KR101489947B1

KR101489947B1 - 프로테아좀 억제제와 배합하여, ｉ－형 및 ｉｉｂ－형 히스톤 데아세틸라아제에 결합 활성을 나타내는 히스톤 데아세틸라아제 억제제

Info

Publication number: KR101489947B1
Application number: KR20097005123A
Authority: KR
Inventors: 야니네 아르츠; 페터 빌렘 얀 헬레만스; 미셸 마리 프랑소와 야니코트; 마틴 존 페이지
Original assignee: 얀센 파마슈티카 엔.브이.
Priority date: 2006-09-15
Filing date: 2007-09-11
Publication date: 2015-02-04
Also published as: EA020276B1; CA2659070C; EP2066327A2; EA200970284A1; JP5185274B2; US20090312284A1; CA2659070A1; IL197426A; PL2066327T3; HK1136770A1; JP2010503636A; KR20090064383A; AU2007296256B2; HRP20130080T1; IL197426A0; WO2008031817A3; MX2009002925A; AU2007296256A1; EP2066327B1; WO2008031817A2

Abstract

본 발명은 종양 세포의 성장을 억제함으로써 암 치료에 유용한, I-형 및 IIb-형 히스톤 데아세틸라아제에 결합 활성을 갖는 히스톤 데아세틸라아제 억제제와 프로테아좀 억제제의 배합물에 관한 것이다.

Description

프로테아좀 억제제와 배합하여, Ｉ－형 및 ＩＩＢ－형 히스톤 데아세틸라아제에 결합 활성을 나타내는 히스톤 데아세틸라아제 억제제{HISTONE DEACETYLASE INHIBITORS WITH COMBINED ACTIVITY ON CLASS-I AND CLASS-IIB HISTONE DEACETYLASES IN COMBINATION WITH PROTEASOME INHIBITORS}

본 발명은 I-형 및 II-형 히스톤 데아세틸라아제에 결합 활성을 갖는 히스톤 데아세틸라아제(HDAC) 억제제에 관한 것이다. 본 발명은 이를 포함하는 배합물 및 조성물, 그리고 의약, 예를 들어, 림프종 및 백혈병과 같은 조혈 종양을 억제하기 위한 의약으로서의 이들의 용도에 관한 것이다.

HDAC 효소 패밀리는 이들의 첫번째 기질이 확인된 후에, 핵 히스톤 단백질로 명명되었다. 히스톤 단백질 (H2A, H2B, H3 및 H4)은 옥타머 복합체를 형성하며, 그 주위에 DNA 나선이 감싸 응축된 크로마틴 구조를 형성한다. 히스톤의 아세틸화 상태는 히스톤 테일의 탈아세틸화에 관여하는 HDAC 및 아세틸화시키는 히스톤 아세틸 트랜스퍼라아제 (HAT)에 의해 좌우되는 동적 평형 상태이다. HDAC 효소를 억제시키면, 뉴클레오좀 히스톤 테일의 아세틸화가 증진되며, 전사되기에 더욱 유능한 크로마틴 구조를 제공하여, 세포적 처리, 이를 테면 세포 증식, 세포 자멸사 및 분화에 관여하는 유전자 발현을 변경시킨다. 최근, 증가하는 수의 추가의 비-히스톤 HDAC 기질이 동정되었다.

크로마틴에 대한 발암성 전사 인자와 결합된 이상조절 및 불변의 HDAC 동원이 림프종 및 백혈병, 이를 테면 급성 전골수구성 백혈병(APL), 비-호지킨 림프종 및 급성 골수 백혈병 (AML)의 특수 형태에서 관찰되었다. 질환이 악성 병변 및 잘-분화된 안드로겐-반응성 전립선 샘암종에서 표현형적으로 탈-분화된 안드로겐 무감응 전립선 암으로 진행함에 따라, HDAC1의 단백질 수준에서의 상향 조절이 전립선 암 세포에서 관찰되었다. 또한, 대다수의 인간 결장 암 외식편(explant)에서 증가된 HDAC2 발현이 관찰되었으며, 이는 종양 저해제 선종성결장폴립증 (APC)의 손실에 의해 유발된다.

암에서 HDAC/HAT 활성 평형에 따라서, HDAC 억제제는 시험관 내에서 넓은 스펙트럼의 인간 종양 세포주에서 세포 주기 억류, 최종의 분화 및/또는 세포 자멸사를 유도하여, 누드 마우스의 인간 이종이식 모델에서 생체 내 항종양 활성을 보유하고 혈관신생을 억제하는 것으로 나타냈다.

효소의 HDAC 패밀리는 통상 예를 들어, I, II 및 III 형의 3개 부류로 나뉜다. I 형 및 II 형만이 현재 임상 개발 중에 있는 HDAC 억제제의 효과를 매개하는 것으로 유력하게 예측된다.

HDAC 패밀리 구성원 1-3 및 8로 구성된 I-형 그룹 HDAC가 종양 세포 증식에 결정적인 것으로 나타났다.

특정 프로모터를 침묵시키기 위하여 I-형 HDAC를 사용하는 많은 다양한 전사 인자 중에서, 가장 잘 알려진 예는 핵 호르몬 수용체의 부류이며, 이는 이의 리간 드의 부재 하에서 HDAC3에만 결합하여, 전사적 침묵의 상태를 유지시킨다. 복합체는 리간드-독립적인 방식으로, 예를 들어 레티노이드, 에스트로겐, 안드로겐 등에 의하여 분리되어, 유전자 발현 및 분화가 유발된다. 또 다른 주요한 예는 사이클린-의존적 키나아제 억제제 p21^waf1 ^, ^cip1의 HDAC1-의존적 침묵이다. HDAC 억제제의 항증식 효과에서 p21^waf1 ^, ^cip1 유도의 주요한 역할은 p21^waf1 ^, ^cip1 결함 세포에서 HDAC 억제제 트리코스타틴 A (TSA)에 대한 저항성이 부모 HCT-116 세포와 비교하여 6-배 증가함을 나타내는 연구에 의해 입증되었다. 또한, 선천성 종양 저해 유전자와 달리, p21^waf1 ^, ^cip1는 종양 세포 도처에 존재하며, HDAC 억제제에 의해 유도된다.

히스톤이 I형 HDAC의 유일한 기질은 아니다. 예를 들어, HDAC 1-3 데아세틸라아제 종양 저해자 p53은 결과적으로 유비퀴틴화하여 분해된다. p53이 세포 주기 억류 및 세포 자멸사를 포함한 유력한 종양 저해자이기 때문에, 이들 단백질을 낮은 수준으로 유지하는 것이 종양 세포의 자유로운 증식 및 생존을 허용하는 관문이다.

II-형 HDAC는 2개의 하위 부류로 나뉠 수 있다: HDAC 4, 5, 7, 9를 포함하는 IIa-형 (HDAC 9은 변이 MITR을 스플라이싱(splice) 시킨다). IIb-형은 HDAC6 및 HDAC10을 포함하며, 둘 모두는 중복된 HDAC 도메인을 가진다. IIa-형 HDAC는 고유의 히스톤 데아세틸라아제 활성을 보유하지 않으나, 이들이 1-형 HDAC 복합체 및 전사 인자/DNA 복합체와 회합하기 때문에, 가교 인자(bridging factor)로 작용하여 유전자 발현을 조절한다.

IIb-형의 구성원인 HDAC6는 Hsp90 데아세틸라아제와의 동일함 때문에 주목을 받았다. HDAC 억제제 LAQ824 및 LBH589는 Hsp90의 탈아세틸화를 유도하나, 트래폭신(trapoxin) 및 소듐 부티레이트는 그렇지 않은 것으로 나타났다. Hsp90 데아세틸라아제는 Hsp90 관련된 프로(pro)-생존 및 프로-증식의 클라이언트(client) 단백질의 분해를 유발한다. 주요한 예는 Her-2, Bcr-Abl, 글루코코르티코이드 수용체, 돌연변이 FLT-3, c-Raf 및 Akt를 포함한다. Hsp90 외에, HDAC6는 또한 튜불린 탈아세틸화를 매개하며, 스트레스 환경 하에서 미소관의 탈안정화를 유발한다.

HDAC6의 생물학적 역할은 HDAC6의 특정 소 분자 억제제, 투바신(tubacin)이 α-튜불린 과아세틸화를 유발하고 세포 주기 진행에 영향을 미치지 않고 세포 운동을 감소시키는 사실로 추가 확인되었다. HDAC6의 α-튜불린 데아세틸라아제 도메인만을 억제하는 투바신은 HSP90 아세틸화의 최소 증가만을 유발한다.

이와 같이, HDAC6는 MCF-7 유방 암종 세포의 에스트라디올-자극 세포 이동을 위해 주요한 것으로 관찰되었다.

