ANÁLOGOS 19-NOR-VITAMINA D CON ANILLO 1.2. O 3.2 HETEROCÍCLICO ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La hormona natural, 1 a ,25-dihidroxivitamina D3 y su análogo en serie ergosterol, es decir 1 a ,25-dihidroxivitamina D2 se conocen como reguladores altamente potentes de homeostasis de calcio en animales y humanos, y más recientemente su actividad en diferenciación celular se ha establecido, Ostrem et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 84, 2610 (1987). Muchos análogos estructurales de estos metabolitos se han preparado y probado, incluyendo 1 a -hidroxivitamina D3, \ a - hidroxivitamina D2, diversas vitaminas homologadas de cadena lateral y análogos fluorados. Algunos de estos compuestos exhiben una separación interesante de actividades en diferenciación celular y regulación de calcio. Esta diferencia en actividad puede ser útil en el tratamiento de una variedad de enfermedades como osteodistrofia renal, raquitismo resistente a vitamina D, osteoporosis, soriasis, y ciertas malignidades. En 1990, se descubrió una nueva clase de análogos de vitamina D, es decir los así denominados compuestos 19-nor-vitamina D, caracterizados por reemplazo del grupo metileno exocíclico de anillo A (carbono 19), típico del sistema de vitamina D, por dos átomos de hidrógeno. Pruebas biológicas de estos análogos 19-nor- (por ejemplo, 1 a ,25-dihidroxi-19-nor-vitamina D3) revelaron un perfil de actividad selectivo con alta potencia para inducir diferenciación celular, con muy baja actividad de movilización de calcio. De esta manera, estos compuestos son potencialmente útiles como agentes terapéuticos para el tratamiento de malignidades, o el tratamiento de diversos desordenes de la piel. Dos diferente métodos de síntesis de estos análogos 19-nor-vitamina D se han descrito (Perlman et al., Tetrahedron Letters 31 , 1823 (1990); Perlman et al., Tetrahedron Letters 32, 7663 (1991 ), y DeLuca et al., en la Patente de los E.U.A. Número 5,086,191 ). Unos cuantos años después, análogos de 1 Oí ,25-dihidroxi-19-norvitamina D3 substituida
en la posición 2- con grupos hidroxi o alcoxi (DeLuca et al., en la Patente de los E.U.A. Número 5,536,713) se sintetizaron. Se ha establecido que exhiben perfiles de actividades interesantes y selectivas. Todos estos estudios indican que sitos de enlace en receptores de vitamina D pueden permitir diferentes substituyentes en C-2 en los análogos de vitamina D sintetizados. En un esfuerzo continuo por explorar la clase 19-nor de compuestos de vitamina D farmacológicamente importantes, análogos que se caracterizan por la transposición del grupo metileno exocíclico de anillo A del carbono 10 (carbono C-10), al carbono 2 (C-2), es decir compuesto 2-metilen-19-nor-vitamina D recientemente se han sintetizado y probado (Sicinski et al, J. Med. Chem., 41 , 4662 (1998); Sicinski et al., Steroids 67, 247 (2002); DeLuca et al., en las Patentes de los E.U.A. Números 5,843,928, 5,936,133 y 6,382,071 ). Estudios de mecánica molecular, realizados en estos análogos, mostraron que un cambio de conformación de anillo A puede esperarse, resultando en el "aplastamiento" del anillo ciclohexandiol. De cálculos de mecánica molecular y estudios de RMN, su equilibrio de conformación de anillo A se estableció de aproximadamente 6:4 a favor del confórmero que tiene un 1 « -OH ecuatorial. Introducción del grupo 2-metileno en el esqueleto de carbono 19-nor-vitamina D cambia el carácter de sus hidroxilos de anillo A- (1 a - y 3 /?-); ambos ahora están en la posición alílica, similar al grupo 1 a -hidroxilo (crucial para actividad biológica) en la molécula de la hormona natural, 1 a ,25-(OH)2D3. Se encontró que análogos 1 a ,25-dihidroxi-2-metilen-19-norvitamina D se caracterizan por potencia biológica significante, mejorada dramáticamente en compuestos con la configuración un (20S) "no natural". Muy recientemente, análogos de 2-etilideno de 1 a ,25-dihidroxi-19-norvitamina D3 se han sintetizado. Resultó que esta modificación del anillo A resulta en potencia biológica significante de compuestos, especialmente mejorada en isómeros E-
geométricos, Sicinski et a!., J. Med. Chem., 45, 3366 (2002). De manera interesante, se ha establecido que los isómeros E tienen un equilibrio de conformación de anillo A desplazado considerablemente a una forma de silla particular, que posee 1 a -hidroxilo en una orientación ecuatorial. También, los análogos que se caracterizan por la presencia de la porción propilideno substituida en C-2 se han sintetizado y pruebas biológicas preliminares indican actividad calcémica fuerte y selectiva (intestinal) de los isómeros geométricos E. Un equilibrio de conformación de anillo A en los compuestos de vitamina D ha atraído interés de investigación considerable por más de 30 años. El desarrollo de espectroscopia de RMN y métodos de cálculo de campo de fuerza hicieron posible establecer, o incluso pronosticar, la proporción de equilibrar formas de anillo A de silla a -y Paralelo a estos estudios, otro problema cercanamente relacionado se ha discutido en la literatura, es decir la correlación de conformación de anillo A, con actividades biológicas de los compuestos de vitamina D. Tan pronto como en 1974 se propuso [Okamura et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 71., 4194 (1974)] que la orientación ecuatorial del grupo 1 -hidroxi (es decir, la forma de silla ?-) es necesaria para la capacidad de regulación de calcio. Recientemente, Moras reportó las estructura de cristal del dominio de enlace de ligando hVDR (LBD = ligand binding domain) a la hormona natural [Moras et al, Molí. Cell, 5, 173 (2000)] y los ligandos con configuración no natural en C-20, [Moras et al, Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 98, 5491 (2001 )] y fue claro que el receptor de vitamina D liga (al menos en el estado cristalino) con análogos de vitamina D que tienen sus anillos A- en la conformación de silla ß. Parece por lo tanto interesante el sintetizar un análogo de vitamina D que solo puede asumir la conformación de silla a - opuesta de su anillo A, y como consecuencia, posee un grupo 1 « -hidroxi en la orientación axial. Como una continuación de la búsqueda por compuestos de 2-alquiliden-19-
norvitamina D biológicamente activos, análogos que se caracterizan por la presencia de un anillo adicional y sistema de "enlace aplastado" [Corey et al, J. Org. Chem., 45, 757 (1980)] se ha sintetizado y probado. Estos compuestos de 19-norvitamina D parecen objetivos interesantes debido a que restricciones estructurales de sus moléculas evitarán que su anillo A se voltee a la forma de silla ß- alterna, efectivamente "congelando" la conformación de silla a - del anillo A-. COMPENDIO DE LA INVENCIÓN La presente invención se dirige a análogos 1 a ,25-dihidroxi y 3/7 ,25-dihidroxi-19-nor-vitamina D3, su actividad biológica, y diversos usos farmacéuticas para estos compuestos. Una clase de compuestos de vitamina D 1 a -hidroxilados no conocidos hasta la fecha son los isómeros de vitamina D que tienen retirada la porción metileno exocíclica de anillo A- en C-10 y poseen un anillo adicional que conecta oxígeno 3 - y C-2. También, sus isómeros geométricos que poseen una anillo adicional que conectan el oxígeno 1 a - y C-2 representan la clase desconocida de compuestos 19-norvitamina D. Estructuralmente, estos análogos novedosos se caracterizan por las fórmulas generales I y II mostradas a continuación:
II
en donde Y se elige del grupo que consiste de hidrógeno y un grupo hidroxi protector, y en donde el grupo R representa cualquiera de las cadenas laterales típicas conocidas para compuestos de tipo vitamina D. De esta manera, R puede ser un grupo alquilo, hidrógeno, hidroxialquilo o fluoroalquilo, o R puede representar una cadena lateral de la fórmula:
en donde Z en la estructura de cadena lateral anterior se elige de Y, -OY, -CH2OY, -C =CY y -CH=CHY, en donde el doble enlace en la cadena lateral puede tener la geometría cis o trans, y en donde Y se elige de hidrógeno, metilo -COR5 y un radical de la estructura:
en donde m y n, independientemente, representan los enteros de 0 a 5, en donde R se elige de hidrógeno, deuterio, hidroxi, hidroxi protegido, flúor, trifluorometilo, y d-s-alquilo, que puede ser de cadena recta o ramificada y opcionalmente, contener un substituyente hidroxi o hidroxi protegido, y en donde cada uno de R2, R3, y R?, independientemente se elige de deuterio, deuteroalquilo, hidrógeno, flúor, trifluorometilo y C1.5 alquilo, que puede ser de cadena recta o ramificada, y opcionalmente, contener un substituyente hidroxi o hidroxi protegido, y en donde R1 y R2, en conjunto representen un grupo oxo, o un grupo alquilideno que tiene una fórmula general CkH2k- en donde k es un entero del grupo =CR2R3, o el grupo -(CH2)P-, en donde p es un entero de 2 a 5, y en donde R3 y R4, juntos
representan un grupo oxo, o el grupo -(CH2)q-, en donde q es un entero de 2 a 5, y en donde R5 representa hidrógeno, hidroxi, hidroxi protegido, o C1-5 alquilo y en donde cualquiera de los grupos CH- en las posiciones 20, 22, o 23 en la cadena lateral puede ser reemplazado por un átomo de nitrógeno, o en donde cualquiera de los grupos -CH(CH3)-, -(CH2)m-, -CR^- o -(CH2)n- en las posiciones 20, 22, y 23, respectivamente, pueden ser reemplazados por un átomo de oxígeno o azufre. La línea ondulada al carbono 20 indica que el carbono 20 puede tener la configuración R o S. Ejemplos importantes específicos de cadenas laterales con configuración 20R-natural son las estructuras representadas por las fórmulas (a), b), (c), (d) y (e) siguientes, es decir la cadena lateral como ocurre en 25-hidroxi vitamina D3 (a); vitamina D3 (b); 25-hidroxi vitamina D2 (c); vitamina D2 (d); y el epímero C-24 de 25-hidroxivitamina D2 (e).
