MX2007014485A - Medicamento a base de saponina sc-2 para el tratamiento de candidiasis. - Google Patents

Abstract

La presente invencion se refiere a la preparacion de un medicamento para el tratamiento de candidiasis cuyo agente activo es la saponina espirostanica denominada SC-2 (6a-0-??-D-xilopiranos il-(1?3)-??-D-quinovopiranosil-(25R)-5a-espirostan-3??-ol). El medicamento es administrable por via topica y suministra al menos 200 ??g/ml, de dicha saponina. La SC-2 muestra actividad fungicida con una Cl50=200 ??g/ml, contra 7 cepas de Candida donde 2 de ellas son cepas resistentes al farmaco fluconazol. La cepa C. glabata24 (resistente a los farmacos probados) requiere de 800 ??g/ml de SC-2 para inhibir su crecimiento.

Description

MEDICAMENTO A BASE DE SAPONINA SC-2 PARA EL TRATAMIENTO BE CANDIDIASIS CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a un medicamento a base de la saponina SC-2 obtenida originalmente del extracto metanólico de las hojas de la especie de Solanum chrysotrichum (Solanaceae). Dicho medicamento se puede utilizar en el tratamiento y cura de infecciones micóticas, en especial aquellas producidas por levaduras del género Candida y aún más, en cepas de Candida resistentes a los fármacos convencionalmente utilizados para el tratamiento de dichas infecciones tales como fluconazol y ketoconazol. El medicamento, objeto de la presente invención, brinda una solución para el tratamiento de la candidiasis provocada por cepas resistentes y cuya aplicación es tópica en todas las formas farmacéuticas posibles, las cuales pueden ser elaboradas con técnicas convencionales de manufactura farmacéutica.

ANTECEDENTES DE LA INVENCION En la actualidad las enfermedades de origen fúngico han mostrado un repunte epidemiológico, sobre todo en grupos de pacientes con factores predisponentes, como enfermedades debilitantes (diabetes mellitus, tuberculosis, desnutrición), inmunodefíciencias primarias o adquiridas (endocrinopatías idiopáticas, leucemias, linfomas, infección con VIH); tratamientos médicos agresivos (antibióticos de amplio espectro, terapia citotóxica, corticoterapia, cateterismo, procedimientos quirúrgicos) y otros. Este repunte se ha complicado con la aparición, cada vez más frecuente, de cepas resistentes a los antimicóticos de uso común, que en el caso de infección sistémica ocasiona tasas de mortalidad que oscilan entre el 40 y el 50% (Fisher A. Primary immunodefíciencies: An experimental model for molecular medicine. Lancet, 2001; 367: 1863-1869; Nakamura T, Takahashi H. Epidemiological study of Candida infections in blood: susceptibilities of Candida spp. to antifungal agents, and clinical features associated with the candidemia. J Infect Chemother. 2006;12: 132-138; Klepser ME. Candida resistance and its clinical relevance. Pharmacotherapy. 2006; 26: 68S-75S). En México, la candidiasis se considera como uno de los padecimientos ginecológicos más frecuentes (Flores-Paz R. et al. Etiology of cevicovaginal infection in mexican women. Salud Pública Mex. 2003; 45 supl 5: S694-S697). En un estudio realizado en pacientes mexicanas, aproximadamente el 60% presentaron cultivos positivos para C albicans y el 40% para Candida spp. (González- Pedraza A., et al. Candidiasis vaginal: diagnóstico y tratamiento en atención clínica primaria. Aten, primaria. 1998; 21(6): 395-398). Los tratamientos antifúngicos más comunes incluyen los triazoles (fluconazol, itraconazol, ketoconazol) y polienos (amfotericina B), no obstante, la aparición de cepas resistentes a dichos fármacos disminuye las posibilidades de tratamiento de un padecimiento común como la candidiasis. Por lo tanto, en la actualidad no se conocen alternativas terapéuticas para cepas resistentes de Candida. Dentro de la medicina tradicional mexicana se emplea un extracto de las hojas de Solanum chrysotrichum (Solanaceae) para el manejo de afecciones de la piel de etiología micótica como el pie de atleta (tinea pedis) (Lozoya X, Navarro V, Garcia M, Zurita M. Solanum chrysotrichum (Schldl.) a plant used in México for the treatment of skin mycosis. J Ethnopharmacol. 1992; 36: 127-32). En 1992, se reportó que el extracto metanólico de las hojas de Solanum chrysotrichum (Solanaceae) se utilizó en la preparación de una crema para curar tinea pedis y que los pacientes a los cuales se les administró, resultaron completamente curados después de 4 semanas de aplicación tópica. Posteriormente, nuestro equipo de investigación logró el aislamiento de saponinas espirostánicas denominadas SC-2, SC-3, SC-4, SC-5 y SC-6, a partir del extracto metanólico de las hojas de Solanum chrysotrichum (Solanaceae). Dichas saponinas resultaron activas sobre cepas de referencia de hongos como Trichophyton mentagrophytes (ATCC 28185), Trichophyton rubrum (ATCC 28188), Aspergillus niger (ATCC 10335) y Candida albicans (ATCC 10231) (Zamilpa A, et al. Five new steroidal saponins from Solanum chrysotrichum leaves and their antimycotic activity. J Nat Prod. 2002; 65: 1815-9). Adicionalmente, con dicho extracto de S. chrysotrichum se preparó un champú para el tratamiento de caspa (Pityriasis capitis) o dermatitis seborreica, objeto de la patente MX PA05004135. En dicha patente se hace mención del posible uso de las saponinas espirostánicas en el tratamiento de enfermedades de la piel asociadas con infecciones causadas por levaduras del género Candida, pero no se ha logrado estandarizar dosificaciones farmacéuticamente apropiadas para dicha indicación terapéutica, ni tampoco se ha ofrecido ninguna evidencia experimental de dicho efecto. En la presente solicitud, se propone la utilización particularmente de la saponina SC-2 en la preparación de un medicamento para el tratamiento de infecciones causadas por cepas resistentes de la levadura Candida como principal objeto de la invención, y se ofrecen ejemplos que ilustran el efecto fungicida y fungistático de dicha saponina sobre cepas resistentes a fármacos tales como fluconazol y ketokonazol, aisladas directamente de pacientes. En la presente invención, se propone de manera particular, la determinación de la dosis a la cual la saponina SC-2 causa un efecto inhibitorio sobre el crecimiento de cepas de Candida resistentes, la cual para un técnico con conocimientos medios en la materia, no podía ser deducida obviamente únicamente por el efecto mostrado anteriormente en cepas de referencia ATCC, también denominadas cepas estándar o de laboratorio (Zamilpa A, et al. Five new steroidal saponins from Solanum chrysotrichum leaves and their antimycotic activity. J Nat Prod. 2002; 65: 1815-9), debido a que en la presente invención se utilizaron cepas clínicas aisladas directamente de pacientes y por ende, algunas de ellas son resistentes a fluconazol y ketokonazol mientras que otras f eron evaluadas y determinadas como resistentes a dichos medicamentos en la presente invención.

DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS En la Eág?ra No. 1 se muestra la inhibición del crecimiento in vitro de la cepa C. albicans por efecto de la saponina SC-2. El experimento se llevó a cabo por duplicado.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN El medicamento de la presente invención puede ser utilizado para el tratamiento y cura de infecciones micóticas, en especial aquellas producidas por levaduras del género Candida y aún más, en cepas de Candida resistentes a los fármacos convencionalmente empleados para el tratamiento de dichas infecciones tales como fluconazol y ketoconazol. El medicamento de la presente invención tiene como agente activo la saponina espirostánica de fórmula I denominada como SC-2 de nombre químico 6a-O-ß-D-xilopiranosil-(l— »3)-ß-D-quinovopiranosil-(25R)-5a-espirostan-3ß-ol. Fórmula I: Las formas farmacéuticas de administración del medicamento objeto de la invención pueden ser diseñadas de acuerdo con cualquier modalidad de aplicación tópica. Dichas formas de dosificación pueden ser elaboradas con técnicas y métodos de fabricación convencionales de manufactura farmacéutica. El efecto fungicida y fúngistático sobre cepas levaduriformes de Candida tanto susceptibles como resistentes a fluconazol y ketoconazol se muestra en los siguientes ejemplos mediante la determinación de los valores de la Concentración Mínima Inhibitoria (CMI) y la Concentración Mínima Fungicida (CMF).

La CMI se define como la concentración mínima de fármaco con la cual se inhibe el 50% del crecimiento en comparación con un control libre de fármaco (CI50). La CMF se define como la concentración mínima farmacéutica que inhibe el crecimiento de células levaduriformes (Rodero L, Córdoba S, Cahn P, Soria M, Lucarini M, Davel G, Kaufman S, Canteros C, Guelfand L. Timmed-kill curves for Cryptococcus neoformans isolated from patients with Aids. Medical Mycology. 2000; 38: 201-7). Los fármacos que se emplean como referencia en los ejemplos son fluconazol (Fluco); itraconazol (Itra); ketoconazol (Keto) y amphotericina B (AmB).

