MX2008005508A - Pequeños oligonucleotidos de interferencia que comprenden nucleotidos modificados de arabinosa. - Google Patents

Pequeños oligonucleotidos de interferencia que comprenden nucleotidos modificados de arabinosa.

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Abstract

Se proporciona dúplex de ácido de baja interferencia que inhibe la expresión del gen que contiene al menos un nucleótido modificado de arabinosa. Preferiblemente, los dúplex contienen ribonucleótidos y al menos un nucleótido modificado de arabinosa es nucleótido 2'deoxi-2'-fluoroarabinucleótido (FANA, por sus siglas en Inglés).

Description

PEQUEÑOS OLIGONUCLEOTIDOS DE INTERFERENCIA QUE COMPRENDEN NUCLEOTIDOS MODIFICADOS DE ARABINOSA Campo de la Invención La invención generalmente se refiere a pequeños dúplex de ARN de interferencia (ARNsi) que contienen por lo menos un nucleótido modificado de arabinosa, así como híbridos de ácido 2'-desoxi-2'-fluoroarabinonucleico de interferencia.ARN para la infra-regulación de la expresión genética. Antecedentes de la Invención Numerosas estrategias para inhibir la expresión genética con moléculas a base de ácido nucleico están en desarrollo [Stephenson, M. L. & Zamecnik, P. C. Inhibition of Rous sarcoma viral RNA translation by a specific oligodeoxynucleotide. Proc. Nati. Acad. Sci. USA 74, 4370-4373 (1977); Opalinska, J.B. & Gewirtz, A.M. Nucleic-acid therapeutics: basic principies and recent applications. Nature Rev. 1 (julio), 1-10 (2002)]. De éstas, las estrategias "antisentido" que conducen la hibridación, usan ribozimas, ADNzimas, y oligonucleótidos antisentido tal como ARN-ADN quimérico (gapmers) o ADN de fosforotioato, han recibido la mayor atención y son el objeto de numerosas revisiones [Stull, R.A. & Szoka, F. C. Antigene, ribozyme and aptamer nucleic acid drugs: progress and prospects. Pharmaceutical Res. 12, 465-483 (1995); Uhlmann E. y Peyxnan, A. Antisense oligonucleotides: a new therapeutic principie. Chem.
Rev. 90, 544-584 (1990)]. Más recientemente, la inhibición de la post-transcripción genética o la interferencia de ARN (ARNi), se ha presentado como una alternativa potencial a estos métodos más clásicos [Elbashir, S.M, Lendeckel, W. & Tuschl, T. RNA interference is mediated by 21- and 22-nucleotide RNAs. Genes Dev. 15, 188-200 (2001); Caplen, N.J. y col. Specific inhibition of gene expression by small dsRNAs in invertebrate and vertébrate systems. Proc. Nati. Acad. Sci. USA 98, 9742-9747 (2001); Nishikura, K. A short primer on RNAi: RNA-directed RNA polymerase acts as a key catalyst. Cell 107, 415-418 (2001); Tuschl, T. Expanding small RNA interference. Nature Biotechnol. 20, 446-448 (2002); Mittal, V. Improving the efficiency of RNA interference in mammals. Nature Rev. 5, 355- 365 (2004); Nykanen A., Haley, B. & Zamore, P.D. ATP requirements and small interfering RNA structure in the RNA interference pathway. Cell 107, 309-321 (2001)]. Hay numerosos reportes que describen la utilidad de este método para inhibir a los genes en los organismos vivos que se encuentran desde la levadura a los mamíferos [Yu, J.Y., S. L. DeRuiter, y D.L. Turner, RNA interference by expression of short-interfering RNAs and hairpin RNAs in mammalian cells. Proc. Nati. Acad. Sci. USA 99, 6047 (2002); Donze, O. y D. Picard, RNA interference in mammalian cells using siRNAs synthesized with T7 RNA polymerase. Nucleic Acids Res. 30, e46 (2002); Sui, G., C. Soohoo, B. Affar el, y col. A DNA vector-based RNAi technology to suppress gene expression in mammalian cells. Proc. Nati. Acad. Sci. USA 99, 5515 (2002); Paddison, P.J., A.A. Caudy, E. Bernstein, y col. Short hairpin RNAs (shRNAs) induce sequence-specific silencing in mammalian cells. Genes Dev. 16, 948 (2002)]. La utilidad de ARNsi in vivo y su posible aplicación en la terapia farmacéutica, como con otras terapias basadas en oligonucleótidos, se enfrenta a algunos problemas importantes (por ejemplo, suministro, absorción celular y estabilidad biológica de los oligonucleótidos). Existe una necesidad de desarrollar las modificaciones químicas que dan lugar a moléculas útiles de manera clínica. El trabajo inicial con los oligonucleótidos antisentido y de ARNsi fue realizado con moléculas naturales sin modificar. Pronto se pondría en manifiesto sin embargo, que los oligonucleótidos nativos se sometieron a una degradación relativamente rápida, principalmente a través de la acción de 3'-exonucleasas, pero también como un resultado del ataque de la endonucleasa. Los oligoribonucleótidos (ARN) son, de hecho, generalmente más susceptibles a la degradación de nucleasa en relación al ADN. Las moléculas antisentido y de ARNsi ahora se modifican de manera rutinaria para mejorar su estabilidad, así como la resistencia de su hibridación con ARN puesto que estos atributos físicos frecuentemente son necesarios para su aplicación terapéutica [Mangos, M.M. & Damha, M.J. Flexible and frozen sugar-modified nucleic acids - modulation of biológica! activity through furanose ring dynamics in the antisense strand, Curr. Top. Med. Chem. 2, 1145-1169 (2002); Agrawal, S. y Q. Zhao. Mixed backbone oligonucleotides: improvement in oligonucleotide-induced toxicity in vivo. Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 8, 135 (1998); Crooke, S.T. Molecular mechanisms of action of antisense drugs. Biochim. Biophys. Acta 1489, 31 (1999); Micklefield, J. Backbone modification of nucleic acids: synthesis, structure and therapeutic applications. Curr. Med. Chem. 8, 1157 (2001); Nielsen, P.E., Antisense peptide nucleic acids. Curr. Opin. Mol. Ther. 2, 282 (2000); Braasch, D.A., S. Jensen, Y. Liu, y col., RNA interference in mammalian cells by chemically-modified RNA. Biochemistry 42, 7967 (2003)]. En presencia de un vehículo de suministro, ambos tipos de moléculas pueden cruzar las membranas celulares y después hibridarse con su ARN objeto previsto. La estructura terciaria de ARN es un factor importante que controla la capacidad de los oligonucleótidos antisentido [Opalinska, J.B., A. Kalota, L.K. Gifford, y col. Oxetane modified, conformationally constrained, antisense oligodeoxyribonucleotides function efficiently as gene silencing molecules [Nucleic Acids Res. 32, 5791 (2004). Scherr, M., J.J. Rossi, G. Sczakiel, y col., RNA accessibility prediction: a theoretical approach is consistent with experimental studies in cell extracts. Nucleic Acids Res. 28, 2455 (2000). Sokol, D.L., X. Zhang, P. Lu, y col., Real time detection of DNA.RNA hybridization in living cells. Proc. Nati. Acad. Sci. USA 95, 11538 (1998)] y ARNsi [Opalinska, J.B., A.