Los compuestos anteriores de las fórmulas I y II exhiben un patrón deseado y altamente ventajoso de actividad biológica. Estos compuestos se caracterizan por tener habilidad significante para movilizar calcio de huesos, en comparación con 1 a ,25-dihidroxivitamina D3. Su actividad preferencial en la actividad de movilización de calcio permite la administración in vivo de estos compuestos para el tratamiento y profilaxis de enfermedades metabólicas de huesos. Debido a su actividad calcémica preferencial en huesos, estos compuestos serán agentes terapéuticos preferidos para el tratamiento y profilaxis de enfermedades de huesos metabólicas tales como osteoporosis, en especial osteoporosis de bajo recambio de huesos, osteoporosis inducida por esteroides, osteoporosis senil u osteoporosis postmenopáusica, así como osteomalacia, osteopenia, osteodistrofia renal y raquitismo resistente a vitamina D. Estos análogos que tienen significante actividad de movilización de calcio en huesos, mientras que son algo activos en diferenciación celular, también se espera que sean útiles como una terapia para tratar hipoparatiroidismo ya que son efectivos para elevar los niveles de calcio en sangre. Los compuestos de la invención de las fórmulas I y II también son útiles para evitar o tratar obesidad, inhibir diferenciación de adipocitos, inhibir trascripción de
gen SCD-1 , y/o reducir grasa corporal en sujetos animales. Por lo tanto, en algunas modalidades, un método para evitar o tratar obesidad, inhibir diferenciación de adipocitos, inhibir trascripción de gen SCD-1 , y/o reducir grasa corporal en un sujeto animal, incluye administrar al sujeto animal, una cantidad efectiva de uno o más de los compuestos o una composición farmacéutica que incluye uno o más de los compuestos de la fórmula I y/o II. La administración de uno o más de los compuestos o las composiciones farmacéuticas al sujeto inhibe la diferenciación de adipocitos, inhiben trascripción de genes y/o reducen la grasa corporal en el sujeto animal. Uno o más de los compuestos pueden estar presentes en una composición para tratar o evitar las enfermedades y desordenes anteriormente anotados en una cantidad de aproximadamente 0.01 /¿ g/gm a aproximadamente 10 mg/gm de la composición, de preferencia de aproximadamente 0.1 g/gm a aproximadamente 1 mg/gm de la composición, y pueden ser administrados en forma tópica, transdérmica, oral, rectal, nasal, sublingual o parenteral, en dosis desde aproximadamente 0.01 // g/día a aproximadamente 10 mg/día, de preferencia de aproximadamente 0.1 µ g/día a aproximadamente 1 mg/día. BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS Las Figuras 1 -6 ilustran diversas actividades biológicas de análogo 1 a ,25-dihidroxí-19-norvitamina D3 13, a continuación referido como "REV-B," y análogo 3 ? ,25-dihidroxi-19-norvitamina D3 14, a continuación referido como "REV-A," en comparación con la hormona nativa 1 a ,25-dihidroxivitamina D3, a continuación "1 ,25(OH)2D3." La Figura 1 es una gráfica que ilustra la actividad relativa de REV-A, REV-B y 1 ,25(OH)2D3 para competir para enlace con [3H]- 1 ,25-(OH)2-D3 con el receptor de vitamina D de rata recombinante de longitud entera; La Figura 2 es una gráfica que ilustra el por ciento de diferenciación de
células HL-60 como una función de la concentración de REV-A, REV-B y 1 ,25(OH)2D3; La Figura 3 es una gráfica que ilustra la actividad de transcripción in vitro de 1 ,25(OH)2D3 en comparación con REV-A y REV-B; y La Figura 4 es una gráfica de barras que ilustra la actividad de movilización de calcio en huesos de 1 ,25(OH)2D3 en comparación con REV-A y REV-B, y más específicamente, muestra el cambio de calcio en suero, en respuesta a una sola inyección intraperitoneal en ratones CD-I deficientes en D. Significancia estadística (p<0.05) en comparación con el grupo de vehículo se indica por un asterisco. La Figura 5 es una gráfica de barras similar a la Figura 4 que ilustra la actividad de movilización de calcio en huesos de 1 ,25(OH)2D3 en comparación con REV-A y REV-B, excepto que la Figura 5 muestra el cambio de calcio en suero en respuesta a una sola inyección intraperitoneal en ratones CD-I suficientes en D en dos dosis diferentes para cada compuesto. Significancia estadística (p<0.05) comparada con el grupo de vehículo, se indica por un asterisco. La Figura 6 es una gráfica de barras similar a la Figura 4 y 5 que ilustra la actividad de movilización de calcio en huesos de 1 ,25(OH)2D3 en comparación con REV-B, excepto porque la Figura 6 muestra el cambio de calcio en suero en respuesta a diferentes rutas de administración en ratones CD-I suficientes en D dada a dosis diferentes para cada compuesto. Significancia estadística (p<0.05) en comparación con el grupo de vehículo se indica por un asterisco. DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Como se emplea en las descripción y en las reivindicaciones, el término "grupo hidroxi protector" significa cualquier grupo comúnmente empleado para la protección temporal de funciones hidroxi, tales como por ejemplo, grupos alcoxicarbonilo, acilo, alquilsililo o alquilarilsililo (a continuación referidos simplemente como grupos
"sililo"), y grupos alcoxialquilo. Grupos protectores alcoxicarbonilo son agrupamientos alquil-O-CO- tales como metoxicarbonilo, etoxicarbonilo, propoxicarbonilo, isopropoxicarbonilo, butoxicarbonilo, isobutoxicarbonilo, ter-butoxicarbonilo, benziloxicarbonilo o aliloxicarbonilo. El término "acilo" significa un grupo alcanoilo de 1 a 6 átomos de carbono, en todas sus formas isoméricas, o un grupo carboxialcanoilo de 1 a 6 átomos de carbono, tales como un grupo oxalilo, malonilo, sucinilo, glutarilo, o un grupo acilo aromático tal como benzoilo, o un grupo benzoilo substituido con halo, nitro o alquilo. La palabra "alquilo" se emplea en la descripción o reivindicaciones, denota un radical alquilo de cadena recta o ramificada de 1 a 10 átomos de carbono en todas sus formas isoméricas. "Alcoxi" se refiere a cualquier radical alquilo que se conecta por oxígeno, es decir un grupo representado por "alquil-O-". Grupos protectores alcoxialquilo son agrupamientos tales como metoxi metilo, etoximetilo, metoxietoximetilo, o te trah id rotura ni lo y tetrahidropiranilo. De preferencia grupos protectores sililo son trimetilsililo, trietilsililo, t-butildimetilsililo, dibutilmetilsililo, difenilmetilsililo, fenildimetilsililo, difenil-t-butilsililo y radicales sililo alquilados análogos. El término "arilo" especifica un grupo fenilo substituido con fenilo o alquilo, nitro o halo. Un grupo "hidr xi protegido" es un grupo hidroxi derivado o protegido por cualquiera de los grupos anteriores comúnmente empleados para la protección temporal o permanente de funciones hidroxi, por ejemplo los grupos sililo, alcoxialquilo, acilo o alcoxicarbonilo, como se definió previamente. Los términos "hidroxi alquilo", "deuteroalquilo" y "fluoroalquilo" se refieren a un radical alquilo substituido por uno o más grupos hidroxi, deuterio o fluoro respectivamente. Un "alquilideno" se refiere a un radical que tiene la fórmula general CkH2k- en donde k es un entero. La preparación de compuestos 19-nor-vitamina D de las estructuras básicas I y II puede lograrse por un método general común, es decir la olefinación Julia
que involucra un acoplamiento de una sulfona insaturada IV, que se prepara fácilmente a partir de una cetona tipo Windaus-Grundmann bicíclica III, con la cetona bicíclica V:
En las estructuras III, IV y V, los grupos Y y R representan grupos definidos anteriormente, mientras que Ar representa fenilo, fenilo substituido (de preferencia un grupo feniitiazolina) y otros grupos aromáticos que pueden ser adecuados para el proceso de olefinación Julia, también entendiéndose que cualesquiera funcionalidades en Ar que puedan ser sensibles, o que interfieran con la reacción de condensación, habrán de evitarse. El proceso mostrado anteriormente representa una aplicación de un concepto de síntesis convergente, que se ha aplicado efectivamente para la preparación de compuestos de vitamina D (por ejemplo Kittaka et al, Synlett, 8, 1 175 (2003), y J. Org. Chem., 68, 7407 (2003). Hidrindanonas de la estructura general III se conocen, o pueden prepararse por métodos conocidos. Ejemplos importantes específicos de estas cetonas bicíclicas conocidas son las estructuras con las cadenas laterales (a), b), (c) y (d) descritas anteriormente, es decir La cetona Grundmann 25-hidroxi (e) [Baggiolini et al., J. Org. Chem, 5J_, 3098 (1986)]; cetona Grundmann's (f) [Inhoffen et al., Chem. Ber. 90, 664 (1957)]; la cetona 25-hidroxi Windaus (g) [Baggiolini et al., J. Org. Chem., 5J_, 3098 (1986)] y la cetona Windaus (h) [Windaus et al., Ann., 524, 297 (1936)]:
Para la preparación de las cetonas bicíclicas requeridas de la estructura general V, se ha desarrollado una nueva ruta sintética partiendo de la trama bicíclica 1
