MX2009002925A - Inhibidores de histona desacetilasa con actividad combinada sobre histona desacetilasas clase i y clase iib en combinacion con inhibidores del proteasoma. - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a las combinaciones de un inhibidor del proteasoma y un inhibidor de histona desacetilasa con actividad combinada sobre histona desacetilasas clase I y clase IIb, para inhibir el crecimiento de células tumorales, útiles en el tratamiento de cáncer.

Description

INHIBIDORES DE HISTONA DESACETILASA CON ACTIVIDAD COMBINADA SOBRE HISTONA DESACETILASAS CLASE I Y CLASE IIB EN COMBINACION CON INHIBIDORES DEL PROTEASOMA MEMORIA DESCRIPTIVA La presente invención se refiere a inhibidores de histona desacetilasa (HDAC) con actividad combinada sobre histona desacetilasas clase I y clase II. Se refiere a combinaciones y composiciones que los comprenden, así como a su uso, como un medicamento, por ejemplo, como un medicamento para inhibir tumores hematopoyéticos tales como linfomas y leucemias. La familia de enzimas HDAC ha sido nombrada después de que se identificó su primer substrato, es decir, las proteínas histonas nucleares. Las proteínas histonas (H2A, H2B, H3 y H4) forman un complejo octámero, alrededor del cual la hélice de ADN se enrolla para establecer una estructura de cromatina condensada. El estado de acetilación de las histonas está en equilibrio dinámico gobernado por histona acetil transferasas (HATs) que acetilan, y HDACs que son responsables de la desacetilación de las colas de histona. La inhibición de la enzima HDAC promueve la acetilación de las colas de histona de nucleosomas, favoreciendo una estructura de cromatina más competente desde el punto de vista de la transcripción, que a su vez lleva a la expresión alterada de genes implicados en procesos celulares tales como proliferación, apoptosis y diferenciación celular. En años recientes, se ha identificado un número creciente de otros substratos de HDAC no de histona. Reclutamiento de HDAC desregulado y constante en conjunto con factores de transcripción oncogénicos para la cromatina, se observa en formas específicas de leucemia y linfoma, tales como leucemia promielocítica aguda (APL), linfoma no de Hodgkin y leucemia mieloide aguda (AML). Sobrerregulación de HDAC1 al nivel de proteína se observó en células de cáncer de próstata, ya que la enfermedad progresa de lesiones malignas y adenocarcinoma de próstata sensible a andrógeno bien diferenciado, hacia el cáncer de próstata insensible a andrógeno fenotípicamente des-diferenciado. Además, expresión incrementada de HDAC2 se encuentra en la mayoría de los explantes de cáncer de colon humano que es desencadenada por la pérdida del supresor de tumores adenomatosis poliposis coli (APC). De acuerdo con el equilibrio de actividad de HDAC/HAT en cáncer, se ha mostrado que los inhibidores de HDAC inducen detención del ciclo celular, diferenciación terminal y/o apoptosis en un amplio espectro de líneas de células tumorales humanas in vitro, inhiben la angiogénesis y exhiben actividad antitumoral in vivo en modelos de xenoinjerto humano en ratones desnudos. La familia de enzimas HDAC se divide comúnmente en 3 clases: es decir, clases I, II y III. Sólo se ha implicado predominantemente que las clases I y II median los efectos de los inhibidores de HDAC comúnmente en desarrollo clínico.

Se ha mostrado que las HDACs del grupo clase I, que consisten de los miembros 1 a 3 y 8 de la familia de HDAC, son cruciales para la proliferación de células tumorales. Entre la amplia variedad de factores de transcripción que usan HDACs clase I para silenciar promotores específicos, el ejemplo mejor conocido es la clase de receptores de hormonas nucleares, que sólo se unen a HDAC3 en ausencia de su ligando, y de esta manera mantienen un estado de silenciamiento de la transcripción. El complejo es disociado en una manera dependiente del ligando, por ejemplo, por retinoides, estrógenos, andrógenos, etc., resultando en expresión y diferenciación génica. Otro ejemplo clave es el silenciamiento dependiente de HDAC1 , del inhibidor de cinasa dependiente de ciclina P21 wafl-Cip1. La función crucial de la inducción de P2-TaW en los efectos antiproliferativos de los inhibidores de HDAC, fue demostrada por estudios que muestran un incremento 6 veces mayor en resistencia al inhibidor de HDAC tricostatina A (TSA) en células deficientes en p2 wafLcip1 , en comparación con las células HCT-1 16 progenitoras. Además, a diferencia de genes supresores de tumores genuinos, p2 wafl'cip1 está presente ubicuamente en células tumorales, y es inducido por inhibidores de HDAC. Las histonas no son los únicos substratos de las HDACs clase I. Por ejemplo, las HDACs 1 a 3 desacetilan el supresores de tumores p53, que como consecuencia llega a ser ubiquitinado y degradado. Puesto que p53 es un supresor de tumores potente, incluyendo detención del ciclo celular y apoptosis, el mantenimiento de bajos niveles de esta proteína es clave para permitir la supervivencia y proliferación sin control de células tumorales. Las HDACs clase I pueden dividirse en dos subclases: clase Ha que contiene las HDACs 4, 5, 7 y 9, y la variante de empalme de HDAC 9 MITR. La clase llb comprende la HDAC6 y la HDAC 10, que tienen dominios de HDAC duplicados. Las HDACs clase Na no poseen actividad intrínseca de histona desacetilasa, pero regulan la expresión génica funcionando como los factores de enlace por puentes, puesto que se asocian con los complejos de HDAC clase I y con los complejos de ADN/factor de transcripción. HDAC6, un miembro de la clase llb, ha recibido atención debido a su identificación como una Hsp90 desacetilasa. Se ha demostrado que los inhibidores de HDAC LAQ824 y LBH589 inducen la desacetilación de Hsp90, mientras que la trapoxina y el butirato de sodio no hacen lo mismo. La Hsp90 desacetilasa resulta en la degradación de proteínas cliente pro-proliferativas y pro-supervivencia asociadas con Hsp90. Ejemplos clave incluyen Her-2, Bcr-Abl, receptor de glucocorticoides, FLT-3 muíante, c-Raf y Akt. Además de Hsp90, HDAC6 media íambién la desaceíilación de íubulina que resulta en desestabilización de los microtúbulos bajo condiciones de estrés. La función biológica de la HDAC6 fue confirmada además por el hecho de que un inhibidor de pequeñas moléculas específico de HDAC6, la tubacina, causó hiperacetilación de a-tubulina, y disminuyó la movilidad celular sin que afectara la progresión del ciclo celular. La tubacina, que inhibe sólo el dominio de desacetilasa de a-tubulina de HDAC6, causa sólo un incremento mínimo en la acetilación de Hsp90.

De acuerdo, se encontró que HDAC6 es clave para la migración celular estimulada por estradiol, de células de carcinoma de mama MCF-7. Por último, HDAC6 desempeña una función crucial en el manejo celular de proteínas mal plegadas y la depuración de éstas del citoplasma. Debido al gran número de proteínas reguladoras del ciclo celular reguladas por HDACs al nivel de su expresión o actividad, el efecto antiproliferativo de los inhibidores de HDAC no puede ser vinculado a un mecanismo de acción Individual. La inhibición de HDAC mantiene promesa particular en la terapia contra el cáncer, en donde los efectos concertados sobre vías múltiples implicadas en inhibición del crecimiento, diferenciación y apoptosis, pueden demostrar ser ventajosos en el tratamiento de una patología heterogénea tal como la formación y el crecimiento de tumores. Durante los años, ha llegado a ser evidente que las HDACs no sólo desempeñan una función clave en la carcinogénesis, sino también en muchos procesos de diferenciación no malignos. Esto es más evidente para la clase lia 4, 5, 7 y 9. Por ejemplo, se ha sugerido que HDAC7 desempeña una función crítica en la maduración tímica de células T, mientras que se ha implicado a HDAC4 en la regulación de la hipertrofia de condrocitos y la formación de hueso endocondral. Sin embargo, la mayoría de las inquietudes se han enfocado alrededor de la función de las HDACs clase lia en la diferenciación muscular. Las HDACs 4, 5, 7 y 9 suprimen la diferenciación de mlocitos (células musculares) como una consecuencia de ser co-represores de transcripción del factor 2 intenslficador de miocitos (MEF2).

