MX2007012361A

MX2007012361A - Gamaretrovirus asociado con cancer.

Info

Publication number: MX2007012361A
Application number: MX2007012361A
Authority: MX
Inventors: Robert Silverman; Eric A Klein; Joseph Derisi; Don Ganem; Graham Casey
Original assignee: Cleveland Clinic Foundation
Priority date: 2005-04-07
Filing date: 2006-04-07
Publication date: 2008-02-11
Also published as: AU2006235266A2; AU2006235266A1; WO2006110589A2; JP2013046619A; EP1882032A2; US8263085B2; US20100166797A1; NZ562221A; WO2006110589A3; CA2603863A1; AU2006235266B2; WO2006110589A8; JP2008538494A; US20130040369A1

Abstract

La presente invencion proporciona virus que codifican secuencias acido nucleicas aisladas; polipeptidos aislados que comprenden secuencias aminoacidas del virus; vectores que comprenden las secuencias acido nucleicas virales; celulas que comprenden los vectores; anticuerpos y sus fragmentos enlazadores de antigenos, mismos que tienen especificidad de enlace para los virus; metodos para detectar o mostrar los virus (por ejemplo, en un individuo); metodos para identificar agentes que inhiben los virus; metodos para inducir una respuesta inmune al virus; metodos para tratar enfermedades asociadas con la presencia de XMRV en un individuo (por ejemplo, cancer, tal como cancer de prostata); metodos para detectar cancer asintomatico (por ejemplo, cancer de prostata); metodos para identificar a un individuo con riesgo de desarrollar cancer (por ejemplo, cancer de prostata); y equipos para detectar el virus.

Description

GAMMARETROVIRUS ASOCIADO CON CÁNCER SOLICITUDES RELACIONADAS Esta aplicación reivindica el beneficio de la solicitud provisional de EE.UU. N° 60/669.473, presentada el 7 de abril de 2005 y de la solicitud provisional de EE.UU. N° 60/751.809, presentada el 19 de diciembre de 2005. Las enseñanzas completas de las solicitudes anteriores se incorporan en este documento como referencia. RESPALDO GUBERNAMENTAL La invención está respaldada, en todo en parte, por una concesión NIH/NCI RO1 CA103943-01 del Instituto Nacional de la Salud. El gobierno tiene ciertos derechos sobre la invención. ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Las enfermedades de transmisión sexual han aumentado en los últimos 30 años. Dichas enfermedades han estado vinculadas con cánceres (por ejemplo cáncer de próstata). El carcinoma de la próstata es la segunda causa principal de muertes por cáncer en hombres americanos y el cáncer visceral más frecuente (Kumar, V., et al., S. L. (1997) in Basic Pathology, 6a ed., páginas 584-588, W. B.

Saunders Co., Philadelphia Kumar er al, 1997). Entre las poblaciones de los EE.UU. los afroamericanos corren el mayor riesgo. La Sociedad Americana de Cáncer (American Cáncer Society) estimó que había aproximadamente 190.000 nuevos casos y 30.000 muertes por cáncer de próstata en los EE.UU. en 2003.

Los factores de riesgo genéticos, de edad, hormonales y medioambientales juegan todos un papel en la patogénesis del cáncer de próstata (Nelson WG., et al., N Engl J Med, 349(4):366-81 , 2003). Existe una necesidad de métodos de detección y tratamientos mejorados para dichos cánceres. SUMARIO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a un virus relacionado (XMRV) con el virus de la leucemia de ratón xenotrópico (MLV) que puede causar cáncer en el individuo. Esto es, la etiología del cáncer en el individuo es un vínculo probable de la presencia de XMRV en el individuo. En una realización, la presente invención se refiere a un XMRV aislado presente en un tumor de próstata de un individuo. En una realización particular, el XMRV es el virus xenotrópico humano (HXV). El individuo puede tener una mutación en el alelo del cáncer de próstata-1 hereditario (HPC1 ) que codifica un gen de ARNasa L. En una realización particular, la mutación es una mutación homocigota (por ejemplo homocigota para la mutación de ARNasa L R462Q). En una realización, el virus aislado comprende una secuencia de ácido nucleico que tiene al menos un 94% de identidad con la SEC ID N° 1 y un complemento de la misma. En una realización particular, el virus aislado comprende la SEC ID N° 1 o un complemento de la misma. En otra realización, la invención ser refiere a un virus aislado que comprende una secuencia de aminoácidos codificada por una secuencia de ácido nucleico que tiene al menos el 94% de identidad con la SEC ID N° 1. Por ejemplo, el virus aislado puede comprender una secuencia de aminoácidos codificada por la SEC ID NY . La presente invención también se refiere a péptidos aislados. En una realización, la invención se refiere a un virus aislado que comprende la SEC ID N° 2. En realizaciones particulares, el péptido aislado comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 97% de similitud con la SEC ID N° 3, una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 97% de similitud con la SEC ID N° 4 y/o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 94% de similitud con la SEC ID N° 5. La presente invención también se refiere a un vector que comprende una o más de las secuencias de ácido nucleico descritas en este documento. La invención también se refiere a una célula que comprende los vectores. Además, la invención comprende métodos para producir XMRV. En una realización, el método comprende conservar una célula transfectada o infectada con XMRV. El método puede comprender además el aislamiento de XMRV producidos por la célula (por ejemplo, a partir de un sobrenadante celular). La presente invención también se refiere a un anticuerpo o un fragmento de unión antígeno del mismo que se une específicamente a un virus que comprende una secuencia de aminoácidos codificada por una secuencia de ácido nucleico que tiene al menos el 94% de identidad con la SEC ID N° 1. El anticuerpo o el fragmento de unión al antígeno puede unirse a un polipéptido gag (SEC ID N° 3), un péptido pro-pol (por ejemplo SEC ID N° 4) y/o un polipéptido env (por ejemplo SEC ID N° 5) del virus. La presente invención también se refiere a métodos para detectar XMRV.

En una realización, la detección del XMRV en un individuo indica que el individuo tiene cáncer o corre el riesgo de desarrollar cáncer (por ejemplo, cáncer de próstata). El método puede comprender la detección del XMRV en el individuo detectando una secuencia de ácido nucleico que codifica todo o parte del XMRV (por ejemplo una secuencia de ácido nucleico que tenga al menos un 94% de identidad con la SEC ID N° 1 o un complemento de la misma). Como alternativa, el método puede comprender y detectar el XMRV en el individuo detectando un polipéptido codificado por el XMRV (por ejemplo, un polipéptido gag, un polipéptido pol, un polipéptido env y combinaciones de los mismos). En otra realización, la invención se refiere a un medio para detectar XMRV en una muestra que comprende poner en contacto la muestra con una secuencia de ácido nucleico que hibride con toda o parte de una secuencia de ácido nucleico del XMRV en condiciones en las que pueda producirse un complejo de hibridación entre la secuencia de ácido nucleico y la secuencia de ácido nucleico del XMRV. Se determina si el complejo de hibridación está presente en la muestra, en la que si se detecta el complejo de hibridación, entonces el XMRV está en la muestra. En otra realización, la invención se refiere a un método para detectar XMRV en una muestra que comprende poner en contacto la muestra con un anticuerpo o un fragmento de unión al antígeno del mismo que se una específicamente a un polipéptido de XMRV en condiciones en las que pueda producirse un complejo entre el anticuerpo y el polipéptido de XMRV. Se determina si el complejo está presente en la muestra, en la que si se detecta el complejo, entonces el XMRV está en la muestra.

La presente invención también se refiere a un método para identificar un agente que inhiba un XMRV que comprende poner en contacto el XMRV con un agente a evaluar. Si se determina que XMRV se inhibe en presencia del agente, donde XMRV se inhibe en presencia del agente, entonces el agente inhibe a XMRV. En una realización particular, la actividad del XMRV en presencia del agente se determina midiendo la capacidad del XMRV para producir partículas retrovirales con actividad de transcriptasa inversa. La presente invención también se refiere a métodos para inducir una respuesta inmune a un XMRV en un individuo que lo necesita. El método puede comprender administrar al individuo una cantidad eficaz de un agente que induce una respuesta inmune al XMRV en el individuo después de la administración. El agente puede ser una sub-unidad de XMRV, un XMRV atenuado y combinaciones de los mismos. La presente invención también se refiere a un método para tratar cáncer, (por ejemplo, cáncer de próstata) en un individuo en el que el XMRV está presente en el individuo, tal como en un tumor, que comprende administrar al individuo una cantidad eficaz de un agente que inhiba al XMRV. La presente invención también se refiere a un método para detectar cáncer asintomático (de etapa temprana) (por ejemplo, cáncer prostético en etapas tempranas) en un individuo en el que el XMRV está presente en la próstata del individuo, que comprende detectar la presencia de un XMRV en el individuo, en el que la presencia del XMRV en el individuo es indicativa de cáncer de próstata en etapas tempranas en el individuo.

La presente invención también se refiere a un método para identificar un individuo que corre el riesgo de desarrollar cáncer (por ejemplo, cáncer de próstata) que comprende detectar la presencia de un XMRV en el individuo, en el que la presencia del XMRV en el individuo es indicativa de un individuo que corre riesgo de desarrollar cáncer de próstata. La invención también se refiere a kits para detectar la presencia de XMRV en una muestra. En una realización, el kit comprende un resto marcado que detecta a XMRV en una muestra (por ejemplo, una secuencia de ácidos nucleicos que hibride con toda o parte de una secuencia de ácido nucleico de XMRV; o un anticuerpo o un fragmento de unión al antígeno del mismo que se una específicamente al XMRV). BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La patente o solicitud contiene al menos un dibujo realizado en color. La oficina proporcionará copias de la publicación de esta patente o solicitud de patente con dibujos en color después de la petición y del pago de la tasa necesaria. La Figura 1 es una representación esquemática del papel del sistema 2-5 A/ARNasa L en la actividad antiviral de los interferones; 2'-PDE,2',5'-fosfodiesterasa; P'tasa, 5'-fosfatasa. La Figura 2 es un esquema que ilustra la mutación RNASEL en diferentes poblaciones de casos de cáncer de próstata alineada con el dominio estructura de ARNasa L; LHO, pérdida de heterocigosis (Carpten, J, et al., Nature Genetics 2002; 30:181-4; Rokman A., et al., Am J Hum Genet. 2002 mayo; 70(5): 1299-304; Rennert, H., ef al., Am J Hum Genet. 2002 oct; 71 (4): 981-4; Wang D., et al., Proc Natl Acad Sci USA. 2002 nov 26; 99(24): 15687-92; Casey G., et al., Nat Genet. 2002 dic; 32(4): 581-3; Xing Y., et al., Cáncer Res. 2003; 63(20): 6795-801 ). La Figura 3 es un esquema que ilustra la estructura genómica de HXV alineada con transcritos virales. La Figura 4 es un dendrograma de la relación entre HXV35 (indicada en el diagrama como "PCRV") y otros gammaretrovirus. La Figura 5 ilustra la estructura secundaria predicha del ARN genómico de HXV35 realizada usando MFOLD (Zuker M, et al., RNA, 1998, 4(6): 669-79, 1998). La Figura 6 es un gel de agarosa que muestra la presencia de ARN de HXV en tejido con cáncer de próstata humano de acuerdo con lo determinado por RTPCR. El bromuro de etidio tiñó el 1 % del gel de agarosa de electroforesis de los productos de RT-PCR. Se detectó un ARN de HXV como un producto de RT-PCR anidado en GAG en las muestras de ARN de la próstata VP 10 (pero no en VP 107 y VP 27), mientras que solamente se observaron productos de amplificación no específicos en las pistas anidadas en HEMI. Método: Se usaron un µg de ARN total tratado con ADNasa, 1 µl de cebador inverso (100 pmol) y 7,5 µl de H2O. La desnaturalización se realizó a 65°C durante 5 minutos y los cebadores se hibridaron a temperatura ambiente durante 5 minutos. Se añadieron diez µl de la mezcla de reacción (10 x tampón (Stratascript) 2 µl, dNTP 12,5 mM 0,8 µl, 3,2 µl de H2O, 2 µl de DTT 0,1 M y 2 µl de RT) y la muestra se incubó a 42°C durante una hora. Después se usaron dos µl de cada reacción de RT para sembrar las PCR. Todos los cebadores estaban a 100 pmol/µl. La receta de PCR para una reacción de 50 µl es como sigue: 10 x tampón de PCR (Stratascript) 5 µl, 2 µl de MgCI2 50 mM, 0,5 µl de cebador directo externo, 0,5 µl de cebador inverso externo, 0,5 µl de dNTP 25 mM (o 1 µl de 12,5 mM), 0,5 µl de Taq ADN polimerasa (5 U/µl Invitrogen Inc.), H2O hasta 50:l. Parámetros de PCR: Desnaturalización a 94°C durante 2 minutos, [94°C durante 45 segundos, hibridación del cebador externo durante 45 segundos, 72°C durante 1 ,5 minutos] x 30 ciclos, seguido de una etapa de elongación a 72°C durante 7 minutos. Se usó un µl de la PCR externa para sembrar a la PCR interna. Los parámetros de termociclado para la PCR interna eran exactamente que para la externa, con la excepción de las temperaturas de hibridación del cebador. Ld = ADN ladder, - = sin ADNc. La Figura 7 es un gel de agarosa que muestra la presencia de ARN relacionado con HXV en la línea celular LNCaP (clon R) de acuerdo con lo determinado por RT-PCR. El bromuro de etidio tiñó el 1 % de la electroforesis en gel de agarosa de los productos de RT-PCR. Se amplificó un µg de ARN total transcrito de forma inversa (tratado con ADNasa) de las líneas celulares de cáncer de próstata LNCaPR, PC3 y DU 145 y de la célula epitelial de próstata normal (PrEC) mediante RT-PCR usando cebadores específicos para la región viral env (parte superior) y GAPDH (parte inferior). Ld = ADN ladder, - sin ADNc, + con ADNc. o La Figura 8 muestra que las células LNCaP producen un virus relacionado con HXV de acuerdo con lo determinado por los ensayos de transcriptasa inversa.

La actividad de RT se observó en los medios de las células LNCaP infectadas con virus a los 2, 4 y 8 días de cultivo (doce horas de exposición). Los medios de los 2, 4 y 8 días se diluyeron a 1 :10 con medio recién preparado antes del ensayo RT. Se usaron reacciones simulacro que no contenían medios como control negativo. La Figura 9 muestra la presencia de virus en la línea celular LNCaP de acuerdo con lo determinado mediante hibridación de fluorescencia in situ. Los análisis FISH de citobloques preparados a partir de células LNCaPR (A), PC3 (B) y DU145 (C). La sonda FISH de virus se generó usando un segmento de 2,14 Kb del genoma env viral. (A) Se observaron señales verdes fluorescentes positivas en el citoplasma y en el núcleo de las células LNCaPR que indicaba el marcado del ARN y el ADN virales. (B) Ausencia de señal fluorescente en células PC3 y (C) células DU145. Método: Los portaobjetos sin parafina se rehidrataron a través de una serie de concentraciones decrecientes de etanol. El tejido rehidratado se sometió a recuperación de la diana (target retrieval) durante 40 minutos a aproximadamente 95°C, después se dejó enfriar a temperatura ambiente durante 20 minutos. El tejido se aclaró con H2O y después se aplicaron 300 µl de proteinasa K directamente a los portaobjetos durante 10 minutos a temperatura ambiente. El tejido se aclaró de nuevo con H2O y se deshidrató a través de concentraciones EtOH crecientes, y después se dejó secar al aire. Se aplicaron 10 µl de mezcla de sonda y los portaobjetos se taparon con cubres, se le retiraron las burbujas y se sellaron con rubber cement. La sonda y el ADN diana se co-desnaturalizaron a 73°C. La hibridación se produjo a 37°C durante una noche. Los portaobjetos se lavaron en condiciones rigurosas durante 3 segundos y se incubaron durante 1 minuto en un lavado con 2 x SSC a 57°C. Después se aclararon los portaobjetos con 2 x SSC. Se aplicó la contratinción con medio de montaje de Vectashield y DAPI (Vectashield Inc.) y se dejó incubar a los portaobjetos en la oscuridad a temperatura ambiente durante al menos 30 minutos para permitir que el DAPI se uniera completamente con el ácido nucleico para una vísualización nuclear más clara. AZUL: DAPI, VERDE: Virus. La Figura 10 muestra la presencia de ADN viral en un tejido con cáncer de próstata humano. Microscopía de fluorescencia confocal o FISH en TMA de cáncer de próstata humano de dos pacientes mutantes para ARNasa L homocigotos diferentes (A) Paciente VP29, (B, C, D) Paciente VP62. Método: Los portaobjetos con TMA de cáncer de próstata humano sin parafina se rehidrataron a través de una serie de concentraciones decrecientes de EtOH. El tejido rehidratado se sometió a recuperación de la diana durante 40 minutos a aproximadamente 95°C, después se le dejó enfriar a temperatura ambiente durante 20 minutos. El tejido se aclaró con H2O y después se aplicaron 300 µl de proteinasa K directamente a los portaobjetos durante 10 minutos a temperatura ambiente. El tejido se aclaró de nuevo con H2O y se deshidrató a través de concentraciones crecientes de etanol, y después se dejó secar al aire. Se aplicaron 10 µl de mezcla de sonda y los portaobjetos se taparon con cubres, se les retiraron las burbujas y se sellaron con goma rubber cement. La sonda y el ADN diana se co-desnaturalizaron a 73°C. La hibridación se produjo a 37°C durante una noche. Los portaobjetos se lavaron rigurosamente durante 3 segundos, y se incubaron durante 1 minuto en un lavado de 2 x SSC a 57°C. Después se aclararon los portaobjetos con 2 x SSC. Se aplicó la contratinción de medio de montaje de Vectashield con DAPI (Vectashield Inc.) y se dejó incubar a los portaobjetos en la oscuridad a temperatura ambiente durante al menos 30 minutos para permitir que el DAPI se uniera completamente a los ácidos nucleicos para una visualización nuclear más clara. AZUL: DAPI, VERDE: Virus. La Figura 1 1 muestra las secuencias de aminoácidos del péptido gag de HXV35 (SEC ID N° 3), los péptidos gag de HXV (SEC ID N° 7, 8, 9) usados para generar anticuerpo en conejos y un esquema de hidropatía generado a partir de la proteína gag de HXV35. La Figura 12 muestra transferencias de western que usan anticuerpos (A) anti-NC, y (B) anti-MA en proteínas diferentes de células (pista 1 ) LNCaPR, (pista 2) PC3, y (pista 3) DU145. La Figura 13 muestra la secuencia de aminoácidos de HXV35 (SEC ID N° 2). La Figura 14 muestra la secuencia de aminoácidos del péptido gag de HXV35 (SEC ID N° 3). La Figura 15 muestra la secuencia de aminoácidos del péptido pro-pol de HXV35 (SEC ID N° 4). La Figura 16 muestra la secuencia de aminoácidos del péptido env de HXV35 (SEC ID N° 5). La Figura 17 es una secuencia de nucleótidos parcial de una secuencia viral de HXV-LNCaP, obtenido como un producto de RTPCR de ARN (7084-7750 pb) (SEC ID N° 6) y que tiene un 97% de identidad con la secuencia de nucleótidos env de HXV35 y tiene un 97,6% de similitud con la secuencias de aminoácidos de env de HXV35, lo que indica que la XHV-LNCaP y la HXV35 son variantes del mismo virus. Las Figuras 18A-18D muestran el análisis inmunohistoquímico de la próstata del paciente VP62 que indica que las próstatas homocigotos para R462Q ARNasa L son positivas para XMRV mediante FISH. Figuras 18A-18D, panel izquierdo inmunohistoquímica (IHC) (rojo) con un cóctel de anticuerpo monoclonal de ratón anticitoqueratina AEI/AE3 (20:1 mezcla de AE1 con respecto a AE3) de Roche. El anticuerpo AE1 antiqueratina reconoce las queratinas de 56,5, 50, 50', 48 y 40 kDa de las subfamilia acida. El anticuerpo AE3 antiqueratina reconoce los 6 miembros de la subfamilia básica. La IHC (rojo) marca las células epiteliales de la próstata. La marca verde es FISH para la sonda env de HXV35 como se describe en la leyenda de la Figura 9. El azul es la tinción con DAPI de los núcleos. Figuras 18A-18D, panel derecho. Tinción de hematoxilina y eosina. Figura 19 análisis inmunohistoquímico de LNCaP, clon R, que muestra que el clon R de LNCaP es XMRV positivo por IHC con un anticuerpo para la cápsida de p30. Figura 19 panel izquierdo. Inmunohistoquímica con antisuero específico preparado en cabras para la proteína p30 del virus de la leucemia de ratón de Rauscher (ATCC, N° de catálogo VR-1564AS-Gt) que muestra el marcado de la proteína gag de HXV más la tinción de DAPI (azul) de los núcleos. Panel derecho: tinción de DAPI de los núcleos.

La Figura 20 muestra el doble marcado mediante IHC y FISH de XHV en células LNCaP infectadas que muestra que el clon R de LNCaP es positivo para XMRV en FISH e IHC. La inmunohistoquímica con antisuero específico preparado en cabras para la proteína p30 del virus de la leucemia de ratón de Rauscher (ATCC, N° de catálogo, VR-1564AS-Gt) muestra el marcado de la proteína gag de HXV más la tinción de DAPI (azul) de los núcleos más el marcado mediante FISH (verde) del ácido nucleico de los virus como se describe en la Figura 18A-18D. La Figura 21 muestra los resultados de un ensayo de transcriptasa inversa que demuestra que el virus (XMRV-LN) producido por células LNCaP es infeccioso cuando se usa para infectar células con cáncer de próstata humanas de DU145. Las células DU145 se infectaron con 500 µl de sobrenadante infectado de LNCaP durante 3 horas en presencia de 8 µg/ml de polibreno, -FBS. El virus se controlaba mediante el ensayo de transcriptasa inversa. Figuras 22A-22B muestra la detección de XMRV mediante microseries de ADN y RT-PCR. La Figura 22A muestra patrones de hibridación Virochip obtenidos de muestras tumorales de 19 pacientes. Las muestras (eje de las x) y los 502 oligonucleótidos retrovirales presentes en la microserie (eje de las y) se agruparon usando una agrupación jerárquica. La barra de colores indica el intervalo de intensidades de hibridación observadas. La vista aumentada muestra el grupo seleccionado que contiene oligonucleótidos con la señal positiva más fuerte. Las muestras de pacientes con el genotipo QQ RNASEL se muestran en rojo y las de individuos RQ y RR así como las de los controles en negro. La Figura 22B muestra los resultados de RT-PCR anidada específica para el gen gag de XMRV. Los fragmentos de gag amplificados por PCR junto con los controles de amplificación de GAPDH humanos correspondientes se separaron mediante electroforesis en gel usando el mismo orden de pistas que en el grupo de microseries. Las Figuras 23A-23C muestran el genoma completo de XMRV. La Figura 23A es un mapa esquemático del genoma de XMRV 8185. Las regiones LTR (R, U5, U3) se indican mediante cajas. Los marcos de lectura abiertos predichos que codifican las poliproteínas Gag, Gag-Pro-Pol, y Env se marcan en verde. Los codones de inicio y de terminación correspondientes (AUG, UAG, UGA, UAA) así como el codón de inicio Gag alternativo (CUG) se muestran junto con sus posiciones en el nucleótido. Análogamente, se muestran también los sitios del donante (SD) y del aceptor (SA) de corte y empalme y corresponden al ARN genómico de Env de 3,2 kb cortado y empalmado (línea quebrada). La Figura 23B muestra la clonación y secuenciación del genoma de XMRV VP35. Los clones obtenidos mediante la recuperación de la sonda de oligonucleótidos de la microserie de hibridación (barras azules) o por PCR de ADNc tumoral (barras negras) se secuenciaron. Los cebadores usados para amplificar los clones individuales (Tabla 10) se obtuvieron del genoma de MTCR (flechas negras) o solapando clones de VP35 (flechas azules). La Figura 23C muestra diagramas de similitud de la secuencia genómica que comparan XMRV VP35 con XMRV VP42, MuLV DG-75 y MTCR. Los alineamientos por parejas se realizaron usando AVID (Bray, N., er al., Genome, Res., 13:97-102 (2003)), y los diagramas se generaron usando mVISTA (Frazer, KA, eí al., Nucleic Acids Res., 32: W273-279 (2004)) con el tamaño de ventana por defecto de 100 nucleótidos. La escala del eje de las Y representa el porcentaje de identidades de nucleótidos del 50 al 100%. La Figura 24 muestra el análisis filogenético de XMRV en base a las secuencias genómicas completas. Genomas completos de XMRV VP35 y VP42; MTCR; MuLV DG-75, MCF1233, Akv, Moloney, Friend y Rauscher; virus de la leucemia felina (FLV); retrovirus Koala (KoRV); y virus de la leucemia de Gibones (GALV) se alinearon usando ClustalX (véase materiales y métodos). Se generó un árbol filogenético sin raíz común usando este alineamiento, excluyendo los huecos y usando la corrección de Kimura para sustituciones de múltiples bases. Valores Bootstrap (N = 1000 ensayos) también se indican. Los genomas de MuLV se marcan como xenotrópicos (X), politrópicos (P) o ecotrópicos (E) en base a las pruebas experimentales publicadas (Raisch KP, eí al., Virology 308: 83-91 ; O'Neill RR., eí al., J. Virol. 53: 100-106; Perryman S., eí al., Nucleic Acids Res 19: 6950; Shinnick TM., eí al., Nature 293: 543-548; Sijts EJ., eí al., Virus Res 34: 339-349; Khimani AH., eí al., Virology 238: 64-67; Lenz J., eí al., J. Virol 42: 519-529). La Figura 25 muestra el alineamiento de secuencias múltiples de secuencias de proteínas de XMRV y de MuLV relacionados que abarcan regiones variables de la glicoproteína SU (VRA y VRB) conocidas para determinar la especificidad del receptor (Batín JL., eí al., J Virol 66: 1468-1475; Tailor CS., eí al., Immunol 281: 29-106). Las secuencias de proteína Env de XMRV VP35 (SEC ID N° 10) y VP42 (SEC ID N° 1 1 ), MTCR (SEC ID N° 14), MuLV DG-75 (SEC ID N° 12), NZB-9-1 (SEC ID N° 13), MCF1233 (SEC ID N° 15), Akv (SEC ID N° 19), Moloney (SEC ID N° 18), Friend (SEC ID N° 16) y Rauscher (SEC ID N° 17) se alinearon usando ClustalX con los ajustes por defecto. Las secuencias se marcan como xenotrópicas (X), politrópicas (P) o ecotrópicas (E) en base a pruebas experimentales publicadas (Raisch KP., eí al., Virology 308: 83-91 ; O'Neill RR., eí al., J. Virol. 53: 100-106; Perryman S., et al., Nucleic Acids Res 19: 6950; Shinnick TM., eí al., Nature 293: 543-548; Sijts EJ., eí al., Virus Res 34: 339-349; Khimani AH., eí al., Virology 238: 64-67; Lenz J., eí al., J. Virol 42: 519-529). Las regiones variables VRA y VRB se muestran en forma de cajas. Las posiciones de los nucleótidos a la derecha del alineamiento se refieren al codón de inicio de Env. La Figura 26 muestra el alineamiento de secuencias múltiples de secuencias nucleótido líder gag de 5' de XMRV y de MuLV relacionados. Las secuencias que se extienden desde el codón de inicio CUG alternativo al codón de inicio AUG de gag obtenido de XMRV VP35 (SEC ID N° 20) y VP42 (SEC ID N° 21 ); MTCR (SEC ID N° 22), MuLV DG-75 (SEC ID N° 24), MCF1233, (SEC ID N° 23) y Friend (SEC ID N° 25) se alinearon con ClustalX usando los ajustes por defecto. La traducción de aminoácidos predicha correspondiente a la secuencia VP35 se muestra por encima del alineamiento; "*" indica una terminación. Las posiciones de nucleótidos a la derecha del alineamiento se refieren a la C del codón de inicio CUG alternativo. Las Figuras 27A-27B muestran una comparación de secuencias de XMRV obtenidas de muestras de tumores de diferentes pacientes. La Figura 27A muestra un árbol filogenético basado en el fragmento de RT-PCR de gag de XMRV de 380 nucleótidos de las 9 muestras de tumores positivos y la secuencia correspondiente de MTCR; y MuLV DG-75, MCF1233, Akv, Moloney, Rauscher y Friend. Las secuencias se alinearon usando ClustalX, y el árbol correspondiente se generó usando el método del vecino más próximo (véase materiales y métodos). Los fragmentos de XMRV de muestras tumorales se indican en rojo. La Figura 27B muestra un árbol filogenético basado en un fragmento de PCR de Pol de 2500 nucleótidos de las 9 muestras tumorales positivas de XMRV. Los fragmentos de PCR se obtuvieron usando ADNc amplificado como plantilla. El árbol se construyó como se describe en la Figura 27A. Las Figuras 28A-28B muestran la secuencia de nucleótidos completa de XMRV VP35 (SEC ID N° 26). Los números a la izquierda indican los coordinados de nucleótidos en relación con el primer nucleótido. Los marcos de lectura abiertos predichos para poliproteínas Gag (SEC ID N° 27); Gag-Pro-Pol (SEC ID N° 28) y Env (SEC ID N° 29) se muestran por debajo de los nucleótidos correspondientes. La deleción de 24-nucleótidos característica en la secuencia líder gag-5' se indica con un triángulo. Otros elementos del genoma así como los cebadores usados en la RT-PCR de gag anidados se muestran como flechas. Figuras 29A-29B muestran el análisis filogenético de XMRV en base a poliproteínas Gag-Pro-Pol (Figura 29A) y Env (Figura 29B) predichas. Las secuencias predichas de Gag-Pro-Pol y Env de XMRV VP35 y VP42 así como las secuencias correspondientes de MTCR; MuLV DG-75, MCF1233, Akv, Moloney, Friend y Rauscher; virus de la leucemia felina (FLV); retrovirus Koala (KoRV); y virus de la leucemia de Gibones (GALV) se alinearon usando ClustalX. Los alineamientos resultantes se usaron para generar árboles filogenéticos sin raíz común (véase Ejemplo 2, Materiales y Métodos). Se indican los valores Bootstrap (N = 1000 ensayos). La Figura 30 muestra la presencia del ácido nucleico de XMRV en tejidos prostéticos determinados mediante FISH. El tejido protático de casos de cáncer de próstata VP62 (paneles A a C) y VP88 (paneles D a F) se visualizaron mediante tinción de H&E (izquierda) después de sondearlos con sondas de ADN de XMRV-35 marcadas con SpectrumGreenTM (aumentos a la derecha). Los núcleos se contratiñeron con DAPI en paneles de FISH. Las flechas en las fotografías de H&E indican células FISH positivas. Las barras que se muestran en los paneles son de 10 µm. Los aumentos son capturas de imágenes con un objetivo 63X 1 ,4 N.A. con zoom 2. La Figura 31 muestra la caracterización de células del estroma prostático infectadas con XMRV mediante FISH y FISH/inmunofluorescecia concomitantes. Usando una microserie de tejido, se analizó tejido prostático del caso del cáncer de próstata VP62 analizado mediante FISH con sondas XMRV-35 (verde) (paneles A y C) y la tinción H&E correspondientes (paneles B y D), respectivamente. Las cabezas de las flechas indican células FISH positivas. La imágenes aumentadas (a la derecha) son células FISH positivas (flechas) capturadas como se describe en la leyenda de la Figura 30. La célula FISH positiva en los paneles A y B es un fibroblasto del estroma; en los paneles C y D es una figura mitótica en una célula del estroma y en E y F un elemento hematopoyético del estroma. (Panel E) tinción concomitante de XMRV mediante FISH (verde) y citoqueratina AE1/AE3 mediante o inmunofluorescencia (rojo). Las barras que se muestran en los paneles son de 10 µm. La Figura 32 muestra un FISH de tejido prostático en el caso VP88 con sondas XMRV-35 (verde) (panel A) y sondas de control (rojo y verde) específicas para dos brazos del cromosoma 1 (panel B) (Ejemplo 3, Materiales y Métodos).

