MX2007011697A - Biomarcadores para eficacia de aliskiren como agente hipertensivo. - Google Patents

Abstract

Se realizo un analisis farmacogenetico retrospectivo en un intento por evaluar la asociacion potencial entre la variacion genetica y el resultado de un aprueba clinica de eficacia de aliskiren como agente antihipertensivo. Se examinaron cuarenta y ocho polimorfismos en doce genes derivados del sistema de renina-angiotensina-aldosterona (RAS) o implicitos con anterioridad en la regulacion de la presion arterial. Se observaron asociaciones significativas entre un polimorfismo en el gen de la enzima conversiva de angiotensina (ACE), dos polimorfismos en el gen receptor de angiotensina II tipo 2 (AGTR2), y los parametros clinicos de la disminucion de la presion arterial diastolica y sistolica promedio en sedestacion. Estos efectos no se encontraron con el tratamiento de irbesartan y placebo, sino mas bien fueron especificos al tratamiento de aliskiren.

Description

"BIOMARCADORES PARA EFICACIA DE ALISKIREN COMO AGENTE HIPERTENSIVO" Campo de la invención Esta invención se refiere en términos generales a las pruebas analíticas de muestras de tejido in vitro, y más particularmente a aspectos de polimorfismos genéticos indicativos de la eficacia de aliskiren como agente anti-hipertensivo.

Discusión de antecedentes El sistema de renina-angiotensina (RAS - renin angiotensin system) desempeña un papel importante en la regulación de la presión arterial y la homeóstasis de volumen. La renina es segregada por el riñon en respuesta a una disminución del volumen circulatorio y la presión arterial , y segmenta el substrato angiotensinógeno para formar el decapéptido inactivo angiotensina I (Ang I ). El Ang I se convierte en el octapéptido activo Ang I I por la enzima conversiva de angiotensina (ACE - angiotensin converting enzyme). El Ang I I interactúa con los receptores celulares que inducen la vasoconstricción y liberación de catecolaminas derivadas de la médula adrenal y de las terminaciones nerviosas de la unión. Mejora también la secreción de aldosterona y la reabsorción de sodio. Además, el Ang I I inhibe la liberación de renina , proporcionándole así una retroalimentación negativa al sistema. Convenientemente, el Angl l actúa en diversos niveles (por ejemplo, vasculatura, sistema nervioso simpático, corteza y médula de la glándula adrenal) a fin de incrementar la resistencia vascular y la presión arterial. El sistema de renina angiotensina (RAS) puede bloquearse en diversos niveles. Dado que los inhibidores de renina bloquean el RAS en un nivel superior que el de los inhibidores de ACE y los antagonistas de Ang I I , tienen un efecto diferente sobre los componentes del RAS. Después de la administración de un inhibidor de renina, se bloquea tanto la formación de Ang I como de Ang I I . Mientras que después de la inhibición de ACE, solamente se bloquea la formación de Ang I I y se incrementan los niveles de Ang I . Consecuentemente, el Ang I aún se encuentra disponible para convertirse en Ang I I y otros péptidos de angiotensina por otras trayectorias tales como el sistema de quimasa . El aliskiren (SPP1 00) es un agente antihipertensivo sin péptidos con un peso molecular bajo (609.8). Ver, Wood J M et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 308(4):698-705 (5 de Septiembre de 2003). El mecanismo de acción es diferente de oros antihipertensivos en el mercado. El aliskiren bloquea el sistema de renina angiotensina (RAS) en su primer paso de limitación de tasa. In vitro, el aliskiren es un potente inhibidor de la renina humana (IC50 = 0.6 nM). In vivo, el aliskiren administrado tanto oralmente (p.o. ) como intravenosamente (i.v. ) en diversos estudios con titíes con sodio reducido ocasionó la inhibición total de la actividad de plasma renina (PRA - plasma renin activity), reducciones prolongadas en la presión arterial media (MAP), e incrementos significativos en las concentraciones de plasma de la renina activa y total. En seres humanos, las concentraciones de plasma de aliskiren se incrementan rápidamente después de la administración alcanzando niveles pico en 3-5 horas. Tanto la Cmáx como la ABC se incrementan con la dosis, pero de manera no lineal. La vida media del aliskiren es de aproximadamente 25 horas y su biodisponibilidad es de aproximadamente 2.7% . Los planteamientos médicos convencionales al diagnóstico y tratamiento de la enfermedad se basan en datos cl ínicos solos o realizados en conjunto con una prueba de diagnóstico. Tales prácticas tradicionales llevan frecuentemente a elecciones terapéuticas que no son óptimas para la eficacia de la terapia del medicamento prescrito o para minimizar la probabilidad de efectos secundarios en un paciente. El diagnóstico específico a la terapia (también conocido como, tratanóstico) es un campo emergente de la tecnolog ía médica, el cual proporciona pruebas útiles para diagnosticar una enfermedad , seleccionar el régimen de tratamiento correcto y monitorear la respuesta de un paciente. Es decir, los tratanósticos son útiles para pronosticar y evaluar la respuesta al medicamento en pacientes individuales, es decir, medicina individualizada. Las pruebas teranósticas también son útiles para seleccionar pacientes para tratamientos que son particularmente propensos a beneficiarse del tratamiento o para proporcionar una indicación inicial y objetiva de eficacia de tratamiento en pacientes, de manera que el tratamiento puede alterarse con un retraso m ínimo. El progreso en la farmacogenética, la cual establece las correlaciones entre las respuestas a medicamentos específicos y el perfil genético de los pacientes, es elemental para el desarrollo de nuevos planteamientos tratanósticos. Por ende, existe necesidad en la materia de una evaluación de las variaciones de paciente a paciente en la secuencia genética y la expresión genética. Una forma común de realizar perfiles genéticos yace en la identificación de variaciones de secuencias de ADN llamadas polimorfismos de nucleótido individual ("SNPs - single nucleotide polymorphisms), los cuales son un tipo de mutación genética que lleva a variaciones de paciente a paciente en respuestas al medicamento del paciente. Se entiende que existe una necesidad en la materia de identificar y caracterizar mutaciones genéticas, tales como SNPs, los cuales son mutaciones genéticas que llevan a identificar los genotipos de pacientes asociados con la capacidad de respuesta al medicamento.

Breve descripción de la invención La presente invención proporciona una respuesta a la necesidad en la materia. Se identifican asociaciones significativas entre polimorfismos en el gen de la enzima conversiva de angiotensina (ACE), los polimorfismos en el gen receptor de angiotensina I I tipo 2 (AGTR2) y los parámetros clínicos de la disminución de la presión arterial diastólica y sistólica promedio en sedentación después del tratamiento con aliskiren como agente antihipertensivo. Estos efectos no se presentan con el tratamiento de irbesartan y placebo, sino que más bien son específicos al tratamiento de aliskiren. Convenientemente, la invención se proporciona para el uso de aliskiren en la elaboración de un medicamento para el tratamiento de hipertensión en una población de pacientes seleccionados. La población de pacientes a tratarse se selecciona con base en los polimorfismos genéticos en genes biomarcadores presentes en los pacientes. Los genes biomarcadores son el gen de la enzima conversiva de angiotensina (ACE) y el gen receptor de angiotensina I I tipo 2 (AGTR2). Los polimorfismos genéticos son indicativos de la eficacia de aliskiren para tratar la hipertensión. La invención proporciona también un método de diagnóstico para determinar la capacidad de respuesta de un paciente con hipertensión al tratamiento con aliskiren, con base en la identidad de un par de nucleótidos en uno o más lugares genéticos polimórficos de la invención. La invención proporciona además un método tratanóstico para tratar la hipertensión en una paciente. Un agente hipertensivo se le administra al paciente si el par de nucleótidos en los lugares genéticos polimórficos de la invención indican que el paciente es sensible al tratamiento con un agente antihipertensivo. En una modalidad , el agente antihipertensivo es aliskiren. Se le administra una terapia alternativa al paciente si el par de nucleótidos en los lugares genéticos polimórficos de la invención indican que el paciente no es sensible al tratamiento con un agente antihipertensivo. La invención proporciona generalmente un método para reducir la presión arterial diastólica ambulatoria diurna (DADBP -daytime ambulatory diastolic blood pressure). En una modalidad específica, la invención proporciona un método tratanóstico para reducir la presión arterial diastólica promedio de sedentación (MSDBP - mean sitting diastolic blood pressure). Además, la invención proporciona un método para reducir la presión arterial sistólica ambulatoria diurna (DASBP - daytime ambulatory systolic blood pressure). En una modalidad específica, la invención proporciona un método tratanóstico para reducir la presión arterial sistólica promedio de sedentación (MSSBP - mean sitting systolic blood pressure). Además, la invención proporciona un método para seleccionar pacientes para la inclusión en una prueba cl ínica para determinar la eficacia de un agente antihipertensivo para el tratamiento de la hipertensión. Un paciente puede incluirse en la prueba si el genotipo del paciente es indicativo de la eficacia del agente antihipertensivo para tratar la hipertensión en ese paciente. El paciente puede retirarse de la inclusión en la prueba si el genotipo del paciente no es indicativo de la eficacia del agente antihipertensivo para tratar la hipertensión en ese paciente. La invención proporciona equipos para la práctica de los métodos de la invención. La ¡nvención proporciona también un modo de utilización del producto de gen de la enzima conversiva de angiotensina (ACE) y el producto del gen receptor de la angiotensina I I tipo 2 (AGTR2) como destinatarios para el descubrimiento del medicamento.