Kalota, L.K. Gifford, y col. Oxetane modified, conformationally constrained, antisense oligodeoxyribonucleotides function efficiently as gene silencing molecules. Nucleic Acids Res. 32, 5791 (2004); Scherr, M., J.J. Rossi, G. Sczakiel, y col., RNA accessibility prediction: a theoretical approach is consistent with experimental studies in cell extracts. Nucleic Acids Res. 28, 2455 (2000); Sokol, D.L., X. Zhang, P. Lu, y col., Real time detection of DNA.RNA hybridization in living cells. Proc. Nati. Acad. Sci. USA 95, 11538 (1998)] para hibridarse con su objetivo. Es evidente que es indeseable que cualquier tipo de molécula ejerza la unión específica no secuencial. Cumplir todos estos requisitos ha resultado ser una tarea demandante. Los dúplex de ARNsi sin modificar se han utilizado con éxito para la inhibición genética, sin embargo, la modificación química de uno o ambos filamentos será probablemente necesaria para las aplicaciones terapéuticas a modo de mejorar la estabilidad biológica y las propiedades farmacocinéticas. Numerosas modificaciones químicas se han probado para determinar sus efectos sobre la actividad de ARNsi, aunque aún no es claro cuál de estas modificaciones será la más ventajosa. En el diseño de nuevos análogos, es importante reconocer que dos características esenciales del ARNsi son diferentes de los métodos antisentido tradicionales: (i) se reconoce que los dúplex de ARNs y (ii) la inhibición genética implica RISC (complejo de inhibición inducida por ARN) - en lugar de ARNasa H - para promover el reconocimiento y la división del mARN objeto [Elbashir, S.M, Lendeckel, W. & Tuschl, T. RNA interference is mediated by 21-and 22-nucleotide RNAs. Genes Dev. 15, 188-200 (2001); Caplen, N.J. y col. Specific inhibition of gene expression by small dsRNAs in invertebrate and vertébrate systems. Proc. Nati. Acad. Sci. USA 98, 9742-9747 (2001); Nishikura, K. A short primer on RNAi: RNA-directed RNA polymerase acts as a key catalyst. Cell 107, 415-418 (2001); Tuschl, T. Expanding small RNA interference. Nature Biotechnol. 20, 446-448 (2002); Mittal, V. Improving the efficiency of RNA interference in mammals. Nature Rev. 5, 355-365 (2004)]. Como tal, los oligonucleótidos similares a ARN son los candidatos principales para introducir las modificaciones de azúcar o estructurales sin alterar en lo absoluto la estructura helicoidal en forma de "A" que requieren para desarrollar su actividad. Una modificación prometedora son los ácidos nucleicos bloqueados (LNA, por sus siglas en inglés), en los cuales los beneficios esenciales fueron logrados con relativamente pocas modificaciones que no comprometen significativamente la actividad de ARNsi (por ejemplo, estabilidad termal y estabilidad biológica mejoradas, y efectos reducidos fuera del objetivo) [Elmen, J. y col. Locked nucleic acid (LNA) mediated improvements in siRNA stability and functionality. Nucí. Acids Res. 33, 439-447 (2005)]. Sin embargo, se encontró que la actividad y especificidad de tales compuestos fueron muy dependientes del sitio y grado de las modificaciones LNA. Una sola substitución de LNA en el extremo 5' del filamento antisentido suprimió la actividad. Por otra parte, la actividad fue significativamente deteriorada cuando el filamento antisentido fue modificado, mientras que las modificaciones LNA del filamento sentido fueron toleradas solamente con oligonucleótidos ligeramente modificados, que exhiben una actividad igual o más baja que ARNsi sin modificar. Parece haber limitaciones con otras químicas, incluyendo la toxicidad (fosforotioato-ARN) y actividad deteriorada (2'F-ARN, boranofosfato-ARN), con el aumento de los grados de modificación [Amarzguioui, M. y col. Tolerance for mutations and chemical modifications in a siRNA, Nucí. Acids. Res. 31, 589-595 (2003)]. Mientras esto en un principio puede ser compensado por la estabilidad y/o especificidad de la nucleasa impartidas por ciertas químicas de oligonucleótidos, la predicción de las químicas efectivas de ARNsi sigue siendo un objeto activo de estudios continuos. Existe una necesidad de ARNsi modificados de manera química que tengan la estabilidad de nucleasa y/o la capacidad de inhibir la expresión genética. Breve Descripción de la Invención De acuerdo a un aspecto amplio de la invención, se proporciona un pequeño ARN de interferencia (ARNsi) para la modulación de la expresión de un gen objeto de una manera específica secuencial, que comprende un dúplex con dos filamentos en donde por lo menos un nucleótido de ácido ribonucleico de ARNsi se sustituye con un nucleótido modificado de arabinosa. El nucleótido modificado de arabinosa es 2'-desoxi-2'-fluoroarabinonucleótido (FANA, por sus siglas en inglés). Preferiblemente, el ARNsi es de 15-30 nucleótidos de longitud y tiene 1-3 proyecciones de nucleótido en las terminales 3' y 5'. En modalidades específicas, el dúplex puede tener cualquier número de arabinonucleótidos en cualquier ubicación en el filamento sentido o antisentido, por ejemplo: 5'- ARAR ARAR ARAR ARARARARA-3' 5'-AARRAARRAARRAARRAARRA-3' 5'-AARRRRRRRRRRRRRRRRRRR-3' 5'-RRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRAA-3' etc. en donde A es un arabinonucleótido y R es un ribonucleótido. En otras modalidades de la invención, el filamento sentido se sustituye completamente con arabinonucleótidos. Por ejemplo: 5'-AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-3' y el filamento antisentido es un filamento completamente de ARN o un filamento parcialmente sustituido con ARN, por ejemplo: 5'-RRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRR-3' 5'-RRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRAA-3' 5'-AARRRRRRRRRRRRRRRRRRRRR-3' etc.
En otras modalidades de la invención, el arabinonucleótido comprende un sustituyente 2' seleccionado del grupo que consiste de grupos flúor, hidroxilo, amino, azido, alquilo, alcoxi, y alcoxialquilo. En una modalidad adicional de la invención, el grupo alquilo se selecciona del grupo que consiste de grupos metilo, etilo, propilo, butilo, y alquilo funcionalizado tal como grupos etilamino, propilamino y butilamino. En las modalidades, el grupo alcoxi se selecciona del grupo que consiste de grupos metoxi, etoxi, proproxi y alcoxi funcionalizado tal como -0(CH2)q-R, donde q = 2-4 y - R es un grupo -NH2, -OCH3, o -OCH2CH3. En las modalidades, el grupo alcoxialquilo se selecciona del grupo que consiste de metoxietilo, y etoxietilo. En las modalidades, el sustituyente 2' es flúor y el arabinonucleótido es un 2'-fluoroarabinonucleótido (FANA). Preferiblemente, el nucleótido FANA es araF-G, araF-T, araF-U, araF-A, araF-5-metil-C. De acuerdo a algunas modalidades de la invención, ARNsi es para disminuir cualquiera de expresión de luciferasa, expresión de CCR3, o expresión de PDE4D. De acuerdo a otra modalidad de la invención, ARNsi es para disminuir la replicación del virus sincitial respiratorio. En otras modalidades de la invención, el dúplex comprende uno o más enlaces de internucleótido seleccionados del grupo que consiste de: a) fosfodiéster; b) fosfotriéster; c) fosforotioato; d) metilfosfonato; e) boranofosfato y f) cualquier combinación de (a) a (e). De acuerdo a otro aspecto amplio de la invención, se proporciona un método para aumentar por lo menos una de estabilidad de nucleasa y modulación de la actividad del gen objeto de un ARNsi que comprende el remplazo de por lo menos un nucleótido de ARNsi por un nucleótido modificado de arabinosa, preferiblemente 2'-desoxi-2'-fluoroarabinonucleótido (FANA). De acuerdo a otro aspecto amplio de la invención, se proporciona una composición farmacéutica, que comprende el ARNsi de la presente invención junto con un portador farmacéuticamente aceptable. De acuerdo a otro aspecto amplio de la invención, el uso del ARNsi de la presente invención se proporciona para la preparación de un medicamento para modular la expresión de un gen objeto, preferiblemente uno de CCR3 y PDE4D. De acuerdo a otra modalidad de la invención, el uso del ARNsi de la presente invención se proporciona para la preparación de un medicamento para disminuir la replicación del virus sincitial respiratorio. De acuerdo a otro aspecto amplio de la invención, se proporciona un método para modular la expresión genética en un paciente en necesidad del mismo. El método comprende administrar al paciente una cantidad terapéuticamente efectiva de la composición farmacéutica de la invención. Preferiblemente, la composición farmacéutica comprende un ARNsi para cualquiera de disminuir la expresión de CCR3, disminuir la expresión de PDE4D, y disminuir la replicacion del virus sincitial respiratorio. Según otro aspecto amplio de la invención se proporciona un paquete comercial. El paquete comercial comprende la composición farmacéutica de la presente invención junto con las instrucciones para su uso para modular la expresión genética. Preferiblemente, la composición farmacéutica comprende un ARNsi para disminuir la expresión de CCR3, disminuir la expresión de PDE4D y disminuir la replicacion del virus sincitial respiratorio. Breve Descripción de los Dibujos La invención ahora será detalladamente con respecto