Las barras que se muestran en los paneles son de 10 µm. Los aumentos se realizaron como se describe en la leyenda de la Figura 31 . La Figura 33 muestra la presencia de proteína Gag en tejidos de la próstata. Se realizó IHC con anticuerpo monoclonal para Gag p30 de SFFV en tejido prostático de los casos VP62 (paneles A a D), VP88 (paneles E a H), y VP51 (paneles I, J). La visualización de la imagen del cromosoma bifuncional que indicaba la proteína Gag mediante inmunofluorescencia (paneles A, B, E, F y aumentos [derecha]) y un campo brillante (paneles C, D, G, H y aumentos [derecha]) se detecta mediante tinción citoplasmática granular (rojo) en células del estroma de los casos VP62 y VP88 con ARNasa L homocigotas para 462Q, pero no en el caso VP51 ARNasa L homocigota para 462R (paneles I y J). Las células positivas en G y H son linfocitos del estroma. Las barras en los paneles A, B e I eran de 5 µm y en los paneles E y F eran de 10 µm. Los aumentos se realizaron como se describe en la leyenda de la Figura 31 . Las Figuras 34A-34D muestran lo siguiente. La Figura 34A muestra resultados de RT-PCR que indican la presencia de gammaretrovirus en células LNCaP-R. Los amplicones de PCR para la región env-LTR de 700 pb se separan en un gel de agarosa al 1 % teñido con bromuro de etidio. Las líneas celulares de próstata se usaron como se indica en la parte superior. Se incluye RT-PCR de los ocho exones del ARNm de GAPDH humano para comparación. La Figura 34B muestra el análisis filogenético de XMRV LNCaP-R en base a secuencias genómicas completas. Los genomas completos de XMRV LNCaP-R, XMRV VP35 Y VP42 (Urisman A., eí al., PLOS Pathogens; MTCR; MuLV DG-75, MCF1233, Akv, Moloney, Friend, y Rauscher; virus de la leucemia felina (FLV), retrovirus Koala (KoRV), y virus de la leucemia de gibones (GALV) se alinearon con ClustalX usando ajustes por defecto. Se generó un árbol filogenético sin raíz común (véase materiales y métodos) en base al alineamiento. Se indican los valores Bootstrap (N = 1000 ensayos). Los genomas de MuLV se marcaron como xenotrópicos (X), politrópicos (P) o ecotrópicos (E). La Figura 34C muestra el alineamiento de secuencias múltiples de las secuencias de nucleótidos líderes gag 5' de XMRV LNCaP-RV y MuLV relacionados. Usando los ajustes por defecto del ClustalX (ejemplo 3, Materiales y Métodos) se alinearon secuencias que se prolongan desde el codón de inicio CUG alternativo hasta el codón de inicio AUG de gag obtenido de XMRV-LNCaP RV (SEC ID N° :30), XMRV-VP35 (SEC ID N°: 20) y VP42 (SEC ID N° :21 ), MTCR (SEC ID N°: 22), MuLV DG-75 (SEC ID N°: 24), MCF1233 (SEC ID N°: 23) y MuLV Friend (SEC ID N°: 25). Las posiciones de los nucleótidos a la derecha del alineamiento están en relación con la primera posición del codón de inicio CUG alternativo. "*" por encima de las secuencias de nucleótidos alineadas indica un codón de terminación. La Figura 34D muestra diagramas de similitud de la secuencia genómica que comparan XMRV VP-35, MTCR, MCF1233, y MuLV DG-75 en relación con XMRV LNCaP RV. Los alineamientos se crearon usando AVID (Bray N., eí al., Genome Res 13: 97-102). Los diagramas se visualizaron usando VISTA (Frazer KA., eí al., Nucleic Acids Res 32: W273-279) con el tamaño de ventana por defecto de 100 nucleótidos. La escala del eje de las X representa el porcentaje de identidades de nucleótidos desde el 50 al 100%. Los diagramas de similitud han demostrado su relación con los marcos de lectura abiertos predichos para XMRV LNCaP-R, que se representan como barras negras. Las Figuras 35A-35C muestran lo siguiente. La Figura 35A es un mapa esquemático del genoma de XMRV LNCaP RV de 8185 nucleótidos. Las regiones LTR (R, U5, U3) se indican mediante cajas abiertas. Los marcos de lectura abiertos predichos que codifican poliproteínas Gag, Gag-Pro-Pol y Env se marcan en verde. Las posiciones de los nucleótidos de los codones de inicio y terminación correspondientes ((AUG, UAG, UGA, UAA) así como el codón de inicio Gag alternativo (CUG) también se indican. Análogamente, las posiciones de los nucleótidos del donante (SD) y del aceptor (SA) de corte y empalme correspondientes a los sitios del ARN subgenómico de Env cortados de 3,2 Kb también se muestran. Las sondas de transferencia de Northern usadas (Figura 35B) se representan como barras negras en relación con la posición en el genoma. La Figura 35B muestra la presencia de transcritos virales en la línea celular de LNCaP-R mediante análisis de transferencia de Northern. El ARN total aislado de las líneas celulares LNCaP-R, Raji, NIH3T3 y DU145 se separó en una gel de agarosa formaldehído al 1 ,2%, transferido y sondeado con ADN radiomarcado correspondiente a las posiciones de nucleótidos 7780-7991 dentro de la región LTR (izquierda). La posición del mensaje de longitud completa y del mensaje cortado se representa con una flecha. La transferencia se dividió en bandas (Materiales y Métodos) y se sondeó de nuevo usando una sonda XMRV VP35 Gag radiomarcada (posiciones 603-957) capaz de detectar solamente el transcrito de longitud completa (derecha). Los marcadores de tamaño a la izquierda indican los tamaños del ARN ribosómico 18S (1 ,9 Kb) y el ARN 28S (5 Kb) humanos. La Figura 35C muestra la exploración de la presencia de LNCaP-RV en diferentes líneas celulares por afinidad por el anticuerpo policlonal purificado contra un péptido Gag (NC) de XMRV VP-35 (rojo) en células LNCap-R, LNCaP-FGC, DU145 y PC3 (como se ha indicado). Los núcleos se contratiñeron usando DAPI. Las imágenes de inmunofluorescencia se capturaron usando un filtro de Rojo Tejas; la barra que se muestra en el panel es de 30 µm. Las Figuras 36A-36C muestran lo siguiente. La Figura 36A muestra sitios de integración virales en la línea celular LNCaP-R. La transferencia de Southern del ADN genómico aislado de las líneas celulares humanas LNCaP-R, LNCaP-FCG, DU145, y de la línea celular de ratón NIH3T3 digeridas con Pstl y sondeadas con una sonda radiomarcada obtenida de la región U3 LTR XMRV- VP35 (posiciones de nucleótidos 7780-7991 ). Las posiciones de los marcadores de peso molecular separados en un gel de agarosa al 0,8% se indican a la derecha. Múltiples sitios de integración dentro del ADN de las células LNCaP-R se señalan con flechas a la izquierda. La Figura 36B muestra la tinción con bromuro de etidio del ADN genómico digerido con Pstl (en la Figura 36A) muestra las cantidades relativas de ADN genómico cargado. La Figura 36C muestra las secuencias de tres sitios de integración de XMRV LNCaP-R diferentes (SEC ID N°: 31 , 32, 33). Los sitios se determinaron mediante una técnica de PCR mediada por el enlazador modificado (véase el Ejemplo 3, Materiales y Métodos). Las secuencias virales se encuentran en cajas; por encima de las posiciones cromosómicas de cada secuencia se indican los sitios de integración correspondientes. Las Figuras 37A-37C muestran que el XMRV LNCaP-R es un virus infeccioso. Las células LNCaP-FCG se infectaron de forma simulada (Virus -) o se infectaron con LNCaP-RP (Virus +) (Ejemplo 3, Materiales y Métodos). La Figura 37A muestra análisis de transcriptasa inversa usando sobrenadantes celulares que se realizaron por duplicado (Virus -) o por cuadruplicado (Virus +) en los momentos indicados después de la infección. La autoradiografía de los ensayos de transcriptasa inversa centrados en DEAE se muestran a la izquierda. La cuantificación de la actividad de transcriptasa inversa mediante análisis de láser de barrido (phosphorimage) se muestra a la izquierda. La Figura 37C muestra el análisis de Transferencia de Northern de las líneas celulares infectadas con simulacro (-) o con LNCaP-RV (+) 24 horas después de la infección. El ARN total se extrajo, se separó en un gel de formaldehído al 1 ,2%, se transfirió y se sondeo con una sonda XMRV VP35 LTR radiomarcada (posiciones 7780-7991 ). Los marcadores de tamaño a la izquierda indican los tamaños del ARN ribosómico 18S (1 ,9 Kb) y el ARN ribosómico 18S (5 Kb) humanos. La Figura 37C muestra el análisis de Transferencia de Southern de las líneas celulares infectadas con simulacro (-) o con LNCaP-RV (+) 36 horas después de la infección. El ADN genómico de células infectadas LNCaP-FGC y DU145 o de células infectadas con simulacro se extrajo (véase el Ejemplo 3, Materiales y Métodos), se digirió con Pstl, se separó en un gel de agarosa al 0,8%, se transfirió y se sondeó con una sonda XMRV VP35 U3 LTR radiomarcada (posiciones 7780-7991 ). Numerosos sucesos de integración de novo, se indican mediante corchetes a la izquierda. Se usó ADN genómico de NIH3T3 como control positivo. Los marcadores de peso molecular se muestran a la derecha. DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN. Como se describe en este documento, se investigó el papel de la enzima antiviral ARNasa L en la biología del tumor de próstata. Se realizó un estudio clínico en el que 150 pacientes con cáncer de próstata a la espera de prostatectomías se genotiparon para la mutación genética más común en ARNasa L (R462Q). El ARN aislado de los tejidos prostéticos se procesó para su análisis en Virochips, una microserie exhaustiva de ADN de las secuencias virales. Se identificó y se clonó un nuevo gammaretrovirus relacionado con las cepas xenotrópicas del virus de la leucemia de ratón (denominado en este documento virus relacionado (XMRV) con el virus de la leucemia de ratón xenotrópico (MLV), para pacientes homocigotos para la mutación de ARNasa L. En una realización particular, el XMRV es el virus xenotrópico humano (HXV). La infección por HXV de la próstata era común en pacientes homocigotos para la mutación R462Q de ARNasa L (una incidencia de aproximadamente el 60%), pero relativamente infrecuente en pacientes heterocigotos y homocigotos de tipo silvestre (incidencia del 10% o menos). Los métodos in situ confirmaron la presencia de ácido nucleico de HXV en las próstatas. Por consiguiente, la presente invención posibilita el aislamiento de secuencias de ácido nucleico que codifican polipéptidos aislados de XMRV que comprenden secuencias de aminoácidos de XMRV; vectores que comprenden las secuencias de ácido nucleico virales, células que comprenden los vectores; anticuerpos y fragmentos de unión al antígeno de los mismos que tienen especificad de unión para XMRV; métodos para producir XMRV; métodos para detectar o seleccionar XMRV (por ejemplo, en un individuo); métodos para identificar agentes que inhiben a XMRV; métodos para inducir una respuesta inmune a XMRV; métodos para tratar enfermedades asociadas con la presencia de XMRV (por ejemplo, cáncer tal como cáncer de próstata); métodos para detectar cáncer asintomático (por ejemplo, cáncer de próstata); métodos para identificar un individuo que corre el riesgo de desarrollar cáncer (por ejemplo, cáncer de próstata) y kits para detectar el XMRV. El carcinoma de la próstata es la segunda causa principal de muertes por cáncer en hombres de Estados Unidos y el cáncer visceral más frecuente (Kumar, V., eí al., Basic Pathology, 6a ed., págs. 584-588, W.B. Saunders Co., Philadelphia). Entre las poblaciones de Estados Unidos, los afroamericanos corren el mayor riesgo. La American Cáncer Society (Asociación Americana del Cáncer) estimó que en los Estados Unidos en 2003 se produjeron aproximadamente 190.000 nuevos casos y 30.000 muertes por cáncer de próstata. Los factores de riesgo genéticos relacionados con la edad, hormonales y medioambientales juegan papeles en la patogénesis del cáncer de próstata (Nelson WG., eí al., N Engl J Med, 349(4): 366-81 , 2003). Sorprendentemente, los hombres con tres o más parientes de primer grado con cáncer de próstata corres un riesgo 1 1 veces mayor en comparación con hombres que no tengan historial familiar de la enfermedad (Steinberg GD., eí al., Prostate, 77(4): 377-47, 1990). Los análisis de segregación apoyan la existencia de un gen autosómico dominante raro, de alta penetración en el cáncer de próstata hereditario (HPC) con aparición temprana (Cárter BS., eí al., Proc. Natl Acad Sci, 89(8): 3367-71 , 1992). Se ha predicho que varios genes diferentes de HPC suponen de forma colectiva aproximadamente el 43% de la enfermedad de aparición temprana (menos de o igual a 55 años) de todos los casos de cáncer de próstata. Se cree que estos genes de susceptibilidad al cáncer de próstata hereditario funcionan en una etapa temprana en la patogénesis molecular del cáncer de próstata, durante la progresión del epitelio de la próstata normal a la atrofia inflamatoria proliferativa (PÍA) (Nelson WG., et al,. N Engl J Med, 349(4): 366-18, 2003). Se sospecha que las infecciones microbianas crónicas o recurrentes son sucesos que inician la PÍA. Las lesiones por PÍA, a su vez, pueden ser precursoras de la neoplasia intraepitelial de la próstata (PIN) y, después de varios años, conducir al carcinoma manifiesto y finalmente al cáncer metastásico. Se ha sugerido que la próstata es un órgano residente para múltiples infecciones víricas incluyendo el poliomavirus BK humano (Das D., eí al., Oncogene, 23(42): 7031 -46, 2004) y el HPV (Zambrano A., eí al., Prostate, 53(4): 263-76, 2002). Además, un gran estudio de casos y controles mostró una asociación entre la frecuencia del cáncer de próstata y un historial de enfermedades de transmisión sexual (Haydes RB., eí al., BR J Cáncer, 82(3): 718-25, 2000). Curiosamente, cinco alelos candidatos de susceptibilidad de cáncer de próstata funcionan en procesos de inmunidad y/e inflamación (HPC1/RNASEL, TLR4, MIC-1, MSR-1 y PON1) (Carpten, J., eí al., Nature Genetics 30: 181-4, 2002; Zheng SL., eí al., Cáncer Res. 64(8): 2918-22, 2004; Lindmark F., eí al., J Natl Cáncer Inst. 96(16): 1248-54, 2004; Xu, J., eí al., Nat. Genet. 32(2): 321 -5, 2002, Marchesani M., et al., J Nat Cáncer Inst. 95(1 1 ): 812-8, 2003). HPC1, el prototipo de la familia génica, se vinculó al cromosoma 1q24-25 en 1996 (Smith et al., 1996) y al gen RNASEL en 1q25 en 2002 (Carpten, J., et al., Nature Genetics 30: 181 -4, 2002). HPCI/RNASEL codifica una nucleasa regulada, ARNasa L, que funciona en la respuesta antiviral de interferón (IFN) (Clemens MJ, eí ai, Cell 13(3): 565-72, 1979; Zhou A., eí al., Cell 72(5): 753-65, 1993; Hassel BA, eí al., EMBO J. 12(8): 3297-304, 1993). El tratamiento con IFN de células induce una familia de 2-5 sintetasas que se estimulan mediante un ARN de doble cadena para convertir ATP en PPi y una serie de oligoadenilatos cortos de 2' a 5', denominados colectivamente 2-5A (Kerr IM, eí al., Proc Natl Acad Sci USA.75 (1 ): 25660, 1978). La única función bien establecida de 2-5A es la activación de la ARNasa L que conduce a la inhibición de la replicación de algunos virus, incluyendo Coxsackievirus (Flodstrom-Tullberg, M., et al., J. Immunol., 174, 1 171-1 177, 2005). Después de la unión de 2-5A, la ARNasa L se convierte de monómeros inactivos en dímeros activos (Dong B., eí al., J. Biol Chem. 270(8): 4133-7), 1995). La activación prolongada de la ARNasa L mediante 2-5A conduce a la escisión de ARN R de 28S y 18S y la apoptosis dependiente de caspasa (Rusch L, eí al., J Interíereon Cytokine Res. 20(12): 1091-100, 2000). La apoptosis mediada por ARNasa L se acompaña con la liberación del citocromo C de las mitocrondias y requiere actividad de JNK y de caspasa-3 (lordanov MS, eí al., Mol Cell Biol. 20(2): 617-26, 2000); Li G., eí al., J Biol Chem. 279(2): 1 123-31 , 2004; Malathi K., eí al., Cáncer Res. 64(24): 9144-51 , 2004). Anteriormente se ha demostrado que la activación de ARNasa L por 2-5A conduce a la apoptosis de líneas celulares de cáncer de próstata de etapa tardía, mientras que las mutaciones de origen natural en el gen RNASEL permiten la supervivencia celular (Nang Y., eí al., Cáncer Res. 63(20): 6795-801 , 2003). La implicación de RNASEUHPC1 en el cáncer de próstata hereditario está apoyada por la identificación y la asociación de diferentes mutaciones (M1 I, E265X, 471 ) AAAG, & R462Q) con la aparición y/o la frecuencia de la enfermedad (Carpten, eí ai, Nature Genetics 30: 181 -4, 2002; Rokman A., eí ai, Am J Hum Genet. 70(5): 1299-304, 2002; Rennert H.f eí ai, Am J Hum Genet. 71(4): 981-4, 2002; Casey, G., eí ai, Nat Genet. 32(4): 581-3, 2002; Silverman, R H, Biochemistry 72, 25; 42(7): 1805-12., 2003) (FIG 2). Los datos funcionales o epidemiológicos del papel de RNASEL en HPC se han observado en la mayoría pero no en todos los estudios (Doping SR., eí ai, Clin Prostate Cáncer 2: 177-80, 2003; Kotar K, eí ai., J Med Genet 40: e22, 2003). Recientemente se ha descubierto que la variante R462q de RNASEL está implicada en casos de cáncer de próstata no selectivos (incluyendo familiares y no familiares) (Casey G., eí ai, Nat Genet. 32(4): 581-3, 2002). Curiosamente, la variante R462Q de la ARNasa L tenía una actividad aproximadamente 3 veces menor in vitro. La actividad ribonucleasa reducida de la ARNasa L R462Q se debe a la capacidad disminuida para dimerizar a la forma activa de la enzima (Xiang Y, eí ai, Cáncer Res. 63(20): 6795-80, 2003). Se realizó un amplio estudio sobre ADN aislado de 423 casos de cáncer de próstata no seleccionados y 454 controles no afectados (Casey G., eí ai, Nat Genet. 32(4): 581 -3, 2002). Se observó una asociación significativa de la variante R462Q con los casos (P = 0,01 1 ). Las proporciones irregulares indicaban que llevar una copia del gen variante R462Q aumentaba el riesgo de cáncer de próstata en aproximadamente 1 ,5 veces, mientras que la posesión de dos alelos variantes doblaba el riesgo. Por otro lado, otra variante de ARNasa L, D541 E, no se asociaba con el riesgo aumentado del cáncer de próstata y no afectaba a la actividad de ARNasa L. Los resultados implicaban a R462Q en hasta el 13% de los casos, lo que le convertiría en el marcador genético más prevalente del cáncer de próstata (y posiblemente de cualquiera de los cánceres comunes). Por lo tanto, R462Q, podría ser un importante marcador de riesgo para el cáncer de próstata en la población masculina en general. Como se describe en este documento, se identificaron virus en próstata con tumores y se compararon con la frecuencia de los virus en hombres con diferentes genotipos de RNASEL. Como las mutaciones de inactivación en ARNasa L son relativamente raras, los estudios se centraron en la variante R462Q. Los métodos de detección de virus tradicionales tienen varias desventajas incluyendo la incapacidad de algunos virus para crecer en el cultivo celular, los límites de la cantidad de secuencias de ADN que pueden amplificarse simultáneamente mediante múltiples PCR, la disponibilidad de los anticuerpos y la evolución de los serotipos virales. Por lo tanto, para determinar la asociación de alguno virus con el cáncer de próstata, se usó un método de detección basado en microseries (Virochip) para genotipar patógenos virales desarrollados en UCSF por los Dr. DeRisi y Gamen (Wang D., eí ai, Proc Natl Acad Sci U S A 99(24): 15687-92, 2002; Wng D., eí ai, Biol. 1 (2):E2. Epub, 2003). Estas microseries contienen oligonucleótidos largos (de 70 monómeros) que pueden detectar e identificar varios cientos de tipos de virus diferentes. Como la serie contiene secuencias altamente conservadas dentro de los ácidos nucleicos virales, puede detectar virus no representados de forma explícita. Se identificó y se clonó un nuevo gammaretrovirus relacionado con cepas xenotrópicas del virus de la leucemia de ratón (denominado en este documento como virus relacionado (XMRV) con el virus de la leucemia de ratón xenótropico (MLV), a partir de pacientes homocigotos para la mutación de ARNasa L. Por consiguiente, la presente invención proporciona un virus relacionado (XMRV) con el virus de la leucemia de ratón xenotrópico (MLV) aislado o recombinante. La presente invención también se refiere a provirus de XMRV asilados o recombinantes y partículas retrovirales (por ejemplo producidas por células infectadas con XMRV). En una realización, el virus XMRV es un virus xenotrópico humano aislado o recombinante (HXV). La invención se refiere a virus depositados en la A.T.C.C., 10801 University Boulevard, Manassass, VA, 021 1 10-2209 el 30 de marzo de 2005, denominados A.T.C.C. N , o virus obtenidos de los mismos. El virus depositado en la A.T.C.C se denomina Virus Xenotrópico Humano (HXV)-LNCap(HXV-LN) aislado de un clon de LNCaP, animal (ser humano). HXV es un retrovirus (gamma) relacionado con el virus de la leucemia de ratón (MLV), gag reacciona con el anticuerpo MLV P30 de Rauscher (A.T.C.C N° de acceso VR-15645A-Gt) en transferencias de Western. Como se indica en este documento el virus puede cultivarse en líneas celulares LNCaP (A.T.C.C N° de acceso CRL-1740) y DU145(A.T.C.C N° de acceso HTB-81 ). Las líneas celulares, los medios y las condiciones para el cultivo de las líneas celulares en las que puede cultivarse el virus incluyen RPMI 1640 con O-Glucosa a 2,0 g/l, glutamina (2,5 mM) 300mg/l, piridoxina HCl 1 ,0 mg/l, bicarbonato sódico a 2 g/l, suero fetal bovino (inactivado por calor) al 10%, 200 unidades de PEN/STREP, aire al 95%: CO2 al 5%, 37°C. El fluido sobrenadante en las células infectadas (por ejemplo células LNCaP) puede centrifugarse (por ejemplo, a 12.000 g durante 15 minutos) seguido de filtración (por ejemplo, a través de dos filtros sucesivos de 0,2 µm). Moléculas de ácido nucleico. La presente invención proporciona moléculas de ácido nucleico de XMRV aisladas. Por una "molécula de ácido nucleico de XMRV" se entiende una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido de XMRV. Dicha molécula de ácido nucleico incluye por ejemplo, la molécula de ácido nucleico de XMRV descrita con detalle en este documento; un ácido nucleico aislado que comprende la SEC ID N°: 1 ; un complemento de un ácido nucleico aislado que comprende la SEC ID N°: 1 ; un ácido nucleico aislado que codifica un polipéptido de XMRV de la SEC ID N°: 2; un complemento de un ácido nucleico aislado que codifica un polipéptido de XMRV de la SEC ID N°: 2; un ácido nucleico que puede hibridarse en condiciones rigurosas con una molécula de ácido nucleico que codifica la SEC ID N°: 1 o un complemento de la misma; una molécula de ácido nucleico que puede hibridar en condiciones muy rigurosas con un ácido nucleico que comprende la SEC ID N°: 1 y una molécula de ácido nucleico aislada que tenga al menos el 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 92%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ó 99%, de identidad de secuencia con toda o parte de la SEC ID N°: 1 , o un complemento de la misma. En una realización, el porcentaje de identidad se determina a partir de la longitud completa de la molécula de ácido nucleico de XMRV (por ejemplo, la longitud completa de la SEC ID N°: 1 ). En otra realización el porcentaje de identidad se determina a partir de una porción de la molécula de ácido nucleico de XMRV (por ejemplo la porción que codifica el polipéptido ga, pro-pol y/o env de XMRV). Por ejemplo, la molécula de ácido nucleico aislada puede tener al menos el 70%, 75%, 80%, 85%, 92%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ó 99%, de identidad de secuencia con una porción de la SEC ID N°: 1 que codifique el polipéptido pol de un XMRV (por ejemplo, SEC ID N°: 4). Las moléculas de ácido nucleico aisladas de la presente invención pueden ser ARN, ARNm o ADN tal como ADNc. Las moléculas de ADN pueden ser de doble cadena o de cadena sencilla; los ARN o ADN de cadena sencilla pueden ser la cadena codificante (sentido) o no codificante (antisentido). La molécula de ácido nucleico puede incluir toda o una parte de la secuencia codificante del gen y puede comprender además secuencias no codificantes adicionales tales como intrones y secuencias 3' y 5' no codificantes (incluyendo por ejemplo secuencias reguladoras). Además, la molécula de ácido nucleico puede fusionarse con una secuencia marcadora, por ejemplo, una secuencia que codifique un polipéptido para ayudar al aislamiento o purificación del polipéptido. Dichas secuencias incluyen, aunque sin limitación, marcas FLAG, y secuencias que codifican una proteína de fusión a glucatión-S-transferasa (GST) y las que codifican un polipéptido marcador de hemaglutinina A (HA) del virus de la gripe. Una molécula de ácido nucleico "asilada", "sustancialmente pura" o "sustancialmente pura y asilada", como se usa en este documento, es una que se separa de los ácidos nucleicos que normalmente flanquean al gen o a la secuencia de nucleótidos (como en las secuencias genómicas) y/o se ha purificado completa o parcialmente de otras secuencias transcritas (por ejemplo, como en una biblioteca de ARN o de ADN). Por ejemplo, un ácido nucleico aislado de la invención, puede asilarse sustancialmente con respecto al medio celular complejo en el que se encuentra de forma natural, o del medio de cultivo cuando se produce mediante técnicas recombinantes, o de precursores químicos u otros productos químicos cuando se sintetiza químicamente. En algunos casos, el material aislado formará parte de una composición (por ejemplo un extracto en bruto que contiene otras sustancias) de un sistema tampón, o de una mezcla de reactivos. En otras circunstancias, el material puede purificarse hasta la homogeneidad esencial, por ejemplo, de acuerdo con lo determinado mediante electroforesis en gel de agarosa o cromatografía en columna tal como HPLC. Preferiblemente, una molécula de ácido nucleico aislada comprende al menos aproximadamente el 50%, 80%, 90% ,95%, 98% ó 99% (en base molar) de todas las especies macromoleculares presentes. La molécula se ácido nucleico de XMRV puede fusionarse con otras secuencias codificantes o reguladoras y seguir considerándose aislada. De este modo, el ARN recombinante contenido en un vector se incluye en la definición de "aislado" como se usa en este documento. Además, las moléculas de ácido nucleico aisladas incluyen moléculas de ADN recombinantes en células hospedadoras heterólogas, así como moléculas de ADN parcial o sustancialmente purificadas en solución. Las moléculas de ácido nucleico "aisladas" también abarcan transcritos de ARN in vivo e in vitro de las moléculas de ADN de la presente invención. Una molécula de ácido nucleico o secuencia de nucleótidos aislada puede incluir una molécula de ácido nucleico o secuencia de nucleótidos que se sintetiza químicamente o por medios recombinantes. Por lo tanto, el ADN recombinante contenido en un vector se incluye en la definición de "aislado" como se usa en este documento. Las moléculas de nucleótidos aislados también incluyen moléculas de ADN recombinantes en organismos heterólogos, así como moléculas de ADN parcial o sustancialmente purificadas en solución. Los transcritos de ARN in vivo o in vitro de las moléculas de ADN de la presente invención también se incluyen en secuencias de nucleótidos "aisladas". Dichas secuencias de nucleótidos aisladas son útiles en la fabricación del polipéptido codificado como sondas para aislar secuencias homologas (por ejemplo, de otras especies de mamífero) o para detectar la expresión del gen en el tejido (por ejemplo, tejido humano), tal como mediante análisis de transferencia de Northern. La presente invención también se refiere a moléculas de ácido nucleico de XMRV variantes que no se encuentran necesariamente en la naturaleza pero codifican un polipéptido de XMRV. De este modo, por ejemplo, las moléculas de ADN que comprenden una secuencia que es diferente de una secuencia de XMRV de origen natural pero que, debido a la degeneración del código genético, codifican un polipéptido de XMRV de la presente invención también son objeto de esta invención. La invención también se refiere a secuencias de nucleótidos de XMRV que codifican porciones (fragmentos), o codifican polipéptidos variantes tales como análogos o derivados de un polipéptidos de XMRV. En una realización, un fragmento de una secuencia de nucleótidos de XMRV comprende la SEC ID N°: 6. Dichas variantes pueden ser de origen natural, tal como en el caso de una variación alélica o polimorfismos de un único nucleótido o no ser de origen natural, tales como las inducidas por diversos mutágenos y procesos mutagénicos. Las variaciones pretendidas incluyen, aunque sin limitación, adición, deleción y sustitución de uno o más nucleótidos que pueden provocar cambios de aminoácidos conservativos y no conservativos, incluyendo adicciones y deleciones. Preferiblemente, el nucleótido de XMRV (y/o el aminoácido resultante) sufre cambios silenciosos o conservados. Esto es, no alteran las características de actividad del polipéptido de XMRV. Otras alteraciones de las moléculas de ácido nucleico de XMRV de la invención pueden incluir, por ejemplo, marcado, metilación, modificaciones internucleotídicas tales como enlaces no cargados (por ejemplo, metilfosfonatos, fosfotriésteres, fofoamidatos y carbamatos), enlaces cargados (por ejemplo, forforotíoatos o fosforiditioatos), restos colgantes (por ejemplo, polipéptidos), intercaladores (por ejemplo acridina o psoraleno), quelantes, alquilantes, y enlaces modificados (por ejemplo, ácidos nucleicos alfa anoméricos). La invención también se refiere a moléculas de ácido nucleico de XMRV que hibridan en condiciones de hibridación rigurosas tales como hibridación selectiva, con una secuencia de nucleótidos descrita en este documento (por ejemplo, moléculas de ácido nucleico que hibridan específicamente con las secuencia de nucleótidos que codifica polipéptidos de XMRV descrita en este documento y opcionalmente, tienen una actividad del polipéptido de XMRV). En una realización, la invención incluye variantes descritas en este documento que híbridan en condiciones de hibridación muy rigurosas (por ejemplo, para hibridación selectiva) con una secuencia de nucleótidos que comprende la secuencia de nucleótidos de la SEC ID N°: 1 y el complemento de la SEC ID N°: 1. En otra realización, la invención incluye variantes descritas en este documento que hibridan en condiciones de hibridación muy rigurosas (por ejemplo, para hibridación selectiva) con una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos de la SEC ID N°: 2. En una realización preferida, la variante que híbrida en condiciones de hibridación muy rigurosas codifica un polipéptido que tiene una actividad biológica del polipéptido de XMRV (por ejemplo, capacidad para infectar el tejido de la próstata). Las actividades de XMRV incluyen la capacidad de infectar una célula (por ejemplo, una célula de la próstata), producir un provirus y producir partículas retrovirales. Dichas moléculas de ácido nucleico pueden detectarse y/o asilarse mediante hibridación específica (por ejemplo, en condiciones muy rigurosas). "Condiciones rigurosas" para la hibridación es una expresión de la técnica que se refiere a las condiciones de incubación y lavado, por ejemplo condiciones de temperatura y concentración de tampón, que permiten la hibridación de un ácido nucleico en particular con un segundo ácido nucleico. El primer ácido nucleico puede ser perfectamente (es decir al 100%) complementario con el segundo, o el primer y el segundo ácido nucleico pueden compartir algún grado de complementariedad que sea menor de la perfección (por ejemplo, aproximadamente o al menos el 70%, 75%, 85%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ó 99%). Por ejemplo, pueden usarse algunas condiciones muy rigurosa para distinguir perfectamente los ácidos nucleicos perfectamente complementarios de aquellos menos complementarios. Las "Condiciones muy rigurosas", "condiciones moderadamente rigurosas" y "condiciones poco rigurosas" para la hibridación de ácidos nucleicos se explican en el documento Current Protocols in Molecular Biology (véase Ausubel et al., supra, cuyas enseñanzas completas se incorporan como referencia en este documento). Las condiciones exactas que determinan la rigurosidad de la hibridación dependen no solamente de la fuerza iónica (por ejemplo, 0,2 X SSC o 0,1 X SSC), temperatura (por ejemplo, temperatura ambiente, 42°C o 68°C), y de la concentración de agentes desestabilizadores tales como formamida o agentes desnaturalizantes tales como SDS, sino también de factores tales como la longitud de la secuencia de ácido nucleico, composición de bases, el porcentaje de emparejamiento incorrecto entre las secuencias que hibrídan y la frecuencia de aparición de subseries de esta secuencia dentro de otras secuencias no idénticas. Por lo tanto, las condiciones equivalentes pueden determinarse modificando uno o más de estos parámetros mientras se mantienen un grado similar de identidad o similitud entre las dos moléculas de ácido nucleico. Típicamente, se usan condiciones tales que las secuencias al menos aproximadamente el 60%, al menos aproximadamente el 70%, al menos aproximadamente el 80%, al menos aproximadamente el 85%, al menos aproximadamente el 90% o al menos aproximadamente el 95% o más idénticas entre sí siguen hibridando entre sí. Modificando las condiciones de hibridación desde un nivel de rigurosidad en el que no se produce hibridación hasta un nivel en el que se observa hibridación por primera vez, pueden determinarse las condiciones que permitirán que una secuencia dada hibride (por ejemplo, de forma selectiva) con las secuencias más similares en la muestra. Las condiciones de hibridación ejemplares se describen en el documento Krause y Aaronson, Methods in Enzymology, 200:546-556 (1991 ) y también en Ausubel et al., supra, que describen la determinación de las condiciones de lavado para unas condiciones de rigurosidad moderada o baja. El lavado es la etapa en el que las condiciones se ajustan normalmente para determinar un nivel mínimo de complementariedad de los híbridos. Generalmente comenzando desde la temperatura más baja en la que solamente se produce hibridación homologa, cada grado °C en el que se reduce la temperatura final de lavado (manteniendo la concentración de SSC constante) permite un aumento del 1 % en el grado máximo de emparejamiento erróneo entre las secuencias que hibridan. Generalmente, al doblar la concentración de SSC se obtiene un aumento de la temperatura de 17°C. Usando estas directrices, puede determinarse la temperatura de lavado, de forma empírica, para una rigurosidad alta, moderada o baja, dependiendo del nivel de emparejamiento erróneo buscado. Por ejemplo, un lavado de rigurosidad baja puede comprender lavar en una solución que contiene 0,2 X SSC/SDS al 0,1 % durante 10 minutos a temperatura ambiente. Un lavado de rigurosidad moderada puede comprender lavar en una solución precalentada (42°C) que contienen 0,2 X SSC/SDS al 0,1 % durante15 minutos a 42°C; y un lavado de alta rigurosidad puede comprender lavar en una solución precalentada (68°C) que contiene 0,1 X SSC/SDS al 0,1 % durante 15 minutos a 68°C. Además, pueden realizarse lavados repetida o secuencialmente para obtener un resultado deseado como se conoce en la técnica. Pueden determinarse condiciones equivalentes modificando uno o más de los parámetros dados como ejemplo, como se conoce en la técnica, mientras se mantiene un grado similar de identidad o de similitud entre la molécula de ácido nucleico diana y el cebador o sonda utilizados. La presente invención también proporciona moléculas de ácido nucleico de XMRV aisladas que contienen un fragmento o porción que hibrida en condiciones muy rigurosas con una secuencia de nucleótidos que comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada entre la SEC ID N°: 1 , y el complemento de la SEC ID N°: 1 y también proporciona moléculas de ácido nucleico aisladas que contienen fragmentos o porciones que hibridan en condiciones muy rigurosas con una secuencia de ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos seleccionada entre la SEC ID N°: 2. Los fragmentos de ácido nucleico de la invención son de al menos 15, preferiblemente al memos aproximadamente 18, 20, 23, ó 25 nucleótidos y pueden ser de más de 30, 40, 50, 100, 200 o más nucleótidos de longitud. Los fragmentos que son por ejemplo, de 30 o más nucleótidos de longitud que codifican polipéptidos antigénicos descritos en este documento son particularmente útiles, para la generación de anticuerpos como se describe en este documento. En un aspecto relacionado, los fragmentos de ácido nucleico de XMRV de la invención se usan como sondas o cebadores en ensayos tales como los que se describen en este documento. "Sondas" o "cebadores" son oligonucleótidos que hibridan de manera específica para las bases con una cadena complementaria de moléculas de ácido nucleico. Dichas sondas y cebadores incluyen ácidos nucleicos polipeptídicos como se describen en el documento Nielsen et al., Science, 254, 1497-1500 (1991 ). También como se usa en este documento, el término, "cebador" se refiere en particular a un oligonucleótido de cadena sencilla que actúa en un punto de iniciación de la síntesis de ADN dirigida con una plantilla usando métodos bien conocidos (por ejemplo, PCR, LCR) incluyendo, aunque sin limitación, los que se describen en este documento. Típicamente, una sonda o cebador comprende una región de la secuencia de nucleótidos que hibrida con al menos aproximadamente 15, típicamente aproximadamente 20-25, y más típicamente aproximadamente 40, 50 ó 75 nucleótidos consecutivos de una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos contiguos seleccionada entre las SEC ID N°: 1 , el complemento de la SEC ID N°: 1 y una secuencia que codifica una secuencia de aminoácidos de la SEC ID N°: 2. En realizaciones preferidas, una sonda o cebador comprende 100 o menos nucleótidos, preferiblemente entre 60 y 50 nucleótidos, y más preferiblemente entre 12 y 30 nucleótidos. En otras realizaciones, la sonda o cebador es al menos el 70% idéntica a la secuencia de nucleótidos contiguos o al complemento de la secuencia de nucleótidos contiguos, preferiblemente, al menos el 80% idéntica, más preferiblemente al menos el 90%, aún más preferiblemente al menos el 95% idéntica o incluso capaz de hibridar de forma selectiva con la secuencia de nucleótidos contiguos o con el complemento de la secuencia de nucleótidos contiguos. A menudo, la sonda o cebador comprende además una marca, por ejemplo un radioisótopo, un compuesto fluorescente, una enzima o un co-factor de una enzima. Las moléculas de ácido nucleico de la invención tales como las que se han descrito anteriormente pueden identificarse y asilarse usando técnicas de biología molecular convencionales y la información de la secuencia proporcionada en la SEC ID N°: 1 y/o en la SEC ID N°: 2. Por ejemplo, las moléculas de ácido nucleico pueden amplificarse y asilarse mediante la reacción en cadena de la polimerasa usando cebadores de oligonucleótidos sintéticos diseñados en base a una o más de la secuencias de ácido nucleico proporcionadas anteriormente y/o el complemento de estas secuencias. Dichas moléculas de ácido nucleico pueden diseñarse en base a secuencias de nucleótidos que codifican las secuencias de aminoácidos proporcionadas en la SEC ID N°: 2. Véase en general los documentos PCR Technology: Principies and Applications for DNA Amplification (ed. H.A. Eriich, Freeman Press, NY, NY, (1992); PCR protocols: A Guide to Methods an Applications (Eds. Innis et al., Academia Press, San Diego, CA, (1990); Mattila et al., Nucleic Acids Res., 19: 4967 (1991 ); Eckert et al., PCR Methods and Applications, 1 : 17 (1991 ); PCR (eds. McPherson et al., IRL Press, Oxford)); y la patente de Estados Unidos N° 4.683.202. Las moléculas de ácido nucleico pueden amplificarse usando ADNc, ARNm, o ADN genómico como plantilla, clonarse en un vector apropiado y caracterizarse mediante análisis de la secuencia de ADN. Los métodos de amplificación adecuados incluyen la reacción en cadena de la ligasa (LCR) (Véase Wu y Wallace, Genomics, 4: 560 (1989); y Landegren et al., Science, 241 : 1077 (1998)); amplificación de transcripción (Kwoh et al., proa. Natl. Acad. Sci. USA, 86: 1 173 (1989)), y amplificación de secuencia sostenida (véase Guatelli et al,. Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 87: 1874 (1990)) y amplificación de secuencia basada en el ácido nucleico (NASBA). Los dos últimos métodos de amplificación implican reacciones isotérmicas basadas en la transcripción isotérmica que producen un ARN de cadena sencilla (ARNcs) y ADN de doble cadena (ADNdc) como productos de amplificación en una proporción de aproximadamente 30 ó 100 a 1 , respectivamente. El ADN amplificado puede radiomarcarse y usarse como sonda para explorar una biblioteca de ADNc, por ejemplo una obtenida de células humanas o de cualquier otro tipo celular deseado. Pueden asilarse clones correspondientes, y puede obtenerse ADN después de la escisión in vivo y los insertos clonados pueden secuenciarse en cualquier orientación o en ambas orientaciones mediante métodos conocidos en la técnica para identificar los marcos de lectura correctos que codifican un polipéptido del peso molecular apropiado. Por ejemplo, el análisis directo de la secuencia de nucleótidos de las moléculas de ácido nucleico de la presente invención puede realizarse usando métodos bien conocidos que está disponibles en el mercado. Véase por ejemplo Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (2a Ed., CSHP, New York (1989)); y Zyskind et al, Recombinant DNA Laboratory Manual, (Acad. Press, (1988)). Usando estos métodos u otros similares, el polipéptido y el ADN que codifican polipéptido pueden asilarse, secuenciarse y caracterizarse adicionalmente. Las moléculas de ácido nucleico de ARN interferente y antisentido (por ejemplo ARNsi, ARNsh) pueden diseñarse usando la secuencia de nucleótidos de la SEC ID N°: 1 , y/o el complemento de la SEC ID N°: 1 , y/o porciones de estas secuencias, y/o el complemento de estas porciones o secuencias, y/o una secuencia que codifica la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N°: 2 o que codifica una porción de la SEC ID N°: 2. Los métodos se basan en la unión de un polinucleótido a un ADN o ARN complementario. Al ARN antisentido o interferente de la invención comprende una secuencia complementaria a al menos una porción de un transcrito de ARN de un gen informador. La complementariedad absoluta, aunque se prefiere no es necesaria. Una secuencia "complementaria a al menos una porción de un ARN", como se describe en este documento, significa una secuencia que tiene la complementariedad suficiente para ser capaz de hibridar con el ARN, formado un dúplex estable. La capacidad para hibridar dependerá del grado de complementariedad y de la longitud de la secuencia de ARN. Generalmente, cuanto mayor sea el ácido nucleico que hibrida, más emparejamientos erróneos de bases con el ARN podrá contener mientras sigue formando un dúplex estable. Un especialista en la técnica puede determinar un grado de emparejamiento erróneo tolerable mediante el uso de procedimientos convencionales para determinar el punto de fusión del complejo hibridado. En general, las secuencias de ácidos nucleicos de XMRV asiladas de la invención pueden usarse para identificar secuencias virales homologas y para detectar un XMRV en un individuo o en una muestra. Las moléculas de ácido nucleico de la presente invención pueden usarse también como agentes terapéuticos. Las moléculas de ácido nucleico de XMRV de la presente invención también pueden usarse para obtener cebadores, para generar anticuerpos antípolipéptidos usando técnicas de inmunización con ADN y como antígeno para generar anticuerpos anti-ADN o provocar respuestas inmunes. Las porciones o fragmentos de las secuencias de nucleótidos identificadas en este documento (y las secuencias génicas completas correspondientes) pueden usarse de muchas maneras como reactivos de polinucleótidos. Las secuencias de nucleótidos de XMRV de la invención pueden usarse para identificar y expresar polipéptidos recombinante para análisis, caracterización, o uso terapéutico o como marcadores de tejidos en los que se exprese el polipéptido correspondiente, de forma constitutiva, durante la diferenciación del tejido o en estados de enfermedad. Las secuencias de ácidos nucleicos pueden usarse además como reactivos en ensayos de exploración y/o diagnóstico descritos en este documento y también pueden incluirse como componentes de kits (por ejemplo, kits de reactivos) para su uso en los ensayos de exploración y/o diagnóstico descritos en este documento. Pueden usarse técnicas convencionales, tales como la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) e hibridación del ADN para clonar homólogos de XMRV en otras especies, por ejemplo homólogos de mamíferos (por ejemplo, homólogos de primates, felinos, caninos, de roedores, ovinos, bovinos, etc.). Los homólogos de XMRV pueden identificarse fácilmente usando hibridación de ADN poco rigurosa o PCR poco rigurosa con sondas o cebadores de XMRV. Pueden usarse cebadores degenerados que codifican polípéptidos de XMRV para clonar homólogos de XMRV mediante RT-PCR. Como alternativa, pueden identificarse homólogos de XMRV adicionales utilizando la información de secuencias consenso para polipéptidos XMRV para buscar polipéptidos similares en otras especies. Por ejemplo, pueden buscarse proteínas con los dominios de XMRV característicos de una molécula de ácido nucleico de XMRV descrita en este documento en bases de datos de polipéptidos. Pude ensayarse la actividad biológica de los polipéptidos que contienen dichos motivos, usando métodos descritos en este documento. Expresión de las moléculas de ácido nucleico.