Breve descripción de los dibujos La Figura 1 es un conjunto de gráficas de barra que muestran la tasa de respondedor segregada por los genotipos SNP_4769 para los tres grupos tratados con aliskiren conjuntamente, el grupo de aliskiren de dosis más grande (600 mg), el grupo irbesartan y el grupo placebo. En las hileras en la parte inferior de la figura, la hilera superior se refiere al alelo de CT y la hilera inferior se refiere al alelo de TT.

Descripción detallada de la modalidad preferida Se realizó un análisis farmacogenético retrospectivo en un intento por evaluar la asociación potencial entre la variación genética y el resultado cl ínico en una prueba cl ínica. En la prueba cl ínica, el aliskiren en 75, 1 50, o 300 mg administrado una vez al d ía mostró ser un agente antihipertensivo efectivo en pacientes hipertensivos leve a moderado que dan como resultado en una reducción estadísticamente significativa en la presión arterial sistólica ambulatoria diurna (DASBP). Todas las dosis del tratamiento activo fueron estad ísticamente superiores al placebo para reducir la presión arterial diastólica promedio de sedentación (MSDBP) al término de la prueba clínica y en la población destinada al tratamiento ( ITT - intend-to treat) en la semana 8, y en la población por protocolo al término de la prueba cl ínica. Se lograron reducciones similares de la MSDBP con 1 50 mg de aliskiren y 1 50 mg de irbesartan. Ver el Ejemplo I mostrado a continuación. Para la presión arterial sistólica promedio de sedentación (MSSBP), todas las dosis de tratamiento activo fueron estadísticamente superiores al placebo al término de la prueba clínica. El Aliskiren 300 y 600 fueron estadísticamente superiores a placebo e irbesartan al término de la prueba clínica. Se lograron reducciones similares de la MSSBP con aliskiren de 150 mg e irbesartan de 300 mg. El aliskiren 300 y 600 mg produjeron las reducciones más grandes. Ver el Ejemplo I , mostrado a continuación. En el análisis farmacogenético, se examinaron cuarenta y ocho polimorfismos en doce genes derivados del sistema de renina-angiotensina-aldosterona (RAS) o involucrada anteriormente en la regulación de la presión arterial. Se observaron asociaciones significativas entre un polimorfismo en el gen de la enzima conversiva de angiotensina (ACE) (SNP_1 445, NO DE ID DE SEC: 1 ), dos polimorfismos en el gen receptor de angiotensina I I de tipo 2 (AGTR2) (SNP_1445, NO DE ID DE SEC:2 y SNP_4795, NO DE ID DE SEC: 3), y los parámetros clínicos de la disminución de la presión arterial diastólica y sistólica promedio en sedentación. Estos efectos no se encontraron con el tratamiento con el tratamiento de irbesartan y placebo, más bien fueron específicos al tratamiento de aliskiren en este análisis. La secuencia de nucleótidos de SNP_4769 (NO DE I D DE SEC: 1 ) es la siguiente: AGGACTTCCC AGCCTCCTCT TCC GCTGCT CTGCTACGGG CACCCTCTGC TGGTCCCCAG CCAGGAGGCA/Y CCCAACAGGT GACAGTCACC CATGGGACAA GCAGCCAGGC AACAACCAGC AGCCAGACAA CCACCCACCA El SNP_4769 es un SNP de codificación que cambia la secuencia de aminoácidos de prolina a serina en el codón 32 en la enzima de ACE. La secuencia de nucleótidos del SNP_1445 (NO DE ID DE SEC: 2) es la siguiente: TGGAAACTTC ATTTTTTTTG TTTGAGATTT ATTTGAATGA GCTGTTATGA TTGGAGACAG TGAGAATTTC AGATTAATGT TTTGCAGACA AAAAAAAACC TCTCTGGAAA GCTGGCAAGG GTTCATAAGT CAGCCCTAGA ATTATGT&GG TTGAAGGCTC CCAGTGGACA GACCAAACAT ATAAGAAGGA AACCAGAGAT CTGGTGCTAT TACGTCCCAG CGTCTGAGAG AACGAGTAAG CACAGAATTC AAAGCATTCT GCAGCCTGAA TTTTGAAGGT AAGTATGAAC AATTTATATA TAATTTACTT GGAAAGTAGA ACATACATTA AATGAAAATA TTTTTTATGG ATGAACTTCT GTTTTTCCTG TGTTTTAACA CTGTATTTTG CAAAACTCCT/R AATTATTTAG CTGCTGTTTC TCTTACAGGA GTGTGTTTAG GCACTAAGCA AGCTGATTTA TGATAACTGC TTTAAACTTC AACAACCAGT AAGTCTTCAA GTGGAATTTA TTATTGATTC TTTTATGTTA ATTTGTTAGG TCAAAAGAAA AATCTTTAGA GCAAAATAAA AGTTTTGCTC TTTATTAGGA GGTTCTTTAG ATATTACACT TTTAATTGGG TAGCTTATTT GCATGTATTT TGAAACTATC TAAAGTAAAT AGTGTTTCCT TTGTATGCTT ATCTTTAGCT AATGTGTTTT TTTTTTTGGT TTTAAAATAA TGCTTCTAGT GAAAAAAATC ACAAAAACCT CAACACTGTA ACGTTTGAGA GCAACGGCTA TTCAGTTCGG TTAAACCGAA El SNP_1 445 es una región no traducida del ARNm de AGTR2 (ver la Tabla 2B).

La secuencia de nucleótidos de SNP_4795 (NO DE I D DE SEC: 3) es la siguiente: ccaacacaaa agcacagcag ttgagaactg ggaaagcatc gcactacaac tgctactgcc attaaccaca ttgtcctgga tgcccaagag cttaagagcc cacttaccta cctggtacac tgctactaca actgacatct gagaaagcca cccaaaggaa caagaatttc cctgtctgga accaacagaa ttgtcactat/& ttctgtacca gatcccaagg atacacatgc ttagcttact attactacca ctgaaacttg caaaagaacc catcaagcat tccattcccc agcacaaatt catcagtttc tatcaataac ctcacaatgc cacacagagg aatagacaga tactactaag gctgtttata gccaatgaaa tcatacacag tcttcacca El SNP_4795 se encuentra en la región genómica de AGTR2 (ver la Tabla 2B). Debe observarse que algunos aspectos, modos, modalidades, variaciones y características de la invención se describen a continuación en diversos niveles de detalle con objeto de proporcionar una comprensión sustancial de la invención. En general, tal descripción proporciona nuevos usos de variaciones de polinucleótidos, los SNPs, útiles en el diagnóstico y tratamiento de pacientes en necesidad del mismo. De acuerdo con lo anterior, los diversos aspectos de la presente invención se refieren a polinucleótidos que codifican las variaciones de polinucleótidos en la invención en los genes ACE y AGTR2. Los diversos aspectos de la presente invención se refieren también a los métodos diagnósticos/tratanósticos y equipos que utilizan las variaciones de polinucleótidos de la invención para identificar a los pacientes predispuestos a la enfermedad o para clasificar a las personas con relación a su capacidad de respuesta al medicamento, efectos secundarios, o dosis óptima de medicamento. En otros aspectos, la invención proporciona métodos para la validación de compuestos y un sistema de computadoras para almacenar y analizar los datos relacionados con las variaciones de polinucleótidos de la invención. De acuerdo con lo anterior, se muestran diversas modalidades particulares que ilustran estos aspectos. Definiciones. A continuación se proporcionan las definiciones de algunos términos utilizados en esta especificación. Pueden encontrarse definiciones de otros términos en el glosario proporcionado por el Departamento de Energ ía de EUA, Oficina de Ciencias, Proyecto Genoma Humano <http://www.orn l.gov/sci/techresources/H uman Genome/glossary/>. Chobanian er al. proporcionan una definición médica, "JNC-7 - Complete Versión" Hypertension 42: 1 206-1252 (2003). La definición de la Asociación Estadounidense para el Corazón de hipertensión puede encontrarse en el sitio web <http://www.american heart.org/presenter. ¡ html?identifier=4623>. Todas estas referencias se incorporan en la presente para referencia. Como se utiliza en la presente, el término "alelo" se refiere a una forma particular de un gen o secuencia de ADN en una posición cromosómica específica (locus). Como se utiliza en la presente, el término "anticuerpo" incluye, pero no se limita a , anticuerpos policlonales, anticuerpos monoclonales, anticuerpos humanizados o quiméricos y fragmentos de anticuerpos biológicamente funcionales suficientes para unir el fragmento del anticuerpo a la proteína. Como se utiliza en la presente, el término "respuesta cl ínica" se refiere a cualquier o a todo lo siguiente: una medición cuantitiva de la respuesta, no respuesta, y respuesta adversa (es decir, efectos secundarios). Como se utiliza en la presente, el término "prueba cl ínica" se refiere a cualquier estudio de investigación diseñado para recoger datos cl ínicos sobre las respuestas a un tratamiento particular, e incluye pero no se limita a las pruebas clínicas de la fase I , fase I I y fase l l l . Se utilizan métodos convencionales para definir la población de pacientes e inscribir a los pacientes. Como se utiliza en la presente, el término "cantidad efectiva" de un compuesto es una cantidad suficiente para alcanzar un efecto terapéutico y/o profiláctico deseado, por ejemplo, una cantidad que da como resultado la prevención de o una disminución en los síntomas asociados con la hipertensión. En una modalidad preferida, el compuesto es aliskiren . La cantidad de compuesto administrado al paciente dependerá del tipo y severidad de la enfermedad y de las características de la persona, tal como salud general , edad, sexo, peso corporal y tolerancia a los medicamentos. También dependerá del grado, severidad y tipo de enfermedad . El experto en la materia será capaz de determinar la dosificación apropiada dependiendo de estos y otros factores. Típicamente, una cantidad efectiva de los compuestos de la presente invención, suficiente para alcanzar un efecto terapéutico o profiláctico, oscilan desde aproximadamente 0.000001 mg por kilogramo de peso corporal al d ía hasta aproximadamente 10,000 mg por kilogramo de peso corporal al d ía. Preferentemente, los rangos de dosis van desde aproximadamente 0.0001 mg por kilogramo de peso corporal al día hasta aproximadamente 100 mg por kilogramo de peso corporal al día. Los compuestos de la presente invención también pueden administrarse en combinación uno con otro, o con uno o más compuestos terapéuticos adicionales. En una modalidad preferida, la cantidad efectiva es aliskiren a 75, 1 50, o 300 mg administrado una vez al d ía. Como se utiliza en la presente, "expresión" incluye pero no se limita a uno o más de los siguientes: transcripción del gen en ARNm precursor; segmentación y otro procesamiento del ARNm precursor para producir el ARNm maduro; estabilidad de ARNm; traducción del ARNm maduro en proteína (incluyendo el uso de codón y disponibilidad de ARNt); y glucosilación y/u otras modificaciones del producto de traducción , si se requiere para la expresión y función apropiadas. Como se utiliza