La toxicidad más común vista con los inhibidores de HDAC, es la mielosupresión de grado leve a moderado. Además, náusea/vómito, fatiga y diarrea aparecen como efectos adversos en muchas pruebas clínicas. El documento EP 1485365, publicado el 18 de septiembre de 2003, describe, entre otros, el inhibidor de HDAC R306465.

El documento WO 2006/010750, publicado el 2 de febrero de 2006, describe la preparación, formulación y propiedades farmacéuticas de compuestos con la fórmula de Markush siguiente: las formas de N-óxido, las sales de adición farmacéuticamente aceptables y las formas estereoquímicamente isoméricas de los mismos, en donde n, m, R1, R2, R3, X y Y tienen los significados como se definen en dicha especificación. El potencial para la terapia con inhibidores de HDAC, va sin embargo más allá del uso de un agente individual. Las vías moleculares afectadas por los inhibidores de HDAC los hacen un candidato prometedor para estudios combinatorios. Existe la necesidad de inhibidores con efectos combinados sobre HDACs clase I y clase llb, que puedan ofrecer ventajas clínicas considerando la eficacia y/o toxicidad, ya sea solos o en combinaciones con otros agentes terapéuticos. También la inhibición de proteasomas representa una estrategia importante recién desarrollada en la terapia del cáncer. El proteasoma es un complejo de enzimas múltiples presente en todas las células, que desempeña una función en la degradación de proteínas implicadas en la regulación del ciclo celular. Muchas proteínas reguladoras clave, que incluyen a p53, ciclinas y la cinasa dependiente de ciclina p2*\ wafl,cip1 , son degradadas temporalmente durante el ciclo celular por la vía del proteasoma-ubiquitina. La degradación ordenada de estas proteínas se requiere para que la célula progrese a través del ciclo celular y sufra mitosis. Además, la vía del proteasoma-ubiquitina se requiere para la regulación de la transcripción. Los documentos EP788360, EP1312609, EP1627880, US 6066730 y US 6083903, describen éster borónico peptídico y compuestos ácidos útiles como inhibidores de proteasomas. Uno de los compuestos, ácido N-pirazincarbonil-L-fenilalanin-L-leucinborónico (PS-341 , conocido ahora como bortezomib o Velcade (Millenium), tiene actividad antitumoral en modelos de xenoinjerto de tumores humanos, y ha recibido aprobación para el tratamiento de pacientes que tienen mieloma múltiple refractario recurrente, y está actualmente sufriendo pruebas clínicas en otras indicaciones que incluyen cánceres hematológicos adicionales, así como tumores sólidos. Bortezomíb induce muerte celular, causando una acumulación de proteínas mal plegadas y de otra manera dañadas, activando de esta manera la vía mitocondrial de la apoptosis, por ejemplo, por medio de mecanismos dependientes de especies de oxígeno reactivas o Bax. Bortezomib causa el secuestro de proteínas conjugadas con ubiquitina en estructuras denominadas agresomas. Los agresomas parecen participar en una respuesta citoprotectora que es activada en respuesta a la inhibición de proteasomas, quizá lanzando proteínas ubiquitinadas hacia los lisosomas para degradación. La formación de agresomas inducida por bortezomib podría ser interrumpida usando el inhibidor de HDAC SAHA (ácido suberoilanilidohidroxámico). SAHA demuestra también efectos sinergísticos sobre la apoptosis in vitro, y en un modelo de xenoinjerto de cáncer pancreático ortotópico in vivo (Cáncer Research 2006; 66: (7) 3773-3781 ). Otro inhibidor de HDAC, LAQ824, demuestra también niveles sinergísticos de muerte celular con bortezomib (Journal of Biological Chemistry 2005; 280: (29) 26729-26734). El efecto sinergístico de SAHA y LAQ824 con bortezomib ha sido relacionado con su actividad inhibidora de HDAC6. Existe además la necesidad de incrementar la eficacia inhibidora de los inhibidores de proteasomas contra el crecimiento de tumores, y también para disminuir las dosificaciones de dichos agentes para reducir el potencial de efectos secundarios tóxicos adversos para el paciente. Por el momento, no están disponibles datos vigorosos de correlación del grado de acetilación con la respuesta tumoral. Métodos rápidos, simples y fácilmente reproducibles para cuantificar el grado de acetilación de substratos de histona y no de histona, causado por los inhibidores de HDAC descritos más adelante, o combinaciones que comprendan dichos inhibidores de HDAC, serán cruciales para su futuro. Es un objetivo de la invención proveer inhibidores de HDAC y combinaciones terapéuticas de un inhibidor de proteasomas e inhibidores de HDAC del tipo descrito más adelante, que puedan tener efectos de acetilación vigorosos y característicos, inhibición de HDACs clase I y clase llb, efecto inhibidor ventajoso contra el crecimiento de células tumorales, y menos efectos secundarios indeseables. De conformidad con la invención, se provee por lo tanto una combinación de un inhibidor del proteasoma y un inhibidor de HDAC de fórmula (I): las sales ácidas o básicas de adición farmacéuticamente aceptables, y las formas estereoquímicamente isoméricas del mismo, en donde: R4 se selecciona de hidrógeno o halo. Compuestos interesantes son aquellos compuestos de fórmula (I), en donde R4 es flúor. Compuestos más interesantes son aquellos compuestos de fórmula (I), en donde R4 está en la posición 4 ó 7 del indol. Compuestos preferidos de fórmula (I), son compuesto No. 1 a, compuesto No. 30 y compuesto No. 39, que corresponden a la numeración indicada en el documento WO 2006/010750.