Otro aspecto de la invención se refiere a construcciones de ácido nucleico que contienen una molécula de ácido nucleico de XMRV, por ejemplo, una seleccionada entre el grupo constituido por el grupo la SEC ID N°: 1 ó 6 y el complemento de cualquiera de las SEC ID N°: 1 ó 6 (o porciones de las mismas). Otro aspecto de la invención se refiere a construcciones de ácido nucleico de XMRV que contienen una molécula de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N°: 2 o de porciones de la SEC ID N°: 2 (por ejemplo, SEC ID N°: 3, 4, 5) las construcciones comprenden un vector (por ejemplo, un vector de expresión) en el que se ha insertado una secuencia de la invención en orientación sentido o antisentido. Un tipo de vector es un "plásmido", que se refiere a un bucle de ADN de doble cadena circular en el que pueden ligarse segmentos de ADN adicionales. Otro tipo de vector es un vector viral en el que pueden ligarse segmentos de ADN adicionales en el gemona viral. Algunos vectores son capaces de replicarse de forma autónoma en una célula hospedadora en la que introducen (por ejemplo, los vectores bacterianos que tienen un origen de replicación bacteriano y vectores de mamífero episomales). Otros vectores (por ejemplo, vectores de mamíferos no episomales) se integran en el genoma de una célula hospedadora después de la introducción en la célula hospedadora, y de este modo se replican junto con el genoma del hospedador. Además, algunos vectores, vectores de expresión, son capaces de dirigir la expresión de genes a los que se unen de forma operativa. En general, los vectores de expresión útiles en técnicas de ADN recombinantes están a menudo en forma de plásmidos. Sin embargo, la invención pretende incluir otras formas de vectores de expresión, tales como vectores virales (por ejemplo, retrovirus, adenovirus, y virus adeno-asociados con replicación defectuosa) que sirvan para funciones equivalentes. Los vectores de expresión recombinantes preferidos de la invención comprenden una molécula de ácido nucleico de la invención en una forma adecuada para la expresión de la molécula de ácido nucleico en una célula hospedadora. Esto significa que los vectores de expresión recombinantes incluyen una o más sencuencias reguladoras, seleccionadas en base a la célula hospedadora que se usará para la expresión, que está unida de forma operativa a la secuencia de ácido nucleico a expresar. Dentro de un vector de expresión recombinante, "unido de forma operativa" pretende significar que la secuencia de nucleótidos de interés está unida a la secuencia reguladora de manera que permita la expresión de la secuencia de nucleótidos (por ejemplo, en un sistema de transcripción/traducción in vitro o en una célula hospedadora cuando el vector se introduce en la célula hospedadora). La expresión "secuencia reguladora" pretende incluir promotores, potenciadotes y otros elementos del control de la expresión (por ejemplo, señales de poliadenilación). Dichas secuencias reguladoras se describen, por ejemplo, en el documento Goeddel, Gene Expresión Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990). Las secuencias reguladoras incluyen las que dirigen la expresión constitutiva de una secuencia de nucleótidos en muchos tipos de células hospedadoras y las que dirigen la expresión directa de la secuencia de nucleótidos solamente en algunas células hospedadoras (por ejemplo, secuencias reguladoras específicas de tejido).

Los especialistas en la técnica entenderán que el diseño del vector de expresión puede depender de factores tales como la elección de la célula hospedadora a transformar y el nivel de expresión del polipéptido deseado. Los vectores de expresión de la invención pueden introducirse en células hospedadoras para producir de este modo polipéptidos, incluyendo polipéptidos de fusión, codificados por moléculas de ácido nucleico como se describen en este documento. Los vectores de expresión recombinante de la invención pueden diseñarse para la expresión de un polipéptido de la invención en células procariotas o eucariotas, por ejemplo células bacterianas, tales como E. coli, células de insecto (usando vectores de expresión de baculovirus), células de levadura o células de mamífero. Las células hospedadoras adecuadas se describen adicionalmente en Goeddel, supra. Como alternativa, el vector de expresión recombinante puede transcribirse y traducirse in vitro, por ejemplo usando secuencias reguladoras del promotor T7 y polimerasa de T7. Otros aspectos de la invención se refieren a células hospedadoras en las que se ha introducido un vector de expresión recombinante de la invención. Las expresiones "célula hospedadora" y "célula hospedadora recombinante" se usan de forma intercambiable en este documento. Se entiende que dichas expresiones se refieren no solamente a las células objeto particular sino también a la progenie o progenie potencial de dicha célula. Debido a que pueden producirse algunas modificaciones en las generaciones posteriores debido a mutación o influencias ambientales, dicha progenie puede no ser de hecho idéntica a la célula parental, pero siguen incluyéndose en el alcance de la expresión como se usa en este documento. Una célula hospedadora puede ser cualquier célula procariota o eucariota. Por ejemplo una molécula de ácido nucleico de la invención puede expresarse en células bacterianas (por ejemplo, E.coli), células de insecto, células de levadura, o células de mamífero (tales como células de ovario de hámster chino (CHO) o células COS, células 293T humanas, células HeLa, células NIH 3T3, células de eritroleucemia de ratón (MEL), células LNCaP, y células DU145). Los especialistas en la técnica conocen otras células hospedadoras adecúas. El ADN vector puede introducirse en células procariotas o eucariotas mediante técnicas de de transformación o transfección convencionales. Como se usan en este documento, los términos "infección", "transformación", y "transfección" pretenden referirse a diversas técnicas reconocidas en la técnica para introducir una molécula de ácido nucleico extraña (por ejemplo, ADN) en una células hospedadora, incluyen co-precipitación con fosfato o cloruro calcico, transfección mediada por DEAD-dextrano, lipofección, o electroporación. Los métodos adecuados para transformar o transfectar células hospedadoras pueden encontrarse en el documento de Sambrook, et al. (supra), y otros manuales de laboratorio. Para la transfección estable de células de mamífero, se sabe que, dependiendo del vector de expresión y de la técnica de transfección usadas, solamente una pequeña fracción de las células puede integrar el ADN extraño en su genoma. Para identificar y seleccionar estos integrantes, se introduce generalmente un gen que codifica un marcador seleccionable (por ejemplo, de resistencia a antibióticos) en las células hospedadoras junto con el gen de interés. Los marcadores seleccionables preferidos incluyen los que otorgan resistencia a fármacos, tales como G418, higromicina, o metotrexato. Las moléculas de ácido nucleico codifican un marcador seleccionable pueden introducirse en una célula hospedadora en le mismo vector que la molécula de ácido nucleico de la invención o pueden introducirse en un vector diferente. Las células transfectadas de forma estable con la molécula de ácido nucleico introducida pueden identificarse mediante selección de fármacos (por ejemplo, las células que han incorporado el gen de marcador seleccionable sobrevivirán, mientras que las otras células morirán). Una célula hospedadora de la invención, tal como una célula hospedadora procariota o eucariota en cultivo, puede usarse para producir (es decir, expresar) un polipéptido de XMRV de la invención. Por consiguiente la invención proporciona además métodos para producir un polipéptido de XMRV usando las células hospedadoras de la invención. En una realización, el método comprende cultivar la célula hospedadora de la invención (en la que se ha introducido un vector de expresión recombinante que codifica un polipéptido de la invención) en un medio adecuado de modo que se produzca el polipéptido de XMRV. En otra realización, el método comprende además aislar el polipéptido a partir del medio o de la célula hospedadora. Polipéptidos. La presente invención se refiere a polipéptidos de XMRV aislados o recombinantes y fragmentos, derivados y variantes de los mismos, así como a polipéptidos codificados por secuencias de nucleótidos descritas en este documento (por ejemplo otras variantes). Como se usa en este documento, el término "polipéptido" se refiere a un polímero o aminoácido y no a una longitud específica; de este modo, los polipéptidos, oligopéptidos y proteínas se incluyen dentro de la definición de un polipéptido. Como se usa en este documento, se dice que un polipéptido está "aislado", es "sustancialmente puro", o "sustancialmente puro y aislado", cuando está sustancialmente libre de material celular cuando se asila de las células recombinantes o no recombinantes, o cuando está libre de precursores químicos u otros productos químicos cuando se sintetiza químicamente. Además, un polipéptido puede unirse a otro polipéptido que normalmente no se asocia a él en una célula (por ejemplo, en una "proteína de fusión") y seguir estando "aislado", "sustancialmente puro", o "sustancialmente puro y aislado". Un polipéptido aislado, sustancialmente puro, o sustancialmente puro y aislado puede obtenerse, por ejemplo, usando técnicas de purificación por afinidad descritas en este documento, así como otras técnicas descritas en este documento y conocidas por los especialistas en la técnica. Por un "polipéptido de XMRV" se entiende un polipéptido que tiene actividad biológica de XMRV, por ejemplo, la capacidad de infectar células de la próstata. Un polipéptido de XMRV es también un polipéptido cuya actividad puede inhibirse mediante moléculas que tengan actividad inhibidora de XMRV. Los ejemplos de polipéptidos de XMRV incluyen un polipéptido sustancialmente puro que comprende o está constituido por la SEC ID N°: 2; y un polipéptido que tenga preferiblemente al menos el 75%, 80%, 82%, 85%, 90%, 92%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ó 99% de identidad de secuencia con respecto a la SEC ID N°: 2, de acuerdo con lo determinado usando el programa BLAST y los parámetros descritos en este documento. En otra realización los ejemplos de polipéptidos de XMRV incluyen un polipéptido sustancialmente puro que comprende o está constituido por la SEC ID N°: 2 y un polipéptido que tiene preferiblemente al menos 75%, 80%, 82%, 85%, 90%, 92%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ó 99% de similitud de secuencia con respecto a la SEC ID N°: 2, de acuerdo con lo determinado usando el programa BLAST y los parámetros descritos en este documento. Un polipéptido de la invención puede purificarse hasta la homogeneidad. Se entiende sin embargo, que las preparaciones en las que el polipéptido no se purifica hasta la homogeneidad también son útiles. La característica crítica es que la preparación permita la función deseada del polipéptido incluso en presencia de cantidades considerables de otros componentes. Por lo tanto, la invención abarca diversos grados de pureza. En una realización, la expresión "sustancialmente libre de material celular" incluye preparaciones del polipéptido que tengan menos de aproximadamente el 30% (en peso seco) de otras proteínas (por ejemplo, proteínas contaminantes), menos de aproximadamente el 20% de otras proteínas, menos de aproximadamente el 10% de otras proteínas, menos de aproximadamente el 5% o menos de aproximadamente el 1 % de otras proteínas. Cuando un polipéptido se produce de forma recombinante, también puede estar sustancialmente libre de medio de cultivo, es decir el medio de cultivo representa menos de aproximadamente el 20%, menos de aproximadamente el 10% o menos de aproximadamente el 5% del volumen de la preparación de polipéptido. La expresión "sustancialmente libre de precursores químicos o de otros productos químicos" incluye preparaciones del polipéptido en las que este se separó de los precursores químicos o de otros productos químicos que están implicados en su síntesis. En una realización, la expresión "sustancialmente libre de precursores químicos o de otros productos químicos" incluye preparaciones del polipéptido que tienen menos de aproximadamente el 30% (en peso seco) de precursores químicos o de otros productos químicos, menos de aproximadamente el 20% de precursores químicos u otros productos químicos, menos de aproximadamente el 10% de precursores químicos u otros productos químicos o menos de aproximadamente el 5% de precursores químicos u otros productos químicos. En una realización, un polipéptido de la invención comprende una secuencia de aminoácidos codificada por una molécula de ácido nucleico de la SEC ID N°: 1 y complementos y porciones de la misma. Los polipéptidos de la invención, también incluyen fragmentos y variantes de secuencia (por ejemplo, variantes alélicas). Las variantes también abarcan polipéptidos obtenidos de otros organismos, pero que tienen homología sustancial con un polipéptido codificado por una molécula de ácido nucleico que comprende la secuencia de nucleótidos de la SEC ID N°: 1 y complementos y porciones de las mismas, o que tienen homología sustancial con un polipéptido codificado por una molécula de ácido nucleico que comprende la secuencia de nucleótidos de la SEC ID N°: 1 . Las variantes también incluyen polipéptidos sustancialmente homólogos o idénticos a estos polipéptidos pero obtenidos de otros organismos, por ejemplo un ortólogo. Las variantes también incluyen polipéptidos que son sustancialmente homólogos o idénticos a estos polipéptidos que se producen mediante síntesis química. Las variantes también incluyen polipéptidos que son sustancialmente homólogos o idénticos a estos polipéptidos que se producen mediante métodos recombinantes. Como se usa en este documento, dos polipéptidos (o una región de los polipéptidos) son sustancialmente homólogos o idénticos cuando las secuencias de aminoácidos son al menos aproximadamente el 82%, 85%, 90%, 92%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ó 99% homologas o idénticas. Una secuencia de aminoácidos sustancialmente idéntica u homologa, de acuerdo con la presente invención, estará codificada por una molécula de ácido nucleico que hibrida con la SEC ID N°: 1 , o una porción de la misma, en condiciones rigurosas como se describe más particularmente en este documento. El porcentaje de identidad de dos secuencias de nucleótidos o aminoácidos puede determinarse alineando las secuencias para fines de comparación óptima (por ejemplo, pueden introducirse huecos en la secuencia de una primera secuencia). Los nucleótidos o aminoácidos en las posiciones correspondientes se comparan y el porcentaje de identidad entre las dos secuencias está en función de la cantidad de posiciones idénticas compartidas por las secuencias (es decir % de identidad = número de posiciones idénticas/número total de posiciones x 100). En algunas realizaciones, la longitud de la secuencia de aminoácidos o de nucleótidos de XMRV alineada para fines de comparación es de al menos el 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 92%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% de la longitud de la secuencia de referencia, por ejemplo, la secuencias que se proporcionan en la FIG. 1 y 2. La comparación real de las dos secuencias puede realizarse mediante métodos bien conocidos, por ejemplo usando un algoritmo matemático. Un ejemplo preferido no limitante de dicho algoritmo matemático se describe en el documento de Karlin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 5873-5877 (1993). Dicho algoritmo se incorpora en los programas BLASTN y BLASTX (versión 2.2) como se describe en el documento de Schaffer et al., Nucleic Acids Res., 29: 2994-3005 (2001 ). Cuando se utilizan los programas BLAST y Gapped BLAST, pueden usarse los parámetros por defecto de los respectivos programas (por ejemplo, BLASTN). En una realización, la base de datos explorada es una base de datos no redundante (NR) y los parámetros para la comparación de secuencias pueden ajustarse en: sin filtros; valor esperado de 10; tamaño de la palabra de 3; la matriz BLOSUM62; y las penalizaciones de hueco tienen una existencia de 1 1 y una extensión de 1. En otra realización, el porcentaje de identidad entre dos polípéptidos o dos polinucleótidos se determina sobre la longitud completa del polipéptido o el polinucleótido de interés. Otro ejemplo preferido no limitante de algoritmo matemático utilizado para la comparación de secuencias es el algoritmo de Myers y Miller, CABIOS (1989). Dicho algoritmo se incorpora en el programa ALIGN (versión 2.0), que es parte del paquete de software de alineamiento de secuencias GCG (Accelrys, San Diego, California). Cuando se utiliza el programa ALIGN para comparar secuencias de aminoácidos, puede usarse una tabla de peso de restos PAM120, una penalización de longitud de hueco de 12 y una penalización de hueco de 4. Los algoritmos adicionales para el análisis de secuencia conocidos en la técnica incluyen ADVANCE y ADAM como se describe en el documento de Torellis y Robotti, Comput. Appl. Biosci., 10: 3-5 (1994), y FASTA descrito en el documento Pearson y Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 2444-8 (1988). En otra realización, el porcentaje de identidad entre dos secuencias de aminoácidos puede conseguirse usando el programa GAP en el paquete de software GCG usando una matriz Blossom 63 o una matriz PAM250 y un peso de hueco de 12, 10, 8, 6, ó 4 y un peso de longitud de 2, 3, ó 4. En otra realización más, el porcentaje de identidad entre dos secuencias de ácidos nucleicos puede conseguirse usando el programa GAP en el paquete de software GCG usando un peso de hueco de 50 y un peso de longitud de 3. La invención también abarca polipéptidos de XMRV que tengan un grado de identidad menor pero que tengan una similitud suficiente para realizar una o más de las mismas funciones realizadas por un polipéptido de XMRV codificado por una molécula de ácido nucleico de la invención. La similitud se determina mediante la sustitución de aminoácidos conservativa. Dichas sustituciones son aquellas que sustituyen un aminoácido dado en un polipéptido con otro aminoácido de similares características. Es probable que las sustituciones conservativas sean fenotípicamente silenciosas. Las sustituciones conservativas observadas típicamente son las sustituciones, uno por otro, entre aminoácidos alifáticos Ala, Val, Leu, e lie; el intercambio de los restos hidroxilos de Ser y Thr; intercambio de los restos ácidos Asp y Glu; sustitución entre restos amida Asn y Gln; intercambio de restos básicos Lys y Arg; y sustituciones entre restos aromáticos Phe y Tyr. Las directrices con respecto a que aminoácidos es probable que sean fenotípicamente silenciosos se encuentran en el documento Bowie et al., Science 247: 1306-1310 (1990). Un polipéptido variante puede ser diferente en la secuencia de aminoácidos en una o más sustituciones, deleciones, inserciones, inversiones, fusiones y truncamientos o combinaciones de cualquiera de estos. Además, los polipéptidos variantes pueden ser completamente funcionales (por ejemplo, capacidad para infectar células y producir progenie de virus) o pueden carecer de función en una o más actividades (por ejemplo, capacidad para producir progenie de virus). Las variantes completamente funcionales contienen típicamente sólo variación conservativa o variaciones en restos no críticos o en regiones no críticas. Las variantes funcionales también pueden contener sustituciones de aminoácidos similares que den como resultado ningún cambio o un cambio no significativo de la función. Como alternativa, dichas sustituciones pueden afectar de forma positiva o negativa a la función en alguna medida. Las variantes no funcionales contienen típicamente una o más sustituciones, deleciones, inserciones, inversiones o truncamientos de aminoácidos no conservativas o una sustitución, inserción, inversión o deleción en un resto crítico o en una región crítica. Los aminoácidos que son esenciales para la función (por ejemplo, infección) pueden identificarse mediante métodos conocidos en la técnica, tales como mutagénesis sitio-dirigida o mutagénesis de selección de alanina (Cunningham et al., Science, 244: 1081-1085 (1989)). El último procedimiento introduce una única mutación de alanina en cada uno de los restos en la molécula (una mutación por molécula). Las moléculas mutantes resultantes se ensayan después para su actividad biológica in vitro. Los sitios que son críticos para la actividad del polipéptido también pueden determinarse mediante análisis estructurales, tales como cristalización, resonancia magnética nuclear, o marcado por fotoafinidad (Véase Smith et al., J. Mol. Biol., 224: 899-904 (1992); y de Vos et al. Science, 255: 306-312 (1992)). La invención también incluye fragmentos de polipéptidos de XMRV de los polipéptidos de la invención. Los fragmentos pueden obtenerse de un polipéptido que comprende la SEC ID N°: 2 o de un polipéptido codificado por una molécula de ácido nucleico que comprende la SEC ID N°: 1 , o una porción de la misma, complementos de la misma u otra variante de la misma. La presente invención también abarca fragmentos de las variantes de los polipéptidos descritos en este documento. Los fragmentos útiles incluyen aquellos que conservan una o más de las actividades biológicas del polipéptido, así como fragmentos que pueden usarse como inmunógenos para generar anticuerpos específicos para polipéptidos. En realizaciones particulares, los fragmentos de polipéptidos de XMRV de los polipéptidos de la invención comprenden un polipéptido gag (por ejemplo, SEC ID N°: 3), un polipéptido pro-pol (por ejemplo, SEC ID N°: 4), un polipéptido env (por ejemplo, SEC ID N°: 4) y combinaciones de los mismo. Los fragmentos biológicamente activos incluyen péptidos que son de por ejemplo, 6, 9, 12, 15, 18, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 o más aminoácidos de longitud. Los fragmentos pueden ser discretos (sin fusionar a otros aminoácidos o polipéptídos) o pueden fusionarse a uno o más componentes de un polipéptido. Además, varios fragmentos pueden estar comprendidos dentro de un único polipéptido más grande. En una realización, un fragmento diseñado para la expresión en un hospedador puede tener regiones pre- y pro- polipeptídicas heterólogas fusionadas al extremo amino del fragmento del polipéptido y una región adicional fusionada al extremo carboxilo del fragmento. En la técnica se conocen métodos de biología molecular convencionales para generar fragmentos de polipéptidos. Una vez que se han generado los fragmentos, puede ensayarse su actividad biológica, usando por ejemplo, cualquiera de los métodos descritos en este documento. La invención proporciona por lo tanto, proteínas quiméricas o de fusión. Estas comprenden un polipéptido de XMRV de la invención unido de forma operativa a una proteína heteróloga o a un p lipéptido que tenga una secuencia de aminoácidos no sustancialmente homologa al polipéptido. "Unido de forma operativa" indica que el polipéptido y la proteína heteróloga se fusionan en marco. La proteína heteróloga puede fusionarse al extremo N- o al extremo C- del polipéptido. En una realización, la proteína de fusión no afecta a la función del polipéptido per se. Por ejemplo, el polipéptido de fusión puede ser un polipéptido de fusión a GTS en el que las secuencias de polipéptidos estén fusionadas al extremo C- de las secuencias GST. Otros tipos de polipéptidos de fusión incluyen, aunque sin limitación, polipéptidos de fusión enzimática, por ejemplo fusiones a ß- galactosidasa, fusiones a dos híbridos GAL de levadura, fusiones a poli-His, fusiones marcadas con FLAG y fusiones a Ig. Dichos polipéptidos de fusión pueden facilitar la purificación del polipéptido recombinante. En algunas células hospedadoras, (por ejemplo células hospedadoras de mamífero), la expresión y/o secreción de un polipéptido puede aumentar usando una secuencia de señal heteróloga. Por lo tanto, en otra realización, el polipéptido de fusión contiene una secuencia de señal heteróloga en su extremo N-. El documento EP-A 0464 533 describe proteínas de fusión que comprenden diversas porciones de regiones constantes de inmunoglobulina. La Fc es útil en terapia y en diagnóstico y esto da como resultado, por ejemplo, propiedades farmacocinéticas mejoradas (EP-A 0232 262). En la investigación de fármacos, por ejemplo, se han fusionado proteínas humanan con porciones Fc para fines de ensayos de exploración de alto rendimiento para identificar antagonistas (Véase Benett et al., Journal of Molecular Recognition, 8: 52-58 (1995) y Johanson et al., The Journal of Biological Chemistry, 270, 16:. 9459-9471 (1995)). De este modo, esta invención también abarca polipéptidos de fusión solubles que contienen un polipéptido de la invención y diversas porciones de las regiones constantes de cadenas pesadas o ligeras de inmunoglobulinas de varias subclases (IgG, IgM, IgA, IgE). Un polipéptido quimérico de fusión puede producirse mediante técnicas de ADN recombinante convencionales. Por ejemplo, fragmentos de ADN que codifican las diferentes secuencias polipéptidicas se ligan conjuntamente en marco de acuerdo con técnicas convencionales. En otra realización, el gen de fusión puede sintetizarse mediante técnicas convencionales incluyendo sintetizadores de ADN automatizados. Como alternativa, puede realizarse la amplificación por PCR de fragmentos de ácidos nucleicos usando cebadores de anclaje que dan origen a protuberancias complementarias entre dos fragmentos de ácidos nucleicos consecutivos que pueden hibridarse posteriormente y amplificarse de nuevo para generar una secuencia de ácido nucleico complementaria (Véase Ausubel et al., "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons, (1998), cuyas enseñanzas completas se incorporan como referencia en este documento). Además, están disponibles en el mercado muchos vectores de expresión que codifican un resto de fusión (por ejemplo, una proteína GST). Una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido de la invención puede clonarse en dicho vector de expresión de modo que el resto de fusión se una en marco con el polipéptido. El polipéptido de XMRV sustancialmente puro, aislado, o sustancialmente puro y aislado puede purificarse a partir de células que lo expresen de forma natural, purificarse a partir de células que se hayan alterado para expresarlo (recombinantes) o sintetizarse usando métodos de síntesis de proteínas conocidos. En una realización, el polipéptido se produce mediante técnicas de ADN recombinante. Por ejemplo, una molécula de ácido nucleico que codifica el polipéptido se clona en un vector de expresión, el vector de expresión se introduce en una célula hospedadora y el polipéptido se expresa en la célula hospedadora. Como alternativa, la célula puede infectarse con el virus XMRV. El polipéptido XMRV puede asilarse después a partir de las células o del sobrenadante de las células mediante un esquema de purificación apropiado usando técnicas de purificación de proteínas convencionales. En general, pueden usarse polipéptidos de XMRV de la presente invención como marcador de peso molecular en geles de SDS-PGE o en columnas de filtración en gel de exclusión molecular usando métodos reconocidos en la técnica. Los polipéptidos de la presente invención pueden usarse para generar anticuerpos o para provocar una respuesta inmune. Los polipéptidos también pueden usarse como reactivo, por ejemplo un reactivo marcado, en ensayos para determinar de forma cuantitativa los niveles del polipéptido o de una molécula a la que se une (por ejemplo, un receptor o un ligando) en fluidos biológicos. Los polipéptidos también pueden usarse como marcadores para células o tejidos en los que el polipéptido correspondiente se expresa preferiblemente, de forma constitutiva, durante la diferenciación tisular o en un estado de enfermedad. Los polipéptidos también pueden usarse para aislar un agente de unión correspondiente y para seleccionar un antagonista del péptido de molécula pequeña o agonistas de la interacción de unión. Los polipéptidos de la presente invención también pueden usarse como agentes terapéuticos. Anticuerpos. También se proporcionan anticuerpos policlonales y/o monoclonales que se unen de forma selectiva a todo o a una porción del polipéptido de XMRV, homólogos y variantes del mismo. La invención proporciona anticuerpos para un polipéptido de XMRV o un fragmento del polipéptido de esta invención. Por ejemplo, que tiene una secuencia de aminoácidos codificada por la SEC ID N°: 2, o una porción de la misma, o que tiene una secuencia de aminoácidos codificada por una molécula de ácido nucleico que comprende toda o una porción de la SEC ID N°: 1 u otra variante o porción de la misma. La expresión "anticuerpo purificado" como se usa en este documento se refiere a moléculas de inmunoglobulina y porciones inmunológicamente activas de moléculas de inmunoglobulina, es decir, moléculas que contienen un sitio de unión al antígeno que se une de forma selectiva a un antígeno. Una molécula que se une selectivamente a un polipéptido de la invención es una molécula que se une a este polipéptido o a un fragmento del mismo pero no se une sustancialmente a otras moléculas en una muestra, por ejemplo, una muestra biológica que contiene de forma natural el polipéptido. Preferiblemente el anticuerpo está al menos en el 60% en peso, libre de proteínas y de moléculas orgánicas de origen natural con las que se asocia de forma natural. Más preferiblemente, la preparación de anticuerpo es al menos el 75% o el 90%, y más preferiblemente el 99% en peso anticuerpo. Los ejemplos de porciones inmunológicamente activas de moléculas de inmunoglobulinas incluyen fragmentos F(ab) y F(ab'2) que pueden generarse tratando el anticuerpo con una enzima tal como pepsina. La invención proporciona anticuerpos policlonales y monoclonales que se unen de forma selectiva a un polipéptido de XMRV de la invención. La expresión "anticuerpo monoclonal" o "composición de anticuerpo monoclonal" como se usa en este documento se refiere a una población de moléculas de anticuerpo que contienen solamente una especie de un sitio de unión a antígeno capaz de inmunoreaccionar con un epítopo particular de un polipéptido de la invención. Una composición de anticuerpo monoclonal por lo tanto muestra típicamente una única afinidad de unión por un polipéptido particular de la invención con el que inmunoreacciona. Los anticuerpos policlonales pueden preparase como se ha descrito anteriormente inmunizando un sujeto adecuado con un inmunógeno deseado, por ejemplo, un polipéptido de XMRV de la invención o un fragmento del mismo. El título de anticuerpos en el sujeto inmunizado puede controlarse a lo largo del tiempo mediante técnicas convencionales, tales como con un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) usando un polipéptido inmovilizado. Si se desea, las moléculas de anticuerpo dirigidas contra el polipéptido pueden asilarse a partir de un mamífero (a partir de tejido, de sangre) y purificarse adicionalmente mediante técnicas bien conocidas tales como cromatografía de proteína A para obtener la fracción de IgG. En un momento apropiado después de la inmunización, por ejemplo cuando los títulos de anticuerpos son más altos, pueden obtenerse células productoras de anticuerpo del sujeto y usarse para preparar anticuerpos monoclonales mediante técnicas convencionales, tales como la técnica del hibridoma descrita originalmente por Kohier y Milstein, Nature 256: 495-497 (1975), la técnica del hibridoma de células B humanas (Kozbor et al., Immunol. Today 4: 72 (1983)), la técnica del hibridoma de EBV (Colé et al., Monoclonal Antibodies and Cáncer Therapy, Alan R. Liss, Inc., págs. 77-96 (1985)) o técnicas de trioma. La tecnología para producir hibridomas se conoce bien (véase en general Current Protocols in Inmunology, Coligan et al., (eds.) John Wiley & Sons, Inc., New York, NY (1994)). En resumen, una línea celular inmortal (típicamente un mieloma) se fusiona con linfocitos (típicamente esplenocitos) de un mamífero inmunizado con un inmunógeno como se ha descrito anteriormente, y los sobrenadantes del cultivo de las células de hibridoma resultantes se seleccionan para identificar un hibridoma que produce un anticuerpo monoclonal que se une a un polipéptido de la invención. Cualquiera de los muchos protocolos bien conocidos usados para fusionar linfocitos y líneas celulares inmortalizadas puede aplicarse para fines de generar un anticuerpo monoclonal para un polipéptido de la invención (véase por ejemplo, Current Protocolos in Immunology, supra; Galfre et al., Nature, 266: 55052(1997); R.H. Kenneth, en Monoclonal Antibodies: A New Dimensión in Biological Analyses, Plenum Publishing Corp., New York, New York (1980); y Lerner, Yale J. Biol. Med. 545: 387-402 (1981 )). Además, el especialista en la técnica entenderá que existen muchas variaciones de dichos métodos que también podrían ser útiles. En una alternativa para preparar hibridomas que secretan anticuerpos monoclonales, un anticuerpo monoclonal para un polipéptido de XMRV de la invención puede identificarse y asilarse explorando una biblioteca de inmunoglobulina combinatoria recombinante (por ejemplo, una biblioteca de presentación de fagos de anticuerpos) con el polipéptido para asilar de este modo los miembros de la biblioteca de inmunoglobulina que se unen al polipéptido. Están disponibles en el mercado kits para generar y explorar bibliotecas de presentación de fármaco (por ejemplo el sistema Pharmacia Recombinant Phage Antibody System, N° de catálogo. 27-9400-01 ; y el kit Stratagene surfZAP™ Phage Display Kit, N° de catálogo 240612). Además, pueden encontrarse ejemplos de métodos y reactivos particularmente adecuados para su uso para generar y explorar bibliotecas de presentación de anticuerpos en por ejemplo las patentes de Estados Unidos N° 5.223.409; la publicación PCT N° WO 92/18619; la publicación PCT N° WO 91/17271 ; la publicación PCT N° WO 92/20791 ; la publicación PCT N° WO 92/15679; la publicación PCT N° WO 93/01288; la publicación PCT N° WO 92/01047; la publicación PCT N° WO 92/09690; la publicación PCT N° WO 90/02809; Fuchs et al., Bio/Technology 9: 1370-1372 (1991 ); Hay et al., Hum. Antibod. Hybridomas 3: 81 -85 (1992); Huse et al., Science 246: 1275-1281 (1989); y Griffiths et al., EMBO J: 12: 725-734 (1993). Además, los anticuerpos recombinantes, tales como anticuerpos monoclonales quiméricos y humanizados, que comprenden porciones humanas y no humanas que pueden prepararse usando técnicas de ADN recombinantes convencionales, están dentro del alcance de la invención. Dichos anticuerpos monoclonales quiméricos y humanizados pueden producirse mediante técnicas de ADN recombinante conocidas en la técnica. En general, los anticuerpos de la invención (por ejemplo, un anticuerpo monoclonal) pueden usarse para asilar un polipéptido de XMRV de la invención mediante técnicas convencionales tales como cromatografía de afinidad o inmunoprecipitación. Un anticuerpo específico del polipéptido puede facilitar la purificación del polipéptido a partir de células y de un polipéptido producido de forma recombinante expresado en células hospedadoras. Además, un anticuerpo específico para un polipéptido de XMRV de la invención puede usarse para detectar el polipéptido (por ejemplo, en un lisado celular, sobrenadante celular, muestra de sangre o muestra de tejido). Los anticuerpos de la presente invención también pueden usarse en diagnóstico para controlar los niveles de proteínas en un tejido, como parte de un procedimiento de ensayo clínico, por ejemplo, para por ejemplo determinar la eficacia de un régimen de tratamiento dado. La detección puede facilitarse acoplando el anticuerpo a una sustancia detectable. Los ejemplos de sustancias detectables incluyen diversas enzimas, grupos prostéticos, materiales fluorescentes, materiales luminiscentes, materiales bioluminiscentes y materiales radioactivos. Los ejemplos de enzimas adecuadas incluyen peroxidasa de rábano rusticano, fosfatasa alcalina, ß-galactosidasa y acetilcolinesterasa; los ejemplos de complejos de grupos prostéticos adecuados incluyen estreptavidina/biotina y avidina/biotina. Los ejemplos de materiales fluorescentes adecuados incluyen umbeliferona, fluoresceína, isotioacianato de fluoresceína, rodamina, diclorotiazinilamina fluoresceína, cloruro de dansilo y ficeoritrina; un ejemplo de un material luminiscente incluye luminol. Los ejemplos de materiales bioluminiscentes incluyen luciferasa, luciferina, proteína verde fluorescente y aecuorina, y los ejemplos de material radioactivo adecuado incluyen por ejemplo, 125l, 131l, 35S, 32P y 3H. Vectores retrovirales. El XMRV de la presente invención también puede usarse como vector de expresión y/o vector de fijación de objetivos en el que inserta un resto en o unido a un XMRV usando métodos conocidos, produciendo de este modo un XMRV recombinante. En una realización el resto de interés es un ácido nucleico que se introduce en el genoma de una XMRV (por ejemplo, usando recombinación homologa) produciendo de este modo un XMRV recombinante y el XMRV recombinante puede expresar el resto de interés. Además, el XMRV recombinante puede usarse para suministrar el resto de interés a células que son objetivo de (pueden ser infectadas por) XMRV (por ejemplo, una célula de tumor de próstata) en condiciones en las que el ácido nucleico se expresa en la célula fijada como objetivo. El ácido nucleico de interés puede ser, un ácido nucleico que codifica un marcador (por ejemplo, neomicina, ß-galactosidasa, proteína fluorescente verde) y/o un agente terapéutico (por ejemplo, interferón, interleuquina, antineoplastinas, péptidos sintéticos) y puede incluir secuencias reguladoras (por ejemplo, promotoras (constitutivas o inducibles), potenciadoras). En realizaciones particulares el XMRV está atenuado (por ejemplo, es avirulento). El XMRV atenuado puede obtenerse usando métodos conocidos (por ejemplo, paso en serie). El genoma del XMRV puede modificarse en el gen que codifica uno o más o todas las proteínas virales (por ejemplo, gag, pol, env) se han sustituido con un ácido nucleico de interés produciendo de este modo un plásmido vector de XMRV. En realizaciones particulares, uno o más genes de XMRV se han sustituido, produciendo de este modo un plásmido vector de XMRV modificado que no puede replicarse. Una línea celular de empaquetamiento que produce proteínas virales pero que carece de la capacidad para producir virus competentes en la replicación, puede usarse para empaquetar el XMRV modificado en partículas retrovirales. El plásmido vector de XMRV que incluye el ácido nucleico de interés puede transfectarse a la línea celular de empaquetamiento en la que el plásmido vector de XMRV se transcribe y se empaqueta en partículas retrovirales modificadas (partículas retrovirales recombinantes). Las partículas retrovirales modificables pueden usar para infectar células que son el objetivo de XMRV y el ácido nucleico de interés presente en el plásmido vector de XMRV puede expresarse entonces en las células infectadas. Una célula infectada con dicha partícula retroviral modificada no puede producir nuevos virus ya que una o más de las proteínas virales no están presentes en las células infectadas. Sin embargo, el ácido nucleico de interés se integra en el ADN de la célula infectada y ahora puede expresarse en la célula infectada. Ensayos de diagnóstico y de exploración. La presente invención también se refiere a ensayos de diagnóstico para evaluar la presencia de expresión de XMRV, o para evaluar la actividad de polipéptidos de XMRV de la invención. En una realización los ensayos se usan en el contexto de una muestra biológica (por ejemplo, sangre, suero, células, tejido) para determinar de este modo si XMRV está presente en un individuo o en una muestra de un individuo, o si un individuo corre el riesgo (tiene una predisposición o una susceptibilidad de) desarrollar cáncer (por ejemplo, un cáncer que pueda desarrollarse debido a la transmisión del XMRV (por ejemplo, transmisión sexual), tales como próstata, cervical o de ovario). La invención también proporciona ensayos para el pronóstico (o predictivos) para determinar si un individuo es susceptible de desarrollar cáncer. Por ejemplo, la presencia de XMRV en un individuo podría indicar que el individuo corre un riesgo aumentado de desarrollar cáncer. Dichos ensayos pueden usarse para fines de pronóstico o predicción para tratar profilácticamente de este modo a un individuo antes de la aparición de los síntomas asociados con el cáncer. Otro aspecto de la invención se refiere a ensayos para controlar la influencia de agentes, o compuestos candidatos (por ejemplo, fármacos u otros agentes) sobre la expresión de la molécula de ácido nucleico o la actividad biológica de polipéptídos de la invención, así como para ensayos para identificar compuestos candidatos que se unen a un polipéptido de XMRV. Estos y otros ensayos y agentes se describen con más detalle en las siguientes secciones. Ensayos de diagnóstico. Pueden usarse moléculas de ácido nucleico de XMRV, sondas, cebadores, polipéptidos y anticuerpos para un polipéptido de XMRV en los métodos de diagnóstico de una susceptibilidad a, o una posibilidad de que un individuo tenga cáncer, así como en kits útiles para el diagnóstico de una susceptibilidad al cáncer. En una realización, la invención se refiere a un método de diagnóstico o detección de cáncer (por ejemplo, cáncer de próstata) usando métodos de hibridación, tales como análisis de Southern, análisis de Northern, o hibridaciones in situ (véase Ausubel, et al., supra). Por ejemplo, una muestra biológica de un sujeto de ensayo (una "muestra de ensayo") de ADN (por ejemplo, ADNc) o ARN se obtiene de un individuo del que se sospecha es susceptible a o predispuesto para el cáncer (el "individuo de ensayo"). La muestra de ensayo puede ser de cualquier fuente que contenga moléculas de ácido nucleico de XMRV tales como una muestra de sangre o una muestra de tejido. Después, se examina la muestra de ADN, ARN o ADNc para determinar si está presente una molécula de ácido nucleico de XMRV. La presencia de la molécula de ácido nucleico de XMRV puede indicarse mediante la hibridación del ARN o del ADNc con una sonda de ácido nucleico. Una "sonda de ácido nucleico", como se usa en este documento, puede ser una sonda de ADN o una sonda de ARN. La sonda puede ser cualquiera de las moléculas de ácido nucleico descritas anteriormente (por ejemplo, toda la molécula de ácido nucleico, un fragmento, un vector que comprende el gen, una sonda o un cebador, etc.). Para detectar ácido nucleico de XMRV se forma una muestra de hibridación poniendo en contacto la muestra de ensayo que se sospecha que contiene el ácido nucleico de XMRV, con al menos una sonda de ácido nucleico. Una sonda preferida es una sonda de ácido nucleico marcada capaz de hibridar con ácidos nucleicos de XMRV descritos en este documento. La sonda de ácido nucleico puede ser por ejemplo, una molécula de ácido nucleico de longitud completa o una porción de la misma, tal como un oligonucleótido de al menos 15, 30, 50, 100, 250 ó 500 nucleótidos de longitud y suficiente para hibridar específicamente en condiciones rigurosas con un ARNm o un ADN genómico apropiado. Por ejemplo, la sonda de ácido nucleico puede ser toda o una porción de la SEC ID N°: 1 o el complemento de la SEC ID N°: 1 ; o puede ser una molécula de ácido nucleico que codifica toda o una porción de la SEC ID N°: 2. Otras sondas adecuadas para su uso en ensayos de diagnóstico de la invención se han descrito anteriormente.