en la presente, el término "gen" se refiere a un segmento de ADN que contiene toda la información para la biosíntesis regulada de un producto de ARN, incluyendo activadores, exones, intrones, y otras regiones no traducidas que controlan la expresión. Como se utiliza en la presente, el término "genotipo" se refiere a una secuencia de 5' a 3' de pares de nucleótidos encontrados en uno o más sitios polimórficos en una posición en un par de cromosomas homólogos en una persona. Como se utiliza en la presente, el genotipo incluye un genotipo completo y/o un sub-genotipo. Como se utiliza en la presente, el término "posición" se refiere a una posición en un cromosoma o molécula de ADN correspondiente a un gen o una característica física o fenotípica. Como se utiliza en la presente, el término "agente modulador de ACE" o "agente de modulación de AGTR2" es cualquier compuesto que altera (por ejemplo, incrementa o disminuye) el nivel de expresión o nivel de actividad biológica del polipétido ACE o del polipéptido AGTR2, respectivamente, en comparación con el nivel de expresión o nivel de actividad biológica de polipéptidos en ausencia del agente modulador. El agente modulador puede ser una molécula pequeña, polipéptido, carbohidrato, l ípido, nucleótido, o combinación de los mismos. El agente modulador puede ser un compuesto orgánico o un compuesto inorgánico. Como se utiliza en la presente, el término "mutante" se refiere a cualquier variación heredera del tipo silvestre que es resultado de una mutación, por ejemplo, polimorfismo de nucleótido individual. El término "mutante" se utiliza intercambiablemente con los términos "marcador", "biomarcador" y "destinatario" a lo largo de la especificación . Como se utiliza en la presente, el término "condición médica" incluye, pero no se limita a, alguna condición o enfermedad manifestada como una o más síntomas físicos y/o fisiológicos para los cuales es deseable el tratamiento, e incluye enfermedades identificadas anterior y recientemente y otros padecimientos. En una modalidad preferida, la condición médica es hipertensión . Como se utiliza en la presente, el término "par de nucleótidos" se refiere a los nucleótidos encontrados en un sitio polimórfico en dos copias de un cromosoma proveniente de una persona. Como se utiliza en la presente, el término "sitio polimórfico" se refiere a una posición en un lugar en el que se encuentran al menos dos secuencias alternas en una población, la más frecuente de las cuales tiene una frecuencia no mayor al 99% . Como se utiliza en la presente, el término "polimorfismo" se refiere a cualquier variante de secuencias presente en una frecuencia >1 % en una población. La variante de secuencias puede estar presente en una frecuencia significativamente mayor que 1 % tal como 5% o 1 0% o más. También, el término puede utilizarse para referirse a la variación de secuencia observada en una persona en un sitio polimórfico. Los polimorfismos incluyen sustituciones de nucleótidos, inserciones, eliminaciones y microsatélites y puede dar como resultado, pero no requiere, diferencias detectables en la expresión genética o en la función de la proteína. Como se utiliza en la presente, el término "polinucleótido" se refiere a cualquier ARN o ADN, el cual puede ser ARN o ADN modificado o no modificado. Los polinucleótidos incluyen, sin limitantes, ADN monocatenario y bicatenario, ADN que sea una mezcla de regiones monocatenarias y bicatenarias, ARN monocatenario y bicatenaria, ARN que sea mezcla de regiones monocatenarias y bicatenarias, y moléculas h íbridas que comprenden ADN y ARN que pueden ser monocatenarias o, más típicamente, bicatenarias o una mezcla de regiones monocatenarias o bicatenarias. Además, el polinucleótido se refiere a regiones tricatenarias que comprenden ARN o ADN o tanto ARN como ADN. El término polinucleótido incluye también ADNs o ARNs que contienen una o más bases modificadas y ADNs o ARNs con estructurales principales modificadas para lograr estabilidad o por otras razones. Como se utiliza en la presente, el término "polipéptido" se refiere a cualquier polipéptido que comprende dos o más aminoácidos unidos uno al otro por enlaces de péptidos o enlaces de péptidos modificados, es decir, isoésteres de péptidos. El polipéptido se refiere tanto a cadenas cortas, comúnmente referidas como péptidos, glucopéptidos u oligómeros, como a cadenas más largas, generalmente referidas como proteínas. Los polipéptidos pueden contener aminoácidos diferentes a los aminoácidos codificados con 20 genes. Los polipéptidos incluyen secuencias de aminoácidos modificados sea por procesos naturales, tales como procesamiento de post-traducción, o por técnicas de modificación qu ímica que son conocidas en la materia . Tales modificaciones son descritas en textos básicos y en monografías más detalladas, así como también en una literatura de investigación voluminosa. Como se utiliza en la presente, el término "ácido nucleico de SNP" se refiere a una secuencia de ácidos nucleicos, la cual comprende un nucleótido que sea variable dentro de una secuencia de nucleótidos de otra manera idéntica entre personas o grupos de personas, que existen consecuentemente como alelos. Tales ácidos nucleicos de SNP tienen un largo preferentemente desde aproximadamente 1 5 hasta aproximadamente 500 nucleótidos. Los ácidos nucleicos de SNP pueden ser parte de un cromosoma, o pueden ser una copia fiel de cierta parte de un cromosoma , por ejemplo, por la amplificación de tal parte de un cromosoma a través de PCR o a través de la clonación. Los ácidos nucleicos de SNP son referidos en la presente simplemente como "SNPs". Un SNP es la ocurrencia de la variabilidad del nucleótido en una posición individual en el genoma, en el cual ocurren dos bases alternativas con una frecuencia considerable (es decir, > 1 %) en la población humana. Un SNP puede ocurrir dentro de un gen o en a regiones intergénicas del genoma. Las sondas de SNP de acuerdo con la invención son oligonucleótidos complementarios a un ácido nucleico de SNP. Como se utiliza en la presente, el término "paciente" se refiere preferentemente a que el paciente es un mam ífero, tal como un ser humano, pero puede ser también un animal, por ejemplo, animales domésticos (por ejemplo, perros, gatos y lo similar), animales de granja (por ejemplo, vacas, ovejas, cerdos, caballos y lo similar) y animales de laboratorio (por ejemplo, mono de Java, mono, ratas, ratones, conejillos de Ind ias y lo similar). Como se utiliza en la presente, la administración de un agente o medicamento a un paciente incluye la auto-administración y la administración por otros. También debe observarse que los diversos modos de tratamiento o prevención de condiciones médicas descritas pretenden referirse a "sustanciales", lo que ¡ncluye un tratamiento o prevención total pero también menor a total, y donde se logra un resultado biológicamente o médicamente relevante. Identificación y caracterización de la variación de la secuencia genética. Debido a su naturaleza dominante y difundida, los SNPs tienen el potencial de ser herramientas importantes para ubicar genes que se encuentran incluidos con los padecimientos de enfermedades humanas. Ver, por ejemplo, Wang et al. , Science (Ciencia) 280: 1077-1082 (1998). Cada vez es más evidente que el riesgo de desarrollar muchos padecimientos comunes y el metabolismo de los medicamentos utilizados para tratar estos padecimientos es influido substancialmente por variaciones genómicas subyacentes, aunque los efectos de cualquier variante pudiesen ser ligeros. Se dice que un SNP es "alélico" debido a la existencia del polimorfismo, algunos miembros de una especie pueden tener una secuencia no mutada (es decir, el alelo original) mientras que otro miembros pueden tener una especie mutada (es decir, la variante o alelo mutante). Una asociación entre un SNP y un fenotipo particular no necesariamente indica o requiere que el SNP sea causante del fenotipo. Más bien, la asociación puede ser básicamente debido a la proximidad del genoma entre un SNP y aquellos factores genéticos actualmente responsables de un determinado fenotipo, de manera tal que el SNP y los factores genéticos se encuentran estrechamente vinculados. Es decir, un SNP puede ser un desequilibrio de enlace ("LD" - linkage disequilibirum) con la "verdadera" variante funcional. El LD (alias, asociación alélica) existe cuando los alelos en dos posiciones distintas del genoma se encuentran más altamente asociadas que lo esperado. Consecuentemente, un SNP puede servir como un marcador que tiene valor en virtud de su proximidad a una mutación que ocasiona un fenotipo particular. Al describir los sitios polimórficos de la invención, se hace referencia a la cadena codificante del gen por conveniencia. Sin embargo, como reconocerá el experto en la materia, las moléculas de ácido nucleico que contienen el gen pueden ser moléculas bicatenarias complementarias y consecuentemente la referencia a un sitio en particular en la cadena codificante se refiere también al sitio correspondiente en la cadena no codificante complementaria . Es decir, puede hacerse referencia al mismo sitio polimórfico en cualquier cadena y puede diseñarse un oligonucleótido para hibridar específicamente a cualquier cadena en una región destinataria que contiene al sitio polimórfico. Consecuentemente, la invención también incluye polinucleótidos monocatenarios que son complementarios a la cadena codificante de las variantes genómicas descritas en la presente. Identificación y caracterización de SNPs. Pueden utilizarse muchas técnicas para identificar y caracterizar SNPs, incluyendo el análisis de polimorfismo de conformación monocatenaria (SSCP -single-strand conformation polymorphism), análisis heterodúplex por cromatografía l íquida de alto rendimiento desnaturalizada (DHPLC -denaturing high-performance liquid chromatography) y métodos directos de secuenciación y cálculos de ADN . Shi er al., Clin. Chem. 47: 164-1 72 (2001 ). Existe una riqueza de información de secuencias en bases de datos públicas. Los métodos de tipificación de SNP más comunes incluyen actualmente la hibridación, extensión de imprimador y métodos de segmentación. Cada uno de estos métodos debe conectarse a un sistema de detección apropiado. Las tecnolog ías de detección incluyen polarización fluorescente (Chan et al., Genome Res. 9:492-299 ( 1 999)), detección luminométrica de liberación de pirofosfatos (pirosecuenciación) (Ahmadiian ef al., Anal. Biochem. 