MX2008006005A - Propiedades inmunoestimuladoras de compuestos a base de oligonucleotidos que comprenden dinucleotidos inmunoestimuladores modificados. - Google Patents

Abstract

La invención se refiere al uso terapéutico de oligonucleótidos como agentes inmunoestimuladores en aplicaciones de inmunoterapia; más particularmente, la invención provee oligonucleótidos inmunoestimuladores para su uso en métodos para generar una respuesta inmune o para tratar a un paciente en necesidad de inmunoestimulación; los oligonucleótidos inmunoestimuladores de la invención comprenden preferiblemente purinas novedosas; los oligonucleótidos inmunoestimuladores de acuerdo con la invención comprenden además por lo menos dos oligonucleótidos enlazados en sus extremos 3', enlaces de internucléosidos o nucleobase funcionalizada o azúcar a un enlazador no nucleótidico, por lo menos uno de los oligonucleótidos siendo un oligonucleótido inmunoestimulador y que tiene un extremo 5' accesible.

Description

PROPIEDADES INMUNOESTIMULADORAS DE COMPUESTOS A BASE DE OLIGONUCLEOTIDOS QUE COMPRENDEN DINUCLEOTIDOS INMUNOESTIMULADORES MODIFICADOS ANTECEDENTES DE LA INVENCION CAMPO DE LA INVENCION La invención se relaciona con inmunología y aplicaciones de inmunoterapia utilizando oligonucleótidos como agentes inmunoestimuladores.

BREVE DESCRIPCION DE LA TECNICA RELACIONADA Los oligonucleótidos se han vuelto herramientas indispensables en la biología molecular moderna, se utilizan en una amplia variedad de técnicas que varían desde métodos de sondeo diagnóstico hasta PCR para inhibición antisentido de la expresión de genes y aplicaciones en inmunoterapia. Este uso ampliamente diseminado de los oligonucleótidos ha generado una demanda cada vez mayor por métodos rápidos, baratos y eficaces para la síntesis de oligonucleótidos. La síntesis de oligonucleótidos para aplicaciones antisentido y de diagnóstico ahora se puede llevar a cabo de manera sistemática. Véase, por ejemplo Methods in Molecular Biology, Vol. 20: Protocols for Oligonucleotides and Analogs pp. 165-189 (S. Agrawal, ed., Humana Press, 1993); Oligonucleotides and Analogues, A Practical Approach, pp. 87-108 (F. Eckstein, ed., 1991 ); y Uhlmann and Peyman, supra; Agrawal and lyer, Curr. Op. in Biotech. 6:12 (1995); y Antisense Research and Applications (Crooke and Lebleu, eds., CRC Press, Boca Ratón, 1993). Los enfoques de síntesis tempranos incluyen la química fosfodiéster y fosfotriester. Por ejemplo, Khorana et al., J. Molec. Biol. 72:209 (1972) describe la química fosfodiéster para la síntesis de oligonucleótidos. Reese, Tetrahedron Lett. 34:3143-3179 (1978), describe la química fosfotriéster para la síntesis de oligonucleótidos y polinucleótidos. Estos enfoques tempranos durante mucho tiempo han fructificado en los enfoques para la síntesis más eficaz de fosforamidita y H-fosfonato. Por ejemplo, Beaucage y Caruthers, Tetrahedron Lett. 22:1859-1 862 (1981 ), describen el uso de fosforoamiditas de desoxirribonucleósido en la síntesis de polinucleótidos. Agrawal y Zamecnik, patente de E.U.A. No. 5,149,798 (1992), describe síntesis optimizada de oligonucleótidos por el enfoque H-fosfonato. Ambos de estos enfoques modernos se han utilizado para sintetizar oligonucleótidos que tienen una diversidad de enlaces internucleotídicos modificados. Agrawal y Goodchild, Tetrahedron Lett. 28:3539-3542 (1987), describe la síntesis de metilfosfonatos oligonucleotídicos utilizando química de fosforoamidita. Connolly et al., Biochem. 23:3443 (1984), describe la síntesis de fosforotioatos oligonucleotídicos utilizando la química de fosforoamidita. Jager et al., Biochem. 27:7237 (1988), describe la síntesis de fosforamidatos oligonucleotídicos utilizando la química de fosforamidita. Agrawal et al., Proc. Nati. Acad. Sci. (EUA) 85:7079-7083 (1988), describe la síntesis de fosforamidatos oligonucleotídicos y fosforotioatos utilizando la química de H-fosfonato. Más recientemente varios investigadores han demostrado la validez del uso de oligonucleótidos como agentes inmunoestimuladores en aplicaciones de inmunoterapia. La observación de que los oligonucleótidos fosfodiéter y fosforotioato pueden inducir estimulación inmunitaria ha generado interés en desarrollar este efecto secundario como una herramienta terapéutica. Estos esfuerzos se han enfocado en oligonucleótidos de fosforotioato que contienen el dinucleotido natural CpG. Kuramoto et al., Jpn. J. Cáncer Res. 83:1 128-1 131 (1992) describen que los oligonucleótidos fosfodiéster que contienen un palíndromo que incluye un dinucleotido CpG pueden inducir síntesis de interferón a y ? e incrementar la actividad citolítica natural. Krieg et al., Nature 371 :546-549 (1995) describe que los oligonucleótidos que contienen CpG fosforotioato son inmunoestimuladores. Liang et al., J. Clin. Invest. 98:1 1 19-1 129 (1996) describe que dichos oligonucleótidos activan linfocitos B humanos. Moldoveanu et al., Vaccine 16:1216-124 (1998) describe que los oligonucleótidos de fosforotioato que contienen CpG incrementan la respuesta inmunitaria contra el virus de la influenza. McCIuskie y Davis, J. Immunol. 161 :4463-4466 (1998) describen que los oligonucleótidos que contienen CpG actúan como adyuvantes potentes, incrementando la respuesta inmunitaria contra el antígeno de superficie de hepatitis B. Hartman et al., J. Immunol 164: 1617-1624 (2000) describen que la secuencia inmunoestinnuladora es específica de especie y diferente entre ratones y primates. Otras modificaciones de oligonucleótidos de fosforotioato que contienen CpG también pueden afectar su capacidad para actuar como moduladores de la respuesta inmunitaria. Véase, por ejemplo Zhao et al., Biochem. Pharmacol. (1996) 51 :173-182; Zhao et al., Biochem Pharmacol. (1996) 52:1537-1544; Zhao et al., Antisense Nucleic Acid Drug Dev. (1997) 7:495-502; Zhao et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. (1999) 9:3453-3458; Zhao et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. (2000) 10:1051 -1054; Yu et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. (2000) 10:2585-2588; Yu et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. (2001 ) 1 1 :2263-2267; y Kandimalla et al., Bioorg. Med. Chem. (2001 ) 9:807-813. Estos reportes dejan claro que aún permanece la necesidad de poder modular la respuesta inmunitaria causada por oligonucleótidos inmunoestimuladores y superar la especificidad de especies de otras secuencias ¡nmunoestimuladoras.

BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCION La invención proporciona métodos para modular la respuesta inmunitaria causada por compuestos oligonucleotídicos. Los métodos de acuerdo con la invención permiten modificar el perfil de citocinas producido por oligonucleótidos inmunoestimuladores para aplicaciones inmunoterapia.

Los presentes inventores han descubierto sorprendentemente que la modificación de dinucleótidos inmunoestimuladores permite flexibilidad en la naturaleza de la respuesta inmunitaria producida y que ciertas modificaciones superan las especificidades de especies observadas hasta ahora de las secuencias inmunoestimuladoras. En un primer aspecto la invención proporciona un oligonucleótido inmunoestimulador que tiene una estructura del grupo de 5'-TCG!AACGiTTCGi-X-GiCTTGiCAAdCT-5'; 5'-TCAGTCG2TTAG-X-GATTG2CTGACT-5'; 5'-TCG2TCG2TTAGA-X-AGATTG2CTG2CT-5; 5'-CAGTCG2TTCAG-X-GACTTG2CTGAC-5'; 5 -TCAGTCG ^ TTAG-X- GATTGiCTGACT-5'; S'-TCGiTCdTTAGA-X-AGATTG^TdCT-S' y 5-CAGTCG iTTCAG-X-G ACTTG iCTGAC-5'; en donde = 2'-desoxi-7-desazaguanosina; G2 = arabinoguanosina; y X = enlazante glicerol. En un segundo aspecto, la invención proporciona composiciones farmacéuticas. Estas composiciones comprenden cualquiera de las composiciones descritas en el primer aspecto de la invención y un portador farmacéuticamente aceptable. En un tercer aspecto, la invención proporciona un método para generar una respuesta inmunitaria en un vertebrado, el método comprende administrar al vertebrado un oligonucleótido inmunoestimulador que tiene una estructura del grupo 5'-TCG 1 AACG 1 TTCG 1 -X-G , CTTG 1 C AAG -\ CT-5' ; 5'-TCAGTCG2TTAG-X-GATTG2CTGACT-5'; 5'-TCG2TCG2TTAGA-X-AGATTG2CTG2CT-5¡ S'-CAGTCGsTTCAG-X-GACTTGzCTGAC-S'; 5'- TCAGTCGiTTAG-X-GATTGiCTGACT-5*; 5'-TCG TCGiTTAGA-X-AGATTdCTGiCT-5' y 5-CAGTCGiTTCAG-X-GACTTGiCTGAC-5'; en donde G-i = 2'-desox¡-7-desazaguanos¡na; G2 = arabinoguanosina; y X = enlazante glicerol. En un cuarto aspecto, la invención proporciona un método para tratar terapéuticamente a un vertebrado que tiene cáncer, un trastorno autoinmune, inflamación de las vías respiratorias, trastornos inflamatorios, trastorno cutáneos, alergia, asma o una enfermedad causada por un patógeno, dicho método comprende administrar al paciente un oligonucleotido inmunoestimulador que tiene una estructura del grupo S'-TCGÍAACG ITTCG T X-dCTTdCAAG!CT-5*; 5·-?????062????-?-?????2??????-5·; 5*-TCG2TCG2TTAGA-X-AGATTG2CTG2CT-5; 5'-CAGTCG2TTCAG-X-GACTTG2CTGAC-5'; 5'-TCAGTCGiTTAG-X-GATTGiCTGACT-5'; 5'-TCG 1 TCG i TTAG A-X-AG ATTG 1 CTG 1 CT-5' y 5-CAGTCGiTTCAG-X-GACTTGiCTGAC-5'; en donde G-\ = 2'-desoxi-7-desazaguanosina; G2 = arabinoguanosina; y X = enlazante glicerol. En un quinto aspecto, la invención proporciona un método para evitar cáncer, un trastorno autoinmune, inflamación de las vías respiratorias, trastornos inflamatorios, trastornos cutáneos, alergia, asma o una enfermedad causada por un patógeno en un vertebrado, dicho método comprende administrar al vertebrado un oligonucleotido inmunoestimulador que tiene una estructura del grupo de 5'-TCG i AACG TTCG -X-G 1 CTTG ^ CAAG -i CT-5' ; 5'-TCAGTCG2TTAG-X-GATTG2CTGACT-5'; 5'-TCG2TCG2TTAGA-X- AGATTG2CTG2CT-5; 5 AGTCG2TTCAG-X-GACTTG2CTGAC-5'; 5'-TCAGTCGiTTAG-X-GATTGiCTGACT-5'; S'-TCdTCG^AGA-X-AGATTG!CTdCT-5' y 5-CAGTCG 1TTCAG-X-GACTTG 1 CTG AC-5'; en donde Gi = 2'-desoxi-7-desazaguanosina; G2 = arabinoguanosina; y X = enlazante glicerol.