마지막으로, HDAC6는 잘못 폴딩된(misfolded) 단백질을 세포적으로 관리하고 세포질로부터 이들을 제거하는 데에서 중요한 역할을 수행한다.

HDAC에 의해 발현 또는 활성의 수준이 조절되는 많은 수의 세포 주기 조절 단백질 때문에, HDAC 억제제의 항증식 효과는 단일 기작의 활동과 연결될 수 없다. HDAC 억제는 항암 요법에서 특정 징후를 억제하며, 성장 억제, 분화 및 세포 자멸사에 관여하는 다중 경로에서의 협동 효과는 종양 형성 및 성장과 같은 외생적 병리학의 치료에서 유익한 것으로 인정될 수 있다.

수년 동안, HDAC가 발암뿐만 아니라, 수많은 비-악성 분화 과정에서 중요한 역할을 수행하는 것으로 밝혀졌다. 이는 IIa 4, 5, 7 및 9-형에 대해 가장 명백하다. 예를 들어, HDAC7은 T-세포의 가슴샘 성숙에서 중요한 역할을 수행하는 것으로 제안되었으나, HDAC4는 연골내 골 형성 및 연골세포 비대의 조절에 연루된다. 그러나 IIa-형 HDAC의 근육 분화에서의 역할에 관심이 가장 집중되었다. HDAC 4, 5, 7 및 9 모두는 근세포 증진 인자 2 (MEF2)의 전사적 공동-저해의 결과로서 근세포 (근육 세포)의 분화를 저해한다.

HDAC 억제제에서 관찰되는 가장 보편적인 독성은 경증 내지 중등도의 골수 억제이다. 또한, 많은 임상 실험에서 부작용으로서 구역/구토, 피로 및 설사 특성이 있었다.

2003년 9월 18일자 공개된 제 EP 1485365호는 다른 것들 중에서 하기의 HDAC 억제제 R306465를 개시하였다:

2006년 2월 2일자 공개된 제 WO 2006/010750호는 하기 마커쉬 식을 갖는 화합물, 이의 N-옥시드 형태, 약제학적으로 허용가능한 부가 염 및 입체화학적 이성체의 제조, 제제 및 약제학적 특성을 기술하였다:

상기 식에서,

n, m, R¹, R², R³, X 및 Y는 상기 명세서에 정의된 것과 같은 의미를 갖는다.

그러나 HDAC 억제제 요법에 대한 잠재력은 단일 제제 사용을 능가한다. HDAC 억제제에 의해 영향을 받는 분자적 경로는 그것을 배합 연구에 대한 유망한 후보자로 만들었다.

단독으로, 또는 다른 치료제와 배합되어, 효능 및/또는 독성에서 임상적 이점을 제공할 수 있는, I-형 및 IIb-형 HDAC에 결합 효과를 갖는 억제제가 필요하다.

또한, 프로테아좀 억제는 암 요법에서 최근 개발된 중요한 전략을 나타낸다. 프로테아좀은 모든 세포에 존재하는 다중-효소 복합체이며, 세포 주기의 조절에 관여하는 단백질의 분해에서 역할을 수행한다. p53, 사이클린 및 사이클린-의존성 키나아제 p21^waf1 ^, ^cip1를 포함하는 수많은 주요 조절 단백질은 유비퀴틴-프로테아좀 경로에 의해 세포 주기 중에 일시적으로 분해된다. 이들 단백질의 지시된 분해는 세포가 세포 주기를 진행하고 유사 분열을 수행하는 데 요구된다. 또한, 유비퀴틴-프로테아좀 경로는 전사 조절에 필요하다.

제 EP788360호, 제 EP1312609호, 제 EP1627880호, 제 US 6066730호 및 제 US 6083903호는 프로테아좀 억제제로서 유용한 펩티드 보론산 에스테르 및 보론산 화합물을 개시하였다. 화합물 N-피라진카보닐-L-페닐알라닌-L-류신보론산 (PS-341, 보르테조미브(bortezomib) 또는 Velcade (Millenium)로 알려짐) 중 하나는 인간 종양 이종이식 모델에서 항종양 활성을 가지며, 재발된 불응 다발성 골수종을 지닌 환자의 치료를 위해 승인되었고, 추가의 혈액 암 및 고형 종양을 포함하는 추가의 적용에 대해 현재 임상 시험 중에 있다. 보르테조미브는 잘못 폴딩되고 달리 손상된 단백질의 형성을 유발하고, 이에 따라, 예를 들어 Bax- 또는 반응성 산소 종 의존적 기작을 통하여, 세포 자멸사의 미토콘드리아 경로를 활성화시켜 세포 사멸을 유도한다.

보르테조미브는 아그레솜 (aggresome)이라 명명된 구조로의 유비퀴틴-결합된 단백질의 격리를 유발한다. 아그레솜은 아마도 분해를 위해 유비퀴틸화 단백질을 리소좀으로 수송함으로써, 프로테아좀 억제에 대한 반응으로 활성화되는 세포 보호 반응에 관여하는 것으로 보인다.

보르테조미브-유도된 아그레솜 형성은 HDAC 억제제 SAHA(수베로일아닐리드 하이드록삼산)를 사용하여 방해될 수 있다. SAHA는 또한 시험관 내 및 생체 내 동소이식 췌장암 이종이식 모델의 세포 자멸사에서 상승적 효과를 나타냈다(Cancer Research 2006; 66: (7) 3773-3781).

또다른 HDAC 억제제 LAQ824는 또한, 보르테조미브와 함께 상승적인 수준의 세포 사멸을 나타냈다 (Journal of Biological Chemistry 2005; 280: (29) 26729-26734).

SAHA 및 LAQ824와 보르테조미브의 상승적 효과는 그의 HDAC6 억제 활성과 관련이 있다.

종양 성장에 대한 프로테아좀 억제제의 억제 효능을 증가시키고, 또한 제제의 투여량을 낮춰 환자에 치명적인 부작용의 가능성을 감소시키는 것이 추가로 요구된다.

현재, 아세틸화의 정도와 종양 반응의 상관 관계의 확실한(robust) 데이터가 이용가능하지 않다. 하기 기술되는 HDAC 억제제 또는 상기 HDAC 억제제를 포함하는 배합물에 의해 유발되는 히스톤 및 비-히스톤 기질의 아세틸화 정도를 정량화하는 빠르고, 간단하고 용이하게 재현가능한 방법이 이들의 미래에 대해 결정적일 것이다.

본 발명의 목적은 강력하고 독특한 아세틸화 효과를 가질 수 있고, I-형 및 IIb-형 HDAC를 억제하고, 종양 세포 성장에 대하여 유리한 억제 효과를 가지며, 원치 않는 부작용을 줄일 수 있는 하기 기술되는 유형의 HDAC 억제제 및 프로테아좀 억제제 및 HDAC 억제제의 치료적 배합물을 제공하는 것이다.

따라서, 본 발명에 따라 본 발명자들은 프로테아좀 억제제 및 하기 화학식 (I)의 HDAC 억제제,이의 약제학적으로 허용가능한 산 또는 염기 부가 염 및 입체화학적 이성체의 배합물을 제공한다:

상기 식에서,

R⁴는 수소 또는 할로에서 선택된다.

관심 화합물은 R⁴가 플루오르인 화학식 (I)의 화합물이다.

더욱 흥미로운 화합물은 R⁴가 인돌의 4 또는 7 번 위치에 있는 화학식 (I)의 화합물이다.

화학식 (I)의 바람직한 화합물은 제 WO 2006/010750호에 나타낸 넘버링에 상응하는 화합물 1a번, 화합물 30번 및 화합물 39번이다.

화학식 (I)의 다른 바람직한 화합물은 R⁴가 수소인 화합물이다.

가장 바람직한 화합물은 하기의 화합물 1a번 (JNJ26481585) 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 부가 염이다:

치환체로부터 바이사이클릭 환 시스템으로 그려진 선은 바이사이클릭 환 시스템의 임의의 적합한 환 원자에 부착될 수 있는 결합을 나타낸다.

상기의 정의 및 하기에 사용되는 할로는 플루오로, 클로로, 브로모 및 요오도를 총칭한다.

본원에 사용되는 용어 "히스톤 데아세틸라아제" 및 "HDAC"는 히스톤의 N-말단에서 라이신 잔기의 ε-아미노 그룹으로부터 아세틸 그룹을 제거하는 효소의 패밀리 중 임의의 하나를 말하는 것으로 의도된다. 문맥에서 달리 나타내지 않는 한, 용어 "히스톤"은 임의의 종류로부터 H1, H2A, H2B, H3, H4 및 H5를 포함하는 임의의 히스톤 단백질을 언급하는 것을 의미한다. 인간 HDAC 단백질 또는 유전자 산물은 HDAC-1, HDAC-2, HDAC-3, HDAC-4, HDAC-5, HDAC-6, HDAC-7, HDAC-8, HDAC-9, HDAC-1O 및 HDAC-11를 포함하나 이에 한정되는 것은 아니다. 히스톤 데아세틸라아제는 또한 원생 동물 또는 진균 소스로부터 유래될 수 있다.

