sistemas, para la recuperación a gran escala de virus, plásmidos y vacunas, entre otras (Walker y Lyddiatt, 1999).

Hatti-Kaul menciona que los SDFA tienen una tensión interfacial extremadamente baj de 0.0001 a 0.1 dinas/cm, a comparación de los sistemas convencionales de agua y solventes orgánicos (1 a 20 dinas/cm). Esto permite la formación de un área de contacto interfacial lo suficientemente grande para producir una transferencia de masa eficiente (la base de separación en SDFA consiste en la distribución selectiva de las sustancias entre las dos fases). Menciona que el escalamiento de la extracción con SDFA a niveles industriales, ha sido posible sólo gracias al uso de equipos de extracción convencionales usados para sistemas acuosos orgánicos empleados en la industria química.

Valcárcel y Luque de Castro mencionan diversas técnicas para el diseño de sistemas de separación líquido-líquido (1991) para aplicaciones analíticas. Otras aplicaciones que implementan los SDFA son: la partición por multietapas por distribución a contracorriente, la cromatografía de partición líquido-líquido para la recuperación de productos en biotecnología, la integración de etapas de clarificación, concentración y purificación parcial, la bioconversión extractiva y la remediación medioambiental (Hatti-Kaul, 2001).

Todos esos años, el reciclado y bajo costo de los químicos para elaborar las fases, fueron los puntos clave de su implementación, por lo cual los SDFA compuestos por PEG-sal fueron los más empleados a nivel industrial. Además su baja tensión interfacial permitían un corto tiempo de separación de fases (Hatti-Kaul, 2001). No fue sino hasta el 2002, en el que las autoras Cunha y Aires-Barros, elaboraron un reporte de los protocolos empleados a nivel industrial para el uso de SDFA, con los equipos existentes hasta entonces: • Separadores por etapas a. Mezcladores y mezcladores-sedimentadores i. Centrífugas mezcladoras con discos , ii. Separadores de columna iii. Columnas con platos perforados b. Separador con discos rotatorios perforados (SDRP) c. Columna de Kühni d. Columna de York-Scheibel e. Separadores diferenciales • Separadores de columna a. Columna de spray b. Columna empacada c. Separadores rotatorios horizontales • Separadores de fuerza centrifuga a. Extractor Podbielniak b. Chromatografía centrifuga líquido-liquido i. Cromatografía centrífuga de partición ii. Cromatografía centrífuga de bobina iii. Centrífuga de bobina axial Los aparatos mencionados, por lo general se componen de la columna y de una o dos bombas peristálticas. Se inyectan las fases a un determinado flujo, con las bombas previamente calibradas, y la columna se llena según el radio de volúmenes deseados, y a contracorriente o dejando una de las fases estacionaria. En experimentos de extracción, una de las fases ya tiene el extracto crudo. Después de arrancar la columna, se presenta un estado de equilibrio, es decir, la estabilización de la altura de dispersión (Cunha y Aires-Barros, 2002).

Dichas autoras mencionan que la aplicación a larga escala se encuentra principalmente limitada por el entendimiento teórico del equilibrio de fases y partición de proteínas, la selectividad de los sistemas y el costo de polímeros.

También que para el diseño de columnas de escala comercial, se requiere tener datos previos sobre parámetros como: coeficientes de transferencia de masa, coeficiente de partición de las proteínas, parámetros hidrodinámicos de retención de la fase dispersa, tamaño de gota, velocidad, recirculación de las fases, y capacidad del mezclado. Éstos además son dependientes de la velocidad de las fases, sus propiedades físicas (viscosidad, densidad y tensión interfacial) y de la geometría de la columna (Cunha y Aires-Barros, 2002). : En el estudio de Cunha et al (2003), se comparó el uso de SDFA en batch y en continuo, en la extracción de proteínas extracelulares de Fusárium solani pisi. Se empleó un prototipo experimental que consiste en una SDRP elaborada de vidrio, con un área de cruce seccional interno de 804 mm y un área de cruce seccional expandida de 5542 mm . Dichas medidas se diseñaron con el objetivo de evitar derramar líquido al aumentar los flujos de entrada (inundación de la columna). Las fases se alimentaron a la columna por medio de gravedad, indicando los flujos a través de un rotámetro, y controlando el flujo mediante válvulas de acero inoxidable. La columna fue colocada en una chaqueta de enfriamiento y mantenida a 20°C. Se empleó un rotor de agitación para los platos, dirigido con un motor a 170 rpm, medido con un tacómetro portable. Tanto en el experimento batch como en el continuo, se agregó hasta 60% de caldo de cultivo directamente. El sistema continuo tuvo una capacidad de separación 2.5 veces mayor a la de el batch. A través de la integración de dicho sistema con la recombinación de la especie Saccharomyces cereyisiae, se logró obtener de 5 a 6 veces más productividad (Cunha et al, 2003).

Simón y Gautam (2004), trabajaron en un modelo matemático teórico para sistemas continuos de un solo paso. Mencionan que una de las ventajas de estos sistemas sobre el sistema batch, es que provee un corto tiempo de residencia, usa condiciones extremas de pH y relativamente altas temperaturas con poca pérdida de actividad de la proteína. Los últimos dos pueden ser controlados, lo que es atractivo desde un punto de vista industrial. Comenzando lo que sería un control sobre el tiempo de los valores de diferentes variables, que ayudarían a un control dinámico de extractores comerciales a gran escala, usando esquemas de control avanzado (Simón y Gautam, 2004).

Calvacanti et al (2008), mencionan que el empleo de centrífugas a escala comercial, para disminuir el tiempo de separación de fases que se observa en tanques de sedimentación o separación por gravedad, tiene un alto costo, por lo que el uso de columnas de extracción es más favorable. Se menciona que la selección de la columna depende de las propiedades de las biomoléculas, como hidrofobicidad, tamaño y conformación molecular, electroquímica. El artículo de los mencionados autores se centra principalmente en el empleo de una columna tipo SDRP debido a que su configuración ha demostrado una mayor eficiencia y mejor flexibilidad operacional que las convencionales. En el estudio se seleccionaron cuatro variables dependientes: tiempo de retención, coeficientes de transferencia de masa, eficiencia de la separación y factor de purificación, en respuesta a flujo de la fase dispersa, flujo de la fase continua y velocidad de rotación de los discos. Los resultados preliminares de dicho estudio, no permitieron la selección de condiciones óptimas para la extracción continua de la toxina en cuestión, debido al sobre flujo bajo ciertas condiciones de alimentación.

Sin embargo, son prometedoras para la optimización futura del proceso, el cual será empelado en escalamientos sucesivos de dicho proceso de purificación para la producción de una vacuna animal (Calvacanti et al, 2008).

Por último, una idea semejante a la de la presente invención, fue presentada en el 2008 por Meagher et al. Empleando un sistema continuo de SDFA, para la separación de proteínas etiquetadas genéticamente, provenientes de Usado de células de E. coli. Se obtuvo la remoción de aproximadamente 85% de las proteínas contaminantes. El proceso operaba en continuo, sin requerir ningún otro paso de purificación ni cromatografía. Sin embargo, dicho prototipo sólo funciona para cantidades micrométricas de alimentación.

Además de todos los beneficios mencionados, que poseen los sistemas de dos fases acuosas en su uso para recuperación primaria de biocompuestos, el presente invento tiene la característica de permitir un flujo continuo. No requiere de una fase dispersa y una fase continua y no presenta problemas de sobre flujo, ya que las velocidades pueden ser variadas fácilmente. No es necesaria la adición de agitadores ni centrífugas. El diseño es más ergonómico que el de una columna, por lo que puede emplear la misma cantidad de volúmenes, en una menor cantidad de espacio. El diseño del sistema no cambia con respecto al tipo de polímeros o sales empleados, es decir, la composición de las fases y sus propiedades, no alteran la elección del tipo de equipo. Finalmente, el diseño propuesto es más selectivo, por lo que la totalidad de las fases no se contamina con la muestra de interés y el resto de las mismas puede ser nuevamente circulado dentro del dispositivo.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Figura 1. Representación esquemática del Dispositivo para recuperación continua de biopartículas mediante sistema de dos fases acuosas (vista lateral).