BREVE DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS La figura 1 es un esquema de síntesis para la síntesis lineal de oligonucleotidos inmunoestimuladores de la invención. DMTr = 4,4'-dimetoxitritilo; CE = cianoetilo. La figura 2 es un esquema de síntesis para la síntesis en paralelo de oligonucleotidos inmunoestimuladores de la invención. DMTr = 4,4'-dimetoxitritilo; CE = cianoetilo. La figura 3 muestra la activación de TLR9 por oligonucleotidos inmunoestimuladores de la invención en células HEK293. La figura 4 muestra inducción de IFN-a en cultivos de pDC humanos por oligonucleotidos inmunoestimuladores de la invención. La figura 5 muestra la inducción de IL-6 en PBMC humanos por oligonucleotidos inmunoestimuladores de la invención. La figura 6 muestra la proliferación de linfocitos B humanos (72 h) por oligonucleotidos inmunoestimuladores de la invención. La figura 7 muestra la inducción de IL-12 en cultivo de célula de bazo de ratón C57BL/6 por oligonucleótidos inmunoestimuladores de la invención. La figura 8 muestra la inducción por IL-6 en cultivos de células de bazo de ratón C57BL/6 por oligonucleótidos inmunoestimuladores de la invención. La figura 9 es una representación esquemática del nucleósido 3'-terminal de un oligonucleotido que muestra que un enlace no nucleotídico se puede unir a un nucleósido en la nucleobase, en la posición 3' o en la posición 2'.