Otros compuestos preferidos de fórmula (I), son los compuestos en donde R4 es hidrógeno. El compuesto más preferido es el compuesto No. 1 a (JNJ26481585): o una sal de adición farmacéuticamente aceptable del mismo. Las líneas trazadas en los sistemas de anillo bicíclico de los sustituyentes, indican que los enlaces pueden estar unidos a cualquiera de los átomos de anillo adecuados del sistema de anillo bicíclico. Como se usa en las definiciones anteriores y más adelante, halo es genérico para fluoro, cloro, bromo y yodo. Como se usa en la presente, se pretende que los términos "histona desacetilasa" y "HDAC" se refieran a cualquiera de una familia de enzimas que remueven grupos acetilo de los grupos épsilon-amino de residuos de lisina en el extremo N-terminal de una histona. A menos que se indique de otra manera por contexto, se pretende que el término "histona" se refiera a cualquier proteína histona, incluyendo H1 , H2A, H2B, H3, H4 y H5, de cualquier especie. Productos génicos o proteínas de HDAC de humano incluyen, pero no están limitados a, HDAC-1 , HDAC-2, HDAC-3, HDAC-4, HDAC-5, HDAC-6, HDAC-7, HDAC-8, HDAC-9, HDAC-10 y HDAC-1 1 . La histona desacetilasa puede derivarse también de un protozoario u hongo. El término "inhibidor de histona desacetilasa" se usa para identificar un compuesto, que es capaz de interactuar con una histona desacetilasa y de inhibir su actividad, más particularmente su actividad enzimática. La inhibición de la actividad enzimática de histona desacetilasa significa reducir la capacidad de una histona desacetilasa para remover un grupo acetilo de una histona u otro substrato de proteína. De preferencia, dicha inhibición específica, es decir, el inhibidor de histona desacetilasa reduce la capacidad de una histona deacetilasa para remover un grupo acetilo de una histona u otro substrato de proteína a una concentración que es menor de la concentración del inhibidor que se requiere para producir algún otro efecto biológico no relacionado. El término "inhibidores de HDAC con actividad combinada sobre HDACs clase I y clase llb" o "inhibición de HDACs clase I y clase llb", se usa para identificar compuestos que reducen la actividad enzimática de un miembro de la familia de HDAC clase I (HDACs 1 a 3 u 8) y un miembro de la familia de HDAC clase llb (HDACs 6 ó 10), a una concentración que es menor que la concentración del inhibidor que se requiere para producir inhibición de otras clases de enzimas HDAC tales como, por ejemplo, clase Na, o a una concentración que es menor que la concentración del inhibidor que se requiere para producir la inhibición de algún otro efecto biológico relacionado. Como se usa en la presente, se pretende que los términos "proteasoma" y "sistema del proteasoma-ubiquitina (UPS)" se refieran a cualquiera de las estructuras y funciones de todos los componentes en el UPS que incluyen, pero no están limitados a: a) las proteínas ubiquitina (Ub) y proteínas tipo ubiquitina (Ulp); por ejemplo, SUMO, NEDD8, ISG15, y similares, b) monómeros de ubiquitina, cadenas de poliubiquitina enlazadas a K48, cadenas de poliubiquitina enlazadas a K63, y similares, c) las enzimas activadoras de ubiquitina E1 ; por ejemplo, E1 Ub, E1SUM0, E1NEDD8, E1 ISG15, y similares, d) subunidades de las enzimas activadoras de ubiquitina E1 ; por ejemplo, APPBP1 , UBA3, SAE1 , SAE2, y similares, e) las enzimas conjugadoras de ubiquitina E2; por ejemplo, UBC9, UBC12, UBC8, y similares, f) las ubiquitina ligasas E3; por ejemplo, E3s del dedo de zinc anular, E3s del dedo de zinc anular simples, E3s del dedo de zinc anular basadas en culina, E3s dependientes de RBX1/RBX2, E3s del dominio de HECT, E3s de la caja U, y similares, g) el complejo SCF (SKP1-culina-caja F) ubiquitina ligasa E3, por ejemplo, SCFSKP2, SCF8-TRCP, SCFFBW7, y similares, h) las culinas, por ejemplo, CUL1 , CUL2, CUL3, CUL4, CUL5, y similares, i) las proteínas de la caja F, por ejemplo, proteínas SKP2, B-TRCP, proteínas FBW, y similares, j) otros adaptadores específicos del substrato, por ejemplo, proteínas BTB, proteínas de la caja SOCS, DDB1/2, VHL, y similares, k) el proteasoma, sus componentes, y similares, I) la metaloisopeptidasa RPN11 , una subunidad de la tapa del proteasoma, que desubiquitina objetivos del UPS antes de su destrucción, y similares, m) la metaloisopeptidasa CSN5, una subunidad del complejo de COP9-signalosoma, que es responsable de la remoción de NEDD8 de las culinas, y similares, n) el paso de activación, por una enzima activadora de ubiquitina E1 , en el cual las Ub/Ulp llegan a ser primero adeniladas en su residuo de glicina C-terminal, y entonces llegan a ser cargadas como un éster de tiol, de nuevo en su extremo C-terminal, o) la transferencia de las Ub/Ulp de una enzima activadora de ubiquitina E1 a una enzima conjugadora de ubiquitina E2, p) reconocimiento del conjugado de ubiquitina, q) transferencia y unión del complejo de substrato-ubiquitina con el proteasoma, r) remoción de la ubiquitina, o s) degradación del substrato. El término "inhibidor del proteasoma" e "inhibidor del sistema del proteasoma-ubiquitina" se usa para identificar un compuesto, que es capaz de interactuar con uno de los componentes normales, alterados, hiperactivos o sobreexpresados en el UPS, y que inhibe su actividad, más particularmente su actividad enzimática. La inhibición de la actividad enzimática del UPS significa reducir la capacidad de un componente del UPS para realizar su actividad. De preferencia, dicha inhibición es específica, es decir, el inhibidor del proteasoma reduce la actividad de un componente del UPS a una concentración que es menor que la concentración del inhibidor que se requiere para producir algún otro efecto biológico no relacionado. Los inhibidores de la actividad de un componente del UPS incluyen, pero no están limitados a: a) inhibidores de la adenilación de Ub o Ulp bloqueando el acceso de Ub/Ulp hacia el sitio del adenilato, o bloqueando el acceso del ATP; por ejemplo, imatinib (Gleevec; Novartis), y similares, b) interruptores de la interacción del E3 o complejo de E3 con E2, c) interruptores de la interacción entre el substrato y el dominio de interacción con el substrato en el E3 o complejo de E3, tal como bloqueando la interacción entre p53 (el substrato) y MDM2 (el del dedo-RING E3), por ejemplo, nutlinas (por unión a MDM2); RITA (por unión al extremo N-terminal de p53), y similares, d) interruptores del complejo de ligasa E3, e) reclutadores artificiales de substratos para las ubiquitina ligasas, por ejemplo, protacs, y similares, f) inhibidores del proteasoma y sus componentes, por ejemplo, bortezomib, carfilzomib, NPI-0052, Bsc2118, y similares, g) inhibidores de la remoción de ubiquitina/Ulp, tales como inhibidores de las metaloisopeptidasas RPN11 y CSN5, o h) modificación de la cadena de poliubiquitina, por ejemplo, ubistatinas, y similares.

Las sales ácidas de adición farmacéuticamente aceptables como se mencionó anteriormente, comprenden las formas de sales ácidas de adición no tóxicas terapéuticamente activas que los compuestos de fórmula (I) son capaces de formar. Los compuestos de fórmula (I), que tienen propiedades básicas, pueden ser convertidos en sus sales ácidas de adición farmacéuticamente aceptables, tratando dicha forma de base con un ácido adecuado. Acidos adecuados comprenden, por ejemplo, ácidos inorgánicos tales como ácidos hidrohálicos, por ejemplo, ácido clorhídrico o bromhídrico; sulfúrico; nítrico; fosfórico, y similares; o ácidos orgánicos tales como, por ejemplo, ácido acético, trifluoroacético, propanoico, hidroxiacético, láctico, pirúvico, oxálico, malónico, succínico (es decir, ácido butanodioico), maleico, fumárico, málico, tartárico, cítrico, metansulfónico, etansulfónico, bencensulfónico, p-toluensulfónico, ciclámico, salicílico, p-amino-salicílico, pamoico, y similares. Los compuestos de fórmulas (I), que tienen propiedades ácidas, pueden ser convertidos en sus sales básicas de adición farmacéuticamente aceptables, tratando dicha forma de ácido con una base orgánica o inorgánica adecuada. Formas de sal de base adecuadas comprenden, por ejemplo, las sales de amonio, las sales de metal alcalino y metal alcalinotérreo, por ejemplo, las sales de litio, sodio, potasio, magnesio, calcio, y similares, sales con bases orgánicas, por ejemplo, las sales de benzatina, N-metil-D-glucamina, hidrabamina, y sales con aminoácidos tales como, por ejemplo, arginina, lísina, y similares.