a los dibujos anexos en los cuales: La figura 1 ilustra la eficacia de diferentes ARNsi en la inhibición de la luciferasa en las células HeLa X1/5. Las células fueron transfectadas con 0.21 [jig de ARNsi que tiene modificaciones solamente en el filamento sentido (A), solamente en el filamento antisentido (B) o en los filamentos sentido y antisentido (C). Los niveles de actividad de luciferasa fueron medidos 24 h después de la transfección y se normalizaron para determinar la actividad metabólica. La actividad normalizada de luciferasa entonces fue determinada como un porcentaje de la actividad de luciferasa con respecto a un ARNsi de control fijado a 100%. Los datos representan la actividad normalizada promedio de luciferasa +/- SEM. Los niveles de ARNm de luciferasa fueron cuantificados por un análisis de PCR en tiempo real 24 h después de la transfección (con respecto a la expresión del gen doméstico GAPDH). Las barras muestran las relaciones de Luciferasa/GAPDH +/- SEM. La figura 2 demuestra la potencia del ARNsi que contiene FANA en la inhibición de la actividad de luciferasa. Las respuestas a la dosis fueron obtenidas para cada ARNsi transfectando las células con diferentes cantidades de ARNsi activo durante 24h. Las respuestas a la dosis para ARNsi que tiene modificaciones solamente en el filamento sentido se muestran en (A), solamente en el filamento antisentido (b) o en los filamentos sentido y antisentido (C). La actividad de luciferasa fue medida y los valores se normalizaron para determinar la actividad metabólica y se compararon a un ARNsi de control fijado a 100%. Los datos representan actividad de luciferasa normalizada promedio +/- SEM. La figura 3 ilustra la eficacia durante el transcurso del tiempo de un diferente ARNsi que detecta ARNm de luciferasa en las células HeLa X1/5. Las células transfectadas con 0.21 pg de ARNsi. La actividad de luciferasa fue medida 4, 8, 24, 48, 72 y 96 h después de la transfección . Los datos representan la actividad normalizada promedio de la luciferasa +/- SEM en comparación a un ARNsi de control fijado a 100%. La figura 4 ilustra la estabilidad en suero de ARNsi que contiene FANA. Los diferentes ARNsi fueron incubados en 10% suero vacuno fetal a 37°C y las alícuotas fueron tomadas en los puntos de tiempo según lo indicado. Los ARNsi fueron separados por PAGE y visualizados con SYBR Gold. Las bandas fueron cuantificadas por densitometría y el porcentaje de ARNsi intacto de la cantidad inicial se fijo en 100%. A) Se muestra la estabilidad en suero de ARNsi que detecta la luciferasa, "ds" representa marcador de ARNsi doblemente filamentoso y "ss" de único filamento. B) La gráfica representa la estabilidad en suero de diferentes ARNsi que detectan la luciferasa. C) La gráfica representa la estabilidad en suero de diferentes ARNsi que detectan CCR3. D) La gráfica representa la estabilidad en suero de diferentes ARNsi que detectan PDE4D. Los datos representan los valores promedios de dos a tres experimentos ± SEM. La figura 5 ilustra la eficacia de ARNsi que contienen FANA en la inhibición de la expresión de CCR3 de rata en las células NIH-3T3. Las cantidades aumentadas de ARNsi que detectan CCR3 de rata fueron co-transfectadas con un plásmido que expresa el gen CCR3 de rata en las células NIH-3T3. Los niveles de expresión de ARNm de CCR3 se midieron 24 h después de la transfección usando el método Quantigene (Panomics) y se normalizaron a los niveles de expresión de un gen de referencia (luciferasa). La actividad de ARNsi fue determinada como la inhibición porcentual comparada a un ARNsi de control fijado a 100%. Los datos representan +/- SEM (n = 6) promedio.
La figura 6 ilustra la eficacia de ARNsi que contienen FANA que detectan la P-proteína viral de RSV en la producción de RSV en las células A549. Las células A549 fueron cultivadas y sembradas a 0.1x105 células por pozo en placas de 24 pozos y fueron cultivadas durante la noche a 37°C, 5% C02. El siguiente día, los cultivos celulares transfectados con 0.05 ug, 0.2 ug, o 0.4 ug de siRSV-P2 (ARNsi contra P-proteína viral de RSV), siRSV-P2-Mi (incompatibilidad de ARNsi contra la P-proteína viral de RSV), siRSV-P2-0/F4 y ARNsi-P2-Mi-0/F4 de control negativo usando el reactivo de transfección Lipofectamine2000 en una relación de ARNsi:Lipofectamine 2000 de 1:3. Cada experimento de transfección fue realizado por triplicado. Un día después de la transfección, las células fueron infectadas con hRSV a M.O.I = 1 y se incubaron a 37°C, 5% C02 durante la noche. Los supernadantes fueron cosechados 24 horas después de la infección y se evaluaron por ELISA para determinar los niveles virales mediante la cuantificación de la proteína de RSV. Los datos son expresados como % de la inhibición de RSV por ARNsi en relación a los niveles de inhibición de RSV por su ARNsi no compatible respectivo.
Descripción Detallada de la Invención Esta invención se relaciona a los dúplex de oligonucleótido modificados diseñados para detectar el ARNm y promover la degradación de ARNm vía el mecanismo de ARNi. Particularmente, se muestra la inhibición selectiva de la actividad de luciferasa, expresión de CCR3 de rata y la replicación viral de RSV usando los dúplex cortos de ARN de interferencia que contienen los arabinonucleótidos modificados (FANA). Los métodos de ARNi descritos en la presente son contrarios a los métodos comunes descritos anteriormente, que se han concentrado en el uso de nucleótidos modificados derivados de las unidades naturales (es decir, ADN, ARN, nucleótidos, 2'-OMe-ARN, 2'F-ARN) [Allerson, CR. y col. Fully 2'-modified oligonucleotide duplexes with improved in vitro potency and stability compared to unmodified small interfering RNA. J. Med. Chem. 48, 901-904 (2005)]. Esta invención comprende la caracterización de una serie de dúplex modificados de azúcar que inhiben la expresión genética gene en una línea celular humana. Estos pequeños dúplex de interferencia contienen nucleótidos modificados de arabinosa que confieren características mejoradas al dúplex, tal como estabilidad mejorada contra las nucleasas presentes en el fluido corporal. Preferiblemente, los nucleótidos modificados de azúcar son 2'-desoxi-2-fluoroarabinonucleótidos (FANA). El método para generar los dúplex modificados de FANA necesitan la sustitución de los nucleótidos de ARN para los residuos de FANA. La actividad de los ARNsi modificados fue evaluada usando una línea de células HeLa modificada diseñada para sobre-expresar la luciferasa. Los niveles de expresión de luciferasa de ARNm y los niveles de actividad de luciferasa fueron determinados usando las técnicas PCR en tiempo real y de análisis de luciferasa, respectivamente. El diseño y selección de la secuencia base de ARNsi actual fueron realizados de acuerdo a ittal y col. [Mittal, V. Improving the efficiency of RNA interference in mammals. Nature Rev. 5, 355-365 (2004)] utilizando los algoritmos Ambion y Qiagen y las búsquedas NCBI Blast. Por lo menos tres dúplex de ARNsi candidatos fueron seleccionados y probados según lo descrito anteriormente. Una vez que el dúplex de ARNsi más activo se haya identificado (CE50 -0.5 nanómetros), los experimentos preliminares fueron realizados para determinar el impacto de la modificación de arabinosa sobre la actividad de ARNsi. Se muestra la inhibición selectiva, específica y eficiente de la actividad de luciferasa de tales dúplex modificados de FANA (figura 1). El reemplazo completo de un filamento de ARN (filamento sentido) en los dúplex de ARNsi con un filamento de FANA genera los híbridos FANA:ARN que también producen la infra-regulación selectiva, específica y eficiente de un ARNm objeto (figura 1A). Los compuestos descritos aquí representan los primeros ejemplos de dúplex modificados de FANA (ARNsi modificados de FANA, e híbridos de FANA:ARN) capaces de inhibir la expresión genética selectivamente vía el mecanismo de ARNi. Específicamente, esta invención proporciona los nucleótidos de FANA que son compatibles con la actividad de los dúplex de ARNsi. Además, se muestra que un filamento sentido entero de FANA se puede unir a un filamento antisentido de ARN sin modificar complementario generando un dúplex que ingresa a la trayectoria de ARNi para detectar selectiva y eficientemente un ARNm y promover su degradación (figuras 1A y 2A). Estos dúplex modificados son obtenidos sintetizando los filamentos constitutivos (vía los métodos químicos de fase sólida) y después se dejan permitiendo que se recuezan para formar un dúplex. Inesperadamente, en todos los casos que implican la modificación parcial o completa del filamento sentido, el gen que inhibe la actividad es similar al observado con los dúplex de ARNsi nativos sin modificar (figuras 1A y 2A). El tratamiento con dúplex modificados de FANA dio lugar a una reducción de la actividad de luciferasa de una manera dependiente de la concentración con un CE50 estimado en el intervalo de 0.06 a 3.6 nanómetros. Las potencias observadas para los dúplex modificados sentido fueron comparables a las de ARNsi nativo (figuras 2A-2C), que tuvieron una CE50 estimada de 0.20 nanómetros en este sistema (tabla 1).