que se obtiene de ácido (1 R,3R,4S,5R)-(-)-quínico comercial, como se describió previamente [Hanessian et al., J. Org. Chem. 62, 465 (1997)]. Las primeras etapas del proceso total de transformación de la lactona de partida 1 en las sintonas de anillo A deseadas, se ¡lustran en el ESQUEMA I. De esta manera, uno de los dos grupos hidroxi secundarios de 1 (hidroxilo ecuatorial en C-3) se protege selectivamente como t-butildimetilsilil éter (TBDMS) y el otro después se oxida con el reactivo peryodinano Dess-Martin a la cetona 4 3. El 1 -hidroxilo terciario se acetila y la acetoxi cetona 4 resultante se somete a la reacción Wittig con una ilida generada del bromuro de fosfonio A apropiado, que se prepara a partir de 3-bromo-1 -propanol, y n-butil litio. Este proceso da por resultado dos compuestos eleofinicos isoméricos 5a y 5b en la proporción aproximada de 5:1. Las etapas subsecuentes de la síntesis se ilustran en el ESQUEMA II. Aunque pueden emplearse muy diferentes reactivos para desprotección del grupo hidroxi primario terminal en 5b (por ejemplo BuSH y MgBr2 en etil éter y B-clorocatecolborano en cloruro, de metileno), un tratamiento con yoduro de aluminio en acetonitrilo proporciona el mejor rendimiento del compuesto 3'-hidroxipropilideno 6 deseado que subsecuentemente se tosila bajo condiciones estándar. Reacción subsecuente del tosilato 7 con fluoruro de tetrabutilamonio de un rendimiento excelente del producto ciclizado 8. Su reducción con borohidruro de sodio produce un triol bicíclico 9. La escisión de peryodato del diol vicinal y subsecuente sililación del hidroxilo axial secundario en la hidroxi cetona formada 10, proporciona el fragmento de anillo A deseado 1 1. Este derivado hexahidrocrominona después se somete a la olefinación Julia modificada. La tiazolina sulfona 12 se sintetiza a partir de la cetona Grundmann 15. La ruta sintética se describe en el ESQUEMA III, y empieza de la conversión de 15 al éster alílico 16, que después se reduce al alcohol alílico 17. Este último compuesto se somete a la secuencia de reacción de tres etapas que involucra reacción Mitsunobu, oxidación y sililación. El acoplamiento de la cetona 11
con el anión generado de 12 y bis(trimetilsilil)amida litio, seguido por remoción de los grupos de protección sililo dió una mezcla esperada de dos análogos 19-norvitamina D 13 y 14 que se purificaron y separaron por HPLC de fase directa e inversa. Análisis de sus espectros 1H RMN confirman que el anillo A en estos compuestos, debido a la presencia de un doble enlace exocíclico es parte del anillo de seis miembros adicional, evita que se voltee y mantenga en la conformación de una silla sencilla. Diversos otros compuestos de 19-nor-vitamina D pueden sintetizarse por el método descrito aquí utilizando la sintona del anillo A 1 1 y las cetonas Windaus-Grundmann apropiadas que tiene la estructura de cadena lateral deseada. Esta invención se describe por los siguientes ejemplos ilustrativos. En estos ejemplos, productos específicos identificados por números arábigos (por ejemplo 1 , 2, 3, etc) se refieren a las estructuras específicas así identificadas en la descripción precedente en el ESQUEMA I, ESQUEMA II, Y ESQUEMA III. EJEMPLOS Química. Puntos de fusión (no corregidos) se determinaron en un aparato de punto de fusión capilar Thomas-Hoover. Espectros de absorción ultravioleta (UV) se registraron con un espectrofotómetro Perkin-Elmer Lambda 3B UV-VIS en etanol. Espectros de resonancia magnética nuclear 1H (RMN) se registraron a 400 y 500 MHz con aparatos espectrómetros Bruker Instruments DMX-400 y DMX-500 Avance consolé en deuteriocloroformo. Espectros de resonancia magnética nuclear 13C (RMN) se registraron a 125 MHz con un aparato espectrómetro Bruker Instruments DMX-500 Avance en deuteriocloroformo. Desplazamientos químicos { d ) se reportan campo bajo de Me4Si interno ( d 0.00). Espectros de masas de impacto de electrones (El) se obtuvieron con un instrumento Micromass AutoSpec (Beverly, MA). Cromatografía líquida de alto desempeño (HPLC) se realiza en un cromatógrafo líquido de Waters Associates equipado
con un sistema de suministro solvente Modelo 6000a, un inyector Universal Modelo U6K, y un detector de absorbencia ajustable Modelo 486. THF se destiló recientemente entes de uso a partir de benzofenona cetil sodio bajo argón. EJEMPLO I Preparación de análogos 1 a ,25-dihidroxi- y 3 ? ,25-dihidrox¡-19-norvitamina D3 13 y 14. Primero con referencia al ESQUEMA I, la lactona bicíclica de partida I se obtiene a partir de ácido quínico comercial (-)- como se describió previamente [Hanessian et al., J. Org. Chem. 62, 465 (1997)]. (a) Protección de Grupo 3-Hidroxi en la Lactona 1. (1 R, 3R, 4S, 5R)-1 ,4-Dihidrox¡-3-[(rer-butildimetilsilil)oxi]-6-oxa-biciclo[3.2.1 ]octan-7-ona (2). A una solución agitada de lactona 1 (1 .80 g, 10.34 mmol) e imidazol (2.63 g, 38.2 mmol) en DMF anhidro (14 mL) se agrega cloruro de t-butildimetilsililo (1 .80 g, 1 1.9 mmol) a 0 grados C. La mezcla se agita a 0 grados C por 30 minutos y 1 h a temperatura ambiente, vacía en agua y extrae con etil acetato y éter. La capa orgánica se lava varias veces con agua, seca (MgS04), y evapora para dar un residuo cristalino incoloro que se cristaliza a partir de hexano/etil acetato para dar 2.12 g de 2 puro. Los licores madre se evaporaron y purificaron por cromatografía instantánea, elución con hexano/etil acetato (8:2) dió una cantidad adicional de monoéter cristalino 2 (0.14 g, rendimiento total 76%) y alguna cantidad de éter isomérico cristalino (3-OH, 4-OTBDMS) (0.10 g, 3%). 2: p.f. 90-94 °C (de hexano); [« ]24D -44° (c 1.00 CHCI3); 1H RMN (500 MHz, CDCI3) d 0.095 (6H, s, 2 x SiCH3), 0.901 (9H, s, Si-f-Bu), ca. 2.0 (2H, br m, 2 - y 2 ß- ), 2.29 (1 H, ddd, J = 1 1.6, 6.0, 2.6 Hz, 8 7-H), 2.63 (1 H, d, J = 1 1.6 Hz, 8 a -H), 3.89 (1 H, ddd, J = 10.4, 7.0, 4.5 Hz, 3/?-H), 3.98 (1 H, t, J = 4.6 Hz, 4/7-H), 4.88 (1 H, dd, J = 6.0, 4.8
??, 5a -H); 13C RMN (125 MHz) d -5.0 (Si-CH3), -4.7 (Si-CH3), 17.9 [C(CH3)3], 25.6 [C(CH3)3], 36.4 (C8), 40.2 (C2), 65.8 (C4), 67.0 (C3), 71.9 (d), 76.3 (C5), 177.9 (C=0), MS (El) m/z (de intensidad relativa) 288(M+, 1 ), 231 (41 ), 213 (21 ), 185 (85), 75 (100); HRMS (ESI), masa exacta para calcular C13H2405SiNa (M+ + Na) 311.1291 , medida 311.1287; Anal. Análisis calculado para C13H2405Si: C, 54.14, H, 8.39. Encontrado: C, 53.94, H, 8.36. (b) Oxidación de Grupo 4-Hidroxi en la Dihidroxi Lactona 2. (1 R,3R,4S,5R)-3-[(ter-Butildimetilsilil)oxi]-1-hidroxi-6-oxa-biciclo[3.2.1]octano-4,7-diona (3). A una suspensión agitada del reactivo peryodinano Dess-Martin (6.60 g, 15.5 mmol) en CH2CI2 anhidro (100 ml_) se agrega al compuestos 2 (3.86 g, 13.4 mmol). La mezcla se agita a temperatura ambiente por 18h, vacía en agua y extrae con etil acetato. La capa orgánica se lava varias veces con agua, seca (MgS04), y evapora para dar un residuo aceitoso que cristaliza lentamente al enfriar (3.67 g, 95%). TLC indica alta pureza de la cetona 3 obtenida que puede utilizarse en la siguiente etapa sin mayor purificación. Muestra analítica se obtiene al recristalizar a partir de hexano. 3: p.f. 92-95 grados C; H RMN (400 MHz, CDCI3) d 0.040 y 0.133 (3H y
3H, cada uno s, 2 x SiCH3), 0.895 (9H, s, Si-f-Bu), 2.15 (1 H, dd, J = 12.4, 10,4 Hz, 2a -H), 2.42 (1 H, d, J = 12.5 Hz, 8a -H), 2.54 (1H, ddd, J = 12.4, 9.0, 3.9 Hz, 2ß- H), 2.86 (1 H, ddd, J = 12.5, 6.7, 3.9 Hz, 8/?-H), 4.54 (1H, dd, J = 10.4, 9.0 Hz, 3/9- H), 4.73 (1 H, d, J -6.7 Hz, 5« -H); 13C RMN (125 MHz) d -5.6 (Si-CH3), -4.8 (Si- CH3), 18.2 [C(CH3)3], 25.6 [C(CH3)3], 42.3 (C8), 43.0 (C2), 70.3 (C3), 71.8 (d), 78.7 (C5), 177.1 (C=0), 202.4 (C4); MS (El) m/z (de intensidad relativa) no M+, 271 (M+ - CH3, 4), 229 (92), 201 (28), 157 (100); HRMS (ESI), masa exacta calculada para C9Hi305Si (M+ - t-Bu) 229.0532, medida 229.0539; Análisis calculado para Ci3H2205Si x H20: C, 51.29, H, 7.95. Encontrado: C, 51.09, H, 7.90. (c) Acetilación de Grupo 1-Hidroxi en el Hidroxi Cetona 3.
(1 R,3R,5R)-1-Acetoxi-3-[(fer-butildimetilsilil) oxi]-6-oxa-biciclo[3.2.1] octano-4,7-diona (4). Solución de hidroxi cetona 3 (1 .64 g, 5.8 mmol) en piridina anhidra (12 mL) y anhidro acético (5.5 mL) se agita por 3 h a temperatura ambiente. Se vacía en agua y extrae con etil acetato. La capa orgánica se lava con NaHC03 saturado, CuS04 saturado y agua, seca (MgS04), y evapora para dar un residuo aceitoso que se disuelve en hexano/etil acetato (8:2) y filtra a través de una ruta corta de gel de sílice. Evaporación de solvente dió el acetato cristalino puro 4 (1.51 g, 81 %). Muestra analítica se obtiene por recristalización a partir de hexano/etilo. 4: p.f. 134-7 grados C; [a ]24D -78° (c 1 .00 CHCI3); H RMN (400 MHz,CDCI3) d 0.046 y 0.141 (3H y 3H, cada uno s, 2 x SiCH3), 0.901 (9H, s, SU-Bu), 2.17 (3H, s, CH3CO), 2.28 (1 H, dd, J = 12.2, 10.4 Hz, 2 a -H ), 2.32 (1 H, d, J = 12.1 Hz, 8a -H), 2.65 (1 H, ddd, J = 12.2, 8.8, 3.9 Hz, 2 ß-?\ 3.56 (1 H, ddd ,J = 12.1 , 6.9, 3.9 Hz, 8 /7-H), 4.58 (1 H, dd, J = 10.4, 8.8 Hz, ? ß- ), 4.80 (1 H, d, J = 6.9 Hz, 5 a - H); 13C RMN (125 MHz) d -5.8 (Si-CH3), -4.9 (Si-CH3), 18.2 [C(CH3)3], 20.9 (CH3-C=0), 25.6 [C(CH3)3], 38.3 (C8), 40.3 (C2), 70.4 (C3), 75.3 (d), 78.4 (C5), 169.1 (CH3-C=0), 171.5 (C=0), 201 .8 (C4); MS (El) m/z (intensidad relativa) (M+, 6), 271 (100), 256 (38), 229 (54), 21 1 (53); HRMS (ESI) masa exacta calculada para CnHi506Si (M+ - t-Bu) 271 .0638, medida 271.0646; Análisis calculado para C15H2 06Si: C, 54.86, H, 7.37. Encontrada: C, 54.88, H, 7.37. (d) Preparación de Bromuro de Fosfonio A. Bromuro de [3-(Metoximetoxi)propil] trifenilfosfonio (A). A una solución de bromometil metil éter (1 .3 mL, 16 mmol) y N,N- diisopropiletilamina (4.5 mL, 27.7 mmol) en CH2CI2 anhidro (50 mL) a 0 grados C, se agrega 3-bromo-1 -propanol (1.0 mL, 1 1 mmol) y la mezcla se agita a 0 grados C por 1 h y a temperatura ambiente por 20 h. La mezcla de reacción se vacía en HCI 1 N (150 mL), la fase orgánica se separa y fase de agua se extrae con CH2CI2. Las fases orgánicas combinadas se lavan con agua y diluyen