280: 103-10 (2000)), pruebas de segmentación basadas en transferencia de energ ía de resonancia de fluorescencia (FRET - fluorescente resonance energy transfer), DHPLC, y espectrometría de masa (Shi, Clin. Chem., 47: 164-1 72 (2001 ); Patente de E. U . No. 6,300,076 B1 ). Otros métodos para detectar y caracterizar los SNPs son los descritos en las Patentes de E. U . Nos. 6,297,018 y 6,300,063. También pueden detectarse polimorfismos utilizando productos comercialmente disponibles, tales como la tecnolog ía I NVADER™ (disponible por Third Wave Technologies Inc. Madison, Wisconsin, EUA). En esta prueba, un oligonucleótido "invasor" corriente arriba específico y una sonda corriente abajo sobrepuesta parcialmente forman una estructura específica cuando se une a la plantilla de ADN complementario. Esta estructura se reconoce y se corta en un sitio específico por la enzima Segmentasa, dando como resultado la liberación de la solapa 5' del oligonucleótido de sonda. Este fragmento sirve después como el oligonucleótido "invasor" con respecto a los destinatarios secundarios sintéticos y sondas de señal secundarias etiquetadas fluorescentemente contenidas en la mezcla de reacción. Ver también, Ryan D et al. , Molecular Diagnosis 4(2): 1 35- 144 ( 1 999) y Lyamichev V ef al. , Nature Biotechnology 1 7: 292-296 ( 1 999), ver también las Patentes de E. U . Nos. 5,846, 717 y 6,001 ,567. La identificación de polimorfismos también puede determinarse utilizando una técnica de detección de incompatibilidad que incluye, pero que no se limita, al método de protección de Rnasa utilizando ribosondas (Winter et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 82:7575 ( 1985); Meyers ef al. , Science 230: 1 242 ( 1985)) y proteínas que reconocen incompatibilidades de nucleótidos, tales como la proteína mutS de E. coli (Modrich P, Ann Rev Genet 25:229-253 ( 1 991 )). Alternativamente, los alelos de variante pueden identificarse por análisis de polimorfismo de conformación monocatenaria (SSCP) (Orita ef al. , Genomics 5:874-879 ( 1989); Humphries ef al., en Molecular Diagnosis of Genetic Diseases (Diagnóstico Molecular de Enfermedades Genéticas), Elles R. , ed . , págs. 321 -340 ( 1 996)) o electroforesis de gel gradiente de desnaturalización (DGGE - denaturing gradient gel electrophoresis) (Wartell eí al., Nucí. Acids. Res. 18:2699-2706 ( 1990); Sheffield ef al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 86:232-236 ( 1 989)). También puede utilizarse un método de extensión de imprimador mediado por polimerasa para identificar los polimorfismos. Se han descrito varios métodos en la patente y en la literatura científica e incluyen el método de "Análisis de Bit Genético" (WO 92/1 5712) y el análisis de bit genético mediado por ligasa/polimerasa (Patente de E. U . No. 5,679,524). Se describen los métodos relacionados en WO 91 /02087, WO 90/09455, WO 95/17676, y las Patentes de E. U . Nos. 5,302,509 y 5,945,283. Los imprimadores extendidos que contienen un polimorfismo pueden detectarse por espectrometría de masa como se describe en la Patente de E. U. No. 5,605,798. Otro método de extensión de imprimador es PCR de alelo específico (Ruafio ef al., Nucí. Acids Res. 17: 8392 ( 1 989); Ruafio ef al. , Nucí. Acids. Res. 1 9:6877-6882 ( 1991 ); WO 93/22456; Turku ef al., J. CIin. Invest. 95: 1635-1641 ( 1995)). Además, pueden investigarse múltiples sitios polimórficos al amplificar simultáneamente múltiples regiones del ácido nucleico utilizando conjuntos de imprimadores de alelo específico como los descritos en la solicitud de patente PCT publicada WO 89/10414. Oligonucleótidos de haplotipificación y genotipificación. La invención proporciona métodos y composiciones para haplotipificar y genotipificar el gen en una persona. Como se utiliza en la presente, los términos "genotipo" y "haplotipo" se refieren al genotipo o haplotipo que contiene el nucleótido o par de nucleótidos, respectivamente, que se encuentran presentes en uno o más sitios polimórficos novedosos descritos en la presente y pueden opcionalmente incluir también el nucleótido o par de nucleótidos presentes en uno o más sitios polimórficos adicionales en ese gen. Los sitios polimórficos adicionales pueden ser sitios polimórficos actualmente conocidos o sitios que se descubran subsecuentemente. Las composiciones de la invención contienen sondas e imprimadores oligonucleótidos para hibridar específicamente a una o más regiones destinatarias que contienen, o que se encuentran adyacentes a, un sitio polimórfico. Las composiciones oligonucleótidas de la invención son útiles en métodos para genotipificar y/o haplotipificar un gen en una persona. Los métodos y composiciones para establecer el genotipo y haplotipo de una persona en los sitios polimórficos novedosos descritos en la presente son útiles para estudiar el efecto de los polimorfismos en la etiolog ía de enfermedades afectadas por la expresión y función de la proteína, estudiar la eficacia de los medicamentos que seleccionan como destinatario, pronosticar la susceptibilidad individual a las enfermedades afectadas por la expresión y función de la proteína y pronosticar la capacidad de respuesta de la persona a los medicamentos que seleccionan como destinatario el producto genético. Los oligonucleótidos de genotipificación de la invención puede inmovilizarse sobre o sintetizarse sobre una superficie sólida tal como un microchip, cuenta, o portaobjeto. Ver, por ejemplo, WO 98/20020 y WO 98/2001 9. Los oligonucleótidos de genotipificación pueden hibridar una región destinataria ubicada uno o varios nucleótidos corriente debajo de uno de los sitios polimórficos identificados en la presente. Tales oligonucleótidos son útiles en los métodos de extensión de imprimadores mediados por polimerasa para detectar uno de los polimorfismos novedosos descritos en la presente y por lo tanto tales oligonucleótidos de genotipificación son referidos en la presente como "oligonucleótidos de extensión de imprimadores". Método de genotipificación directa de la invención. Un método de genotipificación de la invención puede involucrar el aislamiento de una persona de una mezcla de ácido nucleico que comprende dos copias de un gen de interés o fragmento de la misma, y determinar la identidad del par de nucleótidos en uno o más sitios polimórficos en las dos copias. Como comprenderá fácilmente el experto en la materia, las dos "copias" de un gen en una persona pueden ser el mismo alelo o pueden ser alelos diferentes. En una modalidad particularmente preferida, el método de genotipificación comprende determinar la identidad del par de nucleótidos en cada sitio polimórfico. Típicamente, la mezcla de ácido nucleico se aisla de una muestra biológica tomada de la persona, tal como una muestra sangu ínea o muestra de tejido. Las muestras de tejido adecuadas incluyen sangre, semen, saliva, lágrimas, orina, materia fecal, sudor, estudios citológicos bucales, piel y cabello. En el ejemplo mostrado a continuación, se generaron los conjuntos de sondas de polimorfismo de nucleótido individual (SNP) para la prueba de genotipificación para la plataforma Assays-by-Design® de ABI . Livak KJ , Marmaro J & Todd JA, Nature Genetics 9: 341 -2 ( 1 995). La genotipificación se realizó en 10 ng de ADN genómico de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Método de haplotipificación directa de la invención. Un método de haplotipificación de la invención puede incluir el aislamiento de una persona en una molécula de ácido nucleico que contiene solamente una de las dos copias de un gen de interés, o un fragmento del mismo, y determinar la identidad del nucleótido en uno o más de los sitios polimórficos en esa copia. Los métodos de haplotipificación directa incluyen , por ejemplo, la tecnolog ía CLASPER System ™ (Patente de E. U . No. 5,866,404) o PCR de rango largo de alelo específico (Michalots-Beloin ef al., Nucí. Acids. Res. 24:4841 -4843 ( 1 996)). El ácido nucleico puede aislarse utilizando cualquier método capaz de separar las dos copias del gen o fragmento. Como observarán aquellos expertos en la materia, cualquier clon de persona solo proporcionará información de haplotipo en una de las dos copias genéticas presentes en una persona. En una modalidad, se determina un par de haplotipos para una persona al identificar la secuencia por fases de nucleótidos en uno o más sitios polimórficos en cada copia del gen que se encuentra presente en la presente. En una modalidad preferida, el método de haplotipificación comprende identificar la secuencia por fases de nucleótidos en cada sitio polimórfico en cada copia del gen. Tanto en los métodos de genotipificación como de haplotipificación, la identidad de un nucleótido (o par de nucleótidos) en un sitio polimórfico puede determinarse al amplificar una región destinataria que contenga los sitios polimórficos directamente de una o ambas copias del gen, o fragmentos de los mismos, y secuenciar las regiones amplificadas por métodos convencionales. El genotipo o haplotipo para el gen de una persona también puede determinarse por la hibridación de una muestra nucleica