EJEMPLOS EJEMPLO No. 1. Obtención de las cepas dei género Candida Las cepas de referencia empleadas son: C. albicans (ATCC 10231, susceptible a Keto), C. parapsilosis (ATCC 22019, susceptible a Fluco) y C cruzei (ATCC 6258, resistente a Fluco) obtenidas comercialmente. Las cepas obtenidas de aislados clínicos fueron obtenidas de pacientes pediátricos de diferentes hospitales del Sector Salud en la Ciudad de México. Todas las cepas fueron identificadas en el Laboratorio de Micología Médica de la Escuela Nacional de Ciencias Biológicas del IPN (México), mediante técnicas convencionales y ampliamente conocidas, tales como: emisión de tubo germinativo, producción de clamidoconidios en agar clamidospora, filamentación, CHROMagar Candida, tolerancia a la cicioheximida, termotolerancia y perfiles bioquímicos con el sistema API 20C.

Las cepas obtenidas de aislados clínicos son 9: C. albicans , C. albicans , C albicans l9, C. albicans , C. glabrata , C lusitinae , C. parapsilosis ' , C tropicalis y C. glabrata 15.

EJEMPLO No. 2 Evaluación de SC-2 sobre cepas sensibles y resistentes de Candida y determiiroadóim de Ba CIsn v la CMF Los fármacos de referencia se utilizan en las siguientes concentraciones: AmB, Itra y Keto de 16 a 0.03 µg/ml. Para Fluco y la saponina SC-2 las concentraciones son de 128 a 0.5 µg/ml y 800 a 200 µg/ml, respectivamente. AmB, Itra, Keto y Fluco se disuelven en DMSO, mientras que la saponina SC-2 se disuelve en etanol. Para la determinación de la CI50 y CMF se realizan pruebas in vitro donde se utiliza el método de referencia estándar Clinical and Laboratory Standards Institute M27-A2 (CLSI) aprobado por The National Committee for Clinical Laboratory Standard (NCCLS, Reference method for broth dilution antifungal susceptibility testing of yeasts. Approved standard-second edition. NCCLS document M27-A2. NCCLS. Wayne, Penn, USA, 2002). En dicho método las células son suspendidas en solución salina normal estéril. Se ajusta la turbidez a 0.5 Unidades en la escala de McFarland. El medio de cultivo empleado es RPMI 1640 que contiene L-glutamina, 0.165 M 3-(N-morfolino) y ácido morfopropilensulfónico (MOPS) a un pH de 7.0. Así mismo, de conformidad con dicho método, los parámetros para la consideración de cepas sensibles y resistentes a los fármacos empleados son: Fluco (<8 µg/ml: sensible; >64 µg/ml: resistente); Itra y Keto (<0.12 µg/ml: sensible; =l .O µg/ml: resistente) y AmB (<2 µg/m: sensible; la dosis a la cual se considera como resistente, es un valor que aún no se ha establecido internacionalmente).

Partiendo del valor de la CI50 se determina la CMF. Se prueban dos concentraciones que representan los valores de 2 y 4 veces la concentración de la CI50, por ejemplo, la CI5o= 200 µg/ml para la saponina SC-2, entonces para la determinación de la CMF, las concentraciones consideradas a probar comprenden 200, 400 y 800 µg/ml. La viabilidad celular se determina mediante la cuantificación de unidades formadoras de colonias: UFC/ml. Para determinar dichas UFC/ml se siembran 100 µl del inoculo de cada cepa utilizando medio Sabourad dextrosa agar (SDA) e incubando a 35°C por 24 h. Para la preparación del inoculo de cada cepa se tienen los siguientes pasos: 1) Cultivar las cepas por 24 h en agar Sabouraud 2) Preparar una suspensión de levaduras en medio RPMI, ajustando la turbidez a 0.5 Unidades de la escala de McFarland. Agitar vigorosamente durante 15 segundos. Esta suspensión contiene aproximadamente 1.5 X 106 (UFC/ml). Los valores obtenidos de CI50 y CMF se muestran en la Tabla 1. Todas las cepas evaluadas son sensibles al fármaco AmB, y presentan un CI50 entre 0.5 y 1.0 µg/ml. La saponina SC-2 presenta una CI50 entre 200 y 800 µg/ml para cepas de Candida, donde la concentración más alta corresponde a la cepa C. glabrata resistente a Fluco. La saponina SC-2 muestra actividad fungicida con una Cl50= 200 µg/ml, contra siete cepas de Candida. Sorprendentemente, cuatro de estas siete cepas son de la especie C. albicans (dos cepas resistentes a Fluco y Keto, una cepa resistente solo a Keto, mientras que la cepa ATCC 10231 es sensible a todos los antifüngicos evaluados); una cepa es resistente a Itra (C. lusitaniaé) y dos cepas de C. parapsilosis son sensibles a todos los fármacos evaluados. Las CI50 de SC-2 para otras especies del género Candida (Figura 1), muestran que esta saponina es capaz de inhibir el crecimiento levaduriforme de diferentes especies del género. La cepa de C. albicans63 mostró menor susceptibilidad y la especie C. glabrata2* (resistente a los fármacos probados) requiere concentraciones altas de SC-2 para inhibir el crecimiento (CI50 y CMF = 800 µg/ml). Otras especies con baja sensibilidad a SC-2 fueron C tropicalis y C krusei ATCC 6258; estas especies, junto con C glabratai 5, presentan resistencia intrínseca a los azoles (sin contacto previo con la droga). Las CMF en todos los casos f eron < 3 UFC/placa. Las CMF de SC-2 para todas las cepas de Candida estudiadas, oscilaron entre 400 y 800 µg/ml, siendo las más bajas para 2 cepas de C. albicans y una de C. lusitaniae. La actividad fungicida de valor CMF = 400 µg/ml se detecta contra las dos cepas de C albicans resistentes a Fluco y Keto y la cepa de C. lusitanae resistente a Itra. La saponina SC-2 mostró tanto efecto fungistático como fungicida sobre las diferentes cepas y especies de Candida evaluadas.