용어 "히스톤 데아세틸라아제 억제제" 또는 "히스톤 데아세틸라아제의 억제제"는 히스톤 데아세틸라아제와 상호작용하며 그의 활성, 더욱 자세하게 그의 효소 활성을 억제할 수 있는 화합물을 나타내는 데 사용된다. 히스톤 데아세틸라아제 효소 활성을 억제하는 것은 히스톤 또는 또다른 단백질 기질로부터 아세틸 그룹을 제거하는 히스톤 데아세틸라아제의 능력을 감소시키는 것을 의미한다. 바람직하게 이러한 억제는 특이적이며, 예를 들어, 히스톤 데아세틸라아제 억제제는 일부 다른, 비관련 생물학적 효과를 생성하는 데 필요한 억제제의 농도보다 더 낮은 농도에서 히스톤 또는 또다른 단백질 기질로부터 아세틸 그룹을 제거하는 히스톤 데아세틸라아제의 능력을 감소시킨다.

용어 "I-형 및 IIb-형 HDAC에서 결합 활성을 갖는 HDAC 억제제" 또는 "I-형 및 IIb-형 HDAC의 억제"는 다른 부류의 HDAC 효소, 예를 들어 IIa-형의 억제를 생성하는 데 필요한 억제제의 농도보다 낮은 농도, 또는 일부 다른 관련 생물학적 효과의 억제를 생성하는 데 필요한 억제제의 농도보다 더 낮은 농도에서 I-형 HDAC 패밀리 구성원 (HDAC 1-3 또는 8) 및 IIb-형 HDAC 패밀리 구성원 (HDAC 6 또는 10)의 효소적 활성을 감소시키는 화합물을 나타내는 데 사용된다.

본원에 사용되는 용어 "프로테아좀" 및 "유비퀴틴-프로테아좀 시스템 (UPS)"은 다음을 포함하나 이에 한정되지 않는 UPS 중의 모든 성분의 기능 및 구조 중 임의의 것을 언급하는 것으로 의도된다:

a) 유비퀴틴 (Ub) 및 유비퀴틴-유사 단백질 (Ulp); 예를 들어, SUMO, NEDD8, ISG15 등,

b) 유비퀴틴 모노머, K48-링크 폴리유비퀴틴 사슬, K63-링크 폴리유비퀴틴 사슬 등,

c) E1 유비퀴틴-활성화 효소; 예를 들어, E1^Ub, E1^SUMO, E1^NEDD8, E1^ISG15 등,

d) E1 유비퀴틴-활성화 효소의 서브유닛; 예를 들어, APPBP1 , UBA3, SAE1, SAE2 등,

e) E2 유비퀴틴-접합 효소; 예를 들어, UBC9, UBC12, UBC8 등,

f) E3 유비퀴틴 리가아제(ligase); 예를 들어, RING-핑거(finger) E3s, 단순 RING-핑거 E3s, 쿨린(cullin)-계 RING-핑거 E3s, RBX1-/RBX2-의존성 E3s, HECT-도메인 E3s, U-박스 E3s 등,

g) SCF (SKP1-쿨린1-F-박스) E3 유비퀴틴 리가아제 복합체, 예를 들어, SCF^SKP2, SCF^B ^- ^TRCP, SCF^FBW7 등,

h) 쿨린, 예를 들어 CUL1, CUL2, CUL3, CUL4, CUL5 등,

i) F-박스 단백질, 예를 들어 SKP2, B-TRCP 단백질, FBW 단백질 등,

j) 다른 기질 특이적 어댑터, 예를 들어, BTB 단백질, SOCS-박스 단백질, DDB 1/2, VHL 등,

k) 프로테아좀, 그의 성분 등,

l) 메탈로이소펩티다아제 RPN11, 그의 파괴 전에 UPS 표적을 탈유비퀴틸화시키는 프로테아좀 리드(lid)의 서브유닛 등,

m) 메탈로이소펩티다아제 CSN5, 쿨린으로부터 NEDD8을 제거하는 데 관여하는 COP9-시그널로솜(signalosome) 복합체의 서브유닛 등,

n) E1 유비퀴틴-활성화 효소에 의한 활성화 단계 (여기에서 Ub/Ulp는 먼저 그의 C-말단 글리신 잔기 상에서 아데닐화된 다음, 그의 C-말단에서 다시 티올 에스테르로서 하전됨),

o) E1 유비퀴틴-활성화 효소로부터 E2 유비퀴틴-접합 효소로 Ub/Ulp의 전이,

p) 유비퀴틴-접합체 인식,

q) 프로테아좀에 대한 기질-유비퀴틴 복합체의 전이 및 결합,

r) 유비퀴틴 제거, 또는

s) 기질 분해.

용어 "프로테아좀 억제제" 및 "유비퀴틴-프로테아좀 시스템의 억제제"는 UPS에서 정상, 변형, 과-활성화 또는 과발현된 성분 중 하나와 상호작용할 수 있고, 그의 활성, 더욱 특히 그의 효소적 활성을 억제할 수 있는 화합물을 나타내는 데 사용된다. UPS 효소적 활성을 억제하는 것은 UPS 성분의 능력을 줄여, 그의 활성을 수행하는 것을 의미한다. 바람직하게 이러한 억제는 특이적이며, 예를 들어, 프로테아좀 억제제는 일부 다른, 비관련 생물학적 효과를 생성하는데 필요한 억제제의 농도보다 더 적은 농도에서 UPS의 성분의 활성을 감소시킨다. UPS 성분의 활성의 억제제는 다음을 포함하나 이에 한정되지 않는다:

a) 아데닐화 부위에 Ub/Ulp의 접근을 차단하거나 또는 ATP의 접근을 차단하는 Ub 또는 UIp 아데닐화의 억제제; 예를 들어, 이마티니브 (Gleevec; Novartis) 등,

b) E3 또는 E3-복합체와 E2의 상호작용의 교란제(disrupter).

c) p53 (기질)과 MDM2 (RING-핑거 E3) 사이의 상호작용을 차단하는 것과 같은, E3 또는 E3 복합체 상에서의 기질과 기질 상호작용 도메인 사이의 상호작용의 방해제(interrupter), 예를 들어, 누틀린(nutlins) (MDM2에 결합하여), RITA (p53의 N 말단에 결합하여) 등,

d) E3 리가아제 복합체의 방해제,

e) 유비퀴틴 리가아제로의 기질의 인공적인 보충제(recruiter), 예를 들어, 프로택 (protac) 등,

f) 프로테아좀 및 그의 성분의 억제제, 예를 들어, 보르테조미브, 카르필조미브, NPI-0052, Bsc2118 등,

g) 유비퀴틴/Ulp 제거의 억제제, 이를 테면 메탈로이소펩티다아제 RPN11 및 CSN5의 억제제, 또는

h) 폴리유비퀴틴 사슬을 변형시키는 것, 예를 들어, 유비스타틴 등.

상기 언급된 바와 같은 약제학적으로 허용가능한 산 부가 염은 화학식 (I)의 화합물이 형성할 수 있는 치료적으로 활성이 있는 비-독성 산 부가 염 형태를 포함하는 것을 의미한다. 염기성을 갖는 화학식 (I)의 화합물은 상기 염기 형태를 적절한 산으로 처리하여, 그의 약제학적으로 허용가능한 산 부가 염으로 전환될 수 있다. 적절한 산은 예를 들어, 무기산, 이를 테면 할로겐화수소산, 예를 들어 염화수소산 또는 브롬화수소산; 황산; 질산; 인산 등; 또는 유기산, 이를 테면, 아세트산, 트리플루오로아세트산, 프로피온산, 하이드록시아세트산, 락트산, 피루브산, 옥살산, 말론산, 숙신산 (예를 들어, 부탄디오익산), 말레산, 푸마르산, 말산, 타르타르산, 시트르산, 메탄설폰산, 에탄설폰산, 벤젠설폰산, p-톨루엔설폰산, 사이클람산, 살리실산, p-아미노-살리실산, 파모산 등을 포함한다.

산성을 갖는 화학식 (I)의 화합물은 상기 산 형태를 적절한 유기 또는 무기 염기로 처리하여 그의 약제학적으로 허용가능한 염기 부가 염으로 전환될 수 있다. 적절한 염기 염 형태는 예를 들어, 암모늄 염, 알칼리 및 알칼리 토금속 염, 예를 들어 리튬, 소듐, 포타슘, 마그네슘, 칼슘 염 등, 유기 염기와의 염, 예를 들어 벤자틴, N-메틸-D-글루카민, 하이드라바민 염 및 아르기닌, 라이신 등과 같은 아미노산과의 염을 포함한다.