Figura 2. Representación esquemática de un conector rígido de entrada.

Figura 3. Representación esquemática de un dispositivo de turbulencia, en la modalidad de \ ducto con cuerpos sólidos en su interior.

Figura 4. Representación esquemática de un dispositivo de turbulencia con hendiduras y dobleces irregulares y un conector rígido de entrada formando un solo cuerpo.

Figura 5. Representación esquemática del ducto de retención en arcos, confinado en un material rígido.

Figura 6. Representación esquemática del conector rígido de salida con un ducto de entrada y dos ductos de salida.

Figura 7. Representación esquemática de un conector de unión con diámetro de entrada diferente al diámetro de salida. | Figura 8. Cinética de partición de colorante azul en un sistema continuo de dos fases acuosas, empleando la configuración sin generador de turbulencia del dispositivo.

PEGIOOO-Fosfato de potasio, pH 7, VR 1, LLC 34.38% (p/p). (- - -) Fase superior, ( ) Fase inferior.

Figura 9. Cinética de partición de colorante azul en un sistema continuo de dos fases acuosas empleando una configuración con generador de turbulencia del dispositivo.

PEGIOOO-Fosfato de potasio, pH 7, VR 1, LLC 34.38% (p/p). (- - -) Fase superior, ( ) Fase inferior.

Figura 10. Cinética de partición de colorante azul en un sistema continuo de dos fases acuosas empleando una configuración con generador de turbulencia del dispositivo.

PEGIOOO-Fosfato de potasio, pH 7, VR 1, LLC 34.38% (p/p). (- - -) Fase superior, ( ) Fase inferior.

Figura 1 1. Cinética de partición de cristal violeta en un sistema de fases acuosas construido en tubos de centrífuga de 50 mL. PEGIOOO-Fosfato de potasio, pH 7, VR 1, LLC 34.38% (p/p). ( ) Fase superior, ( ) Fase inferior.

Figura 12. Cinética de partición de cristal violeta en un sistema continuo de dos fases acuosas, empleando una de las configuraciones del dispositivo. PEGIOOO-Fosfato de potasio, pH 7, VR 1, LLC 34.38% (p/p). (— ) Fase superior, ( ) Fase inferior.

Figura 13. Cinética de partición de cristal violeta en un sistema continuo de dos fases acuosas empleando una de las configuraciones del dispositivo. PEGIOOO-Fosfato de potasio, pH 7, VR 1, LLC 34.38% (p/p). (— ) Fase superior, (— ) Fase inferior.

Figura 14. Cinética de partición de Albúmina de Suero Bovino en un sistema de dos fases acuosas construido en tubos de 50mL. PEGIOOO-Fosfato de potasio, pH 7, VR 1, LLC 34.38% (p/p). ( ) Fase superior, ( ) Fase inferior.

Figura 15. Cinética de partición de Albúmina de Suero Bovino en un sistema continuo de dos fases acuosas, empleando una de las configuraciones del dispositivo. PEGIOOO-Fosfato de potasio, pH 7, VR 1, LLC 34.38% (p/p). (— ) Fase superior, ( ) Fase inferior.

Figura 16. Representación esquemática del conector rígido de salida con un ducto de entrada y tres ductos de salida.

Figura 17. Representación esquemática de un dispositivo de turbulencia con hendiduras y dobleces irregulares y un conector rígido de entrada formando un solo cuerpo.

Figura 18. Representación esquemática de un dispositivo de turbulencia, en la modalidad de ducto con cuerpos sólidos en su interior, ensamblado con el conector rígido de entrada. Figura 19. Representación esquemática del generador de turbulencia con seis subunidades conectadas en serie.

Figura 20. Representación esquemática del generador de turbulencia con tres subunidades conectadas en serie.

Figura 21. Representación esquemática del Dispositivo para recuperación continua de biopartículas mediante sistema de dos fases acuosas (vista superior).

Figura 22. Fotografía del sistema de dos fases acuosas corriendo en el Dispositivo para recuperación continua de biopartículas, donde se observa la partición de cristal violeta (vista lateral del ducto de retención).

Figura 23. Fotografía del sistema de dos fases acuosas corriendo en el Dispositivo para recuperación continua de biopartículas, donde se observa la partición de cristal violeta (vista lateral del conector rígido de salida).

Figura 24. Fotografía del sistema de dos fases acuosas por lote construido en tubos de centrífuga de 50 mL, donde se observa la partición de cristal violeta.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN El dispositivo para recuperación continua de biopartículas mediante sistemas de dos fases acuosas y método de operación (ver figura 1 y figura 21), motivo de esta invención está conformado por (1): a) Al menos dos contenedores para el almacenamiento de cada una de las fases que conformarán el sistema de dos fases acuosas (2). La muestra de interés (que opcionalmente es una proteína, mezcla de proteínas o extractos) de la que se separarán las biopartículas, opcionalmente puede estar contenida en una de las fases' o bien alimentarse al sistema mediante un contenedor adicional de cualquier tipo. b) Al menos un sistema de bombeo, por ejemplo una bomba peristáltica con control de flujo que succiona e impulsa el líquido en cada uno de los contenedores anteriormente descritos, de manera independiente (3). Las bombas están situadas, secuencialmente, enseguida de los contenedores para almacenamiento de cada una de las fáses que conforma el sistema de dos fases acuosas. Si la viscosidad y densidad de los líquidos dé los contenedores es similar y se decide que el radio de volúmenes (VR) requerido es aproximadamente 1 , con una sola bomba acoplada a un tipo adecuado de cabezal es suficiente para un número indeterminado de tuberías, siendo así que se puede controlar pluralidad de contenedores a un mismo flujo. Sin embargo, si la viscosidad y densidad de los líquidos de los contenedores son diferentes o el VR es diferente a 1 , se prefiere emplear una bomba para cada contenedor. c) Un conector rígido de entrada, (ver figura 2) manufacturado de cualquier material que no interactúe con los componentes del sistema, opcionalmente de vidrio o plástico, que es alimentado por el sistema de bombeo, preferentemente bombas peristálticas (4). La geometría ,de este conector puede variar, pero siempre considerando que tiene un número de entradas coincidente con el número de contenedores y una salida que desemboca preferentemente en un generador de turbulencia.

A cada entrada (1 1) y salida (12) de este conector rígido se ensambla un ducto de material flexible (opcionalmente silicón o nylon) (10), de tal manera que si el conector rígido tiene dos entradas a cada una se le conectará un ducto por donde circula el líquido proveniente de cada uno de los contenedores; y un ducto de salida (13) a la salida del conector rígido. La longitud de cada ducto de entrada depende de la distancia entre el conector rígido de entrada y los contenedores respectivos; y la longitud del ducto de salida depende de la distancia entre el conector rígido y el generador de turbulencia. El diámetro interno de cada ducto de entrada y salida opcionalmente son iguales o diferentes, dependiendo de la relación de volumen de cada uno de los líquidos y la muestra que conformará el sistema de dos fases acuosas, Un generador de turbulencia (ver figura 3 y 4), en donde se realiza el mezclado de las dos fases acuosas del sistema. Este generador de turbulencia se encuentra después del contenedor rígido de entrada (5). Dicho generador de turbulencia es un ducto (ver figura 3), de un material que no interactúe con los componentes del sistema, de vidrio o plástico; opcionalmente tiene hendiduras y dobleces irregulares (ver figura 4), y en su interior opcionalmente tiene cuerpos sólidos de geometría variable de un material inerte (16), para evitar la interacción química con las fases del sistema (por ejemplo perlas de vidrio) para inducir la turbulencia y promover la transferencia del compuesto de interés hacia la fase por la cual tiene mayor afinidad. Cabe señalar que dichos cuerpos sólidos deben permitir el fluir de las fases acuosas.