con NaHC03, seca (MgS04), y evapora para dar un aceite amarillento. El residuo se purifica por cromatografía instantánea. Elución con hexano/etil acetato (95:5) dió por resultado aceitoso puro 1 -bromo-3-(methoximetoxi)propano (1.12 g, 55%): 1H RMN (400 MHz, CDCI3) 5 2.13 (2H, m, CH2-CH2-CH2), 3.37 (3H, s, O-CH3), 3.53 (2H, br t, J = 6.5 Hz, Br-CH2), 3.67 (2H, br t, J = 5.8 Hz, CH2- CH2-0), 4.63 (2H, s, 0-CH2-0). A una solución de 1 -bromo-3-(metoximetoxi)propano (0.46 g, 2.5 mmol) en tolueno anhidro (1.5 mL) se agrega trifenilfosfina (0.71 g, 2.7 mmol) bajo argón con agitación. La mezcla se calienta por 100 grados C por 20 h y enfría á temperatura ambiente. El líquido se decanta y el residuo sólido se muele con espátula, filtra y lava varias veces con éter. Después de secar durante la noche en un desecador al vacío, cristales incoloros de sal fosfonio A (0.98 g, 88%) pudieron utilizarse en la reacción Wittig sin mayor purificación. A: p.f. 165-168 grados C, 1H RMN (500 MHz, CDCI3) d 1.96 (2H, m, CH2-CH2-CH2), 3.31 (3H, s, O-CH3). 3.85 (2H, br t, J = 5.6 Hz, CH2-CH2-0), 4.00 (2H, m, P-CH2), 4.60 (2H, s, O-CH2-O), 7.70, 7.79 y 7.86 (6H, 3H y 6H, cada uno m, Ar-H); Análisis calculado para C23H2602PBr: C, 62.03, H, 5.88, Br, 17.94. Encontrado: C, 61.87, H, 5.77, Br, 17.89. (e) Reacción Wittig de la Cetona 4-4 con la ilida generada de A. [(E)- y (Z)-(1 R.3R,5R)-1 -Acetox¡-3-[(ter-butildimetilsilil)oxi]-6-oxa-4-[3'-metoximetoxi)propiliden] biciclo[3.2.1]octano-7-ona (5a y 5b). A un bromuro de fosfonio A (420 mg, 0.94 mmol) en anhidro THF (5 mL) a 0 grados C se agrega por gotas rc-BuLi (1 .6 M en hexanos, 1.12 mL, 1.8 mmol) bajo argón con agitación. Después de 5 minutos, se agregó otra porción de A (420 mg, 0.94 mmol) y la solución se agita a 0 grados C por 10 minutos y después a temperatura ambiente por 20 minutos. La mezcla naranja-rojo se
enfría a -78 grados C y extrae con sifón en 2 porciones iguales (intervalo 30 minutos) a una solución de ceto lactona 4 (300 mg, 0.91 mmol) en THF anhidro (8 ml_). La mezcla de reacción se agita a -78 grados C y detiene por adición de salmuera que contiene HCI al 1% (3 h después de adición de la primera porción del reactivo Wittig). Etil acetato (9 mL), benceno (6 mL), éter (3 mL), NaHC03 sat. (3 mL), y agua (3 mi) se agregan y la mezcla se agita vigorosamente a temperatura ambiente por 18 h. Después la fase orgánica se separa, lava con salmuera, seca (MgS04), y evapora. El residuo aceitoso (que consiste primordialmente con los compuestos isoméricos 5a y 5b en la proporción aproximada de 5:1 ) se separa por cromatografía instantánea en sílice. Elucsión con hexano/etil acetato (85:15) resulta en separación parcial de productos: 29 mg de 5b, mezcla de 5a y 5b (85 mg) y 5a puro (176 mg; rendimiento total 77%). Recromatografía de las fracciones mixtas resulta en una separación casi completa de los productos. 5a: [« ]24D -63° (c 0.60 CHCI3); 1H RMN (500 MHz, CDCI3) d 0.074 (6H, s, 2 x SiCH3), 0.914 (9H, s, Si-Z-Bu), 2.13 (3H, s, OCH3), 2.00 (1 H, br t, J = 11.2, Hz, 2a -H), 2.10 (1 H, d, J = 10.8 Hz, 8a -H), 2.34 (1 H, ddd, J = 11.7, 7.0, 2.9 Hz, 2/?-H), 2.38 y 2.43 (1 H y IH, cada uno m, =C-CH2), 3.31 (1 H, ddd, J = 10.8, 6.5, 2.9 Hz, 8 9-H), 3.35 (3H, s, 0-CH3), 3.54 y 3.60(1 H y IH, cada uno m, CH2- CH2-0), 4.41 (1 H, t, J = 8.2 Hz, 3/ff-H), 4.60 (2H, s, O-CH2-O), 5.52 (1 H, d, J = 6.5 Hz, 5a -H), 5.71 (1 H, br t, J = 7.1 Hz, =CH); 13C RMN (125 MHz) d -5.1 (Si-CH3), -4.9 (Si-CH3), 18.1 [C(CHa)3], 21.1 CH3-C=0), 25.7 [C(CH3)3], 27.5 (CH2-CH2- C=), 40.5 (C8), 41.5 (C2), 55.2 (0-CH3), 66.7 (0-CH2-CH2), 66.8 (C3), 77.1 (d), 73.9 (C5), 96.3 (0-CH2-O), 121.9 C=C-CH2), 136.8 (C4), 169.1 (CH3-C=0), 172.9 (C=0); MS (El) m/z (intensidad relativa), no M+, 383 (M+ - OCH3, 3), 357 (10), 325 (44), 297 (12), 267 (15), 265 (40), 237 (89), 75 (100); HRMS (ESI) masa exacta calculada para C2oH3407SiNa (M+ + Na) 437.1972, medida 437.1975. 5b: 1H RMN (500 MHz, CDCI3) d 0.108 y 0.125 (3H y 3H, cada uno s, 2 x
SiCH3), 0.912 (9H, s, Si-f-Bu), 2.13 (3H, s, OCH3), 2.15 (1 H, dd, J = 12.6, 8.3 Hz, 2 « -H), 2.31 (1 H, d, J = 10.8 Hz, 8 a -H), 2.33 (1 H, 2 7-H superpuesto con 8 a -?), 2.67 y 2.73 (1 H y 1 H, cada uno m, =C-CH2), 3.25 (1 H, ddd, J = 10.8, 6.3, 2.8 Hz, 8/MH), 3.36 (3H, s, 0-CH3), 3.55 (2H, m, CH2-CH2-0), 4.61 (2H, s, O- CH2-0), 4.71 (1 H, br t, J - 7 Hz, 3ß-?), 4.94 (1 H, d, J = 6.3 Hz, 5 « -H), 5.64 (1 H, dt, J = 1 .7, 7.1 Hz, =CH); 13C RMN (125 MHz) d -4.6 (Si-CH3), -4.5 (Si-CH3), .17.9 [C(CHa)3], 21.1 (CH3-C=0), 25.7 [C(CH3)3], 27.8 (CH2-CH2-C=), 38.9 (C8), 41.2 (C2), 55.3 (0-CH3), 67.1 (0-CH2-CH2), 67.2 (C3), 77.1 (C,), 81.8 (C5), 96.4 (0-CH2-O), 128.9 C=C-CH2), 134.8 (C4), 169.1 (CH3-C=0), 173.0 (C=0); MS (El) m/z (intensidad relativa), no M+, 383 (M+ - OCH3, 2), 357 (2), 325 (22), 297 (17), 267 (35),265 (14), 237 (96), 75 (100); HRMS (ESI) masa exacta calculada para C2oH3407Si a (M+ + Na) 437.1972, medida 437.1974. (4Z)-(1 R,3R,5R)-1 -Acetoxi-3-[(ter-butildimetilsilil)oxi]-4-[3'-hidroxipropilideno]-6-oxabiciclo[3.2.1 ]octan-7-ona (6). A una solución de 5b (26 mg, 63 A/mol) en anhidro CH3CN (0.6 mL) se agrega All3 (170 mg, 0.42 mmol) a 0 grados C bajo argón. La mezcla se agita a 0 grados C por 50 minutos, vacía en Na2S203 acuoso, y extrae con etil acetato. El extracto se lava con salmuera, seca (Na2S04), y evapora. El residuo se purifica por cromatografía instantánea, elución con hexano/etil acetato (6:4) dió por resultado el compuesto 6 como un aceite incoloro (16.5 mg, 71 %). 6: 1H RMN (500 MHz, CDCI3) d 0.132 y 0.144 (3H y 3H, cada uno s, 2 x SiCH3), 0.925 (1 H, s, C(CH3)3), 2.13 (3H, s, COCH3), 2.14 (1 H, dd, J = 12.4, 8.8 Hz, 2 a -H), 2.28 (1 H, d, J = 10.8 Hz, 8« -H), 2.33 (1 H, ddd, J = 12.4, 7.0, 2.8 Hz, 2 ß-?), 2.45 y 2.79 (2H, 2 x m, CH-CH2), 3.29 (1 H, ddd, J = 10.8, 6.2, 2.8 Hz, 8 ?-H), 3.60 y 3.71 (2H, 2 x m, CH2OH), 4.71 (1 H, t, J = 7.8 Hz, 3/?-H), 4.97 (1 H, d, J = 6.3 Hz, 5a -H), 5.65 (1 H, dt, J = 1.8, 7.8 Hz, =CH); 13C RMN (125 MHz) d -4.6 (SiCH3), 17.9 [C(CH3)3], 25.8 [C(CH3)3],21.1 (COCH3), 30.1 (CH- CH2), 39.8 (C8), 41.4 (C2), 61.4 (CH2OH), 67.6 (C3),
77.0 (d), 81.2 (C5), 128 (CH- CH2), 135.8 (C4), 169.2 (COCH3), 173.0 (CO); HRMS (ESI) masa exacta calculada para C18H3o06S¡Na (M+ + Na) 393.1709, medida 393.1690. (4Z)-(1 R,3R,5R)-1-Acetoxi-3-[(ter-butildimetil silil)oxi]-6-oxa-4-[3'-(p-toluensulfoniloxi) propilideno]biciclo[3.2.1]octan-7-ona (7). A una solución de compuesto hidroxi (16 mg, 43 //mol) en piridina anhidra (140 µ L) se agrega a 0 grados C/cloruro de p-toluensulfonilo (24 mg, 127 // mol) y una cantidad catalítica de 4-(dimetilaminp)piridina. La mezcla se agita a 0 grados C por 1 hora a 6 grados C por 18 horas. Después se vacía en NaHC03 saturaro/hielo agita por 15 min y extrae con etil acetato y benceno. Los extractos combinados se lavaron con NaHC03 saturado, agua CuS04 saturado, agua de nuevo, secan (Na2S04) y evaporan. El residuo (aproximadamente 16 mg) se disuelve en benceno/hexano, aplica en un cartucho Sep-Pak de sílice, y lava con hexano/etil acetato (95:5, 10 mL) para retirar impurezas apolares. Elución-lavado con hexano/etil acetato (85:15,20 mL) proporciona un tosilato aceitoso puro 7(19mg, 84%). 7: [a fAD -48° (c 0.80 CHCI3); 1H RMN (400 MHz, CDC!3) d 0.043 y 0.088 (3H y 3H, cada uno s, 2 x SiCH3), 0.871 (1 H, s, C(CH3)3), 2.13 (3H, s, COCH3), 2.08 (1 H, dd, J = 12.0, 9.3 Hz, 2 a -H), 2.16 (1 H, d, J - 10.8 Hz, 8« -H), 2.28 (1 H, ddd, J = 12.0, 6.9, 3.0 Hz, 2 ¿?-H), 2.46 (3H, s, CH3-Ar), 2.67 y 2.88 (2H, 2 x m, CH-CH2), 3.26 (1 H, ddd, J = 10.8, 6.2, 3.0 Hz, 8-/?H), 4.05 (2H, t, J = 6.4 Hz, CH2OS), 4.62 ( IH, t, J ~ 8 Hz, 3/7-H), 4.85 (1 H, d, J = 6.4 Hz, 5« -H), 5.43 (1 H, dt, J = 2, 7.5 Hz, -CH), 7.36 y 7.78 (2H y 2H, cada uno d, J = 8.3 Hz, Ar-H); HRMS (ESI) masa exacta calculada para C25H3608SSiNa (M+ + Na) 547.1798, medida 547.1812. (1 R,7R,9S)-(9-Acetoxi-6,11-dioxa-triciclo [7.2.1.0*2,7*]dodec-2-en-10-ona (8). Solución de tosilato 7 (18.8 mg, 36 // mol) en THF seco (8 mL) se trata con fluoruro de tetrabutilamonio (1.0 M en THF, 180 µ ?, 180 / mol). La mezcla se agita bajo argón a temperatura ambiente por 18 h, vacía en salmuera y extrae con etil acetato y benceno.