용어 산 또는 염기 부가 염은 또한 화학식 (I)의 화합물이 형성할 수 있는 수화물 및 용매 부가 형태를 포함한다. 이러한 형태의 예는 예를 들어 수화물, 알코올화물 등이다.

상기에서 사용된 용어 화학식 (I)의 화합물의 입체화학적 이성체 형태는 동일한 순서의 결합에 의하여 결합된 동일한 원자로 구성되나, 상호호환적이지 않은 상이한 3-차원 구조를 가지며, 화학식 (I)의 화합물이 소유할 수 있는 모든 가능한 화합물을 정의한다. 달리 언급되거나 나타내지 않는 한, 화합물의 화학적인 명명은 화합물이 소유할 수 있는 모든 가능한 입체화학적 이성체 형태의 혼합물을 포함한다. 상기 혼합물은 상기 화합물의 기본 분자 구조의 모든 디아스테레오머(diastereomer) 및/또는 에난티오머(enantiomer)를 포함할 수 있다. 순수한 형태로 있거나 서로 배합되어 있는 화학식 (I)의 화합물의 모든 입체화학적 이성체 형태는 본 발명의 범위 내에 포함되는 것으로 간주된다.

또한, 일부 화학식 (I)의 화합물은 그의 토토머 형태로 존재할 수 있다. 이러한 형태는 상기 화학식에 명백하게 나타내지 않더라도, 본 발명의 범위 내에 포함되는 것으로 의도된다.

이하에서 용어 "화학식 (I)의 화합물"이 사용되는 경우, 이는 약제학적으로 허용가능한 산 또는 염기 부가 염 및 모든 입체이성체 형태를 포함하는 것을 의미한다.

본 발명에 따라 사용하기에 특히 바람직한 프로테아좀 억제제는 보르테조미브이다. 보르테조미브는 Millennium로부터 상품명 Velcade로 상업적으로 입수할 수 있으며, 예를 들어, 제 EP788360호, 제 EP1312609호, 제 EP1627880호, 제 US 6066730호 및 제 US 6083903호에 나타낸 바와 같이 또는 이와 유사한 방법에 의하여 제조될 수 있다.

본 발명은 또한 예를 들어, 종양 세포의 성장을 억제하기 위한 것과 같이, 의학 요법에서 사용하기 위한 본 발명에 따른 배합물에 관한 것이다.

본 발명은 또한, 종양 세포의 성장 억제용 약제학적 조성물을 제조하기 위한 본 발명에 따른 배합물의 용도에 관한 것이다.

본 발명은 또한, 본 발명에 따른 배합물의 유효량을 대상에 투여하는 것을 포함하여, 인간 대상에서 종양 세포의 성장을 억제하는 방법에 관한 것이다.

본 발명은 본 발명에 따른 배합물의 유효량을 투여하여, 형질전환된 세포를 포함하는 비정상적인 세포 성장을 억제하는 방법을 추가로 제공한다. 세포의 비정성적인 성장은 정상 조절 기작과 독립적인 세포 성장을 말한다(예를 들어, 접촉 억제의 손실). 암 세포의 성장 억류, 말기 분화 및/또는 세포 자멸사를 유발하여, 직접적으로 종양 성장을 억제하고, 종양 세포의 이주, 침입 및 생존, 또는 종양의 혈관신생을 억제하여 간접적으로 종양 성장을 억제하는 것을 포함한다.

본 발명은 또한 치료를 요하는 대상, 예를 들어 포유 동물 (더욱 특히 인간)에 본 발명에 따른 배합물의 유효량을 투여하여, 종양 성장을 억제하는 방법을 제공한다. 특히, 본 발명은 본 발명에 따른 배합물의 유효량을 투여하여 종양의 성장을 억제하는 방법을 제공한다. 본 발명은 특히 췌장 암, 림프 계통의 조혈성 종양, 예를 들어, 급성 림프모세포성 백혈병, 급성 골수 백혈병(acute myelogenous leukemia), 급성 전골수구성 백혈병, 급성 골수 백혈병(acute myeloid leukemia), 급성 단구성 백혈병, 림프종, 만성 B 세포 백혈병, 만성 골수 백혈병, 모구성 발증(blast crisis)에서 만성 골수 백혈병, 버킷 림프종, 다발성 골수종, 비-소-세포 폐 암, 소-세포 폐 암, 비-호지킨 림프종, 흑색종, 전립선 암, 유방암 및 결장암의 치료에 적용가능하다. 억제될 수 있는 다른 종양의 예는 갑상샘 소포 암, 골수 형성 이상 증후군 (MDS), 중간엽 기원의 종양 (예를 들어, 섬유육종 (fibrosarcomas) 및 횡문근육종), 기형암종, 신경모세포종, 신경아교종, 피부의 양성 종양 (예를 들어, 각질가시세포종), 신장 암종, 난소 암종, 방광 암종 및 표피 암종을 포함하나 이에 한정되지 않는다.

본 발명은 또한, 화학식 (I)의 히스톤 데아세틸라아제 억제제의 유효량을 치료를 요하는 대상, 예를 들어 포유류 (더욱 특히 인간)에 투여하여, 급성 림프모세포성 백혈병, 급성 골수 백혈병, 급성 전골수구성 백혈병, 급성 골수 백혈병, 급성 단구성 백혈병, 림프종, 만성 B 세포 백혈병, 만성 골수 백혈병, 모구성 발증에서 만성 골수 백혈병, 버킷 림프종 및 다발성 골수종의 치료 방법을 제공한다.

본 발명은 또한, 단독, 또는 다른 프로테아좀 억제제와 배합된 화학식 (I)의 히스톤 데아세틸라아제 억제제의 유효량을 치료를 요하는 대상, 예를 들어 포유류 (더욱 특히 인간)에 투여하여, 비제한적으로 림프 계통의 조혈성 종양, 예를 들어 약물 내성 급성 림프모세포성 백혈병, 약물 내성 급성 골수 백혈병, 약물 내성 급성 전골수구성 백혈병, 약물 내성 급성 골수 백혈병, 약물 내성 급성 단구성 백혈병, 약물 내성 림프종, 약물 내성 만성 B 세포 백혈병, 약물 내성 만성 골수 백혈병, 모구성 발증에서 약물 내성 만성 골수 백혈병, 약물 내성 버킷 림프종 및 약물 내성 다발성 골수종과 같은 약물 내성 종양을 치료하는 방법을 제공한다. 본 발명은 특히 약물 내성 다발성 골수종, 더욱 특히 프로테아좀 억제제에 내성이 있는 다발성 골수종, 더더욱 특히 보르테조미브 내성 다발성 골수종 치료에 적용가능하다.

용어 "약물 내성 다발성 골수종"은 탈리도미드, 덱사메타손, 레블리미드, 독소루비신, 빈크리스틴, 사이클로포스파미드, 파미드로네이트, 멜팔란, 데피브로티드, 프레드니손, 다리나파르신, 벨리노스태트, 보리노스태트, PD 0332991, LBH589, LAQ824, MGCDO103, HuLuc63, AZD 6244, 파조파니브, P276-00, 플리티뎁신, 벤다무스틴, 타네스피마이신, 엔자스타우린, 페리포신, ABT-737 또는 RADOO1의 군으로부터 선택된 하나 이상의 약물에 대하여 내성이 있는 다발성 골수종을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 용어 "약물 내성 다발성 골수종"은 또한 재발 또는 불응 다발성 골수종을 포함한다.

용어 "약물 내성"은 선천성 내성 또는 후천성 내성을 나타내는 증상을 의미한다. "선천성 내성"은 암 세포의 세포 자멸사, 세포 진행 및 DNA 수선을 포함하나 이에 한정되지 않는 관련된 경로에서 특징적 주요 유전자의 발현 프로필을 의미하며, 이는 그의 정상 부본과 비교하여 암 세포의 더욱 빠른 성장 능력에 기여한다. "후천성 내성"은 약물에 대한 암 세포의 민감도에 영향을 미칠 수 있는 종양 형성 및 진행에서 발생되는 다인성 현상을 의미한다. 후천성 내성은 비제한적으로 약물-표적의 변형, 약물 축적 감소, 세포내 약물 분포의 변경, 약물-표적 상호작용의 감소, 해독 반응 증가, 세포-주기 탈규제, 손상된 DNA 복구 증가 및 세포 자멸사 반응 감소와 같은 몇몇 기작 때문일 수 있다. 상기 기작들 중 일부는 동시에 발생하고/거나 서로 상호작용할 수 있다. 이들의 활성화 및/또는 불활성화는 유전적 또는 후생유전적 사건, 또는 종양 바이러스 단백질의 존재 때문일 수 있다. 후천성 내성은 개개의 약물에 대하여 발생할 수 있으나, 활성의 상이한 기작 및 상이한 화학적 구조를 갖는 많은 상이한 약물에 대하여 더욱 광범위하게 발생할 수 있다. 이러한 형태의 내성을 다중 약물 내성이라 부른다.