Los términos sales ácidas o básicas de adición comprenden también los hidratos y las formas de adición de solvente que los compuestos de fórmulas (I) son capaces de formar. Ejemplos de dichas formas son, por ejemplo, hidratos, alcoholatos, y similares. El término formas estereoquímicamente isoméricas de los compuestos de fórmulas (I), como se usó anteriormente, define todos los compuestos posibles formados de los mismos átomos unidos por la misma secuencia de enlaces, pero que tienen diferentes estructuras tridimensionales que no son intercambiables, que los compuestos de fórmulas (I) pueden poseer. A menos que se mencione o se indique de otra manera, la designación química de un compuesto abarca la mezcla de todas las formas estereoquímicamente isoméricas posibles que dicho compuesto puede poseer. Dicha mezcla puede contener todos los diastereómeros y/o enantiómeros de la estructura molecular básica de dicho compuesto. Se pretende que todas las formas estereoquímicamente isoméricas de los compuestos de fórmulas (I), tanto en forma pura como en mezcla entre sí, sean abarcadas dentro del alcance de la presente invención. Algunos de los compuestos de fórmula (I) pueden existir también en sus formas tautómeras. Se pretende que dichas formas, aunque no se indique explícitamente en la fórmula anterior, sean incluidas dentro del alcance de la presente invención. Cada vez que se use más adelante, se pretende que el término "compuestos de fórmula (I)" incluya también las sales ácidas o básicas de adición farmacéuticamente aceptables y todas las formas estereoisoméricas. Un inhibidor del proteasoma particularmente preferido para su uso de conformidad con la invención, es bortezomib. Bortezomib está disponible comercialmente de Millennium bajo el nombre de fábrica Velcade, y puede prepararse, por ejemplo, como se describe en los documentos EP788360, EP1312609, EP1627880, US 6066730 y US 6083903, o por procedimientos análogos a los mismos. La presente invención se refiere también a combinaciones de conformidad con la invención para su uso en terapia médica, por ejemplo, para inhibir el crecimiento de células tumorales. La presente invención se refiere también al uso de combinaciones de conformidad con la invención, en la preparación de una composición farmacéutica para inhibir el crecimiento de células tumorales. La presente invención se refiere también a un método para inhibir el crecimiento de células tumorales en un sujeto humano, que comprende administrar al sujeto una cantidad efectiva de una combinación de conformidad con la invención. Esta invención provee además un método para inhibir el crecimiento anormal de células, incluyendo células transformadas, administrando una cantidad efectiva de una combinación de conformidad con la invención. El crecimiento anormal de células se refiere a crecimiento celular independiente de mecanismos reguladores normales (por ejemplo, pérdida de inhibición por contacto). Esto incluye la inhibición del crecimiento tumoral directamente causando detención del crecimiento, diferenciación terminal y/o apoptosis de células cancerosas, e indirectamente, inhibiendo la migración, invasión y supervivencia de células tumorales o la neovascularización de tumores. Esta invención provee también un método para inhibir el crecimiento tumoral, administrando una cantidad efectiva de una combinación de conformidad con la presente invención, a un sujeto, por ejemplo, un mamífero (y más particularmente un humano) que necesita de dicho tratamiento. En particular, esta invención provee un método para inhibir el crecimiento de tumores mediante la administración de una cantidad efectiva de la combinación de conformidad con la presente invención. La presente invención es particularmente aplicable al tratamiento de cáncer pancreático, tumores hematopoyéticos de linaje linfoide, por ejemplo, leucemia linfoblástica aguda, leucemia mielógena aguda, leucemia promielocítíca aguda, leucemia mieloide aguda, leucemia monocítíca aguda, linfoma, leucemia crónica de células B, leucemia mieloide crónica, leucemia mieloide crónica en crisis de blastos, linfoma de Burkitt, mieloma múltiple, cáncer pulmonar de células no pequeñas, cáncer pulmonar de células pequeñas, linfoma no de Hodgkin, melanoma, cáncer de próstata, cáncer de mama y cáncer de colon. Ejemplos de otros tumores que pueden ser inhibidos incluyen, pero no están limitados a, cáncer folicular de tiroides, síndrome mielodisplásico (MDS), tumores de origen mesenquimático (por ejemplo, fibrosarcomas y rabdomiosarcomas), teratocarcinomas, neuroblastomas, gliomas, tumor benigno de la piel (por ejemplo, queratoacantomas), carcinoma de riñon, carcinoma de ovario, carcinoma de vejiga y carcinoma epidérmico. Esta invención provee también un método para el tratamiento de leucemia linfoblástica aguda, leucemia mielógena aguda, leucemia promielocítica aguda, leucemia mieloide aguda, leucemia monocítica aguda, linfoma, leucemia crónica de células B, leucemia mieloide crónica, leucemia mieloide crónica en crisis de blastos, linfoma de Burkitt y mieloma múltiple, administrando una cantidad efectiva de un inhibidor de histona desacetilasa de fórmula (I), a un sujeto, por ejemplo, un mamífero (y más particularmente un humano) que necesita de dicho tratamiento. Esta invención provee también un método para el tratamiento de tumores resistentes a fármacos tales como, pero no limitados a, tumores hematopoyéticos de linaje linfoide, por ejemplo, leucemia linfoblástica aguda resistente a fármacos, leucemia mielógena aguda resistente a fármacos, leucemia promielocítica aguda resistente a fármacos, leucemia mieloide aguda resistente a fármacos, leucemia monocítica aguda resistente a fármacos, linfoma resistente a fármacos, leucemia crónica de células B resistente a fármacos, leucemia mieloide crónica resistente a fármacos, leucemia mieloide crónica resistente a fármacos en crisis de blastos, linfoma de Burkitt resistente a fármacos y mieloma múltiple resistente a fármacos, administrando una cantidad efectiva de un inhibidor de histona desacetilasa de fórmula (I), ya sea solo o en combinación con un inhibidor del proteasoma, a un sujeto, por ejemplo, un mamífero (y más particularmente un humano) que necesita de dicho tratamiento. La presente invención es particularmente aplicable al tratamiento de mieloma múltiple resistente a fármacos, más particularmente a mieloma múltiple resistente a inhibidores de proteasomas, aún más particularmente al tratamiento de mieloma múltiple resistente a bortezomib. El término "mieloma múltiple resistente a fármacos" incluye, pero no está limitado a, mieloma múltiple resistente a uno o más fármacos seleccionados del grupo de talidomida, dexametasona, revlimid, doxorrubicina, vincristina, ciclofosfamida, pamidronato, melfalán, defibrótido, prednisona, darinaparsina, belinostat, vorinostat, PD 0332991 , LBH589, LAQ824, MGCD0103, HuLuc63, AZD 6244, Pazopanib, P276-00, plitidepsina, bendamustina, tanespimicina, enzastaurina, perifosina, ABT-737 o RAD001. El término "mieloma múltiple resistente a fármacos" incluye también mieloma múltiple refractario o recurrente. Con el término "resistente a fármacos" se entiende una condición que demuestra resistencia intrínseca o resistencia adquirida. Con "resistencia intrínseca" se entiende el perfil de expresión característico en células cancerosas de genes clave en vías relevantes que incluyen, pero no están limitadas a, apoptosis, progresión celular y reparación de ADN, que contribuyen a la capacidad de crecimiento más rápida de células cancerosas cuando se comparan con sus contrapartes normales. Con "resistencia adquirida" se entiende un fenómeno multifactorial que ocurre en la formación y progresión de tumores que puede influir sobre la sensibilidad de las células cancerosas a un fármaco. La resistencia adquirida puede deberse a varios mecanismos tales como, pero no limitados a, alteraciones en objetivos de fármacos, acumulación disminuida de fármacos, alteración de la distribución intracelular de fármacos, interacción reducida de fármaco-objetivo, respuesta incrementada a la destoxificación, desregulación del ciclo celular, reparación incrementada de ADN dañado y respuesta apoptótica reducida. Varios de dichos mecanismos pueden ocurrir simultáneamente, y/o pueden interactuar entre sí. Su activación y/o inactivación puede deberse a eventos genéticos o epigenéticos, o a la presencia de proteínas oncovirales. Puede ocurrir resistencia adquirida a fármacos individuales, pero pueden ocurrir también más ampliamente a muchos fármacos diferentes con diferentes estructuras químicas y diferentes mecanismos de acción. Esta forma de resistencia se denomina resistencia a fármacos múltiples. La combinación de conformidad con la invención puede usarse para otros propósitos terapéuticos, por ejemplo: a) la sensibilización de tumores a la radioterapia, administrando el compuesto de conformidad con la invención antes, durante o después de la irradiación del tumor para el tratamiento de cáncer; b) el tratamiento de artropatías y condiciones osteopatológicas tales como artritis reumatoide, osteoartritis, artritis juvenil, gota, poliartritis, artritis psoriática, espondilitis alquilosante y lupus eritematoso sistémico; c) inhibición de la proliferación de células de músculo liso, incluyendo trastornos proliferativos vasculares, aterosclerosis y restenosis; d) el tratamiento de condiciones inflamatorias y condiciones dérmicas tales como colitis ulcerativa, enfermedad de Crohn, rinitis alérgica, enfermedad de injerto contra hospedero, conjuntivitis, asma, ARDS, enfermedad de Behget, rechazo de trasplante, urticaria, dermatitis alérgica, alopecia areata, esclerodermia, exantema, eczema, dermatomiositis, acné, diabetes, lupus eritematoso sistémico, enfermedad de Kawasaki, esclerosis múltiple, enfisema, fibrosis quística y bronquitis crónica; e) el tratamiento de endometriosis, fibroides uterinos, sangrado uterino disfuncional e hiperplasia endometrial; f) el tratamiento de vascularización ocular, incluyendo vasculopatía que afecta a vasos retiñíanos y coroidales; g) el tratamiento de una disfunción cardiaca; h) inhibición de condiciones inmunosupresoras tales como el tratamiento de infecciones por VIH; i) el tratamiento de disfunción renal; j) la supresión de trastornos endocrinos; k) inhibición de la disfunción de la gluconeogénesis; I) el tratamiento de una neuropatología, por ejemplo, enfermedad de Parkinson o una neuropatología que resulta en un trastorno cognitivo, por ejemplo, enfermedad de Alzheimer o enfermedades neuronales relacionadas con poliglutamina; m) el tratamiento de trastornos psiquiátricos, por ejemplo, esquizofrenia, trastorno bipolar, depresión, ansiedad y psicosis; n) inhibición de una patología neuromuscular, por ejemplo, esclerosis lateral amilotrófica; o) el tratamiento de atrofia muscular espinal; p) el tratamiento de otras condiciones patológicas sujetas a tratamiento potenciando la expresión de un gen; q) mejora de la terapia génica; r) inhibición de adipogénesis; y s) el tratamiento de parasitosis tales como la malaria. Por lo tanto, la presente invención describe las combinaciones descritas anteriormente para su uso como un medicamento, así como el uso de un inhibidor de HDAC de fórmula (I) con actividad combinada sobre HDACs clase I y clase llb, ya sea solo o en combinación con un inhibidor del proteasoma, en la fabricación de un medicamento para tratar una o más de las condiciones mencionadas anteriormente. De esta manera, la presente invención describe el uso de un inhibidor de HDAC de fórmula (I) con actividad combinada sobre HDACs clase I y clase llb, ya sea solo o en combinación, en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de leucemia linfoblástica aguda, leucemia mielógena aguda, leucemia promielocítica aguda, leucemia mieloide aguda, leucemia monocítica aguda, linfoma, leucemia crónica de células B, leucemia mieloide crónica, leucemia mieloide crónica en crisis de blastos, linfoma de Burkitt y mieloma múltiple. La presente invención describe también el uso de un inhibidor de HDAC de fórmula (I) con actividad combinada sobre HDACs clase I y clase llb, ya sea solo o en combinación, en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de tumores resistentes a fármacos tales como, pero no limitados a, tumores hematopoyéticos de linaje linfoide, por ejemplo, leucemia linfoblástica aguda resistente a fármacos, leucemia mielógena aguda resistente a fármacos, leucemia promielocítica aguda resistente a fármacos, leucemia mieloide aguda resistente a fármacos, leucemia monocítica aguda resistente a fármacos, linfoma resistente a fármacos, leucemia crónica de células B resistente a fármacos, leucemia mieloide crónica resistente a fármacos, leucemia mieloide crónica resistente a fármacos en crisis de blastos, linfoma de Burkitt resistente a fármacos y mieloma múltiple resistente a fármacos. La presente invención describe además el uso de un inhibidor de HDAC de fórmula (I) con actividad combinada sobre HDACs clase I y clase llb, ya sea solo o en combinación, en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de mieloma múltiple resistente a fármacos, más en particular de mieloma múltiple resistente a inhibidores de proteasomas, incluso más en particular de mieloma múltiple resistente a bortezomib. El inhibidor del proteasoma y el inhibidor de HDAC de fórmula (I) pueden administrarse simultáneamente (por ejemplo, en composiciones separadas o unitarias) o secuencialmente en cualquier orden. En el último caso, los dos compuestos se administrarán dentro de un período y en una cantidad y manera que sea suficiente para asegurar que se logre un efecto ventajoso o sinergístico. Se apreciará que el método y el orden de administración preferidos y las cantidades y los regímenes de dosificación respectivos para cada componente de la combinación, dependerán del inhibidor del proteasoma particular y el inhibidor de HDAC que esté siendo administrado, la vía de administración de la combinación, el tumor particular que esté siendo tratado y el hospedero particular que esté siendo tratado. El método y el orden de administración y las cantidades y el régimen de dosificación óptimos pueden ser determinados fácilmente por los expertos en la técnica usando métodos convencionales y en vista de la información expuesta en la presente. La presente invención se refiere además a un producto que contiene, como primer ingrediente activo, un inhibidor de HDAC de fórmula (I), y como segundo ingrediente activo un inhibidor del proteasoma, como una preparación combinada para uso simultáneo, separado o secuencial, en el tratamiento de pacientes que sufren de cáncer. Los expertos en la técnica podrían determinar fácilmente la cantidad efectiva a partir de los resultados de prueba presentados más adelante. En general, se contempla que una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto de fórmula (I) y de un inhibidor del proteasoma sería de 0.005 mg/kg a 100 mg/kg de peso corporal, y en particular de 0.005 mg/kg a 10 mg/kg de peso corporal. Puede ser adecuado administrar la dosis requerida como dos, tres, cuatro o más subdosis a intervalos adecuados a lo largo del día. Dichas subdosis pueden formularse como formas de dosificación unitaria, por ejemplo, conteniendo de 0.5 a 500 mg, y en particular de 10 mg a 500 mg de ingrediente activo por forma de dosificación unitaria. En vista de sus propiedades farmacológicas útiles, los componentes de las combinaciones de conformidad con la invención, es decir, el inhibidor del proteasoma y el inhibidor de HDAC, pueden formularse en varias formas farmacéuticas para propósitos de administración. Los componentes pueden formularse por separado en composiciones farmacéuticas individuales o en una composición farmacéutica unitaria que contenga ambos componentes. Los inhibidores de HDAC pueden prepararse y formularse en composiciones farmacéuticas mediante métodos conocidos en la técnica, y en particular de conformidad con los métodos descritos en la especificación de patente publicada mencionada en la presente e incorporada en la presente como referencia. La presente invención se refiere también por lo tanto a una composición farmacéutica que comprende un inhibidor del proteasoma y un inhibidor de HDAC de fórmula (I), junto con uno o más vehículos farmacéuticos. Para preparar composiciones farmacéuticas para su uso de conformidad con la invención, una cantidad efectiva de un compuesto particular, en forma de sal básica o ácida de adición, como el ingrediente activo, se combina en mezcla íntima con un vehículo farmacéuticamente aceptable, en donde el vehículo puede tomar una amplia variedad de formas, dependiendo de la forma de preparación deseada para administración. Estas composiciones farmacéuticas están deseablemente en forma de dosificación unitaria adecuada, de preferencia, para administración oralmente, rectalmente, percutáneamente o por inyección parenteral. Por ejemplo, en la preparación de las composiciones en forma de dosificación oral, puede usarse cualquiera de los medios farmacéuticos usuales tales como, por ejemplo, agua, glicoles, aceites, alcoholes, y similares, en el caso de preparaciones líquidas orales tales como suspensiones, jarabes, elíxires y soluciones; o vehículos sólidos tales como almidones, azúcares, caolín, lubricantes, aglutinantes, agentes de desintegración, y similares, en el caso de polvos, pildoras, cápsulas y tabletas. Debido a su facilidad de administración, las tabletas y cápsulas representan la forma unitaria de dosificación oral más ventajosa, en cuyo caso se usan obviamente vehículos farmacéuticos sólidos. Para composiciones parenterales, el vehículo comprenderá usualmente agua estéril, por lo menos en gran parte, aunque pueden incluirse otros ingredientes que faciliten la solubilidad, por ejemplo. Pueden prepararse soluciones inyectables, por ejemplo, en las cuales el vehículo comprenda solución salina, solución de glucosa o una mezcla de solución salina y solución de glucosa. Pueden prepararse también suspensiones inyectables, en cuyo caso pueden usarse vehículos líquidos, agentes de suspensión, y similares adecuados. En las composiciones adecuadas para administración percutánea, el vehículo comprende opcionalmente un agente intensificador de penetración y/o un agente mojante adecuado, opcionalmente combinado con aditivos adecuados de cualquier naturaleza en proporciones menores, cuyos aditivos no causen un efecto deletéreo significativo a la piel. Dichos aditivos pueden facilitar la administración a la piel y/o pueden ser útiles para preparar las composiciones deseadas. Estas composiciones pueden administrarse en varias formas, por ejemplo, como un parche transdérmico, como un producto aplicable o como un ungüento. Es especialmente ventajoso formular las composiciones farmacéuticas mencionadas anteriormente en forma unitaria de dosificación para facilidad de administración y uniformidad de dosificación. La forma unitaria de dosificación, como se usa en la especificación y en las reivindicaciones en la presente, se refiere a unidades físicamente discretas adecuadas como dosificaciones unitarias, cada unidad conteniendo una cantidad predeterminada de ingrediente activo calculada para producir el efecto terapéutico deseado en asociación con el vehículo farmacéutico requerido. Ejemplos de dichas formas unitarias de dosificación son tabletas (incluyendo tabletas ranuradas o recubiertas), cápsulas, pildoras, paquetes de polvo, obleas, suspensiones o soluciones inyectables, cucharadas, cucharaditas, y similares, y múltiplos segregados de los mismos. Puede ser adecuado administrar la dosis requerida de cada componente de la combinación como dos, tres, cuatro o más subdosis a intervalos adecuados a lo largo del curso de tratamiento. Las subdosis pueden formularse como formas de dosificación unitaria, por ejemplo, en cada caso conteniendo independientemente de 0.01 a 500 mg, por ejemplo, de 0.1 a 200 mg y en particular de 1 a 100 mg, de cada ingrediente activo por forma de dosificación unitaria.