Extractos orgánicos se lava con salmuera, secan (Na2S04) y evaporan. El residuo aceitoso se disuelve en hexano y aplica en un cartucho Sep-Pak de sílice, y lava con hexano/etil acetato (85:15, 20 ml_) para dar producto tricíclico puro 8 (7.6 mg, 89%) como un aceite. 8: [a ]24D-5I° (c 0.40 CHCI3); 1H RMN (400 MHz, CDCI3) d 2.02 (1 H, dm, J -17 Hz, 4P-H), 2.07 (1H, dd, J = 11.6, 10.6 Hz, 8a-H), 2.1 1 (1H, d, J = 11.0 Hz, 12a-H), 2.13 (3H, s, COCH3), 2.39 (1H, m, w/2 = 38 Hz, 4«-H), 2.50 (1H,ddd, J = 11.6,7.8,3.1 Hz, 8 ?-H),3.35 (1H,ddd, J = 11.0, 6.2, 3.1 Hz, 12/7-H), 3.66 (1H, dt, J = 3.8, 11.4 Hz, 5 7-H), 4.04 (1H, dd, J = 11.5, 6.3 Hz, 5«-H), 4.3J (1H, m, w/2 = 22 Hz, 7 7-H), 5.00 (1H, d, J = 6.2 Hz, ?a-?), 5.86 (1H, m, w/2 = 11 Hz, 3-H); 13C RMN (125 MHz) d 21.1 (COCH,), 24.5 (C4), 37.6 (C8), 40.9 (C12), 64.2 (C5), 69.1 (C7), 78.5 (d), 77.1 (C9), 121.9 (C3), 134.6 (C2), 169.2 (COCH3), 172.5 (Cl0); HRMS (ESI) masa exacta calculada para C|2H1405 (M+) 238.0841, medida 238.0851 (5R,7R,8aR)-7-Hidroximetil-3,5,6,7,8,8a-hexahidro-2H-cromeno-5,7-diol (9). A una solución de compuesto tricíclico 8 (9.5 mg, 40 µ mmol) a 0 grados C se agrega NaBH . La mezcla resultante después se agita a temperatura ambiente por 18 h, un pequeño volumen se salmuera/ NH CI saturado se agrega y los solventes se retiran al vacío. El residuo se lava varias veces con etanol caliente. Los extractos de etanol se combinan y evaporan a sequedad con benceno. El residuo sólido después se lava unas cuantas veces con cloroformo caliente. Los extractos de cloroformo combinados se concentraron en un pequeño volumen y aplican en un cartucho Sep-Pak de sílice. Elución con hexano/etil acetato (1:9, 20 mL) dió por resultado un tiol semi sólido puro 9 (6 mg, 75%). 9: [a]24D +20° (c 0.30, MeOH); 1H RMN (500 MHz, CDCI3) d 1.54 (1H, t, J = 12.1 Hz, 8a-H), 1.65 (1H, dd, J = 14.3, 3.9 Hz, 6a-H), 1.98 (1H, dm, J - 16 Hz, 3 ?-H),
2.18 (1H, dt, J = 14.3, 2.3 Hz, 6/7-H), 2.29 (1H, ddd, J = 12.4, 5.5, 2.3 Hz, 8/7-H), 2.34 (1H, br m, 3a -H), 3.60 (1H, ddd, J = 11.2, 10.2, 3.8 Hz, 2ß- ), 3.72 y 3.81 (1H y IH, cada uno d, J = 1 1.3 Hz, CH2OH), 3.94 (1H, ddd, J = 1 1.2, 5.7, 2.0 Hz, 2 -?), 4.37 (2H, m, 5a-y8a ?-H), 5.84 (1H, m, w/2 = 11 Hz, 4-H); 13C RMN (125 MHz) d 25.5 (C3). 41.3 y 41.8 (C6 y C8), 62.9 (C2), 69.2
(CH2OH), 69.4 (Cea), 72.2 (C5), 76.5 (C7), 122.8 (C4), 140.0 (C48); HRMS (ESI) masa exacta calculada para C10H14O3 (M+ - H20) 182.0943, medida 182.0949. (5R,8aR)-5-Hidrox¡-2,3,5,6,8,8a-hexahidiO-cromen-7-ona (10): Agua saturada con peryodato de sodio (50 µ L) se agrega a una solución del triol 21 (5 mg, 2.6 µ mol) en metanol (200 µ L) a 0 grados C. La mezcla se agita a 0 grados C por 1 hora, después tioanisol se agrega y agitación se continúa por 10 min. La mezcla se diluye con benceno/etil acetato (1:1, 1 mL) y filtra a través de un Sep-Pak de sílice. Después el Sep-Pak se lava con 5 mL adicionales del mismo sistema solvente, las soluciones combinadas se evaporan, el residuo se redisueive en hexano/etil acetato (7:3) y aplica en un Sep-Pak gel de sílice. Elución con el mismo sistema solvente (10 mL) proporciona compuestos aromáticos y una (5R,8aR)-5-hidroxi-2,3,5,6,8,8a-hexahidro-cromen-7-ona (4.1 mg, 98%) pura se eluye con hexano/etil acetato (1:1, 10 mL) como un aceite incoloro. 10: [CX]24D +6° (c 0.22, CHCI3); 1H RMN (500 MHz, CDCI3) d 2.09 (1H, dm, J = 17.6 Hz, 3a-H), 2.38 (1H, m, w/2 = 35 Hz, 3/7-H), 2.49 (1H, dd, J = 13.8, 1 1.1 Hz, 8a-H), 2.60 (1H, dd, J = 15.0, 3.7 Hz, 6«-H), 2.65 (1H, dd, J = 15.0, 2.5 Hz, 6 ?-H), 2.89 (1H, ddd, J = 13.8, 6.4, 1.6 Hz, 8/7-H), 3.68 (1H, ddd, J = 1 1.3, 9.3, 3.9 Hz, 2/?-H), 3.96 (1H, ddd, J = 1 1.3, 5.4, 2.9 Hz, 2a-H), 4.62 (1H, t, J ~ 3 Hz, 5a-H), 4.67 (1H, m, w/2 = 24 Hz, 8a/?-H), 6.01 (1H, m, w/2 = 10 Hz, 4-H); 13C RMN (125 MHz) d 25.1 (C3), 47.9 (C8), 48.8 (C6).62.5 (C2), 69.9 (C8a), 72.5 (C5), 123.3 (C4), 138.2 (C4a), 206.5 (C7); HRMS (ESI) masa exacta calculada para C9H]203Na (M+ + Na) 191.0684, medido 191.0676.
(5R,8aR)-5-[ter-Butildimetilsilil)oxi]-2,3,5,6,8,8a-hexahidro-cromen-7-ona (1 1 ). A una solución de la hidroxi cetona (4 mg, 24 //moles) en cloruro de metileno anhidro (90 µ?) a -50 grados se agregan C 2,6-lutidina (7 µ?_, 60 mmoles) y ter-butildimetilsililo trifluorometansulfonato (12 µ?_, 51 mmoles). La mezcla de reacción se agita a -50 grados C por 50 minutos, diluye con cloruro de metileno frío y vacía en agua. La fase orgánica se lava con CuS04 saturado y agua, seca (Na2S0 ) y evapora. El residuo se redisuelve en hexano y aplica en un Sep-Pak de gel de sílice. Elución con hexano/etil acetato (95:5, 10 mL) proporciona compuesto menos polar (2.1 mg) que es el derivado TBDMS del enol éter derivado de 11. La hidroxi cetona 1 1 protegida desea (3.3 mg, 49%) se eluye con hexano/etil acetato (9: 1 , 10 mL) como un aceite incoloro. Mayor elución con el mismo sistema solvente dió por resultado 2,3,8,8a-tetrahidro-cromen-7-ona (0.6 mg). 1 1 : [a ]2 D -9° (C 0.1 1 , CHCI3); 1H RMN (500 MHz, CDCI3) d 0.035 y 0.058 (3H y 3H, cada uno s, 2 x S¡CH3), 0.838 [1 H, s, C(CH3)3], 2.08 (1 H, dm, J - 17.3 Hz, 3a -H), 2.33 (1 H, m, w/2 = 33 Hz, 3/7-H), 2.46 (1 H, dd, J - 14.0, 10.9 Hz, 8 a -H), 2.53 (2H, narr m, 6 a - and 6 /7-H), 2.86 (1 H, br dd, J = 14.0, 6.5 Hz, 8ß- H), 3.65 (1 H, ddd, J = 1 1 .4, 9.0, 3.9 Hz, 2 /7-H), 3.92 (1 H, ddd, J = 1 1.4, 4.9, 3.7 Hz, 2 a -H), 4.51 (1 H, t, J ~ 3 Hz, 5 a -H), 4.61 (1 H, m, w/2 = 22 Hz, 8a tf-H), 5.87 (1 H, m, w/2 = 10 Hz, 4-H); HRMS (ESI) masa exacta calculada para Ci5H2603S¡Na (M+ + Na) 305.1549, medida 305.1534. Etil éster de ácido [(1 R,3aS,7aR)-7a-Metil-1-[(R)-6-[(trietilsilil)-ox¡]-6-metilheptan-2-il]-octahidro-inden-(4jE )-iliden]acético (16): A una suspensión de NaH (49 mg, 2.04 mmoles) en THF anhidro (1 .2 mL) se agregan (EtO)2P(0)CH2COOEt (500 mi, 2.53 mmoles) a 0 grados C. La mezcla se agita a temperatura ambiente por 10 minutos y después se agrega cloruro de litio (13 mg, 0.30 mmol). La agitación se continua por 1 h, enfría a 0 grados C y una solución de la hidroxi cetona protegida 15 (100 mg, 0.25 mmol)
en THF (0.6 mL) se agrega. Después de agitar a temperatura ambiente por 70 h, la mezcla de reacción se diluye con etil acetato y vacía en cloruro de amonio saturado. La fase orgánica se separa, lava con salmuera, seca (Na2S04) y evapora. El residuo se separa por cromatografía instantánea. Elución con hexano/etil acetato (99:1 ) dió por resultado etil éster de ácido [(IR,3aS,7aR)-7a-metil-l-[(R)-6-[(trieti!silil)oxi]-6-metilheptan-2-il]-octahidro-inden-(4E)-ilideno]acét¡co aceitoso puro 16 (61 mg, 52%, 65% con base en el material de partida recuperado). Mayor elución con hexano/etil acetato (97:3) dió el substrato sin cambio 15 (20 mg). 16: H RMN (400 MHz, CDCI3) d 0.562 (6H, q, J = 7.9 Hz, 3 x SiCH2), 0.581 (3H, s, 7a-H3), ca. 0.94 (3H, superpuesto, CH3-CH), 0.944 (9H, t, J = 7.9 Hz, 3 x SiCH2CH3), 1.187 [6H, s, C(CH3)2], 1.284 (3H, t, J = 7.1 Hz, CH3CH20), 3.84 (1 H, m, 5ß-H), 4.15 (2H, m, CH3CH20), 5.45 (1 H, br s, =CH). 2-[(1 R,3aS,7aR)-7a-Metil-[(R)-6-[(thetilsilil)-oxi]-6-metilheptan-2-il]-octahidro-inden-(4E)-ilideno]etanol (17). Hidruro de diisobutilaluminio (1 M en tolueno, 200 ¿íL, 0.2 mmol) se agrega a una solución agitada de éster alílico (29 mg, 62 //moles) en tolueno anhidro (0.5 mL) a -78 grados C bajo argón. La mezcla se agita a -78 grados C por 1 h, y la reacción se neutraliza por adición de tartrato de sodio-potasio (2 N, 1 mL), HCI aq (2 N, 1 mL), y agua (12 mL). La mezcla se vacía en salmuera y extrae con etil acetato y éter. Los extractos combinados se lavaron con NaHC03 diluido y salmuera, secaron (Na2S04) y evaporaron. El residuo se redisolvió en hexano y aplicó a un Sep-Pak de gel de sílice, elución con hexano/etil acetato (95:5, 20 mL, y 9: 1 , 10 mL) dió el alcohol alílico 17 (23 mg, 87%) como un aceite incoloro. 17: 1H RMN (400 MHz, CDCI3) d 0.563 (6H, q, J = 7.9 Hz, 3 x SiCH2), 0.554 (3H, s, 7a-H3), 0.928 (3H, d, J = 7 Hz, CH3-CH), 0.945 (9H, t, J = 7.9 Hz, 3 x SiCH2CH5), 1.188 [6H, s, C(CH3)2], 2.63 (1H, dd, J = 12.0, 4.5 Hz, 5ß- H), 4.20 (2H, m;