Esta invención también proporciona los dúplex de ARN en los cuales un filamento sentido sin modificar se recuece a un filamento antisentido en el cual los residuos terminales dN colgantes (terminales 3' ó 5') están sustituidos con FANAs sin afectar la actividad (figura 1B y 2B). Asombrosamente, sustituyendo los dos 3'-desoxinucleótidos con residuos de FANA confiere una potencia aumentada por encima del ARNsi sin modificar (figuras 1B y 2B), en contraste notable a los ARNsi con modificaciones LNA, donde los cambios correspondientes dieron lugar a una disminución significativa o a una pérdida completa de la actividad [Elinen, J. y col. Locked nucleic acid (LNA) mediated improvements in siRNA stability and functionality. Nucí. Acids Res. 33, 439-447 (2005)]. Esta invención también proporciona los dúplex de ARN en los cuales los filamentos sentido y antisentido contienen residuos modificados mientras mantienen la actividad de ARNi (figura 1C). En cuanto a los dúplex de ARN que contienen FANAs en uno de los dos filamentos, estos dúplex muestran la degradación objeto específica a potencias iguales o mayores que las de ARNsi sin modificar (figura 2C). Similar a los ARNsi sin modificar, la inhibición continua de la actividad de luciferasa fue observada cuando los dúplex modificados de arabinosa transfectados en las células durante hasta 4 días después de la transfección (figura 3). Sin embargo, en este punto de tiempo, se encontró que los ARNsi modificados tuvieron una mayor actividad inhibidora que ARNsi sin modificar.
En la presente se presenta evidencia de que la estabilidad de nucleasa de FANA que contiene los dúplex de ARNsi, está mejorada por encima de los dúplex de ARNsi sin modificar (figura 4). Considerando que los ARNsi sin modificar se degradan totalmente en un periodo de 15 minutos, los dúplex de ARNsi que contienen un filamento sentido completamente modificado y el filamento antisentido modificado proyectado en el extremo 3' es fácilmente detectable después de 5 h. Por consiguiente, 2'-desoxi-2-fluoro- -D-arabino-(oligonucleótidos), solos o en combinación con unidades de ribonucleótido (ARN), son capaces de hibridar a los filamentos de ARN (antisentido) complementarios para generar los dúplex de ARNsi con una potencia mejorada y resistencia aumentada a la nucleasa. Estas propiedades son muy deseadas contemplando la administración in vivo de estos compuestos. Una "cantidad terapéuticamente efectiva" se refiere a una cantidad efectiva, a dosificaciones y durante periodos de tiempo necesarios, para lograr el resultado terapéutico deseado. Una cantidad terapéuticamente efectiva de un ácido nucleico modificado de la invención puede variar de acuerdo a factores tal como el estado de la enfermedad, edad, sexo, y peso del individuo, y de la capacidad del ácido nucleico modificado para provocar una respuesta deseada en el individuo. Los regímenes de dosificación se pueden ajustar para proporcionar la respuesta terapéutica óptima. Una cantidad terapéuticamente efectiva es también una en la cual cualquier efecto tóxico o dañino del compuesto es compensado por los efectos terapéuticamente benéficos. Para cualquier sujeto particular, los regímenes de dosificación específicos se pueden ajustar durante el transcurso del tiempo de acuerdo a la necesidad individual y ai juicio profesional de la persona que administra o monitorea la administración de las composiciones. Según lo usado en la presente, "portador" o "excipiente farmacéuticamente aceptable" incluye cualquiera y todos los solventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antihongos, agentes isotónicos y retardadores de absorción, y similares que son fisiológicamente compatibles. En una modalidad, el portador es conveniente para la administración parenteral. Alternativamente, el portador puede ser conveniente para la administración intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, sublingual u oral. Los portadores farmacéuticamente aceptables incluyen soluciones o dispersiones acuosas y polvos estériles para la preparación improvisada de soluciones o dispersiones inyectables estériles. El uso de tales medios y agentes para las sustancias farmacéuticamente activas es bien conocido en la técnica. Excepto que cualquier medio o agente convencional es incompatible con el compuesto activo, se contempla el uso del mismo en las composiciones farmacéuticas de la invención. Los compuestos activos complementarios también se pueden incorporar en las composiciones. Las composiciones terapéuticas comúnmente deben ser estériles y estables bajo condiciones de fabricación y almacenamiento. La composición se puede formular como una solución, microemulsión , liposoma, u otra estructura deseada conveniente a una concentración alta de fármaco. El portador puede ser un solvente o un medio de dispersión que contiene, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol, y polietilenglicol líquido, y similares), y mezclas convenientes de los mismos. La fluidez apropiada se puede mantener, por ejemplo, por el uso de un revestimiento tal como lecitina, por el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de la dispersión y por el uso de tensioactivos. En muchos casos, será preferible incluir los agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, polialcoholes tal como manitol, sorbitol, o cloruro sódico en la composición. La absorción prolongada de las composiciones inyectables puede ser causada por la inclusión en la composición de un agente que retrasa la absorción, por ejemplo, sales de monoestearato y gelatina. Por otra parte, un dúplex de oligonucleótido de la invención se puede administrar en una formulación de liberación temporal, por ejemplo en una composición que incluye un polímero de liberación lenta liberación. El oligonucleótido modificado se puede preparar con portadores que protegerán el dúplex de oligonucleótido modificado contra la liberación rápida, tal como una formulación de liberación controlada, incluyendo los implantes y sistemas de suministro microcapsulados. Se pueden utilizar los polímeros biodegradables, biocompatibles, por ejemplo acetato de vinil- etileno, polianhídridos, ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres, ácido poliláctico y copolímeros polilácticos, polig licólicos (PLG). Muchos métodos para la preparación de tales formulaciones se patentan o son conocidas generalmente por los expertos en la técnica. Las soluciones inyectables estériles se pueden preparar incorporando un compuesto activo, tal como un dúplex de oligonucleótido de la invención, en la cantidad requerida en un solvente apropiado con uno o una combinación de ingredientes listados anteriormente, según sea necesario, seguido por la esterilización filtrada. Generalmente, las dispersiones son preparadas incorporando el compuesto activo en un vehículo estéril que contenga un medio de dispersión básico y los otros ingredientes requeridos de los enumerados anteriormente. En el caso de los polvos estériles para la preparación de las soluciones inyectables, los métodos preferidos de preparación son el secado al vacío y liofilización que producen un polvo del ingrediente activo más cualquier ingrediente deseado adicional a partir de una solución previamente filtrada de manera estéril del mismo. De acuerdo con un aspecto alternativo de la invención, un dúplex de oligonucleótido de la invención se puede formular con uno o más compuestos