DESCRIPCION DETALLADA DE LAS MODALIDADES PREFERIDAS La invención se relaciona con el uso terapéutico de oligonucleótidos como agentes inmunoestimuladores para aplicaciones de inmunoterapia. Las patentes, solicitudes de patentes y referencias descritas que se mencionan en la presente se incorporan en este documento como referencia en la misma medida así cada una fuera indicada específica e individualmente como incorporada como referencia. En caso de inconsistencias entre cualquier enseñanza de cualquier referencia mencionada en la presente y esta especificación, esta última prevalecerá, para los propósitos de la invención. La invención proporciona métodos para mejorar la respuesta inmunitaria provocada por compuestos inmunoestimuladores utilizados para aplicaciones de inmunoterapia tales como, pero sin limitarse a tratamiento de cáncer, trastornos autoinmunes, asma, alergias respiratorias, alergias a alimentos e infecciones por bacterias, parásitos o virus en un adulto y un humano pediátrico y en aplicaciones veterinarias. Por lo tanto, la invención proporciona adicionalmente compuestos que tiene niveles óptimos de efecto inmunoestimulador para inmunoterapia y métodos para elaborar y utilizar dichos compuestos. Además, los compuestos de la invención son útiles como adyuvantes en combinación con vacunas de ADN, anticuerpos y alérgenos; y en combinación con agentes quimioterapéuticos y/u oiigonucleótidos antisentido. Los presentes inventores han descubierto sorprendentemente que una modificación de un oligonucleótido inmunoestimulador para presentar de manera óptima sus extremos 5' afectan perceptiblemente sus capacidades inmunoestimuladoras. Además, los presentes inventores han descubierto que el perfil de citocina y la especificidad de especies de una respuesta inmunitaria se puede modular mediante la utilización de las estructuras de purina o pirimidina novedosas como parte de un oligonucleótido inmunoestimulador. En un primer aspecto, la invención proporciona oiigonucleótidos inmunoestimuladores solos o que comprenden por lo menos dos oiigonucleótidos unidos en sus extremos 3' o un enlace internucleosídico o una nucleobase funcionalizada o azúcar a un enlazante no nucleotídico, por lo menos uno de los oiigonucleótidos es un oligonucleótido inmunoestimulador y tiene un extremo 5' accesible. Como se utiliza en la presente, el término "extremo 5' accesible" significa que el extremo 5' del oligonucleotido está disponible lo suficiente de manera que factores que reconocen y se unen al oligonucleotido y estimulan al sistema inmunitario tienen acceso al mismo. En oligonucleótidos que tienen un extremo 5' accesible, la posición 5' OH del azúcar terminal no está unida covalentemente a más de dos residuos nucleosídicos o cualquier otra porción que interfiere con la interacción con el extremo 5'. Opcionalmente, el 5' OH se puede unir a un fosfato, fosforotioato o una porción fosforad itioato, un enlazante aromático o alifático, colesterol u otra entidad la cual no interfiera con su accesibilidad. Los oligonucleótidos inmunoestimuladores de acuerdo con la invención preferiblemente comprenden además un dinucleótido inmunoestimulador que comprende una purina o pirimidina novedosa. En algunas modalidades, los oligonucleótidos inmunoestimuladores incluyen una ribozima o un oligonucleotido señuelo. Como se utiliza en la presente, el término "ribozima" se refiere a un oligonucleotido que posee actividad catalítica. Preferiblemente, la ribozima se une a un objetivo de ácido nucleico específico y separa el objetivo. Como se utiliza en la presente, el término "oligonucleotido señuelo" se refiere a un oligonucleotido que se une a un factor de transcripción de una manera específica de secuencia y suprime la actividad de transcripción. Preferiblemente, la ribozima u oligonucléotido señuelo muestra estructura secundaria que incluye, sin limitación, estructuras de tallo-bucle u horquilla. En algunas modalidades, por lo menos un oligonucleótido comprende poli(l)-pol¡ . En algunas modalidades, por lo menos un conjunto de Nn incluye una cadena de 3 a 10 dGs y/o Gs o Gs ribo o arabino 2'-sustituido. Para propósitos de la invención, el término "oligonucleótido" se refieren a un polinucleósido a partir de una pluralidad de unidades nucleosídicas unidas. Dichos oligonucleótidos se pueden obtener a partir de fuentes de ácido nucleico existentes que incluyen genómico o ADNc pero preferiblemente se producen por métodos sintéticos. En modalidades preferidas, cada unidad nucleosídica incluye una base heterocíclica y pentofuranosilo, trehalosa, arabinosa, arabinosa 2'-desoxi-2'-sustituido, arabinosa 2'-O-sustituido o un grupo de azúcar exosa. Los residuos nucleosidos se pueden acoplar entre sí por cualquiera de numerosos enlaces internucleosídicos conocidos. Dichos enlaces internucleosídicos incluyen, sin limitación, fosfodiéster, fosforotioato, fosforoditioato, alquilfosfonato, alquilfosfonotioato, fosfotriéster, fosforoamidato, siloxano, carbonato, carboalcoxi, acetamidato, carbamato, morfolino, borano, tioéter, fosforoamidato puenteado, fosfonato metileno puenteado, fosforotioato puenteado y enlaces internucleosídicos sulfona. El término "oligonucleótido" también abarca polinucleósidos que tienen uno o más enlaces internucleosídicos estereoespecíficos (por ejemplo {Rp)- o (Sp)-fosforotioato, alquilfosfonato o enlaces fosfotriéster). Como se utiliza en la presente, los términos "oligonucleótidos" y "dinucleótidos" se diseñan expresamente para incluir polinucleósidos y dinucleósidos que tienen cualquier enlace intemucleosídico, ya sea que el enlace comprenda o no un grupo fosfato. En algunas modalidades preferidas, estos enlaces internucleosídicos pueden ser fosfodiéster, fosforotioato o enlaces fosforoditioato o combinaciones de los mismos. En algunas modalidades, cada uno de los oligonucleótidos tiene de aproximadamente 3 a aproximadamente 35 residuos nucleosídicos, preferiblemente de aproximadamente 4 a aproximadamente 30 residuos nucleosídicos, de manera más preferible de aproximadamente 4 a aproximadamente 20 residuos nucleosídicos. En algunas modalidades, los oligonucleótidos inmunoestimuladores comprenden oligonucleótidos que tienen de aproximadamente 5 a aproximadamente 18, o de aproximadamente 5 a aproximadamente 14 residuos nucleosídicos. Como se utiliza en la presente, el término "aproximadamente" implica que el número exacto no es crítico. De esta manera, el número de residuos nucleosídicos en los oligonucleótidos no es crítico y se contemplan oligonucleótidos que tengan uno o dos residuos nucleosídicos menos o de uno a varios residuos nucleosídicos adicionales, como equivalentes de cada una de las modalidades descritas en lo anterior. En algunas modalidades, uno o más de los oligonucleótidos tienen 11 nucleotidos. En el contexto de los oligonucleótidos inmunoestimuladores, las modalidades preferidas tienen de aproximadamente 13 a aproximadamente 35 nucleotidos, de manera más preferible, de aproximadamente 13 a aproximadamente 26 nucleotidos. El término "oligonucleótido" también abarca polinucleósidos que tienen sustituyentes adicionales que incluyen, sin limitación, grupos proteínicos, grupos lipofílicos, agentes de intercalado, diaminas, ácido fólico, colesterol y adamantano. El término "oligonucleótido" también abarca cualquier otro polímero que contenga nucleobase que incluye, sin limitación, ácidos péptido nucleicos (PNA), ácidos péptido nucleicos con grupos fosfato (PHONA), ácidos nucleicos asegurados (LNA), oligonucleótidos con estructura morfolino y oligonucleótidos que tengan secciones de estructura principal con enlazantes alquilo o enlazantes amino. Los oligonucleótidos de la invención pueden incluir nucleosidos como se encuentran de manera natural, nucleosidos modificados o mezclas de los mismos. Como se utiliza en la presente, el término "nucleósido modificado" es un nucleósido que incluye una base heterocíclica modificada, una porción azúcar modificada o una combinación de las mismas. En algunas modalidades, el nucleósido modificado es un nucleósido pirimidina o purina no natural como se describe en la presente. En algunas modalidades, el nucleósido modificado es un nucleósido 2'-sustituido, un arabinonucleósido o un 2'-desoxi-2'-sustituido-arabinósido. Para propósitos de la invención, el término "ribonucleósido 2'-sustituido o arabinósido 2'-sustituido" incluye ribonucleósidos o arabinonucleósido en el cual el grupo hidroxilo en la posición 2' de la porción pentosa está sustituido para producir un ribonucleósido 2'-sustituido o 2'-0-sustituido. Preferiblemente, dicha sustitución es con un grupo alquilo inferior que contiene 1-6 átomos de carbono saturados o insaturados o con un grupo arilo que tiene 6-10 átomos de carbono, en donde el grupo alquilo o arilo puede estar no sustituido o puede estar sustituido, por ejemplo, con halo, idroxi, trifluorometilo, ciano, nitro, acilo, aciloxi, alcoxi, carboxilo, carboalcoxi o amino. Los ejemplos de ribonucleosidos 2'-O-sustituidos o arabinósidos 2'-O-sustituidos incluyen, sin limitación, 2'-O-metilribonucleósidos o 2'-O-metilarabinósidos y 2'-O-metoxietilribonucleósidos o 2 -O-metoxietilarabinósidos. El término "ribonucleósido 2'-sustituido" o "arabinósido 2'-sustituido" también incluye ribonucleosidos o arabinonucleósidos en los cuales el grupo 2'-hidroxilo está sustituido con un grupo alquilo inferior que contiene 1 -6 átomos de carbono saturados o insaturados o con un grupo amino o halo. Los ejemplos de dichos ribonucleosidos 2'-sustituidos o arabinósidos 2'-sustituidos incluyen, sin limitación, ribonucleosidos o arabinósidos 2 -amino, 2'-fluoro, 2'-alilo y 2'-propargilo. El término "oligonucleotido" incluye oligonucleótidos híbridos y quiméricos. Un "oligonucleotido quimérico" es un oligonucleotido que tiene más de un tipo de enlace internucleosídico. Un ejemplo preferido de dicho oligonucleotido quimérico es un oligonucleotido quimérico que comprende una región fosforotioato, fosfodiéster o fosforad itioato y enlaces no iónicos tales como enlaces alquilfosfonato o alquilfosfonotioato (véase, por ejemplo, Pederson et al, patentes de E.U.A. Nos. 5,635,377 y 5,366,878). Un "oligonucleotido híbrido" es un oligonucleotido que tiene más de un tipo de nucleósido. Un ejemplo preferido de dicho oligonucleotido híbrido comprende un ribonucleótido o una región de ribonucleótido 2' sustituida y una región de desoxirribonucleótido (véase, por ejemplo Metelev y Agrawal, patente de E.U.A. No. 5,652,355, 6,346,614 y 6,143,881 ). Para propósitos de la invención, el término "oligonucleótido inmunoestimulador" se refiere a un oligonucleótido como se describe en lo anterior que induce una respuesta inmunitaria cuando se administra a un vertebrado tal como un pez, un ave o un mamífero. Como se utiliza en la presente, el término "mamífero" incluye, sin limitación a ratas, ratones, gatos, perros, caballos, vacas, cerdos, conejos, primates no humanos y humanos. Los oligonucleótidos inmunoestimuladores útiles se pueden encontrar descritos en Agrawal et al., WO 98/49288, publicada el 5 de noviembre de 1998; WO 01/12804, publicada el 22 de febrero del 2001 ; WO 01/55370, publicada el 2 de agosto del 2001 ; PCT/US01/13682, presentada el 30 de abril del 2001 y PCT/US01/30 37 presentada el 26 de septiembre del 2001. Preferiblemente, el oligonucleótido inmunoestimulador comprende por lo menos un enlace fosfodiéster, fosforotioato o fosforoditioato internucleosídíco. En algunas modalidades el oligonucleótido inmunoestimulador comprende un dinucleótido inmunoestimulador de fórmula 5'-Pyr-Pur-3', en donde Pyr es un nucleosido de pirimidina natural o sintético y Pur es un nucleosido de purina natural o sintética. En algunas modalidades preferidas, el oligonucleótido inmunoestimulador comprende un dinucleótido inmunoestimulador de fórmula 5'-Pur*-Pur-3', en donde Pur* es un nucleosido de purina sintético y Pur es un nucleosido de purina natural o sintético. En diversos lugares el dinucleotido se expresa como RpG, C*pG o YZ, en cuyo caso respectivamente, R, C* o Y representan una purina sintética. Una purina sintética particularmente preferida es 2-oxo-7-desaza-8-metilpurina. Cuando esta purina sintética está en la posición Pur* del dinucleotido, se elimina la especificidad de especie (dependencia de secuencia) del efecto inmunoestimulador y se mejora el perfil de citocina. Como se utiliza en la presente, el término "nucleosido de pirimidina" se refiere