que contenga una o ambas copias del gen a arreglos de ácido nucleico y subarreglos tales como los descritos en WO 95/1 1995. Método de genotipificación indirecta utilizando sitios polimórficos en el desequilibrio de acoplamiento con un polimorfismo destinatario. Además, la identidad del alelo presente en cualquiera de los sitios polimórficos novedosos de la invención puede determinarse indirectamente al genotipificar otros sitios polimórficos en el desequilibrio de acoplamiento con aquellos sitios de interés. Como se describió con anterioridad , se dice que dos sitios se encuentran en desequilibrio de acoplamiento si la presencia de una variante particular en un sitio es indicativa de la presencia de otra variante en un segundo sitio. Stevens JC, Mol. Diag. 4: 309-31 7 ( 1999). Los sitios polimórficos en desequilibrio de acoplamiento con los sitios polimórficos de la invención pueden ubicarse en regiones del mismo gen o en otras regiones genómicas. Amplificar una región genética destinataria. Las regiones destinatarias pueden amplificarse utilizando cualquier método de amplificación dirigida por oligonucleótidos, incluyendo pero sin lim itarse a la reacción de cadena de polimerasa (PCR). (Patente de E.U . No. 4,965, 188), reacción de cadena de ligasa (LCR - ligase chain reaction) (Barany eí al. Proc. Nati. Acad. Sci. USA 88: 189-1 93 ( 1991 ); la solicitud de patente PCT publicada WO 90/01069), y prueba de ligadura de oligonucléotidos (OLA - oligonucleotide ligation assay) (Landegren ef al., Science 241 : 1077-1080 ( 1988)). Los oligonucleótidos útiles como imprimadores o sondas en tales métodos deben hibridar específicamente a una región del ácido nucleico que contiene o se encuentra adyacente al sitio polimórfico. Típicamente, los oligonucleótidos se encuentran entre 1 0 y 35 nucleótidos de largo y preferentemente, entre 1 5 y 30 nucleótidos de largo. Muy preferentemente, los oligonucleótidos son 20 a 25 nucleótidos de largo. El largo exacto del oligonucleótido dependerá de muchos factores que se consideran rutinarios y que son llevados a la práctica por el experto en la materia. Pueden utilizarse otros procedimientos conocidos de amplificación de ácido nucleico para amplificar la región destinataria incluyendo los sistemas de amplificación basados en transcripción (Patente de E. U . No. 5, 1 30,238; EP 329,822; Patente de E. U . No. 5, 169,766, solicitud de patente PCT publicada WO 89/06700) y métodos isotérmicos (Walker et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 89:392-396 ( 1 992)). Hibridar oligonucleótido de alelo específico a un gen destinatario. Un polimorfismo en la región destinataria puede evaluarse antes o después de la amplificación utilizando uno de varios métodos basados en la hibridación conocidos en la materia. Típicamente, los oligonucleótidos de alelo específico se utilizan en el diseño de tales métodos. Los oligonucleótidos de alelo específico pueden utilizarse como pares de sondas etiquetadas diferentemente, mostrando un miembro del par una equivalencia perfecta con una variante de una secuencia destinataria y mostrando el otro miembro una equivalencia perfecta con una variante diferente. En algunas modalidades, puede detectarse más de un sitio polimórfico a la vez utilizando un conjunto de oligonucleótidos de alelo específico o pares de oligonucleótidos.

Preferentemente, los miembros del conjunto tienen temperaturas de fusión de 5°C, y más preferentemente de 2°C, cuando se hibridan en cada uno de los sitios polimórficos que se detectan. La hibridación de un oligonucleótido de alelo específico en un polinucleótido destinatario puede realizarse con ambas entidades en solución , o tal hibridación puede realizarse cuando el oligonucleótido o el polinucleótido objetivo se fija covalentemente o no covalentemente en un soporte sólido. El anexo puede mediarse, por ejemplo, por interacciones de anticuerpo-antígeno, poli-L-Lys, estreptavidina o avidina-biotina, puentes de sal, interacciones hidrofóbicas, enlaces qu ímicos, reticulación de UV, bicarbonato sódico, etc. El oligonucleótido de alelo específico puede sintetizarse directamente sobre el soporte sólido o anexarse al soporte sólido subsecuente a la síntesis. Los soportes sólidos adecuados para su uso en los métodos de detección de la invención incluyen substratos elaborados de silicio, vidrio, plástico, papel y lo similar, los cuales pueden formarse, por ejemplo, en cavidades (como en las placas de 96 cavidades), cortes, láminas, membranas, fibras, chips, platos y portaobjetos. El soporte sólido puede tratarse, cubrirse o derivarse para facilitar la inmovilización del oligonucleótido de alelo específico o el ácido nucleico destinatario. Determinar los genotipos y haplotipos de población y correlacionarlos con un atributo. La invención proporciona un método para determinar la frecuencia de un genotipo o haplotipo en una población. El método comprende determinar el genotipo o el haplotipo para un gen presente en cada miembro de la población, donde el genotipo o haplotipo comprende el nucleótido o par de nucleótidos detectados en uno o más de los sitios polimórficos en el gen, y calcular la frecuencia en la que el genotipo o haplotipo se encuentra en la población. La población puede ser una población de referencia, una población familiar, una población del mismo sexo, un grupo poblacional, o una población de atributos (por ejemplo, un grupo de personas que presentan un atributo de interés tal como una condición médica o respuesta a un tratamiento terapéutico). En otro aspecto de la invención, los datos de frecuencia para los genotipos y/o haplotipos encontrados en una población de referencia se utilizan en un método para identificar una asociación entre un atributo y un genotipo o haplotipo. El atributo puede ser cualquier fenotipo detectable, incluyendo pero sin limitarse a la susceptibilidad a una enfermedad o respuesta a un tratamiento. El método incluye obtener datos sobre la frecuencia de los genotipos o haplotipos de interés en una población de referencia y comparar los datos con la frecuencia de los genotipos o haplotipos en una población que presenta el atributo. Los datos de frecuencia para uno o ambos de las poblaciones de referencia y atributo pueden obtenerse al genotipificar o haplotipificar cada persona en las poblaciones que utilizan uno de los métodos descritos con anterioridad . Los haplotipos para la población de atributo pueden determinarse directamente o, alternativamente, por el planteamiento de genotipo pronóstico a haplotipo descrito con anterioridad . Los datos de frecuencia para las poblaciones de referencia y/o atributo se obtienen al acceder los datos de frecuencia determinados con anterioridad, los cuales pueden estar en forma escrita o electrónica. Por ejemplo, los datos de frecuencia pueden estar presentes en una base de datos q ue sea accesible por una computadora. Una vez que se obtienen los datos de frecuencia, se comparan las frecuencias de los genotipos o haplotipos de interés en las poblaciones de referencia y atributo. Cuando se analizan los polimorfismos, puede realizarse un cálculo para corregir una asociación significativa que pudiese encontrarse por oportunidad. Para métodos estadísticos útiles en los métodos de la invención, ver Statistical methods in Biology (Métodos estadísticos en Biología), 3a edición, Bailey NTJ , (Cambridge Univ. Press, 1 997); Waterman MS, Introduction to Computational Biology (Introducción a Biología Computacional) (CRC Press, 2000) y Bioinformatics (Bioinformática), editores Baxevanis AD & Ouellette BFF (John Wiley & Sons, Inc. , 2001 ). En otra modalidad , se examinan los datos de frecuencia de haplotipo para diferentes grupos para determinar si son consistentes con el equilibrio de Hardy-Weinberg. Hartl DL ef al., Principies of Population Genomics (Principios de Genómica Poblacional), 3a Ed. (Sinauer Associates, Sunderland , MA, 1997). En otra modalidad , el análisis estad ísitco se realiza por el uso de pruebas ANOVA convencionales con una corrección Bonferoni o un método de enlace que simule muchas veces la correlación genotipo fenotipo y calcula un valor de significatividad . ANOVA se utiliza para probar hipótesis acerca de si una variable de respuesta es ocasionada por o se correlaciona con uno o más atributos o variables que pueden medirse. Fisher LLD & vanBelle G, Biostatistics: A Methodology for the Health Sciences (Bioestadística: una metodología para las Ciencias de la Salud) (Wiley-lnterscience, Nueva York, 1993). Cap. 10. En una modalidad para pronosticar un par de haplotipos, el análisis incluye un paso de asignación, como se explica de la siguiente manera. Primeramente, cada uno de los pares de haplotipos posibles se compara con los pares de haplotipos en la población de referencia. Generalmente, solo uno de los pares de haplotipos en la población de referencia equivale a un posible par de haplotipos y ese par se le asigna a la persona. Ocasionalmente, solo un haplotipo representado en los pares de haplotipos de referencia es consistente con un posible par de haplotipos para una persona, y en tales casos se le asigna a la persona un par de haplotipos que contienen este haplotipo conocido y un nuevo haplotipo derivado al restar el haplotipo conocido del posible par de haplotipos. En otra modalidad, puede utilizarse un genotipo o haplotipo detectable que se encuentra en desequilibrio de acoplamiento con un genotipo o haplotipo de interés como marcador indirecto. Un genotipo que se encuentra en desequilibrio de acoplamiento con otro genotipo se indica cuando un genotipo o haplotipo particular para un determinado gen es más frecuente en la población que demuestra también el genotipo de marcador indirecto potencial que en la población de referencia. Si la frecuencia es estad ísticamente