después D20 d, J = 7.0 Hz, CH2OH), 5.22 (1 H, t, J = 7.0 Hz, =CH). (1 R,3aS,7aR)-4-[2-(Benzot¡azol-2-sulfonil)-(4E)-etiliden]-7a-metil-1 -[(R)-6-[(trietilsilil)oxi]-6-metil-heptan-2-il]-octahidro-indeno (12). A una solución de 2-mercaptobenzotriazol (1*2.5 mg, 75 emoles) y Ph3P (19.5 mg, 75 yumoles) en cloruro de metileno seco (150 /L) a 0 grados C, se agrega a una solución de alcohol alílico 17 (21 mg, 50 jumóles) en cloruro de metileno (150 µ?_) seguido por DIAD (14 µL·, 50 /vmoles). La mezcla se agita a 0 grados C por 1 h y los solventes se evaporan al vacío. El residuo se disuelve en etanol (300 mL), enfría a 0 grados C y H202 al 30% (30 µ?) se agrega, seguido por amonio (NH4)6Mo07024 X 4H20 (12.3 mg, 10 /umoles). La mezcla se agita a temperatura ambiente por 3 h, vacía en Na2S03 saturado frío y extrae con etil acetato. La capa orgánica se lava con salmuera, seca (Na2S04) y evapora. El residuo se disuelve en un pequeño volumen de benceno/hexano (1 :1 ) y aplica en un Sep-Pak de sílice. Elución con hexano/etil acetato (9: 1 , 20 mL y 85: 15, 20 mL) y remoción de los solventes dió un producto aceitoso (33 mg) que se disuelve en DMF anhidro (300 /vL). Imidazol (18 mg, 0.26 mmol) se agrega seguido por cloruro de trietilsililo (50 µ\., 0.29 mmol) y la mezcla se agita a temperatura ambiente por 3 h. Etil acetato se agrega y agua, y la capa orgánica se separa, lava con salmuera, seca (Na2S04) y evapora. El residuo se purifica por HPLC (columna Zorbax-Sil 10 mm x 25 cm, 4 mL/min) utilizando sistema solvente hexano/etil acetato (9:1 ). Sulfona analíticamente pura 12 (22.8 mg, 76%) se recolecta a Ry 24 mL. 12: 1H RMN (400 MHz, CDCI3) d 0.262 (3H, s, 7a-H3), 0.552 (6H, q, J = 7.9 Hz, 3 x 'SiCHz), 0.852 (3H, d, J = 6.2 Hz, CH5-CH), 0.935 (9H, t, J = 7.9 Hz, 3 x SiCH2CH5), 1.173 [6H, s, C(CH3)2], 2.55 (1 H, br d, J ~ 13 Hz, 5 7-H), 4.21 (1 H, dd, J -14.2, 6.9 Hz, cada uno de CH2S), 4.43 (1 H, dd, J - 14.2, 8.9 Hz, cada uno de CH2S), 5.02 (1 H, t, J - 7.8 Hz, =CH), 7.61 (2H, m, Ar-H), 8.00 y 8.22 (1 H y 1 H, cada uno de d, J = 8.0 Hz, Ar-H).
Análogos de 1 a ,25-Dihidroxi- y 3 ? ,25-dihidrox¡- 19-norvitamina D3 (13 y 14). A una solución de sulfona 12 (20.7 mg, 34 emoles) en THF seco (150 µ?) se agrega LiHMDS (1 M en THF, 32 µ?_, 32 //moles) a -78 grados C bajo argón. La solución viró a rojo intenso. La mezcla se agita a -78 grados C por 1 h y una solución de la cetona 1 1 (2.0 mg, 7.1 /vmoles) en THF (100 /L) se agrega. La agitación se continúa a -78 grados C por 2 h, y la mezcla de reacción se deja que caliente lentamente (por 4 h) a 0 grados C. Después de agitar por 30 minutos adicionales a 0 grados C se vacía en NH CI saturado y extrae con éter. El extracto se lava con salmuera, seca (Na2S04) y evapora. El residuo aceitoso amarillo se disuelve en hexano y aplica en un Sep-Pak de sílice. Elución con hexano/etil acetato (99.5:0.5, 10 mL y 99: 1 , 10 mL) y remoción de solventes proporciona el residuo aceitoso que contiene 19-norvitaminas sililadas (aproximadamente 0.5 mg). El residuo se disuelve en THF seco (200 µ?) que contiene Et3N (3 µ?) y trata con fluoruro de tetrabutilamonio (1.0 M en THF, 20 µ?, 20 emoles). La mezcla se agita bajo argón a temperatura ambiente por 17 h, vacía en salmuera, y extrae con etil acetato. Extracto orgánico se lava con salmuera, seca (Na2S0 ) y evapora. El residuo se purifica por HPLC (columna Zorbax-Sil 10 mm x 25 cm, 4 mL/min) utilizando sistema solvente hexano/2-propanol (9:1 ). 19-Norvitaminas 13 y 14 isoméricas (0.2 mg, 6%) se recolectan a Rv 35 mL y Rv 37 mL. Purificación final y separación de ambos isómeros se logra por HPLC de fase inversa (columna Zorbax-ODS 6.2 mm x 25 cm, 2 mL/min) utilizando sistema solvente metanol/agua (9:1 ). Análogo 1 a ,25-dihidroxi vitamina D 13 (120 ^g) se recolecta a Rv 22.5 mL y su isómero 14 (72 ^g) a Rv 17.5 mL. 13: UV (en EtOH) Amax 242.0, 251.0, 261 .5 nm; 1H RMN (500 MHz, CDCI3) d 0.548 (3H, s, 18-H3), 0.938 (3H, d, J = 6.2 Hz, 21-H3), 1.219 (6H, s, 26- y 27-H3), 2.69 (1 H, dd, J = 1 1.7, 6.3 Hz, 4« -H), 2.83 (1 H, br d, J ~ 10 Hz, 9/7-H), 3.05 (1 H, d, J = 14.5 Hz, 1 Oa-H??), 3.62 (1 H, dt, J - 10.5, 3.4 Hz, uno de CH2-CH2- O), 3.93 (1 H, m, w/2 = 22
Hz, uno de CH2-CH2-0), 4.30 (1H, m, w/2 = 25 Hz, 3a- H), 4.34 (1H, br s, 1 ß- ), 5.82 (1H, narrm, HC=C-CH2), 5.83 y 6.47 (1H y 1H, cada unod, J = 1 1.0 Hz, 7-y6-H); HRMS (ESI) masa exacta calculada para C29H4603Na (M+ + Na) 465.3345, medido 465.3346. 14: UV (en EtOH) Amax 242.5, 251.0, 261.0 nm; 1H RMN (500 MHz, CDCI3) d 0.551 (3H, s, 18-H3), 0.939 (3H, cL J = 6.2 Hz, 21-H3), 1.220 (6H, s, 26- y 27-H3), 2.42 y 2.47 (1H y 1H, cada uno d, J = 13.5 Hz, 4a-y4/?-H), 2.82 (1H, brd, J = 10.3 Hz, 9y9-H), 3.24 (1H, dd, J - 12.0, 5.6 Hz, 10^-H), 3.64 y 3.96 (1H y 1H, cada uno m, CH2-CH2-0), 4.29 (2H, m, 1 ß-? superpuesto con 3cr-H), 5.84 (1H, m, w/2 ~ 15 Hz, HC=C-CH2), 5.93 y 6.33 (1H y 1H, cada uno d, J = 10.5 Hz, 7- y 6-H); HRMS (ESI) masa exacta calculada para C29H4603Na (M+ + Na) 465.3346, medido 465.3350.
ESQUEMA I
(·)¦ ácido quínico Peiyododinano Dess-Martin CH,CI,
ESQUEMA II
ESQUEMA III
ACTIVIDAD BIOLÓGICA DE COMPUESTOS la ,25-DIHIDROXI (ANÁLOGO 13, REV-B) Y 3 ^,25-DIHIDROXI (ANÁLOGO 14, REV-A) 19-NOR VITAMINA D3 La introducción de un anillo heterocíclico que conecta el oxígeno 3 ß y el carbono-2 (análogo 13, REV-B) o el oxígeno 1 a y carbono-2 (análogo 14, REV-A) disminuye marcadamente el enlace al receptor de vitamina D de rata recombinante de longitud íntegra, en comparación con 1 a ,25 -dihidroxi vitamina D3. REV-B tuvo poca actividad de enlace para VDR, mientras que REV-A fue 3 órdenes de magnitud menos activo que 1 ,25-(OH)2 D3 (Figura 1 ). A pesar de deficiente actividad de enlace de receptor
in vitro, estos compuestos in vivo tuvieron significante actividad en huesos. De esta manera, REV-A y REV-B son análogos altamente selectivos con actividad biológica única. La Figura 4 demuestra que REV-A y REV-B tienen considerable actividad de movilización de calcio en huesos, en comparación con 1 ,25(OH)2D3, a la dosis probadas. La Figura 4 ilustra de esta manera que REV-A y REV-B pueden caracterizarse porque tienen actividad calcémica significante. Su actividad preferencial en actividad de movilización de calcio en huesos permite la administración in vivo de estos compuestos para el tratamiento y profilaxis de enfermedades metabólicas de huesos, Debido a su actividad preferencial en huesos, estos compuestos serán preferidos agentes terapéuticos para el tratamiento y profilaxis de enfermedades tales como osteoporosis, en especial osteoporosis de bajo recambio de huesos, osteoporosis inducida por esteroides, osteoporosis senil u osteoporosis post-menopáusica, así como osteomalacia y osteodistrofia renal. La Figura 2 ilustra que REV-A y REV-B son considerablemente menos activos que 1 ,25(OH)2D3 en diferenciación de células HL-60. La Figura 3 ilustra que el compuesto REV-A tiene mucho menos actividad de transcripción que l a ,25-dihidroxi vitamina D3 en células de huesos, mientras que el compuesto REV-B es inactivo en este ensayo. Parece posible que REV-A y REV-B puedan convertirse in vivo en las formas de ácido libre que poseen actividad en huesos. La actividad de REV-A y REV-B en diferenciación de HL-60 sugiere que sean activos para suprimir el crecimiento de glándulas paratiroides y en la supresión del gen preproparatiroide. Estos análogos que tienen actividad calcémica relativamente alta, también se espera útiles como una terapia para tratar hipoparatiroidismo ya que son efectivos para llevar niveles de calcio en sangre.