a un nucleosido en donde el complemento base del nucleosido es una nucleobase monocíclica. De manera similar, el término "nucleosido de purina" se refiere a un nucleosido en donde el componente base de nucleosido es una nucleobase bicíclica. Para propósitos de la invención, un nucleosido de pirimidina o purina "sintético" incluye una base de pirimidina o purina como no se encuentra de manera natural, una porción azúcar que no se encuentra de manera natural o una combinación de los mismos. Los nucleósidos de pirimidina preferidos de acuerdo con la invención tienen la estructura (I): en donde: D es un donador de enlace hidrógeno; D' se selecciona del grupo que consiste de hidrógeno, un donador de enlace hidrógeno, un aceptor de enlace hidrógeno, un grupo hidrofílico, un grupo hidrofobico, un grupo que retira electrones y un grupo que dona electrones; A es un aceptor de enlace hidrógeno o un grupo hidrofílico; A' se selecciona del grupo que consiste de un aceptor de enlace hidrógeno, un grupo hidrofílico, un grupo hidrofobico, un grupo que retira electrones y un grupo que dona electrones; X es carbono o nitrógeno; y S' es un anillo de azúcar pentosa o hexosa o un azúcar que no se encuentra de manera natural. Preferiblemente, el anillo azúcar está derivatizado con una porción fosfato, una porción fosfato modificada u otra porción enlazante adecuada para enlazar el nucleósido pirímidina a otro nucleósido o análogo de nucleósido. Los donadores de enlace hidrógeno preferidos incluyen, sin limitación, -NH-, -NH2-, -SH y -OH. Los aceptores de enlace hidrógeno preferidos incluyen, sin limitación, C=O, C=S y los átomos de nitrógeno en el anillo de un heterociclo aromático, por ejemplo N3 de citosina. En algunas modalidades, la porción base en (I) es una base de pirimidina que no se encuentra de manera natural. Los ejemplos de base de pirímidina preferidas que no se encuentran de manera natural incluyen, sin limitación, 5'-hídroxicitosina, 5-hidroximetilcitosina, N4-alquilcitosina, preferiblemente N4-etilcitosina y 4'-tiouracílo. No obstante, en algunas modalidades se excluye específicamente 5-bromocitosina. En algunas modalidades, la porción de azúcar S' en (I) es una porción azúcar que no se encuentra de manera natural. Para los propósitos de la presente invención, una "porción de azúcar que se encuentra de manera natural" es una porción de azúcar que se encuentra de manera natural como parte de ácido nucleico, por ejemplo ribosa y 2'-desoxirribosa y una "porción de azúcar que no se encuentra de manera natural" es cualquier azúcar en la cual no se encuentra de manera natural como parte de un ácido nucleico pero la cual se puede utilizar en la estructura principal de un oligonucleótido, por ejemplo hexosa. La arabinosa y los derivados de arabinosa son ejemplos de porciones de azúcar preferidas. Los análogos de nucleósido de purina preferidos de acuerdo con la invención tienen la estructura (II): en donde: D es un donador de enlace hidrógeno; D' se selecciona del grupo que consiste de hidrógeno, donador de enlace hidrógeno y un grupo hidrofílico; A es un aceptor de enlace hidrógeno o un grupo hidrofílico; X es carbono o nitrógeno; cada L es independientemente un átomo que se selecciona del grupo que consiste de C, O, N y S; y S' es un anillo de azúcar pentosa o hexosa o un azúcar que no se encuentra de manera natural. Preferiblemente, el anillo de azúcar está derivatizado con una porción fosfato, una porción fosfato modificada u otra porción enlazante adecuada para enlace del nucleósido de pirimidina a otro nucleósido o análogo de nucleósido. Los donadores de enlace hidrógeno preferidos incluyen, sin limitación, -NH-, -NH2-, -SH y -OH. Los aceptores de enlace hidrógeno preferidos incluyen, sin limitación, C=O, C=S, -NO2 y los átomos de nitrógeno en el anillo de un heterociclo aromático, por ejemplo N1 de guanina. En algunas modalidades, la porción base en (II) es una base purina que no se encuentra de manera natural. Los ejemplos de bases purina que no se encuentran de manera natural preferidas incluyen, sin limitación, 2-amino-6-tiopurina y 2-amino-6-oxo-7desazapurina. En algunas modalidades, la porción azúcar S' en (II) es una porción azúcar como se encuentra de manera natural, como se describe en lo anterior para la estructura (I). En modalidades preferidas, el dinucleótido inmunoestimulador se selecciona del grupo que consiste de CpG, C*pG, CpG* y C*pG*, en donde la base de C es citosina, la base de C* es 2'-timina, 5-hidroxicitosina, N4-alquilcitosina, 4-tiouracilo u otra pirimidina no natural, o 2-oxo-7-desaza-8-metilpurina, en donde la base es 2-oxo-7-desaza-8-metilpurina, preferiblemente unida covalentemente a la posición 1 ' de una pentosa vía la posición 1 de la base; la base de G es guanosina, la base de G* es 2-amino-6-???-7-desazapurina, 2-oxo-7-desaza-8-metilpurina, 6-tioguanina, 6-oxopurina u otro nucleósido de purina no natural y p es un enlace internucleosídico que se selecciona del grupo que consiste de fosfodiéster, fosforotioato y fosforoditioato. En algunas modalidades preferidas, el dinucleótido inmunoestimulador no es CpG. Los oligonucleótidos inmunoestimuladores pueden incluir porciones ¡nmunoestimuladoras en uno o ambos lados del dinucleótido inmunoestimulador. De esta manera, en algunas modalidades el oligonucleótido inmunoestimulador comprende un dominio inmunoestimulador de estructura (III): 5'-??-?1-?-?-?1-??-3' (III) en donde: la base de Y es citosina, timina, 5-hidroxicitosina, N4-alquilcitosina, 4-tiouracilo u otro nucleósido de pirimidina no natural o 2-oxo-7-desaza-8 metilpurina, en donde la base es 2-oxo-7-desaza-8-met¡lpurina, preferiblemente está unida covalentemente a la posición 1 " de una pentosa vía la posición 1 de la base; la base de Z es guanina, 2-amino-6-oxo-7-desazapur¡na, 2-oxo- 7-desaza-8-metilpurina, 2-amino-6-tiopurina, 6-oxopurina u otro nucleósido de purina no natural; N1 y Nn independientemente cada vez que se presenta, preferiblemente es un nucleósido como se encuentra de manera natural o sintético o una porción inmunoestimuladora que se selecciona del grupo que consiste de nucleósidos abásicos, arabinonucleósidos, 2'-desoxiuridina, a-desoxirribonucleósidos, ß-L-desoxirribonucleósidos y nucleósidos unidos por un fosfodiéster o un enlace internucleosídico modificado a un nucleósido adyacente en el lado 3', el enlace internucleotídico modificado se selecciona, sin limitación, de un enlazante que tiene una longitud de aproximadamente 2 angstroms a aproximadamente 200 angstroms, un enlazante alquilo de 2 a 18 átomos de carbono, un enlazante poli(etilenglicol), un enlazante 2-aminobutil-1 ,3-propanodiol, un enlazante glicerilo, un enlace internucleosídico 2'-5' y un enlace internucleosídico fosforotioato, fosforad itioato o metilfosfonato; con la condición de que por lo menos un N1 o Nn sea opcionalmente una porción inmunoestimuladora; en donde n es un número de 0 a 30; y en donde el extremo 3', un enlazante internucleosídico o una nucleobase derivatizada o azúcar está unido directamente o vía un enlazante no nucleotídico a otro oligonucleótido, el cual puede o no ser inmunoestimulador. En algunas modalidades preferidas, YZ es arabinocitidina o arabinocitidina sustituida con 2'-desoxi-2' y arabinoguanosina o arabinoguanosina sustituida con 2'-desoxi-2'. Las porciones inmunoestimuladoras preferidas incluyen estructuras principales fosfodiéster naturales y modificaciones en las estructuras principales fosfato que incluyen, sin limitación, metilfosfonatos, metilfosfonotioatos, fosfotriésteres, fosforotiotriésteres, fosforotioatos, fosforoditioatos, profármacos triéster, sulfonas, sulfonamidas, sulfamatos, formacetal, N-metilhidroxilamina, carbonato, carbamato, morfolino, boranofosfonato, fosforamidatos, especialmente amino-fosforamidatos primarios, N3 fosforamidatos y N5 fosforamidatos y enlaces estereoespecíficos (por ejemplo enlaces (Rp) o (Sp)-fosforotioato, alquilfosfonatos o fosfotriéster). Las porciones inmunoestimuladoras preferidas de acuerdo con la invención incluyen además nucleosidos que tienen modificaciones azúcar que incluyen, sin limitación, azúcares pentosa 2'-sustituidas que incluyen, sin limitación, azúcares pentosa 2'-0-metilribosa, 2'-0-metox¡etilribosa, 2'-0-propargilribosa y 2'-desoxi-2'-fluororibosa; azúcares pentosa 3'-sustituidos que incluyen, sin limitación, 3'-O-metilribosa; 1 ',2'-didesoxirribosa; arabinosa; azúcares de arabinosa sustituidos que incluyen, sin limitación, V-metilarabinosa, 3'-hidroximetilarabinosa, 4'-hidroximetilarabinosa, 3'-hidroxiarabinosa y azúcares de arabinosa 2'-sustituidos; azúcares de hexosa que incluyen, sin limitación, 1 ,5-anhidrohexitol; y anómeros a. En modalidades en las cuales el azúcar modificado es un 3'-desoxirribonucleósido o un ribonucleósido 3'-O-sustituido, la porción inmunoestimuladora está unida al nucleósido adyacente por medio de un enlace internucleosídico 2'-5'. Las porciones inmunoestimuladoras preferidas de acuerdo con la invención incluyen además oligonucleótidos que tienen otras modificaciones y sustituiciones en la estructura principal de carbohidrato que incluyen ácidos nucleicos peptídicos (PNA), ácidos nucleicos peptídicos con grupos fosfato (PHONA), ácidos nucleicos asegurados (LNA), oligonucleótidos de estructura principal morfolino y oligonucleótidos que tienen secciones enlazantes de estructura principal que tienen una longitud de aproximadamente 2 angstroms a aproximadamente 200 angstroms que incluyen, sin limitación, enlazantes alquilo o enlazantes amino. El enlazante alquilo puede estar ramificado o sin ramificar, sustituido o sin sustituir y quiralmente puro o una mezcla racémica. De manera más preferible, dichos enlazantes alquilo tienen de aproximadamente 2 a aproximadamente 18 átomos de carbono. En algunas modalidades preferidas dichos enlazantes alquilo tienen de aproximadamente 3 a aproximadamente 9 átomos de carbono. Algunos enlazantes alquilo incluyen uno o más grupos funcionales que se seleccionan del grupo que consiste de hidroxi, amino, tiol, tioeter, éter, amida, tioamida, éster, urea y tioéter. Algunos de dichos enlazantes alquilo funcionalizados son enlazantes poli(etilenglicol) de fórmula -O-(CH2-CH2-O-)n (n = 1-9). Algunos otros enlazantes de alquilo funcionalizados son péptidos o aminoácidos. Las porciones inmunoestimuladoras preferidas de acuerdo con esta invención incluyen además isoformas de ADN que incluyen, sin limitación, ß-L-desoxirribonucleósidos y a-desoxirribonucleósidos. Las porciones inmunoestimuladoras preferidas de acuerdo con la invención incorporan modificaciones 3' e incluyen además nucleósidos que tienen posiciones de enlace internucleosídico no natural que incluyen, sin limitación enlaces 2'-5\ 2'-2\ 3'-3' y 5"-5'. Las porciones inmunoestimuladoras preferidas de acuerdo con la invención incluyen además nucleósidos que tienen bases heterocíclicas modificadas que incluyen, sin limitación, 5'-hidroxicitosina, 5-hidroximetilcitosina, N4-alquilcitosina, preferiblemente N4-etilcitosina, 4-tiouracilo, 6-tioguanina, 7-desazaguanina, inosina, nitropirrol, C5-propinilpirimidina y diaminopurinas que incluyen, sin limitación, 2,6-diaminopurina. A modo de ilustración específica y de ninguna manera como limitación, por ejemplo, en el dominio inmunoestimulador de la estructura (III), un enlace internucleosídico metilfosfonato en la posición N1 o Nn es una porción inmunoestimuladora, un enlazante que tiene una longitud de aproximadamente 2 angstroms a aproximadamente 200 angstroms, un enlazante alquilo de 2 a 18 átomos de carbono en la posición X1 es una porción inmunoestimuladora y un ß-L-desoxirribonucleósido en la posición X1 es una porción inmunoestimuladora. Véase el Cuadro 1 siguiente para posiciones representativas y estructuras de las porciones inmunoestimuladoras. Debe entenderse que la referencia a un enlazante como la porción inmunoestimuladora en una posición especificada significa que el residuo nucleosídico en esta posición está sustituido en su 3'-hidroxilo con el enlazante indicado, por lo que se genera un enlace internucleosídico modificado entre dicho residuo nucleosídico y el nucleósido adyacente en el lado 3'. De manera similar, la referencia a un enlace internucleosídico modificado como la porción inmunoestimuladora en una posición especificada significa que el residuo nucleosídico en esa posición está unido al nucleósido adyacente en el lado 3' por medio de la articulación mencionada.