La longitud del generador de turbulencia (19) depende del tiempo requerido para particionar una biopartícula, teniendo que si una determinada biopartículas particiona en una hora, la longitud del generador de turbulencia preferentemente tiene una longitud no mayor a 30 cm. El diámetro a la entrada y salida del generador de turbulencia (15) coincide con el diámetro de la salida del conector rígido de entrada. El generador de turbulencia se une a través de conexiones macho-hembra opcionalmente al conector rígido de entrada (ver figura 18); o en serie, a otro generador de turbulencia para incrementar la longitud (ver figura 21). Opcionalmente, el conector rígido de entrada y el generador de turbulencia forman un solo cuerpo (ver figuras 4 y 19): Un ducto de retención, como su nombre lo indica va a retener en su interior la mezcla de las fases acuosas y la biopartículas que conforman el sistema (6). Es de un material que carece de afinidad por la biopartículas y las fases del sistema, que resiste sin degradarse el paso de las fases acuosas y es resistente a un amplio rango de temperaturas, por lo que opcionalmente es de plástico rígido o semirrígido, preferentemente PVC; vidrio; metal, preferentemente acero inoxidable; polietileno reticulado; o con multicapas; que incluyen materiales como polipropileno, polietileno de alta densidad, poliuretano y láminas de aluminio o acero. ^ Su interior, consiste de una pared lisa y continua, para permitir el libre fluir de las fases acuosas y promover la separación de éstas, manteniendo en equilibrio el contenido de biopartículas presente en cada una de las fases. El ducto opcionalmente tiene un arreglo en horizontal respecto al suelo, opcionalmente recto o formando arcos (ver figura 5) para evitar la turbulencia de las fases, en el interior del ducto. En el caso de formar arcos (23), este ducto puede adoptar una geometría tipo zig-zag o espiral, y en esta ultima geometría, preferentemente el ángulo de inclinación del ducto, en cada vuelta es igual o menor a su diámetro.

Considerando que a longitudes mayores se prefiere que el ducto adopte geometrías con arcos (en zig-zag o espiral), esto para minimizar el área ocupada por este ducto, y para evitar la deformación de la geometría que incluye arcos, se sujeta o confina con material rígido (26), opcionalmente en una caja de acrílico o acero inoxidable, que opcionalmente tiene un control de temperatura. La entrada (25) del ducto de retención se conecta al generador de turbulencia (5), y la salida (29) del ducto de retención se conecta a un conector rígido de salida (7); sin embargo el diámetro del ducto de retención opcionalmente es igual, pudiendo ser mayor o menor. El diámetro y longitud del ducto de retención es variable de al menos 50 cm de longitud y al menos 0.5 cm, considerando que: -a una mayor longitud, se prefiere un menor diámetro, y -a una menor longitud, se prefiere un mayor diámetro.

Un conector rígido de salida, que se ensambla a la salida del ducto de retención (7), fabricado de cualquier material que no interactúe con los componentes del sistema, opcionalmente de plástico o vidrio. El conector rígido de salida, está conformado por una entrada (39), un cuerpo con un espacio físico mayor que la entrada y se separa en al menos dos salidas (34), para permitir que por cada salida fluye de manera independiente la fase superior, la fase inferior o la interfase (ver figura 6 y figura 16). El diámetro de la boquilla de entrada de este conector rígido de salida (38), debe ser tal que embone con la salida del ducto de retención (31). El diámetro de las boquillas de salida puede ser diferente al diámetro de la boquilla de entrada e independientes entre sí. g) Cada boquilla de salida se extiende mediante un ducto de un material flexible que no interactúe con los componentes del sistema (40), por donde los flujos de cada fase desembocan independientemente en contenedores de recolección (8). Opcionalmente se pueden emplear pinzas, válvulas, abrazaderas, o estranguladores de flujo para dichos ductos, con el fin de controlar la cantidad de fluido a recolectar y también evitar que el fluido se regrese. h) Opcionalmente, se emplean conectores de unión (ver figura 7), pueden ser de vidrio, acero inoxidable, plástico nylon, polipropileno o polietileno de alta densidad, o cualquier material rígido y con cualquier tipo de recubrimiento que sean estables y no reaccionen con los componentes del sistema, y que opcionalmente tiene un diámetro de entrada (42) diferente al diámetro de salida (43) o ambos el mismo diámetro, y son ajustables a los diámetros de entrada del generador de turbulencia y la entrada del ducto de retención.

En el dispositivo para recuperación continua de biopartículas mediante sistemas de dos fases acuosas, motivo de esta invención y descrito anteriormente; el método de operación se caracteriza porque: a) es llevado a cabo de manera continua, b) en un mismo dispositivo se lleva a cabo la recuperación primaria continua de biopartículas, sin requerir centrifugación, agitación y decantación, lo que permite una recuperación biopartículas con mayor eficiencia que los procesos de recuperación mediante sistemas de dos fases acuosas conocidos, que llevan a cabo cada operación unitaria en dispositivos o equipos independientes. c) facilita la recuperación de cada una de las fases del sistema de dos fases acuosas, disminuyendo con esto la probabilidad de contaminación de una fase por la otra, d) Se puede implementar en diferentes escalas como nivel laboratorio, escala piloto e industrial, a diferencia de algunos microdispositivos para operar en sistemas tipo lote y sistemas continuos empleados con muestras pequeñas y de utilidad principalmente analítica, el presente invento puede ser implementado en escala industrial. e) Ahorra energía dado que como equipo mayor sólo requiere de bombas peristálticas. f) Reduce el tiempo de operación debido a que todas las etapas se llevan a cabo en un mismo dispositivo que permite la recuperación continua.

El método de operación del dispositivo motivo de esta invención, se caracteriza porque comprende las siguientes etapas: a) Inyectar cada una de las fases que conforman el SDFA, y la muestra de bioparticulas a particionar.

Cabe señalar que: -La muestra de bioparticulas se refiere a compuestos orgánicos, opcionalmente de origen biológico tales como células, proteínas, colorantes; u origen sintético, tales como colorantes, compuestos químicos, productos de reacción.

-Las fases de SDFA y la muestra de bioparticulas deben estar en solución.

-La muestra puede inyectarse de manera independiente o en puede estar contenida en una de las fases del SDFA.

-Cuando la muestra se inyecta de manera independiente, su flujo de entrada debe ser menor que el flujo de entrada de las fases para asegurar un VR de 1.

-La inyección de la muestra de biopartículas al sistema, debe ser con un flujo discreto desde el inicio de la corrida, para permitir la partición del compuesto(s) de interés.

-Cada una de las fases se inyecta opcionalmente de manera simultánea o de manera secuencial, considerando siempre que la inyección de la primer fase es continua; de manera que se estabilice el VR y el flujo; para opcionalmente, después inyectar la muestra de biopartículas.

-La inyección se puede llevar a cabo a favor o en contra de la gravedad, con referencia al ducto de retención.

-Evitar la entrada de aire al inyectar las fases. 1 - Las bombas deben estar funcionando en un rango de velocidad que corresponda al radio de volúmenes de flujo deseado para alcanzar un buen coeficiente de partición - Cuando la muestra de biopartículas haya sido inyectada en su totalidad, se sugiere continuar inyectando las fases del sistema para asegurar la recuperación de la totalidad de la muestra de biopartículas inyectada.

Recuperar cada una de las fases que conforma el SDFA y la muestra de biopartículas particionada, a la salida.

Cabe señalar que: -La recuperación de cada una de las fases opcionalmente es manual o automática. -La recuperación de cada una de las fases y opcionalmente la interfase sé lleva a cabo en recipientes independientes.

-Si la muestra de bioparticulas contiene compuestos volátiles la recuperación se realiza en cámaras selladas.

-El número de efluentes a recolectar están en función del perfil de separación de la(s) proteína(s) de interés a través del tiempo, y pueden ser fase superior, fase inferior e interfase.