La muestra de hibridación se mantiene en condiciones que son suficientes para permitir la hibridación de la sonda de ácido nucleico con el ácido nucleico de XMRV. Puede usarse también más de una sonda de ácido nucleico de forma concurrente en este método. La hibridación de una cualquiera de las sondas de ácido nucleico es indicativa de una susceptibilidad a o de la posibilidad de que un individuo tenga cáncer (por ejemplo, cáncer de próstata). La hibridación puede detectarse usando análisis de transferencia de Southern, análisis de transferencia de Northern, series de sondas de oligonucleótidos que son complementarías a los segmentos de secuencias diana de ácido nucleico de un individuo. Por ejemplo, en una realización, puede usarse una serie de oligonucleótidos. Las series de oligonucleótidos comprenden típicamente una pluralidad de sondas de oligonucleótidos diferentes que se acoplan a una superficie de un sustrato en diferentes ubicaciones conocidas. Las series de oligonucleótidos incluyen "Virochip" y "GENECHIPS™" (Patente de Estados Unidos N° 5.143.854 y publicación de patente PCT N° WO 90/15070 y 92/10092). Estas series pueden producirse generalmente usando métodos de síntesis mecánica o métodos de síntesis fotodirigida que incorporan una combinación de métodos fotolitográficos y métodos de síntesis de oligonucleótidos en fase sólida. Véase Fodor et al., Science 251 : 767-777 (1991 ), Patente de Estados Unidos N° 5.143.854; Publicación PCT N° WO 90/15070; Publicación PCT N° WO 92/10092; y Patente de Estados Unidos N° 5.424.186, cuyas enseñanzas completas se incorporan como referencia en este documento. Las técnicas para la síntesis de estas series usando métodos de síntesis mecánica se describen, por ejemplo, en la patente de Estados Unidos N° 5.384.261 , cuyas enseñanzas completas se incorporas como referencia en este documento. Una vez que se ha preparado una serie de oligonucleótidos, se hibrida un ácido nucleico de interés a la serie y se explora la molécula de ácido nucleico diana. La hibridación y la exploración se realizan generalmente mediante métodos descritos en este documento y también por ejemplo en las publicaciones PCT N° WO 92/10092 y WO 95/1 1995, y en la patente de Estados Unidos N° 5.424.186, cuyas enseñanzas completas se incorporan como referencia en este documento.

Además el nivel de ácido nucleico de XMRV puede detectarse usando por ejemplo, técnicas de hibridación in situ conocidas por los especialistas en la técnica, o examinando el nivel de expresión, actividad y/o composición de un polipéptido de XMRV, mediante diversos métodos, incluyendo ensayos inmunoabsorbentes ligados a enzima (ELISA), transferencias de Western, inmunoprecipitaciones, inmunohistoquímica e inmunofluorescencia. También puede evaluarse una muestra de ensayo de un individuo para la presencia de una alteración a nivel de un ácido nucleico de XMRV o en la expresión y/o una alteración en la composición del polipéptido codificado ácido nucleico de XMRV. La detección de XMRV en una muestra puede compararse con la expresión o composición de un XMRV en una muestra de control. Una muestra de control es una muestra que corresponde a la muestra de ensayo (por ejemplo, es del mismo tipo de células) y es de un individuo en el que el XMRV no está presente. Pueden usarse diversos medios para examinar la expresión o composición de un polipéptido de XMRV, incluyendo espectroscopia, colorimetría , electroforesis, enfoque isoeléctrico, e inmunoensayos tales como inmunotransferencias (véase también Ausubel et al., supra; particularmente en el capítulo 10). Por ejemplo, en una realización, puede usarse un anticuerpo capaz de unirse al polipéptido (por ejemplo, como se ha descrito anteriormente), preferiblemente un anticuerpo o una marca detectable. Los anticuerpos pueden ser policlonales, o más preferiblemente monoclonales. Puede usarse un anticuerpo intacto o un fragmento del mismo (por ejemplo, Fab, o F(ab')2). El término "marcado", con respecto al anticuerpo, pretende abarcar el marcado directo del anticuerpo mediante el acoplamiento (es decir, el enlace físico) a una sustancia detectable en el anticuerpo, así como el marcado indirecto del anticuerpo haciéndolo reaccionar con otro reactivo que esté directamente marcado. Un ejemplo de marcado indirecto es la detección de un anticuerpo primario usando un anticuerpo secundario marcado con fluorescencia. El análisis de transferencia de Western, usando un anticuerpo como se ha descrito anteriormente que se una específicamente a un polipéptido de XMRV puede usarse para identificar la presencia en una muestra de ensayo de un polipéptido de XMRV. En una realización de este método, el nivel o cantidad de un polipéptido de XMRV en una muestra de ensayo se compara con el nivel o cantidad de un polipéptido de XMRV en una muestra de control. Un nivel o cantidad del polipéptido en la muestra de ensayo que sea mayor o menor que el nivel o cantidad del polipéptido en la muestra de control, de modo que la diferencia sea estadísticamente significativa, es indicativo de una alteración en la expresión del polipéptido de XMRV, y puede ser indicativo de una susceptibilidad al cáncer. Los kits (por ejemplo, kits de reactivos) útiles en los métodos de diagnóstico comprenden componentes útiles en cualquiera de los métodos descritos en este documento, incluyendo por ejemplo, sondas o cebadores de hibridación como se describen en este documento (por ejemplo, sondas o cebadores marcados), reactivos para la detección de moléculas marcadas, anticuerpos que se unen a un polipéptido de XMRV, medios para la amplificación de ácidos nucleicos que comprenden XMRV, o medios para analizar la secuencia de ácido nucleico de XMRV o para analizar la secuencia de aminoácidos de un polipéptido de XMRV, etc. Ensayos de exploración y agentes identificados, La invención proporciona métodos (también denominados en este documento "ensayos de exploración") para identificar la presencia de un ácido nucleico de la invención, así como para identificar la presencia de un polipéptido codificado por un ácido nucleico de la invención. Por ejemplo la presente invención proporciona un método de exploración y de control de la presencia de XMRV en por ejemplo, tejido, unidades de sangre, plasma y/o plaquetas en un depósito de dichas muestras (por ejemplo, un banco de sangre; un banco de órganos). En una realización, la presencia (o ausencia) de una molécula de ácido nucleico de interés (por ejemplo, un ácido nucleico que tenga homología significativa con un ácido nucleico de XMRV) en una muestra puede evaluarse poniendo en contacto la muestra con un ácido nucleico que comprende un ácido nucleico de la invención (por ejemplo, un ácido nucleico que tenga la secuencia de la SEC ID N°: 1 , o un complemento de la misma, o un ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos que tenga la secuencia de la SEC ID N°: 2, o un fragmento o una variante de dicho ácido nucleico), en condiciones rigurosas como se ha descrito anteriormente y después evaluar la presencia o ausencia de hibridación en la muestra. En una realización preferida, las condiciones muy rigurosas son condiciones apropiadas para la hibridación selectiva. En otra realización, una muestra que contiene la molécula de ácido nucleico de interés, se pone en contacto con un ácido nucleico que contiene una secuencia de nucleótidos contiguos (por ejemplo, un cebador o una sonda como se ha descrito anteriormente) que es al menos parcialmente complementaria a una parte de la molécula de ácido nucleico de interés (por ejemplo, un ácido nucleico de XMRV) y se evalúa la presencia o ausencia de hibridación en la muestra que se puso en contacto. En una realización preferida, el ácido nucleico que contiene una secuencia de nucleótidos contiguos es completamente complementario a parte de la molécula de ácido nucleico de XMRV. En cualquiera de las realizaciones anteriores, todo o una porción del ácido nucleico de interés puede someterse a amplificación antes de realizar la hibridación. En otra realización la presencia (o ausencia) de un polipéptido de XMRV, tal como un polipéptido de la invención o un fragmento o variante del mismo, en una muestra puede evaluarse poniendo en contacto la muestra con un anticuerpo que se una específicamente al polipéptido de XMRV (por ejemplo, un anticuerpo tal como los que se han descrito anteriormente) y después evaluar la presencia (o ausencia) de unión del anticuerpo al polipéptido de XMRV en la muestra. En otra realización, la invención proporciona métodos para identificar agentes o compuestos (por ejemplo, proteínas de fusión, polipéptidos, péptidomiméticos, profármacos, receptores, agentes de unión, anticuerpos, moléculas pequeñas u otros fármacos o ribozímas) que alteran o modulan (por ejemplo, aumentan o disminuyen; potencian o inhiben) la actividad de los polipéptido descritos en este documento o que interaccionan de otra manera con los polipéptido de este documento. Por ejemplo dichos compuestos pueden ser compuestos o agentes que se unen a polipéptido descritos en este documento, que tienen un efecto estimulador o inhibidor, sobre, por ejemplo, la actividad de los polipéptidos de la invención; o que cambian (por ejemplo, potencian o inhiben) la capacidad de los polipéptido para interaccionar con moléculas con las que interaccionan los polipéptido de XMRV (agentes de unión a XMRV). Los compuestos candidatos pueden causar un aumento de la actividad del polipéptido. Por ejemplo la actividad del polipéptido puede aumentar en al menos 1 ,5 veces a 2 veces, al menos 3 veces, o al menos 5 veces, en relación con el control. Como alternativa la actividad de polipéptido puede sufrir un descenso, por ejemplo, en al menos el 10%, al menos el 20%, 40%, 50%, ó 75%, o al menos el 90%, en relación con el control. En una realización la invención proporciona ensayos para seleccionar compuestos candidatos o agentes de ensayo para identificar compuestos que se unan a o modulen la actividad de polipéptidos descritos en este documento (o porciones biológicamente activas de los mismos), así como agentes identificables mediante los ensayos. Como se usa en este documento, un "compuesto candidato" o "agente de ensayo" es una molécula química sea de origen natural u obtenida artificialmente que incluye, por ejemplo, péptidos, proteínas, moléculas sintetizadas, por ejemplo, moléculas orgánicas sintéticas, moléculas de origen natural, por ejemplo moléculas orgánicas de origen natural, moléculas de ácido nucleico y componentes de los mismos. En general, los compuestos candidatos para su uso en la presente invención pueden identificarse a partir de grandes bibliotecas de productos naturales o extractos sintéticos (semi-sintéticos) o bibliotecas químicas de acuerdo con métodos conocidos en la técnica. Los especialistas en la técnica de la investigación y el desarrollo de fármacos, entenderán que la fuente exacta de los extractos o compuestos de ensayo no es crítica para el(los) procedimiento(s) de exploración de la invención. Por consiguiente, puede explorarse habitualmente cualquier número de extractos o compuestos químicos usando los métodos ejemplares descritos en este documento. Los ejemplos de dichos extractos o compuestos incluyen, aunque sin limitación, extractos basados en plantas, hongos, procariotas o animales, caldos de fermentación y compuestos sintéticos, así como modificaciones de compuestos existentes. También están disponibles numerosos métodos para generar síntesis aleatoria o dirigida (por ejemplo, semi-síntesis o síntesis total) de cualquier número de compuestos químicos, incluyendo, aunque sin limitación, compuestos basados en sacáridos, lípidos, péptidos y ácidos nucleicos. Están disponibles en el mercado bibliotecas compuestos sintéticos, por ejemplo, de Brandon Associates (Merrimack, NH), y Aldrich Chemical (Milwaukee, Wl). Como alternativa, están disponibles en el mercado bibliotecas de compuestos naturales en forma de extractos de bacterias, de hongos, vegetales y animales de varias fuentes incluyendo Biotics (Sussex, UK), Xenova (Slough, UK) Harbor Branch Oceangraphics Institute (Ft. Pierce, FL), y PharmaMar, U.S.A (Cambridge, MA). Además, se generan bibliotecas producidas de forma natural y sintética, si se desea de acuerdo con métodos conocidos en la técnica, por ejemplo mediante métodos de extracción y fraccionamiento convencionales. Por ejemplo, pueden obtenerse compuestos candidatos usando cualquiera de los numerosos enfoques en métodos de biblioteca combinatoria conocidos en la técnica, incluyendo: bibliotecas biológicas, bibliotecas de fase sólida o fase en solución paralelas; métodos de biblioteca sintética que requieren deconvolución; el método de la biblioteca "una perla un compuesto"; y métodos de biblioteca sintética usando selección por cromatografía de afinidad. El enfoque de biblioteca biológica está limitado a bibliotecas de polipéptidos, mientras que los otros cuatro enfoques son aplicables a polipéptidos, oligómeros no peptídicos o a bibliotecas de pequeñas moléculas de compuestos (Lam, Anticancer Drugs Des. 12: 145 (1997)). Además, si se desea, cualquier biblioteca de compuestos puede modificarse fácilmente usando métodos químicos, físicos o bioquímicos convencionales. Si se desea, los compuestos que han demostrado ser agentes útiles para el tratamiento se modifican químicamente de acuerdo con métodos conocidos en la técnica. Los compuestos identificados como de valor terapéutico pueden analizarse posteriormente usando modelos animales para enfermedades en las que es deseable alterar la actividad o expresión de los ácidos nucleicos o polipéptidos de la presente invención. En una realización, para identificar compuestos candidatos que alteran la actividad biológica de un polipéptido de XMRV, puede ponerse en contacto una célula, tejido, lisado celular, lisado de tejido o solución que contiene o expresa un polipéptido de XMRV (por ejemplo, SEC ID N°: 2), con un compuesto candidato a ensayar en condiciones adecuadas para la infección por XMRV de una célula. Los métodos para evaluar la infectividad vírica se conocen en la técnica (evaluar la capacidad del XMRV para producir partículas retrovirales con actividad de transcriptasa inversa). Como alternativa, la molécula de ácido nucleico o polipéptido de XMRV puede ponerse en contacto directamente con el compuesto candidato a ensayar. El nivel (cantidad) de actividad biológica de XMRV se evalúa (directa o indirectamente) y se compara con el nivel de actividad biológica en un control. Si el nivel de la actividad biológica en presencia del compuesto candidato es diferente, en una cantidad que sea estadísticamente significativa, del nivel de actividad biológica en ausencia del compuesto candidato, o en presencia del vehículo del compuesto candidato solamente, entonces, el compuesto candidato es un compuesto que altera la actividad biológica de un polipéptido de XMRV. Por ejemplo un aumento en el nivel de una actividad biológica de XMRV en relación con el control, indica que el compuesto candidato es un compuesto que potencia (es un agonista de) la actividad de XMRV. Análogamente, un descenso en el nivel de actividad biológica de XMRV en relación con el control, indica que el compuesto candidato es un compuesto que inhibe (es un antagonista de) la actividad de XMRV. En otra realización el nivel de actividad biológica de un polipéptido de XMRV, o derivado, o fragmento del mismo en presencia del compuesto candidato a ensayar, se compara con un nivel de control que se haya establecido previamente. Un nivel de actividad biológica en presencia del compuesto candidato que difiera del nivel de control en una cantidad que sea estadísticamente significativa, indica que el compuesto altera la actividad biológica de XMRV. La presente invención también se refiere a un ensayo para identificar compuestos que alteran la expresión de una molécula de ácido nucleico de XMRV (por ejemplo, ácidos nucleicos antisentido, ARN interferente (por ejemplo, ARNsi, ARNsh), proteínas de fusión, polipéptidos, peptidomiméticos, profármarcos, receptores, agentes de unión, anticuerpos, moléculas pequeñas u otros fármacos o ribozimas) que alteran (por ejemplo, aumentan o disminuyen) la expresión (por ejemplo, la transcripción o la traducción) de la molécula de ácido nucleico o que interaccionan de otra manera con los ácidos nucleicos descritos en este documento, así como compuestos ¡dentificables por los ensayos. Por ejemplo, una solución que contiene un ácido nucleico que codifica un polipéptido de XMRV puede ponerse en contacto con un compuesto candidato a ensayar. El nivel y/o patrón de la expresión de XMRV se evalúa y se compara con el nivel y/o patrón de expresión en un control. Si el nivel y/o patrón en presencia del compuesto candidato es diferente en una cantidad o de un modo que sea estadísticamente significativo, del nivel y/o patrón en ausencia del compuesto candidato, o en presencia de solamente el vehículo del compuesto candidato, entonces el compuesto candidato es un compuesto que altera la expresión de XMRV. Esta invención se refiere además a nuevos compuestos identificados mediante los ensayos de exploración descritos anteriormente. Por consiguiente, se incluye en el alcance de esta invención el uso adicional de un compuesto identificado como se ha descrito anteriormente en un modelo animal apropiado. Por ejemplo, un compuesto identificado como se describe en este documento (por ejemplo un anticuerpo) pude usarse en un modelo animal para determinar la eficacia, toxicidad, o efectos secundarios del tratamiento con dicho compuesto. Como alternativa, un compuesto identificado como se ha descrito en este documento puede usarse en un modelo animal para determinar los mecanismos de acción de dicho compuesto. Además, esta invención se refiere a usos de algunos compuestos identificados mediante los ensayos de exploración descritos anteriormente para el tratamiento como se describen en este documento. Además, un compuesto identificado como se describe en este documento, puede usarse para alterar la actividad de un polipéptido de XMRV o para alterar la expresión de XMRV, poniendo en contacto el polipéptido o la molécula de ácido nucleico (o poniendo en contacto una célula que comprende el polipéptido o la molécula de ácido nucleico) con el compuesto identificado como se describe en este documento. Composición farmacéutica. La presente invención también se refiere a composiciones farmacéuticas que comprenden ácidos nucleicos descritos en este documento, particularmente nucleótidos que codifican los polipéptidos descritos en este documento; que comprenden polipéptidos descritos en este documento (por ejemplo, SEC ID N°: 2 y/o variantes de la misma) y/o que comprenden un compuesto que altera (por ejemplo, aumenta o disminuye) la expresión de XMRV o la actividad del polipéptido de XMRV como se describe en este documento. Por ejemplo, las composiciones pueden formularse con un vehículo o excipiente fisiológicamente aceptable para prepara una composición farmacéutica. El vehículo y la composición pueden ser estériles. La formulación debe adecuarse al modo de administración. Los vehículos farmacéuticamente aceptables adecuados incluyen aunque sin limitación agua, soluciones de sales (por ejemplo, NaCI), solución salina, solución salina tamponada, alcoholes, glicerol, etanol, goma arábiga, aceites vegetales, alcoholes bencílicos, polietilenglicoles, gelatinas, hidratos de carbono tales como lactosa, amilosa o almidón, dextrosa, estearato de magnesio, talco, ácido silícico, parafina viscosa, aceite aromático, esteres de ácidos grasos, hidroximetilcelulosa, polivinilpirrolidona, etc., así como combinaciones de los mismos. Las preparaciones farmacéuticas pueden, si se desea, mezclarse con agentes auxiliares por ejemplo lubricantes, conservantes, estabilizantes, agentes humectantes, emulsionantes, sales para influir en la presión osmótica, tampones, colorantes, aromatizantes y/o sustancias aromáticas y similares que no reaccionen de forma perjudicial con los compuestos activos. La composición, si se desea también puede contener cantidades secundarias de agentes humectantes o emulsionantes, o agentes tamponantes del pH. La composición puede ser una solución líquida, suspensión, emulsión, comprimido, pildora, cápsula, formulación de liberación sostenida, o polvo. La composición pude formularse en forma de supositorio, con aglutinantes y vehículos tradicionales tales como triglicéridos. La formulación oral puede incluir vehículos convencionales tales como calidades farmacéuticas de manitol, lactosa, estearato de magnesio, polivinilpirrolidona, sacarina sódica, celulosa, carbonato de magnesio, etc. Los métodos de introducción de estas composiciones incluyen, aunque sin limitación, intradérmico, intramuscular, intraperitoneal, intraocular, intravenoso, subcutáneo, tópico, oral, e intranasal. Otros métodos adecuados de introducción también pueden incluir terapia génica (como se describe a continuación) dispositivos recargables o biodegradables, dispositivos de aceleración de partículas ("pistolas de genes") y dispositivos poliméricos de liberación lenta. Las composiciones farmacéuticas de esta invención también pueden administrarse como parte de una terapia de combinación con otros compuestos. La composición también puede formularse de acuerdo con los procedimientos rutinarios como una composición farmacéutica adaptada para la administración a seres humanos. Por ejemplo, las composiciones para la administración intravenosa son típicamente soluciones en tampón acuoso isotónico estéril. Cuando sea necesario, la composición puede incluir también un agente solubilizante y una anestesia local para aliviar el dolor en el sitio de inyección. Generalmente, los ingredientes se suministran por separado o se mezclan conjuntamente en una forma de dosificación unitaria, por ejemplo, como un polvo liofilizado seco o concentrado sin agua en un recipiente cerrado herméticamente tal como una ampolla o un sobrecito que indica la cantidad de compuesto activo. Cuando la composición debe administrarse mediante infusión, puede dispensarse junto con un frasco de infusión que contenga agua, solución salina o dextrosa/agua de calidad farmacéutica estéril. Cuando la composición se administra mediante inyección, pude proporcionarse una ampolla de agua estéril para inyección o de solución salina siempre que los ingredientes puedan mezclarse antes de la administración. Para la administración tópica, pueden emplearse formas no pulverizables, formas viscosas a semisólidas o sólidas que comprenden un vehículo compatible con la aplicación tópica y que tengan una viscosidad dinámica preferiblemente mayor que el agua. Las formulaciones adecuadas, incluyen aunque sin limitación soluciones, suspensiones, emulsiones, cremas, pomadas, polvos, enemas, lociones, sol-geles, linimentos, pomadas balsámicas, aerosoles, etc., que, si se desean se esterilizan o se mezclan con agentes auxiliares, por ejemplo, conservantes, estabilizantes, agentes humectantes, tampones o sales para influir en la presión osmótica. El compuesto puede incorporarse en una formulación cosmética. Para la aplicación tópica, también son adecuadas preparaciones de aerosol en las que el ingrediente activo, preferiblemente junto con un material vehículo inerte líquido o sólido, se envasa en un frasco exprimible, mezclado con un propulsor gaseoso volátil a presión, por ejemplo aire a presión. Los compuestos descritos en este documento pueden formularse como sales neutras. Las sales farmacéuticamente aceptables incluyen las formadas con grupos amino libres tales como las obtenidas de ácidos clorhídrico, fosfórico, acético, oxálico, tartárico, etc., y las formadas con grupos carboxilo libres tales como las obtenidas de sodio, potasio, amonio, calcio, hidróxidos férricos, isopropilamina, trietilamina, 2-etilamino etanoi, histidina, procaína, etc. Los compuestos se administran en una cantidad terapéuticamente eficaz.

La cantidad de compuestos que será terapéuticamente eficaz en el tratamiento de un trastorno o afección particular dependerá de la naturaleza del trastorno o afección, y puede determinarse mediante técnicas clínicas convencionales. Además, pueden emplearse opcionalmente ensayos in vitro o in vivo para ayudar a identificar los intervalos de dosificación óptimos. La dosis exacta a emplear en la formulación dependerá también de la vía de administración y de la gravedad de los síntomas de una enfermedad angiogénica, o una enfermedad vascular, una enfermedad cardiaca o una enfermedad circulatoria y debe decidirse de acuerdo con el juicio de un médico y con las circunstancia de cada paciente. Las dosis eficaces pueden extrapolarse a partir de curvas de respuesta a la dosis, obtenidas de sistemas de ensayo de modelos animales o in vitro. La invención también proporciona un envase o kit farmacéutico que comprende uno o más recipientes llenos con uno o más de los ingredientes de la composición farmacéutica de la invención. Asociado opcionalmente con dicho(s) recipiente(s) puede estar un aviso de la forma prescrita por una agencia gubernamental que regula la fabricación, el uso o la venta de productos farmacéuticos o biológicos, este aviso refleja la aprobación por la agencia de la fabricación, uso o venta para administración humana. El envase o kit puede etiquetarse con información referente al modo de administración, la secuencia de la administración del fármaco (por ejemplo por separado, de forma secuencial o concurrente) o similares. El envase o kit también puede incluir medios para recordar al paciente la toma de la terapia. El envase o kit puede ser una dosificación unitaria única de la terapia de combinación o puede ser una pluralidad de dosificaciones unitarias. En particular, los compuestos pueden estar separados, mezclados conjuntamente en cualquier combinación, o estar presentes en un único vial o comprimido. Se prefieren compuestos reunidos en un envase blister o en otro medio de dispensado. Para los fines de esta invención, dosificación unitaria significa dosificación que depende de la farmacodinámica individual de cada compuesto y se administra en dosificaciones aprobadas por la FDA en intervalos de tiempos convencionales. Métodos de terapia. La presente invención también se refiere a métodos de tratamiento (profilácticos, de diagnóstico y/o terapéutico) de una enfermedad asociada con XMRV usando un compuesto terapéutico para XMRV. Un "compuesto terapéutico para XMRV" es un compuesto que inhibe la actividad del polipéptido XMRV y/o la expresión de la molécula de ácido nucleico de XMRV, como se describe en este documento (por ejemplo, un agonista o un antagonista). Los compuestos terapéuticos para XMRV pueden inhibir la actividad del polipéptido de XMRV o la expresión de la molécula de ácido nucleico mediante diversos medios, tales como por ejemplo induciendo una respuesta inmune para un XMRV, impidiendo la actividad del polipéptido de XMRV (por ejemplo, uniéndose a un polipéptido de XMRV) o regulando negativamente la expresión de la molécula de ácido nucleico de XMRV. En una realización el compuesto terapéutico para XMRV es una vacuna. Los compuestos terapéuticos para XMRV representativos incluyen lo siguientes: ácidos nucleicos o fragmentos o derivados de los mismos descritos en este documento, polipéptidos descritos en este documento, peptidomiméticos, proteínas de fusión o profármacos de las mismas, anticuerpos; otras moléculas pequeñas; y otros compuestos que inhiban la expresión del ácido nucleico de XMRV o la actividad del polipéptido, por ejemplo, aquellos compuestos identificados en los métodos de exploración descritos en este documento. En realizaciones particulares, los inhibidores de XMRV son inhibidores de transcriptasa inversa (por ejemplo, AZT, zidovudina, Retrovir) e inhibidores de proteasa. Puede usarse de forma concurrente más de un compuesto terapéutico de XMRV, si se desea. El compuesto terapéutico para XMRV que es un ácido nucleico se usa en el tratamiento de una enfermedad asociada con el XMRV. En una realización, la enfermedad es un cáncer en el que la etiología del cáncer puede atribuirse a la presencia de XMRV en un individuo (por ejemplo, cáncer de próstata, cervical o uterino). El término "tratamiento" como se usa en este documento, se refiere no solamente a la mejoría de los síntomas asociados con la enfermedad, sino también a la prevención o al retraso de la aparición de la enfermedad, induciendo una respuesta inmune a la enfermedad y también disminuyendo la gravedad o frecuencia de los síntomas de la enfermedad. La terapia se diseña para inhibir o regular negativamente la actividad de un polipéptido XMRV en un individuo. Por ejemplo, puede administrase un compuesto terapéutico para XMRV para regular negativamente o disminuir la expresión o disponibilidad de la molécula de ácido nucleico de XMRV o de variantes de las mismas. En una realización, la invención se refiere a un método para tratar cáncer (por ejemplo, cáncer de próstata) en un individuo en el que XMRV está presente en el individuo, que comprende administrar al individuo una cantidad eficaz de un agente que inhiba a XMRV. En otra realización la invención se refiere a un método para detectar cáncer asintomático (de etapa temprana) en un individuo en el que XMRV está presente en el individuo, que comprende detectar la presencia de un XMRV en el individuo en el que la presencia del XMRV es indicativa de cáncer de etapa de temprana en el individuo. En otra realización más, la invención se refiere a un método para identificar un individuo que corre el riesgo de desarrollar cáncer, que comprende determinar si un XMRV está presente en el individuo, en el que si el XMRV está presente en el individuo, entonces el individuo corre el riesgo de desarrollar cáncer. El(los) compuesto(s) terapéutico(s) para XMRV se administran en una cantidad terapéuticamente eficaz (es decir, una cantidad que es suficiente para tratar la enfermedad, tal como mejorando los síntomas asociados con la enfermedad, previniendo o retrasando la aparición de la enfermedad y/o también disminuyendo la gravedad o frecuencia de los síntomas de la enfermedad). La cantidad que será terapéuticamente eficaz en el tratamiento de un trastorno o afección de un individuo particular, dependerá de los síntomas y de la gravedad de la enfermedad y puede determinarse mediante técnicas clínicas convencionales.

Además, también pueden emplearse opcionalmente ensayos in vivo o in vitro para ayudar a identificar los intervalos de dosificación óptimos. La dosis exacta a emplear en la formulación también dependerá de la vía de administración, y de la gravedad de la enfermedad o trastorno, y debe decidirse de acuerdo con el juicio de un médico y con las circunstancias de cada paciente. Las dosis eficaces pueden extrapolarse a partir de curvas de respuesta a la dosis obtenidas de sistemas de ensayo in vitro o de modelos animales. La invención se describirá adicionalmente mediante los siguientes ejemplos no limitantes. EJEMPLIFICACIÓN. EJEMPLO 1. Revisión General de los Métodos Usados para Identificar Gammaretrovirus en Tejido de la Próstata. Métodos y Resultados. 1. Genotipado, procesamiento de tejidos de la próstata y aislamiento de ARN. Se genotiparon hombres en lista de espera para someterse a prostatectomías en la fundación Cleveland Clinic Foundation para la mutación R 462Q (1385G->A) en RNASEL usando un ensayo del sistema Amplification Refractory Mutation System (ARMS) en ADN aislado de PBMC. El análisis emplea un ensayo basado en PCR que usa secuencias de cebadores directos específicos de alelo, capaces de detectar mutaciones homocigotas de tipo silvestre (GG), heterocigotas (GA) u homocigotas mutantes (AA) en RNASEL (Casey G., et al, Mal Genet. 32(4) :581-3, 2002). Inmediatamente después de las prostatectomías, se extrajeron núcleos tisulares de la zona de transición (el sitio de la hiperplasia prostática benigna, BPH) y de la zona periférica (donde se produce generalmente el cáncer) y se congelaron en hielo seco y se almacenaron en nitrógeno liquido a -70°C (del Deparment of Laboratory Medicine, Cleveland Clinic). Inmediatamente después de que se retiraran los núcleos de las próstatas recién extirpadas, el resto del tejido de la próstata se colocó en formalina tamponada neutra al 10% para la fijación. El tejido fijado se procesó y se incluyó en parafina para un uso histológico posterior. Hasta ahora, se habían genotipado 150 pacientes que habían sufrido prostatectomía, constituidos por 73 (el 48J%) con 1385GG (tipo silvestre homocigoto); 62 (el 41 ,3%) con 1385GA (heterocigoto) y 15 (el 10%) con 1385AA (mutante homocigoto). También se recogió una muestra de sangre de estos hombres y se procesó con plasma y se congeló a -30°C. Los núcleos de transición y periféricos se alojaron en hielo seco directamente del laboratorio de anatomía patológica del CCF donde se almacenaron en nitrógeno líquido. Una vez obtenido, el tejido se transfirió de hielo seco inmediatamente a reactivo TRIzol, se homogeneizó hasta completarlo usando un potente homogeneizador, y se procesó para el aislamiento del ARN de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Invitrogen). El ARN del tejido de la próstata se sometió después a una digestión con ADNasa I. Para recuperar la máxima cantidad de ARN después de la digestión con ADNasa, el fenol extraído se extrajo de nuevo dos veces con tampón TE libre de ARNasa. El ARN extraído se precipitó durante una noche a -20°C. Se aisló ARN Poly A+ del ARN total digerido con ADNasa usando el kit Oligotex® de ARN mensajero (Qiagen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Después se midió el ARN Poly A+ usando el kit de cuantificación RIBOgreen (Molecular Probes). Las muestras se almacenaron congeladas a -70°C, hasta que se trasladaron a hielo seco para el análisis de micro serie Virochip. 2. Sondeos con Virochips de ADNc obtenidos de ARN de la próstata. En resumen, el ARN total y el ARN Poly A+ del tejido de la próstata se transcribieron de forma inversa a ADNc usando un cebador Oligo-dT para la síntesis de la primera cadena. Se incorporaron flouróforos Cy5 en la mezcla de reacción en presencia de nucleótidos sin marcar. El ADNc marcado resultante se purificó mediante un centrifugado de la muestra a través de un micro-concentrador Centricon-30 (Amicon). Se añadió la sonda purificada a la microserie de Virochip y se le dejo hibridar durante al menos 12 horas. La microserie hibridada se lavó después usando una solución de sal estricta para retirar cualquier sonda no específica o no unida, de la serie. Los portaobjetos se analizaron después en 2-3 horas usando un escáner para visualizar las señales fluorescentes de la hibridación de la sonda con la serie. Las hibridaciones de la serie usaron sondas amplificadas con Cy5 marcado para el ARN total, o el ARN Poly A+ del tejido de la próstata o agua (control). Se generó una señal de referencia usando una versión complementaria inversa marcada con Cy3 de un polímero de 70 monómeros definido único presente en cada punto de la microserie. Las señales positivas se evaluaron mediante la intensidad de Cy5 en relación con la de los controles. Los resultados obtenidos después de la hibridación, cuando se usaba ARN total aislado a partir del tejido de cáncer de próstata, era una señal positiva de 9 a 14 pacientes genotipados con mutante homocigoto para ARNasa L (1385AA). La señal del virus se detectó en 0 de 10 heterocigotos (1385GA) examinados y en 12 de 13 próstatas homocigotas de tipo silvestre para ARNasa L (1385GG), lo que indicaba que la ARNasa L suprime la replicación del virus (Tabla 1 ). La sonda marcada con CyS se unió al ADN del virus de la leucemia de ratón (MLV). 3. Aislamiento y análisis de la secuencia de la longitud completa del ADNc viral. Para establecer la identidad completa del virus candidato se recuperó ARN viral de una muestra de próstata mediante hibridación/selección. Este material posteriormente se amplificó, se clonó y se secuenció. Inicialmente, el clon más grande abarcaba aproximadamente 1 ,0 kb; este fragmento abarcaba el motivo 3' UTR conservado y se extendía en la mayor parte de la región codificante 3' del genoma viral. La clonación completa de todo el ARN geonómico viral de 8188 nucleótidos (SEC ID N° 1 ) del paciente 35 se determinó posteriormente (Tabla 2). El genoma viral es el de un gammaretrovirus canónico con genes gag, pro-pol y env (FIGURA 3). Los tres marcos de lectura abiertos (ORF) están intactos, por lo tanto, tienen el potencial de generar virus infecciosos. Los gammaretrovirus tienen morfología de tipo C, se reúnen en la membrana plasmática con un núcleo esférico simétrico central y contienen el mayor numero de miembros conocidos de los retroviridae incluyendo el virus de la leucemia de ratón (MLV), virus de la leucemia felina (FeLV) y el virus de la leucemia de gibones (GALV) (Goff, S., eí ai, Field's Virology, cuarta edición, (Knipe, D.M. y Howley, P.M., eds.). Lippincott Williams & Wilkins. New York. 2001 , págs. 1871-1939). El emparejamiento mas significativo en la base de datos geonómica viral de longitud completa es el de un retrovirus de tipo C de ratón xenotrópico conocido como DG-75 (Gl 9628654) (93% de identidad a nivel de los nucleótidos) (FIG. 4). El retrovirus DG-75 se describió como un contaminante exógeno de una línea celular linfoblastoide B EBV. negativa del mismo nombre (Raisch KP., et ai, Virology 250 (1 ): 135-9,1998; Raisch KP., eí ai, Virology 308 (1 ): 83-91 , 2003). Se descubrió que un paso temprano de la línea celular DG-75 (sublínea HAD), estaba libre de retrovirus y se desconoce el origen del virus de DG-75. La divergencia del virus aislado recientemente (denominado en este documento HXV para el virus xenotrópico humano, o como alternativa, XMRV para el virus relacionado con el virus de la leucemia de ratón xenotrópico (MLV)) de DG-75 indica que los dos virus son distintos, pero están relacionados. El índice de similitud entre las secuencias codificantes de HXV35 y DG-75 para gag, pro-pol y env es del 96,3%, 96,3% y 93,8%, respectivamente (alineamiento de Lipman-Pearson) (Tablas 3, 4 y 5). La rama de HXV y DG-75 está relacionada más estrechamente con MCF1233, un MLV obtenido de C57BL que causa linfomas T y B de forma asociada a MHC (Sijts EJ, eí ai, Virus Res 34(3): 339-49, 1994). EL MCF1233 tiene una estructura ecotrópica con secuencias politrópicas en la región 5'. La siguiente rama más estrechamente relacionada contiene las cepas de MLV ecotrópicas clásicas de Moloney, Rauscher y Friend. Diferentes subrramas de virus relacionados incluyen KoRv, un virus aislado a partir de koalas que se agrupa con los virus de la leucemia de gibones (GALV) (Hanger JJ, eí ai, J Virol 74(9): 4264-72, 2000). Todos estos miembros de la familia de los MLV se relacionan con el MLV endógeno de Mus Dunni.