본 발명에 따른 배합물은 예를 들어 다음과 같은 다른 치료 목적에 사용될 수 있다:

a) 암을 치료하기 위한 종양의 방사선 조사 전, 이 동안, 또는 이후에 본 발명에 따른 화합물을 투여하여 방사선 치료법에 대한 종양의 민감화;

b) 관절병증 및 골병리적 증상, 이를 테면 류마티스 관절염, 골관절염, 연소성 관절염, 통풍, 다발성 관절염, 건선 관절염, 강직성 척추염 및 전신홍반루프스의 치료;

c) 혈관 증식 질병, 죽상동맥경화증 및 재협착을 포함하는 평활근 세포 증식의 억제;

d) 염증 증상 및 피부 증상, 이를 테면 궤양성 대장염, 크론병, 알러지성 관절염, 이식편대 숙주병, 결막염, 천식, ARDS, 베세트병, 이식 거부, 두드러기 (uticaria), 알러지성 피부염, 원형탈모증, 공피증, 발진, 습진, 피부근육염, 여드름, 당뇨병, 전신홍반루프스, 가와사키병, 다발성 경화증, 폐기종, 낭성섬유증 및 만성 기관지염의 치료;

e) 자궁내막증, 자궁 근종, 기능부전성 자궁출혈 및 자궁내막 증식증의 치료;

f) 안구 혈관신생, 이를 테면 망막 및 맥락막 관에 영향을 미치는 혈관병증의 치료;

g) 심기능장애의 치료;

h) 면역억제 증상, 이를 테면 HIV 감염 치료의 억제;

i) 신 기능 장애의 치료;

j) 내분비 장애의 저해;

k) 글루코오스신합성 기능장애의 억제;

l) 신경병리학, 이를 테면 파킨슨 질환 또는 알츠하이머 질환 또는 폴리글루타민 관련 신경 질환과 같은 인지 장애를 유발하는 신경병리학의 치료;

m) 정신분열병, 양극성 장애, 우울증, 불안증 및 정신병과 같은 정신과 질병의 치료;

n) 신경근육 병리학, 이를 테면 근육위축 가쪽 경화증의 억제;

o) 척수근육위축증의 치료;

p) 유전자의 발현을 강력하게 하여 치료를 받아들이는 다른 병리학적 증상의 치료;

q) 유전자 치료법의 증진;

r) 지방 형성의 억제;

s) 기생충증, 이를 테면 말라리아의 치료.

이에 따라, 본 발명은 하나 이상의 상기 언급된 증상의 치료용 의약을 제조하기 위한, 단독, 또는 프로테아좀 억제제와 배합된, I-형 및 IIb-형 HDAC에 결합 활성을 지닌 화학식 (I)의 HDAC 억제제의 용도 및 의약으로서의 용도를 위한 상기 기술된 배합물을 개시한다.

따라서, 본 발명은 급성 림프모세포성 백혈병, 급성 골수 백혈병, 급성 전골수구성 백혈병, 급성 골수 백혈병, 급성 단구성 백혈병, 림프종, 만성 B 세포 백혈병, 만성 골수 백혈병, 모구성 발증에서 만성 골수 백혈병, 버킷 림프종 및 다발성 골수종 치료용 의약을 제조하기 위한, 단독 또는 배합된, I-형 및 IIb-형 HDAC에 결합 활성을 지닌 화학식 (I)의 HDAC 억제제의 용도를 개시한다.

본 발명은 또한 림프 계통의 조혈성 종양, 예를 들어 약물 내성 급성 림프모세포성 백혈병, 약물 내성 급성 골수 백혈병, 약물 내성 급성 전골수구성 백혈병, 약물 내성 급성 골수 백혈병, 약물 내성 급성 단구성 백혈병, 약물 내성 림프종, 약물 내성 만성 B 세포 백혈병, 약물 내성 만성 골수 백혈병, 모구성 발증에서 약물 내성 만성 골수 백혈병, 약물 내성 버킷 림프종 및 약물 내성 다발성 골수종과 같으나 이에 한정되지 않는 약물 내성 종양의 치료용 의약을 제조하기 위한, 단독, 또는 배합된, I-형 및 IIb-형 HDAC에 결합 활성을 갖는 화학식 (I)의 HDAC 억제제의 용도를 개시한다.

본 발명은 추가로 약물 내성 다발성 골수종, 더욱 특히 프로테아좀 억제제에 내성이 있는 다발성 골수종, 더더욱 특히 보르테조미브 내성 다발성 골수종 치료용 의약을 제조하기 위한, 단독, 또는 배합된, I-형 및 IIb-형 HDAC에 결합 활성을 갖는 화학식 (I)의 HDAC 억제제의 용도를 개시한다.

프로테아좀 억제제 및 화학식 (I)의 HDAC 억제제는 동시에(예를 들어, 별도 또는 단일 조성물로) 또는 순차적으로, 어느 순서로도 투여될 수 있다. 후자의 경우에, 바람직하거나 상승적인 효과가 성취되도록 하기에 충분한 양 및 방식으로, 그리고 그러한 기간 내에 두 개의 화합물이 투여될 것이다. 배합물의 각 성분에 대한 각각의 용량 및 용법 및 바람직한 투여 방법 및 순서는 투여되는 특정 프로테아좀 억제제 및 HDAC 억제제, 배합물의 투여 경로, 치료될 특정 종양 및 치료될 특정 숙주에 따라 달리지는 것을 알 것이다. 최적의 투여 방법 및 순서와 용량 및 용법은 본원에 나타낸 정보 및 통상의 방법을 사용하여 본 분야의 숙련자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

본 발명은 또한, 암으로 고통받는 환자의 치료에서 동시, 별도, 또는 순차적 사용을 위한 배합된 제제로서, 화학식 (I)의 HDAC 억제제를 제1 활성 성분으로, 그리고 프로테아좀 억제제를 제2 활성 성분으로 함유하는 산물에 관한 것이다.

본 분야의 숙련자는 하기 나타낸 시험 결과로부터 유효량을 용이하게 결정할수 있다. 일반적으로, 화학식 (I)의 화합물 및 프로테아좀 억제제의 치료적 유효량은 0.005 mg/kg 내지 100 mg/kg(체중) 및 특히 0.005 mg/kg 내지 10 mg/kg(체중)인 것으로 판단된다. 하루에 적절한 간격으로 둘, 셋, 넷 이상의 서브-용량으로 필요한 용량을 투여하는 것이 적절할 수 있다. 상기 서브-용량은 예를 들어 단위 투여형당 0.5 내지 500 mg 및 특히 10 mg 내지 500 mg의 활성 성분을 함유하는 단위 투여형으로 제제화될 수 있다.

그들의 유용한 약리적 특성에 비추어, 본 발명에 따른 배합물의 성분, 이를 테면 프로테아좀 억제제 및 HDAC 억제제는 투여 목적을 위한 다양한 약제학적 형태로 제제화될 수 있다. 상기 성분은 개개의 약제학적 조성물에 따로 제제화되거나, 두 성분을 함유하는 단일의 약제학적 조성물로 제제화될 수 있다. HDAC 억제제는 본 분야에 공지인 방법 및 특히 본원에 언급되고 참조로 인용된 공개 특허의 상세한 설명에 기술된 방법에 따라 약제학적 조성물로 제제화되고 제조될 수 있다.

따라서, 본 발명은 하나 이상의 약제학적 담체와 함께, 프로테아좀 억제제 및 화학식 (I)의 HDAC 억제제를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따라 사용하기 위한 약제학적 조성물을 제조하기 위하여, 활성 성분으로서 염기 또는 산 부가 염 형태의 특정 화합물의 유효량은 약제학적으로 허용가능한 담체와의 친밀한 혼합물로 배합되며, 여기에서 담체는 투여에 바람직한 제제 형태에 따라 매우 다양한 형태를 취할 수 있다. 이들 약제학적 조성물은 바람직하게 경구, 직장, 경피 투여, 또는 비경구 주입에 적합한 단일 투여형이다. 예를 들면, 경구 투여형의 조성물을 제조함에 있어서, 예를 들면, 현탁제, 시럽, 엘릭시르 및 용액 등의 경구 액체 제제의 경우에는 물, 글리콜, 오일, 알콜 등; 또는 분제, 환약, 캡슐 및 정제의 경우에는 전분, 당, 카올린, 윤활제, 결합제, 붕괴제 등의 고체 담체와 같은 통상의 약제학적 매질 중 임의의 것을 사용할 수 있다. 이들의 투여 용이성으로 인해, 정제 및 캡슐이 가장 유리한 경구용 단위 투여형을 나타내고, 이 경우에 고체 약제학적 담체가 명백히 사용된다. 비경구 조성물에 대해서는, 가용성을 향상시키기 위해 다른 성분이 포함될 수도 있으나, 담체는 주로 멸균수를 포함할 것이다. 예를 들면, 주사가능한 용액은 식염수, 글루코스 용액, 또는 식염수와 글루코스 용액의 혼합물을 포함하는 담체를 사용하여 제조될 수 있다. 주사용 현탁제는 적당한 액체 담체, 현탁화제 등을 사용하여 제조될 수도 있다. 경피 투여에 적합한 조성물에 있어서, 담체는 임의로 임의의 성질의 적절한 첨가제와 소량의 비율로 혼합된 침투촉진제 및/또는 적당한 습윤제를 포함할 수 있고, 상기 첨가제는 피부에 심각한 악영향을 끼치지 않는 것이다. 상기 첨가제는 피부로의 활성 성분의 투여를 용이하게 할 수 있고/있거나 원하는 조성물을 제조하는데 유용할 수 있다. 이들 조성물은 다양한 방법, 예를 들면 경피 패치, 스팟 온 (spot-on) 또는 연고로서 투여될 수 있다.