El término "la inducción de la acetilacion de histonas u otras proteínas", significa la inducción del estado de acetilacion de substratos de HDAC tales como, pero no limitados a, histonas, por ejemplo, histona 3, histona 4, y similares; tubulina, por ejemplo, alfa-tubulina, y similares; proteínas de choque térmico, por ejemplo, Hsp 90, y similares. El término "la inducción de proteínas funcionalmente reguladas por dicha acetilacion" significa efectos secundarios tales como, pero no limitados a, la inducción de Hsp70, inducción de p21 , y similares. La invención se refiere también a un método para la caracterización de un inhibidor de HDAC de fórmula (I), ya sea solo o en combinación con un inhibidor del proteasoma, que comprende la determinación, en una muestra, de la cantidad de inducción de acetilacion de histonas u otras proteínas, o de la inducción de proteínas funcionalmente reguladas por dicha acetilacion. Más en particular, la invención se refiere a un método para la caracterización de un inhibidor de HDAC de fórmula (I), ya sea solo o en combinación con un inhibidor del proteasoma, que comprende la determinación, en una muestra, de la cantidad de: a) inducción de acetilacion de histona 3, inducción de acetilacion de histona 4 o inducción de p21 , y b) inducción de acetilacion de alfa-tubulina, inducción de acetilacion de Hsp 90 o inducción de Hsp 70. Más en particular, la invención se refiere al método anterior, en donde la concentración necesaria para lograr la inducción bajo a), está en la misma escala que la concentración para lograr la inducción bajo b). La determinación, en una muestra, de la cantidad de inducción de acetilación de histonas u otras proteínas o de la inducción de proteínas funcionalmente reguladas por dicha acetilación, puede abarcar la identificación de pacientes que responden a un tratamiento, y de esta manera puede tener un efecto benéfico para el tratamiento de cáncer en humanos. La determinación, en una muestra, de la cantidad de inducción de acetilación de histonas u otras proteínas o de la inducción de proteínas funcionalmente reguladas por dicha acetilación, puede abarcar monitorear la eficacia de un tratamiento en pacientes, y de esta manera puede tener un efecto benéfico para el tratamiento de cáncer en humanos. La determinación, en una muestra, de la cantidad de inducción de acetilación de histonas u otras proteínas o de la inducción de proteínas funcionalmente reguladas por dicha acetilación, puede abarcar predecir respuestas terapéuticas a un tratamiento, y de esta manera puede tener un efecto benéfico para el tratamiento de cáncer en humanos. Por lo tanto, la presente invención se refiere también al uso de un inhibidor de HDAC de fórmula (I), con actividad combinada sobre HDACs clase I y clase llb, ya sea solo o en combinación con un inhibidor del proteasoma, en donde la inducción de hiperacetilación de histonas u otras proteínas, o la inducción de proteínas funcionalmente reguladas por dicha acetilación, tiene un efecto benéfico para el tratamiento de cáncer en humanos.