El genoma de HXV35 tiene en sus extremos 5' (nucleótidos 1 a 69) y 3' (nucleótidos 81 16 a nucleótidos 8184) una región repetida (R) de 69 nucleótidos. Cadena debajo de la región R 5' esta la región U5 de 76 nucleótidos seguida del sitio de unión del cebador (PVS) (Tabla 6). El PBS de HXV35 es complementario con los 18 últimos nucleótidos del ARNt de prolina (Itin y Keshet, J. Virol. 54(1 ): 236-239 (1985)), y es por lo tanto diferente del PVS de DG-75 complementario con los ARNt de glutamina o treonina (Raisch KP., eí ai, Virology 308(1 ): 83-91 ,2003). La región gag pro-pol está interrumpida por un único codón de terminación UAG (en el nucleótido 2223) que separa gag de pro pol, un elemento conservado en los retrovirus gamma y épsilon (Goff, S., eí ai, Field's Virology, cuarta edición, (Knipe, D.M y Howley, P.M., eds). Lippincott Williams & Wilkins. New York. 2001 . págs. 1871-1939, 2001 ). Existe una búsqueda del codón de terminación durante del 5% al 10% del tiempo proporcionado para la síntesis del polipéptido pro-pol que se procesa en la proteasa (PR), transcriptasa inversa (RT) e integrasa (IN). EL gen gag codifica un polipéptido de 536 aminoácidos que se procesa en las proteínas de Matriz (M), Proteína p12, Cápsida (CA) y nucleocápsida (NC) (Tabla 3). El marco de lectura abierto env, transcrito como un ARNm cortado y empalmado, codifica un precursor de 645 aminoácidos de las glicoproteínas de la envuelta, y de la subunidad de superficie (SU) y la Subunidad Transmenbrana (TM), (Tabla 5). TM contiene los segmentos de fusión transmembrana e hidrófobos que funcionan en la fusión de las membranas viral y celular. SU es el principal determinante del intervalo de hospedadores y del sitio de unión al receptor. Existen secuencias hipervariables en la proteína SU, responsables de la selectividad de unión al receptor de la superficie de la célula hospedadora. En la proteína SU, la región variable A funciona en el reconocimiento del receptor y la región variable B estabiliza el virus con su receptor especifico (Battini JL, eí ai, Proc Natl Acad Sci U S A. 96(4): 1385-90,1992; Fass D., eí ai, Science 277(5332): 1662-6,1997). Estas regiones variables en HXV35 son prácticamente idénticas en la cepa xenotrópica DG-75 y son distintas del los MLV anfotrópicos y ecotrópicos (Tabla 7). El receptor de la superficie de las células humanas para las cepas de MLV xenotrópicos es XPR-1 (receptor xenotrópico y politrópico 1 ), que contiene muchos dominios que se extienden más allá de la membrana (Battini JL eí ai, Proc Matl Acad Sci U S A. 96(4): 1385-90,1992). Por lo tanto XPR-1 es el supuesto receptor de la superficie de las células para HXV. La 2-5A sintetasa se activa mediante ARNdc virales o mediante estructuras troncales en el ARN que de otra manera sería de cadena sencilla. Por ejemplo, el ARN de HIV-1 TAR es capaz de activar la 2-5A sintetasa in vitro (Maitra, RK, eí ai, Virology, 1994 204(2): 823-7). Además, la ARNasa L es capaz de suprimir de forma potente la replicación de HIV-1 (Maitra, RK, eí ai, virol. , 1998, 72(2): 1 146-52J. La estructura secundaria predicha con MFOLD del ARN genómico de XHV35 se muestra (figura 5) (Zuuker M, eí ai, RNA, 1998, 4(6): 669-79). Existen extensas regiones de plegamiento de pares de bases internos en regiones de estructuras troncales de doble cadena. El ARN de HXV35 se analizará para determinar si existe el suficiente carácter de doble cadena para activar la 2-5A sintetasa. Para verificar la presencia de HXV en tejido del paciente se obtuvo un núcleo de próstata congelado (del paciente VP35 que había demostrado anteriormente ser positivo para el virus tanto con análisis de Virochips y RT-PCR, Tabla 1 ) a partir del laboratorio patológico quirúrgico de CCF en un recipiente de plástico para material de riesgo biológico y se envió directamente al grupo UCSF para analizarlo. Se realizo PCR sobre el ADN genómico aislado a partir del tejido de la próstata (caso VP35) y se confirmó la presencia de ADN de HXV mediante electroforesis en gel de agarosa y secuenciación. Estos resultados confirmaron que el HXV estaba presente en el tejido con cáncer de próstata humano. Además, los parámetros de la RT-PCR anidada se desarrollaron y se usaron para confirmar los tejidos positivos para el retrovirus inicial y para seleccionar la presencia del retrovirus en los restantes tejidos con cáncer de próstata humano. Se diseñaron dos condiciones de PCR anidada. La primera reacción usa cebadores que son específicos para una región (400 pb) en la porción gag del virus. PCRV-GAG-Directo Externo, 5' CGCGTCTGATTTGTTTTGTT 3' (SEC ID N° 34); PCRV-GAG-Inverso Externo, 5' CCGCCTCTTCTTCATTGTTC 3' (SEC ID N° 35); PCRV-GAG-Directo Interno, 5' TCTCGAGATCATGGGACAGA 3' (SEC ID N° 36); PCRV-GAG-Inverso Interno 5' AGAGGGTAAGGGCAGGGTAA 3' (SEC ID N° 37), mientras que el segundo usa cebadores que amplifican 7200 pb de todo el genoma viral (SEMI-anidada) Env 7600 Directo Externo, 5' CGCTTGGTCCAGTTTGTAAAA 3' (SEC ID N° 38); Env 227 Inverso, 5' TGGGGAACTTGAAACTGAGG 3' (SEC ID N° 39); Env 720 Directo Interno, 5' CTAGTGGCCACCAAACAATTC 3' (SEC ID N° 40). 7600 Directo Externo y 227 Inverso son los cebadores de oligonucleótidos externos para la PCR semianidada en la región env-LTR. 7200 Directo Externo es el cebador anidado. La electroforesis en gel de 3 RT-PCR anidadas de diferentes pacientes del VP descubrió que era un mutante homocigoto (1385AA, R462Q) para RNASEL demostrando que la RP-PCR anidada usando la región gag era capaz de detectar el virus en 1 (VP10) de los 3 pacientes, mientras que los cebadores semianidados amplificaron productos no específicos (Figura 6). Los análisis de secuenciación para el producto de PCR verificaron que el ARN viral era de HXV. 4. Identificación de un virus relacionado con HXV en la línea celular de cáncer de próstata humano LNCaP. Para determinar si las líneas celulares de cáncer de próstata humanas comunes (PC3, LMCaP y DU 145) o las células epiteliales de la próstata normales (PrEC, Clonetics Co.) contenían HXV o un virus estrechamente relacionado, se realizo RT-PCR en ARN de estas células usando cebadores específicos para una región de 700 pb conservada específica dentro de la región codificante de la proteína env de HXV (figura 7). La RT se realizó usando cebadores de hexámeros aleatorios (Applied Biosystems). Posteriormente se realizo la PCR sobre el ADNc producido usando cebadores específicos para la región de 700 pb conservada del HXV (virus directo, 5' GTT TAT GGC CAG TTT GGA AA 3' (SEC ID N° 41 ); Virus inverso, 5' GCC TTA TGG TGG GGT CTT TC 3' (SEC ID N° 42)).Como control positivo, se usaron 8 cebadores específicos del exón GAPDH. Los resultados mostraron una banda del tamaño correcto para un producto de env relacionado con HXV solamente de las células LNCaP (virus de 700 pb) cuando se analizaban mediante electroforesis de en gel de agarosa. El producto de ADN de GAPDH (391 pb) estaba presente en las reacciones de RT-PCR de todas las líneas celulares (FIGURA 6). Curiosamente, la línea celular LNCaP es heterocigota para una mutación de deleción inactivadora en la ARNasa L (4710AAAG) y es heterocigota para R462Q. Por el contrario PC3, DU 145 y PrEC tienen ARNasa L de tipo silvestre (Xiang Y, et al., Cáncer Res. n2003 63(20): 6795-801 ; Malathi K., et al., Cáncer Res. 64(24): 9144-51 , 2004 eí ai, 2004). Los resultados descritos en este documento indican por lo tanto que ARNasa L suprime la infección o la replicación de HXV. El fragmento de PCR env de LNCaP se clonó en el vector pGEM®-T Easy (Promega) y se secuenció para determinar la similitud de secuencia con respecto a la secuencia del virus descubierta en las muestras de tejido de la próstata humana. Después del alineamiento de secuencia de un segmento de 675 nucleótidos del gel env del virus de LNCaP, usando BLAST, se descubrió que el virus LNCaP era el 97% homologo a los niveles de nucleótido y aminoácidos con el prototipo de virus, HXV35 (Tabla 8). El mismo plásmido que contenía el fragmento de PCR purificado se secuenció otras 3 veces para determinar si existían errores en el análisis de secuenciación de ADN. De este modo se confirmo que el virus de células LNCaP difiere en aproximadamente el 3-4% en este particular tramo de 700 pb. Es probable que la inactivación de la ARNasa L, como resultado de esta mutación, permita que los virus relacionados con HXV infecten y se repliquen en las células LNCaP. Para determinar si se estaban liberando partículas de retrovirus con actividad de transcriptasa inversa a los medio desde estas células LNCaP infectadas con virus, los medios del cultivo tisular de las células LNCaP infectadas se ensayaron a los 2, 4 y 8 días de incubación para detectar actividad de transcriptasa inversa. Este ensayo usa un ácido polirriboadenílico homopolimérico sintético [poly(rA)] como plantilla y un ácido oligodexitimidílico [oligo(dT)] como cebador. Los medios del cultivo tisular se incubaron con este complejo cebador-plantilla y con V-32P-dTTP; la incorporación de dTMP resultante se controló colocando gotas de alícuota de reacción en papel de DEAE y retirando medíante lavado el dTTP no incorporado. Se depositaron alícuotas de medios LNCaP no diluidos o diluidos en papel DEAE seco y se secaron durante 30 minutos con una lámpara de calor. Se usaron reacciones simulacro que no contenían medios de control negativo. El papel se lavó tres veces con 2 x SSC, se aclaró brevemente con EtOH al 95% dos veces y secó con una lámpara de calor. El papel se envolvió en plástico y se dejó en exposición a una película de rayos X (Kodak) a -70°C durante 12 horas. Los resultados demuestran que los medios de cultivo tisular de LNCaP contienen transcriptasa inversa activa mientras que los controles simulados solamente mostraron V 32P-dTTP no incorporado como trasfondo (FIGURA 8). Esto demostró también que los medios de las células LNCaP infectadas son capaces de infectar células LCNaP y DU145 no infectadas, aunque que la cantidad de virus presente en las células DU145 era menor que en las LNCaP después de la infección como indicaba el análisis de RT-PCR usando cebadores específicos para el retrovirus. DU145 es homocigota de tipo silvestre para al ARNasa L (Xiang Y., eí ai, Cáncer Res., 2003, 63(20): 6795-801 ). La diferencia en la cantidad de virus presente en estas células después de la infección puede deberse a las mutaciones de la ARNasas L descubiertas en la línea celular LNCaP que no están presentes en las células DU145. La deficiencia de ARNasa L enzimática en LNCaP puede permitir que el virus evite el efecto antiviral de la ARNasa L, mientras que la carga de virus en las células DU145 disminuye debido a que estas células tienen ARNasa L completamente funcional. 5. Identificación del ácido nucleico de HXV en tejido con cáncer de próstata mediante métodos de hibridación de fluorescencia in situ (FISH). Para demostrar directamente la presencia de ADN de HXV en próstatas, se realizo FISH en tejidos de próstata humana recogidos mediante prostatectomía y se fijaron posteriormente en formalina y se incluyeron en parafína. La línea celular LNCaP, confirmó tener una cuasi especie del virus mediante análisis de RT-PCR y secuenciación, y se uso como control positivo, mientras que PC3 y DU145, que se descubrieron como negativas para el virus se usaron como controles negativos.

Se prepararon citobloques de las tres líneas celulares. Aproximadamente 109 células se lavaron con solución salina equilibrada de Hank (HBSS) sin rojo fenol, o Ca++ y Mg++ (GIBCO) y se resuspendieron lenta pero completamente con formalina tamponada neutra al 10%. Después se fijó la suspensión durante una noche a 4°C. Después se centrifugaron y se lavaron las células dos veces con HBSS. El sobrenadante se aspiró y las células se resuspendieron con una gota de HBSS. La suspensión celular se transfirió con una pipeta a un pocilio de una cásete de citobloques. Los citobloques con cultivos celulares fijados se enviaron al laboratorio de histología para procesarlos en 24 horas. Los citobloques procesados se incluyeron en bloques de parafina, y se cortaron en secciones de 4-6 µm de grosor en portaobjetos super-frost y se hornearon durante al menos 1 hora a 60-65°C para asegurar la adherencia de las células a los portaobjetos. La sonda FISH para HXV VP35 se generó usando un fragmento de 2,15 kb del genoma del Virus 2345 directo 5' ACC CCT AAG TGA CAA GTC TG 3' (SEC ID N° 43) Virus 4495 inverso 5' CTG GAC AGT GAA TTA TAC TA 3' (SEC ID N° 44) que se clonó en el vector pGEM®-T Easy. El vector recombínate se restringió usando EcoRI para liberar el fragmento de ADNc viral de 2,15 kb y se purifico para la generación de la sonda FISH (Quiagen). El inserto de ADNc viral de 2,15 kb purificado se usó en una reacción de traducción con desplazamiento de mella (nick) (Vysis Inc.) como se describe en las instrucciones del fabricante para producir una sonda marcada por fluorescencia. El tamaño de la sonda de aproximadamente 250 pb se determinó en un gel de agarosa. A la muestra se le añadieron ADN de COT1 humano (Visis Inc.) y ADN de placenta humana (Sigma) como agentes de bloqueo. Después se precipito la sonda y se resuspendió en agua sin nucleasa. Para determinar la incorporación, se comparó la emisión de fluorescencia del sobrenadante de la etapa de precipitación con el de la sonda resuspendida. Se determinó que la incorporación media de UTPd era del 19%. Portaobjetos con cortes de aproximadamente 4 µm de LNCaP, DU145 y PC3 recién horneados, se liberaron de la parafina a través de una serie de lavados de xileno. Los portaobjetos sin parafina se rehidrataron después a través de una serie de concentraciones decrecientes de etanol. El tejido rehidratado se sometió a una recuperación de la diana y se aclaró en H2O. Se aplicó proteinasa K (Dako) directamente a los portaobjetos durante 10 minutos a temperatura ambiente. El tejido se aclaro de nuevo en H2O y se deshidrató a través de soluciones con concentraciones crecientes de etanol. Las etapas restantes se realizaron en luz reducida para minimizar el fotoblanqueo de la sonda. En portaobjetos recién secados, se aplico la mezcla de sonda [3:1 sonda + 7:1 tampón de hibridación (Vysis Inc.)]. Se colocaron cubres sobre los portaobjetos a los que se extrajeron las burbujas y se sellaron herméticamente con goma rubber cement. La sonda y el ADN diana se desnaturalizaron usando Vysis Hybrite (Vysís). La hibridación se produjo a 37°C durante una noche en una cámara humidificada sin luz. Al día siguiente, se retiraron los cubres empapando los portaobjetos en 2 x SSC. Después se agitaron los portaobjetos durante 3 segundos y se incubaron durante 1 minuto en un lavado de 2 x SSC a 57°C. Después se aclararon los portaobjetos con 2 x SSC a temperatura ambiente cuidadosamente, seguido de agua destilada y se dejo secar al aire. Se aplico el medio de montaje Vectashield con una contratinción con DAPI (Vectasil Inc.) al tejido seco y se añadieron los cubres. Los resultados muestran señales verdes fluorescentes positivas que se observaron en el citoplasma y el núcleo de las células LNCaP, mientras que no se observaba ninguna señal en las células DU145 o PC3 (FIGURA 9). Estos resultados se correlacionan con los datos de RT-PCR que mostraban que el virus estaba presente en células LNCaP, y no en las células DU145 o PC3. La intensa tinción observada dentro del citoplasma indicaba que parte de la sonda podía unirse al ARN viral así como al ADN. Después de realizar un pretratamiento del tejido con ARNasa, una cantidad significativa del marcado disminuyo en el citoplasma confirmando la hibridación con ARN e indicando que el marcado en el citoplasma podía ser una unión de la sonda con el ARN y con ADN viral no integrado. La digestión con ADNasa después de la digestión con ARNasa eliminó completamente las señales fluorescentes tanto en el citoplasma como en el núcleo, especificando la hibridación de la sonda con el ADN viral (no se muestra). No se realizó pretratamiento con ADNasa en el tejido de la próstata humana en los posteriores experimentos. Como resultado, se mantuvo la posibilidad de que la sonda hibride con cualquier secuencia viral (ARN o ADN) en los tejidos del paciente. Los resultados de los experimentos iniciales usando portaobjetos de la microserie de tejido de cáncer de próstata humano (TMA) (FIGURA 10) demuestran que aproximadamente el 1 % de las células que tienen hibridación especifica para la sonda de ADN de HXV, y aquellas positivas que están presentes en pacientes que se descubrieron eran positivos para el virus mediante RT-PCR en el grupo UCSF (Tabla 9). Los portaobjetos se examinaron en un estudio ciego, permitiendo la investigación imparcial de los experimentos FISH. Se asignó un valor umbral arbitrario para cuantificar los resultados de FISH. Las directrices para controlar los resultados FISH positivos eran de la siguiente manera: < 1 célula positiva/500 células contadas = -; 1-2 células positivas/500 células contadas = +/-; 3-4 células positivas/500 células contadas= + y 5-6 células positivas/500 células contadas = ++. Los resultados de FISH positivos correlacionaban con los resultados de RT-PCR para el grupo UCSF. Aunque se observaron hibridaciones positivas en 5 de 8 tejidos de pacientes que se descubrió que eran positivos para HXV mediante RT-PCR, se determinó que un tejido (VP31 ) era "++" para FISH, sin ser positivo para el virus por RT-PCR. Las explicaciones posibles para la obtención de solamente 5 de 8 positivos usando FISH podrían ser las diferencias en la frecuencia del virus dentro de la muestra de tejido específica que se analizaba en comparación con la del tejido usado para el análisis de RT-PCR, dando como resultado un numero viral por debajo del limite detectable por el método FISH. Como alternativa, también podría haberse producido un problema técnico durante la recogida y el procesamiento del tejido, lo que causó la degradación del ARN o del ADN. 6. Detección de HXV con nuevos anticuerpos antipéptido de HXV purificados por afinidad.

Para detectar la proteína gag de HXV en células y tejidos infectados, se generaron nuevos anticuerpos (Open Biosystems, Inc.). Se generó un diagrama de hidropatía a partir de la proteína gag de HXV35 para el que se seleccionaron los siguientes péptidos como inmunógeno (FIGURA 11 ): MA: DVKKRRWVTFCSAE (SEC ID N° 7) (anticuerpo 401 ) CA: EAGKAVRGNDGRPTQL (SEC ID N° 8) (anticuerpo 402) NC: KDCPKKPRGPRGPR (SEC ID N° 9) (anticuerpo 403). Se generaron anticuerpos en conejos y se purificaron por afinidad posteriormente mediante unión a y elución de las proteínas inmovilizadas (de acuerdo con protocolos desarrollados en Open Biosystems Inc.). Los anticuerpos para MA (401 ) y NC (403) eran capaces de detectar gag de las células LNCaPR infectadas con un virus relacionado con HXV (FIGURA 12). Conclusiones. En este documento se describe el descubrimiento de los nuevos gammaretrovirus HXV presentes en próstatas con tumores. El porcentaje de próstatas que contienen HXV es significativamente mayor en pacientes con una variante de R462Q homocigota de de ARNasa L (HPC1) (el 60%) que en pacientes que son de tipo silvestre o heterocigotos (< 10%). La implicación potencial del HXV en esta enfermedad se basa por lo tanto principalmente en un mayor índice de aparición de HXV en próstatas de pacientes con mutaciones en las líneas génicas homocigotas en el gen de la ARNasa L, un gen candidato de susceptibilidad al cáncer de próstata (HPC1). Mas allá de esta correlación, la demostración de que las infecciones por HXV contribuyen a la carcinogénesis protática es la siguiente. Como grupo, los retrovirus son responsables de un amplio intervalo de diferentes enfermedades incluyendo inmunodeficiencia, leucemia y enfermedad neurológica (Goff, S., Retroviridae: The Retroviruses and Their Replication, Capitulo 57 en "Field 's Virology", cuarta edición (Knipe, D.M and Hwley, P.M., eds). Lippiincott Williams & Wilkinks. New York, págs. 1871 -1939, 2001 ). Sin embargo, muchos de los retrovirus simples son relativamente benignos e incluso se usan ampliamente como estructuras para vectores de terapia génica. Un número relativamente pequeño de retrovirus tales como lentivirus HIV1 y algunos retrovirus de las aves son citopáticos. Otros, concretamente los retrovirus transformantes agudos contienen genes hospedadores que causan tumores agresivos en ausencia de latencia. Pero la mayoría de los retrovirus no son citopáticos y tienen efectos mínimos sobre la replicación o la fisiología celulares. Estos retrovirus, a diferencia de muchos otros virus, usan solamente una pequeña proporción de la capacidad de replicación celular. A menudo se obtiene una viremia de bajo nivel in vivo que es persistente durante la vida del animal. Sin embargo, incluso cuando no son citopáticos, los retrovirus causan enfermedad mediante mutagénesis de inserción que altera el control de la división o supervivencia celular. Estos sucesos de inserción del ADN pueden activar proto-oncogenes endógenos y conducir a tumorgénesis. El proceso de enfermedad puede ser muy lento como en el caso del virus del tumor de mama de ratón (MMTV). El HXV puede ser un miembro de la última categoría de retrovirus simples, de replicación competente caracterizada por el crecimiento lento y por un largo periodo de latencia. Los retrovirus simples están vinculados principalmente a leucemia o a linfoma, enfermedades que actualmente no están implicadas en infecciones por HXV. El número de células de próstata infectada con HXV, incluso en casos de ARNasa L homocigota (R462Q) es bajo (del orden del 1 %) (Tabla 9). La potencial contribución del HXV al cáncer podría deberse a una infección lenta que daría como resultado una atrofia infamatoria proliferativa, un precursor sospechoso de la neoplasia intra-epitelial prostática y del carcinoma (Nelson WG., eí a , N Engl J Med 349(4): 366-81 , 2003). Las células infectadas, aunque pocas en número, podían producir factores de crecimiento, citoquinas u otros factores que contribuirían indirectamente a la proliferación celular (Brightman BK., eí ai, J Virol., septiembre de 1990; 64(9): 4582-4). Sin tener en cuenta el mecanismo, es probable que cualquier carcinogénesis causada por HXV podría ocurrir como un proceso de etapas múltiples que se produciría a lo largo de muchos años. El hecho de que el cáncer de próstata es una enfermedad de la edad que no es evidente hasta la edad de 65 años es coherente con un virus lento que causa inflamación crónica o recurrente. La revisión general descrita en el Ejemplo 1 se detalla aun más en los Ejemplos 2 y 3 de la siguiente manera. EJEMPLO 2. Identificación de un genoma de gammaretrovirus distintivo en tumores de próstata de pacientes homocigotos para la variante de RNASEL R462Q . La ARNasa L es un efector importante de la respuesta antiviral innata. Las mutaciones o variantes que alteran la función de la ARNasa L, particularmente R426Q, se han propuesto como factores de susceptibilidad para el cáncer de próstata. Como se muestra en este documento, es probable que una infección vírica contribuya al cáncer de próstata en individuos que alojan la variante R462Q. Se ensayo la presencia de secuencias virales en ADNc amplificado aleatoriamente de tumores de próstata mediante hibridación con una microserie de ADN constituida por oligonucleótidos correspondientes a las secuencias mas conservadas de todos los virus conocidos. La presencia de las secuencias retrovirales se mostró mediante microserie en 7 de 11 casos homocigotos para R462Q (QQ), y en uno de 8 casos heterocigotos (RQ) y homocigotos de tipo silvestre (RR). Los genomas víricos de longitud completa se clonaron y se secuenciaron a partir del tejido del tumor de 2 casos (QQ). El virus está estrechamente relacionado con virus de leucemia de ratón xenotrópicos (MuLV), pero su secuencia es claramente diferente de todos los miembros conocidos de este grupo. En base a la secuencia recuperada, se desarrolló un ensayo de RT-PCR específico y el ensayo del tejido tumoral se expandió hasta un total de 86 casos. Se descubrió que ocho de 20 casos (QQ) (el 40%) eran positivos en comparación con solamente una muestra (el 1 ,5%) entre 66 casos RQ y RR. La comparación de secuencias gag y pol de diferentes tumores aislados indicaba infección con los mismos virus en todos los casos, aunque la variación de secuencia era coherente con las infecciones adquiridas independientemente. Estos datos proporcionan la primera demostración de que el virus relacionado con MuLV xenotrópico puede producir una autentica infección humana e implica estrechamente a la actividad de ARNasa L en la prevención o eliminación de la infección in vivo. Estos descubrimientos también demuestran una relación entre la infección exógena y el desarrollo del cáncer en individuos genéticamente susceptibles. Materiales y métodos. Genotipado de pacientes y procesamiento del tejido prostático Todas las muestras humanas usadas en este estudio se obtuvieron de acuerdo con protocolos aprobados por el Cleveland Clinic's Institutional Review Board. Los hombres en lista de espera para someterse a prostatectomías en la Clínica Cleveland se genotiparon para la variante de RNASEL R462Q (1385G ?-A) usando un ensayo de genotipado TAQMAN preparado anteriormente (Applied Biosystems, foster City, CA, USA; Assay c_935391_1 ) en ADN aislado de células mononucleares de la sangre periférica (PBMC). Se ensayaron cinco nanogramos de ADN genómico de acuerdo con las instrucciones del fabricante y se analizaron en un instrumento 7900HT Sequence Detection System de Applied Biosystems. Inmediatamente después de las prostatectomías, se tomaron núcleos tisulares de la zona de transición (el sitio de la hiperplasia prostática benigna, BPH) y de la zona periférica (donde aparece el cáncer generalmente), se congelaron inmediatamente en nitrógeno líquido y se almacenaron a -80°C. El resto del tejido prostático se fijó con formalina tamponada neutra al 10%, se procesó y se incluyó en parafina para análisis histológicos posteriores. Los núcleos de tejido congelado se transfirieron de hielo seco inmediatamente al reactivo TRIZOL (Invitrogen, Carisbad, CA, USA), se homogeneizaron con un homogeneizador automático o de forma manual usando un escalpelo seguido de una jeringa y se aisló el ARN total de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El ARN del tejido de la próstata se sometió después a ADNasa I libre de ARNasa (Ambion, Austin, TX, USA) durante 30 minutos a 37°C. Después se extrajo la muestra de un fenol y el ARN se precipitó con isopropanol durante una noche a -20°C seguido de centrifugado a 12.000 g durante 30 minutos a 4°C. Se aisló ARN poli-A del ARN total digerido con ADNasa usando el kit Oligotex mRNA Midi Kit (Qiagen USA, Valencia, CA, USA) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La concentración de ARN poli-A se midió usando el kit de cuantificación RIBOgreen (Molecular Probes, Invitrogen, Carisbad, CA, USA), y las muestras se almacenaron a -80°C. Exploración de microseries. Las microseries Virochip usadas en este estudio eran idénticas a las descritas anteriormente (Wang D, eí ai, 2002, Proc Natl Acad Sc. USA 99: 15687-15692; Wang D, eí ai, 2003, PloS Biol. 1 : E2; Urisman A, eí ai, 2005, Genome Bioi 6: R78) las muestras de ARN de tumores de próstata se amplificaron y se marcaron usando un método de PCR aleatorio modificado Ronda A/B y se hibridaron con las microseries Virochip como se ha descrito anteriormente (Wang D, eí ai, 2003, PLoS Biol. 1 : E2). Las microseries se exploraron con un escáner Axon 4000B (Axon Instruments, Union City, CA, USA) y se clasificaron usando el software del paquete GenePix 3.0. Los datos de la microserie se sometieron a la base de datos en NCBIGEO (GSE3607). Y los patrones de hibridación se interpretaron usando E-Predict como se ha descrito anteriormente (Urisman A, eí ai, 2005, Genome Biol. 6: R78) (Tabla 12). Para preparar las figuras 22A-22B, se usaron intensidades de hibridación menos el trasfondo de todos los oligonucleótidos retrovirales (205) para agrupar las muestras y los oligonucleótidos. El enlace jerárquico medio se agrupó mediante correlación de Pearson a medida que la similitud métrica se estimaba usando Cluster (versión 2.0) (Eisen, MB., PNAS 95: 14863-14868 (1998)). Las imágenes de Cluster se generaron usando Java TreeView (versión 1.0.8) (Saldaña, AJ., 2004, Bioinformatics 20: 3246-3248). Clonación y secuenciación del genoma. El ADNc marcado y amplificado de la muestra tumoral VP35 se híbrido con una microserie marcada de forma manual que contenía varios oligonucleótidos retrovirales, que tenía una intensidad de hibridación alta en Virochip durante la exploración inicial de la microserie. Los ácidos nucleicos que hibridaban con dos de los oligonucleótidos (9628654 317 rc obtenido de MTCR: TTC GCT TTA TCT GAG TAC CAT CTG TTC TTG GCC CTG AGC CGG GGC CCA GGT GCT CGA CCA CAG ATA TCC T (SEC ID N° 45); y 9626955 16 rc obtenido de virus formadores de focos en el bazo: TCG GAT GCA ATC AGC AAG AGG CTT TAT TGG GAA CAC GGG TAC CCG GGC GAC TCA GTC TGT CGG AGG ACT G (SEC ID N° 46)) se eluyeron individualmente de la superficie de las colonias y se amplificaron mediante PCR mediante cebadores de Ronda B. La preparación de la serie manual, la hibridación, la recuperación de la sonda y la amplificación por PCR del material recuperado se realizaron consecutivamente. Las muestras de ADN amplificadas recuperadas se clonaron después en el vector PCR2.1-TOPO TA (Invitrogen), y las bibliotecas resultantes se exploraron mediante hibridación de colonias con los oligonucleótidos anteriores correspondientes como sondas. Las hibridaciones se realizaron usando tampón Rapid-Hyb (Amersham, Piscataway, NJ, USA) de acuerdo con el protocolo del fabricante a 50°C durante 4 horas. Se secuenciaron ocho clones positivos, de los cuales dos (uno para cada biblioteca, clones K1 y K2R1 en la Figura 23A) eran virales y tenían un 94-95% de identidad de nucleótidos con respecto a MTCR. Para secuenciar el resto de la secuencia del genoma de VP35 así como todo el genoma del tumor VP42, se amplificaron fragmentos por PCR usando ADNc amplificado (Ronda B) o no amplificado (Ronda A) preparado para la exploración con el Virochip original. Esto se consiguió usando en primer lugar una combinación de cebadores obtenidos de la secuencia de MTCR (GenBank: NC 001702) y clones recuperados en la fase temprana de XMRV; todos los cebadores se presentan en la Tabla 1 1. Los fragmentos amplificados se clonaron en el vector PCR2.1 -TOPO TA (Invitrogen) y se secuenciaron usando cebadores de secuenciación M13. El ensamblaje del genoma se realizó usando CONSED versión 13.84 para Linux (Gordon, D., eí ai, 1998, Genoma Res 8: 195-202). Las secuencias genómicas ensambladas de XMRV VP35 y VP42 se han depositado en el GenBank (accesos DQ241301 y DQ241302). PCR La exploración de las muestras tumorales mediante RT-PCR anidada en gag se realizó de acuerdo con el protocolo S3. Los fragmentos de PCR de todos los casos positivos se purificaron en gel usando el kit de extracción en gel QIAEX II (Qiagen), se clonaron en el vector pCR2.1-TOPO TA (Invitrogen) y se secuenciaron usando cebadores de secuenciación M13. Se realizó una PCR de Pol usando ADNc amplificado (material con Ronda B) como plantilla. La secuencia de los cebadores usada para la amplificación (2670F, 3870R, 381 OF, y 5190R) se presenta en la Tabla 1 1 . Los productos amplificados se purificaron en gel usando el kit de extracción en gel QIAEX II (Qiagen), y los productos purificados se usaron directamente para secuenciación. Análisis Filogenético El árbol filogenético de los genomas de longitud completa (Figura 24) se generó de la siguiente manera. En primer lugar los genomas de XMRV VP35 (GenBank: DQ241301 ) y VP42 (GenBank: DQ241302), MTCR (GenBank: NC 001702), MuLV DG-75 (GenBank: AF221065), MuLV MCF1233 (GenBank: U13766), AKV MuLV (GenBank: J01998), Friend MuLV (GenBank: NC 001362), Rauscher MuLV (GenBank: NC 001819), Moloney MuLV (GenBank: NC 001501 ), virus de la leucemia felina (GenBank: NC 001940), virus de la leucemia de Gibones (GenBank: NC 001885), y retrovirus Koala (GenBank: AF151794) se editaron de forma manual para hacer que todos los genomas tengan la misma longitud, es decir R a R. Las secuencias editadas se alinearon después con ClustalX versión 1.82 para Linux (Thompson, JD., eí al., 1997, Nucleic Acids Res 25: 4876-4882; Jeanmougin, F., eí ai, 1998, Trends Biochem Sci 23: 403-405) usando ajustes por defecto. El árbol se generó en base a solamente posiciones sin huecos. Se usaron también la corrección de Kimura para sustituciones de bases múltiples (Kimura, M., 1980, J Mol Evol 16: 1 1 1-120) y el muestreo de bootstrapping con N = 1000.

Los árboles filogenéticos de los fragmentos gag y pol de diferentes pacientes (Figura 27A-27B) se generaron como anteriormente, excepto que solamente se incluyeron los genomas de MuLV. Los árboles filogenéticos de poliproteínas Gag-Pro-Pol (Figura 29A) y Env (Figura 29B) se basaban en alineamientos de secuencias proteicas extraídas de los registros del GenBank de los 12 genomas anteriores y se generaron como anteriormente, excepto que se incluyeron los huecos y no se usó la corrección de Kimura. Abreviaturas. 2-5A - 2'-5' oligoadenilato 5'-fosforilado; CAT-I - Transportador de aminoácido catiónico; FLV - Virus de la leucemia felina; GALV - Virus de la leucemia de Gibones; GRE - Elemento de respuesta glucocorticoides; HPC - Cáncer de próstata hereditario; IFN - Interferón; KoRV - Retrovirus Koala; MCF1233 - Virus de leucemia de ratón 1233 que induce focos celulares en Visón; MuLV - Virus de la leucemia de ratón; MTCR - Retrovirus de ratón de tipo C; NZB-9-1 - Virus xenotrópico New Zealand Black 9-1 ; OAS - 2'-5' oligoadenilato sintetasas; QQ -R462Q homocigota para RNASEL; QR - R462Q heterocigota para RNASEL; ARNasa L - Ribonucleasa L; RR - RNASEL homocigota de tipo silvestre; SCLC -Cáncer pulmonar microcítico; SYG 1 - supresor del gpal de levadura; VRA -región variable A; VRB - región variable B; XMRV - virus relacionado con el MuLV xenotrópico; XPR1 - receptor de retrovirus xenotrópico y politrópico. Resultados. Detección de XMRV mediante ensayos basados en microseries.