adicionales que mejoren su solubilidad. Aunque varias modalidades de la invención se describen en la presente, muchas adaptaciones y modificaciones se pueden hacer dentro del alcance de la invención de acuerdo al conocimiento general común de los expertos en esta técnica. Tales modificaciones incluyen la sustitución de los equivalentes conocidos para cualquier aspecto de la invención para alcanzar el mismo resultado sustancialmente de la misma manera. Los intervalos numéricos son inclusivos de los números que definen el intervalo gama. En las reivindicaciones, la palabra "comprende" se utiliza como un término amplio, sustancialmente equivalente a la frase "que incluye, pero no se limita a". Los siguientes ejemplos son ilustrativos de varios aspectos de la invención, y no limitan los aspectos amplios de la invención según lo descrito en la presente. Ejemplo 1: Síntesis química de los dúplex de ARNsi y de los dúplex modificados de arabinosa La secuencia y composición de los oligómeros preparados en este estudio se muestran en la tabla 1. La síntesis de los oligoribonucleótidos, oligoribonucleótidos modificados de FANA, así como todos los oligonucleótidos de FANA fueron realizados en una escala de 1 µ?t??? en un sintetizador Applied Biosystems (ABI) usando la química estándar de ß-cianoetilfosforamidita de acuerdo a los protocolos publicados [E. Viazovkina, M.M. Mangos, M.l. Elzagheid, y M.J. Damha (2002) Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry, Unit 4.15); M.J. Damha y K.K. Ogilvie (1993) Oligoribonucleotide synthesis - the silyl-phosphoramidite method in "Protocols for Oligonucleotide and Analogs: Synthesis and Properties" S. Agrawal (ed.). Methods in Molecular Biology pp.81- 114, The Humana Press Inc., Totowa, New Jersey]. Los oligoribonucleótidos modificados de FANA y los oligoribonucleótidos fueron desprotegidos, purificados y tratados idénticamente. Todos los oligonucleótidos fueron purificados por CLAR de intercambio iónico o por electroforesis en gel, y desalaron vía cromatografía de exclusión de tamaño usando gránulos de Sefadex G-25. Las soluciones madre de los dúplex fueron preparadas mezclando los filamentos correspondientes sentido y antisentido (1:1 de relación estequiométrica) , liofilizando las muestras, y agregando el suficiente amortiguador de suspensión repetida/recocido para producir una solución de 20 µ?. La composición del amortiguador de ARNsi suspensión repetida/recocido es de 100 mM de acetato de potasio, 30 mM de HEPES-KOH, 2 mM de acetato de magnesio, pH 7.4. Ejemplo 2: Eficacia de ARNsi que contiene FANA Este ejemplo se relaciona a la eficacia de ARNsi que contienen FANA con respecto a la reducción específica de ARNm objeto y a la reducción de la actividad de luciferasa en las células HeLa X1/5. La línea de células HeLa X1/5 fue obtenida de ECACC (ECACC No. 95051229) y mantenida en un medio EMEM complementado (Invitrogen, Burlington ON) con 10% de suero bovino fetal, 2 mM de L-glutamina, 1% de aminoácidos no esenciales, 1% de vitaminas, 500 pg/ml de G418 y 300 de pg/ml higromicina. Para la transfección, 1.0X105 células/pozo fueron colocadas en placas de 24 pozos 24 horas antes de la transfección. El día de la transfección, las células transfectadas con 0.21 g de ARNsi usando Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Burlington ON) a una relación de ARNsi:Lipofectamine 2000 de 1:2 de acuerdo a las recomendaciones de los fabricantes. Las células fueron cosechadas 24 h después de la transfección. La actividad metabólica celular, como un indicador de la toxicidad celular que resulto de la transfección de ARNsi, fue determinada usando el análisis fluorimétrico Alamar Blue™ (Medicorp, Montreal QC) de acuerdo a las recomendaciones de los fabricantes. Los análisis de actividad de luciferasa fueron realizados usando el sistema de análisis de luciferasa (BD Bioscience, Mississauga, ON) de acuerdo al protocolo del fabricante. Brevemente, después de la exposición al ARNsi, las células fueron lavadas con solución salina amortiguada con fosfato (Invitrogen, Burlington ON) y se sometieron a Usinas. Los Usados celulares fueron centrifugados para eliminar los desperdicios celulares y 20 µ? de alícuotas fueron transferidas a placas lumitrac de 96 pozos (Ultident; Greiner Bio-one). La luminiscencia fue medida usando un luminómetro de microplaca (Luminoskan Ascent, Thermo LabSystem) inmediatamente después de la adición de la solución de sustrato de luciferina. Los valores de luminiscencia entonces fueron normalizados a los valores de la actividad metabólica celular (Alamar Blue™) para compensar la toxicidad resultante de la transfección.
Para el análisis PCR en tiempo real, el ARN total fue extraído usando el mini kit RNeasy (Qiagen, Mississauga ON) de acuerdo al protocolo de los fabricantes. ADNc fue preparado a partir de 1 de ARN total usando el Superscript™ II Reverse Transcriptase y los cebadores aleatorios (Invitrogen, Burlington ON). La PCR en tiempo real cuantitativa fue realizada usando los cebadores genéticos específicos y las sondas para el gene de luciferasa (LUC5013 F1: 5'-acgctgggcgttaatcagag-3'; LUC5013 R1: 5'-gtcgaagatgttggggtgttg-3'; TIB MOLBIOL) y el gene domestico GAPDH (huGAPD para: 5'-ggtggtctcctctgacttc-3' ; huGAPD rev: 5"-ctcttcctcttgtgctcttg-3'; TIB MOLBIOL) usando las condiciones previamente optimizadas y el LightCycler (control Roche, Laval QC). Los resultados presentados en la tabla 1 indican que FANA es bien tolerado cuando está incorporado en ARNsi. De hecho, un ARNsi que tiene un filamento de sentido de FANA completamente modificado (F3/0) conserva su actividad (actividad de ARNm y luciferasa) cuando se compara a ARNsi sin modificar (figura 1A). Nuestros datos también indican que las modificaciones de FANA son bien toleradas cuando se introducen en el filamento antisentido (figura 1B). El reemplazo de los dos deoxinucleótidos proyectados en 3' con dos residuos de FANA (0/F4 y F3/F4) dio lugar a la actividad inhibidora aumentada (65%) del dúplex cuando se compara a un dúplex de ARNsi sin modificar (55%) (figura 1B y 1C). Estos resultados son contrarios a los datos publicados, en los cuales se mostró que las modificaciones químicas fueron bien toleradas solamente en un extremo, dependiendo del tipo de modificación. Sin embargo, la introducción de seis FANAs, que comprenden el extremo 5' y la parte media del filamento antisentido colectivamente, suprimió la actividad del dúplex de ARNsi sin importar las modificaciones introducidas al filamento sentido (figura 1B y 1C). Se conoce que la porción media del filamento antisentido del ARNsi es importante para la interacción del dúplex con la maquinaria celular de ARNi y es muy sensible a las modificaciones químicas. Preferiblemente, por lo tanto, las modificaciones en los filamentos sentido y antisentido están dentro de los parámetros según lo descrito anteriormente (figura 1C). Ejemplo 3: Potencia de ARNsi que contiene FANA Este ejemplo se relaciona a la potencia de ARNsi que contienen FANA con respecto a la disminución específica de la actividad de luciferasa en las células HeLa X1/5. Los estudios de la respuesta a la dosis fueron realizados usando una cantidad total de ARNsi de 0.21 g por lo cual el ARNsi efectivo fue diluido de manera serial con un ARNsi de control, reduciendo la cantidad efectiva de oligonucleótido activo mientras se mantiene constante la cantidad final de ARNsi. Las células