Finalmente, cualquiera de las fracciones recolectadas puede ser: i. circuladas nuevamente por el sistema, para aumentar la recuperación del compuesto de interés, ii. analizadas mediante técnicas de proteómica para conocer el perfil de distribución de las bioparticulas presentes en la muestra inicial, iii. tratadas para la purificación del compuesto de interés y eliminación de las sales o polímeros que empleados en el sistema de fases acuosas.

A continuación se presentan algunos ejemplos que ilustran la partición de muestras con bioparticulas, mediante el dispositivo motivo de esta invención y su método de operación.

Ejemplo 1. Partición de colorante azul utilizando el dispositivo para recuperación continua de biopartículas mediante sistemas de dos fases acuosas motivo de la presente invención.

I Implementacion del dispositivo para recuperación continua de biopartículas mediante SDFA.

De acuerdo a las características mencionadas del dispositivo sujeto del presente invento, se implementaron tres diferentes configuraciones para la partición de un colorante azul (Mane, México). Las características de cada tipo de configuración son las siguientes: Configuración 1 La configuración del dispositivo para recuperación continua de biopartículas mediante sistemas de dos fases acuosas consiste en: a) Tres contenedores, con una capacidad de 2 kilos. Dos de ellos para el almacenamiento individual de cada una de las fases que conforman el sistema de dos fases acuosas, y un último contenedor para el almacenamiento de la biopartícula en solución a particionar: el primer contenedor contiene la fase superior; el segundo contenedor contiene la fase inferior, y el tercer contenedor contiene la biopartícula de interés, que en este ejemplo en particular consiste en una muestra de colorante azul (Proveedor MANE), diluido en la fase inferior. b) Una bomba peristáltica por cada contenedor. Cada bomba tiene niveles de flujo, que succionan el líquido de los contenedores y lo impulsan a un conector rígido de entrada.

Las velocidades de flujo es la misma para las tres bombas, de 60ml/min, siendo que el VR es de 1. Las fases tienen una viscosidad y densidad similar, teniendo una viscosidad promedio de 24 cps y una densidad promedio de 1.17g/cm3. ! c) Un conector rígido de entrada de vidrio Pyrex con tres entradas y una salida, formando una cruceta (Ver figura 2). En cada boquilla de entrada, de 0¡7cm de diámetro, se conecta un ducto de silicón (10) que transporta el líquido de cada uno de los contenedores hacia cada boquilla de entrada del ducto rígido. El diámetro de las entradas del conector rígido de entrada es de 0.7 cm (11) y el de la salida es de 1 cm (12). Dichos ductos pasan a través de las bombas peristálticas y tienen un diámetro interno de 0.5 cm y una longitud de 50 cm, que representa la distancia entre el fondo de los contenedores y el conector rígido de entrada. Mediante el choque entre las dos fases acuosas y la muestra de biopartículas que entran en contacto a un flujo de 60 ml/min, dentro del conector, se genera turbulencia, debido a lo cual, la salida del conector rígido de entrada, desemboca en la entrada de un ducto de retención (13). d) El ducto de retención (ver figura 5), tiene una longitud de 5 metros (24) y un diámetro interno de 1 cm (25 y 29), es de PVC transparente, que nos permite visualizar el nivel de la interfase.

Está colocado dentro de una caja de acrílico de medidas 20x20x15cm (LxLxA) (26), de modo que se pliega formando un espiral, de tal manera que el ducto de retención queda acomodado sobre sí. mismo en cada vuelta de 360°. La caja tiene dos orificios en una de las caras laterales: uno de entrada del ducto de retención en la parte inferior izquierda, y otro de salida en la parte superior derecha, la ubicación de los orificios está diseñada para hacer fluir las fases en contra de la gravedad, trayendo consigo un incremento en el tiempo de la partición de la muestra (27). A la salida y entrada del ducto de retención, se considero extenderlo 5 cm fuera de la caja para facilitar la conexión al conector rígido de entrada y un conector rígido de salida, respectivamente (28). El tamaño de los orificios concuerda exactamente con el diámetro externo de la tubería, Un conector rígido de salida es de vidrio Pyrex (ver figura 6), y se ensambla a la salida del ducto de retención (30 y 31). El conector rígido de salida tiene una entrada y dos salidas, con un bulbo intermedio de 6 cm de longitud (32) y 2.5 cm de diámetro (33). El diámetro de las boquillas de salida son de 0.7 cm (34), con segmentos de 1.5 cm (35) y 2.5 cm (36), separados por un codo de 90° (37). Y el diámetro de entrada es de 1 cm (38) y 3cm de longitud (39). Cada boquilla de salida tiene conectada un ducto de silicón de 0.05 cm de diámetro interno (40), con longitud no mayor a 30 cm, por los cuales fluye cada fase del sistema dos fases acuosas hacia un contenedor de recolección. Y cada uno de estos ductos flexibles está controlado por una estrangulador de flujo.

Configuración 2 a) Esta configuración difiere de la Configuración 1, en que después del conector rígido de entrada se conecta un generador de turbulencia (Ver figura 3). El cual consiste en un segmento de tubería de plástico con 0.8 cm diámetro interno (15), que en su interior tiene perlas de vidrio de 0.3 cm de diámetro (16). Para evitar que las perlas de vidrio se fueran con el flujo, se colocaron trampas de plástico a ambos lados del generador de turbulencia (17), de manera que existiera un segmento no menor a 1 cm libre para ensamblar el generador de turbulencia con el resto de los cuerpos del dispositivo (18). La longitud del generador de turbulencia es de 14 cm (19), de modo que las perlas están colocadas en un segmento de 10 cm, mientras que las trampas abarcan 1 cm cada una. Esta configuración requiere de un conector que une el generador de turbulencia con el conector rígido de entrada y el ducto de retención (Ver figura 7). Elaborado de vidrio Pyrex, tiene una boquilla de entrada de 7 mm de diámetro externo (42) y la boquilla de salida tiene 1 cm de diámetro externo (43), de modo que se ajusta a los diámetros de las boquillas a las que está embonado.

Configuración 3 La diferencia entre la configuración 3 y la configuración 2, radica en que: El generador de turbulencia es una extensión del conector rígido de entrada (ver figura 4). Formado a partir de un segmento de 15 cm de tubería de vidrio Pyrex con 1 cm de diámetro externo, presenta hendiduras aleatorias y al menos tres ondulaciones que modifican el flujo lineal. El diámetro de la boquilla de salida es de 1 cm (21), y se ensambla con la entrada del ducto de retención (22).

II Preparación de las fases del SDFA y colorante azul.

Para preparar las fases acuosas que alimentarán el sistema, se deben seleccionar las características del mismo que se desea utilizar, determinando la identidad química de los compuestos que lo conforman así como los parámetros que describen el sistema de dos fases acuosas (Longitud de línea de corte (LLC), Radio de volúmenes (VR), pH, volumen de muestra, % p/p de los componentes).

En seguida, se mezclan todos los ingredientes en un mismo recipiente y se espera a que se formen las fases, para posteriormente separarlos por medio de bombas o por acción de gravedad y colocarlos en contenedores separados. Alternativamente, se puede dividir el contenido de agua total del sistema en dos partes y disolver uno de los polímeros o sales que conforman el sistema de fases acuosas en una parte y el otro polímero o sal en la parte restante de agua. Cada fase, se coloca en contenedores separados. De tal manera que, las fases que conforman el SDFA alcanzan el equilibrio en el dispositivo, después de inyectarse; o se inyectan estando en equilibrio. Posteriormente, se debe determinar la cantidad adecuada de muestra o extracto proteico que se va a aplicar. En este caso, para el colorante azul, se realizaron pruebas rápidas de coloración de ambas fases del sistema de dos fases acuosas, a partir de las cuales se decidió que no más del 0.02% (p/p) de colorante disuelto en la totalidad del sistema de dos fases acuosas, era suficiente para darle una coloración notablemente distinta (azul) a la coloración transparente que caracteriza a los SDFA.