La muestra puede derivarse de células que hayan sido tratadas con dicho inhibidor de HDAC o dicha combinación. La muestra puede derivarse también de tejido afectado por un trastorno y/o de individuos tratados con un inhibidor de HDAC de fórmula (I), o una combinación de un inhibidor del proteasoma y un inhibidor de HDAC de fórmula (I). Las células pueden ser células de cultivo que hayan sido puestas en contacto con dicho inhibidor de HDAC o dicha combinación. Dicho inhibidor o dicha combinación puede añadirse al medio de crecimiento de las células. Las células pueden derivarse también de un tejido y/o de un individuo que se trató con dicho inhibidor o dicha combinación. De preferencia, el método de caracterización comprende sólo pasos que se llevan a cabo in vitro. Por lo tanto, de conformidad con esta modalidad, el paso para obtener el material de tejido del cuerpo humano o del animal no es abarcado por la presente invención. Las células se procesan usualmente para que estén en una condición que sea adecuada para el método usado, para determinar la inducción de acetilacion de histonas u otras proteínas o la inducción de proteínas funcionalmente reguladas por dicha acetilacion. El procesamiento puede incluir homogenización, extracción, fijación, lavado y/o permeabilización. La forma de procesamiento depende en gran parte del método usado para la determinación de la inducción de acetilacion de histonas u otras proteínas, o la inducción de proteínas funcionalmente reguladas por dicha acetilacion. La muestra puede derivarse de una biopsia del paciente. La biopsia puede tratarse además para dar una muestra que esté en una condición adecuada para el método usado para determinar la inducción de acetilación de histonas u otras proteínas, o la inducción de proteínas funcionalmente reguladas por dicha acetilación. La cantidad de acetilación de proteínas o la cantidad de proteína inducida, puede determinarse mediante el uso de un anticuerpo. Como se usa en la presente, el término "anticuerpo" designa una inmunoglobulina o un derivado de la misma que tenga la misma especificidad de unión. El anticuerpo usado de conformidad con la invención puede ser un anticuerpo monoclonal o un anticuerpo derivado de o comprendido en un antisuero policlonal. El término "anticuerpo" significa además derivados tales como fragmentos Fab, F(ab')2, Fv o scFv. El anticuerpo o el derivado del mismo puede ser de origen natural, o puede producirse (semi)sintéticamente. Puede usarse Western blotting que se conoce generalmente en la técnica. El material o tejido celular puede homogenizarse y tratarse con agentes desnaturalizantes y/o reductores para obtener las muestras. La muestra puede cargarse sobre un gel de poliacrilamida para separar las proteínas, seguido de transferencia a una membrana, o puede ser aplicada directamente sobre una fase sólida. El anticuerpo es entonces puesto en contacto con la muestra. Después de uno o más pasos de lavado, el anticuerpo unido se detecta usando técnicas que se conocen en la materia. Puede usarse inmunohistoquímica después de la fijación y permeabilización del material de tejido, por ejemplo, cortes de tumores sólidos, el anticuerpo es incubado entonces con la muestra, y después de uno o más pasos de lavado, el anticuerpo unido es detectado. La cantidad de la inducción de acetilación de histonas u otras proteínas, o la inducción de proteínas funcionalmente reguladas por dicha acetilación, puede determinarse mediante ELISA. Puede contemplarse una variedad de formatos de la ELISA. En un formato, el anticuerpo es inmovilizado sobre una fase sólida tal como una placa de microtítulo, seguido de bloqueo de sitios de unión específicos e incubación con la muestra. En otro formato, la muestra es puesta primero en contacto con la fase sólida para inmovilizar las proteínas acetiladas y/o inducidas contenidas en la muestra. Después del bloqueo y opcionalmente lavado, el anticuerpo es puesto en contacto con la muestra inmovilizada. La cantidad de la inducción de acetilación de histonas u otras proteínas, o la inducción de proteínas funcionalmente reguladas por dicha acetilación, puede determinarse mediante citometría de flujo. Células, por ejemplo, células de cultivo de células o células sanguíneas o células de médula ósea, son fijadas y permeabilizadas para permitir que el anticuerpo llegue a las proteínas acetiladas y/o inducidas. Después de pasos opcionales de lavado y bloqueo, el anticuerpo es puesto en contacto con las células. Se realiza entonces citometría de flujo de acuerdo con procedimientos conocidos en la técnica para determinar células que tengan anticuerpo unido a las proteínas acetiladas y/o inducidas. Para determinar si un inhibidor de HDAC o una combinación de un inhibidor del proteasoma y un inhibidor de HDAC de fórmula (I) tiene esta actividad, puede determinarse la cantidad de acetilación de una proteína o la inducción de una proteína en una muestra de referencia, en donde la muestra de referencia se deriva de células que no hayan sido tratadas con dicho inhibidor de HDAC o dicha combinación. La determinación de la cantidad de acetilación de proteínas y/o la cantidad de proteína inducida en la muestra y la muestra de referencia, puede realizarse en paralelo. En el caso de células de cultivo de células, se proveen dos composiciones celulares, una de las cuales se trata con dicho inhibidor de HDAC o dicha combinación, mientras que la otra se deja sin tratar. Después, ambas composiciones se producen adicionalmente, y se determinan las cantidades respectivas de acetilación de proteínas y/o la cantidad de proteína inducida. En forma alternativa, para determinar si un inhibidor de HDAC o una combinación de un inhibidor del proteasoma y un inhibidor de HDAC de fórmula (I) tienen esta actividad, puede determinarse la inhibición de la proliferación celular. En el caso de pacientes, la muestra se deriva de un paciente que haya sido tratado con el inhibidor de HDAC de fórmula (I) o la combinación de un inhibidor del proteasoma y un inhibidor de HDAC de fórmula (I). La muestra de referencia se deriva de otro paciente que sufre del mismo trastorno que no haya sido tratado con dicho inhibidor de HDAC o dicha combinación, o de un individuo sano. El tejido del cual la muestra de referencia se deriva, corresponde al tejido del cual la muestra se deriva. Por ejemplo, si la muestra se deriva de tejido tumoral de un paciente con cáncer de mama, la muestra de referencia se deriva también de tejido tumoral de un paciente con cáncer de mama, o de tejido de mama de un individuo sano. Puede contemplarse también que la muestra y la muestra de referencia, se derivan del mismo individuo. En este caso, el tejido, del cual la muestra de referencia se deriva, se obtuvo del individuo antes o después del tratamiento del individuo con dicho inhibidor de HDAC o dicha combinación. De preferencia, el tejido se obtiene antes del tratamiento para excluir posibles efectos posteriores del tratamiento con el inhibidor después de la descontinuación del tratamiento.