MÉTODOS EXPERIMENTALES Los compuestos de la invención se prepararon y estudiaron utilizando los siguientes métodos. Enlace de Receptor de Vitamina D Material de Prueba Fuente de Proteína Receptor de rata recombinante de longitud íntegra se expresa en células RIL Plus de Codón BL21 (DE3) de E. coli y purificado a homogeneidad utilizando dos sistemas de cromatografía en columna diferentes. El primer sistema fue una resina de afinidad de níquel que utiliza la etiqueta histidina C-terminal en esta proteína. La proteína que se eluye de esta resina fue además purificada utilizando cromatografía de intercambio de iones (S- Sepharose Fast Flow). Alícuotas de la proteína purificada se congelaron rápidamente en nitrógeno líquido y almacenaron a -80 grados C hasta utilizar. Para uso en ensayos de enlace, la proteína se diluye en TEDK50 (Tris 50 mM, EDTA 1 .5 mM, pH 7.4, DTT 5 mM, KCI 150 mM) con detergente Chaps al 0.1 %. La concentración de ligando y proteína de receptor se optimiza de manera tal que no más de 20% del ligando radio-etiquetado agregado se liga al receptor. Drogas de Estudio Ligandos no etiquetados se disolvieron en etanol y las concentraciones se determinaron utilizando espectrofotometría de UV (1 ,25(OH)2D3: coeficiente de extinción molar = 18,200 y Amax = 265 nm). Ligando radio-etiquetado (3H- 1 ,25(OH)2D3, -159 Ci/mmoles) se agrega en etanol a una concentración final de 1 nM. Condiciones de Ensayo Ligandos radio-etiquetados y sin etiquetar se agregan a 100 mcl de la proteína diluida a una concentración de etanol final de <10%, mezclan e incuban durante
la noche en hielo para alcanzar equilibrio de enlace. El día siguiente, 100 mcl de fango de hidroxilapatita (50%) se agrega a cada tubo y mezclan a intervalos de 10 minutos por 30 minutos. La hidroxilapaptita se recolecta por centrifugación y después se lava tres veces con amortiguador Tris-EDTA (Tris 50 mM, EDTA 1.5 mM, pH 7.4) que contiene Titron X-100 al 0.5%. Después del lavado final, los granulos se transfieren a ampolletas de destelleo que contienen 4 mi de cóctel de destelleo Biosafe II, mezclan y colocan en un contador de destelleo. Enlace total se determina de los tubos que contienen solo ligando radio-etiquetado. Diferenciación HL-60 Material de Prueba Drogas de Estudio Las drogas de estudio se disolvieron en etanol y las concentraciones se determinan utilizando espectrofotometría de UV. Diluciones en serie se preparan de manera tal que un intervalo de concentraciones de droga puede probarse sin cambiar la concentración final de etanol (<0.2%) presente en los cultivos celulares. Células Células de leucemia promielocítica humana (HL60) se desarrollan en medio RPMI-1640 que contiene suero bovino fetal al 10%. Las células se incubaron a 37 grados C en la presencia de C02 al 5%. Condiciones de Ensayo Células HL60 se revisten a 1.2 x 105 células/ml. Dieciocho horas después de revestir, se trataron las células en duplicado con droga. Cuatro días después, las células se recolectaron y se realizó un ensayo de reducción de nitro azul de tetrazolio (Collins et al., 1979; J. Exp. Med. 149:969-974). El por ciento de células diferenciadas se determina al contar un total de 200 células y registrar el número que contiene depósitos
de negro-azul de formazan intracelular. La verificación de diferenciación a células monocíticas se determina al medir actividad fagocítica (datos no mostrados). Ensayo de Transporte In Vivo La actividad de transcripción se midió en células ROS 17/2.8 (hueso) que se transfectaron en forma estable con un promotor de gen 24-hidroxilasa (240hasa) corriente arriba de un gen reportero luciferasa (Arbour et al., 1998). A las células se dió un intervalo de dosis. Dieciséis horas después de dosificar las células se recolectaron y se midieron las actividades de luciferasa utilizando un luminómetro. RLU - unidades de luciferasa relativas. El antagonismo se probó al agregar una combinación de 1 ,25(OH)2D3 y el compuesto en el mismo pozo manteniendo la concentración final de etanol igual. Movilización de Calcio en Hueso Primer Estudio In Vivo Ratones CD-1 hembra (6 semanas de edad) se adquirieron de Harían Sprague-Dawley. Al llegar, los animales se colocaron en una habitación con iluminación filtrada y se les alimenta con una dieta deficiente en D purificada (Suda et al 1970 J. Nutrition) por 17 semanas. Después de este momento, los ratones fueron asignados a 4 grupos (n=3/grupo), y se les dió una sola inyección intraperitoneal de vehículo (5% etanol:95% propilen glicol), 1 ,25(OH)2D3, REV-A o REV-B. Se recolectó sangre antes de administración de dosis y múltiples veces posteriormente. Calcio en suero se midió al diluir con cloruro de lantanio al 0.1 % y leer la absorbancia utilizando un espectómetro de absorción atómica. Se reporta el cambio en calcio en suero de valores pre-dosis (línea base). 2° Estudio In Vivo Ratones CD-I hembra de 6-7 semanas de edad se adquirieron de Harían
(Indianapo!is, IN). Los animales se alojaron en grupos y se les suministró una dieta purificada que contiene calcio al 0.47%. (Suda et al 1970 J. Nutrition). Después de un periodo de aclimatado de 5-7 días, los animales fueron asignados a grupos de tratamiento (n=5-6/grupo) y se les dió una sola dosis de los análogos designados por inyección intraperitoneal. Se recolecta sangre para análisis de concentración de calcio en suero, inmediatamente antes de administración de dosis y 72 horas después del suministro de dosis. Calcio en suero se analizó como se describió anteriormente. 3er Estudio In Vivo Ratones CD-I hembra de 6-7 semanas de edad se adquirieron de Harían (Indianapolis, IN). Los animales se alojaron en grupos y alimentaron con una dieta purificada que contiene 0.47% de calcio. (Suda et al 1970 J. Nutrition). Después de un periodo de aclimatación de 5-7 días, los animales fueron asignados a grupos de tratamiento (n=5/grupo) y se les dió una sola dosis de los análogos designados por inyección intraperitoneal o suministro oral. Se recolectó sangre para análisis de concentración de calcio en suero en diversos puntos en tiempo después de suministro de dosis. Calcio en suero se analizó como se describió anteriormente. Análisis Estadístico Datos in vivo se analizaron por ANOVA de una vía seguido por comparaciones en pares cuando se detectaron diferencias totales significantes. Análisis Post-hoc incluye pruebas de LSD de Tukey, Scheffe y Fisher. Solo diferencias (p<0.05) que estuvieron presentes en dos de las tres pruebas post-hoc se consideran significantes. INTERPRETACIÓN DE DATOS Enlace VDR, diferenciación de células HL60, y actividad de transcripción. REV-A (Ki=3.0xl0'8M) y REV-B (K,=M 0"5M) tienen mucho menor habilidad que la hormona natural \ a ,25-dihidroxivitamina D3 (KJ=S OXI O"1 1M) en su habilidad para competir con
[3H]- 1 ,25(OH)2D3 para enlace con el receptor de vitamina D de rata recombinante de longitud íntegra (Figura 1 ). Entre los derivados sintetizados de 19-nor-1 a ,25- (OH)2D3 REV-B y REV-A, que poseen un anillo dihidropirano adicional, solo este último tiene afinidad de enlace significante al receptor de vitamina D aunque disminuye más de quinientas veces en comparación con 1 ,25(OH)2D3 (Figura 1 ). REV-A (EC50= 1.0x10 7M) y REV-B (EC50= 1.0x10"6M) también son considerablemente menores en su capacidad por promover la diferenciación de HL60 en comparación con 1 a ,25- dihidroxivitamina D3 (EC5o=2.0x10"9M) (Ver Figura 2). Estudios en la capacidad de las vitaminas REV-B y REV-A para inducir diferenciación de células HL-60 de promielocitos humanos en monocitos muestra que su potencia se disminuye por tres y dos órdenes de magnitud, respectivamente en comparación con la hormona natural (Figura 2). También, el compuesto REV-A (EC50=3.0xl 0"8M) tiene mucho menor actividad de transcripción en células de hueso que 1 a ,25-dihidroxivitamina D3 (EC5o=2.0x10 10M) mientras que REV-B parece no tener actividad de transcripción esencial. (Ver Figura 3). De esta manera, REV-A tiene débil actividad de transcripción, indicada en el sistema de gen reportero luciferasa que desplaza el promotor 24-hidroxilasa (CYP-24), mientras que REV-B se ha encontrado completamente inactivo en este aspecto (Figura 3). Movilización de calcio de huesos en animales deficientes en vitamina D. Utilizando ratones deficientes en vitamina D en una dieta de bajo calcio (0.02%), se probaron las actividades de REV-A, REV-B y 1 ,25(OH)2D3 en huesos. Como se esperó, la hormona nativa (1 ,25(OH)2D3) aumentó los niveles de calcio en suero a la dosis probada (Figura 4). Tomando en cuenta los resultados in vitro anteriormente descritos, puede esperarse muy baja actividad calcémica o incluso completa carencia de actividad in vivo para los análogos sintetizados REV-B y REV-A. Sin embargo, estudios realizados con
estos compuestos in vivo en ratones deficientes D en dosis que exceden treinta veces la de la hormona natural, muestran que estos compuestos tienen respuesta calcémica similar después de 24 h ya que calcitriol e isómero REV-B fue marcadamente más activos 48 horas después de la dosis administrada (Figura 4). Un segundo estudio realizado en ratones CD-I suficiente en D de nuevo mostró la actividad in vivo notable de REV-B para elevar los niveles de calcio en sangre (Figura 5). Sin embargo, no se detectó aumento significante en calcio en suero con REV-A, que es consistente con el estudio de ratones deficientes en D ya que el aumento aparente en calcio en suero después de administración de REV-A no resulta ser estadísticamente significante dada la variación y los pocos animales por grupo (n=3). De manera interesante, el análogo que tiene la menor cantidad de actividad in vitro (forma de silla a - REV-B), tiene la mayor actividad in vivo y además, su potencia in vivo es similar a la de la hormona nativa. El último experimento realizado con REV-B se muestra en la Figura 6. Este estudio de nuevo se realiza en ratones CD-I suficientes en D. Dos rutas de administración diferentes (suministro oral contra inyección intraperitoneal) se estudiaron. Ambas rutas de administración son efectivas para provocar un aumento en calcio en suero; sin embargo, la inyección intraperitoneal es más efectiva que el suministro oral. Esta observación es similar a la de la hormona nativa. También habrá de notarse que como en los animales deficientes en D, hay un retraso significante en comparación con 1 ,25(OH)2D3 para un aumento observado en calcio en suero que ocurra cuando los animales se les da REV-B. Se puede sugerir que en el organismo vivo ambos análogos pueden someterse a algunos cambios metabólicos, posible escisión de los anillos de dihidropirano, que resultan en un compuesto sin o muy baja actividad biológica y el otro con actividad in vivo pronunciada que tarda más en manifestarse cuando se compara con la hormona nativa. Si la escisión o ruptura de anillo es la conversión metabólica que se lleva a cabo, no es difícil