La búsqueda de virus potenciales en tumores de cáncer de próstata, una estrategia basada en microseries de ADN se empleó para seleccionar virus entre todas las familias virales conocidas (Wang D, eí ai, 2002, Proc Natl Acad Sc. USA 99: 15687-15692; Wang D, eí ai, 2003, PLoS Bioi 1 : E2). El ARN total o poliadenilado extraído de tejido tumoral se amplificó en primer lugar y se marcó con fluorescencia de manera no específica de secuencia. Los fragmentos amplificados y marcados, que contenían secuencias virales potenciales así como del hospedador, se hibridaron después con una microserie de ADN (Virochip) que tenía las secuencias más conservadas de aproximadamente 950 genomas virales de referencia NCBI secuenciados completamente (~ 1 1.000 nucleótidos de 70 monómeros). El Virochip se usó para seleccionar muestras de ARN aisladas a partir de tumores de próstata de 19 individuos (Figura 22A). Se detectó una señal de hibridación positiva que sugería la presencia de un gammaretrovirus en 7 de los 1 1 tumores de pacientes homocigotos para la variante de RNASEL R462Q (QQ). Por el contrario, no se detectaron virus en 3 tumores de heterocigotos RQ y solamente 1 de 5 tumores de individuos RR era positivo. La agrupación de las intensidades de oligonucleótidos de la microserie (Figura 22A) mostraba un patrón de hibridación similar en todos los casos positivos. Además, un análisis informático usando E-Predict, un algoritmo descrito recientemente para la identificación de especies víricas (Urisman, A., eí ai, 2005, Genoma Biol. 6: R78), asignó las probabilidades más altas a varios gammaretrovirus de mamífero estrechamente relacionados, lo que sugería que el mismo virus o virus muy similares estaban presentes en todos los tumores positivos (Tabla 12). Por lo tanto, el Virochip detectó la presencia de un gammaretrovirus probable en prácticamente la mitad de las muestras tumorales QQ y solamente en una muestra no QQ. Caracterización del genoma de XMRV Para caracterizar adicionalmente el virus se recuperó todo su genoma de uno de los tumores (VP35) (Figura 23A-23C). Para obtener clones virales, se empleó en primer lugar una técnica de recuperación de microserie directa descrita anteriormente (Wang, D., eí ai, 2003, PLoS Biol. 1: E2). En resumen, el ácido nucleico amplificado del tejido tumoral, que hibridaba con oligonucleótidos de la microserie viral, se eluyó a partir de dos puntos específicos. El ADN eluído se reamplificó y se exploraron bibliotecas de plásmidos construidas a partir de este material mediante hibridación de colonias usando los oligonucleótidos de dichos puntos como sondas. Los oligonucleótidos de la serie usados en este caso se obtuvieron de la región LTR del retrovirus de tipo C de ratón (MTCR; GenBank: NC_001702) y del virus formador de focos en el bazo (GenBank: NC 001500; (Clark, SP., ef ai, 1983, Proc Natl Acad Sci USA 80: 5037-5041 ). El fragmento recuperado más grande tenía 415 nucleótidos de longitud, y un 96% de identidad de nucleótidos con la región LTR de MTCR, un MuLV identificado en el genoma de una línea celular de mieloma de ratón (Heinemyer T; sin publicar). Estos descubrimientos establecen que el virus en cuestión era efectivamente un gammaretrovirus y probablemente un pariente de los virus de la leucemia de ratón. Para clonar y secuenciar el resto del genoma viral, se usó ADNc tumoral para amplificar por PCR segmentos solapantes usando cebadores obtenidos de MTCR. Los huecos se taparon usando cebadores de los clones recuperados en las etapas tempranas (Figura 23A-23C). Usando una estrategia similar, la secuencia completa del virus de un segundo tumor, VP42, también se determinó. Los dos genomas comparten > 98% de identidad de secuencia global y > 99% de identidad de aminoácidos para los marcos de lectura abiertos predichos (ORFS) y por lo tanto representan el mismo virus. El genoma completo del virus (Figura 23A-23C y 28) es de 8185 nucleótidos de longitud y es distinto de todos los aislados conocidos de MuLV. El genoma es más similar a los genomas de MuLV DG-75 clonado de una línea celular linfoblastoide B (GenBank: AF221065, (Raisch, KP., et al., 2003, Virology 308: 83-91 ) y de MTCR, con el que comparte el 94 y el 93% de identidad de secuencia de nucleótidos global, respectivamente. Los árboles filogenéticos construidos usando los genomas retrovirales de tipo C de mamífero disponibles (Figura 24 y 29A-29B) mostraron que el virus recién identificado es más similar a genomas xenotrópicos y politrópicos que a los ecotrópicos. En base a estos descubrimientos se propuso el nombre provisional "Virus relacionado con MuLV xenotrópico" (o XMRV) para este agente. La traducción de la secuencia genómica de XMRV usando el ORF Finder (Wheeler, DL., eí ai, 2003, Nucleic Acids Res 31: 28-33) identificó dos ORF solapantes que codifican las poliproteínas Gag-Pro-Pol y Env de longitud completa. No pudieron detectarse secuencias codificantes exógenas, tales como oncogenes virales, en el genoma de XMRV. La poliproteína Gag-Pro-Pol predicha tiene 1733 aminoácidos de longitud y tiene la mayor identidad de aminoácidos con MuLV DG-75 (el 95%) (Figura 29A). Un codón de terminación ámbar (UAG) separa los ORF de Gag de 536 aminoácidos y de Pro-Pol de 1197 aminoácidos, análogos a otros MuLV en los que se requiere una lectura traduccional para generar la poliproteína Gag-Pro-Pol de longitud completa (revisado en Wills, NM., eí ai, 1991 , Proc Natl Acad Sci USA 88: 6991 -6995). Análogamente a otros MuLV (Clark, SP., eí ai, (1993), Proc Natl Acad Sci USA 80: 5037-5041 ; Raisch, KP., eí al. (2003), Virology 308: 83-91 ; Herr, W., 1984, J Virol 4947 -478; O'Neill, RR., eí al, (1985), J Virol 53: 100-106; Perryman, S., 1991 , Nucleic Acids Res 19: 6950; Shinnick, TM., eí ai, (1981 ), Nature 293: 543-548; Sijts, EJ., eí ai, (1994), Virus Res 34: 339-349), la poliproteína Env de XMRV está en un marco de lectura diferente en comparación con Gag-Pro-Pol. La secuencia de la proteína Env es de 645 aminoácidos de longitud y tiene la mayor identidad de aminoácidos con la proteína Env de un MuLV infeccioso aislado de un cáncer de pulmón microcítico humano (SCLC) la línea NCI-417 (GenBank: AAC97875; (Antoine, M., eí ai, (1998), Virus Genes 17: 157-168)) y MuLV NZB-9-1 (GenBank: K02730; (O'Neill, RR., Buckler eí ai, (1985), J Virol 53: 100-106)), 95% y 94% respectivamente. El donador (AGGTAAG (SEC ID N° 47), posición 204) y el aceptor (CACTTACAG (SEC ID N° 48) de corte y empalme conservados; posición 5479) implicados en la generación de los ARN subgenómicos de env (Coffin, JM., eí ai, (1997), Retrovirus. Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press) se descubrieron en las mismas ubicaciones relativas que en otros genomas de MuLV. Un alineamiento de múltiples secuencias de Env de XMRV y de las secuencias de proteínas correspondientes de otros gammaretrovirus (Figura 25) mostró que dentro de dos regiones altamente variables (VRA y VRB) de las que se sabe que son importantes para el tropismo celular (Battini, JL., eí ai, (1992), J Virol 66: 1468-1475; Tailor CS., eí al., (2003), Curr Top Microbiol Immunol 281: 29-106), XMRV comparte una alta identidad de aminoácidos con las envueltas xenotrópicas de MuLV DG-75 y MuLV NZB-9-1 (el 87% para VRA y el 78% para VRB). En base a este descubrimiento, se predijo que el receptor celular para XMRV es XPR1 (SYGI), el receptor recién identificado para MuLV xenotrópicos y politrópicos (Battini, JL., et al., (1999), Proc Natl Acad Sci USA 96: 1385-1390; Tailor CS, et al., (1999), Proc Natl Acad Sci USA 96: 927-932; Yang, YL., et al., (1999), Nat Genet 21 ; 216-219). La repetición terminal larga (LTR) de XMRV es de 535 nucleótidos de longitud y tiene la mayor identidad de nucleótidos con las LTR de MTCR (el 96%) y MuLV NZB-9-1 (el 94%). Las LTR de XMRV contienen elementos estructurales y reguladores conocidos típicos de otras LTR de MuLV (Coffin, JM., eí ai, (1997), Retroviruses. Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring harbor Laboratory Press; Temin, HM., (1981 ), Cell 27: 1-3) (Figura 28). En particular, la caja CCAAT (SEC ID N° 49), la caja TATAAAA (SEC ID N° 50), y la secuencia de señal de poliadenilación AATAAA (SEC ID N° 51 ) se descubrieron en U3 en sus ubicaciones esperadas. U3 también contiene un elemento de respuesta al glucocorticoides (GRE) secuencia AGA ACÁ GAT GGT CCT (SEC ID N° 52). Secuencias esencialmente idénticas están presentes en el genoma de otros MuLV. Estos elementos han demostrado activar la transcripción dirigida por LTR y la replicación viral in vitro en respuesta a diversos esteroides incluyendo andrógenos (Celander, D., eí ai, (1988), J Virol 62: 1314-1322; Speck, NA., eí ai, (1987J, Mol Cell Biol 7: 1 101-1 1 10; DeFranco, D., eí ai, (1986), Mol Cell Biol 6: 993-1001 ; Miksicek, R., eí ai, (1986) Cell 46: 283-290). Además, se cree que la presencia de un GRE intacta es determinante en una susceptibilidad muy alta a la infección con FIS-2 MuLV en machos en comparación con ratones MRI hembra (Bruland, T., eí ai, (2003), J Gen Virol 84: 907-916; Bruland, T., eí ai, (2001 ), J Gen Virol 82: 1821 -1827). El líder 5' gag de XMRV definido como la secuencia que se prolonga desde el extremo de U5 al codón de iniciación ATG de gag, está constituido por una región no codificante conservada de aproximadamente 200 nucleótidos, que contiene un sitio de unión al cebador de ARNt de prolina así como secuencias necesarias para el empaquetamiento viral (Adam, MA:, eí ai, (1988), J Virol 62: 3802-3806; Fisher, J., eí ai, (1998), Virology 244: 133-145) y el inicio de la traducción (Berilos, C, eí ai, (1995), J Virol 69: 2214-2222; Vagner, S., eí ai, (1995J, J Biol Chem 270: 20376-20383). La región no codificante viene seguida de una región de aproximadamente 270 nucleótidos que se prolonga desde el codón de inicio alternativo CTG conservado de gag. Esta región representa el segmento más divergente del genoma en comparación con otros MuLV (Figuras 26 y 23B). A diferencia de los MuLV ecotrópicos, donde la traducción de este codón añade un péptido líder N-terminal de aproximadamente 90 aminoácidos en marco con el resto de la proteína Gag, generando de este modo una forma glicosílada de Gag (Prats, AC, eí ai, (1989), J Mol Biol 205: 363-372), el XMRV tiene un codón de terminación de 53 restos de aminoácidos cadena abajo del inicio alternativo. Curiosamente, las dos secuencias líderes de MuLV DG-75 y de MTCR gag estaban interrumpidas por codones de terminación y por lo tanto no se espera que produzcan glico-Gag de longitud completa. Además, una deleción de 24 nucleótidos característica estaba presente en esta región del genoma de XMRV, lo que no se descubrió en ningún aislado de MuLV exógeno o elemento retroviral endógeno conocido en el genoma de ratón secuenciado. En el cultivo celular, la expresión de glico-Gag intacto no es esencial para la replicación del virus (Fan, H., eí ai, (1983), Proc Nat Acad Sci USA 80: 5965-5969; Schwartzberg, P., eí ai, (1983), J Virol 46: 538-5464). Sin embargo, las lesiones en esta región se han asociado con variaciones interesantes en las propiedades patogénicas ¡n vivo (Chun, O, eí al., (1994), J Biomed Sci 1: 218-223; Corbin, A., eí ai, (1994), J virol 68: 3857-3867; Fujisawa, R., et al., (1997), J Virol 71: 5355-5360; Munk, C, et ai, (2003), Virology 313: 44-55; Portis, JL., eí ai, (1996), Virology 226: 384-392). Por ejemplo, una alteración de 10 nucleótidos que afecta a 5 restos en el péptido N-terminal de glico-Gag se descubrió que era responsable de una diferencia de 100 veces en la frecuencia de neuroinvasión entre las cepas de MuLV CasFrKP y CasFrKP41 (Fujisaza, R., eí ai, (1998), J Virol 72: 5619-5625). Además, la inserción de un octanucleótido resultante en un codón de terminación cadena abajo del codón de inicio CUG evitó la anemia hemolítica temprana grave y prolongo la latencia de la eritroleucemia en ratones infectados con Friend MuLV (Corbin, A., eí al., (1994), J Virol 68: 3857-3867). Aunque el significado patogénico de las lesiones de XMRV glico-Gag aún no se conoce, el alto grado de divergencia de secuencia indica que esta región está sometida a una presión selectiva positiva, y por lo tanto, es probable que sea relevante para el establecimiento de la infección dentro del hospedador humano. Asociación de la infección por XMRV y el genotipo R462Q de RNASEL. Para analizar adicionalmente la asociación entre la presencia del virus y el genotipo R462Q (1385G -> A) de RNASEL, se desarrolló un ensayo de RT-PCR anidada en base a la secuencia del virus recuperada de una de las muestra tumorales (VP35, véase anteriormente). Los cebadores de este ensayo (Figuras 28A- 28B) amplifican un fragmento de 380 nucleótidos del líder 5' divergente y del extremo N-terminal de gag. La RT-PCR era positiva en 8 (el 40%) de 20 tumores examinados de individuos homocigotos (QQ). Además, un tumor de un paciente homocigoto de tipo silvestre (RR) era positivo entre 52 RR y 14 RQ examinados (Figura 22B y Tabla 10). Curiosamente, este caso estaba asociado con el mayor grado del tumor entre todos los casos positivos para XMRV (Tabla 11 en Molinaro et al, 2005). La PCR específica para el gen GAPDH de ratón era negativa en todas las muestras, lo que contradecía fuertemente la posibilidad de que las muestras tumorales estuvieran contaminadas con ácido nucleico de ratón. Colectivamente, estos datos demuestran una fuerte asociación entre el genotipo homocigoto para R462Q de RNASEL (QQ) y la presencia de virus en el tejido tumoral (p < 0,00002 mediante un ensayo de Fisher exacto de dos colas). Diversidad de la secuencia de XMRV en muestras de diferentes pacientes. Para examinar el grado de diversidad de secuencia de XMRV en diferentes pacientes, se secuenciaron los fragmentos amplificados de las 9 muestras, que eran positivas en la RT-PCR de gag anidada. Los fragmentos gag amplificados eran altamente similares (Figura 27A) con > 98% de identidad de nucleótidos y > 98% de identidad de aminoácidos entre sí. Por el contrario, los fragmentos tenían < 89% de identidad de nucleótidos y < 95% de identidad de aminoácidos con la secuencia más relacionada de MuLV DE-75. Además del gen gag, las muestras del mismo paciente también se examinaron para detectar la variación de secuencia en el gen pol. Los fragmentos de PCR obtenidos con un conjunto de cebadores que se dirigían a un tramo de 2.500 nucleótidos en el gen pol se secuenciaron (Figura 28A-28B). De forma similar a los fragmentos gag, los fragmentos pol amplificados eran muy similares (Figura 27B) y tenían > 97% de identidad de nucleótidos y > 97% de identidad de aminoácidos entre sí. Por el contrario, los fragmentos tenían < 94% de identidad de nucleótidos y < 95% de identidad de aminoácidos con la secuencia más relacionada, la de MuLV DG-75. La agrupación cercana de los fragmentos gag y pol secuenciados (Figura 27A-27B) indica que toda la microserie y los casos positivos para RT-PCR representan infección con el mismo virus. Por otro lado, el grado de variación de secuencia en los fragmentos examinados es mayor que el esperado de errores introducidos durante la amplificación por PCR y la secuenciación. La frecuencia de incorporación errónea de nucleótidos mediante Taq polimerasa se ha estimado en 10"6-10"4 ((Bracho, MA., eí ai, (1998), J Gen Virol 79 (Pt 12): 2921-2928) y referencias en estos documentos), en comparación con la tasa observada de hasta el 2% en los fragmentos gag y pol. Estos descubrimientos indican que la variación de secuencia de XMRV observada es el resultado de la diversidad de secuencia natural, coherente con el virus adquirido independientemente por los pacientes afectados, y es un argumento contra la contaminación de laboratorio como una fuente posible de XMRV. Discusión Los resultados presentados en este documento identifican la infección por XMRV en el tejido prostático de aproximadamente la mitad de los pacientes con el cáncer de próstata que son homocigotos para la variante R4652Q (QQ) de ARNasa L, según lo determinado mediante la hibridación de la microserie Virochip y mediante RT-PCR con cebadores específicos para XMRV. Estudios de RT-PCR paralelos de tumores de próstata de pacientes de tipo silvestre (RR) y heterocigotos (RQ) mostraron pruebas de XMRV solamente en 1 de 66 muestras, demostrando claramente que la infección por XMRV en el ser humano está fuertemente vinculada con disminuciones en la actividad de ARNasa L. Estos resultados apoyan la hipótesis de que la variante R462Q de ARNasa L conduce a un ligero defecto en la inmunidad antiviral innata (dependiente de IFN). Como su propio nombre indica, el XMRV está estrechamente relacionado con los virus de la leucemia de ratón xenotrópico (MuLV). A diferencia de los MuLV ecotrópicos, tales como el Moloney MuLV que solamente crecen en células de roedor en cultivo, los MuLV xenotrópicos pueden crecer en células no de roedor en cultivo pero no en líneas celulares de roedor. Se piensa que los MuLV xenotrópicos son el resultado de la recombinación in vivo entre un virus ecotrópico exógeno que infecta una cepa de ratón susceptible y numerosas secuencias similares a MuLV endógenas presentes en el genoma del ratón. Estos elementos endógenos son vestigios de integración retroviral ancestral en la línea génica del ratón y la mayoría han sufrido deleciones inactivadoras y otras reorganizaciones a lo largo del proceso evolutivo. Algunos, sin embargo, son de longitud completa y se expresan en algunas estructuras de ratón ((Levy, JA, (1973) Science 182: 1 151 -1 153; Levy, JA (1978), Curr Top Microbiol Immunol 79: 1 1 1-123). La recombinación implica de forma invariable sustitución del extremo 5' del gen env que codifica la región N-terminal de la glicoproteína SU madura ((Evan, LH., eí ai, (2003), J Virol 77: 10327-10338) y referencias en este documento). Esta región específica la preferencia del receptor de la glicoproteína SU y determina por lo tanto el rango del hospedador del virus recombinante (Battini, Jl., eí ai, (1992) J Virol 66: 1468-1475; Ott, D., eí ai, (1992), J Virol 66: 4632-4638). A diferencia de los MuLV ecotrópicos, que solamente pueden reconocer un receptor (CAT-1 ) específico para especies de ratón y rata (Albritton, LM., eí ai, (1989), Cell 57: 659-666; Kim, JW., eí ai, (1991 ), Nature 352: 725-728; Wang, H., eí ai, (1991 ), Nature 352: 729-731 ), las cepas xenotrópicas reconocen una proteína conocida como XP Rl o SYGI. XPR1 se expresa en todos los vertebrados superiores, incluyendo ratones, pero los polimorfismos en el gen de presentación del ratón le hacen incapaz de mediar en la entrada de MuLV xenotrópico (Battini, JL., eí ai, (1999), Proc Natl Acad Sci USA 96: 1385-1390, Tailor CS, eí al., (1999;, Proc Natl Sci USA 96: 927-932; Yang, YL., eí al., (1999;. Nat Genet 21: 216-219). Por lo tanto, los MuLV xenotrópicos tienen el potencial para infectar una amplia diversidad de especies de mamíferos, incluyendo seres humanos.

Se ha detectado ocasionalmente MuLV xenotrópicos en líneas celulares humanas cultivadas. Por ejemplo, el MuLV DG-75 se clonó a partir de una línea celular linfoblastoide B humana (Raisch, KP., eí ai, (2003), Virology 308: 83-91 ) y se detectó un MuLV xenotrópico infeccioso en un cáncer de pulmón microcítico humano (SCLC) la línea NCI-417 (Antoine, M., eí ai, (1998), Virus Genes 17: 157-168). Aunque la combinación en el laboratorio, en cultivo o durante el paso de líneas celulares en ratones desnudos, no puede interpretarse como una fuente posible en estos casos, dicha contaminación no puede explicar los resultados. La demostración de esto es de la siguiente manera: (i) se detectó XMRV en tejidos humanos primarios; (ii) no pudieron detectarse secuencias de ratón (por ejemplo GAPDH) en nuestro material mediante PCR; y (iii) la infección estaba restringida de forma predominante a muestras humanas con el genotipo de RNASEL QQ; (iv) se descubrieron polimorfismos en los clones de XMRV recuperados a partir de diferentes pacientes coherentes con la adquisición independiente del virus por estos individuos. Finalmente, en el ejemplo 3 (Molinaro et al., 2005) se muestra que los transcritos y antígenos virales pueden detectarse en tejido de próstata QQ infectado mediante hibridación con fluorescencia in situ e inmunohistoquímica, respectivamente, proporcionando una prueba adicional de la infección in vivo. Tomadas conjuntamente, las pruebas anteriores son fuertes argumentos contra la contaminación de laboratorio con virus o material de ADN clonado como la fuente de la infección por XMRV en las muestras analizadas. Los descubrimientos descritos en este documento son ejemplos de auténtica infección de seres humanos con un agente similar a un MuLV xenotrópico.

La secuencia de XMRV no se ha descubierto en el ADN genómico humano (como se representa en las bases de datos de secuencia) lo que indica que debe haberse adquirido de forma exógena mediante infección en sujetos positivos. Aún se desconoce de que reserva y mediante que vía se adquirieron dichas infecciones. Parece improbable que el contacto directo con ratones ferales, pudiera explicar la distribución observada de la infección en nuestra cohorte, ya que no existen razones para creer que la exposición a roedores se modificara de acuerdo con el genotipo de RNASEL. Es posible que la infección esté más extendida de lo que se indica en el presente estudio, especialmente, si como parece probable, los individuos con la ARNasa L de tipo silvestre eliminan la infección más rápidamente que aquellos con el genotipo QQ. Pero si es así, un modelo de transferencia de especies cruzadas de la infección por XMRV podría necesitar unos niveles de exposición al ratón improbablemente altos para una sociedad desarrollada como la nuestra. Por lo tanto, aunque la secuencia viral sugiere que la reserva definitiva de XMRV es probablemente el roedor, parece improbable que la fuente próxima de la infección sean ratones o ratas. Los datos descritos en este documento indican que el XMRV no funciona codificando un oncogen que actúa de forma dominante, ya que XMRV es un retrovirus simple constituido únicamente por secuencias gag, pol, env y no ha adquirido secuencias obtenidas del hospedador en su genoma. Además, el análisis de la única célula del Ejemplo 3 muestra que el genoma viral no está presente en las propias células cancerosas, pero parece dirigirse a células del estroma cuyas identidades están siendo examinadas. Esto hace improbable otro modelo de oncogénesis retroviral, concretamente, activación del oncogen del hospedador mediante inserción en el genoma celular de células epiteliales prostéticas como la causa de la expansión clonal de estas células. EJEMPLO 3. Infección por XMRV en tejidos y en líneas celulares de cáncer de próstata con mutaciones RNASEUHPC1. La ARNasa L es una proteína antiviral única activada por 2'-5'-oligoadenilatos 5' fosforilados. El Ejemplo 2 describe la identificación del genoma de un nuevo gammaretrovirus, llamado virus relacionado con MuLV xenotrópico (XMRV) en casos de cáncer de próstata homocigotos para una variante de actividad de ARNasa L (R462Q). En este documento se muestra mediante fluorescencia la hibridación in situ y la inmunohistoquímica que pueden detectarse ácidos nucleicos y proteínas de XMRV en aproximadamente el 1 % de las células en tejidos de la próstata de casos infectados con XMRV y homocigotos para la variante de ARNasa L. las células infectadas son células del estroma prostático, predominantemente fibroblastos y elementos hematopoyéticos en regiones adyacentes al carcinoma. La exploración de líneas celulares obtenidas de cáncer de próstata mostró que un único clon de células LNCaP que también tiene mutaciones en la ARNasa L aloja un genoma similar al de XMRV relacionado estrechamente con los descubiertos en los tumores in vivo. Este clon expresa transcritos virales genómicos y subgenómicos y libera partículas infecciosas al medio. Estas partículas pueden propagarse en serie en varias líneas celulares de ser humano pero no de origen de ratón. La disponibilidad de XMRV de replicación competente debería facilitar el estudio de la replicación viral, su vinculación a las variantes de ARNasa L y su relación con enfermedades prostéticas y otras. Materiales y Métodos Genotipado de pacientes y procesamiento del tejido de la próstata. Se genotiparon hombres en lista de espera para someterse a una prostatectomía como tratamiento curativo en la clínica Cleveland Clinic para la variante R462Q (1385G -> A) de RNASEL usando un ensayo de genotipado TAQMAN preparado anteriormente (Applied Biosystems, assay c_935391_1 ) en ADN asilado de células mononucleares de la sangre periférica. Inmediatamente después de la prostatectomía radical, se tomaron núcleos de tejido de la zona periférica (donde se produce la mayor parte del cáncer) y se congelaron en nitrógeno líquido para el posterior aislamiento de ARN (Urisman, A., eí ai, (2005), PLOS Pathogens). Para los análisis histológicos, el tejido prostático recién cortado se fijó en formalina tamponada neutra al 10%, se procesó y se incluyó en parafina. Se usaron microseries de tejidos para algunos experimentos (véase la leyenda de la figura 31 ). Todos estos estudios se realizaron bajo un protocolo aprobado por el Cleveland Clinic institucional review board. Anticuerpos. Se produjo el anticuerpo monoclonal para la proteína Gag SFFV a partir de células R187 (ATCC, CRL-1912) cultivadas en DMEM (Media Core, Cleveland Clinic Foundation, Cleveland, OH) con IgG FBS ultra-bajo al 10% (invitrogen) hasta que se alcanzó la confluencia. El medio acondicionado se recogió cada tres días de los cultivos confluyentes. Se centrifugaron a 168 g cinco ml de medios acondicionados por preparación durante 5 minutos a 4°C. El sobrenadante se filtró a través de una unidad de filtro de jeringa de 0,22 µm (Millipore Corp.) y se concentró 16 veces en una unidad de ultrafiltración de Amicon con un límite de peso molecular de 100 kDa (Millipore Corp.). Se añadió azida sódica a una concentración final del 0,02%. El anticuerpo policlonal de conejo para la secuencia peptídica de MuLV NC conservada: KDCPKKPRGPRGPR (SEC ID N° 53) conjugada con hemocianina de lapa se preparó en Open Biosystems, Inc. Huntsville, AL. El anticuerpo se purificó por afinidad mediante un protocolo que incluía la unión del péptido a sefarosa, y después la elución del anticuerpo de la columna. Se realizó inmunofluorescencia de citoqueratina y FISH del XMRV concomitantes usando un anticuerpo monoclonal de ratón anticitoqueratina AE1/AE3 (mezcla 20:1 ) (Chemicon) capaz de reconocer células normales y neoplásicas de origen epitelial. Cultivo celular Las líneas celulares, LNCaP-R (W. Heston, Cleveland), LNCaP-FGC (ATCC N° de Cat. CRL-1740), DU145 (ATCC N° de Cat. HTB-81 ) y PC3 (ATCC N° de Cat. CRL-1435) se cultivaron en medio RPMI 1640 con L-glutamina 2 mM, suero fetal bovino al 10%; 200 unidades de penicilina G y 200 µg/ml de estreptomicina. Se obtuvieron células epiteliales de próstata normales de Clonetics Corporation (San Diego, CA) y se mantuvieron en PrEGM suplementado con una mezcla de diversos factores de crecimiento (SingleQuots) (Clonetics); y suero fetal bovino al 10%.

Preparación de los citobloques. Aproximadamente 109 células (LNCaP-R, LNCaP-FGC, DU145 y PC3) se cultivaron con solución salina equilibrada de Hank (HBSS) sin rojo fenol, Ca++ o Mg++ (Invitrogen) y se resuspendieron lenta pero completamente con formalina taponada neutra al 10%. Las suspensiones celulares se fijaron durante una noche a 4°C, se centrifugaron y se lavaron dos veces con HBSS. El sobrenadante se aspiró y las células se resuspendieron en una gota de HBSS. Las suspensiones celulares se transfirieron con una pipeta a una cásete de citobloques (Termo Electrón Corp). Los citobloques de cultivo celular fijado se procesaron y se incluyeron en bloques de parafina en 24 horas. Los citobloques incluidos se cortaron en secciones de aproximadamente 4 µm de grosor y se colocaron en portaobjetos cargados y se hornearon durante al menos 4 horas a 60-65°C para la inmunofluorescencia. Aislamiento del ARN y RT-PCR. El ARN total se aisló de células usando el reactivo TRIzol (Invitrogen). El ARN se trató con ADNasa I (sin ARNasa) (Ambion), fenol ácido: con el cloroformo extraído y se precipitó para el análisis de RT-PCR. La síntesis de la primera cadena de ADNc se realizó usando 1 µg de ARN y cebadores de hexámeros aleatorios con el kit TaqMan® Reverse Transcription Reagents (Applied Biosystems). Se realizó PCR en la primera cadena del ADNc usando cebadores específicos para una región env de 700 pb de XMRV-35; cebador directo-7050, 5' GTT TAT GGC CAG TTT GGA AA 3' (SEC ID N° 41 ), y cebador inverso-7750, 5' GCC TTA TGG TGG GGT CTT TC 3' (SEC ID N° 42). Se usaron 8 cebadores específicos para el exón GAPDH como control positivo; cebador directo, 5' TGC CAT CAC TGC CAC CCA GA 3' (SEC ID N° 54), y cebador inverso 5' CTT GAC AAA GTG GTC GTT GA 3' (SEC ID N° 55). FISH El cóctel de sondas FISH para XMRV-35 se generó usando segmentos de 2,15 kb y de 1 ,84 kb del genoma viral obtenido por PCR con el cebador directo-2345, 5' ACC CCT AAG TGA CAA GTC TG 3' (SEC ID N° 43) con el cebador inverso-4495, 5' CTG GAC AGT GAA TTA TAC TA 3' (SEC ID N° 44) y el cebador directo-4915, 5' AAA TTG GGG CAG GGG TGC GA 3' (SEC ID N° 56) con el cebador inverso-6755, 5' TTG GAG TAA GTA CCT AGG AC 3' (SEC ID N° 57), clonados todos en pGEM®-T (Promega). Los vectores recombinantes se digirieron con EcoRI para liberar los fragmentos ADNc viral, que se purificaron después de la electroforesis en gel (Qiagen). Los insertos de ADNc viral purificado se usaron en reacciones de traducción con desplazamiento de mella para producir una sonda marcada con fluorescencia de UTPd SpectrumGreen™ de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Vysis Inc.). Los portaobjetos recién horneados de tejidos de próstata o las series de microseries del tejido con secciones de tejido de aproximadamente 4 µm de grosor se extrajeron de la parafina, se rehidrataron y se sometieron a una recuperación de la diana (Target Retrieval) (Dako) durante 40 min. a 95°C. Los portaobjetos se enfriaron a temperatura ambiente y se aclararon con H2O. Se aplicó proteinasa K (Dako) a 1 :5000 en Tris-HCL pH 7,4 directamente a los portaobjetos durante 10 min. a temperatura ambiente. Las secciones de tejido adyacente se sondearon también con ADN de KSHV-8 marcado con fluorescencia con SpectrumGreen™ dUTP (nucleótidos 85820-92789) como control negativo o como control positivo con un cóctel de sondas de ADN marcadas con SpectrumGreen™ y SpectrumOrange™ y TelVysion™ (Vysis Inc.), específicos para diferentes brazos del cromosoma 1 humano como control positivo para asegurarse de que el tejido era completamente accesible para el FISH. Los portaobjetos de FISH se examinaron usando un microscopio Leica DMR (Leica Micro-Systems, Heidelberg, Alemania), equipado con una cámara Retiga EX CCD (Q-lmaging, Vancouver, British Columbia, Canadá). Las imágenes de FISH se capturaron usando un escáner láser confocal Leica TCS SP2 con un objetivo de 63 aumentos con apertura numérica (N.A.) 1.4 (Leica Micro-systems, Heidelberg, Alemania). Los ácidos nucleicos de XMRV se visualizaron usando proyecciones de intensidad máxima de los portaobjetos ópticos adquiridos usando un láser de argón de 488 nm (emisión a 500 y 550 nm) las sondas de ADN TelVysion™ se visualizaron usando proyecciones de máxima intensidad de los cortes adquiridas usando un láser de argón de 488 nm (emisión a 500 y 550 nm) y un láser de criptón-argón a 568 nm (emisión a 575 y 680 nm). El DAPI se visualizó usando proyecciones de intensidad máxima de los cortes ópticos adquiridos usando un láser UV a 364 nm (emisión a 400 y 500 nm). Posteriormente se lavaron los cortes con 2 x SSC [cloruro sódico 0,3 M y citrato sódico 0,03 M (pH 7,0)] para retirar los cubres y se tiñeron con H&E para la evaluación morfológica.

IHC Se realizó la IHC sobre tejidos humanos en un aparato Benchmark Ventana Autostainer (Ventana Inc.). Las secciones de próstata incluidas en parafina fijadas con formalina y no teñidas se colocaron en portaobjetos con carga electroestática y se les retiró la parafina seguido de un acondicionamiento celular suave conseguido a través del uso de un Cell Conditioner N° 2 (Ventana Inc.). El anticuerpo monoclonal R187 concentrado contra SFFV p30 Gag se dispensó de forma anual en las secciones a 10 µg por ml (Ventana Inc.) y se le dejó incubar durante 32 min. a 37°C. La biotina endógena se bloqueó en secciones usando el kit Endógenos Biotin Blocking Kit (Ventana Inc.). Las secciones se lavaron y se aplicó IgG ImmunoPure de cabra anti-rata biotinlada (Pierce) a una concentración de 4,8 µg/ml durante 8 min. Para obtener la ubicación de la proteína Gag, se usó el kit Ventana Enhaced Alkaline Phosphatase Red Detection Kit (Ventana Inc.). Las secciones se lavaron brevemente con agua destilada y se contratiñeron con Hematoxilina II (Ventana Inc.) durante aproximadamente 6 min. Las secciones se lavaron, se deshidrataron en alcoholes graduados, se incubaron en xileno durante 5 min. y se añadieron cubres con Cytoseal (Microm Int.). Los controles negativos se realizaron como anteriormente excepto que no se añadía el anticuerpo monoclonal R187. Se realizó IHC de citoqueratina/FISH de los XMRV de forma concomitante sobre los portaobjetos de tejido de la próstata del paciente VP62. En primer lugar, se inmunotiñeron secciones de citoqueratina AE1/AE3 usando el kit de amplificación de la señal de tiramida Alexa Fluor 594 (Molecular Probes) exactamente como se describe a continuación excepto que se usó Proteasa II (Ventana Inc.) durante 3 min. a temperatura ambiente y se añadió IgG anti-ratón -peroxidasa de rábano rusticano (Molecular Probes). Los portaobjetos se colocaron en solución Target Retrieval (recuperación de la diana) (Dako) durante 40 min. a 95°C. Se realizó FISH para XMRV como se ha descrito anteriormente excepto en ausencia de tratamiento con proteinasa K. Después del FISH, los portaobjetos se montaron con medio de montaje más DAPI (Vectashield Inc.) y se examinaron usando microscopía de fluorescencia. Las imágenes inmunofluorescentes se capturaron usando un filtro rojo tejas con un microscopio Leica DMR (Leica Microsystems, Heidelberg, Alemania), equipado con una cámara Retiga EX CCD (Qimaging, Vancouver, British Columbia, Canadá). Se realizó la inmunofluorescencia de las secciones de los citobloques de LNCaP-R, LNCaP-FGC, DU145 y PC3 de forma manual usando el kit de amplificación de señal de tiramida Alexa Fuor 594 (Molecular Probes). En resumen, las secciones de citobloques incluidas en parafina, fijadas con formalina sin teñir, cortadas a aproximadamente 4 µm, se colocaron en portaobjetos cargados con electricidad estática, se hornearon a 65°C durante al menos 4 horas, se retiraron de la parafina en xileno y se rehidrataron mediante concentraciones decrecientes de alcohol. Los portaobjetos se incubaron en Proteasa lll (Ventana Inc.) durante 3 min. a temperatura ambiente y se lavaron en solución salina tamponado con fosfato (PBS) en tampón de interrupción de peroxidasa (PBS + H2O2 al 3%) durante 60 min. a temperatura ambiente, se incubaron con radiactivo bloqueante al 1 % (10mg/ml de BSA en PBS) durante 60 min. a temperatura ambiente. Los portaobjetos se incubaron con el anticuerpo contra el péptído NC (Gag) de XMRV-35 (Open Biosystems) a una concentración de 0,25 µg/ml diluido en reactivo de bloqueo al 1 % durante 60 min. a temperatura ambiente y se aclararon tres veces en PBS. Se añadió el IgG anti-ratón de cabra - peroxidasa de rábano rusticano (Molecular Probes) y se incubó durante 60 min. a temperatura ambiente. Los portaobjetos se aclararon después tres veces en PBS. Se añadió la solución de tiramida a los portaobjetos durante 10 min. a temperatura ambiente y los portaobjetos se aclararon en 3 x PBS. Los portaobjetos se montaron con medio de montaje más DAPI (Vectashield Inc.) y se examinaron usando microscopía de fluorescencia. Infecciones por Virus y Ensayos de RT Las células LNCaP-FGC se incubaron en placas al 20% de confluencia y se lavaron con PBS. Quinientos µl del sobrenadante de LNCaP-R, centrifugados a 3000 g durante 15 min. y filtrados dos veces a través de un filtro de 0,22 µm se añadieron a las células diluidos 1 :2 en RPMI con 8 µg/ml de polibreno (sigma) sin FBS o antibióticos durante 3 horas. Se retiró el virus, y las células se recuperaron con RPMI, al 90%; suero fetal bovino al 10%; 200 unidades de Penicilina/Estreptomicina. La actividad de RT se midió después de incubar a 37°C durante 1 hora como se ha descrito (Telesnitsky, A., eí ai, (1995), Methods Enzymol 262: 347-362). Todas las reacciones se realizaron con a-32P-dTTP y se recogieron alícuotas de medios de cultivo tisular cada día después de la infección y se ensayaron sus actividades de RT. La cuantificación se realizó mediante análisis de formación de imágenes con fósforo usando un escáner Storm Scanner 840 (GE Healthcare), y el software ImageQuant V5.2 (Molecular Dynamic). Se usó PBS como control negativo y 0,4 unidades de MLV-RT (Invitrogen) se usaron como control positivo en los ensayos de RT. Transferencias de Northern Se separó el ARN en un gel de agarosa al 1 % y después se transfirió a membranas de nylon usando kits Turbo Blot (Scleicher y Schuell) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las membranas transferidas se aclararon en 2 x SSC y se autorreticularon (UV Stratalinker 2400; Stratagene). Las transferencias se hibridaron previamente en Ultrahyb (Ambion) y después se hibridaron con sondas marcadas con 32P. Las sondas de ADN se generaron usando RediPrimell (Amersham Biosciences) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Hibridación de Southern Las células cultivadas en matraces de 75 cm2 se tripsinizaron y se lisaron en tampón dodecil sulfato sódico (Tris 100 mM, NaCI 150 mM, EDTA 10 mM, dodecil sulfato sódico al 0,1 %) que contenía 100 µg de proteinasa K por ml durante 1 hora a 55°C seguido por un tratamiento con ARNasa A, 30 min. a 37°C. Se extrajo el ADN con fenol-cloroformo, se precipitó con etanol y se digirió con Pstl. Se separaron 10 µg de ADN de cada muestra mediante electroforesis en gel de agarosa, se transfirieron a una membrana de nylon (alkalic transfer), se neutralizaron con 2 x SSC, se reticularon y se hibridaron con una sonda U3 LTR de XMRV VP35 radiomarcada correspondiente a la posición 7780-7991. La membrana se lavó y se expuso a una película kodak XAR5 durante 1-12 horas. Clonación y secuenciación del genoma La clonación y la secuenciación del genoma de XMRV-LNCaP RV se realizaron como se describe en el documento (Urisman, A., eí ai, (2005), PLOS Pathogens). Análisis Filogenético Se generaron los árboles filogenéticos de los genomas de longitud completa de la siguiente manera. Los genomas de XMRV LNCaP-R (Genebank: DQ272467), VP35 (GenBank: DQ241301 ) y VP42 (GenBank: DQ241302), MTCR (GenBank: NC_001702), MuLV DG-75 (GenBank:: AF221065), MuLV MCF1233 (GenBank: U13766), AKV MuLV (GenBank: J01998), Friend MuLV (GenBank: NC_001362), Rauscher MuLV (GenBank: NC_001819), Moloney MuLV (GenBank: NC 001501 ), Virus de la leucemia felina (GenBank: NC 001940), virus de la leucemia de Gibones (GenBank: NC 001885), y retrovirus Koala (GenBank: AF151794) se alinearon con ClustalX versión 1.83 con los ajustes por defecto. El árbol se generó de acuerdo con lo descrito por Urisman, A., eí ai, (2005), PLOS Pathogens. Los árboles filogenéticos de las poliproteínas Gag-Pro-Pol y Env se basaban en alineamientos de secuencias de proteínas extraídos de los registros del GenBank de los 12 genomas anteriores y se generaron como se describe en el documento Urisman, A., eí ai, (2005), PLOS Pathogens.