fueron cosechadas 24 h después de la transfección y fue determinada la actividad de la luciferasa. Los resultados indican que un ARNsi que tiene dos deoxinucleótidos de la proyección 3' del filamento antisentido se remplaza por FANAs y tienen un filamento sentido sin modificar (0/F4) o completamente modificado (F3/F4) que inhibe la actividad de luciferasa de una manera dependiente de ta concentración con una potencia aumentada por encima del ARNsi sin modificar equivalente (figura 2B y 2C). Los valores estimados CE50 se presentan en La figura 1. Ejemplo 4: Duración de la acción del ARNsi que contiene FANA Este ejemplo muestra que los ARNsi que contienen FANA han mantenido la actividad inhibidora durante hasta 96 h. La actividad de luciferasa fue medida en diferentes puntos de tiempo después de la exposición a diferentes ARNsi modificados y sin modificar (figura 3). Los resultados indican que los ARNsi que contienen residuos de FANA han prolongado la actividad durante hasta 4 días. Por otra parte, los datos muestran que ARNsi que contiene FANA ha aumentado la actividad inhibidora en el punto del tiempo de 96 h en comparación al ARNsi sin modificar (inhibición del 65% contra inhibición del 45% de la actividad de luciferasa, respectivamente). Ejemplo 5: Estabilidad aumentada de ARNsi que contiene FANA Este ejemplo se relaciona a la estabilidad del dúplex de ARNsi en presencia de suero bovino fetal. Los resultados de los experimentos se presentan en la figura 4. Los ARNsi fueron diluidos en 10% suero bovino fetal en DMEM y se incubaron en a 37°C. 12 µ? de alícuotas fueron recolectadas después de 0.25, 0.5, 0.45, 1, 2, 6 y 24 h y se congelaron en 36 µ? de 1.5X amortiguador cargado con TBE que contiene 50% Ficoll hasta el análisis. Las muestras fueron separadas en 20% gel de poliacrilamida bajo condiciones distintas a la desnaturalización y se tiñeron con SYBR Gold (Invitrogen, Burlington ON). Las bandas correspondientes a ARNsi intacto fueron cuantificadas por análisis de densitometría. Los resultados muestran que la incorporación de FANAs en el filamento sentido confiere resistencia significativa a la degradación de ARNsi mediada por suero. La introducción de FANAs mejora significativamente la resistencia al suero de ARNsi. Un gel representativo se muestra en la figura 4A. Todas las formas de ARNsi sin modificar (O/O), sin importar la secuencia, tienen períodos de vida de menos de 15 minutos (figura 4B, 4C y 4D). La sustitución de los dos desoxinucleótidos de la proyección 3' en el filamento antisentido con dos FANAs (0/F4), no tuvo ningún impacto sobre las propiedades de estabilidad en suero de los dúplex de ARNsi (figuras 4B, 4C y 4D). Sin embargo, tienen un filamento sentido de FANA completamente modificado (F3/0) que confiere resistencia significativa a la degradación mediada por suero mientras que fueron observados los periodos de vida de los dúplex de ARNsi de hasta 4 h (figura 4B). Finalmente, la modificación de FANA de los filamentos sentido y antisentido (F3/F4) dio lugar incluso a más resistencia a la nucleasa mientras que se determinaron los períodos de vida de ARNsi de aproximadamente 5 h (figuras 4B y 4C). Ejemplo 6: Eficacia de ARNsi que contiene FANA en la inhibición de los niveles de expresión de ARNm de CCR3 Este ejemplo se relaciona a la eficacia de los ARNsi que contienen FANA en la reducción específica de los niveles de expresión de ARNm de CCR3 en las células NIH-3T3. La línea de células NIH-3T3 fue obtenida de ATCC (ATCC CRL-1658) y fue mantenida en medio DMEM (Invitrogen, Burlington ON) complementado con 10% de suero bovino de becerro, 4 mM L-glutamina, 3.7 g/l de bicarbonato de sodio, 4.5g/l glucosa y 1% penicilina/estreptomicina. 1.0X105 células/pozo fueron sembradas en placas de 24 pozos un día antes de la transfección. Las células transfectadas con 0.2 g de plásmido que expresa el gene CCR3 de rata, 0.2 g de plásmido que expresa luciferasa (gene de referencia) y 0.01, 0.1 ó 0.2 g de ARNsi usando Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Burlington ON) a una relación de ADN/ARNsi:Lipofectamine 2000 de 1:2 de acuerdo a las recomendaciones de los fabricantes. Las células fueron cosechadas 24 h después de la transfección. Los niveles de expresión de CCR3 y luciferasa fueron cuantificados usando el método Quantigene (Panomics, Fremont CA). Los niveles de expresión de CCR3 entonces se normalizaron a los niveles medidos para la luciferasa. Los resultados presentados en la figura 5 indican que la incorporación de los residuos de FANA en ARNsi dio lugar a un aumento dependiente de la dosis en la actividad inhibidora de un ARNsi que detecta ARNm de CCR3 de rata. De hecho, la sustitución de los dos deoxinucleótidos de la proyección 3' en el filamento antisentido con dos FANAs (0/F4) dio lugar a la actividad inhibidora aumentada del dúplex (hasta 49% cuando se compara a un ARNsi de CCR3 sin modificar (35%)) (figura 5). Además, un ARNsi de CCR3 que tiene un filamento sentido de FANA completamente modificado (F3/0) fue más activo (inhibición del 75% de los niveles de ARNm de CCR3) cuando se compara a ARNsi sin modificar (figura 5). Finalmente, la modificación de ambos filamentos del dúplex de ARNsi fue bien tolerada con una actividad inhibidora que alcanzó el 75%. Estos datos apoyan la observación que FANA es: 1) bien tolerado cuando se introduce en un dúplex de ARNsi y 2) mejora la actividad inhibidora del dúplex de ARNsi. Ejemplo 7: Eficacia aumentada de ARNsi que contiene FANA en la inhibición de la replicación viral Este ejemplo se relaciona a la eficacia de los dúplex de ARNsi que contienen residuos de FANA para inhibir la replicación del virus sincitial respiratorio en las células A549. La línea de células A549 (ATCC, # CCL-185) fue mantenida en el medio Ham F12 (HyClone, Logan UT) complementado con 10% FBS no inactivado (HyClone). 1.??105 células fueron sembradas en pozos individuales de placas de 24 pozos un día antes de la transfección. En el día de la transfección, las células transfectadas con 0.05 g, 0.2 ó 0.4 g de ARNsi a una relación de 1:3 de ARNsi al reactivo de transfección (Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Burlington ON)) de acuerdo a las recomendaciones de los fabricantes. 24 horas después de la transfección las células fueron infectadas con RSV a una multiplicidad de infección (M.O.I.) de 1 y se dejo proceder la infección viral durante un día. 24 horas después de la exposición al virus, los supernadantes celulares fueron cosechados y los niveles de RSV fueron determinados usando un método ELISA para detectar las proteínas de RSV. Los resultados indican que un dúplex de ARNsi, en donde los dos deoxinucleótidos de la proyección 3' del filamento antisentido se sustituyen con FANAs y el filamento sentido permanece sin modificar (0/F4), inhibe la replicación de RSV de una manera dependiente de la concentración que tiene una actividad inhibidora aumentada comparada al ARNsi sin modificar a dosis más bajas (figura 6). Estos resultados apoyan la observación que FANA aumenta la actividad inhibidora de ARNsi. Todas las referencias citadas son incorporadas por referencia en la presente. Aunque las modalidades preferidas de la invención se hayan descrito en la presente, será entendido por los expertos en la técnica que además las variaciones pueden ser hechas sin apartarse del espíritu de la invención o del alcance de las reivindicaciones anexas.