comprender porque REV-B es mucho más activo que REV-A in vivo en comparación con la situación in vitro como REV-A no tendría un grupo 1 -hidroxi que se sabe es muy importante para enlace VDR. Adicionales estudios se requieren para demostrar que la abertura de anillo es la explicación para los resultados diferentes obtenidos in vivo contra in vitro. Discusión El equilibrio de conformación del anillo ciclohexano A de compuestos de vitamina D y su influencia en actividad biológica se han estudiado por más de tres décadas. En 1974, Okamura teorizó que la forma de silla ß , que posee un 1 a -hidroxilo ecuatorial, es responsable por las actividades biológicas de los análogos de vitamina D. Nuestros primeros estudios en 1 a ,25 -dihidroxi-10,19-dihidro vitamina D3 parecen contradecir esta sugerencia. Entonces, los resultados de pruebas biológicas y análisis de conformación de análogos 2-metil substituidos de la hormona, sintetizados por científicos japoneses, y sus contra-partes 19-nor obtenidos en nuestro laboratorio, nos indicaron en sugerir una orientación axial de 1 a -OH puede ser de importancia crucial para ejercer actividad calcémica. Se encontró que vitaminas 2 -alquiladas, caracterizadas por fuertes sesgo (sobre 90%) hacia confórmeros con el hidroxilo axial en C-1 , son mucho más biológicamente potentes que sus 2 ?-¡sómeros respectivos que existen en solución primordialmente en la forma de silla ß opuesta. Posteriormente, sin embargo el grupo Moras reportó la estructura de cristal del dominio de enlace de ligando hVDR (LBD) en complejo con calcitriol y varios otros ligandos caracterizados por una configuración no natural en C-20. Todos estos resultados claramente indican que el receptor liga (al menos en un estado cristalino) compuestos de vitamina D que tienen sus anillos A en la conformación de silla ß . Aún más convincente fue el reciente reporte de nuestro laboratorio, en donde Vanhooke describió la estructura de cristal de la VDR LBD de rata
en complejo con el análogo de vitamina D3 2a -metil-substituido, que posee biopotencia altamente elevada tanto en intestino como en huesos. El estudio muestra que este compuesto de vitamina D también adopta la conformación de anillo A de silla ß en su complejo cristalino con VDR. Sin embargo, en todos estos casos, la interconversión entre los conformadores de silla de anillo A de ligando no fue prohibida, y por lo tanto pudieron surgir algunas dudas que forman el complejo ligando-VDR actualmente existe en el ambiente fisiológico real. De esta manera, fue tentador el sinterizar y evaluar biológicamente un compuesto de vitamina D que posee un grupo hidroxilo axialmente orientado en C-1 es incapaz de cambiar su conformación de anillo A. El análogo 1 a ,25-dihidroxivitamina D3 REV-B, descrito en el presente trabajo, cumple con estos requerimientos. Se estableció que esta vitamina D no liga al VDR y carece de la actividad en diferenciación celular y para inducir transcripción de un gen de respuesta de vitamina D. En forma notable, su isómero REV-A posee grupos 3ß- y 25-hidroxilo libres, pero caracterizado por una conformación de silla ß de anillo A "congelada", se encontró de aproximadamente 560 veces menos potente el enlace al receptor que la hormona. Esta habilidad de enlace puede esperarse para el derivado 25-OH-D3 en donde la función 1 a -oxígeno no puede actuar como un donador de hidrógeno y crear los enlaces de hidrógeno con los aminoácidos de LBD. Los resultados biológicos obtenidos in vitro en los análogos sintetizados REV-B y REV-A claramente confirman que la conformación de silla ß de anillo A y consecuentemente la orientación ecuatorial para el 1 a -OH es necesario para el compuesto de vitamina D para asegurar su enlace con VDR y ejercer actividad biológica. La evaluación biológica de las vitaminas de prueba in vivo, no genera resultados consistentes con aquellos obtenidos in vitro, muy probablemente debido a la transformación metabólica de ambos compuestos que ocurre en los organismos vivos. Conclusiones
Las conformaciones de los anillos A de vitaminas REV-B y REV-A, así como las estructuras de compuestos intermedios utilizados para la construcción de sus partes de anillo A, se establecieron por métodos espectroscópicos de RMN. En análisis de las constantes de acoplamiento de protón vecinal observadas demostraron que en los análogos de vitamina D sintetizados REV-B y REV-A, que poseen un anillo dihidropirano adicional, sus anillos A solo pueden existir en una sola conformación, silla a - y ß , respectivamente. Pruebas in vitro biológicas de los análogos REV-B y REV-A nos permitieron concluir que la presencia de un hidroxilo libre ecuatorialmente orientado en C-1 es necesaria para ligar al receptor de vitamina D. De esta manera, solo la vitamina D que puede adquirir una conformación de anillo A de silla ß puede aceptarse por el VDR además induciendo cambios en conformación cruciales para la activación de receptor-ligando. Estos resultados ilustran que REV-A y REV-B son excelentes candidatos para numerosas terapias en humanos como se describe aquí, y que pueden ser particularmente útiles en una cantidad de circunstancias tales como la supresión de hiperparatiroidismo secundario de osteodistrofia renal. El hecho de que REV-A y REV-B in vivo tienen impresionante actividad en huesos sugiere que serán útiles para tratar enfermedades metabólicas de huesos, especialmente osteodistrofia renal, osteoporosis, osteopenia, raquitismo resistente a vitamina D, y osteomalacia. Los compuestos de la invención de la fórmula I y II también son útiles para evitar o tratar obesidad, inhibiendo diferenciación de adipocitos, inhibiendo transcripción de gen SCD-1 , y/o reduciendo grasa corporal en sujetos animales. Por lo tanto, en algunas modalidades, un método para evitar o tratar obesidad, inhibir diferenciación de adipocitos, inhibir transcripción de gen SCD-1 , y/o reducir grasa corporal en un sujeto animal, incluye administrar al sujeto animal, una cantidad efectiva de uno o más de los
compuestos o una composición farmacéutica que incluye uno o más de los compuestos de la fórmula I y/o II. La administración del compuesto o las composiciones farmacéuticas al sujeto inhiben la diferenciación de adipocitos, inhibe la transcripción de genes, y/o reducen la grasa corporal en el sujeto animal. El animal puede ser un humano, un animal doméstico tal como un perro o gato, o un animal agrícola, en especial aquellos que proporcionan carne para consumo humano, tales como aves como gallinas, pavos, faisanes o codornices, así como animales bovinos, ovinos, caprinos o porcinos. Para propósitos de prevención y/o tratamiento, los compuestos de esta invención definidos por la fórmula I y II pueden formularse para aplicaciones farmacéuticas como una solución en solventes inocuos, o como una emulsión, suspensión o dispersión en solventes o portadores convenientes, o como pildoras, tabletas o cápsulas, junto con portadores sólidos, de acuerdo con métodos convencionales conocidos en la técnica. Cualesquiera de estas formulaciones también pueden contener otros excipientes farmacéuticamente aceptables y no tóxicos tales como estabilizantes, anti-oxidantes, aglutinantes, agentes colorantes o agentes emulsificantes o que modifican el gusto. Los compuestos de las fórmulas I y II pueden administrarse en forma oral, tópica, parenteral, rectal, nasal, sublingual o transdérmica. El compuesto se administra ventajosamente por inyección o por infusión intravenosa o soluciones estériles convenientes, o en la forma de dosis líquidas o sólidas o el canal alimentario o en la forma de cremas, ungüentos, parches o vehículos similares, adecuados para aplicaciones transdérmicas. Una dosis desde 0.01 µg a 10 mg por día de los compuestos I o II, de preferencia aproximadamente 0.1 a aproximadamente I mg por día, es apropiada para propósitos de prevención y/o tratamiento, esta dosis se ajusta de acuerdo con la enfermedad a tratar, su severidad y la respuesta del sujeto, como se comprende bien en
la técnica. Ya que los compuestos exhiben especificidad de acción, cada uno puede ser administrado convenientemente solo o junto con dosis graduadas de otro compuesto de vitamina D activo — por ejemplo 1 a -hidroxivitamina D2 o D3, o I a ,25- dihidroxivitamina D3 - en situaciones en donde se encuentran ventajosos grados diferentes de movilización de minerales en huesos y estímulo de transporte de calcio. Composiciones para uso en los tratamientos anteriormente mencionados, comprenden una cantidad efectiva de los compuestos I o II como se define por las fórmulas anteriores I y II como el ingrediente activo, y un portador conveniente. Una cantidad efectiva de este compuesto para utilizar de acuerdo con esta invención es de aproximadamente 0.01 /g a aproximadamente 10 mg por gm de composición, de preferencia de aproximadamente 0.1 jug a aproximadamente 1 mg por gramo de composición, y puede administrarse en forma tópica, transdérmica, oral, rectal, nasal, sublingual o parenteral en dosis desde aproximadamente 0.01 /vg/día a aproximadamente 10 mg/día, y de preferencia de aproximadamente 0.1 ¿/g/día a aproximadamente 1 mg/día. Los compuestos I y II pueden formularse como cremas, lociones, ungüentos, parches tópicos, pildoras, cápsulas o tabletas, supositorios, aerosoles o en forma líquida como soluciones, emulsiones, dispersiones o suspensiones en solventes o aceites farmacéuticamente inocuos y aceptables, y estas preparaciones pueden contener además otros componentes benéficos o inocuos farmacéuticos, tales como estabilizantes, antioxidantes, emulsificantes, agentes colorantes, aglutinantes o agentes que modifican el gusto. Los compuestos I y II pueden administrarse ventajosamente en cantidades suficientes para efectuar la diferenciación de promielocitos a macrófagos normales. Dosis como se describe anteriormente son convenientes, entendiéndose que las cantidades dadas son para ajustarse de acuerdo con la severidad de la enfermedad, y la condición y
respuesta del sujeto como se comprende bien en la técnica. Las formulaciones de la presente invención comprenden un ingrediente activo en asociación con un portador farmacéuticamente aceptable del mismo, y opcionalmente otros ingredientes terapéuticos. El portador debe ser "aceptable" en el sentido de ser compatible con los otros ingredientes de las formulaciones y no ser nocivo a su recipiente. Formulaciones de la presente invención adecuadas para administración oral pueden estar en la forma de unidades discretas como cápsulas, saquitos, tabletas o pastillas, cada una que contiene una cantidad predeterminada del ingrediente activo; en la forma de un polvo o gránulos; en la forma de una solución o una suspensión en un líquido acuoso o líquido no acuoso; o en la forma de una emulsión de aceite-en-agua o una emulsión de agua-en-aceite. Formulaciones para administración rectal pueden estar en la forma de un supositorio que incorpora el ingrediente activo y portador tal como manteca de cacao, o en la forma de un enema. Formulaciones adecuadas para administración parenteral convenientemente comprenden una preparación acuosa o aceitosa estéril del ingrediente activo, que de preferencia es isotónica con la sangre del recipiente. Formulaciones adecuadas para administración tópica incluyen preparaciones líquidas o semilíquidas tales como linimentos, lociones, agentes de aplicación, emulsiones de aceite-en-agua o agua-en-aceite tales como cremas, ungüentos o pastas; o soluciones o suspensiones tales como gotas; o como rocíos. Para formulaciones de administración nasal, inhalación de polvo, autopropulsoras o de rocío, el surtido con una lata de rocío, un nebulizador o un atomizador puede emplearse. Las formulaciones cuando se surten, de preferencia tienen
un tamaño de partículas en un intervalo de 10 a 100 µ. Las formulaciones pueden presentarse convenientemente en forma de dosis unitaria y pueden prepararse por cualquiera de los métodos bien conocidos en la técnica de farmacia. Por el término "unidad de dosis" se entiende una dosis unitaria, por ejemplo sencilla, que es capaz de ser administrada a un paciente como una dosis unitaria física y químicamente estable que comprende ya sea el ingrediente activo como tal o una mezcla de el con diluyentes o portadores farmacéuticos sólidos o líquidos.