투여의 용이성 및 투여량의 균일성을 위해 상기 언급된 약제학적 조성물을 단위 투여형으로 제제화하는 것이 특히 유리하다. 본 명세서에서 사용되는 "단위 투여형"은 단위 용량으로서 적합한 물리적으로 분리된 단위를 말하며, 각각의 단위는 필요한 약제학적 담체와 회합되어 원하는 치료 효과를 산출하도록 계산된 소정량의 활성성분을 함유한다. 이러한 단위 투여형의 예로는 정제 (분할정 또는 코팅정을 포함), 캡슐, 환약, 분말 패킷, 웨이퍼, 주사제 또는 주사용 현탁제, 티스푼형 (teaspoonful), 테이블스푼형 (tablespoonful) 등, 및 이들의 분리된 다중회분 (segregated multiples)이 있다.

치료 과정에서 적절한 간격으로 2회, 3회, 4회 이상의 서브 용량으로서 배합물의 각 성분의 필요한 용량을 투여하는 것이 적절할 수 있다. 상기 서브 용량은 예를 들면, 각 경우에, 단위 투여형 당 각 활성 성분을 독립적으로 0.01 내지 500 mg, 예를 들어 0.1 내지 200 mg 및 특히 1 내지 약 100 mg을 함유하는 단위 투여형으로서 제제화될 수 있다.

용어 "히스톤 또는 다른 단백질의 아세틸화 유도"는 HDAC 기질, 이를 테면 비제한적으로 히스톤, 예를 틀어 히스톤 3, 히스톤 4 등; 튜불린, 예를 들어 알파-튜불린 등; 열 쇼크 단백질, 예를 들어 Hsp90의 아세틸화 상태의 유도를 의미한다.

용어 "상기 아세틸화에 의해 기능적으로 조절되는 단백질의 유도"는 비제한적으로 Hsp70의 유도, p21의 유도 등과 같은 2차 효과를 의미한다.

본 발명은 또한 샘플에서, 상기 아세틸화에 의해 기능적으로 조절되는 단백질의 유도, 또는, 히스톤 또는 다른 단백질의 아세틸화 유도의 양을 결정하는 것을 포함하여, 단독 또는 프로테아좀 억제제와 배합된 화학식 (I)의 HDAC 억제제를 특성화하는 방법에 관한 것이다. 더욱 특히, 본 발명은 샘플에서,

a) 히스톤 3의 아세틸화 유도, 히스톤 4의 아세틸화 유도, 또는 p21 유도 및

b) 알파-튜불린의 아세틸화 유도, Hsp 90의 아세틸화 유도, 또는 Hsp 70 유도의 양을 결정하는 것을 포함하여, 단독 또는 프로테아좀 억제제와 배합된 화학식 (I)의 HDAC 억제제를 특성화하는 방법에 관한 것이다. 더욱 특히, 본 발명은 a)하에 유도를 얻기 위해 필요한 농도가 b)하에 유도를 얻기 위한 농도와 같은 범위인 상기의 방법에 관한 것이다.

샘플에서 상기 아세틸화에 의해 기능적으로 조절되는 단백질의 유도 또는 히스톤 또는 다른 단백질의 아세틸화 유도의 양을 결정하는 것은 치료에 반응하는 환자를 식별하는 것을 포함할 수 있으며, 이에 따라, 인간 암의 치료에 대해 유익한 효과를 가질 것이다.

샘플에서 상기 아세틸화에 의해 기능적으로 조절되는 단백질의 유도 또는 히스톤 또는 다른 단백질의 아세틸화 유도의 양을 결정하는 것은 환자의 치료 효과를 모니터링하는 것을 포함할 수 있으며, 이에 따라 인간 암의 치료에 대해 유익한 효과를 가질 수 있다.

샘플에서 상기 아세틸화에 의해 기능적으로 조절되는 단백질의 유도 또는 히스톤 또는 다른 단백질의 아세틸화 유도의 양을 결정하는 것은 치료에 대한 치료적 반응을 예상하는 것을 포함할 수 있으며, 이에 따라 인간 암의 치료에 대해 유익한 효과를 가질 수 있다.

따라서, 본 발명은 또한, 단독 또는 프로테아좀 억제제와 배합된, I-형 및 IIb-형 HDAC에 결합 활성을 갖는 화학식 (I)의 HDAC 억제제의 용도에 관한 것이며, 상기 아세틸화에 의해 기능적으로 조절되는 단백질의 유도, 또는, 히스톤 또는 다른 단백질의 과아세틸화의 유도가 인간 암의 치료에 유익한 효과를 갖는다.

상기 샘플은 상기 HDAC 억제제 또는 상기 배합물로 치료되는 세포로부터 유래될 수 있다. 상기 샘플은 또한 화학식 (I)의 HDAC 억제제 또는 프로테아좀 억제제 및 화학식 (I)의 HDAC 억제제의 배합물로 처리된 개체 및/또는 질병에 의해 영향을 받는 조직으로부터 유래될 수 있다.

세포는 상기 HDAC 억제제 또는 상기 배합물과 접촉된 배양 세포일 수 있다. 상기 억제제 또는 상기 배합물은 세포의 성장 배지에 첨가될 수 있다. 상기 세포는 상기 억제제 또는 상기 배합물로 처리된 개체 및/또는 조직으로부터 유래될 수 있다.

바람직하게, 특성화 방법은 시험관 내에서 수행되는 단계만을 포함한다. 따라서, 본 구체예에 따라서, 인간 또는 동물 몸에서 조직 물질을 수득하는 단계는 본 발명에 포함되지 않는다.

세포는 통상 상기 아세틸화에 의해 기능적으로 조절되는 단백질의 유도, 또는, 히스톤 또는 다른 단백질의 아세틸화의 유도를 결정하기 위하여 사용되는 방법에 적합한 조건에서 처리될 것이다. 처리는 균질화, 추출, 고정, 세정 및/또는 투과화 (permeabilization)를 포함할 수 있다. 상기 처리 방법은 상기 아세틸화에 의해 기능적으로 조절되는 단백질의 유도, 또는, 히스톤 또는 다른 단백질의 아세틸화의 유도를 결정하기 위해 사용되는 방법에 따라 크게 달라진다. 상기 샘플은 환자의 생검으로부터 유래될 수 있다. 상기 생검은 추가로 처리되어 상기 아세틸화에 의해 기능적으로 조절되는 단백질의 유도, 또는, 히스톤 또는 다른 단백질의 아세틸화의 유도를 결정하기 위하여 사용되는 방법에 적합한 조건에 있는 샘플을 생성할 수 있다.

유도된 단백질의 양 또는 단백질 아세틸화의 양은 항체를 사용하여 결정될 수 있다.

본원에서 사용되는 용어 "항체"는 동일한 결합 특성을 갖는 면역글로불린 또는 이의 유도체를 나타낸다. 본 발명에 따라 사용되는 항체는 모노클로널(monoclonal) 항체이거나 폴리클로널(polyclonal) 항혈청으로부터 유래되거나 이로 구성된 항체일 수 있다. 용어 "항체"는 또한 Fab, F(ab')2, Fv 또는 scFv 단편과 같은 유도체를 의미한다. 항체 또는 이의 유도체는 자연 기원의 것이거나 (반)합성적으로 생성될 수 있다.

본 분야에 일반적으로 알려진 웨스턴 블롯팅이 사용될 수 있다. 세포 물질 또는 조직을 균질화하고, 변성제 및/또는 환원제로 처리하여 샘플을 수득할 수 있다. 상기 샘플을 폴리아크릴아미드 겔에 로딩하여 단백질을 분리하고, 멤브레인에 옮기거나 고체 상에 직접적으로 스폿팅(spotted)할 수 있다. 그 다음, 상기 항체를 샘플과 접촉시킨다. 1회 이상의 세정 단계 후에, 본 분야에 알려진 기술을 사용하여 결합 항체를 검출한다.