Tabla 1. Oligon ucleótidos y dúplex sin tetizados en este estu dio SEC ID Tipo Secuencia CE50 objeto NO. (nM) Luciferase O/O 1 ARN 5 ' -GCUUGAAGUCUUUAAUUAAgg- 3 ' 0-20 2 3 ' -ggCGAACUUCAGAAAUUAAUU- 5 ' Fl/O 3 ARN/FANA 5 ' -GCUUGAAGUCUUUAAUUAATT- ' 0- 25 4 3 ' -ggCGAACUUCAGAAAUUAAUU-5 ' F2/0 5 ARN/FANA 5 ' -GCTTGAAGUCTTUAATTAAtt- 3 ' 2.0 6 3 ' -ggCGAACUUCAGAAAUUAAUU-5 ' F3/0 7 ARN/FANA 5 ' -GCTTOAAGTCTTTAATTAAGG- 3 ' 0 59 8 3 ' -ggCGAACUUCAGAAAUUAAUU-5 ' O/Fl 9 ARN/FANA 5 ' -GCUUGAAGUCUUUAAUUAAgg- 3 ' 0.16 10 3 ' -gGCGAACUUCAGAAAUUAAUU- 5 ' 0/F2 11 ARN/FANA 5 ' -GCUUGAAGUCUUUAAUUAAgg- 3 ' 0-52 12 3 ' -ggCGAACUUCAGAAAUUAAUT- 5 ' 0/F3 13 ARN/FANA 5 ' -GCUUGAAGUCUUUAAUUAAgg-3 ' 6-3 14 3 ' -ggCGAACTTCAGAAATTAATT- 5 ' 0/F4 15 ARN/FA A 5 ' -GCUUGAAGUCUUUAAUUAAgg- 3 ' 0.06 16 3 ' -GGCGAACUUCAGAAAUUAAUU- 5 ' F2/F1 17 ARN/FANA 5 ' -GCTTGAAGUCTTUAATTAAtt- 3 ' 0 11 18 3 ' -gGCGAACUUCAGAAAUUAAUU- 5 ' F2/F2 19 ARN/FANA 5 ' -GCTTGAAGUCTTUAATTAAtt- 3 ' 1- 7 20 3 ' -ggCGAACUUCAGAAAUUAAUT- 5 ' F2/F3 21 ARN/FANA 5 ' -GCTTGAAGUCTTUAATTAAtt-3 ' 3 6 22 3 ' -ggCGAACTTCAGAAATTAATT-5 ' F2/F4 23 ARN/FANA 5 ' -GCTTGAAGUCTTUAATTAAtt-3 ' 0-06 24 3 ' -GGCGAACUUCAGAAAUUAAUU-5 ' F3/F1 25 ARN/FANA 5' -GCTTOAAGTCTTTAATTAAGG-3 ' 0.24 26 3 ' -gGCGAACUUCAGAAAUUAAUU- 5 ' F3/F3 27 ARN/FANA 5 ' -GCTTGAAGTCTTTAATTAAGQ- 3 ' >10 28 3 ' -ggCGAACTTCAGAAATTAATT- 5 ' F3/F4 29 ARN/FANA 5 ' -GCTTGAAGTCTTTAATTAAGG- 3 ' 0 17 30 3 ' -GGCGAACUUCAGAAAUUAAUU- 5 ' CCR3 de rata O/O ARN 5 ' -ACACCCUAUGAAUAUGAGUtt- 3 ' n . d . 3 ' - ttUGUGGGAUACUUAUACUCA- 5 ' 0/F4 ARN/FANA 5 ' - CACCCUAUGAAUAUGAGUt - 3 ' n.d. 3 ' -TTUGUGGGAUACUUAUACUCA- 5 ' F3/0 ARN/FANA 5 ' -ACACCCTATQAATATQAQT - 3 ' n.d. 3 ' - ttUGUGGGAUACUUAUACUCA- 5 ' F3/F4 ARN / FANA 5 < -ACACCCTATQAATATQAOTT - 3 ' n.d. 3 ' -TTUGUGGGAUACUUAUACUCA- 5 ' PDE4D humano 0/0 ARN 5 ' -AAGAACUUGCCUUGAUGUAca- 3 ' n.d. 3 ' - ttUUCUUGAACGGAACUACAU- 5 ' 0/F4 ARN/FANA 5 ' -AAGAACUUGCCUUGAUGUAca- 3 ' n.d. 3 ' -TTUUCUUGAACGGAACUACAU- 5 ' F3/0 ARN/FANA 5 ' -AAOAACTTOCCTTGATGTACA-3 * n.d. 3 ' - tUUCUUGAACGGAACUACAU- 5 ' F3/F4 ARN/FANA 5 ' -AAGAACTTGCCTTGATQTACA-3 * n.d. 3 ' -TTUUCUUGAACGGAACUACAU-5 ' RSVP2 O/O ARN 5 ' -CCCUACACCAAGUGAUAAUtt- 3 ' n.d. 3 ' -1tGGGAUGUGGUUCACUAUUA- 5 ' 0/F4 ARN/FANA 5 ' -CCCUACACCAAGUGAUAAUtt-3 ' n.d. 3 ' -TTGGGAUGUGGUUCACUAUUA- 5 ' a Letras mayúsculas = ARN; letras minúsculas = ADN; letras mayúsculas en negritas = FANA por ejemplo 0/0 representa el ARNsi sin modificar mientras que 0/F1 representa un ARNsi con un filamento sentido sin modificar y la modificación F1 en el filamento antisentido, n.d. = no determinado.

Claims (49)

REIVINDICACIONES
1. Un pequeño ARN de interferencia (ARNsi) para modular la expresión de un gen objeto de una manera específica secuencial, que comprende un dúplex con dos filamentos, en donde por lo menos un nucleotido de ácido ribonucleico del ARNsi se sustituye con un nucleotido modificado de arabinosa.
2. El ARNsi de la reivindicación 1, es de 15-30 nucleótidos de longitud.
3. El ARNsi de la reivindicación 2, tiene 1-3 proyecciones de nucleotido en las terminales 3' y 5'.
4. El ARNsi de la reivindicación 3, en donde el nucleotido modificado de arabinosa tiene un sustituyente 2' seleccionado del grupo que consiste de grupos flúor, hidroxilo, amino, azido, alquilo, alcoxi, y alcoxialquilo.
5. El ARNsi de la reivindicación 4, en donde el grupo alquilo se selecciona del grupo que consiste de grupos metilo, etilo, propilo, butilo, y alquilo f uncionalizado, el grupo alcoxi se selecciona del grupo que consiste de los grupos metoxi, etoxi, proproxi y alcoxi funcionalizado y el grupo alcoxialquilo se selecciona del grupo que consiste de metoxietilo, y etoxietilo.
6. El ARNsi de la reivindicación 5, en donde el grupo alquilo funcionalizado se selecciona del grupo que consiste del grupo etilamino, propilamino y butilamino y el grupo alcoxi funcionalizado se selecciona del grupo que consiste del grupo -0(CH2)q-R, donde q = 2-4 y -R es un grupo -NH2, -OCH3, o -OCH2CH3.
7. El ARNsi de la reivindicación 3, en donde por lo menos un nucleótido modificado de arabinosa es 2'-desoxi-2'-fluoroarabinonucleótido (FANA).
8. El ARNsi de la reivindicación 7, en donde por lo menos un nucleótido modificado de arabinosa está en un filamento sentido del ARNsi.
9. El ARNsi de la reivindicación 7, en donde por lo menos un nucleótido modificado de arabinosa está en un filamento antisentido del ARNsi.
10. El ARNsi de la reivindicación 8, en donde todos los nucleótidos en el filamento sentido se sustituyen con FANA.
11. El ARNsi de la reivindicación 7, en donde por lo menos un nucleótido modificado de arabinosa es un nucleótido que cuelga de por lo menos una de las proyecciones.
12. El ARNsi de cualquiera de las reivindicaciones 1-11 para disminuir la expresión de luciferasa.
13. El ARNsi de la reivindicación 12 con los filamentos del dúplex que tienen las secuencias base de SEC ID NOS. 1 y 2.
14. El ARNsi de la reivindicación 1 con los filamentos del dúplex que tienen las secuencias seleccionadas del grupo que consiste de SEC ID NOS. 3 y 4; SEC ID NOS. 5 y 6; SEC ID NOS. 7 y 8; SEC ID NOS. 9 y 10; SEC ID NOS. 11 y 12; SEC ID NOS. 13 y 14; SEC ID NOS. 15 y 16; SEC ID NOS. 17 y 18; SEC ID NOS. 19 y 20; SEC ID NOS. 21 y 22; SEC ID NOS. 23 y 24; SEC ID NOS. 25 y 26; SEC ID NOS. 27 y 28; y SEC ID NOS. 29 y 30.
15. El ARNsi de cualquiera de las reivindicaciones 1-11 para disminuir la expresión de CCR3.
16. El ARNsi de la reivindicación 12 con los filamentos del dúplex que tienen las secuencias base de SEC ID NOS. 31 y 32.