Parte experimental A. Ejemplo farmacológico Para la actividad celular de los compuestos de fórmula (I) que se determinó sobre células tumorales A2780 usando una prueba colorimétrica para toxicidad o supervivencia de células (Mosmann Tim, Journal of Immunological Methods 65: 55-63, 1983), se hace referencia a la parte experimental del documento WO 2006/010750. Los efectos antiproliferativos de inhibidores de HDAC han sido vinculados a la inhibición de HDACs clase I, que consiste de los miembros 1 a 3 y 8 de la familia de HDAC. La actividad de JNJ 26481585 sobre HDAC1 inmunoprecipitada de células A2780 y su potencia cuando se compara con R306465, SAHA, LBH-589 y LAQ-824, puede encontrarse en el ejemplo A.1 .

La actividad de JNJ 26481585 sobre la enzima recombinante humana HDAC8 y su potencia cuando se compara con R306465, SAHA, LBH-589 y LAQ-824, puede encontrarse en el ejemplo A.2. Se investigó además si R306465 modula el estado de acetilación de los substratos de HDAC 1 histona 3 (H3) e histona 4 (H4). También se investigó la inducción del inhibidor de cinasa dependiente de ciclina p21 en células de carcinoma ovárico A2780. P2 wafl'cip1 es reprimido como una consecuencia de la acetilación de la histona, y desempeña una función clave en la inducción de la detención del ciclo celular en respuesta a los inhibidores de HDAC (véase ejemplo A.3). Para evaluar la inhibición de HDAC6, y la potencia relativa de los compuestos para HDAC1 contra HDAC6, se monitoreó la acetilación de su substrato tubulina, y la inducción de Hsp 70, que es la consecuencia de la acetilación de Hsp 90 (véase ejemplo A.4).

EJEMPLO A Especificidad de la clase I y efectos de acetilación de los compuestos de fórmula (I) EJEMPLO A.1 Inhibición de la enzima HDAC1 inmunoprecipitada de células A2780 Para pruebas de actividad de HDAC1 , se inmunoprecipitó HDAC1 de lisados de células A2780, y se incubó con una curva de concentración del inhibidor de HDAC indicado, y con un fragmento de péptido H4 marcado con acetilo tritiado (50,000 cpm) [biotina-(6-aminohexanoico)Gly-Ala-(acetilo[3H]Lys-Arg-His-Arg-Lys-Val-NH2] (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ). Se evaluó la actividad de HDAC midiendo la liberación de grupos acetilo libres. Los resultados se expresan como valores de IC50 promedio ± desviación estándar (SD) para tres experimentos independientes.

EJEMPLO A.2 Inhibición de la enzima recombinante humana HDAC8 Para la inhibición de HDAC8 recombinante humana, se usó el equipo de descubrimiento de fármacos/prueba de actividad fluorimétrica/colo métrica de HDAC8 (Biomol; No. de catálogo AK-508). Los resultados se expresan como valores de IC5o promedio (nM) ± desviación estándar para tres experimentos independientes. Las pruebas se realizaron por duplicado, y el error estándar de la IC50 se calculó usando Graphpad Prism (Software Graphpad).

Inhibición de HDAC8 IC5o en nM JNJ 26481585 34 ± 41 R306465 23 ± 17 SAHA 370 ± 314 LAQ-824 37 ± 23 LBH-589 283 ± 29 EJEMPLO A.3 Acetilación de substratos celulares de HDAC1 e inducción de p2iwafl c'P1 Se incubaron células de carcinoma ovárico A2780 de humano con 0, 1 , 3, 10, 30, 100, 300, 1000 y 3000 nM de los compuestos por 24 horas.

Se prepararon lisados de células totales y se analizaron mediante SDS-PAGE. Se detectaron los niveles de las histonas H3 y H4 acetiladas, el nivel total de proteínas H3 y los niveles de la proteína p2 wafl cip1, usando anticuerpos monoclonales de ratón y anticuerpos policlonales de conejo, seguido de detección mejorada de quimioluminiscencia (ECL).

Se detectaron los niveles de H3 y H4 acetiladas con anticuerpos de Upstate Biotechnology (No. de catálogo 06-299 y 06-866), se detectó el nivel total de proteínas H3 con anticuerpos de Abcam (No. de catálogo ab1791 ), y se detectó el nivel de proteína p2 wafl cip1 con anticuerpos de Transduction Laboratories (No. de catálogo C24420). Diluciones adecuadas de anticuerpos se incubaron por 1 a 2 horas a temperatura ambiente o durante la noche a 4°C. Para controlar la carga igual, se extrajeron blots y se resondearon con IgM anti-actina monoclonal de ratón (Ab-1 , Oncogene Research Products). Para controlar la eficiencia de extracción de proteínas nucleares, se extrajeron blots y se resondearon con B1 anti-lamina (Zymed; No. de catálogo 33.2000). Se visualizaron entonces complejos de proteína-anticuerpo mediante quimioluminiscencia (Pierce Chemical Co.) o fluorescencia (Odyssey), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los experimentos se realizaron tres veces.

EJEMPLO A.4 Acetilación de tubulina y la inducción de Hsp70 Se incubaron células de carcinoma ovárico A2780 de humano con 0, 1 , 3, 10, 30, 100, 300, 1000 y 3000 nM de los compuestos por 24 horas. Se prepararon lisados de células totales y se analizaron mediante SDS-PAGE. Se detectaron los niveles de tubulina total y acetilada usando anticuerpos de Sigma: clones DM1 A (No. de catálogo T9026) y 6- 1 1 1 B (No. de catálogo T6793). Se detectó la proteína Hsp 70 con un anticuerpo de Stressgen (No. de catálogo SPA-810), seguido de detección de ECL. Diluciones adecuadas de anticuerpos se incubaron por 1 a 2 horas a temperatura ambiente o durante la noche a 4°C. Para controlar la carga igual, se extrajeron blots y se resondearon con IgM anti-actina monoclonal de ratón (Ab-1 , Oncogene Research Products). Para controlar la eficiencia de extracción de proteínas nucleares, se extrajeron blots y se resondearon con B1 anti-lamina (Zymed; No. de catálogo 33.2000). Se visualizaron entonces complejos de proteína-anticuerpo mediante quimioluminíscencia (Pierce Chemical Co.) o fluorescencia (Odyssey), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los experimentos se realizaron tres veces.

EJEMPLO B Inhibición de la proliferación de células tumorales hematológicas humanas La evaluación de la actividad antiproliferativa de JNJ 26481585 en un panel de líneas de células tumorales hematológicas humanas se realizó en Oncodesign (Dijon, Francia). Se desarrollaron células tumorales como una suspensión de células en el medio de cultivo adecuado correspondiente a 37°C en una incubadora humidificada con CO2 a 5%. Se sembraron células tumorales libres de micoplasmas en placas de microfiltración de fondo plano de 96 cavidades, y se incubaron a 37°C por 24 horas en medio de cultivo que contenía FCS a 10%. Se expuso entonces a las células tumorales a vehículo (control) o concentraciones crecientes de JNJ 26481585 (5 diferentes concentraciones*), bortezomib (5 diferentes concentraciones*), o combinación de ambos fármacos a varias relaciones. Las células se incubaron entonces por otras 72 horas. La actividad citotóxica de los compuestos se reveló mediante prueba de MTS estándar por medición de la absorbancia a 490 nm. Las interacciones de los compuestos (sinergia, aditividad o antagonismo) se calcularon por análisis múltiple del efecto de los fármaco, y se realizaron mediante el principio de ecuación de la mediana de acuerdo con la metodología descrita por Chou y Talalay [CHOU et al. (1984), Adv. Enzyme Regul. 22: 27-55; CHOU et al. (1991 ), en Encyclopaedia of human Biology. Academic Press. 2: 371 -379; CHOU et al. (1991 ), en Synergism and antagonism in chemotherapy. Academic Press: 61 -102; CHOU et al. (1994), J. Nati. Cáncer Inst. 86: 1517-1524]. *: con base en la predeterminación de la actividad antiproliferativa de cada fármaco usado como agente individual, se eligieron concentraciones que no excedieran 50% de inhibición en cada una de las líneas de células seleccionadas.