CUADRO 1 El Cuadro 2 muestra posiciones representativas y estructuras de porciones inmunoestimuladoras dentro de un oligonucleótido inmunoestimulador que tiene un dominio de potenciación corriente arriba. Como se utiliza en la presente, el término "separador 9" se refiere a un enlazante poli(etilenglicol) de fórmula -O-(CH2CH2-O)n-, en donde n es 3. El término "separador 18" se refiere a un enlazante poli(etilenglicol) de fórmula -0-(CH2CH2-O)n-, en donde n es 6. Como se utiliza en la presente, el término "enlazante alquilo de 2 a 18 átomos de carbono se refiere a un enlazante de fórmula -O-(CH2)q-O-, en donde q es un número entero de 2 a 18. En consecuencia, los términos "enlazante C3" y enlazante alquilo de 3 átomos de carbono" se refiere a un enlazante de fórmula -O-(CH2)3-O-. Para cada separador 9, separador 18 y enlazante alquilo de 2 a 18 átomos de carbono, el enlazante está conectado a los nucleosidos adyacentes por medio de enlaces fosfodiéster, fosforotioato o fosforoditioato.

CUADRO 2 Posición PORCION INMUNOESTIMULADORA TIPICA 5' N2 Nucleosidos que se encuentran de manera natural, enlazante 2-aminobutil-1 ,3-propanodiol 5' N1 Nucleosidos que se encuentran de manera natural, ß-L- desoxirribonucleósido, enlazante alquilo de 2 a 18 átomos de carbono, poli(etilenglicol), enlazante abásico, enlazante de 2- aminobutil-1 ,3-propanodiol 3' N1 Nucleosidos que se encuentran de manera natural, 1 ',2'- didesoxirribosa, 2'-O-metilribonucleósido, enlazante alquilo de 2 a 18 átomos de carbono, separador 9, separador 18 3' N2 Nucleosidos como se encuentran de manera natural, 1 ',2'- didesoxirribosa, 3'-desoxirribonucleósido, ß-L- desoxirribonucleósido, 2'-O-propargil-rigonucleósido, enlazante alquilo de 2 a 18 átomos de carbono, separador 9, separador 18, enlace internucleosídico metilfosfonato 3' N3 Nucleosidos que se encuentran de manera natural, 1 ',2'- didesoxirribosa, enlazante alquilo de 2 a 18 átomos de carbono, separador 9, separador 18, enlace internucleosídico metilfosfonato, enlace internucleosídico 2'-5\ d(G)n, polil- poliC 3'N 2 + 3' N 3 l '^'-didesoxirribosa, ß-L-desoxirribonucleósido, enlazante alquilo de 2 a 18 átomos de carbono, d(G)n, polil-poliC 3'N3 + 3' N 4 2'-O-metoxietilribonucleósido, enlace internucleosídico metilfosfonato, d(G)n, polil-poliC 3'N5 + 3" N 6 1',2'-didesoxirhbosa, enlazante alquilo de 2 a 18 átomos de carbono, d(G)n, polil-poliC 5'N1 + 3' N 3 1 ',2'-didesoxirribosa, d(G)n, polil-poliC El Cuadro 3 muestra posiciones representativas y estructuras de porciones inmunoestimuladoras dentro de un oligonucleótido inmunoestimulador que tiene un dominio de potenciación corriente abajo CUADRO 3 Los oligonucleotidos estimuladores de acuerdo con la invención comprenden por lo menos dos oligonucleotidos unidos en sus extremos 3' o enlace internucleosídico o una nucleobase funcionalizada o azúcar vía un enlazante no nucleotídico. Para propósitos de la invención, un "enlazante no nucleotídico" es cualquier porción que se puede unir a los oligonucleotidos por medio de enlaces covalentes o no covalentes. Preferiblemente dicho enlazante es de aproximadamente 2 angstroms a aproximadamente 200 angstroms de longitud. Se establecen en lo siguiente varios ejemplos de enlazantes preferidos. Los enlazantes no covalentes incluyen, pero no se limitan a interacción electrostática, interacciones hidrofóbicas, interacciones de apilado p y unión por hidrógeno. El término "enlazante no nucleotídico" no significa referirse a un enlace internucleosídico, como se describe en lo anterior, por ejemplo un grupo funcional fosfodiéster, fosforotioato o fosforoditioato que conecta directamente los grupos 3'-hidroxilo de dos nucleótidos. Para propósitos de esta invención, se considera que dicho enlace 3',3'-directo (en donde no está involucrado el enlazante) es un "enlace nucleotídico". En algunas modalidades, el enlazante no nucleotídico es un metal que incluye, sin limitación, partículas de oro. En algunas otras modalidades, el enlazante no nucleotídico es una esfera de polímero biodegradable soluble o insoluble. En otras modalidades adicionales, el enlazante no nucleotídico • es una porción orgánica que tiene grupos funcionales que permiten la unión al oligonucleotido. Dicha unión preferiblemente es por cualquier enlace covalente estable. Como un ejemplo no limitante, el enlazante se puede unir a cualquier posición adecuada del nucleósido, como se ilustra en la figura 9. En algunas modalidades preferidas, el enlazante se une a 3'-hidroxilo. En dichas modalidades, el enlazante preferiblemente comprende un grupo funcional hidroxilo el cual preferiblemente se une al 3'-hidroxilo por medio de un enlace basado en fosfodiéster, fosforotioato, fosforoditioato o no basado en fosfato. En algunas modalidades, el enlazante no nucleotídico es una biomolécula que incluye, sin limitación polipéptidos, anticuerpos, lípidos, antígenos, alérgenos y oligosacáridos. En algunas otras modalidades, el enlazante no nucleotídico es una molécula pequeña. Para propósitos de la invención, una molécula pequeña es una porción orgánica que tiene un peso molecular menor de 1 ,000 Da. En algunas modalidades, la molécula pequeña tiene un peso molecular de menos de 750 Da. En algunas modalidades, la molécula pequeña es un hidrocarburo alifático o aromático, cualquiera de los cuales opcionalmente puede incluir, ya sea en una cadena lineal que conecta los oligonucleótidos unidos al mismo, uno o más grupos funcionales que se seleccionan del grupo que consiste de hidroxi, amino, tiol, tioéter, éter, amida, tiamida, éster, urea y tiourea. La molécula pequeña puede ser cíclica o acíclica. Los ejemplos de enlazantes de moléculas pequeñas incluyen, pero no se limitan a aminoácidos, carbohidratos, ciclodextrlnas, adamantano, colesterol, haptenos y antibióticos. No obstante, para propósitos de describir el enlazante no nucleotídico, no se pretende que el término "molécula pequeña" incluya un nucleósldo. En algunas modalidades, el enlazante de molécula pequeña es glicerol o un homólogo de glicerol de la fórmula HO-(CH2)0-CH(OH)-(CH2)p-OH en donde o y p independientemente son números enteros de 1 a aproximadamente 6, de 1 a aproximadamente 4, o de 1 a aproximadamente 3. En algunas otras modalidades, el enlazante de molécula pequeña es un derivado de 1 ,3-diamino-2-hidroxipropano. Algunos de dichos derivados tienen la fórmula HO-(CH2)m-C(0)NH-CH2-CH(OH)-CH2-NHC(O)-(CH2)m-OH, en donde m es un número entero de 0 a aproximadamente 10, de 0 a aproximadamente 6, de 2 a aproximadamente 6 o de 2 a aproximadamente 4. Algunos enlazantes no nucleotídicos de acuerdo con la invención permiten la unión de más de dos oligonucleótidos. Por ejemplo, el glicerol de enlazante de molécula pequeña tiene tres grupos hidroxilo a los cuales se puede unir covalentemente oligonucleótidos. Algunos oligonucleótidos inmunoestimuladores de acuerdo con la invención por lo tanto comprenden más de dos oligonucleótidos unidos en sus extremos 3' a un enlazante no nucleotídico. Los oligonucleótidos inmunoestimuladores de la invención convenientemente se pueden sintetizar utilizando un sintetizador automatizado y el enfoque de fosforoamidita como se describe esencialmente en la figura 1 y 2 y como se describe adicionalmente en los ejemplos. En algunas modalidades, los oligonucleótidos inmunoestimuladores se sintetizan por el enfoque de síntesis lineal (véase la figura 1 ). Como se utiliza en la presente, el término "síntesis lineal" se refiere a una síntesis que comienza en el extremo de oligonucleotido inmunoestimulador y avanza linealmente hacia el otro extremo. La síntesis lineal permite la incorporación de unidades monoméricas idénticas o no idénticas (en términos de longitud, composición de bases y/o modificaciones químicas incorporadas) dentro de los oligonucleótidos inmunoestimuladores.

ENLAZANTES PARA SINTESIS LINEAL Un modo de síntesis alternativo es la "síntesis paralela" en la cual la síntesis avanza hacia fuera desde una porción enlazante central (véase figura 2). Un enlazante unido a un soporte sólido se puede utilizar para síntesis paralela, como se describe en la patente de E.U.A. número 5,912,332. De manera alternativa, se puede utilizar un soporte sólido universal (tal como vidrio de poro controlado unido a fosfato) como soporte.

ENLAZANTES PARA SINTESIS PARALELA Sin enlazante S, Ramificador de glicerol B, Ramificador sim. Enlazante corto Enlazante largo La síntesis paralela de oligonucleótidos inmunoestimuladores tiene varias ventajas sobre la síntesis lineal: (1 ) la síntesis paralela permite la incorporación de unidades monoméricas idénticas; (2) a diferencia de la síntesis lineal, ambas (o la totalidad) de las unidades monoméricas se sintetizan al mismo tiempo, por lo tanto el número de etapas sintéticas y el tiempo que se requiere para la síntesis es el mismo que el de una unidad monomérica; y (3) la reducción en las etapas de síntesis mejora la pureza y el rendimiento del producto oligonucleótido inmunoestimulador final.