Clonación y mapeado de los sitios de integración Veinte microgramos de ADN genómico se digirieron con Pst I y se extrajeron con fenoLcloroformo (1 :1 v/v), seguido de precipitación con etanol. El Pst I escinde una vez el genoma viral en el nucleótido de la posición 7.150 y se usó para producir fragmentos de ADN que contenían la LTR correcta y el ADN celular adyacente. El ADN digerido se hibridó con 0,1 µM de un cebador biotinilado B-7151 F (5' Bio-TEGGGAGTTGGAACAGGGACTACA (SEC ID N° 58); Operon), que es complementario con las posiciones de nucleótidos 7.151-7.171 , aproximadamente 600 pb cadena arriba de la LTR correcta. El cebador hibridado se prolongó después hasta un volumen final de 300 µl usando 10 unidades de ADN polimerasa pfuUltra y 0,2 mM de dNTP en 1 x tampón PfuUltra (Stratagene). La mezcla de reacción se calentó a 94°C durante 5 min., se enfrió a 56°C durante 5 min. y se mantuvo después a 72°C durante 20 min. Después de la elongación de la cadena, el cebador biotinilado libre se retiró mediante digestión con exonucleasa I de E. Coli y la muestra se trató con extracción en fenoLcloroformo y precipitación en etanol. El ADN biotinílado se aisló usando el kit Dynabeads kilobase BINDER kit (DYNAL Biotech) de acuerdo con lo descrito por el fabricante. El ADN aislado se digirió con Nsp I y se lavó con 2 x 800 µl de tampón A (Tris-HCl 10 mM, pH 7,5, NaCI 1 M, EDTA 1 mM, 200 µg/ml de albúmina de suero bovino) y 2 x 800 µl de tampón de ligamiento de ADN T4. El ADN se ligó después al enlazador Nsp usando ADN ligasa de T4 (Invitrogen) durante 3 horas a 16°C con agitación ocasional. El enlazador Nsp se preparó hibridando 20 µM de enlazador A (5' CGGATCCCGCATCATATCTCCAGGTGTGACAGTTT (SEC ID N° 59)) con 20 µM de enlazador-Nsp-S (5' AACCTGGAGATATGATGCGGGATCCGCATG (SEC ID N° 60)). El exceso de enlazadores Nsp se eliminaron lavando las perlas Dynabeads con 2 x 800 µl de tampón A, seguido por 2 x 800 µl de tampón B (Tris-HCl 5 mM, pH 7,5, EDTA 0,1 mM). Las uniones de ADN proviral se amplificaron mediante PCR usando 0,5 µM de U38F (5'-CGTGTTCCCAATAAAGCCTT (SEC ID N° 61 )) y NspL-R (5 - TAACCTGGAGATATGATGCGGGA (SEC ID N° 62)) como cebadores directo e inverso, respectivamente. La mezcla de reacción, que contenía ADN polimerasa píi/Ultra, 0,2 µM de dNTP, y 1 x tampón PfuUltra, se calentó a 94°C durante 2 min., y después se sometió a 27 ciclos a 94°C durante 30 segundos, 56°C durante 40 segundos., y 72°C durante 8 min., y una extensión final a 72°C durante 15 min. El ADN amplificado se clonó usando el kit Zero Blunt PCR Cloning Kit (Invitrogen) y se secuenció. Las secuencias cromosómicas adyacentes a la LTR viral se mapearon en el genoma humano usando el UCSC Genome Browser en el programa Human May 2004 Assembly. Abreviaturas FISH - hibridación in situ por fluorescencia; H&E - Hematoxilina y eosina; HPC - Cáncer de próstata hereditario; IFN - Interferón; IHC -Inmunohistoquímica; FLV - Virus de la leucemia felina; GALV - Virus de la leucemia de Gibones; KoRV - Retrovirus Koala; MCF1233 - Virus de la leucemia de ratón 1233 que induce focos en células de visón; MuLV - Virus de la leucemia de ratón; MTCR - Retrovirus tipo C de ratón; N.A. - apertura numérica; OAS - 2'- 5' oligoadenilato sintetasas; PBS - Solución salina tamponada con fosfato; PCR -reacción en cadena de la polimerasa; PÍA - Atrofia inflamatoria proliferativa; PIN -Neoplasia intraepitelial postática; 2-5A - 2'-5' oligoadenilato 5'-fosforilado; QQ-RNASEL homocigoto para R462Q; QR - RNASEL heterocigoto para R462Q; ARNasa L- Ribonucleasa L; RT - Transcriptasa inversa; RR - RNASEL homocígoto de tipo silvestre 462R; SNP - Polimorfismo de un único nucleótido; VRA - Región variable A; VRB - Región variable B; XMRV - Virus relacionado con MuLV xenotrópico. Resultados El ácido nucleico de XMRV está presente en tejido de próstata con tumor. Para ubicar el XMRV dentro de los tejidos prostéticos humanos, y para medir la frecuencia de células infectadas, se usaron técnicas moleculares in situ. El ácido nucleico de XMRV se visualizó usando hibridación in situ con fluorescencia (FISH) en tejidos de próstata fijados con formalina. Se preparó un cóctel de sondas FISH marcadas por fluorescencia con SpectrumGreen que abarcaba todos los genes virales usando ADNc obtenido del aislado de XMRV clonado a partir del paciente VP35 (Materiales y métodos). Se observaron diferentes células positivas para FISH en los tumores positivos para XMRV mediante RT-PCR (por ejemplo VP62 y VP88) (Figura 30). Para identificar tipos celulares asociados con la señal FISH positiva, las mismas secciones se tiñeron posteriormente con hematoxilina y eosina (H&E). La mayoría de las células positivas para FISH eran fibroblastos del estroma, aunque también se observaron ocasionalmente células hematopoyéticas infectadas. Aunque el ácido nucleico de XMRV normalmente estaba presente dentro de los núcleos, lo que indicaba el ADN proviral integrado, algunas células mostraron tinción en el citoplasma adyacente al núcleo, lo que sugería preintegración de complejos en células no en división (Figura 31 , panel A). Un ejemplo de un leucocito infectado por XMRV se muestra junto con una glándula prostática teñida (rojo) con un cóctel de anticuerpo monoclonal de ratón para citoqueratina AE1/AE3 específico para las células epiteliales (Wernert, N., eí ai, (1987), Pathol Res Pract 182: 617-626) (Figura 31 , paneles E y F). La célula infectada en el estroma es negativa para las citoqueratinas AE1/AE3, confirmando su origen no epitelial. El supuesto núcleo y la cromatina oscura y condensada son coherentes con una célula hematopoyética del estroma. Frecuencia de células prostéticas infectadas por XMRV Se usó FISH para obtener una estimación mínima de la frecuencia de células prostéticas infectadas por XMRV. Las sondas FISH de XMRV se compararon con dos sondas FISH específicas para las regiones subteloméricas de los brazos p y q del cromosoma 1 (marcados con SpectrumGreen y spectrumOrange, respectivamente) (Figura 32). Mientras que se observaron dos células positivas FISH de XMRV en un campo de tejido prostático de VP88 (señales verdes en la Figura 32, panel A), esencialmente todas las células en la sección adyacente estaban marcadas con las sondas específicas para el cromosoma 1 (señales rojas y verdes en la Figura 32, panel B). Debido a la baja frecuencia de células positivas para XMRV, se realizaron controles negativos usando una sonda dirigida al ADN (nucleótidos 85820-92789) del herpesvirus asociado al sarcoma de Kaposi (KSHV) que no marcaba ninguna célula en muestras de próstata VP88 y VP51 , pero esta sonda marcaba eficazmente células 293T transfectadas con ADN de KSHV. Se realizaron experimentos FISH de XMRV adicionales en una microserie de tejido que contenía duplicados de 14 muestras diferentes de tejido con cáncer de próstata (Tabla 13). Cinco casos homocigotos para 462Q en ARNasa L (QQ) (VP29, 31 , 42, 62 y 88) mostraron de 5 a 10 células positivas para FISH en XMRV cada uno (aproximadamente el 1 % de las células de próstata observadas). La muestra del paciente VP79, también un caso QQ, contenía 2 células positivas (el 0,4% de las células totales examinadas). Todas las células positivas en FISH para XMRV observadas eran células del estroma. Por el contrario, tres muestras de tejido RR y dos muestras de tejido RQ mostraron una o no mostraron ninguna célula positiva para FISH (< 0,15%). Dos de los casos QQ, VP35 y VP90, positivas en RT-PCR de gag (Urisman, A., eí ai, (2005), PLOS Pathogens) mostraron solamente una célula positiva para FISH cada una (Tabla 13). Inversamente, un caso, VP31 , era positivo para FISH, pero negativo para la RT-PCR del gag. Estos resultados podrían deberse a la heterogeneidad en el número de copias del virus entre las regiones específicas de la próstata muestreada. Presencia de XMRV en tejidos prostéticos según lo determinado mediante inmunohistoquímica Para identificar las células que expresan proteínas de XMRV, se investigó la presencia de la proteína gag usando un anticuerpo monoclonal contra virus que forman focos en el bazo (SFFV); este anticuerpo es reactivo contra las proteínas gag de un amplio intervalo de cepas de MuLV ecotrópicas, anfotrópicas y xenotrópicas (Chesebro, B., eí ai, (1983), Virology 127: 134-148). Usando este anticuerpo, se observó una señal positiva mediante IHC en tejidos prostéticos de los casos positivos para XMRV VP62 y.VP88, ambos QQ (Figura 33). Un método de detección potenciado con fosfatasa alcalina roja permitió la detección de gag en las mismas células con microscopía de fluorescencia (Figura 33, Paneles A, B, E y F) y de campo brillante (Figura 33, paneles C, D, G y H). Las células que expresaban gag se observaron en células del estroma prostático con una distribución y frecuencia similares a las detectadas mediante FISH (Figura 33). Por el contrario, no se observaron células positivas para gag en el tejido prostático de VP51 , que es del genotipo RR (Figura 33, paneles I y J). Un gammaretrovirus relacionado en una línea celular de cáncer de próstata. A lo largo de los años, se han obtenido varias líneas celulares de cánceres de próstata humanos. Dos de estas líneas, PC3 y DU145, son de tipo silvestre con respecto a RNASEL, mientras que la línea LNCaP ampliamente estudiada es heterocigota para una delecíón de inactivación en RNASEL (471 ?AAAG) y para la variante R462Q (Rennert, H., eí ai, (2002), Am J hum Genet 71: 981-984; Xiang, Y., eí ai, (2003), Cáncer Res 63: 6795-6801 ). Una vez que se estableció la relación entre la infección por XMRV y las mutaciones de RNASEL (Urisman, A., eí ai, (2005), PLOS Pathogens), se investigaron las pruebas de infección con agentes similares a XMRV en estas líneas celulares. Además, se investigó una línea de células epiteliales prostéticas normales (PrEC). Se estudiaron dos clones de LNCaP, uno de los cuales, LNCaP-FGC, se acababa de obtener para este fin del depósito ATCC. El otro (LNCaP-R) se había sometido a pasos en serie en el laboratorio [LNCaP-R es el nombre de un aislado obtenido originalmente de ATCC (como LNCaP-FGC) y mantenido en la Clínica Cleveland, Departamento de Biología del Cáncer (laboratorio de W. Heston)]. Se realizó RT-PCR en ARN de estas líneas celulares usando cebadores específicos para una región conservada de 700 pb dentro de la región que codifica la proteína env del XMRV VP35 (Figura 34, panel A). No se detectaron productos de PCR en la mayoría de las líneas celulares, incluyendo todas las del tipo silvestre para RNASEL. Particularmente, sin embargo, uno de los dos clones ensayados de LNCaP (LNCaP-R) era positivo en una banda del tamaño esperado, mientras que el otro (LNCaP-FGC) era negativo. El control positivo de GAPDH (391 pb) estaba presente a niveles similares después de las reacciones de RT-PCR para cada una de las líneas celulares. El genoma del retrovirus LNCaP-R Todo el genoma del retrovirus de células LNCaP-R se recuperó en forma de fragmentos de ADNc solapantes aplicando la misma estrategia de RT-PCR utilizada para recuperar el genoma de XMRV de muestras con tumores de próstata (Figura 31 , panel A y Urisman, A., eí ai, (2005), PLOS Pathogens). En resumen, el ARN total del clon LNCaP-R se transcribió de forma inversa usando oligonucleótidos de hexámeros aleatorios, seguido de PCR con cebadores de PCR específicos para XMRV (Urisman, A., eí ai, (2005), PLOS Pathogens). Los fragmentos de PCR amplificados se clonaron y se secuenciaron. El genoma del retrovirus LNCaP-R deducido (GenBank: DQ272467) es de 8185 nucleótidos de longitud y es muy similar a los dos genomas de XMRV (XMRV VP35 y XMRV VP42) obtenidos de tumores de próstata (Urisman, A., eí ai, (2005), PLOS Pathogens), con los que comparte el 94% de identidad de nucleótidos (Figura 34, panel B [diagramas del árbol y de similitud]). El genoma recuperado también comparte una alta identidad de nucleótidos (el 92%) con otros dos genomas de MuLV xenotrópicos; el retrovirus de tipo C de ratón (GenBank: NC_001702, Heinemeyer T., sin publicar) y MuLV DG-75 (GenBank: AF221065, (Raisch, KP., eí ai, (2003), Virology 308: 83-91 )). En base a estos descubrimientos, se le asignó al virus el nombre provisional de XMRV LNCaP-R. El genoma del XMRV LNCaP-R contiene dos ORF solapantes que codifican las poliproteínas Gag-Pro-Pol y Env de longitud completa (Fig. 35A). Análogamente a los virus relacionados obtenidos de tumor, el XMRV LNCaP-R es un retrovirus canónico sencillo que carece de genes reguladores virales accesorios o secuencias de oncogenes obtenidas del hospedador. La proteína Gag es de 536 aminoácidos de longitud y comparte su mayor identidad de aminoácidos con el XMRV VP35 (el 98%) (Fig. 34, panel D). Cadena arriba del AUG de gag está una región de 300 nucleótidos conocida como la región gag líder 5', que en la mayoría de los MuLV ecotrópicos codifica una forma de Gag glicosilada secundaria (glico-Gag) expresada a partir de un codón de inicio CUG alternativo (Prats, AC., eí ai, (1989), J Mol Biol. 205: 363-372). Se descubrió que el líder gag 5' era la región más divergente en los genomas de XMRV obtenidos de tumor en comparación con otros MuLV (Urisman, A., eí ai, (2005), PLOS Pathogens). Al igual que en XMRV VP35 y VP42 esta región está interrumpida por un codón de terminación 53 aminoácidos cadena abajo del codón de inicio CUG de glico-Gag y lleva una deleción de 24 nucleótidos característica de los XMRV (Fig. 34, panel C) y que no se descubre en ningún otro genoma de gammaretrovirus conocido. (Nota: puesto que la proteína glico-gag es prescindible para la aplicación de retrovirus (Fan, H., eí ai, (1983), Proc Natl Acad Sci USA 80: 5965-5969; Schwartzberg P, eí ai, (1983), J Virol 46: 538-546), no se espera que estas lesiones alteren la infectividad del XMRV; véase a continuación). Análogamente, todas las secuencias reguladoras presentes en los genomas de XMRV obtenidos del tumor se encontraron también en las mismas posiciones en el genoma de XMRV LNCaP-R. Esto incluye un sitio de unión para un prolil-ARNt, que funciona como el cebador para la trascripción inversa durante la replicación del virus (Adam, MA., et ai, (1988), J Virol 62: 3802-3806; Fisher, J., et al., (1998), Virology 244: 133-145; Beriloz, C, eí ai, (1995), J Virol 69: 2214-2222; Vagner, S., eí ai, (1995), J Biol. Chem 270: 20376-20383); sitios donadores y aceptores de corte y empalme implicados en la generación de ARN subgenómicos de env (véase a continuación); cajas TATAAA (SEC ID N° 50) y CCAAT (SEC ID N° 49) implicadas en el inicio de la transcripción (Temin, HM, (1981 ), Cell 27: 1-3; Coffin, JM., et al., (eds.) (1997) Retroviruses. Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press); un elemento de respuesta glucocorticoides (GRE) y una señal de poliadenilación AATAAA (SEC ID N° 51 ). Sin embargo, a pesar de su similitud global con los XMRV caracterizados, el aislado de LNCaP-R sigue siendo distinto de estos aislados obtenidos del tumor. Al nivel del genoma completo, el aislado no está tan estrechamente relacionado con las secuencias de XMRV VP35 y VP42 como están estos últimos entre sí. Para la región pro-pol predicha (1084 aminoácidos que codifican las actividades proteasa, transcriptasa inversa e integrasa), la identidad de aminoácidos con el XMRV obtenido del tumor es menor que en otras regiones (el 92%), y es similar a la observada en MuLV DG-75 o MTCR. Además, porciones de la región env muestran divergencia significativa con respecto a los XMRV caracterizados (véase Fig. 34, panel D para un diagrama de similitud que compara XMRV35 con XMRV LNCaP-R). Sin embargo la región env sigue siendo muy similar a los gammaretrovirus xenotrópicos/politrópicos lo que indica que el virus debe presentar un rango de hospedadores que incluye a células humanas (véase a continuación). Expresión de los genes del virus en XMRV LNCaP-R Como se ha indicado anteriormente, los sitios donadores (AGGTAAG (SEC ID N° 47), posición 204) y aceptores (CACTTACAG (SEC ID N° 48), posición 5479) de corte y empalme conservados implicados en la generación de ARN subgenómicos de env se encontraron en la misma posición que en XMRV (Urisman, A., eí al., (2005), PLOS Pathogens). Los transcritos del transcrito de 8,2 kb completo sin cortar que codifica gag y pro-pol, y el transcrito de env cortado (3,2 kb) se confirmaron en las células LNCaP-R mediante análisis de Northern usando una sonda LTR (posiciones de nucleótidos 7780 a 7991 ), que detecta los dos mensajes (Figura 35B). Como se había previsto, una sonda específica para gag (posiciones de nucleótidos 603 a 957) detecta solamente el ARN genómico de longitud completa (Figura 35B). El ARNm de env no es detectable con esta sonda porque las secuencias gag se han eliminado mediante corte y empalme. De forma coherente con la expresión de estos transcritos, una gran proporción de las células LNCaP-R se tiñeron de forma positiva con un anticuerpo anti-Gag, mientras que las células LNCaP-FGC no se tiñeron (Fig. 35C). Las células LNCaP-R producen XMRV infeccioso La presencia de ARNm genómicos y subgenómicos implicó fuertemente a la existencia de ADN proviral integrada en las células LNCaP-R. Para buscar directamente esto, se extrajo y se examinó ADN genómico, escindido con la enzima de restricción Pst I (que solamente escinde la región env). Los fragmentos resultantes se examinaron mediante transferencia de Southern con una sonda correspondiente a la región U3 (posiciones 7780-7991 ). Como se muestra en la Fig. 36A, una compleja serie de bandas, que sugiere múltiples sitios de inserción, se observaron en LNCaP-R pero no en las líneas negativas para el virus. La clonación basada en PCR de varias uniones de hospedador- virus confirmó que están presentes múltiples sitios de integración distintos en diferentes cromosomas humanos en el ADN de LNCaP-R (Fig. 36C). El patrón de integrantes del virus en LNCaP-R implicaba que habían ocurrido múltiples infecciones de novo con esta sublínea, lo que indicaba la producción de virus infecciosos. Para demostrar esto de forma directa, se determinó si los sobrenadantes de LNCaP-R podían transmitir la infección a otras líneas. El sobrenadante de las células LNCaP-R se transfirió a células LNCaP-FGC incubadas durante dos horas; después de esto, las células se lavaron, se añadió medio recién preparado y se tomaron muestras del sobrenadante diariamente durante la siguiente semana. La Fig. 37A muestra un aumento progresivo en la actividad de transcriptasa inversa en el medio de cultivo receptor durante este periodo de tiempo, lo que indicaba replicación y multiplicación del virus. Para examinar el intervalo de hospedadores de XMRV-LNCaP R, se inocularon células humanas (DU145, LNCaP-FGC y 293T) o de ratón (3T3) con sobrenadantes de LNCaP-R; 24 o 36 horas después, se prepararon y examinaron ARN y ADN mediante transferencia-hibridación. Una transferencia de Northern de células infectadas humanas (células LNCaP-FGC y 293T) y de ratón 3T3 mostró transcritos genómicos y subgenómicos de las líneas humanas, pero no se observó ARNm de XMRV en las células 3T3 (Fig. 37B). Los análisis de transferencia de Southern del ADN viral en las células humanas receptoras (LNCaP-FGC y DU145) (Fig. 37C) mostraron un grupo de bandas difusas, indicativo de múltiples integraciones independientes, en las líneas humanas inoculadas pero no en las que no se inocularon. (Las células 3T3 de ratón se usaron en este punto solamente como control de hibridación positivo, y mostraron múltiples sitios de integración obtenidos de retrovirus de ratón endógenos. Este alto trasfondo evita el uso eficaz de la transferencia de Southern para provirus de XMRV en esta línea). El descubrimiento de que las células humanas, pero no las de ratón, son vulnerables a la infección es coherente con el xenotropismo predicho para la secuencia de la proteína de la envuelta vírica. Discusión El XMRV es un nuevo gammaretrovirus detectado originalmente en el tejido de la próstata de pacientes con cáncer de próstata y mutaciones genómicas en RNASEL (Urisman, A., eí ai, (2005), PLOS Pathogens). El XMRV es el primer ejemplo de una infección por retrovirus xenotrópico en tejido humano y el vínculo epidemiológico con lesiones de RNASEL implica un importante papel de la ARNasa L en el control de la infección. Estos descubrimientos se apoyan en el análisis in situ del tejido de la próstata descrito en este documento, que refuerza que la infección se encuentra principalmente en sujetos homocigotos para la R462Q en la variante de ARNasa L. Es importante, que se demuestre que la infección no está presente en las propias células del carcinoma, sino en un subconjunto de células del estroma principalmente fibroblastos y elementos de la sangre. Estos descubrimientos proporcionan las condiciones limitantes dentro de las que se pueden enmarcar las dos preguntas principales planteadas por XMRV: (i) ¿Cómo influye la actividad de ARNasa L en la infección por XMRV? y (ii) ¿Cuál, si existe alguna, es la relación entre la infección por XMRV y el cáncer de próstata? Acción de ARNasa L e infección por XMRV Los datos que se proporcionan en este documento y los de Urisman y colaboradores (Urisman, A., eí al., (2005), PLOS Pathogens) proporcionan una demostración empírica de que las mutaciones en RNASEL son importantes en la adquisición o en la persistencia de la infección por XMRV in vivo (Urisman, A., eí ai, (2005), PLOS Pathogens). Aunque existen pruebas considerables a partir de estudios animales y de cultivos celulares de que la ARNasa L es una proteína antiviral importante, la mayoría de los estudios se centraron en virus con ciclos de replicación basados en el ARN incluyendo picornavirus (Zhou, A., eí ai, (1997), Embo J 16: 6355-6363; Flodstrom-Tullberg, M., et ai, (2005) J Immunol 174: 1 171 -1177), paramixovirus (Behera, AK., eí ai, (2002), J Biol. Chem 277: 25601 -25608), alfavirus (Ryman, KD., eí ai, (2002), Viral Immunol 15: 53-76) o retrovirus (Smith, JA., eí ai, (2005), J Virol 79: 2240-2250). Relativamente pocos estudios se han centrado en el papel del sistema 2-5A/ ARNasa L e infecciones por retrovirus. Los interferones de tipo I inhiben claramente la replicación de los retrovirus, pero estas citoquinas activan muchos efectores cadena abajo además de la ARNasa L, y pueden crear bloqueos en muchas etapas de la replicación de los retrovirus, incluyendo transcripción inversa, traducción, ensamblaje del virus y liberación del virus (Pitha, PM., (1994) Antiviral Res 24: 205-219; Poli, G., eí ai, (1994), Antiviral Res 24: 221-233, Friedman, RM., eí ai, (1974) Proc Natl Acad Sci USA 71: 3542-3544). Sin embargo, la sobreexpresión experimental de OAS (Schroder, HC., eí ai, (1992), Int J Biochem 24: 55-63) o ARNasa L (Maitra, RK., eí ai, (1998), J Virol 72: 1 146-1 152) en células cultivadas altera la replicación del VIH, y la supresión de la actividad de la ARNasa L mediante la sobreexpresión de un inhibidor de ARNasa L también potencia modestamente el crecimiento del VIH en cultivo (Martinand, C, eí ai, (1999), J Virol 73: 290-296). En infecciones por VIH, las OAS pueden activarse mediante regiones de ARN estructurales dentro de las regiones 5' UTR y TAR; puede pensarse de este modo que OAS es un "sensor" celular para el VIH (Maitra, RK., eí ai, (1994), Virology 204: 823-827). Las regiones del ARN de XMRV detectadas por OAS, o cómo la activación de ARNasa L afecta a la replicación de XMRV no está claro, pero la recuperación de un miembro de la familia de XMRV de células LNCaP-R abre las dos preguntas al estudio experimental. La barrera a la infección por XMRV planteada por la ARNasa L es relativa, no absoluta: la célula DU145, que no tiene lesiones en el RNASEL, puede ser infectada por XMRV en condiciones de alta multiplicidad de infección (MOI) in vitro (Figuras 37A-37C). Esto no debe ser completamente sorprendente, ya que se mantiene junto con otros factores de restricción para la replicación de los retrovirus, como el Fv-1 de MuLV y factores de restricción identificados más recientemente de VIH y SIV, todos los cuales pueden superarse mediante un MOI alto (Goff, SP., (2004), Mol Cell 16: 849-859; Bieniasz, PD., (2003), Trends Microbiol 11: 286-291 ). Puesto que la mayoría de las infecciones in vivo se establecen inicialmente en condiciones de MOI bajo, posiblemente es esta restricción a este nivel de MOI la que se selecciona durante la evolución del virus.

A partir de los resultados del examen de líneas celulares de cáncer de próstata humano descritos en este documento, pueden extraerse varias conclusiones. En primer lugar, la ausencia de ADN del virus en el ADN genómíco de la mayoría de las células humanas indica que el XMRV no es un retrovirus endógeno, sino un agente adquirido de forma exógena. En segundo lugar, aunque las células LNCaP se establecieron a partir de un tumor clonal, los sitios de integración parecen no ser clónales. Esto indica que la infección de la línea celular era posterior al establecimiento de la línea clonal. La multiplicidad de integrantes refleja presumiblemente la propagación horizontal de la infección dentro de la línea. Esta interpretación también es coherente con el hecho de que el clon LNCaP-FGC es negativo para la infección. Puesto que los análisis in situ de los tumores de próstata (Figuras 30-33) indican que las células de carcinoma no se infectan in vivo, esta infección debe haberse producido in vitro. Por lo tanto, hay dos posibles escenarios para dicha infección: (i) durante la explantación del tumor original, una pequeña cantidad de células tumorales pueden haber adquirido infección mediante propagación a partir de las células del estroma; o (ii) la infección puede haberse producido en el laboratorio durante el paso en serie de la línea. Si las células LNCaP-FGC se purificaron antes del depósito en el ATCC, entonces la posibilidad (ii) es más probable. Infección por XMRV y cáncer de próstata Los descubrimientos descritos en este documento de que la infección por XMRV se dirige a células del estroma y no a células del carcinoma tienen implicaciones principales para considerar la relación de la infección por XMRV con el cáncer de próstata. Este descubrimiento, y el hecho de que el genoma de XMRV no aloja oncogenes derivados del hospedador, excluye dos modelos clásicos de la oncogénesis de retrovirus: introducción directa de un oncogen que actúa de forma dominante y activación mediante la inserción de dicho gen. Se hace hincapié en que la epidemiología descrita en este documento vincula la infección por XMRV con el genotipo RNASEL pero no implica obligatoriamente ningún vinculo etiológico con el cáncer de próstata. Aunque su exclusión de las células del carcinoma hace improbable la oncogénesis directa mediante XMRV, pueden preverse más aportaciones indirectas del virus al tumor. El cáncer de próstata es una enfermedad con una larga historia natural y en la glándula se producen muchos cambios histológicos antes de la aparición del tumor manifiesto. Los trabajos actuales hacen hincapié en que los cánceres de próstata se acompañan generalmente con pruebas de inflamación prostática crónica y una lesión llamada atrofia inflamatoria proliferativa (PÍA) que a menudo se encuentra en las etapas anteriores al tumor de la enfermedad (Nelson, WG., eí ai, (2003), N Engl J Med 349: 366-381 ). Se especula que los subproductos de esta inflamación (por ejemplo, radicales libres y el daño por oxidación) pueden desencadenar la lesión y la regeneración del epitelio prostático. Esta proliferación potenciada proporciona oportunidades de errores en la replicación para engendrar mutaciones. Aquellas mutaciones que regulan de forma negativa tienen una ventaja selectiva. A menudo se encuentra la PÍA junto con una neoplasia intraepitelial de la próstata (HGPIN) en el cáncer temprano y las pruebas acumuladas sugieren una ruta genética identificable entre PÍA, HGPIN, y el cáncer (Nelson, WG., eí ai, (2003), N Engl J Med 349: 366-381 ). Existen observaciones que apoyan la hipótesis de infección/inflamación, de que variantes o sucesos epigenéticos en otros genes implicados en inmunidad innata (la familia TLR), control de la respuesta inflamatoria (MSR1 y MIC-1 ), actividad antioxidante (PON1 y GSTP1 ), o reparación del ADN en respuesta al estrés oxidativo (OGG1 , CHEK2, y BRCA2), predisponen a los hombres al cáncer de próstata (Zheng, SL., eí ai, (2004), Cáncer Res 64: 2918-2922; Xu, J., eí ai, (2002), Naf Genet 32: 321 -325; Lindmark, F., ef ai, (2004), J Natl Cáncer Inst 96: 1248-1254; Marchesani, M., ef ai, (2003), J Natl Cáncer Inst 95: 812-818; Xu. J., ef ai, (2002), Cáncer Res 62: 2253-2257; Dong, X., ef ai, (2003), Am J Hum Genet 72: 270-280; Edwards, SM., eí ai, (2003), Am J Hum Genet 72: 1 -12). Aunque se desconoce la causa de la inflamación en PÍA, las infecciones son un desencadenante potencial obvio y una infección vírica persistente restringida al estroma estaría bien colocada para contribuir a dicho proceso. Desde este punto de vista, una razón para el vínculo entre las mutaciones de R?ASEL y el cáncer de próstata sería la incapacidad para el sistema inmune deficiente en AR?asa L de forma innata, para eliminar una infección por XMRV en el estroma; la infección persistente resultante podría contribuir después a un estado inflamatorio crónico cuyo resultado final sería PÍA. (Se observa que la de XMRV no es necesariamente la única infección que precipita dicho escenario). El descubrimiento de que XMRV afecta principalmente a las células del estroma da origen a otro mecanismo potencial para contribuir a la neoplasia prostática. Los trabajos recientes han demostrado que las células del estroma tienen un papel activo en la promoción de la tumorgénesis de las células epiteliales adyacentes produciendo diversas citoquinas y factores del crecimiento que sirven como señales de proliferación (Tlsty, TD., ef ai, (2001 ), Curr opin Genet Dev 11: 54-59). En particular, los fibroblastos asociados con el cáncer estimulan el crecimiento de células epiteliales prostéticas humanas y alteran su histología in vivo (Olumi, AF. Et ai, (1999), Cáncer Res 59: 5002-5011 ). Puede pensarse que las células del estroma prostéticas infectadas por XMRV podrían producir y secretar factores de crecimiento, citoquinas u otros factores que estimulen la proliferación celular en el epitelio circundante. Dicho mecanismo paracrino podría seguir funcionando de forma bastante eficaz incluso con la relativamente pequeña cantidad de células infectadas por XMRV que caracteriza a la lesión. Finalmente, se observa que la identificación de una infección exógena como XMRV podría ayudar a explicar porque no todos los estudios genéticos han identificado de forma coherente a ARNasa L como un factor de susceptibilidad al cáncer de próstata. Si dicha infección estuviera vinculada, aunque fuera indirectamente, al riesgo de cáncer de próstata, y si la prevalencia de la infección no fuera uniforme en diferentes poblaciones, podría esperarse que las poblaciones con una prevalencia de XMRV baja no mostraran asociación de lesiones de RNASEL con el cáncer de próstata.

Tabla 1. Detección de HXV en Próstatas (lista maestra) Leyenda: MR = -retrovirus de ratón. 10 15 10 15 10 15 10 15 o 10 15 10 15 Tabla 2. Secuencia de HXV35 HXV35= PCRV genoma completo a partir de RdB (Edit 1 , 30-06-2004; Edit 2, 28-02-05) GCGCCAGTCATCCGATAGACTGAGTCGCCCGGGTACCCGTGTTCCCAATAAAGCCTTTT GCTGTTTGCATCCGAAGCGTGGCCTCGCTGTTCCTTGGGAGGGTCTCCTCAGAGTGATT GACTACCCAGCTCGGGGGTCTTTCATTTGGGGGCTCGTCCGGGATTCGGAGACCCCCGC CCAGGGACCACCGACCCACCGTCGGGAGGTAAGCCGGCCGGCGATCGTTTTGTCTTTGT CTCTGTCTTTGTGCGTGTGTGTGTGTGCCGGCATCTAATCCTCGCGCCTGCGTCTGAAT CTGTACTAGTTAGCTAACTAGATCTGTATCTGGCGGTTCCGCGGAAGAACTGACGAGTT CGTATTCCCGGCCGCAGCCCAGGGAGACGTCCCAGCGGCC CGGGGGCCCGTTTTGTGG CCCATTCTGTATCAGTTAACCTACCCGAGTCGGACTCTTTGGAGTGGCTTTGTTGGGGG ACGAGAGACAGAGACACTTCCCGCCCCCGTCTGAATTTTTGCTTTCGGTTT ACGCCGA AACCGCGCCGCGCGTCTGATTTGTTTTGTTGTTCTTCTGTTCTTCGTTAGTTTTCTTCT GTCTTTAAGTGTTCTCGAGATCATGGGACAGACCGTAACTACCCCTCTGAGTCTAACCT TGCAGCACTGGGGAGATGTCCAGCGCATTGCATCCAACCAGTCTGTGGATGTCAAGAAG AGGCGCTGGGTTACCTTCTGTTCCGCCGAATGGCCAACTTTCAATGTAGGATGGCCTCA GGATGGTACTTTTAATTTAGGTGTTATCTCTCAGGTCAAGTCTAGAGTG TTGTCCTG GTCCCCACGGACACCCGGATCAGGTCCCATATATCGTCACCTGGGAGGCACTTGCCTAT GACCCCCCTCCGTGGGTCAAACCGTTTGTCTCTCCTAAACCCCCTCCTTTACCGACAGC TCCCGTCCTCCCGCCCGGTCCTTCTGCGCAACCTCCGTCCCGATCTGCCCTTTACCCTG CCCTTACCCTCTCTATAAAGTCCAAACCTCCTAAGCCCCAGG TCTCCC GATAGCGGC GGACCTCTCATTGACCTTCTCACAGAGGATCCCCCGCCGTACGGAGTACAACCTTCCTC CTCTGCCAGGGAGAACAATGAAGAAGAGGCGGCCACCACCTCCGAGGTTTCCCCCCCTT CTCCCATGGTGTCTCGACTGCGGGGAAGGAGAGACCCTCCCGCAGCGGACTCCACCACC TCCCAGGCATTCCCACTCCGCATGGGGGGAGATGGCCAGCTTCAGTACTGGCCGTTTTC CTCCTCTGATTTATATAATTGGAAAAATAATAACCCTTCCTTTTCTGAAGATCCAGGTA AATTGACGGCCTTGATTGAGTCCGTCCTCATCACCCACCAGCCCACCTGGGACGACTGT CAGCAGTTGTTGGGGACCCTGCTGACCGGAGAAGAAAAGCAGCGGGTGCTCCTAGAGGC TGGAAAGGCAGTCCGGGGCAATGATGGACGCCCCACTCAGT GCCTAATGAAGTCAATG CTGCTTTTCCCCTTGAGCGCCCCGATTGGGATTACACCACTACAGAAGGTAGGAACCAC CTAGTCCTCTACCGCCAGTTGCTCTTAGCGGGTCTCCAAAACGCGGGCAGGAGCCCCAC CAATTTGGCCAAGGTAAAAGGGATAACCCAGGGACCTAATGAGTCTCCCTCAGCCTTTT TAGAGAGACTCAAGGAGGCCTATCGCAGGTACACTCCTTATGACCCTGAGGACCCAGGG CAAGAAACCAATGTGTCCATGTCATTCATCTGGCAGTCTGCCCCGGATATCGGGCGAAA GTTAGAGCGGTTAGAAGATTTAAAGAGCAAGACCTTAGGAGACTTAGTGAGGGAAGCTG AAAAGATCTTTAATAAGCGAGAAACCCCGGAAGAAAGAGAGGAACGTATCAGGAGAGAA ATAGAGGAAAAAGAAGAACGCCGTAGGGCAGAGGATGAGCAGAGAGAGAGAGAAAGGGA CCGCAGAAGACATAGAGAGATGAGCAAGCTCTTGGCCACTGTAGTTATTGGTCAGAGAC AGGATAGACAGGGGGGAGAGCGGAGGAGGCCCCAACTTGATAAGGACCAATGCGCCTAC TGCAAAGAAAAGGGACACTGGGCTAAGGACTGCCCAAAGAAGCCACGAGGGCCCCGAGG ACCGAGGCCCCAGACCTCCCTCCTGACCTTAGGTGACTAGGGAGGTCAGGGTCAGGAGC CCCCCCCTGAACCCAGGATAACCCTCAAAGTCGGGGGGCAACCCGTCACCTTCCTGGTA GATACTGGGGCCCAACACTCCGTGCTGACCCAAAATCCTGGACCCGTAAGTGACAAGTC TGCCTGGGTCCAAGGGGCTACTGGAGGAAAGCGGTATCGCTGGACCACGGATCGCAAAG TACATCTGGCTACCGGTAAGGTCACCCACTCTTTCCTCCATGTACCAGACTGCCCCTAT CCTCTGCTAGGAAGAGACTTGCTGACTAAACTAAAAGCCCAAATCCACTTCGAGGGATC AGGAGCTCAGGTTGTGGGACCGATGGGACAGCCCCTGCAAGTGCTGACCCTAAACATAG AAAATAAGTATCGGCTACATGAGACCTCAAAAGAGCCAGATGTTCCTCTAGGGTCCACA TGGCTTTCTGATtTTCCCCAGGCCTGGGCGGAAACCGGGGGCATGGGACTGGCAGTTCG 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TGCCAGATTTGACTAAGCCCTTTGAACTCTTTGTCGACGAGAAGCAGGGCTACGCCAAA GGCGTCCTAACGCAAAAACTGGGACCT GGCGTCGGCCTGTGGCCTACCTGTCCAAAAA GCTAGACCCAGTGGCAGCTGGGTGGCCCCCTTGCCTACGGATGGTAGCAGCCATTGCCG TTCTGACAAAGGATGCAGGCAAGCTAACTATGGGACAGCCGCTAGTCATTCTGGCCCCC CATGCGGTAGAAGCACTGGTCAAACAACCCCCTGACCGTTGGCTATCCAATGCCCGCAT GACCCACTATCAGGCAATGCTCCTGGATACAGACCGGG TCAGTTCGGACCGGTGGTGG CCCTCAACCCGGCCACCCTGCTCCCCCTACCGGAAAAGGAAGCCCCCCATGACTGCCTC GAGATCTTGGCTGAGACGCACGGAACCAGACCGGACCTCACGGACCAGCCCATCCCAGA CGCTGATTACACTTGGTACACAGATGGAAGCAGCTTCCTACAAGAAGGACAACGGAGAG CTGGAGCAGCGGTGACTACTGAGACCGAGGTAATCTGGGCGAGGGCTCTGCCGGCTGGA ACATCCGCCCAACGAGCCGAACTGATAGCACTCACCCAAGCC TAAAGATGGCAGAAGG TAAGAAGCTAAATGTTTACACTGATAGCCGCTATGCCTTCGCCACGGCCCATGTCCATG GAGAAATATATAGGAGGCGAGGG TGCTGACCTCAGAAGGCAGAGAAATTAAAAACAAG AACGAGATCT GGCC TGC AAAAGCTCTCTTTCTGCCCAAACGACTTAG ATAA CA CTGTCCAGGACATCAAAAAGGAAACAGTGCTGAGGCCAGAGGCAACCGTATGGCAGATC AAGCAGCCCGAGAGGCAGCCATGAAGGCAGTTCTAGAAACCTCTACACTCCTCATAGAG GACTCAACCCCGTATACGCCTCCCCATTTCCATTACACCGAAACAGATCTCAAAAGACT ACGGGAACTGGGAGCCACCTACAATCAGACAAAAGGATATTGGGTCCTACAAGGCAAAC CTGTGATGCCCGATCAGTCCGTGT TGAACTG AGACTCCCTACACAGACTCACCCAT CCGAGCCCTCAAAAGATGAAGGCACTCCTCGACAGAGAAGAAAGCCCCTACTACATGT AAACCGGGACAGAACTATCCAGTATGTGACTGAGACCTGCACCGCCTGTGCCCAAGTAA ATGCCAGCAAAGCCAAAATTGGGGCAGGGGTGCGAGTACGCGGACATCGGCCAGGCACC CATTGGGAAGTTGATTTCACGGAAGTAAAGCCAGGACTGTATGGGTACAAGTACCTCCT AGTGTTTGTAGACACCTTCTCTGGCTGGGTAGAGGCATTCCCGACCAAGCGGGAAACTG CCAAGGTCGTGTCCAAAAAGCTGTTAGAAGACATTÜTTCCGAGATTTGAAATGCCGCAG GTATTGGGATCTGATAACGGGCCTGCCTTCGCCTCCCAGGTAAGTCAGTCAGTGGCCGA TTTACTGGGAATCGAT3X3G2VAGTTACATTGTGCTTATAAACCCCAGAGTTCAGGACAGG TAGAAAGAATAAATAAAACAATTAAGGAGACTTTAACCAAATTAACGCTTGCATCTGGC ACTAAAGACTGGGTACTCCTACTCCCCTTAGCCCTCTACCGAGCCCGGAATACTCCGGG CCCCCACGGACTGACTCCGTATGAAATTCTGTATGGGGCACCCCCGCCCCTTGTCAATT TTCATAATCCTGAAATGTCAAAGTTAACTAATAGTCCCTCTCTCCAAGCTCACTTACAG GCCCTCCAAGCAGTACAACAAGAGGTCTGGAAGCCGCTGGCCGCTGCTTATCAGGACCA GCTAGATCAGCCAGTGATACCACACCCCTTCCGTGTCGGTGACGCCGTGTGGGTACGCC GGCACCAGACTAAGAACTTAGAACCTCGCTGGAAAGGACCCTACACCGTCCTGCTGACA ACCCCCACCGCTCTCAAAGTAGACGGCATCTCTGCGTGGATACACGCCGCTCACGTAAA GGCGGCGACAACTCCTCCGGCCGGAACAGCATGGAAAGTCCAGCGTTCTCAAAACCCCT TAAAGATAAGATTAACCCGTGGGGCCCCCTGATAATTATGGGGATCTTGGTGAGGGCAG GAGCCTCAGTACAACGTGACAGCCCTCACCAGGTCTTTAATGTCACTTGGAAAATTACC AACCTAATGACAGGACAAACAGCTAATGCTACCTCCCTCCTGGGGACGATGACAGACAC TTTCCCTAAACTATATTTTGACTTGTGTGATTTAGTTGGAGACAACTGGGATGACCCGG AACCCGATATTGGAGATGGTTGCCGCTCTCCCGGGGGAAGAAAAAGGACAAGACTATAT GATTTCTATGTTTGCCCCGGTCATACTGTATTAACAGGGTGTGGAGGGCCGAGAGAGGG CTACTGTGGCAAATGGGGATGTGAGACCACTGGACAGGCATACTGGAAGCCATCATCAT CATGGGACCTAATTTCCCTTAAGCGAGGAAACACTCCTAAGGGTCAGGGCCCCTGTTTT GATTCC CAGTGGGCTCCGGTAGCATCCAGGGTGCCACACCGGGGGGTCGATGCAACCC CCTAGTCCTAGAATTCACTGACGCGGGTAAAAGGGCCAGCTGGGATGCCCCCAAAACAT GGGGACTAAGACTGTATCGATCCACTGGGGCCGACCCGGTGACCCTGTTCTCTCTGACC CGCCAGGTCCTCAATGTAGGGCCCCGCGTCCCCATTGGGCCTAATCCCGTGATCACTGA ACAGCTACCCCCCTCCCAACCCGTGCAGATCATGCTCCCCAGGCCTCCTCGTCCTCCTC CTTCAGGCGCGGCCTCTATGGTGCCTGGGGCTCCCCCGCCTTCTCAACAACCTGGGACG GGAGACAGGCTGCTAAACC GGTAGAAGGAGCCTACCAAGCCCTCAACCTCACCAGTCC CGACAAAACCCAAGAGTGCTGGCTGTGTCTAGTATCGGGACCCCCCTACTACGAAGGGG TGGCCGTCCTAGGTACTTACTCCAACCATACCTCTGCCCCGGCTAAC GCTCCGTGACC TCCCAACACAAGCTGACCCTGTCCGAAGTGACCGGGCAGGGACTCTGCATAGGAGCAGT TCCCAA_ .CCCATCAGGCCCTGTGTAATACCACCCAGAAGACGAGCGACGGG CCTACT ATTTGGCCTCTCCCGCCGGGACCATTTGGGCTTGCAGCACCGGGCTCACTCCCTGTCTA TCTACTACTGTGCTTAACrTAACCAC GATTACTGTGTCCTGGTTGAACTCTGGCCAAA GGTAACCTACCACTCCCCTAATTATGTTTATGGCCAGTTTGGAAAGAAAACTAAATATA AAAGAGAGCCGGTGTCATTAACTCTGGCCCTGCTGTTGGGAGGAC TACTATGGGCGGC ATAGCTGCAGGAGTTGGAACAGGGACTACAGCCCTAGTGGCCACCAAACAATTCGAGCA GCTCCAGGCAGCCATACATACAGACCTTGGGGCCTTAGAAAAATCAGTCAGTGCCCTAG AAAAGTCTCTGACC CGTTGTCTGAGGTGGTCCTACAGAACCGGAGGGGATTAGATCTA CTGTTCCTAAAAGAAGGAGGATTA GTGCTGCCCTAAAAAAAGAATGCTGTTT? ACGC GGACCACACTGGCG..AGTAAGAGATAGCATGGCAAAGCTAAGAGAAAGGTTAAACCAGA GACAAAAATTGTTCGAATCAGGACAAGGGTGGT GAGGGACTGTTTAACAGGTCCCCA TGGTTCACGACCCTGATACCACCATTATGGGCCCTC GATAGTACTT TATTAATCCT ACTCTTCGGACCCTGTA TCTCAACCGCTTGGTCCAG TGTAAAAGACAGAATTTCGG TAGTGCAGGCCCTGGTTCTGACCCAACAGTATCACCAACTCAAATCAATAGATCCAGAA GAAGTGGAATCACGTGAATAAAAGATTT ATTCAGTTTCCAGAAAGAGGGGGGAATGAA AGACCCCACCATAAGGCTTAGCACGCTAGCTACAGTAACGCCATT TGCilAGGCATGGA AAAGTACCAGAGCTGAGTTC CAAAAGTACAAGGAAGTTTAATTAAAGAATAAGGCTG AATAACACTGGGACAGGGGCCAAACAGGATATCTGTAGTCAGGCACCTGGGCCCCGGCT CAGGGCCAAGAACAGA GG CCTCAGATAA GCGAAAC 2_ACA CAGTTTC GGAAGa, CCCACCTCAGTTTCAAGTTCCCCAAAAGACCGGGAAATACCCCAAGCCTTATTTAAACT AACCAATCAGCTCGCTTC CGCTTCTGTACCCGCGCTTTTTGCTCCCCAGTCCTAGCCC TATAAAAAAGGGGTAAGAACTCCAGACTCGGCGCGCCAGTCATCCGATAGACTGAGTCG CCCGGGTACCCGTGTTCCCAATA2_AGCCTTTTGCTGTTTGCAAAAA Tabla 3. Alineamiento de polipéptidos Gag de HXV35 y DG-75 Alineamiento de Proteínas de Lipman-Pearson Ktuple: 2; Penalización de Hueco: 4; Penalizacíón de Longitud de Hueco: 12 Sec 1 (1 > 536) Sec 2 (1 > 536) Similitud Hueco Hueco Consenso HXV35 gag DG75 gag índice Número Longitud Longitud (1 > 536) (1 > 536) 96,3 0 0 536 (1 > 536) (1 > 536) 96,3 0 0 536 vlO v20 v30 v40 v50 v60 v70 v80 v90 vlOO MGQTVTTP Sl-TLQHWGDVQIttASNQSVDVKKRRí^ MGQTVXTPLSLT : H GDVQ?OASNQSVDVKKRR VTFCSAB PTF: VG PQDGTFN : : I QVKS : VF . PGPHGHPDQVPYIVT EAIAYDPPPWVKPF MGQTVTTPLSLTLEHWGDVQRIASNQSVDVKKRRWVTFCSAEWPTFDVGWPQDG 5 ?10 ?20 ?30 ?40 ?S 0 A60 ?70 ? 80 90 ?100 vllO vl20 v!30 vl40 vl50 vl60 vl70 vlBO vl90 v200 VSPKPPPLPTAF\pkPPGPSAßPBSRSA YP?T SIKSKEPKeQ\niPDSIM^ VSPKPPPLPTAPVLPPGPSAQPPSRSALYPAIiT SIK:KPPKSQVLPD :G<3PI.IDLLTEDPPPYG . QPSSSaR.N: EEEAA: ISEVSPPSPMVSRLRGRR 10 VSPKPPPLPiaiPVLPPGPSAQPPSRSALYPi^TPSIKTKPPKPQVI-PDNItePIíIDLLTEDPPPYGAQPSSSARGNDEEEJ?atSEVSPPSPMV-SRLRGRR A110 A120 A130 ?140 ?150 ?160 ?170 ?180 ?190 ?200 v210 t220 v230 v240 v250 v260 v270 v280 v290 v300 15 DPPAADSTTSQAFPLRMGGDGQI YWPFSSSDI.YNWKNNOTSFSEDPGKM DPPAADST : SQ-_ PLRMGGDGQI?QYWPFSSSDLYNWK n!raPSFSEDPGKLT?LIESVLITHQPTWDDCQßLLGTLLTGEEKQRVLLEA KAVRGNDGRPT DPPAADSTSSQl-FPLRMGGDGQLg?ffiPFSSSDLY WKNtmPSFSEDPGKLTAL^ ?210 ?220 ?230 ?240 ?250 ?260 ?270 ?280 ?290 ?300 20 25 O u-i CM CN Tabla 4. Alineamiento de polipéptidos PRO-POL de HXV35 y DG-75.