Con respecto a lo anterior, para el presente ejemplo de operación, se formularon 4 kg de un SDFA con las siguientes propiedades: a) 17% (p/p) Polietilenglicol con peso molecular de 1000 (PEG1000) b) 16.2% (p/p) Fosfato de potasio (a partir de la combinación de fosfato monobásico y fosfato dibásico en una proporción 7: 18, respectivamente). c) pH 7 d) VR=1 e) LLC= 34.48%.

Se pesaron las cantidades correspondientes de los reactivos (PEG1000 en estado liquido, fosfato monobásico, fosfato dibásico y agua bidestilada) y se mezclaron en un matraz de 4 litros sin orden preferente.

Con los reactivos mezclados, se agitó de manera manual, hasta notar una disolución parcial de las sales y el PEG y posteriormente el matraz se colocó sobre una parrilla con agitador magnético durante 12 horas, preferentemente por una noche. Posteriormente se dejó reposar por 1 hora el sistema, o hasta observar la interfase dentro del mismo matraz. Las fases formadas se extrajeron con ayuda de una bomba peristáltica y mediante tubería de plástico, y fase superior se coloco en el primer contenedor, la fase inferior en el segundo contenedor; y finalmente la muestra de interés se coloco en un tercer contenedor. Considerando que del segundo contenedor que contiene fase inferior, se tomaron 400 g de fase inferior y se colocó en el tercer contenedor, en el cual se agregó 0.01% (p/p) de colorante azul (Mane, México).

Esta última mezcla, de colorante azul en fase inferior, fue puesta en agitación constante a 60 rpm hasta observar la disolución total del colorante en el líquido, es decir, hasta no observar ningún grumo o conglomerados de colorante en las paredes del contenedor o en la parte superior de la fase. Y fue mantenido en agitación hasta su posterior utilización.

III Método de operación del Dispositivo motivo de esta invención para la partición de la muestra de biopartículas.

Previa a la inyección de cada una de las fases del SDFA, se circuló agua bidestilada por el interior del sistema, para asegurar que no hubiera ningún tipo de fuga o entrada de aire. Todas las velocidades manejadas, para cada una de las 3 configuraciones y las 2 repeticiones de cada configuración, fueron las mismas, es decir, 60 ml/min. a) Inyectar cada una de las fases que conforman el SDFA, y la muestra de biopartículas a particionar.

Las condiciones fueron las siguientes: -Las fases de SDFA y la muestra de biopartículas están en solución y en contenedores indivuales. ( -La muestra esta contenida en una de las fases del SDFA.

-Cada una de las fases se inyectan de manera simultánea, y se compruebá que se estabilizo el VR y el flujo. La estabilización de las fases se logra hasta que por la fase superior fluye por la salida superior del conector rígido de salida, y la fase inferior fluye por la salida inferior del conector rígido de salida, esto sin modificación de la altura de la interfase.

Opcionalmente, un restrictor de flujo en el ducto que proviene de la salida inferior del conector rígido de salida facilita la estabilización.

-Cuando se inyecto la muestra inmediatamente se observó una coloración azul en el SDFA que viajaba a través de los ductos, y que migraba de la fase inferior (donde estaba contenida) a la fase superior (por la que tiene afinidad), desde el momento en que ambas fases entraban en contacto, y hasta que entraban en conector rígido de salida.

-Cuando la muestra con colorante azul termino de inyectarse, se continuó inyectando las fases para evitar pérdida de colorante dentro de la tubería, hasta que se apagaron las bombas peristálticas. e recuperaron cada una de las fases que conforma el SDFA a la salida del sistema continuo, teniendo que: -La recuperación de cada una de las fases se llevó a cabo en recipientes independientes.

-El número de efluentes fueron 2, uno con fase inferior y otro con fase superior en la cual estaba contenida la muestra de colorante azul. -A la desembocadura de los ductos flexibles a la salida, se hicieron muéstreos de 200 µ?, con frecuencia de 10 segundos, mediante una micro pipeta, durante el tiempo que inició desde la inyección del colorante, hasta cinco minutos después de de que éste se terminó de inyectar. Cabe señalar que este método se realizo para cada configuración por duplicado.

IV Resultados Cada muestra tomada con la pipeta de 200 µ?, fue colocada en una caja de microplatos de 96 pozos, de manera secuencial. Para analizar el contenido de colorante presente en cada fase, durante diferentes etapas en todo el tiempo del muestreo, la absorbancia de las fases en cada pozo fue leída mediante un lector de microplatos a una longitud de onda de 640nm (longitud de máxima absorción) La cinética de partición del colorante azul, en cada una las configuraciones "1", "2" y "3"; se muestran en las figuras 8, 9 y 10, respectivamente.

El porcentaje de colorante para cada gráfica se refiere a la concentración de colorante presente en una u otra fase en un determinado tiempo, con respecto a la cantidad máxima de colorante que se introdujo en el sistema. Éste porcentaje fue calculado en base a una curva de calibración elaborada previamente para colorante azul disuelto en cada fase.

En las tres gráficas se aprecia que la detección del colorante inicia a partir del minuto 4. Esto denota que el tiempo de residencia característico de estas configuraciones, a la velocidad de 60 ml/min, es de 4 minutos, y es dictado principalmente por la distancia que deben recorrer las fases desde su entrada hasta la salida del dispositivo. La mayor concentración de colorante se presenta entre los minutos 7 y 8, a partir de los cuales la concentración comenzó a disminuir, hasta que el color desapareció por completo de las fases.

En la figura 8 se observa que en la configuración 1, que prescinde del dispositivo de turbulencia, no hay la suficiente transferencia de masa para que el colorante, el cual tiene mayor afinidad por la fase superior, migre hacia la fase rica en PEG. En cambio, con el empleo del generador de turbulencia con perlas de vidrio, y el generador de turbulencia con hendiduras y ondulaciones, aparentemente la transferencia del colorante es del 100% de la fase inferior a la fase superior (ver figuras 9 y 10).

Ejemplo 2. Partición de Cristal Violeta utilizando el dispositivo para recuperación continua de biopartículas mediante sistemas de dos fases acuosas motivo de la presente invención I Implementacion del dispositivo para recuperación continua de biopartículas mediante SDFA.

Dado que en experimentos previos al presente ejemplo, se encontró que el cristal violeta tiene mucha mayor afinidad por la fase superior, que el colorante azul, de modo que el tiempo de partición es menor, se decidió disminuir el tamaño del ducto de retención y, por lo tanto, la velocidad de flujo, de modo que la configuración de los dispositivos empleados fueron los siguientes: Configuración 4 a) Dos contenedores con una capacidad de 2 kilos para el almacenamiento individual de cada una de las fases que conforman el sistema de dos fases acuosas. El primer contenedor contiene la fase superior y el segundo contenedor contiene la fase inferior. Un tercer contenedor con capacidad de 1 kilo para el almacenamiento de la biopartícula en solución a particionar, que en este ejemplo en particular corresponde a una muestra de Cristal Violeta (Proveedor: Sigma de México), diluido en la fase inferior. b) Una bomba peristáltica por cada contenedor. Cada bomba tiene niveles de flujo que succionan el líquido de los contenedores y lo impulsan a un conector rígido de entrada. Las velocidades de flujo es la misma para las tres bombas, de 50ml/min, siendo que el VR es de 1. Las fases tienen una viscosidad y densidad similar. c) Un conector rígido de entrada de vidrio Pyrex con tres entradas y una salida, formando una cruceta. En cada boquilla de entrada se conecta un ducto de silicón que transporta el líquido de cada uno de los contenedores hacia cada boquilla de entrada del ducto rígido. Dichos ductos pasan a través de las bombas peristálticas y tienen un diámetro interno de 0.5 cm y una longitud de 50 cm, que representa la distancia entre el fondo de los contenedores y el conector rígido de entrada. El diámetro de las entradas del conector rígido de entrada es de 0.7 cm y el de la salida es de 1 cm. La salida del conector rígido de entrada, desemboca en la entrada del generador de turbulencia, tal como se describe en la Configuración 1 pero en este ejemplo conectado a un generador de turbulencia. d) Un generador de turbulencia, el cual consiste en un segmento de tubería de plástico con 0.8 cm diámetro interno, que en su interior tiene perlas de vidrio de 0.3 cm de diámetro. Para evitar que las perlas de vidrio se fueran con el flujo, se colocaron trampas de plástico a ambos lados del generador de turbulencia, de manera que existiera un segmento no menor a 1 cm libre para ensamblar el generador de turbulencia con el resto de los cuerpos del dispositivo. La longitud del generador de turbulencia es de 14 cm, de modo que las perlas están colocadas en un segmento de 10 cm, mientras que las trampas abarcan 1 cm cada una.