EJEMPLO No. 3 Diseño de ia fform?Bación tópica De conformidad con reportes de farmacocinética (Kaye CM, Alien A, Perry S, McDonagh M, Davy M., Store K, Bird N, Dewit O. The clinical pharmacokinetics of a new pharmacokinetically enhaced formulation of Amoxilin/Clavulanate. Clinical Therapeutics, 2001, 23(4):578-584; Martín Herrero JE, García Rey C, Jiménez Mestre MJ y Aguilar Alfaro L. Estrategias para superar las resistencias de patógenos respiratorios en Atención Primaria. Sociedad Española de Quimioterapia. Reunión Anual 2002. Madrid), un valor de al menos el 40% del CI50 adicional es predictor de eficacia bacteriológica y por lo tanto, las fórmulas farmacéuticas pueden ser diseñadas específicamente con la proporción indicada.

Tabla 1. Evaluación de la saponina SC-2 y fármacos aprobados en cepas de Candida *S=sensible; R=resistente En el ejemplo 2 de la presente solicitud se ha mostrado el efecto de la saponina SC-2 sobre cepas de Candida resistentes en concentraciones de 200, 400 y 800 µg/ml. De conformidad con los reportes de farmacocinética de Kaye et al. y Martín Herrero et al., a cada valor de CI50 le corresponde al menos: - 40% de 200- 80; 200+80= 280 µg/ml 40% de 400= 160; 400+160=560 µg/ml 40% de 800=320; 800+320= 1 120 µg/ml Dichos valores representan la cantidad mínima para preparar una formulación farmacéutica en proporción peso/volumen. Las formas farmacéuticas de la invención comprenden formas tópicas sólidas, semisólidas o líquidas convencionales que podrán ser elaboradas con técnicas convencionales, de manera que se asegure que las cantidades terapéuticamente efectivas de la saponina SC-2 se administren en al menos el 40% adicional del valor de CI50.

Habiendo descrito de manera suficiente y clara mi invención, considero como una novedad y por lo tanto reclamo como de mi exclusiva propiedad, lo contenido en las siguientes reivindicaciones.

Claims (5)

1. REIVINDICACIONES 1.- El uso de una cantidad farmacéuticamente efectiva de al menos 200 µg/ml del compuesto de fórmula I: para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de candidiasis, en donde el medicamento está adaptado para ser administrable por vía tópica.
2. 2.- El uso de conformidad con la reivindicación 1 , donde la cantidad farmacéuticamente efectiva es preferentemente de 280 µg/mg de dicho compuesto.
3. 3.- El uso de conformidad con la reivindicación 1, donde la cantidad farmacéuticamente efectiva es preferentemente de 560 µg/mg de dicho compuesto.
4. 4.- El uso de conformidad con la reivindicación 1 , donde la cantidad farmacéuticamente efectiva es preferentemente de 1 120 µg/mg de dicho compuesto.
5. 5.- El uso de conformidad con la reivindicación 1, donde las formas farmacéuticas comprenden formas tópicas sólidas, semisólidas o líquidas.