조직 물질, 예를 들어 얇은 조각의 고형 종양의 고정 및 투과화 후에 면역조직화학이 사용될 수 있고, 그 다음 항체를 샘플과 함께 인큐베이션시키고, 1회 이상의 세정 단계 후에, 결합 항체를 검출한다.

상기 아세틸화에 의해 기능적으로 조절되는 단백질의 유도, 또는, 히스톤 또는 다른 단백질의 아세틸화 유도의 양은 ELISA로 결정될 수 있다. 다양한 형식의 ELISA가 사용될 수 있다. 하나의 형식에서, 항체를 미량역가판과 같은 고체 상에 고정시키고, 비특이성 결합 부위를 블로킹(blocking)하고 샘플과 함께 인큐베이션시킨다. 또다른 형식에서, 상기 샘플을 먼저 고체 상과 접촉시켜, 샘플 중에 함유된 아세틸화 및/또는 유도된 단백질을 고정시킨다. 블로킹 및 임의의 세정 후에, 항체를 움직이지 않게 한 샘플과 접촉시킨다.

상기 아세틸화에 의해 기능적으로 조절되는 단백질의 유도, 또는, 히스톤 또는 다른 단백질의 아세틸화 유도의 양은 유세포분석으로 결정될 수 있다. 세포 배양 세포 또는 혈구 또는 골수로부터의 세포와 같은 세포를 고정시키고 투과화하여, 항체가 아세틸화 및/또는 유도된 단백질에 도달되도록 한다. 임의의 세정 및 블로킹 단계 후에, 항체는 세포와 접촉된다. 그 다음, 본 분야에 알려진 방법에 따라 유세포 분석을 수행하여, 아세틸화 및/또는 유도된 단백질에 결합된 항체를 갖는 세포를 결정한다.

HDAC 억제제 또는 프로테아좀 억제제 및 화학식 (I)의 HDAC 억제제의 배합물이 그의 활성을 갖는지 여부를 결정하기 위하여, 상기 HDAC 억제제 또는 상기 배합물로 처리되지 않은 세포로부터 유래된 참조 샘플에서 단백질의 유도 또는 단백질의 아세틸화의 양을 결정할 수 있다. 샘플 및 참조 샘플에서 단백질 아세틸화의 양 및/또는 유도된 단백질의 양을 결정하는 것은 동시에 수행될 수 있다. 세포 배양 세포의 경우에, 두 개의 세포 조성물이 제공되고, 이중 하나는 상기 HDAC 억제제 또는 상기 배합물로 처리하고, 다른 하나는 처리하지 않고 놔둔다. 그 다음, 두개의 조성물을 추가로 처리하고, 각 단백질 아세틸화의 양 및/또는 유도된 단백질의 양을 결정한다. 대안적으로, HDAC 억제제 또는 프로테아좀 억제제 및 화학식 (I)의 HDAC 억제제의 배합물이 이의 활성을 갖는지 여부를 결정하기 위하여, 세포 증식의 억제를 결정할 수 있다.

환자의 경우에, 샘플은 화학식 (I)의 HDAC 억제제 또는 프로테아좀 억제제 및 화학식 (I)의 HDAC 억제제의 배합물로 처리된 환자로부터 유래된다. 참조 샘플은 상기 HDAC 억제제 또는 상기 배합물로 처리되지 않은 동일한 질병으로 고통받는 또다른 환자, 또는 건강한 개체로부터 유래된다. 참조 샘플이 유래된 조직은 샘플이 유래된 조직에 상응한다. 예를 들어, 샘플이 유방암 환자의 종양 조직으로부터 유래된다면, 참조 샘플은 또한, 유방암 환자로부터의 종양 조직, 또는 건강한 개체로부터의 유방 조직으로부터 유래된다. 샘플 및 참조 샘플이 동일한 개체로부터 유래되는 것 또한 예상될 수 있다. 이러한 경우에, 참조 샘플이 유래된 조직은 HDAC 억제제, 또는 상기 배합물로 상기 개체를 처리하기 전, 또는 후에 개체로부터 수득된다. 바람직하게, 조직은 처리 전에 수득하여, 치료의 종료 후에 억제제 치료의 가능한 여효과를 배제시킨다.

실험 부분

A. 약리학적 실시예

비색 분석법(Mosmann Tim, Journal of Immunological Methods 65: 55-63, 1983)을 사용하여 A2780 종양 세포에서 세포 독성 또는 생존에 대하여 결정되는 화학식 (I)의 화합물의 세포 활성을 위하여, 제 WO 2006/010750호의 실험 부분을 참 고하였다.

HDAC 억제제의 항증식 효과는 1형 HDAC의 억제와 연관되며, 이는 HDAC 패밀리 구성원 1-3 및 8로 구성된다. A2780 세포로부터 면역-침전된 HDAC 1 상의 JNJ 26481585의 활성 및 그 효능을 R306465, SAHA, LBH-589 및 LAQ-824와 비교하여 실시예 A.1.에 나타내었다. HDAC 8 인간 재조합 효소에서 JNJ 26481585의 활성 및 그의 효능을 R306465, SAHA, LBH-589 및 LAQ-824와 비교하여 실시예 A.2.에 나타내었다.

R306465가 HDAC 1 기질 히스톤 3 (H3) 및 히스톤 4 (H4)의 아세틸화 상태를 조절하는지 여부를 추가로 조사하였다. 또한, A2780 난소 암종 세포에서 사이클린 의존적 키나아제 억제제 p21^waf1 ^, ^cip1의 유도를 조사하였다. p21^waf1 ^, ^cip1는 히스톤 아세틸화의 결과로 억제되며, HDAC 억제제에 대한 반응으로 세포 주기 억류의 유도에서 중요한 역할을 수행한다 (실시예 A.3. 참조).

HDAC 6의 억제를 평가하기 위하여, HDAC1 대 HDAC 6에 대한 화합물의 상대 효능, 그의 기질 튜불린의 아세틸화 및 Hsp 90 아세틸화의 결과인 Hsp 70의 유도를 모니터하였다 (실시예 A.4. 참조).

실시예 A: 화학식 (I)의 화합물의 I-형 특이성 및 아세틸화 효과

실시예 A.1: A2780 세포로부터 면역-침전된 HDAC 1 효소의 억제

HDAC1 활성 분석을 위하여, HDAC1을 A2780 세포 용해물로부터 면역침전시키 고, 일정 농도 곡선의 제시된 HDAC 억제제 및 H4 펩티드(50.000 cpm) [비오틴-(6-아미노헥사노익)Gly-Ala-(아세틸[³H]Lys-Arg-His-Arg-Lys-Val-NH₂]의 [³H]아세틸-표지된 단편과 함께 인큐베이션하였다 (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ). 유리 아세틸기의 방출을 측정하여 HDAC 활성을 평가하였다. 세개의 독립적인 실험에 대한 결과를 평균 IC_5O 값 ± SD로 나타냈다.

실시예 A.2: HDAC 8 인간 재조합 효소의 억제

인간 재조합 HDAC 8의 억제를 위하여, HDAC 8 Colorimetric/Flourimetric Activity Assay/Drug Discovery 키트 (Biomol; 제품 번호 AK-508)를 사용하였다. 세개의 독립적인 실험에 대한 결과를 평균 IC_5O 값 (nM) ± SD로 나타냈다. 분석을 중복하여 수행하고, Graphpad Prism (Graphpad Software)를 사용하여 IC₅₀의 표준 오차를 계산하였다.

실시예 A.3: 세포 HDAC 1 기질의 아세틸화 및 p21^waf1 ^, ^cip1의 유도

인간 A2780 난소 암종 세포를 0, 1, 3, 10, 30, 100, 300, 1000 및 3000 nM의 화합물과 함께 24 시간 동안 인큐베이션시켰다. 총 세포 용해물을 제조하고, SDS-PAGE로 분석하였다. 아세틸화된 H3 및 H4 히스톤의 수준, H3 단백질의 총 수준 및 p21^waf1 ^, ^cip1의 수준을 토끼 폴리클로널 및 마우스 모노클로널 항체로 검출한 후, 증진된 화학 발광 (ECL)로 검출을 수행하였다. 아세틸화된 H3 및 H4의 수준을 Upstate Biotechnology (제품 번호 06-299 및 06-866)로부터의 항체로 검출하고, H3 단백질의 총 수준을 Abeam (제품 번호 abl791)의 항체로 검출하고, p21^waf1 ^, ^cip1 단백질의 수준을 Transduction Laboratories (제품 번호 C24420)의 항체로 검출하였다. 항체의 적절한 희석액을 실온에서 1 내지 2 시간 또는 4 ℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 동일한 로딩을 제어하기 위하여, 블롯을 스트립핑하고 (stripped), 마우스 모노클로널 항-액틴 IgM (Ab-I, Oncogene Research Products)으로 재-프로빙하였다. 핵 단백질 추출 효능을 조절하기 위하여, 블롯을 스트립핑하고, 항-라 민 B1 (Zymed; 제품 번호 33.2000)으로 재-프로빙하였다. 그 다음, 단백질-항체 복합체를 제조자의 지시에 따라 화학 발광 (Pierce Chemical Co) 또는 형광 (Odyssey)으로 가시화하였다. 실험을 3회 수행하였다.