Un ducto de retención que es de 3 metros de longitud con 8 mm de diámetro interno, es de PVC transparente. Está colocado dentro de una caja de acrílico de medidas 14xl4xl0cm (LxLxA), de modo que se convierte en un espiral en el que la tubería queda acomodada sobre sí misma en cada vuelta de 360°. La caja tiene dos orificios en una de las caras laterales: uno de entrada de la tubería en la parte inferior izquierda, y otro de salida en la parte superior derecha, siendo que la tubería se extiende al menos 5 cm fuera de la caja. El tamaño de los orificios concuerda exactamente con el diámetro externo de la tubería.

Un conector rígido de salida, que se ensambla a la salida del ducto de retención, que es de vidrio Pyrex. Con una entrada, un cuerpo opcionalmente ovoide y dos salidas. El diámetro de las boquillas de salida y de entrada son de 7 mm. Cada boquilla de salida tiene conectada un ducto de silicón de 5mm de diámetro interno, con longitud no mayor a 30 cm, por los cuales fluye cada fase del sistema dos fases acuosas hacia un contenedor de recolección. Y cada uno de estos ductos flexibles está controlado por una estrangulador de flujo.

Esta configuración requiere de un ducto que une el generador de turbulencia con el ducto de retención. Elaborado de vidrio Pyrex, tiene una boquilla de entrada y una boquilla de salida de 7 mm, de modo que se ajusta a los diámetros de las boquillas a las que está embonado.

Configuración 5 La diferencia entre la configuración 5 y la configuración 4, radica en que: El generador de turbulencia es una extensión del conector rígido de entrada. Formado a partir de un segmento de 15 cm de tubería de vidrio Pyrex con 1 cm de diámetro externo, presenta hendiduras aleatorias y al menos tres ondulaciones que le hacen perder el ángulo recto. El diámetro de la boquilla de salida es de 1 cm, y se ensambla con la entrada del ducto de retención II Preparación de las fases del SDFA y cristal violeta.

Para el presente ejemplo de operación, se formularon 4 kg de un SDFA con las siguientes propiedades: a) 16.7% (p/p) Polietilénglicol con peso molecular de 1000 (PEG1000) b) 14.3% (p/p) Fosfato de potasio (a partir de la combinación de fosfato monobásico y fosfato dibásico en una proporción 7: 18, respectivamente). c) pH 7 d) VR ¾ i e) LLC= 34.38%.

El PEG es usado en estado líquido. Para lo cual, es necesario aplicar calor al PEG, esto se realiza preferentemente a baño maría hasta cambiar completamente a estado liquidó, esto se lleva a cabo durante al menos 4 horas a 70°C (para no producir cambios en su peso molecular).

Se pesaron las cantidades correspondientes de los reactivos (PEG 1000 en estado liquido, fosfato monobásico, fosfato dibásico y agua bidestilada) y se mezclaron en un matraz de 4 litros sin orden preferente.

Con los reactivos mezclados, se agitó de manera manual, hasta notar una disolución parcial de las sales y el PEG y posteriormente el matraz se colocó sobre una parrilla con agitador magnético durante 12 horas, preferentemente por una noche. Posteriormente se dejó reposar por 1 hora el sistema, o hasta observar la interfase dentro del mismo matraz. Las fases formadas se extrajeron con ayuda de una bomba peristáltica y mediante tubería de plástico, y fase superior se coloco en el primer contenedor, la fase inferior en el segundo contenedor; y finalmente la muestra de interés se coloco en un tercer contenedor. Considerando que del segundo contenedor que contiene fase inferior, se tomaron 800 g de fase inferior y se colocó en el tercer contenedor, en el cual se agregó 41 mi de una solución stock que contenía 5 mg de cristal violeta (Sigma de México) diluido en lOOmL de H20 bi-destilada (0.05 mg/ml). De éste último stock se separaron 200 mL y se colocaron, en un contenedor aparte, para su empleo en el estudio de partición de cristal violeta en un SDFA por lotes. El resto, fue puesto en agitación constante a 60 rpm hasta observar la disolución total del colorante en el líquido, es decir, hasta no observar ningún grumo o conglomerados de colorante en las paredes del contenedor o en la parte superior de la fase. Y fue mantenido en agitación hasta su inyección al sistema continuo.

Para realizar la curva de calibración, del colorante Cristal Violeta. A partir de la solución stock de 5mg de colorante diluidos en 100 mL de H20 bi-destilada (0.05 mg/ml), se realizaron diluciones del 0 al 100% en cantidades de 0.3 mi de fase superior o 0.3 mi de fase inferior del sistema PEG1000-PO4, que fueron colocados en pozos de microplatos y cuya densidad fue leída a una densidad óptica de 580 nm (dicha longitud de onda fue obtenida mediante el promedio de tres repeticiones de barrido). Las curvas de calibración se realizaron por duplicado.

Para los sistemas por lote, se realizó un experimento de partición del colorante Cristal Violeta por triplicado. Se siguió la metodología propuesta por Hatti-Kaul (2000, p.51), en la cual en un recipiente se diluye la muestra de biopartículas, en este caso cristal violeta, en una cantidad predeterminada de fase inferior; después se agrega al recipiente la misma cantidad, pero de fase superior, e inmediatamente en seguida se comienza a muestrear de la parte media de cada fase durante intervalos de tiempo predeterminados. En este caso, se tomaron 25ml de los 200 mi de solución stock separados previamente, y 25 mi de la fase superior. Ambas porciones de fase inferior con colorante y fase superior, fueron mezcladas por triplicado en tubos para centrífuga con capacidad de 50 mL. Los muéstreos se llevaron a cabo en porciones de 1 mi, tomadas con pipetas Pasteur, a los minutos: 1, 2, 3, 4, 5 10, 15, 20, 30 y 40. Posteriormente, se tomaron 0.3 mL de dichas porciones, y se colocaron secuencialmente en pozos de un microplató para la lectura de densidad óptica a 580nm.

III Método de operación del Dispositivo motivo de esta invención para la partición de la muestra de biopartículas.

Previa a la inyección de cada una de las fases del SDFA, se circuló agua bidestilada por el interior del sistema, para asegurar que no hubiera ningún tipo de fuga o entrada de aire. Todas las velocidades manejadas, para cada una de las 3 configuraciones y las 2 repeticiones de cada configuración, fueron las mismas, es decir, 50 ml/min.

Inyectar cada una de las fases que conforman el SDFA, y la muestra de biopartículas a particionar.

Las condiciones fueron las siguientes: -Las fases de SDFA y la muestra de biopartículas están en solución y en contenedores individuales.

-La muestra está contenida en una de las fases del SDFA.

-Cada una de las fases se inyectan de manera simultánea, y se comprueba que se estabilizo el VR y el flujo. La estabilización de las fases se logra hasta que por la fase superior fluye por la salida superior del conector rígido de salida, y la fase inferior fluye por la salida inferior del conector rígido de salida, esto sin modificación de la altura de la interfase. Opcionalmente, un restrictor de flujo en el ducto que proviene de la salida inferior del conector rígido de salida facilita la estabilización.