significativa, entonces el genotipo de marcador es pronóstico de ese genotipo o haplotipo, y puede utilizarse como marcador indirecto. Otro método para encontrar correlaciones entre el contenido de haplotipo y las respuestas cl ínicas utiliza modelos de pronóstico basados en algoritmos de optimización de minimización de errores, uno de los cuales es un algoritmo genético. Ver, Judson R, "Genetic Algorithms and Their Uses in Chemistry" ("Algoritmos genéticos y sus usos en Qu ímica") en Reviews in Computational Chemistry (Reseñas de Química computacional), Cap. 10, Lipkowitz KB & Boyd DB, eds. (VCH Publishers, Nueva York, 1997) págs. 1 -73. La renaturalización simulada (Press ef al., Numérica! Recipes in C: The Art of Scientific Computing (Recetas numéricas en C: El arte de cálculos científicos)), Cap. 10 (Cambridge, University Press, Cambridge, 1992), redes neurales (Rich E & Knight K, Artificial Intelligence (Inteligencia artificial), 2a edición, Cap. 10 (McGraw-Hill, Nueva York, 1991 ), métodos convencionales de descenso de gradiente (Press ef al., supra Cap. 10), o también pueden utilizarse otros planteamientos de optimización globales o locales (ver la discusión en Judson, supra). En el ejemplo mostrado a continuación, los estudios de asociación genotipo-fenotipo y análisis relacionados se realizaron en SAS (Cary, NC, EUA) utilizando Analyst®. Las pruebas de asociación utilizaron genotipos categóricos como la variable independiente, sin hipótesis acerca de la dominancia, y las diversas variables de eficacia como variables dependientes. Se utilizaron pruebas de variables dependientes continuas utilizadas en análisis ANCOVA, y la regresión log ística para variables dependientes categóricas. Las covariables en el análisis de asociación genotipo-fenotipo fueron: tratamiento, región de prueba y medición al inicio del estudio. El análisis ANCOVA se repitió con el mismo modelo para cada grupo de tratamiento. Además, el porcentaje de pacientes que responden al tratamiento fue analizado por medio de un modelo de regresión logística con tratamiento y región como factores y el inicio del estudio como una covariable. Las asociaciones con p < 0.05 en todo el conjunto de datos se consideraron significativas. Correlacionar el genotipo o haplotipo del paciente con la respuesta al tratamiento. En las modalidades preferidas, el atributo es la susceptibilidad a una enfermedad, severidad de una enfermedad, la estadificación de una enfermedad o respuesta a un medicamento. Tales métodos tienen aplicabilidad para desarrollar las pruebas diagnósticas y los tratamientos terapéuticos para todas las aplicaciones farmacogenéticas donde existe el potencial para una asociación entre un genotipo y un resultado del tratamiento, incluyendo las mediciones de eficacia, mediciones farmacocinéticas y mediciones secundarias. En otra modalidad preferida, el atributo de interés es una respuesta clínica exhibida por un paciente a algún tratamiento terapéutico, por ejemplo, la respuesta al destinatario del medicamento o a un tratamiento terapéutico para una condición médica. Para deducir una correlación entre una respuesta cl ínica a un tratamiento y un genotipo o haplotipo, se obtienen los datos de genotipo o haplotipo en las respuestas cl ínicas exhibidas por una población de personas que recibieron el tratamiento, en lo sucesivo definida como "población clínica". Estos datos clínicos pueden obtenerse analizando los resultados de una prueba clínica que ha sido realizada y/o al diseñar y realizar una o más pruebas clínicas. Las personas incluidas en la población clínica se clasifican normalmente para la existencia de la condición médica de interés. Esta clasificación de pacientes potenciales podría emplear un examen físico convencional o una o más pruebas de laboratorio. Alternativamente, la clasificación de pacientes podría utilizar la haplotipificación para situaciones en las que existe una fuerte correlación entre el par de haplotipos y susceptibilidad o severidad de la enfermedad. El tratamiento terapéutico de interés se administra a cada persona en la población de la prueba, y la respuesta de cada persona al tratamiento se m ide utilizando uno o más criterios predeterminados. Se contempla que en muchos casos, la población de prueba presentará un rango de respuestas y que el investigador elegirá el numero de grupos de pacientes que respondan al tratamiento (por ejemplo, bajo, medio, alto) realizado por las diversas respuestas. Además, el gen para cada persona en la población de prueba se genotipifica y haplotipifica, lo cual puede realizarse antes o después de la administración del tratamiento. Estos resultados se analizan después para determinar si alguna variación observada en respuesta cl ínica entre los grupos de polimorfismo es estad ísticamente significativa. Los métodos de análisis estadístico, que pueden utilizarse, se describen en Fisher LD & vanBelle G, Biostatistics: A Methodology for the Health Sciences (Wiley- Interscience, Nueva York, 1 993). Este análisis también puede incluir un cálculo de regresión del cual los sitios polimórficos en el gen contribuyen muy significativamente a las diferencias en el fenotipo. Después de que se han obtenido tanto los datos clínicos como los del polimorfismo, se crean las correlaciones entre la respuesta de I apersona y el contenido de genotipo o haplotipo. Las correlaciones pueden producirse de diversas maneras. En un método, las personas son agrupadas por su genotipo o haplotipo (o par de haplotipos) (también referido como grupo de polimorfismo), y después se calculan los promedios y desviaciones estándar de las respuestas cl ínicas presentadas por los miembros de cada grupo de polimorfismo. A partir de los análisis descritos con anterioridad , el experto en la materia que pronostica la respuesta clínica en función del contenido de genotipo o haplotipo puede construir fácilmente un modelo matemático. La identificación de una asociación entre una respuesta cl ínica y un genotipo o haplotipo (o par de haplotipos) para el gen puede ser la base para diseñar un método de diagnóstico a fin de determinar a aquellas personas que responderán o no al tratamiento, o alternativamente, que responderán a un menor nivel y que consecuentemente pueden requerir más tratamiento, es decir, una mayor dosis de medicamento. El método de diagnóstico puede tomar una de varias formas: por ejemplo, una prueba de ADN directo (es decir, genotipificar o haplotipificar uno o más sitios polimórficos en el gen), una prueba serológica, o una medición de examen físico. El único requisito es que haya una buena correlación entre los resultados de la prueba diagnóstica y el genotipo o haplotipo subyacente. En una modalidad preferida, este método de diagnóstico utiliza el método de haplotipificación de pronóstico descrito con anterioridad . Asignarle a una persona un grupo de genotipo. Como comprenderá el experto en la materia, habrá un cierto grado de incertidumbre involucrado en esta determinación. Por lo tanto, las desviaciones estándar de los niveles de grupo control se utilizarían para realizar una determinación probabilística y los métodos de esta invención serían aplicables sobre un amplio rango de determinaciones de grupo de genotipo basadas en la probabilidad. Consecuentemente, por ejemplo, y no a manera de limitante, en una modalidad, si el nivel medido del producto de expresión genética tiene 2.5 desviaciones estándar del promedio de cualquiera de los grupos de control , entonces a esa persona puede asignarse a ese grupo de genotipo. En otra modalidad , si el nivel medido del producto de expresión genética tiene 2.0 desviaciones estándar del promedio de cualquiera de los grupos de control, entonces esa persona puede asignarse a ese grupo de genotipo. Aún en otra modalidad , si el nivel medido del producto de expresión genética tiene 1 .5 desviaciones estándar del promedio de cualquiera de los grupos de control, entonces esa persona puede asignarse a ese grupo de genotipo. Aún en otra modalidad , si el nivel medido del producto de expresión genética tiene 1 .0 desviaciones estándar del promedio de cualquiera de los grupos de control, entonces esa persona puede asignarse a ese grupo de genotipo. Consecuentemente, este proceso permite la determinación , con diversos grados de probabilidad, de en cuál grupo se colocará a un paciente específico, y tal asignación a un grupo de genotipo determinara entonces la categoría de riesgo en la cual se colocará a la persona. Correlación entre respuesta clínica y genotipo o haplotipo. Con objeto de deducir una correlación entre la respuesta cl ínica a un tratamiento y un genotipo o haplotipo, es necesario obtener datos acerca de las respuestas clínicas exhibidas por una población de personas que recibieron el tratamiento, en lo sucesivo definido con el término "población clínica". Estos datos clínicos pueden obtenerse al analizar los resultados de una prueba cl ínica que ya se ha realizado y/o los datos clínicos pueden obtenerse al diseñar y realizar una o más pruebas cl ínicas. Los niveles de control convencionales del producto de expresión genética, así determinados en los diferentes grupos de control , se compararían entonces con el nivel medido de un producto de expresión genética en un determinado paciente. Este producto de expresión genética podría ser el ARNm característico asociado con ese grupo de genotipo particular o el producto de expresión genética del polipéptido de ese grupo de genotipo. Después, el paciente podría clasificarse o asignarse a un grupo de genotipo particular con base en cuan similares fueron los niveles medidos en comparación con los niveles de control para un grupo determinado. Sistema de computadora para almacenar o visualizar datos de polimorfismo. La invención también proporciona un sistema