EJEMPLO B.1 Inhibición de la proliferación de células tumorales hematologicas humanas por JNJ 26481585 Los resultados se expresan como el valor de IC40 medio (es decir, concentración, expresada en nM, requerida para lograr 40% de inhibición de la proliferación celular) ± desviación estándar, determinada a partir de 3 experimentos confiables independientes.

CUADRO F.1 Línea de células Tipo Media SD CCRF-CEM Leucemia linfoblástica aguda 1 1.93 7.18 Jurkat, clon E6-1 Leucemia linfoblástica aguda 9.22 1 .78 KG-1 Leucemia mielógena aguda 13.39 10.48 MOLT-4 Leucemia linfoblástica aguda 42.96 56.25 SUP-B15 Leucemia linfoblástica aguda 1.13 Leucemia promielocítica HL-60 24.28 10.72 aguda OCI-AML2 Leucemia mieloide aguda 19.56 13.93 THP-1 Leucemia monocítica aguda 50.65 22.84 EHEB Leucemia crónica de células B 165.81 128.15 BV-173 Leucemia crónica de células B 4.54 4.28 K-562 Leucemia mieloide crónica 15.91 8.29 KCL-22 Leucemia mieloide crónica 7.71 5.14 Leucemia mieloide crónica en LAMA-84 30.40 19.93 crisis de blastos U-937 Linfoma 23.67 10.14 Daudi Linfoma de Burkitt 9.08 1 .27 Namalwa Linfoma de Burkitt 4.65 4.32 Raji Linfoma de Burkitt 26.34 16.1 1 Ramos Linfoma de Burkitt 4.66 2.82 ARH-77 Mieloma 40.42 24.32 RPMI 8226 Mieloma 6.41 5.44 EJEMPLO B.2 Inhibición de la proliferación de células tumorales hematolóqicas humanas por bortezomib Los resultados se expresan como el valor de IC 0 medio (es decir, concentración, expresada en nM, requerida para lograr 40% de inhibición de la proliferación celular) ± desviación estándar, determinada a partir de 3 experimentos confiables independientes.

CUADRO F.2 Línea de células Tipo Media SD CCRF-CEM Leucemia linfoblástica aguda 4.40 0.84 Jurkat, clon E6-1 Leucemia linfoblástica aguda 5.63 2.68 KG-1 Leucemia mielógena aguda 3.36 0.83 MOLT-4 Leucemia linfoblástica aguda 12.14 12.91 SUP-B15 Leucemia linfoblástica aguda 2.40 Leucemia promielocítica HL-60 13.38 1 .99 aguda OCI-AML2 Leucemia mieloide aguda 1 1.64 1 1 .61 THP-1 Leucemia monocítica aguda 5.83 0.94 EHEB Leucemia crónica de células B 6.02 0.34 BV-173 Leucemia crónica de células B 2.77 0.20 K-562 Leucemia mieloide crónica 12.83 4.1 1 KCL-22 Leucemia mieloide crónica 1.74 1.56 Leucemia mieloide crónica en LAMA-84 2.61 0.46 crisis de blastos U-937 Linfoma 5.68 1 .07 Daudi Linfoma de Burkitt 2.68 0.54 Namalwa Linfoma de Burkitt 4.48 1.00 Raji Linfoma de Burkitt 5.20 0.69 Ramos Linfoma de Burkitt 1 .83 0.10 ARH-77 Mieloma 7.21 2.22 RPMI 8226 Mieloma 4.23 0.99 EJEMPLO B.3 Inhibición de la proliferación de células tumorales hematologicas humanas por JNJ 26481585 en combinación con bortezomib Los resultados se expresan como el índice de combinación medio (Cl ± SD) de valores de Cl (intervalo de confianza) medios en cada estudio individual (3 experimentos confiables independientes), y calculado a partir de cada relación de combinación individual. Un intervalo de confianza menor de 0.9 indica "sinergia" (color oscuro), y un Cl entre 0.91 y 1.09 indica "aditividad" (en blanco).

CUADRO 3

Claims (14)

NOVEDAD DE LA INVENCION REIVINDICACIONES

1 .- Una combinación de un inhibidor del proteasoma y inhibidor de histona desacetilasa de fórmula (I): las sales ácidas o básicas de adición farmacéuticamente aceptables, y las formas estereoquímicamente isoméricas del mismo, en donde R4 se selecciona de hidrógeno o halo.

2.- La combinación de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque el inhibidor de histona desacetilasa de fórmula (I) se selecciona de compuesto número 1 a, compuesto número 30 y compuesto número 39: C2HF3O2; Compuesto 1 a C2HF3O2 (1 :1 ); Compuesto 30 C2HF302 (1 :1 ); Compuesto 39

3.- La combinación de conformidad con las reivindicaciones 1 ó 2, caracterizada además porque el inhibidor de histona desacetilasa de fórmula (I) es el compuesto No. 1 a (JNJ26481585):

4. - La combinación de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizada además porque el inhibidor del proteasoma es bortezomib.

5. - La combinación de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizada además porque está en la forma de una composición farmacéutica que comprende un inhibidor del proteasoma y un inhibidor de histona desacetilasa de fórmula (I), junto con uno o más vehículos farmacéuticos.

6.- La combinación de conformidad con la reivindicación 5, caracterizada además porque es para uso simultáneo, separado o secuencial.

7.- La combinación de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizada además porque es para su uso en terapia médica.

8. - El uso de una combinación como se reclama en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en la fabricación de un medicamento para inhibir el crecimiento de células tumorales.

9. - El uso de un inhibidor de histona desacetilasa, ya sea solo o en combinación con un inhibidor del proteasoma, en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de leucemia linfoblástica aguda, leucemia mielógena aguda, leucemia promielocítica aguda, leucemia mieloide aguda, leucemia monocítica aguda, linfoma, leucemia crónica de células B, leucemia mieloide crónica, leucemia mieloide crónica en crisis de blastos, linfoma de Burkitt y mieloma múltiple, en donde dicho inhibidor de histona desacetilasa es un compuesto de fórmula (I): las sales ácidas o básicas de adición farmacéuticamente aceptables y las formas estereoquímicamente isoméricas del mismo, en donde R4 se selecciona de hidrógeno o halo.

10. - El uso como se reclama en la reivindicación 9, en donde dicho medicamento es para el tratamiento de leucemia linfoblástica aguda resistente a fármacos, leucemia mielógena aguda resistente a fármacos, leucemia promielocítica aguda resistente a fármacos, leucemia mieloide aguda resistente a fármacos, leucemia monocítica aguda resistente a fármacos, linfoma resistente a fármacos, leucemia crónica de células B resistente a fármacos, leucemia mieloide crónica resistente a fármacos, leucemia mieloide crónica resistente a fármacos en crisis de blastos, linfoma de Burkitt resistente a fármacos y mieloma múltiple resistente a fármacos.

11. - El uso como se reclama en las reivindicaciones 9 y 10, en donde dicho medicamento es para el tratamiento de mieloma múltiple resistente a bortezomib.

12.- El uso como se reclama en cualquiera de las reivindicaciones 8 a 11 , en donde la inducción de hiperacetilación de histonas u otras proteínas, o la inducción de proteínas funcionalmente reguladas por dicha acetilacion, tiene un efecto benéfico para el tratamiento de cáncer en humanos.

13.- Un método para la caracterización de un inhibidor de histona desacetilasa de fórmula (I) de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, ya sea solo o en combinación con un inhibidor del proteasoma, que comprende la determinación, en una muestra, de la cantidad de inducción de acetilación de histonas u otras proteínas, o de la inducción de proteínas funcionalmente reguladas por dicha acetilación.

14.- Un método para la caracterización de un inhibidor de histona desacetilasa de fórmula (I) de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, ya sea solo o en combinación con un inhibidor del proteasoma, que comprende la determinación, en una muestra, de la cantidad de a) inducción de la acetilación de la histona 3, inducción de la acetilación de la histona 4 o inducción de p21 , y b) inducción de la acetilación de alfa-tubulina, inducción de la acetilación de Hsp 90 o inducción de Hsp 70.