Al final de la síntesis ya sea por síntesis lineal o protocolo de síntesis paralela, los oligonucleótidos ¡nmunoestimuladores se pueden desproteger convenientemente con solución de amoníaco concentrado o como lo recomiende el proveedor de fosforoamidita, si se incorpora un nucleósido modificado. El producto oligonucleótido inmunoestimulador preferiblemente se purifica por CLAP en fase inversa, se destritila, se elimina la sal y se dializa.

El cuadro 4 muestra los oligonucleótidos ¡nmunoestimuladores representativos de acuerdo con la invención.

CUADRO 4 Ejemplos de secuencias oligonucleotídicas inmunoestimuladoras DENTIFICACION Secuencias y modificación DE SECUENCIA NÚMERO 1 S'-TCdAACG^TTCG X-d-GTTdAAdCT-S' 2 5'-TCAGTCG2TTAG-X-GATTG2CTGACT-5' 3 S'-TCGaTCGzTTAGA-X-AGATTGaCTGzCT-S' 4 5'-CAGTCG2TTCAG-X-GACTTG2CTGAC-5' 5 5'-TCAGTCGiTTAG-X-GATTGiCTGACT-5' 6 S'-TCdTCdTTAGA-X-AGATTGiCTdCT-S' 7 5'-CAGTCGiTTCAG-X-GACTTGiCTGAC-5' 8 5'-ACACACCAACT-X-TCAACCACACA-5' (control) Gi = 2'-desoxi-7-desazaguanosina; G2 = araguanosina; X = enlazante glicerol. En un segundo aspecto, la invención proporciona conjugados oligonucleótidos inmunoestimuladores que comprenden un oligonucleótido inmunoestimulador como se describe en lo anterior y un antígeno conjugado al oligonucleótido inmunoestimulador en una posición diferente al extremo 5' accesible. En algunas modalidades, el enlazante no nucleotídico comprende un antígeno el cual está conjugado al oligonucleótido. En algunas modalidades, el antígeno está conjugado al oligonucleótido en una posición diferente de su extremo 3'. En algunas modalidades, el antígeno produce un efecto de vacuna. Preferiblemente, el antígeno se selecciona del grupo que consiste de antígenos asociados con un patógeno, antígenos asociados con cáncer, antígenos asociados con un trastorno autoinmune y antígenos asociados con otras enfermedades tales como, pero sin limitarse a enfermedades veterinarias o pediátricas. Para propósitos de la invención, el término "asociado con" significa que el antígeno está presente cuando está presente el patógeno, cáncer, trastorno autoinmune, alergia a alimento, alergia respiratoria, asma u otra enfermedad, pero no está presente o está presente en cantidades reducidas cuando está ausente el patógeno, cáncer, trastorno autoinmune, alergia a alimento, alergia respiratoria o enfermedad. El oligonucleótido inmunoestimulador unido covalentemente al antígeno o asociado de alguna otra manera operativamente con el antígeno.

Como se utiliza en la presente, el término "asociado operativamente con" se refiere a cualquier asociación que mantenga la actividad de ambos, el oligonucleotido inmunoestimulador y el antígeno. Los ejemplos no limitantes de dichas asociaciones operativas incluyen ser parte del mismo liposoma u otro de dicho vehículo de suministro o reactivo. En modalidades en donde el oligonucleotido inmunoestimulador está unido covalentemente al antígeno dicho enlace covalente preferiblemente está en cualquier posición en el oligonucleotido inmunoestimulador además del extremo 5' accesible de un oligonucleotido inmunoestimulador. Por ejemplo, el antígeno se puede unir en un enlace internucleosídico o se puede unir a un enlazante no nucleotídico. De manera alternativa, el antígeno se utiliza como un enlazante no nucleotídico. En un tercer aspecto, la invención proporciona formulaciones farmacéuticas que comprenden un oligonucleotido inmunoestimulador o un conjugado de oligonucleotido inmunoestimulador de acuerdo con la invención y un portador fisiológicamente aceptable. Como se utiliza en la presente, el término "fisiológicamente aceptable" se refiere a un material que no interfiere con la eficacia del oligonucleotido inmunoestimulador y que es compatible con un sistema biológico tal como una célula, cultivo celular, tejido u organismo. Preferiblemente, el sistema biológico es un organismo vivo tal como un vertebrado. Como se utiliza en la presente, el término "portador" abarca cualquier excipiente, diluyente, material de relleno, sal, amortiguador, estabilizante, solubilizante, lípido u otro material bien conocido en la técnica para uso en formulaciones farmacéuticas. Se comprenderá que las características del portador, excipiente o diluyente dependerán de la vía de administración para una aplicación particular. La preparación de formulaciones farmacéuticamente aceptables que contienen estos materiales se describen, por ejemplo en Remington's Pharmaceuticals Sciences, décima octava edición, ed. A. Gennaro, Mack Publishing Co., Easton, PA, 1990. En un cuarto aspecto, la invención proporciona métodos para generar una respuesta inmunitaria en un vertebrado, dichos métodos comprenden administrar al vertebrado un oligonucleótido inmunoestimulador o un conjugado de oligonucleótido inmunoestimulador de acuerdo con la invención. En algunas modalidades, el vertebrado es un mamífero. Para propósitos de esta invención, el término "mamífero" se pretende de manera expresa que incluya a humanos. En modalidades preferidas, el oligonucleótido inmunoestimulador o el conjugado de oligonucleótido inmunoestimulador se administra a un vertebrado en necesidad de inmunoestimulación. En los métodos de acuerdo con este aspecto de la invención, la administración del oligonucleótido inmunoestimulador o del conjugado oligonucleotídico inmunoestimulador puede ser por cualquier vía adecuada que incluye, sin limitación, la vía parenteral, oral, sublingual, transdérmica, tópica, intranasal, en aerosol, intraocular, intratraqueal, ¡ntrarectal, vaginal, por pistola de genes, por parche dérmico o gotas en los ojos o en forma de enjuague bucal. La administración de las composiciones terapéuticas de los oligonucleotidos inmunoestimuladores se puede llevar a cabo utilizando procedimientos conocidos a dosificaciones y por períodos de tiempo eficaces para reducir los síntomas o marcadores sustitutos de la enfermedad. Cuando se administra de manera sistémica, la composición terapéutica preferiblemente se administra en una dosificación suficiente para obtener una concentración en sangre de oligonucleótido inmunoestimulador desde aproximadamente 0.0001 micromolar a aproximadamente 10 micromolar. Para administración localizada, pueden ser eficaces concentraciones mucho menores que estas y se pueden tolerar concentraciones mucho mayores. Preferiblemente, una dosificación total de oligonucleótido inmunoestimulador varía de aproximadamente 0.001 mg por paciente por día a aproximadamente 200 mg por kg de peso corporal por día. Puede ser deseable administrar de manera simultánea o secuencial una cantidad terapéuticamente eficaz de una o más de las composiciones terapéuticas de la invención a un individuo como un episodio de tratamiento único. En algunas modalidades preferidas, el oligonucleótido inmunoestimulador o el conjugado de oligonucleótido inmunoestimulador de acuerdo con la invención se administra combinado con vacuna, anticuerpos, agentes citotóxicos, alérgenos, antibióticos, oligonucleotidos antisentido, péptidos, proteínas, vectores de genoterapia, vacunas de ADN y/o adyuvantes para incrementar la especificidad o magnitud de la respuesta inmunitaria. En estas modalidades los oligonucleotidos inmunoestimuladores de la invención pueden actuar de manera diversa como adyuvantes y/o producir efectos inmunoestimuladores directos. Ya sea los oligonucleótidos inmunoestimuladores o el conjugado de oligonucleótido inmunoestimulador o la vacuna, o ambos opcionalmente pueden estar unidos a una proteína inmunogénica, tal como hemocianina de lapa de bocallave (KLH), subunidad B de toxina de cólera o cualquier otra proteína portadora inmunogénica. Cualquiera de la gama de adyuvantes se pueden utilizar e incluyen, sin limitación, adyuvante completo de Freund, KLH, monofosforilo lípido A (MPL), dióxido de aluminio y saponinas que incluyen QS-21 , imiquimod, R848 o combinaciones de los mismos. Para los propósitos de este aspecto de la invención, el término "en combinación con" significa en el curso de tratamiento de la misma enfermedad en el mismo paciente e incluye administrar el oligonucleótido inmunoestimulador y/o la vacuna y/o el adyuvante en cualquier orden, incluyendo administración simultánea así como temporalmente separada ordenada de hasta por varios días de diferencia. Dicho tratamiento combinado también puede incluir más de una sola administración de oligonucleótido inmunoestimulador y/o independientemente la vacuna y/o independientemente el adyuvante. La administración del oligonucleótido inmunoestimulador y/o la vacuna y/o el adyuvante puede ser por vías iguales o diferentes. Los métodos de acuerdo con este aspecto de la invención son útiles para estudios de modelos del sistema inmunitario. Los métodos también son útiles para el tratamiento profiláctico o terapéutico de enfermedades en humanos o animales. Por ejemplo, los métodos son útiles para aplicaciones pediátricas y de vacunas veterinarias. En un quinto aspecto, la invención proporciona métodos para tratar terapéuticamente a un paciente que tiene una enfermedad o trastorno, dichos métodos comprenden administrar al paciente un oligonucleótido inmunoestimulador o un conjugado de oligonucleótido inmunoestimulador de acuerdo con la invención. En diversas modalidades, la enfermedad o trastorno que va a ser tratado es cáncer, un trastorno autoinmune, inflamación de las vías respiratorias, trastornos inflamatorios, alergia, asma o una enfermedad causada por un patógeno. Los patógenos incluyen bacterias, parásitos, hongos, virus, viroides y priones. La administración se lleva a cabo como se describe para el cuarto aspecto de la invención. Para propósitos de la invención, el término "alergia" incluye, sin limitación, alergia a alimentos y alergias respiratorias. El término "inflamación de vías respiratorias" incluye, sin limitación, asma. Como se utiliza en la presente, el término "trastorno autoinmune" se refiere a trastornos en los cuales las proteínas "propias" experimentan ataque por el sistema inmunitario. Dicho término incluye asma autoinmune. En cualquiera de los métodos de acuerdo con este aspecto de la invención, el oligonucleótido inmunoestimulador o el conjugado de oligonucleótido inmunoestimulador se puede administrar en combinación con cualquier otro agente útil para tratar la enfermedad o condición que no disminuye el efecto inmunoestimulador del oligonucleótido inmunoestimulador. Por ejemplo, en el tratamiento de cáncer, se contempla que el oligonucleótido ¡nmunoestimulador o el conjugado de oligonucleótido inmunoestimulador se pueda administrar en combinación con un compuesto quimioterapéutico. Los ejemplos siguientes están diseñados para ilustrar adicionalmente ciertas modalidades preferidas de la invención y no se pretende que limiten el alcance de la invención.