-Cuando se inyecto la muestra inmediatamente se observó una coloración violeta en el SDFA que viajaba a través de los ductos, y que mi graba de la fase inferior (donde estaba contenida) a la fase superior (por la que tiene afinidad), desde el momento en que ambas fases entraban en contacto, y hasta que entraban en conector rígido de salida.

-Cuando la muestra con cristal violeta terminó de inyectarse, se continúo inyectando las fases para evitar pérdida de colorante dentro de la tubería, hasta que se apagaron las bombas peristálticas. b) Se recuperaron cada una de las fases que conforma el SDFA a la salida del sistema continuo, teniendo que: -La recuperación de cada una de las fases se lleva a cabo en recipientes independientes.

-El número de efluentes fueron 2, uno con fase inferior y otro con fase superior en la cual estaba contenida la muestra de Cristal Violeta.

-A la desembocadura de las tuberías flexibles a la salida, se tomaron muestras, ya no en los vasos de precipitados, sino que en tubos de centrífuga de 50 mi que fueron colocados bajo los efluentes de salida de ambas fases, y que cada 20 segundos eran sustituidos por tubos limpios, para seguir recolectando las fracciones durante el tiempo que inició desde la inyección del colorante, hasta 4 minutos después de que éste había sido dejado de inyectar.

Cabe señalar que este método se realizo para cada configuración por duplicado.

IV Resultados En las figuras 22 y 23, se muestra el colorante cristal violeta particionado en la parte superior del SDFA, cuando el dispositivo motivo del presente invento estaba en marcha, mientras que en la figura 24 se muestran los tubos de centrífuga con el colorante particionado al minuto 50. La figura 1 1 es una gráfica que muestra el promedio de las 3 cinéticas de separación del colorante con respecto al tiempo, en los sistemas por lote. El porcentaje de colorante para cada gráfica se refiere a la cantidad de colorante presente en determinada fase al mismo tiempo, con respecto a la cantidad máxima de colorante en el sistema, observada durante el tiempo de muestreo.

En el dispositivo continuo, con la configuración 4, el tiempo comenzó a tomarse a partir de que el colorante llegara al conector rígido de entrada, resultando la gráfica de concentración que se muestra en la figura 12. El mismo procedimiento fue repetido, para la configuración 5, y el resultado se observa en la figura 13.

Como se puede apreciar, en el sistema por lotes, el equilibrio entre ambas fases se logra a partir del minuto 3, mientras que en los sistemas continuos, se alcanza a los minutos 2.5 y 2, respectivamente. Dichos tiempos corresponden al tiempo de retención del colorante dentro del sistema completo. Por lo tanto, se puede concluir que para biopartículas que tienen afinidad por una sola fase, las configuraciones 4 y 5 igualan el tiempo de partición en los sistemas por lote. Sin embargo, disminuyen el tiempo de muestreo y mejoran en dicha instancia a los sistemas por lote.

Por lo anteriormente descrito, se concluye que el tiempo de partición del cristal violeta en un SDFA, llevado a cabo en la configuración 4 y 5 del dispositivo de la presente invención es menor que, el tiempo de partición del cristal violeta en un SDFA tipo lote. Teniendo que el tiempo de retención es menor en al menos 0.5 minutos.

Sin embargo es importante señalar que, esto solo aplica para el tiempo de partición, sin considerar que, en un SDFA por lotes se realiza de manera independiente y discontinua cada operación unitaria, trayendo consigo perdida de muestra y mayor tiempo de análisis; con el presente dispositivo la manipulación de la muestra entre las etapas se descarta y el tiempo de partición se minimiza, sin sacrificar los resultados de partición de la biopartícula.

Ejemplo 3. Partición de Albúmina de Suero Bovino (BSA) utilizando el dispositivo para recuperación continua de biopartículas mediante sistemas de dos fases acuosas motivo de la presente invención I Implementación del dispositivo para recuperación continua de biopartículas mediante SDFA.

Para este ejemplo, la configuración del dispositivo de recuperación continua de biopartículas mediante SDFA, fue la configuración 4 previamente descrita, con la única diferencia de que las dimensiones del ducto de retención fueron de 5 m de longitud y 1 cm de diámetro interno. Además, de que el generador de turbulencia se dobla por la mitad y se une a través de conexiones macho-hembra y en serie, a otros 3 generadores de turbulencia del mismo tipo y en la misma forma para incrementar la longitud (Ver figura 20).

II Preparación de las fases del SDFA y BSA.

Se emplearon las mismas propiedades del SDFA y el mismo protocolo de preparación de las fases del SDFA que en el ejemplo 2, hasta tener la fase superior contenida en el primer contenedor y la fase inferior en el segundo contenedor. Del segundo contenedor, se tomaron 200 mi para la realización de los tres sistemas por lotes.

Para la realización de la curva de calibración, se realizó un stock de lOmg de BSA/ml de agua bidestilada, de la cual posteriormente se hicieron diluciones del 0 al 100%, ya sea en fase superior o en fase inferior, de los mismos, se midió cantidad de proteína por medio de la técnica de Bradford, correlacionando la densidad óptica con el contenido de BSA.

Para los sistemas por lote, el procedimiento fue similar a aquel del cristal violeta. Sin embargo, se colocaron 20 mi del stock de BSA en agua, a los 200 mi de fase inferior separadas de los primeros dos contenedores, para poder obtener una solución con 1 mg de BSA por mi de fase inferior. De esta última solución, se tomaron 25 mi y se colocaron en un recipiente de 50 mi. Al mismo recipiente se agregaron 25 mi de fase superior, y el resto del procedimiento fue similar al del ejemplo 2. El resto de la solución stock con 1 mg ml de BSA en fase inferior, se colocó en el tercer contenedor del dispositivo, para ser inyectado como tercera entrada.

III Método de operación del Dispositivo motivo de esta invención para la partición de la muestra de biopartículas.

Previa a la inyección de cada una de las fases del SDFA, se circuló agua bidestilada por el interior del sistema, para asegurar que no hubiera ningún tipo de fuga o entrada de aire. Todas las velocidades manejadas, para cada una de las 3 configuraciones y las 2 repeticiones de cada configuración, fueron las mismas, es decir, 50 ml/min. a) Inyectar cada una de las fases que conforman el SDFA, y la muestra de biopartículas a particionar.

Las condiciones fueron las siguientes: -Las fases de SDFA y la muestra de biopartículas están en solución y en contenedores individuales.

-La muestra está contenida en una de las fases del SDFA.

-Cada una de las fases se inyectan de manera simultánea, y se comprueba que se estabilizo el V y el flujo. La estabilización de las fases se logra hasta que por la fase superior fluye por la salida superior del conector rígido de salida, y la fase inferior fluye por la salida inferior del conector rígido de salida, esto sin modificación de la altura de la interfase. Opcionalmente, un restrictor de flujo en el ducto que proviene de la salida inferior del conector rígido de salida.

-Cuando se inyecto la muestra inmediatamente se observó una turbidez en el SDFA que viajaba a través de los ductos, y que migraba de la fase inferior (donde estaba contenida la proteína) hacia la interfase y hacia la fase superior, desde el momento en que ambas fases entraban en contacto, y hasta que se encontraban en la parte intermedia del ducto de retención. A partir de allí la turbidez fue disminuyendo y desapareciendo por completo, hasta que las fases entraban en el conector rígido de salida.

-Cuando la muestra de BSA terminó de inyectarse, se continúo inyectando las fases para evitar pérdida de proteína dentro de la tubería, hasta que se apagaron las bombas peristálticas.

Se recuperaron cada una de las fases que conforma el SDFA a la salida del sistema continuo, teniendo que: -La recuperación de cada una de las fases se lleva a cabo en recipientes independientes.

-El número de efluentes fueron 2, uno con fase inferior y otro con fase superior en la cual estaba contenida la muestra de BSA.