Alineamiento de Proteínas de Lipman-Pearson 5 Ktuple: 2; Penalización de Hueco: 4; Penalización de Longitud de Hueco: 12 Sed (1 > 1196) Sec 2 (1 > 1197) Similitud Hueco Hueco Consenso HXV35 pro-pol 2 2 8 05 DG75 pro-pol índice Número Longitud Longitud (1 > 1196) (2 > 1197) 96,5 0 0 1196 10 (1 > 1196) (2 > 1197) 96,5 0 0 1196 15 20 25 30 vlO v20 v30 v40 v50 v60 v70 v80 v90 vlOO GGQGQEPPPEPRITLKVGGQPVTFLVbTGAQHSVLTQNPGPLSDKSAWVQGATGGKRYRWTTDR VHLATGKVTHSFLHVPDCPYPLLGRDLLTK KAQrHF GGQGQEPPPEPRITL-rVGGQPVTFLVDTGAQHSVLTQNPGPLSDKSAWVQGATGGKRYRWTTDRKVHLATG VTHSFLHVPDCPYPLLGRDLLTKLKAQIHF GGQGQEPPPEPRITLKVGGQPVTFLVDTGAQHSVLTQNPGPLSDKSAWVQGATGGKRYRWTTDRKVHL?TGKVTHSFLHVPDCPYPLIGRDLLTKLEÍAQIHF 10 ?20 ?30 ?40 A50 A60 ?70 ?80 ?90 A100 5 vllO vl20 vl30 vl40 vl50 vldO vl70 vl80 vl 90 v200 EGSGAQVVGPMGQPLQVLTLNIENKYRLHETS EPDVPLGSTWLSDFPQ? AETGGMGLAVRQAPLri?LKATSTPVSIKQYPMSQEARlGIKPHIQRI. D EGSGAQVVGPMGQPLQVLTLNIE : , RLHETS . EPDV : LGSTWLSDFPQAWAETG MGLAVRQAPLIIPLKATSTPVSIKQYPMSQEARLGIKPHIQRLLD EGSGAQWGPMGQPLQVLTLNIEDEYRLHETSTEPDVSLGSTW SDFPQAWAETGGMGIAVRQAPLllPLKATSTPVSIKQYPMSQEARLGIKPilIQRLLD 10 All0 ?120 ?130 140 A150 ?160 A170 ?180 ?190 ?200 v210 v220 v230 v240 v250 v260 v270 v280 v290 v300 QGILVPCQSPWNTPLLPVKKPGTNDYRPVQDLREVNKRVEDIHPTVPNPYNLLSGLPPSHQWYTVLDLKDAFFCLRLHPTSQPLFAFEWRDPEMGISGQL . 15 QGILVPCQSPW TPLLPVEtKPGTNDYRPVQDLREVNKRVEDIHPTVPNPYNLLSGLPPSHQ YTVLDLKDAFFCLRLHPTSQPLFAFEWRDPEMGISGQL QGILVPCQSP NTPLLPVKKPGTNDYRPVQDLREVNKRVEDIHPTVPNPYNL SGLPPSHQ YTVLDLKDAFFCLRLHPTSQPLFAFEWRDPE.IGISGQL A210 A220 A230 A240 A250 A260 A270 A280 290 A300 v310 v320 v330 v340 v350 v360 v370 v380 v390 v400 20 TWTRLPQGFKüfSPTLFDEALHRDLADFRIQHPDLlLLQYVDDLLLTyVTSEQDCQRGTRALLQTLGNLGYRASAKKAQICQKQVKYLGYL EGQRWLTEA T TRLPQGFKNSPTLFDEALHRDLADFRIQHPDLILLQYVDD : LLAATSE DCQ : GTRALL TLGNLGYRASAKKAQ : CQKQVKYIGYLLKEGQRWLTEñ TWTRLPQGFÍ NSPTLFDEA HRDr,ADFRIQKPDLrLLQYVDDILLAATSELDCQQGTRALLLTLGNLGYRASAKKAQLCQKQVKYLGYLLKEGQRWLTEA A310 ?320 ?330 A340 A350 360 A370 A380 A390 A400 25 v410 v420 v430 v440 v450 v460 v470 v480 v490 v500 RKETVMGQPGPKTPRQLREFLGTAGFCRL IPGFAEMAAPLYPLTKTGTLFNWGPDQQKAYQEIKQALLTAPALGLPDLTKPFELFVDEKQGYAKGVITQ RKETVMGQPTPÍCTPRQLREFLGTAGFCR IPGFAEMAAPLYPLT TGTLFNWGPÜQQKAYQSIKQALLTAPALGLPDLTKPFELFVDEKQGYAKGVLTQ RKETVMGQPTPKTPRQLREFLGTAGFCRL(.IPGF?EMAAPLYPLTKTGTLFNWGPDQQKAYQEIKQALLT?PALGLPDLTKPFELFVDE QGYAKGVXTQ A410 A420 ?430 A 440 ?450 A 4 60 A 470 ?480 A 490 A500 5 v510 v520 v530 v540 v55Q v560 v570 v580 v590 v600 KLGPWRRPVAYLSKKLDPVAAG PPCLRMVAAIAVLTKD?GKL? GQP VlLAPHAVEALVKQPPDRM SNARMTHYQAbiLLDTDRVQFGPVVALNPATL KLGP RRPVAYLSKKLDPVAA PPCLRMVAAIAVLTKDAGKLT GQPLVILAPHAVEALVKQPPDRWLSNARMTHYQAMLLDTDRVQFGPVVALNPATL KLGPWRRPVAYLSKKLDPVAAR PPCLR VAMAVLTKDAGKLTMGQPLVIIAPHAVEALVKQPPDRWLSNARMTHYQA LLDTDRVQFGPVVALN P?TL 1 U A510 A520 ?530 ?540 A550 A560 A570 A580 ?590 ?600 v610 v620 ' v630 v640 v650 v660 v670 v680 v690 v700 LPLPEKEAPHDCLEIIJffiTHGTRPDLTDQPIPDADYTPnfTDGSSF QEGQRRAGAAVTTETEVIMARALPAGTSAQRAELIALTQALK AEGKKLNVYTD 15 LPLPEK.APHDCLEII?ETHGTRPDLTDQPIPDAD. T?nrTDGSSFI -EGQRRAGAAVTTETEVIWARALPAGTSAQPAELIALTQALKMAEGKKLNVYTD LPLPEKGAPHDCLE ILAETKGTRPDLTDQP I PDADHTWYTDGSS FS.QEGQRRAGAAVTT ETEVIWARALPAGTS AQRAEL IA TQALKMAEGKKLNVYTD ?610 A620 630 A 640 ? 650 A 660 670 A 680 A690 A700 v710 v720 • v730 v740 v750 v760 v770 v780 v790 v800 20 SRYAFATAHVHGEIYRRRGLLTSEGRErK KNEILALLKALFLPKRLSIlHCPGHQKGNSAEARGNRMADQAAREAAMKAVLETSTLLrEDSTPYTPPHF SRYAFATAHVHGEIYRRRGLLTSEGREIKNK: EILALLKALFLPKRLSIIHCPGHQKGNSAEARGNRMADQAAREAA: : : ETSTLLIEDSTPYTP : HF SRYAFAT?HVHGEIYRRRGLLTSEGREIK KSEILALLKALFLPKRLSIIHCPGHQKGMSAEARGNRMADQAAREAAIRTSPETSTLLIEDSTPYTPSHF A710 A720 ?730 ?740 ?750 A760 A770 A780 A 790 ?800 25 v810 v820 v830 v840 v850 v860 v870 v880 v890 v90O HYTETDLKRLRELGATYNQTKGY VXQGKPVMPDQSVFELLDSI-HRLTHPSPQKMKALLDDREESPYYMLNRDRTIQYVTETCTACAQVNAS AKIGAGV HYTETDLKRLRELGATYNQ.KGY VLQGKPVtíPDQ VFELLDSLHRLTH SPQKMKAL1DDREESPYYMLNRDRT:QYV:E: CTACAQVNASKA IGAGV HYTETDLKRLRELGATYNQIKGYHVLQGKPV PDQ-?E?LLDSLHRLTLPSPQKMKALLDDREESPYYMLNRDRTLQYVAESCTACAQVNASKAKIGAGV ?610 A020 A030 840 A850 T60 ?Q70 ?880 ?890 A900 - -) 10 "3* 10 t_> Z S 2 u~> O CN CM Tabla 5. Alineamiento de polipéptidos ENV de HXV35 y DG-75. Alineamiento de Proteínas de Lípman-Pearson Ktuple:2; Penalización de Hueco: 4; Penalización de Longitud de Hueco: 12 Sec 1 (1 > 645) Sec 2 (1 > 644) Similitud Hueco Hueco Consenso HXV35 env DG75 env índice Número Longitud Longitud (1 > 645) (1 > 644) 93,8 1 1 645 (1 > 645) (1 > 644) 93,8 1 1 645 10 15 c 20 25 vlO v20 v30 v40 v50 v60 v70 v80 v90 vlOO MESPAFSKPLK0KIKPWGPLIXMGlLVRAGASVQRDSPHQVFNVT iTNLMTGQTANATSUjGTMTDTFPKLYFDLCDLVGDNWDDPEPDIGDGCRSPG ME : PAFSKPLKDKINPWGPLI:MGILVRñGASVQRDSPHQ : FNVTW: : TNLMTGQTANATSLLGTMTDTFPKLYFDLCDLVGD WDDPEPDIGDGCR : G MEGPAFSKPLKDKINPWGPLIVMGILVRAGASVQRDSPHQIFNVTWRVTNLMTGQTANATSLLGTMTDTFPKLYFDLCDLVGDYWDDPEPDIGDGCRTPG A10 A20 A30 A40 A50 A60 ?70 ABO A90 A100 5 vllO vl20 vl30 vl 40 vl50 vl60 vl70 vl80 vl90 v200 GRKRTRLTDFIVCPGHTVLTGCGGPREGY(»íOTGCETTG?2AY KPSSSlTOllSLKRGNTPKGQGPCFDSSVGSGSIQGATPGGRCNPLVI.EFTDAGKRAS GR: RTRLTDE1VCPGHTV . GCGGP EGYCGKWGCETTGQAYWKPSSS DI?ISLKRGNTPK: QGPC: DSSV: SG : QGATPGGRCNPLV EETDAG : :AS GRKRTRLTDFTVCPGHWPIGCGGPGEGYCGKÍTOCETTGQAYHKPSSS?roitISLKRG_rc,FKD^ 10 ?110 ?120 A130 "140 A 150 A16O A170 A180 A190 v210 v220 v230 v240 v250 v260 v270 v280 v290 v300 TOAPKTWGIJ^3^?GADFTOLFSLTRQVI?i ¡PRVPIGPNWITEQLPPSQPVQI^ 15 TO5APK . WGLRL?RSTGADPVT TSJ-TRQVI?ÍVGPR : PIGPNPVTT : QLPPSQPVQIMLPRPP : PPPS : . . SMVPGA?PPSQQPGTGDRLI.mVEGAYQAI. TOAP-^GLÍ^XRSTGAD PVTRFSLTRQVLHVGP IP 1 GENOTr T^ A200 ?210 ?220 A230 A240 ? 250 A 260 ?270 A280 A290 v310 v320 v330 v340 v350 v360 v370 v380 v390 v400 20 ip_TSEDKTQECMXCLVSGPPrSBGVAVLGííSS_?HTSAPANCSrvtSQHKLI_.SEVTGQGLCIGAVPKTHQai.C^ KLTSPDKTQECBtCLVSGPBIYBGVAVLGTSSlTHTSAPANCSV: SQHKLTI.SEVTGQGLC : GaVPKTHQAI.CNTTQKTSDGSTYLA : PAGTIWAC : TGLT ipiTSPDKTQBCnffiCLVSGPP?YEGVAVLGlI?SMHTSAPANCSWASQHKLTI.SEVTGQGlCVGAVPKTHQAI.CWTTQKTSDGSYYLAAPAGTIWñCNTGLT A300 310 320 A330 A340 ?350 A360 A370 A380 390 25 LGI O .-H CM CN Tabla 6. Sitios de unión al cebador en HXV35 y DG-75 HXV35 PBS: TGGGGGCTCGTCCGGGAT (SEC ID N° 69) ARNt de Prolina DG-75 PBS (1): TGGAGGTCCCACCGAGAT (SEC ID N° 70) ARNt de Treonina 10 DG-75 PBS (2): TGGAGGCCCCAGCGAGAT (SEC ID N° 71) Tabla 7. Regiones variables A y B en las proteínas SU de diferentes gammaretrovirus. 15 Región Variable A V HXV35 (xenotrópico) DnWDDpepdigd (SEC ID N° 72) GCrTPggRrR (SEC ID N° 73) DG-75 (xenotrópico) DyWDDpepdigd (SEC ID N° 74) GCrTPggRrR (SEC ID N° 75) 20 MCF247 (politrópico) DdWDEtgl (SEC ID N° 76) GCrTPggRkR (SEC ID N° 77) MKVENVA MLV (anfotrópico) EeWDPsdqepyvgy (SEC ID N° 78) GCrTPggRqR (SEC ID N° 79) M-MLV (ecotrópico) SyWGLeyqspfssppgppccsggsspgcsrdceepItsItpRCnTAwnRIK (SEC ID N° 80) Región Variable B 25 HXV35 (xenotrópico) trlyd(SECIDN°81)[. .] FYVCPGhtvItG (SEC ID N° 82) DG-75 (xenotrópico) trlyd (SEC ID N° 83) [. .] FYVCPGhtvpiG (SEC ID N° 84) MCF247 (politrópico) artfd(SECIDN°85)[. ..] FYVCPGhtvptG (SEC ID N° 86) MKVENVA MLV (anfotrópico) trtfd (SEC ID N° 87) [. .] FYVCPGhtvskG (SEC ID N° 88) M-MLV (ecotrópico) IdgtthksnegFYVCPGphrprEsks (SEC ID N° 89) Tabla 8. Alineamiento de la secuencia parcial de un virus obtenido de LNCap. Secuencia del producto de RTPCR de ARN de LNCap. (7084-7750 pb) AññAGAGAGCCCGGTG'TCATTAACrCTGGCCCTGTCTGTTGGGAGGACTTACTATGGGCGGCATAGCTCCAGGAGTTGGAACAGGGACTACñGCCCTAGTGGCCACCAA ACAATTCGAGCAGCTC^GG^GCCTACATACAGACCTTGGGGCCTTAGAAAA TCAGTCAGTGCCCTAGAAAAGTCTCTGACCTCGTTGTCTGAGGTGGTCCTACAG AACCGGAGGGGATTAGATCTACTGTTCCTAAAAGAAGGAGGATTATGTGCTGCCCTAAAAGAAAGAATGCTGTTTTTACGCGGACCACACTGGCGTAGTAAGAGATAGC ATGGCAAAGCTAAGAGAAAGGTTAMCC^GAGACAAAAATTGTTCGAATCAGGACAAGGGTGGTTTGAGGGACTGTTTAACAGGTCCCCATGGTTCACGACCCTGATAT CCACCACCATTATGGGCCCTCTGATAGTACTTTTATTAATCCTACTTTTCGGACCCTGTATTCTCAACCGCTTGGTCCAGTTTGTAAAAGACACAGAATTTCGGTAGTG CAGGCCCTGGTTCTGACCCAGCAGTATCACCAACTCAAATCAATAGATCCAGAAGAAGTGGAATCACGTGAATAAAAGATTTTATTCAGTTTCCAGAAAGAGGGGGGAA TGAAAGACCCCCCCATAAGGC {SEC ID N° 6) 10 Alineamiento de Proteínas de Lipman-Pearson Ktuple:2; Penalización de Hueco: 4; Penalización de Longitud de Hueco: 12 Sed (1 > 127) Sec 2 (1 > 645) Similitud Hueco Hueco Consenso o Sec LNCAP env HXV 35 env índice Número Longitud Longitud 15 (2 > 123) (496 > 616) 97,6 1 1 122 (2 > 123) (496 > 616) 97,6 1 1 122 vio v20 v30 v40 v50 v60 v70 v80 v90 vl OO KSVSALEKSLTSLSEVVLQNRRGLDLLE1.KEGGLCAALKEECCFYADHTGVVRDSMAKLRERLNQRQKLFESGQG FEGLFNRSPWFTTLISTTIMGPLI 20 KSVSALEÍCSLTSLSEVVLQNRRGLDLLFLKEGGLCAALK- ECCFYADHTGVVRDSMAKLRERLNQRQKLFESGQG FEGLFNRSPWFTTLIST IMGPLI SVSALEKSLTSLSEWLQNRRGLDLLFLKEGGLCAALKKECCFYADHTGVVRDSl^KIJ^ A500 A510 A520 A530 A540 ?550 A560 A570 580 A590 vllO vl20 25 VLLLILLFGPCILNRLVQFVKÜ (SEC ID N° 90) VLLLILLFGPCILNRLVQFVKD ( SEC ID N° 91 ) VLLLILLFGPCILNRLVQFVKD (SEC ID N° 92 ) A600 A 610 Alineamiento de Proteínas de Lipman-Pearson Ktuple:2; Penalización de Hueco: 4; Penalización de Longitud de Hueco: 12 Sed (1 > 127) Sec 2 (1 > 644) Similitud Hueco Hueco Consenso Sec LNCAP env HXV 35 env índice Número Longitud Longitud (2 > 123) (495 > 615) 97,6 1 1 122 (2 > 123) (495 > 615) 97,6 1 1 122 10 15 00 20 25 Tabla 9. Presencia de HXV en próstatas según lo determinado por RT-PCR y FISH HXV % de HXV Genotipo mediante Células Células células mediante N° de VP de RNL RT-PCR FISH (+) contadas FISH (+) FISH VP29 AA si 7 659 1,062 + + VP42 AA si 6 530 1,132 ++ VP62 AA si 10 904 1,106 ++ VP88 AA si 5 408 1,225 ++ VP31 AA no 6 526 1,141 ++ VP79 AA sí 2 464 0,431 +/- VP10 AA si 1 872 0,115 - VP35 AA si 1 849 0,118 - VP90 AA si 1 843 0,119 - VP27 AA no 0 762 0,000 - VP45 AG no 0 987 0,000 - VP46 AG no 0 794 0,000 - VP30 GG no 1 661 0,151 - VP50 GG no 1 787 0,127 - VP51 GG no 0 842 0,000 - < 1/500 = - ; 1-2/500 = +/-; 3-4/500 +; 5-6/500 ++ Tabla 10. Selección de XMRV mediante RT-PCR anidada de gag Genotipo3 Total QQ RQ RR PCR + 8 0 1 9 PCR - 12 14 51 77 Total 20 14 52 86 a los genotipos de RNASEL son de la siguiente manera: QQ - variante homocígota para R462Q; RQ - heterocigoto; RR - homocigoto de tipo silvestre.

Tabla 11. Cebadores de PCR usados para la secuenciación de genomas de XMRV.

Tabla 12. Predicciones informáticas de especies de virus usando el programa Predict para las microseries Virochip que se muestran en las Figuras 22A-22B.

Muestra ID de la serie Predicción superior ID Valor p (P < 0,05)a taxonómica de la NCBI VP10 MegaViroP7-244 NA VP27 MegaVíroP7-245 NA VP29 MegaViroP5-174 formador de focos en 11819 1 ,3 E-05 el bazo VP31 MegaVíroP5-176 NA VP35 MegaViroP5-177 formador de focos en 1 1819 1.0 E-05 el bazo VP42 MegaViroP5-178 Osteosarcoma de 1 1830 1 ,5 E-05 ratón VP62 MegaViroP8-037 formador de focos en 1 1819 2,0 E-05 el bazo VP79 MegaViroP8-030 Tipo C de ratón 44561 2,9 E-03 VP88 MegaViroP8-031 formador de focos en 1 1819 1.4 E-05 el bazo VP90 MegaViroP8-032 formador de focos en 11819 2,4 E-04 el bazo VP107 MegaViroP7-246 NA VP45 MegaViroP5-195 NA VP46 MegaViroP5-196 NA VP49 MegaVíroP5-197 NA VP30 MegaViroP5-175 NA VP50 MegaViroP10-128 NA VP51 MegaViroP5-199 NA VP66 MegaViroP8-035 NA VP86 MegaViroP8-036 Virus formador de 11819 8,2 E-04 focos en el bazo HeLa MegaViroP5-179 Papílomavirus 10582 1 ,0 E-06 humano de tipo 18 a las microseríes se analizaron usando E-Predict como se ha descrito anteriormente (Urisman, A., et al. (2005), Genome Biol. 6: R78).

Tabla 13. Frecuencia de células prostéticas infectadas por XMRV determinado mediante FISH. a en el nucleótido 1385 de SPN "A" da como resultado glutamina (Q) en el aminoácido 462, y en el nucleótido 1385 de SPN "G" corresponde a una arginina (R) en el resto 462; incluye todos los tipos de células prostéticas; c +/- = 0,1 -0,2% + = 0,2 - 1 %; ++ = > 1 %; d Véase el documento Urisman, A., et al., (2005), PLOS Pathogens.

Todas las referencias mencionadas en este documento se incorporan como referencia en su totalidad.

Aunque esta invención se ha mostrado particularmente como se describe en referencia a realizaciones preferidas de la misma, los especialistas en la técnica entenderán que pueden realizarse diversos cambios de forma y detalles sin alejarse del alcance de la invención abarcado por las reivindicaciones adjuntas.

INDICACIONES RELACIONADAS CON MICROORGANISMOS DEPOSITADOS U OTRO MATERIAL BIOLÓGICO (PCT/norma 13b/s) A. Las indicaciones que se utilizan a continuación se refieren al microorganismo depositado o a otro materi. biológico mencionado en la descripción en la pág. 19, línea 23 y en la pág. 20, línea 5. B. IDENTIFICACIÓN DEL DEPOSITO Los depósitos adicionales se identifican en una hoja adicional [ ] Nombre de la institución depositaría AMERICAN TYPE CULTURE COLLECTION Dirección de la institución depositaría (incluyendo código postal y país) American Type Culture Collection 10801 University Boulevard Manassas, Virginia 20110-2209 United States of America Fecha del depósito Número de acceso 30 de marzo de 2005 No disponible C. INDICACIONES ADICIONALES (déjese en blanco si no es aplicable) Esta información continúa en una hoj adicional [X] Con respecto a las denominaciones para las que se busca una Patente Europea, el Solicitante informa por I presente a la Oficina Internacional de que el Solicitante desea que, hasta la publicación de la mención de I concesión de una Patente Europea o durante 20 años a partir de la fecha de presentación si la solicitud es rechazad o retirada o se considera que debe ser retirada, el material biológico depositado en la American Type Cultur Collection con el N° de acceso [ ] debe estar disponible como se prevé en la Norma 28(3) EPC solamente com muestra a un experto nombrado por el Solicitante (Norma 28(4) EPC). D. ESTADOS DESIGNADOS PARA LOS QUE SE REALIZAN INDICACIONES (si las indicaciones no son par todos los estados designados) E. CARACTERÍSTICAS O INDICACIONES POR SEPARADO (Déjese en blanco si no es aplicable) Las indicaciones presentadas a continuación se someterán a la Oficina Internacional más adelante (especifique I naturaleza general de las indicaciones por ejemplo, "Número de Acceso del Depósito") Únicamente para uso de la Oficina receptora Únicamente para uso de la Oficina Internacional D Esta hoja se recibió junto con la solicitud O Esta hoja se recibió en la oficina internacional el día: internacional Funcionario autorizado Funcionario autorizado INDICACIONES RELACIONADAS CON EL MICROORGANISMO DEPOSITADO O CON OTRO MATERIAL BIOLÓGICO (Hoja adicional) C. INDICACIONES ADICIONALES (Continuación).

Con respecto a la designación de Australia en la solicitud PCT expuesta y de acuerdo con la normativa 3.25(3) de las Normativas de Patentes Australianas, el Solicitante por la presente avisa de que el depósito de una muestra del material biológico depositado en la American Type Culture Collection con el número de Acceso N/A debe realizarse solamente antes de la concesión de una patente, o antes del retraso, rechazo o retirada de la solicitud, a una persona que sea un remitente autorizado sin interés en la invención y que se nombra en una solicitud del depósito de una muestra. Con respecto a la designación de Canadá en la aplicación PCT, el Solicitante informa por la presente a la Oficina Internacional que el solicitante desea que, hasta que se haya expedido una Patente Canadiense en base a la solicitud o que la solicitud se haya rechazado o se abandone y ya no sea objeto de reinstauración o de retirada, el Comisionado de Patentes autoriza solamente la extracción de una muestra del material biológico depositado en la American Type Culture Collection con el número de acceso N/A y mencionada en la solicitud, a un experto nombrado de forma independiente por el Comisionado.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un XMRV aislado presente en un tumor de próstata de un individuo.

2. El virus de la reivindicación 1 , en el que el individuo comprende una mutación en el alelo del cáncer de próstata hereditario 1 (HPC1 ) que codifica un gen de ARNasa L.

3. El virus de la reivindicación 2, en el que la mutación es una mutación homocigota.

4. El virus de la reivindicación 3, en el que la mutación es homocigota para la mutación R462Q de ARNasa L.

5. Un virus aislado que comprende una secuencia de ácido nucleico que tiene al menos el 94% de identidad con la SEC ID N° 1 o un complemento de la misma.

6. Un virus aislado que comprende la SEC ID N° 1 y un complemento de la misma.

7. Un virus aislado que comprende una secuencia de aminoácidos codificada por una secuencia de ácido nucleico que tiene al menos el 94% de identidad con la SEC ID N° 1 .

8. Un virus aislado que comprende una secuencia de aminoácidos codificada por la SEC ID N° 1.

9. Un virus aislado que comprende la SEC ID N° 2.

10. Un polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 97% de similitud con la SEC ID N° 3.

1 1. Un polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 97% de similitud con la SEC ID N° 4.

12. Un polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 94% de similitud con la SEC ID N° 5.

13. Un polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionado entre el grupo constituido por: SEC ID N° 3, SEC ID N° 4, SEC ID N° 5 y combinaciones de las mismas.

14. Un vector que comprende la secuencia de ácido nucleico de la reivindicación 5.

15. Una célula que comprende el vector de la reivindicación 14.

16. Un anticuerpo o un fragmento de unión al antígeno del mismo que se une específicamente a un virus que comprende una secuencia de aminoácidos codificada por una secuencia de ácido nucleico que tiene al menos el 94% de identidad con la SEC ID N° 1 .

17. El anticuerpo o fragmento de unión al antígeno de la reivindicación 16, en el que el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno se une a un polipéptído gag codificado por el virus.

18. El anticuerpo o fragmento de unión al antígeno de la reivindicación 17, en el que el polipéptido gag comprende la SEC ID N° 3.

19. Un método para detectar XMRV en una muestra que comprende: a) poner en contacto la muestra con una secuencia de ácido nucleico que híbrida con toda o una porción de la secuencia de ácido nucleico de XMRV en condiciones en las que puede producirse un complejo de hibridación entre la secuencia de ácido nucleico y la secuencia de ácido nucleico del XMRV; y b) determinar si el complejo de hibridación se detecta en la muestra, en el que si se detecta el complejo de hibridación, entonces XMRV está en la muestra.

20. Un método para detectar XMRV en una muestra que comprende: a) poner en contacto la muestra con un anticuerpo o un fragmento de unión al antígeno del mismo que se una específicamente a un polipéptido de XMRV en condiciones en las que puede producirse un complejo entre el anticuerpo y el polipéptido de XMRV; y b) determinar si el complejo se detecta en la muestra, en el que si se detecta el complejo, entonces XMRV está en la muestra.

21. Un método para identificar un agente que inhibe a un XMRV que comprende: a) poner en contacto el XMRV con un agente a evaluar, y b) determinar si el XMRV se inhibe en presencia del agente, en el que, si el XMRV se inhibe en presencia del agente, entonces el agente inhibe a XMRV.

22. El método de la reivindicación 21 , en el que la actividad del XMRV en presencia del agente se determina midiendo la capacidad del XMRV para producir partículas retrovirales con actividad de transcriptasa inversa.

23. Un método para inducir una respuesta inmune a un XMRV en un individuo que lo necesite, que comprende administrar al individuo una cantidad eficaz de un agente que induce una respuesta inmune al XMRV en el individuo, después de la administración.

24. El método de la reivindicación 23, en el que el agente se selecciona entre el grupo compuesto por: una subunidad de XMRV y un XMRV atenuado.

25. Un método para tratar cáncer de próstata en un individuo en el que el XMRV está presente en el individuo, que comprende administrar al individuo una cantidad eficaz de un agente que inhibe a XMRV.

26. Un método para detectar cáncer de próstata asintomático (de etapa temprana) en un individuo, en el que XMRV está presente en la próstata del individuo, que comprende detectar la presencia de un XMRV en el individuo, en el que la presencia del XMRV en el individuo es indicativa de cáncer de próstata de etapa temprana en el individuo.

27. Un método para identificar un individuo que corre el riesgo de desarrollar cáncer de próstata, que comprende determinar si un XMRV está presente en el individuo, en el que si XMRV está presente en el individuo entonces el individuo corre el riesgo de desarrollar cáncer de próstata.

28. el método de la reivindicación 27, en el que el individuo tiene una mutación en el alelo de cáncer de próstata hereditario 1 (HCP1 ) que codifica un gen de ARNasa L.

29. El método de la reivindicación 28, en el que la mutación es una mutación homocigota.

30. El método de la reivindicación 29, en el que la mutación es homocigota para la mutación R462Q de ARNasa L.

31. Un kit para determinar la presencia de XMRV en una muestra que comprende un resto marcado que detecta a XMRV en una muestra.

32. El kit de la reivindicación 31 , en el que el resto marcado es una secuencia de ácido nucleico que hibrida con toda o parte de una secuencia de ácido nucleico de XMRV.

33. El kit de la reivindicación 1 , en el que el resto marcado es un anticuerpo o un fragmento de unión al antígeno del mismo que se une específicamente a XMRV.

34. Un método para producir XMRV, que comprende mantener la célula de la reivindicación 14 en condiciones en las que se produce XMRV.

35. El método de la reivindicación 33, que comprende aislar el XMRV producido por la célula.