EJEMPLOS EJEMPLO 1 Síntesis de oliqonucleótidos que contienen porciones inmunoestimuladoras Se sintetizan oligonucleótidos en una escala de 1 µ?t??? a 0.1 mM en un sintetizador automatizado de ADN (OligoPilot II, AKTA, (Amersham) and/or Expedite 8909 (Applied Biosystem)), siguiendo los procedimientos de síntesis lineal o síntesis en paralelo indicadas en las figuras 1 y 2. Las fosforoamiditas 5 -DMT dA, dG, dC y T se adquieren de Proligo (Boulder CO). Las 5-DMT 7-desaza-dG y araG fosforoamiditas se obtienen de Chemgenes (Wilmington, MA). El soporte sólido de enlazante DiDMT-glicerol se obtiene de Chemgenes. La amidita 1 -(2'-desoxi- -D-ribofuranosil)-2-oxo-7-desaza-8-metilpurina se obtiene de Glen Research (Sterling, VA), amiditas 2'-O-metilrribonucleósido se obtienen de Promega (Obispo, CA). Todos los oligonucleótidos se modifican en la estructura principal de fosforotioato. Todas las fosforoamiditas de nucleótidos se caracterizan por espectro de RMN 31 P y 1H. Los nucleósidos modificados se incorporan en sitios específicos utilizando ciclos de acoplamiento normales recomendados por el proveedor. Después de la síntesis, los oligonucleótidos se desprotegen utilizando hidróxido de amonio concentrado y se purifican por CLAP en fase inversa, eliminación de tritilo, seguido por diálisis. Los oligonucleótidos purificados como en forma de sal de sodio se localizan antes de su uso. Se prueba la pureza por CGE y EM MALDI-TOF. Se determinan las concentraciones de endotoxina por la prueba LAL y se encuentra por debajo de 1.0 EU/mg.

EJEMPLO 2 Activación de los TLR Se cultivan células HEK293/mTLR9 (Invivogen, San Diego, CA) en placas de 48 pozos en DMEM 250 µ?/???? suplementado con FBS 10% inactivado por calor en un incubador con C02 5%. Al 80% de confluencia los cultivos se transforman transitoriamente con 400 ng/ml de plásmido indicador Seap (pNifty2-Seap) (San Diego CA) en presencia de 4 µ?/ml de Lipofectamine (Invitrogen, CA) en medio de cultivo. El ADN plasmídico y Lipofectamine se diluyen por separado en medio libre de suero y se incuban a temperatura ambiente durante 5 minutos. Después de la incubación, el ADN diluido y üpofectamine se mezclan y las mezclas se incuban a temperatura ambiente durante 20 minutos. Se agregan a cada pozo de la placa de cultivo celular 25 µ? de la mezcla de ADN/Lipofectamine que contiene 100 ng de ADN plasmídico y 1 µ? de üpofectamine y los cultivos se continúan durante 4horas. Después de la transformación se sustituye el medio con medio de cultivo fresco y los oligonucleótidos estimulantes e inhibidores se agregan a los cultivos como sigue: Oligonucleótido estimulante a 0.5 pg/ml más oligonucleótido inhibidor a 0, 0.25, 0.5, 2.0, 5.0 pg/ml; los cultivos continúan durante 18 horas. Al final del tratamiento con oligonucleótido se toman 30 µ? de sobrenadante de cultivo de cada tratamiento y se utilizan para el análisis SEAP. Se sigue el protocolo del fabricante (Invivogen) para el análisis. Las señales se detectan por un vector de placa a 405 nm. Todas las lecturas de OD se normalizan por medio control (DO de tratamiento - DO de medio) y la actividad de NF-?? se expresa como múltiplo del control PBS (tratamiento normalizado/PBS normalizado). Se calcula el porcentaje de actividad al tomar los oligonucleótidos estimulantes x 0.5 Kg grupo como 100% y todos los demás grupos de tratamiento como porcentajes de este oligonucleótido estimulante x 0.5 pg en grupo. Los resultados se proporcionan en la figura 3.

EJEMPLO 3 Inducción de INF-g en pDC humano Se aislan células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de sangre de voluntarios sanos recién extraída (CBR Laboratories, Boston, MA) mediante método de centrifugación con gradiente de densidad Ficoll (Histopaque-1077, Sigma). Se aislan los pDC a partir de los PBMC mediante selección positiva utilizando equipo de aislamiento de células BDCA4 (Miltenyi Biotec) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se siembran en placas los PBC en recipientes de 96 pozos utilizando 1 x 06 células/ml. Los IMO disueltos en DPBS (pH 7.4; Mediatech) se agregan a una concentración final de 10.0 pg/ml a los cultivos celulares. Las células después se incuban a 37°C durante 24 h y los sobrenadantes se recolectan por análisis de ELISA. Los experimentos se realizan en pozos por triplicado. Se determinan las concentraciones de IFN-a mediante la prueba de ELISA indirecta (tipo emparedado). Los reactivos necesarios, que incluyen anticuerpos de citocina y estándares se adquieren de PharMingen. Los resultados se muestran en la figura 4.

EJEMPLO 4 Inducción de citocina por IMO en los PBMC humanos Se siembran en placa PBMC humanos en placas de 48 pozos utilizando 5 x 106 células/ml. Los IMO se disuelven en DPBS (pH 7.4; Miediatech) y se agregan a una concentración final de 10.0 µ?/?t?? a los cultivos celulares. Las células después se incuban a 37°C durante 24 h y los sobrenadantes se recolectan por análisis de ELISA. Los experimentos se realizan por pozos por triplicado. Se miden las concentraciones de IL-6 mediante ELISA indirecto. Los reactivos requeridos, que incluyen anticuerpos de citocina y estándares se adquieren de PharMingen. Los resultados se muestran en la figura 5.

EJEMPLO 5 Proliferación de linfocitos B humanos El medio de cultivo utilizado para el análisis consiste de medio RPMI 1640 suplementado con glutamina 1.5 mM, piruvato de sodio 1 mM, aminoácidos no esenciales 0.1 mM, 2-mercaptoeranol 50 µ?, 100 Ul/ml de mezcla de penicilina-estreptomicina y suero bovino fetal inactivado por calor 10%. Se estimulan un total de 0.5 X 106 leucocitos B por mi (es decir 1 X 105/200 µ?/????) en placas de fondo plano de 96 pozos con concentraciones diferentes de oligonucleotidos de prueba por triplicado por un período total de 72 horas. Después de 66 h las células se someten a pulsos con 0.75 µ?? de [3H]-timidina (1 C¡ = 37 GBq; Perkin Elmer Life Sciences) en 20 µ? de medio RPMI 1640 (sin suero) por pozo y se cosechan 8 h después. Las placas después se cosechan utilizando un cosechador de células y se determina la incorporación de reactivo utilizando técnicas de centello líquido estándar. Los resultados que se muestran en la figura 6 se expresan ya sea como media de cpm +/- SD o como índice de proliferación (cpm del grupo tratado/cpm del medio control).

EJEMPLO 6 Inducción de citocina en cultivos de células de bazo de ratón Se preparan células de bazo de ratones BALB/c o C57BL/6 de 4-8 semanas de edad y se cultivan en medio completo RPMI. Las células de bazo de ratón se siembran en placas, en placas de 24 pozos a 5 x 106 células/ml. Se disuelven los IMO en amortiguador TE (Tris-HCI 10 mM, pH 7.5, EDTA 1 mM), y se agregan a una concentración final de 0.03, 0.1 , 1.0, 3.0 o 10 pg/ml a los cultivos celulares. Las células después se incuban a 37°C durante 24 horas y se recolectan los sobrenadantes para los análisis de ELISA. Se determinan las concentraciones de IL-12 e IL-6 en los sobrenadantes mediante la prueba de ELISA indirecta. Los reactivos necesarios que incluyen anticuerpos de citocina como estándares se adquieren de BD Pharmingen. La estreptavidina-peroxidasa y el sustrato se adquieren de KPL. Los resultados se muestran en las figuras 7 y 8.

EQUIVALENTES Aunque la invención anterior se ha descrito con cierto detalle para propósitos de claridad y comprensión, se apreciará por los expertos en la técnica a partir de una lectura de esta descripción que se pueden realizar diversos cambios en la forma y los detalles sin por esto apartarse del verdadero alcance de la invención y las reivindicaciones anexas.

Claims (37)

NOVEDAD DE LA INVENCION REIVINDICACIONES

1.- Un oligonucleótido inmunoestimuiador que tiene una estructura del grupo de 5'-TCAGTCG2TTAG-X-GATTG2CTGACT-5'¡ 5'-TCG2TCG2TTAGA-X-AGATTG2CTG2CT-5'; 5'-CAGTCG2TTCAG-X-GACTTG2CTGAC-5'; 5'-TCAGTCG TTAG-X-GATTGiCTGACT-5'; 5'-TCG 1 TCG -i TTAG A-X-AG ATTG 1 CTG ^ CT-5' y 5'-CAGTCGiTTCAG-X-GACTTdCTGAC-5'; en donde = 2'-desoxi-7-desazaguanosina; G2 = arabinoguanosina; y X = enlazante glicerol.