de computadoras para almacenar y visualizar datos de polimorfismo determinados para el gen. El sistema de computadora comprende una unidad de procesamiento de computadora, una pantalla, y una base de datos que contiene los datos de polimorfismo. Los datos de polimorfismo incluyen los polimorfismos, los genotipos y los haplotipos identificados para un determinado gen en una población de referencia. En una modalidad preferida, el sistema de computadora es capaz de producir una pantalla que muestra haplotipos organizados de acuerdo con sus relaciones evolutivas. Una computadora puede implementar alguna o todas las operaciones analíticas y matemáticas involucradas en la práctica de los métodos de la presente invención. Además, la computadora puede ejecutar un programa que genera vistas (o pantallas) visualizados en un dispositivo de visualización y con el cual el usuario puede interactuar a fin de visualizar y analizar grandes cantidades de información referentes al gen y su variación genómica, incluyendo la posición cromosómica, estructura genética y familia genética, datos de expresión genética, datos de polimorfismo, datos de secuencia genética, y datos de población clínica (por ejemplo, datos acerca del origen etnogeográfico, respuestas clínicas, genotipos y haplotipos para una o más poblaciones). Los datos de polimorfismo descritos en la presente pueden almacenarse como parte de una base de datos relacional (por ejemplo, una instancia de una base de datos de Oracle o un conjunto de archivos planos de ASCI I ). Estos datos de polimorfismo pueden almacenarse en el disco duro de la computadora o pueden, por ejemplo, almacenarse en un CD-ROM o en uno o más dispositivos de almacenamiento accesibles por la computadora. Por ejemplo, los datos pueden almacenarse en una o más bases de datos en comunicación con la computadora mediante una red. Diagnósticos basados en ácido nucleico. En otro aspecto, la invención proporciona sondas de SNP, las cuales son útiles para clasificar a los pacientes de acuerdo con sus tipos de variación genética. Las sondas de SNP de acuerdo con la invención son oligonucleótidos, los cuales discriminan entre los SNPs en pruebas convencionales de discriminación alélica. En algunas modalidades preferidas, los oligonucleótidos de acuerdo con este aspecto de la invención son complementarios a un alelo del ácido nucleico de SNP, pero no a algún otro alelo del ácido nucleico de SNP. Los oligonucleótidos de acuerdo con esta modalidad de la invención pueden discriminar entre SNPs de diversas maneras. Por ejemplo, bajo condiciones de hibridación severas, un oligonucleótido de largo apropiado se hibridará en un SNP, pero no en otro. El oligonucleótido puede etiquetarse utilizando una radioetiqueta o una etiqueta molecular fluorescente. Alternativamente, puede utilizarse un oligonucleótido de largo apropiado como imprimador para PCR, en el que el nucleótido de terminal 3' es complementario a un alelo que contiene un SNP, peo no a algún otro alelo. En esta modalidad, la presencia o ausencia de amplificación por PCR determina el haplotipo del SNP. Los fragmentos genómicos y de ADNc de la invención comprenden al menos un sitio polimórfico novedoso identificado en la presente, tienen un largo de al menos 1 0 nucleótidos, y pueden oscilar todo el largo del gen . Preferentemente, un fragmento de acuerdo con la presente invención tiene entre 100 y 3000 nucleótidos de largo, y más preferentemente entre 200 y 2000 nucleótidos de largo, y muy preferentemente entre 500 y 1 000 nucleótidos de largo. Equipos de la invención. La invención proporciona equipos de ácido nucleico y de detección de polipéptidos para haplotipificar y/o genotipificar el gen en una persona. Tales equipos son útiles para clasificar personas para el propósito de clasificación de las personas. Específicamente, la invención contempla equipos para detectar la presencia de un polipéptido o ácido nucleico correspondiente a un marcador de la invención en una muestra biológica, por ejemplo, cualquier fluido corporal que incluya, pero que no se limite a, suero, plasma, linfa, fluido cístico, orina, materias fecales, fluido cerebroespinal , fluido de ascitis o sangre, y que incluye muestras de biopsia de tejido corporal. Por ejemplo, el equipo puede comprender un compuesto etiquetado o agente capaz de detectar un polipéptido o un ARNm que codifique un polipéptido correspondiente a un marcador de la invención en una muestra biológica y medios para determinar la cantidad del polipéptido o ARNm en la muestra, por ejemplo, un anticuerpo que une el polipétido o una sonda de oligonucleótidos que se une al ADN o 0 ARNm que codifica el polipétido. Los equipos también pueden incluir instrucciones para interpretar los resultados obtenidos utilizando el equipo. En otra modalidad, la invención proporciona un equipo que comprende al menos dos oligonucleótidos de genotipificación empaquetados en recipientes separados. El equipo también puede contener otros componentes tales como un regulador de hibridación (donde los oligonucleótidos van a utilizarse como sonda) empaquetados en un recipiente separado. Alternativamente, donde los oligonucleótidos van a utilizarse para amplificar una región destinataria, el equipo puede contener, empaquetada en recipientes separados, una polimerasa y un regulador de reacción optimizado para la extensión de imprimador mediada por la polimerasa, tal como en el caso de PCR. En una modalidad preferida, tal equipo puede comprender además un medio de recolección de muestras de ADN. Para los equipos basados en anticuerpos, el equipo puede comprender, por ejemplo, ( 1 ) un primer anticuerpo, por ejemplo, unido a un soporte sólido, que se une a un polipéptido correspondiente a un marcador o la invención; y, opcionalmente (2) un segundo anticuerpo diferente que se une al polipéptido o al primer anticuerpo y se conjuga a una etiqueta detectable. Para equipos basados en oligonucleótidos, el equipo puede comprender, por ejemplo, ( 1 ) un oligonucleótido, por ejemplo, un oligonucleótido etiquetado detectablemente, que se hibrida a una secuencia de ácido nucleico que se codifica a un polipéptido correspondiente a un marcador de la invención; o (2) un par de imprimadores útiles para amplificar una molécula de ácido nucleico correspondiente a un marcador de la invención. El equipo también puede comprender, por ejemplo, un agente de regulación, un conservador o un agente estabilizador de proteínas. El equipo puede comprender además componentes necesarios para detectar la etiqueta detectable, por ejemplo, una enzima o un substrato. El equipo también puede contener una muestra de control o una serie de muestras de control , que puede evaluarse y compararse con la muestra de prueba. Cada componente del equipo puede incluirse en un recipiente individual y los diversos recipientes pueden estar dentro de un solo empaque, junto con instrucciones para interpretar los resultados de las pruebas realizadas utilizando el juego. Secuencias de ácido nucleico de la invención. En un aspecto, la invención comprende uno o más polinucleótidos aislados. La invención abarca también las variaciones alélicas de la misma, es decir, formas alternas de generación natural de los polinucleótidos aislados que cod ifican los polipéptidos mutantes que son idénticas, homólogos o relacionados con aquellos codificados por los polinucleótidos. Alternativamente, los variantes de generación no natural pueden producirse por técnicas de mutagénesis o por técnicas de síntesis directas bien conocidas en la materia. De acuerdo con lo anterior, las secuencias de ácido nucleico capaces de hibridar con una baja severidad con algún polipéptido mutante de codificación de secuencias de ácido nucleico de la presente invención se consideran dentro del alcance de la invención . Las condiciones convencionales de severidad se encuentran bien caracterizadas en textos convencionales de clonación biológica molecular. Ver, por ejemplo, Molecular Cloning A Laboratory Manual (Clonación molecular Un manual de laboratorio), 2a edición, Sambrook, Fritsch & Maniatís (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1 989); DNA Cloning (Clonación de ADN), Volúmenes I y II, Glover DN, ed. (1985); Oligonucleotide Synthesis (Síntesis de oligonucleótidos), Gait MJ , ed . ( 1984); Nucleic Acid Hybridization (Hibridación de ácido nucleico), Hames BD & Higgins SJ, eds. ( 1984). Caracterizar nivel de expresión genética. Son bien conocidos los métodos para detectar y medir los niveles de ARNm (es decir, nivel de transcripción genética) y los niveles de productos de expresión genética de polipéptidos (es decir, nivel de transcripción genética) son conocidas en la materia e incluyen el uso de microarreglos de nucleótidos y métodos de detección de polipéptidos que involucran espectrómetros de masa y/o técnicas de cuantificación y detección de anticuerpos. Ver también, Strachan T & Read A, Human Molecular Genetics ( Genética molecular humana), 2a Edición. (John Wiley and Sons, Inc. Publication, Nueva York, 1999). Determinación de transcripción genética destinataria. La determinación del nivel del producto de expresión del gen en una muestra biológica, por ejemplo, los fluidos del tejido o corporales de una persona, pueden realizarse en una variedad de formas. El término "muestra biológica" pretende incluir tejidos, células, fluidos biológicos y aislados del mismo, provenientes de un paciente, así como también tejidos, células y fluidos presentes en un paciente. Muchos métodos de detección de expresión utilizan ARN aislado. Para los métodos in vitro, cualquier técnica de aislamiento de ARN que no se seleccione contra el aislamiento del ARNm puede utilizarse para la purificación de ARN derivado de las células. Ver, por ejemplo, Ausubel ef al. , ed . , Curr.