실시예 A.4. 튜불린의 아세틸화 및 Hsp 70의 유도

인간 A2780 난소 암종 세포를 0, 1, 3, 10, 30, 100, 300, 1000 및 3000 nM의 화합물과 함께 24 시간 동안 인큐베이션시켰다. 총 세포 용해물을 제조하고, SDS-PAGE로 분석하였다. 전체 및 아세틸화된 튜블린의 수준을 Sigma로부터의 항체를 사용하여 검출하였다: 클론 DM1A (제품 번호 T9026) 및 6-111B (제품 번호 T6793). Hsp 70 단백질을 Stressgen으로부터의 항체 (제품 번호 SPA-810)로 검출한 후, ECL 검출하였다. 항체의 적절한 희석액을 실온에서 1 내지 2 시간 또는 4 ℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 동일한 로딩을 제어하기 위하여, 블롯을 스트립핑하고, 마우스 모노클로널 항-액틴 IgM (Ab-I, Oncogene Research Products)으로 재-프로빙하였다. 핵 단백질 추출 효능을 조절하기 위하여, 블롯을 스트립핑하고, 항-라민 B1 (Zymed; 제품 번호 33.2000)으로 재-프로빙하였다. 그 다음, 단백질-항 체 복합체를 제조자의 지시에 따라 화학 발광 (Pierce Chemical Co) 또는 형광 (Odyssey)으로 가시화하였다. 실험을 3회 수행하였다.

실시예 B: 인간 혈액 종양 세포 증식의 억제

인간 혈액 종양 세포주의 패널(pannel)에서 JNJ 26481585의 항-증식 활성의 평가를 Oncodesign (Dijon, France)에 부탁하였다. 종양 세포를 상응하는 적절한 배양 배지 중의 세포 현탁물로 37 ℃, 5% CO₂ 가습 인큐베이터에서 배양하였다. 미코플라스마-부재의 종양 세포를 96-웰 평판 미량 역가판에 씨딩하고, 10% FCS를 함유하는 배양 배지 중에, 37 ℃에서 24 시간 동안 배양하였다. 그 다음, 종양 세포를 비히클(대조군), 또는 증가하는 농도의 JNJ 26481585 (5개의 다른 농도*), 보르테조미브 (5개의 다른 농도*), 또는 다양한 비율의 두 약물의 배합물에 노출시켰다. 그 다음, 세포를 추가적으로 72 시간 동안 인큐베이션하였다. 화합물(들)의 세포 독성을 490 nm에서 흡광도 측정에 의한 표준 MTS 분석으로 나타내었다. 화합물 상호 작용 (상승 작용, 가산성(Additivity), 또는 길항 작용)을 다중 약물 효과 분석으로 계산하고, 문헌 [Chou & Talalay [CHOU et al. (1984) Adv. Enzyme Regul. 22: 27-55; CHOU et al. (1991) in Encyclopaedia of human Biology. Academic Press. 2: 371-379; CHOU et al. (1991) in Synergism and antagonism in chemotherapy. Academic Press: 61-102; CHOU et al. (1994) J. Natl. Cancer Inst. 86: 1517-1524]에 기술된 방법에 따른 중간 식 원리(median equation principle)로 수행하였다.

*: 단일 제제로서 사용된 각 약물의 미리-결정된 항-증식 활성에 기초하여, 선택된 각 세포주에서 50% 억제를 넘지않도록 농도를 선택하였다.

실시예 B.1.: JNJ 26481585에 의한 인간 혈액 종양 세포의 억제

표 F.1: 결과를 3개의 독립된 신뢰성 있는 실험으로부터 결정된 평균 IC₄₀ 값(예를 들어, 세포 증식의 40% 억제에 도달하기 위하여 요구되는 nM으로 나타낸 농도) ± SD로 나타내었다.

실시예 B.2.: 보르테조미브에 의한 인간 혈액 종양 세포 증식의 억제

표 F.2: 결과를 3개의 독립된 신뢰성 있는 실험으로부터 결정된 평균 IC₄₀ 값(예를 들어, 세포 증식의 40% 억제에 도달하기 위하여 요구되는 nM으로 나타낸 농도) ± SD로 나타내었다.

실시예 B.3.: 보르테조미브와 배합된 JNJ 26481585에 의한 인간 혈액 종양 세포의 억제

표 3: 결과를 각각의 연구 (3개의 독립된 신뢰성 있는 실험)에서 중간 CI 값의 평균 배합 지수 (CI ± SD)로 나타내었으며, 각 개개의 배합비로부터 계산하였다. 0.9 미만의 CI는 '상승 작용'(회색)을 나타내며, 0.91 내지 1.09의 CI는'가산성(Additivity)'(흰색)을 나타낸다.

Claims

종양 세포의 성장 억제를 위한,

프로테아좀 억제제 및

하기 화합물 1a번(JNJ26481585)의 히스톤 데아세틸라아제 억제제, 이의 약제학적으로 허용가능한 산 또는 염기 부가 염, 또는 입체화학적 이성체의 배합물로,

상기 프로테아좀 억제제가 보르테조미브인, 배합물.
삭제
삭제
삭제
제 1항에 있어서, 하나 이상의 약제학적 담체와 함께, 보르테조미브인 프로테아좀 억제제 및 화합물 1a번(JNJ26481585)의 히스톤 데아세틸라아제 억제제를 포함하는 약제학적 조성물의 형태인 것을 특징으로 하는 배합물.
제 5항에 있어서, 동시, 별도 또는 순차적 사용을 위한 배합물.
제 1항 또는 제 5항에 있어서, 종양 세포의 성장 억제의 의학적 치료법에 사용하기 위한 배합물.
삭제
제 1항에 있어서, 상기 배합물이 급성 림프모세포성 백혈병, 급성 골수 백혈병(acute myelogenous leukemia), 급성 전골수구성 백혈병, 급성 골수 백혈병(acute myeloid leukemia), 급성 단구성 백혈병, 림프종, 만성 B 세포 백혈병, 만성 골수 백혈병, 모구성 발증(blast crisis)에서 만성 골수 백혈병, 버킷 림프종 및 다발성 골수종 치료를 위한 것인 배합물.
제 9항에 있어서, 상기 배합물이 약물 내성 급성 림프모세포성 백혈병, 약물 내성 급성 골수 백혈병, 약물 내성 급성 전골수구성 백혈병, 약물 내성 급성 골수 백혈병, 약물 내성 급성 단구성 백혈병, 약물 내성 림프종, 약물 내성 만성 B 세포 백혈병, 약물 내성 만성 골수 백혈병, 모구성 발증에서 약물 내성 만성 골수 백혈병, 약물 내성 버킷 림프종 및 약물 내성 다발성 골수종의 치료를 위한 것인 배합물.
제 9항에 있어서, 상기 배합물이 보르테조미브 내성 다발성 골수종의 치료를 위한 것인 배합물.
제 1항에 있어서, 인간 암 치료를 위한, 히스톤 또는 다른 단백질의 과아세틸화가 유도되거나, 아세틸화에 의해 기능적으로 조절되는 단백질이 유도되는 것을 특징으로 하는 배합물.
환자에서 수득된 샘플에서, 히스톤 또는 다른 단백질의 아세틸화 유도 또는 아세틸화에 의해 기능적으로 조절되는 단백질의 유도의 양을 결정(determination)하는 것을 포함하여,

단독, 또는 보르테조미브인 프로테아좀 억제제와 배합된, 제 1항에 기재된 화합물 1a번(JNJ26481585)의 히스톤 데아세틸라아제 억제제를 특성분석(characterization)하는 시험관 내(in vitro) 방법.
환자에서 수득된 샘플에서,

a) 히스톤 3의 아세틸화 유도, 히스톤 4의 아세틸화 유도, 또는 p21의 유도 및

b) 알파-튜불린의 아세틸화 유도, Hsp 90의 아세틸화 유도, 또는 Hsp 70 유도의 양을 결정하는 것을 포함하여,

단독, 또는 보르테조미브인 프로테아좀 억제제와 배합된, 제 1항에 기재된 화합물 1a번(JNJ26481585)의 히스톤 데아세틸라아제 억제제를 특성분석하는 시험관 내 방법.