2.- El oligonucleótido inmunoestimuiador de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque tiene la estructura 5'-TCAGTCG2TTAG-X-GATTG2CTGACT-5'.

3.- El oligonucleótido inmunoestimuiador de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque tiene la estructura 5'-TCG2TCG2TTAGA-X-AGATTG2CTG2CT-5'.

4. - El oligonucleótido inmunoestimuiador de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque tiene la estructura 5'-CAGTCG2TTCAG-X-GACTTG2CTGAC-5\

5. - El oligonucleótido inmunoestimuiador de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque tiene la estructura 5'-TCAGTCG1TTAG-X-GATTG1CTGACT-5'.

6. - El oligonucleótido ¡nmunoestimulador de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque tiene la estructura 5'-TCG1TCG1TTAGA-X-AGATTG1CTG1CT-5'.

7. - El oligonucleótido ¡nmunoestimulador de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque tiene la estructura 5'- CAGTCdTTCAG-X-GACTTG ^ CTGAC-5'.

8. - Una formulación farmacéutica que comprende el oligonucleótido de conformidad con la reivindicación 1 y un portador fisiológicamente aceptable.

9.- El uso de un oligonucleótido ¡nmunoestimulador que tiene una estructura del grupo de 5'-TCAGTCG2TTAG-X-GATTG2CTGACT-5'; 5'-TCGzTCGzTTAGA-X-AGATTGzCTGzCT-S'; 5'-CAGTCG2TTCAG-X-GACTTG2CTGAC-5'; S'-TCAGTCGiTTAG-X-GATTdCTGACT-S'; 5'-TCGiTCGiTTAGA-X-AGATTG!CTG!CT-5' y S'-CAGTCdTTCAG-X-GACTTdCTGAC-5'; en donde d = 2'-desoxi-7-desazaguanosina; G2 = arabinoguanosina; y X = enlazante glicerol, para la fabricación de un medicamento útil para generar una respuesta inmunitaria en un vertebrado.

10.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 9, en donde el medicamento se adapta para ser administrable por la vía seleccionada de parenteral, oral, sublingual, transdérmica, tópica, intranasal, en aerosol, infraocular, intratraqueal, intrarectal, vaginal, pistola de genes, parche dérmico, gota para los ojos y enjuague bucal.

1 1. - El uso como el que se reclama en la reivindicación 9, en donde el oligonucleótido inmunoestimulador tiene la estructura 5'-TCAGTCG2TTAG-X-GATTG2CTGACT-5'.

12. - El uso como el que se reclama en la reivindicación 9, en donde el oligonucleótido inmunoestimulador tiene la estructura 5'- TCG2TCG2TTAGA-X-AGATTG2CTG2CT-5'.

13. - El uso como el que se reclama en la reivindicación 9, en donde el oligonucleótido inmunoestimulador tiene la estructura 5'-CAGTCG2TTCAG-X-GACTTG2CTGAC-5'.

14.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 9, en donde el oligonucleótido inmunoestimulador tiene la estructura 5'-TCAGTCGiTTAG-X-GATTGiCTGACT-5'.

15. - El uso como el que se reclama en la reivindicación 9, en donde el oligonucleótido inmunoestimulador tiene la estructura 5'-TCG 1 TCG 1 TTAG A-X- AG ATTG 1 CTG 1 CT-5' .

16. - El uso como el que se reclama en la reivindicación 9, en donde el oligonucleótido inmunoestimulador tiene la estructura 5'-CAGTCG ! TTC AG-X-G ACTTG 1 CTG AC-5\

17. - El uso de un oligonucleótido inmunoestimulador que tiene una estructura del grupo de 5,-TCAGTCG2TTAG-X-GATTG2CTGACT-5'; 5'- TCG2TCG2TTAG A-X-AG AUG2CTG2CT-5' ; 5'-CAGTCG2TTCAG-X-GACTTG2CTGAC-5'; 5'-TCAGTCG 1 TTAG-X-G ATTG 1 CTG ACT-5"; 5'-TCG 1 TCG !TTAG A-X-AG ATTG ^ CTG 1 CT-5' y 5'-CAGTCGiTTCAG-X- GACTTdCTGAC-5'; en donde Gi = 2'-desox¡-7-desazaguanosina; G2 = arabinoguanosina; y X = enlazante glicerol, para la fabricación de un medicamento útil para tratar a un vertebrado que tiene cáncer, un trastorno autoinmune, inflamación de las vías respiratorias, trastornos inflamatorios, trastornos cutáneos, alergia, asma o una enfermedad causada por un patógeno.

18. - El uso como el que se reclama en la reivindicación 17, en donde el medicamento se adapta para ser administrable por la vía seleccionada de parenteral, oral, sublingual, transdérmica, tópica, intranasal, en aerosol, infraocular, intratraqueal, intrarectal, vaginal, pistola de genes, parche dérmico, gotas para los ojos y enjuague bucal.

19. - El uso como el que se reclama en la reivindicación 17, en donde el oligonucleótido inmunoestimulador tiene la estructura 5'-TCAGTCG2TTAG-X-GATTG2CTGACT-5'.

20.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 17, en donde el oligonucleótido inmunoestimulador tiene la estructura 5'-TCG2TCG2TTAGA-X-AGATTG2CTG2CT-5'.

21 . - El uso como el que se reclama en la reivindicación 1 7, en donde el oligonucleótido inmunoestimulador tiene la estructura 5'-CAGTCG2TTCAG-X-GACTTG2CTGAC-5\

22. - El uso como el que se reclama en la reivindicación 17, en donde el oligonucleótido inmunoestimulador tiene la estructura 5'-TCAGTCG ^ TTAG-X-G ATTG , CTGACT-5'.

23. - El uso como el que se reclama en la reivindicación 7, en donde el oligonucleótido inmunoestimulador tiene la estructura 5'-TCGiTCGiTTAGA-X-AGATTGiCTGiCT-5'.

24. - El uso como el que se reclama en la reivindicación 17, en donde el oligonucleótido inmunoestimulador tiene la estructura 5'- CAGTCGiTTCAG-X-GACTTGiCTGAC-5'.

25. - El uso de un oligonucleótido inmunoestimulador que tiene una estructura del grupo de 5,-TCAGTCG2TTAG~-X-GATTG2CTGACT-5'; 5'-TCG2TCG2TTAGA-X-AGATTG2CTG2CT-5'; 5'-CAGTCG2TTCAG-X-GACTTG2CTGAC-5"; 5'-TCAGTCG ^ TTAG-X-G ATTG ^ CTG ACT-5'; 5 -TCG i TCG - TTAG A-X-AG ATTG 1 CTG 1 CT-5' y S'-CAGTCG^CAG-X-GACTTGTCTGAC-S'; en donde d = 2'-desoxi-7-desazaguanosina; G2 = arabinoguanosina; y X = enlazante glicerol, para la fabricación de un medicamento útil para evitar cáncer, un trastorno autoinmune, inflamación de las vías respiratorias, trastornos inflamatorios, trastornos cutáneos, alergia, asma o una enfermedad causada por un patógeno en un vertebrado.

26. - El uso como el que se reclama en la reivindicación 25, en donde el medicamento se adapta para ser administrable por una vía seleccionada de parenteral, oral, sublingual, transdérmica, tópica, intranasal, en aerosol, intraocular, intratraqueal, intrarectal, vaginal, pistola de genes, parche dérmico, gotas para los ojos y enjuague bucal.

27. - El uso como el que se reclama en la reivindicación 25, en donde el oligonucleótido inmunoestimulador tiene la estructura 5'-TCAGTCG2TTAG-X-GATTG2CTGACT-5'.

28. - El uso como el que se reclama en la reivindicación 25, en donde el oligonucleótido inmunoestimulador tiene la estructura 5'- TCG2TCG2TTAGA-X-AGATTG2CTG2CT-5,.

29. - El uso como el que se reclama en la reivindicación 25, en donde el oligonucleótido inmunoestimulador tiene la estructura 5'-CAGTCG2TTCAG-X-GACTTG2CTGAC-5\

30.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 25, en donde el oligonucleótido inmunoestimulador tiene la estructura 5'-TCAGTCG ? TTAG-X-G ATTG CTGACT-5'.

31. - El uso como el que se reclama en la reivindicación 25, en donde el oligonucleótido inmunoestimulador tiene la estructura 5'-TCG -|TCG TTAG A-X- AG ATTG CTGi CT-5' .

32. - El uso como el que se reclama en la reivindicación 25, en donde el oligonucleótido inmunoestimulador tiene la estructura 5'-CAGTCGiTTCAG-X-GACTTGiCTGAC-5'.

33. - El oligonucleótido de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque comprende un anticuerpo, oligonucleótido antisentido, proteína, antígeno, alérgeno, agente quimioterapéutico o adyuvante.

34.- La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 8, caracterizada además porque comprende un anticuerpo, oligonucleotido antisentido, proteína, antígeno, alérgeno, agente quimioterapéutico o adyuvante.

35.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 9, en donde el medicamento se adapta para ser además administrable con un anticuerpo, oligonucleotido antisentido, proteína, antígeno, alérgeno, agente quimioterapéutico o adyuvante.

36. - El uso como el que se reclama en la reivindicación 17, en donde el medicamento se adapta para ser además administrable con un anticuerpo, oligonucleotido antisentido, proteína, antígeno, alérgeno, agente quimioterapéutico o adyuvante.

37. - El uso como el que se reclama en la reivindicación 25, en donde el medicamento se adapta para ser además administrable con un anticuerpo, oligonucleotido antisentido, proteína, antígeno, alérgeno, agente quimioterapéutico o adyuvante.