17. El ARNsi de la reivindicación 1 con los filamentos del dúplex que tienen las secuencias que consisten de SEC ID NOS. 33 y 34; SEC ID NOS. 35 y 36; o SEC ID NOS. 37 y 38.
18. El ARNsi de cualquiera de las reivindicaciones 1-11 para disminuir la replicación viral del virus sincitial respiratorio.
19. El ARNsi de la reivindicación 12 con los filamentos del dúplex que tienen las secuencias base de SEC ID NOS. 47 y 48.
20. El ARNsi de la reivindicación 1 con los filamentos del dúplex que tienen las secuencias que consisten de SEC ID NOS. 49 y 50.
21. El ARNsi de cualquiera de las reivindicaciones 1-11 para disminuir la expresión de PDE4D.
22. El ARNsi de la reivindicación 12 con los filamentos del dúplex que tienen las secuencias base de SEC ID NOS. 39 y 40.
23. El ARNsi de la reivindicación 1 con los filamentos del dúplex que tienen las secuencias seleccionadas del grupo que consiste de SEC ID NOS. 41 y 42; SEC ID NOS.43 y 44; y SEC ID NOS. 45
24. El ARNsi de cualquiera de las reivindicaciones 1-23, que contiene por lo menos un enlace de internucleótido seleccionado del grupo que consiste de fosfodiéster, fosfotriéster, fosforotioato, metilfosfonato, boranofosfato y cualquier combinación de los mismos.
25. Un método para aumentar por lo menos uno de estabilidad de nucleasa y actividad inhibidora del gen objeto de un ARNsi, que comprende remplazar por lo menos un nucleótido del ARNsi por un nucleótido modificado de arabinosa.
26. El método de la reivindicación 25, en donde el nucleótido modificado de arabinosa es 2'-desoxi-2'-fluoroarabinonucleótido (FANA).
27. El método de cualquiera de las reivindicaciones 25-26, en donde el ARNsi es un a dúplex con dos filamentos y 15-30 nucleótidos de longitud con 1-3 proyecciones del nucleótido en las terminales 3' y 5'.
28. El método de la reivindicación 27, en donde por lo menos un nucleótido que es sustituido está en un filamento sentido del ARNsi.
29. El método de la reivindicación 27, en donde por lo menos un nucleótido que es sustituido está en un filamento antisentido del ARNsi.
30. El método de la reivindicación 28, en donde se sustituyen todos los nucleótidos en el filamento sentido.
31. El método de la reivindicación 27, en donde por lo menos un nucleótido que es sustituido está en la proyección.
32. El método de cualquiera de las reivindicaciones 25-31, en donde los filamentos del dúplex tienen las secuencias base de las SEC ID NOS. 1 y 2 y el dúplex con dos filamentos del ARNsi disminuye la expresión de luciferasa.
33. El método de cualquiera de las reivindicaciones 25-31, en donde los filamentos del dúplex tienen las secuencias de las SEC ID NOS. 31 y 32 y el ARNsi disminuye la expresión de CCR3.
34. El método de cualquiera de las reivindicaciones 25-31, en donde los filamentos del dúplex tienen las secuencias de las SEC ID NOS. 39 y 40 y el ARNsi disminuye la expresión de PDE4D.
35. El método de cualquiera de las reivindicaciones 25-31, en donde los filamentos del dúplex tienen las secuencias de las SEC ID NOS. 47 y 48 y el ARNsi disminuye la replicación del virus sincitial respiratorio.
36. Una composición farmacéutica que comprende el ARNsi de cualquiera de las reivindicaciones 1-24 junto con un portador farmacéuticamente aceptable.
37. Uso del ARNsi de cualquiera de las reivindicaciones 1-24 para la preparación de un medicamento para modular la expresión de un gen objeto.
38. Uso del ARNsi de cualquiera de las reivindicaciones 12-14 para la preparación de un medicamento para disminuir la expresión de luciferasa.
39. Uso del ARNsi de cualquiera de las reivindicaciones 15-17 para la preparación de un medicamento para disminuir la expresión de CCR3.
40. Uso del ARNsi de cualquiera de las reivindicaciones 18-20 para la preparación de un medicamento para prevenir o tratar la infección del virus sincitial respiratorio.
41. Uso del ARNsi de cualquiera de las reivindicaciones 21-23 para la preparación de un medicamento para disminuir la expresión de PDE4D.
42. Un método para modular la expresión de un gen objeto en un paciente en necesidad del mismo, que comprende administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de la composición farmacéutica de la reivindicación 36.
43. El método de la reivindicación 42, en donde el gen objeto es CCR3 y la composición farmacéutica comprende el ARNsi de las reivindicaciones 15-17.
44. El método de la reivindicación 42, en donde el gen objeto es un gen para la replicación del virus sincitial respiratorio (RSV) y la composición farmacéutica comprende el ARNsi de las reivindicaciones 18-20.
45. El método de la reivindicación 42, en donde el gen objeto es PDE4D y la composición farmacéutica comprende el ARNsi de las reivindicaciones 21-23.
46. Un paquete comercial que comprende la composición de la reivindicación 36 junto con las instrucciones para su uso para modular la expresión de un gen objeto.
47. El paquete comercial de la reivindicación 46, en donde el gen objeto es CCR3 y la composición farmacéutica comprende el ARNsi de las reivindicaciones 15-17.
48. El paquete comercial de la reivindicación 46, en donde el gen objeto es un gene para la replicación del virus sincitial (RSV) respiratorio y la composición farmacéutica comprende el ARNsi de las reivindicaciones 18-20.
49. El paquete comercial de la reivindicación 46 en donde el gen objeto es PDE4D y la composición farmacéutica comprende el ARNsi de las reivindicaciones 21-23.
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Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
PT1527176E (pt) 2002-08-05 2007-04-30 Atugen Ag Novas formas de muléculas de arn de interferência
WO2008049078A1 (en) 2006-10-18 2008-04-24 Nastech Pharmaceutical Company Inc. Nicked or gapped nucleic acid molecules and uses thereof
RU2010112771A (ru) 2007-10-09 2011-11-20 Коули Фармасьютикал ГмбХ (DE) Иммуностимулирующие аналоги олигонуклеотидов, содержащие модифицированные сахарные группировки
US8470999B2 (en) 2008-05-15 2013-06-25 Luc Paquet Oligonucleotides for treating inflammation and neoplastic cell proliferation
CA2635187A1 (en) 2008-06-05 2009-12-05 The Royal Institution For The Advancement Of Learning/Mcgill University Oligonucleotide duplexes and uses thereof
ES2605990T3 (es) * 2010-12-29 2017-03-17 F. Hoffmann-La Roche Ag Conjugados de molécula pequeña para la administración intracelular de ácidos nucleicos
RU2733361C1 (ru) * 2020-07-14 2020-10-01 Федеральное государственное бюджетное учреждение "Государственный научный центр "Институт иммунологии" Федерального медико-биологического агентства России (ФГБУ "ГНЦ Институт иммунологии" ФМБА России) Средство для ингибирования репликации вируса SARS-CoV-2, опосредованного РНК-интерференцией
RU2746362C9 (ru) * 2021-03-11 2021-04-26 Федеральное государственное бюджетное учреждение "Государственный научный центр "Институт иммунологии" Федерального медико-биологического агентства России (ФГБУ "ГНЦ Институт иммунологии" ФМБА России) Комбинированное лекарственное средство, обладающее противовирусным эффектом в отношении нового коронавируса SARS-CoV-2

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20040171031A1 (en) * 1996-06-06 2004-09-02 Baker Brenda F. Sugar surrogate-containing oligomeric compounds and compositions for use in gene modulation
US20050233342A1 (en) * 2003-03-07 2005-10-20 Muthiah Manoharan Methods of preventing off-target gene silencing
EP2664672A1 (en) * 2003-04-17 2013-11-20 Alnylam Pharmaceuticals Inc. Modified iRNA agents
WO2005027962A1 (en) * 2003-09-18 2005-03-31 Isis Pharmaceuticals, Inc. 4’-thionucleosides and oligomeric compounds

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