-A la desembocadura de las tuberías flexibles a la salida, se tomaron muestras, en tubos de centrífuga de 50 mi que fueron colocados bajo los efluentes de salida de ambas fases, y que cada 20 segundos eran sustituidos manualmente por tubos limpios, para seguir recolectando las fracciones durante el tiempo que inició desde la inyección de la solución con BSA, hasta 4 minutos después de que ésta había sido dejada de inyectar.

Cabe señalar que este método se realizo para cada configuración por duplicado.

IV Resultados La figura 14 demuestra que el tiempo de estabilización del sistema en lote es relativamente mayor que en el caso de los colorantes, los cuales tienen una afinidad casi absoluta por la fase superior, lo cual no es el caso del la BSA. Aunque la proteína también tiene tendencia hacia dicha fase, la BSA tiene un coeficiente de partición diferente a la unidad (Kp=1.2, n=3). Es por tales motivos, que se decidió emplear el sistema de 5 metros para comparar su eficiencia, y dar un tiempo de retención mayor que en el caso del sistema de 3 metros. Además, la configuración del presente ejemplo, se probó empleado una velócidád de 50 ml/min, lo cual permite mayor tiempo de separación de fases.

Como se observa en la figura 15, con datos promedio de dos repeticiones de la implementación del dispositivo continuo, sujeto del presente invento, el tiempo de equilibrio y separación de fases no fue mayor al de sistema en por lotes, sino¦ que fue menor, lo cual refleja una de las ventajas por las cuales el dispositivo para recuperación continua de biopartículas mediante sistemas de dos fases acuosas motivo de la presente invención. Además, el coeficiente de partición logró ser superior en el dispositivo continuo que en el sistema por lotes, al minuto 15 (Kp > 3.4, n=2), por lo cual también, se puede decir que, al haber inyectado la proteína en la fase inferior, la transferencia de masa con el dispositivo continuo fue mejor que con el sistema por lotes. Adicionalmente la disposición en serie de los generadores de turbulencia empleados, corrobora la necesidad de los mismos para incrementar el área de contacto entre las fases y por ende aumentar la transferencia de materia entre ellas.

Claims (19)

REIVINDICACIONES Habiendo descrito suficiente mi invención, considero como una novedad y por lo tanto reclamo como de mi exclusiva propiedad, lo contenido en las siguientes cláusulas: >

1. Dispositivo para recuperación continua de biopartículas mediante sistemas de dos fases acuosas caracterizado porque está conformado por: a) Al menos dos contenedores para el almacenamiento de una de las fases que conformarán el sistema de dos fases acuosas, y la muestra de interés, b) Al menos un sistema de bombeo con control de flujo que succiona e impulsa el líquido en cada uno de los contenedores anteriormente descritos, de' manera independiente a: c) Un conector rígido de entrada con un número de entradas coincidente con el número de contenedores y una salida que desemboca preferentemente en: d) Al menos un generador de turbulencia para el mezclado de las fases acuosas del sistema, consiste al menos un ducto para inducir la turbulencia y promover la transferencia del compuesto de interés hacia la fase por la cual tiene mayor afinidad, se une a través de conexiones macho-hembra, opcionalmente a otros generadores de turbulencia, o a: e) Un ducto de retención, cuyo interior, consiste de una pared lisa y continua, para permitir el libre fluir de las fases acuosas y promover la separación de éstas, manteniendo en equilibrio el contenido de biopartículas presente en cada una de las fases, tiene un arreglo en horizontal respecto al suelo, opcionalmente recto o formando arcos para evitar la turbulencia de las fases en el interior del ducto, a su salida se conecta a: f) Un contenedor rígido de salida, tiene una entrada, al menos dos salidas, y un cuerpo con un espacio físico mayor que la entrada para permitir la separación de las fases que por cada una de sus salidas, y que cada fase fluya de manera independiente la fase superior, la fase inferior o la interfase.

Dispositivo para recuperación continua de biopartículas mediante sistemas de dos fases acuosas, de conformidad con la reivindicación 1 caracterizado porque la muestra de interés opcionalmente es una proteína, mezcla de proteínas o extractos.

Dispositivo para recuperación continua de biopartículas mediante sistemas de dos fases acuosas, de conformidad con la reivindicación 1 caracterizado porque la muestra de interés opcionalmente se ingresa al dispositivo, contenida en una de las fases o bien mediante un contenedor adicional de cualquier tipo.

Dispositivo para recuperación continua de biopartículas mediante sistemas de dos fases acuosas, de conformidad con la reivindicación 1 caracterizado porque requiera una bomba peristáltica por contenedor, si la viscosidad y densidad de los líquidos de los contenedores son diferentes o el VR es diferente a l .

Dispositivo para recuperación continua de biopartículas mediante sistemas de dos fases acuosas, de conformidad con la reivindicación 1 caracterizado porque el generador de turbulencia en su interior, opcionalmente tiene cuerpos sólidos de geometría variable de un material inerte, para inducir la turbulencia y promover la transferencia del compuesto de interés hacia la fase por la cual tiene mayor afinidad.

Dispositivo para recuperación continua de biopartículas mediante sistemas de dos fases acuosas, de conformidad con la reivindicación 5 caracterizado porque los ' cuerpos sólidos de geometría variable de un material inerte, son perlas de vidrio.

Dispositivo para recuperación continua de biopartículas mediante sistemas de dos fases acuosas, de conformidad con la reivindicación 1 caracterizado porque el ducto de retención preferentemente forma arcos en su interior, que se acoplan entre ellos, para incrementar su longitud.

Dispositivo para recuperación continua de biopartículas mediante sistemas de dos fases acuosas, de conformidad con la reivindicación 1 caracterizado porque el conector rígido de salida está conformado por una entrada, y se separa en al menos dos salidas, para permitir que por cada salida fluya de manera independiente, la fase superior, la fase inferior o la interfase.

9. Un método de operación del dispositivo motivo de esta invención, se caracteriza porque comprende las siguientes etapas: a) Inyectar cada una de las fases que conforman el SDFA, y la muestra de biopartículas a particionar, y b) Recuperar cada una de las fases que conforma el SDFA y la muestra de biopartículas particionada, a la salida.

10. El método de operación de la reivindicación 9, caracterizado porque las etapas a) y b) se llevan a cabo de manera continua.

11. El método de operación de la reivindicación 9, caracterizado porque en la etapa a) las fases que conforman el SDFA están en equilibrio antes de inyectarse.

12. El método de operación de la reivindicación 9, caracterizado porque en la etapa a) las fases que conforman el SDFA alcanzan el equilibrio en el dispositivo, después de inyectarse.

13. El método de operación de la reivindicación 9, caracterizado porque en la etapa a) las fases del sistema de dos fases acuosas y la muestra de biopartículas deben estar en solución.

14. El método de operación de la reivindicación 9, caracterizado porque en la etapa a) la muestra se inyecta opcionalmente de manera independiente o contenida en una de las fases del sistema de dos fases acuosas.

15. El método de operación de la reivindicación 14, caracterizado porque la muestra se inyecta de manera independiente, después de la inyección de la fase superior e inferior, y el flujo de inyección de la muestra es menor que el flujo de entrada de las fases del sistema para evitar cambios en el VR. i

16. El método de operación de la reivindicación 9, caracterizado porque en la etapa a), la inyección de la muestra es con un flujo discreto desde el inicio de la corrida, para permitir la partición de la muestra de biopartículas.

17. El método de operación de la reivindicación 9, caracterizado porque en la etapa a), las fases del sistema de dos fases acuosas, se inyectan de manera simultánea de manera que se estabilice el VR y el flujo antes de inyectar la muestra de biopartículas.

18. El método de operación de la reivindicación 9, caracterizado porque en la etapa a), la inyección, preferentemente se lleva a cabo en contra de la gravedad, con referencia al ducto de retención.

19. El método de operación de la reivindicación 9, caracterizado porque en la etapa b), la recuperación de cada fase dpcionalmente es manual o automática. \