Prot. Mol. Biol. (John Wiley & Sons, Nueva York, 1987-1 999). En una modalidad, se determina el nivel del producto de expresión de ARNm del gen objetivo. Los métodos para medir el nivel de un ARNm específico son conocidos en la materia e incluyen análisis Northern , PCR de transcripción inversa, y PCR cuantitativa en tiempo real o por hibridación a un arreglo o microarreglo de oligonucléotidos. En otras modalidades más preferidas, la determinación del nivel de expresión puede realizarse por la determinación del nivel de proteína o producto de expresión de polipéptido del gen en los fluidos corporales o muestras de tejidos que incluyen pero que no se limitan a sangre o suero. Puede procesarse fácilmente un gran número de muestras de tejido utilizando técnicas bien conocidas por aquellos expertos en la materia, tales como, por ejemplo, el proceso de aislamiento de ARN de un paso de la Patente de E. U. No. 4,843, 155. El ARNm aislado puede utilizarse en pruebas de hibridación o amplificación que ¡ncluyen , pero que no se limitan a, los análisis Southern o Northern , análisis de PCR y arreglos de sondas. Un método de diagnóstico preferido para la detección de niveles de ARNm involucra contactar el ARNm aislado con una (sonda) molécula de ácido nucleico que puede hibridar al ARNm codificado por el gen detectado. La sonda de ácido nucleico puede ser, por ejemplo, un ADNc de tamaño natural, o una porción del mismo, tal como un oligonucleótido de al menos 7, 1 5, 30, 50, 100, 250 o 500 nucleótidos de largo y suficientes para hibridar específicamente bajo condiciones severas en un ARNm o ADN genómico que codifique un marcador de la presente invención. Otras sondas adecuadas para su uso en las pruebas diagnósticos de la invención son descritas en la presente. La hibridación de un ARNm con la sonda indica que se está expresando el marcador en cuestión. En un formato, las sondas se inmovilizan sobre una superficie sólida y el ARNm es contactado con las sondas, por ejemplo, en un arreglo de chips genéticos Affymetrix (Affymetrix, Calif. , EUA). Un experto en la materia puede adaptar fácilmente los métodos de detección de ARNm conocidos para su uso en la detección del nivel de ARNm codificado por los marcadores de la presente invención . Un método alternativo para determinar el nivel de ARNm correspondiente a un marcador de la presente invención en una muestra involucra el proceso de amplificación de ácido nucleico, por ejemplo, por RT-PCR (la modalidad experimental expuesta en la Patente de E. U . No. 4,683,202); reacción de cadena de ligasa (Barany ef al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 88: 1 89-193 ( 1 991 )) replicación de secuencias autónomas (Guatelli ef al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 87: 1874-1 878 ( 1990)); sistema de amplificación de transcripción (Kwoh ef al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 86: 1 1 73- 1 1 77 ( 1989)); Replicasa de Q-Beta (Lizardi ef al., Biol. Technology 6: 1 1 97 ( 1988)); replicación de círculo de contacto (Patente de E. U . No. 5,854,033); o algún otro método de amplificación de ácido nucleico, seguido por la detección de las moléculas amplificadas utilizando técnicas conocidas por aquellos expertos en la materia. Estos esquemas de detección son especialmente útiles para la detección de las moléculas de ácido nucleico si tales moléculas se encuentran presentes en números muy bajos. Como se utiliza en la presente, los "imprimadores de amplificación" se definen como un par de moléculas de ácido nucleico que pueden renaturalizarse en las regiones 5' o 3' de un gen (más y menos cadenas, respectivamente, o viceversa) y contienen una región corta en medio. En general, los imprimadores de amplificación van desde aproximadamente 1 0-30 nucleótidos de largo y distinguen una región de aproximadamente 50-200 nucleótidos de largo. La PCR cuantitativa en tiempo real (RT-PCR) es una manera de evaluar los niveles de expresión genética, por ejemplo, de genes de la invención, por ejemplo, aquellos que contienen SNPs y polimorfismos de interés. La prueba de RT-PCR utiliza una transcriptasa inversa de ARN a fin de catalizar la síntesis de una cadena de ADN a partir de una cadena de ARN , incluyendo una cadena de ARNm . El ADN resultante puede detectarse y cuantificarse específicamente y este proceso puede utilizarse para determinar los niveles de especies específicas de ARNm . Un método para hacer esto es TAQMAN® (PE Applied Biosystems, Foster City, California, EUA) y explota la actividad de nucleasa 5' de la polimerasa de ADN AMPLITAQ GOLD ™ para segmentar una forma específica de sonda durante una reacción de PCR. Este es referido como sonda TAQMAN®. Ver Luthra et al., Am. J. Pathol. 1 53: 63-68 ( 1 998); Kuimelis eí al., Nucí. Acids. Symp. Ser. Ser. 37: 255-256 ( 1 997); y Mullah et al., Nucleic Acids Res. 26(4): 1026-1 031 ( 1 998)). Durante la reacción, la segmentación de la sonda separa un tinte relator y un tinte de extinción, dando como resultado una mayor fluorescencia del relator. La acumulación de los productos de PCR se detecta directamente al monitorear el incremento en la fluorescencia del tinte relator. Heid et al., Genome Res. 6(6): 986-994 (1996)). Entre mayor sea el número de copia inicial del destinatario de ácido nucleico, más rápido se observará un incremento significativo en la fluorescencia. Ver Gibson, Heid & Williams eí al., Genome Res. 6:995-1001 ( 1996). Otras tecnolog ías para medir el estado de transcripción de una célula producen mezclas de fragmentos de restricción de complejidad limitada para el análisis electroforético, tales como métodos que combinan la doble digestión enzimática de restricción con imprimadores en fase (ver, por ejemplo, EP 0 534858 A1 ), o métodos que seleccionan los fragmentos de restricción con sitios más próximos a un extremo de ARNm definido. (Ver, por ejemplo, Prashar & Weissman, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 93(2) 659-663 ( 1 996)). Otros métodos muestrean estad ísticamente mezclas de ADNc, tales como secuenciando suficientes bases, por ejemplo, 20-50 bases, en cada uno de los múltiples ADNs para identificar cada ADNc, o secuenciando etiquetas cortas, por ejemplo, 9-1 0 bases, las cuales se generan en posiciones conocidas con relación a un patrón de trayectoria de extremo de ARNm definido. Ver, por ejemplo, Velculescu, Science, 270: 484-487 ( 1 995). Los niveles de ADNc en las muestras se cuantifican y se determinan la media, promedio y desviación estándar de cada ADNc utilizando medios estad ísticos convencionales conocidos por los expertos en la materia. Norman T.J. Bailey, Statistical Methods in Biology (Métodos estadísticos en Biología), 3a Edición (Cambridge University Press, 1 995).

Detección de polipéptidos. Métodos de detección inmunológicos. La expresión de la proteína codificada por los genes de la invención puede detectarse por una sonda que se etiqueta detectablemente, o que puede etiquetarse subsecuentemente. El término "etiquetado", con referencia a la sonda o anticuerpo, pretende abarcar la etiquetación directa de la sonda o anticuerpo al acoplar, es decir, enlazar físicamente, una substancia detectable a la sonda o anticuerpo, así como también una etiquetación indirecta de la sonda o anticuerpo por reactividad con otro reactivo que se etiqueta directamente. Los ejemplos de etiquetación indirecta incluyen la detección de un anticuerpo primario utilizando un anticuerpo secundario etiquetado fluorescentemente y una etiquetación de extremo de una sonda de ADN con biotina de manera tal que puede detectarse con estreptavidina etiquetada fluorescentemente. Generalmente, la sonda es un anticuerpo que reconoce la proteína expresada. Puede emplearse una variedad de formatos para determinar si una muestra contiene una proteína destinataria que se une a un determinado de anticuerpo . Los métodos de inmunoanálisis útiles en la detección de polipéptidos destinatarios de la presente invención incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, un análisis sanguíneo, análisis Western, proteinochips, ensayos inmunoabsorbentes de enzima enlazada (ELISA - enzyme-linked immunosorbant assays), inmunohistoqu ímica, clasificación celular activada por fluorescencia (FACS - fluorescence activated cell sorting), y otros utilizados comúnmente y ampliamente descritos en la literatura científica y de patentes, y muchos empleados comercialmente. Un experto en la materia puede adaptar fácilmente los métodos de detección de proteínas/anticuerpos conocidos para su uso en la determinación de si las células expresan un marcador de la presente invención y la concentración relativa de ese producto de expresión de polipétido específico en la sangre u otros tejidos corporales. Las proteínas provenientes de personas pueden aislarse utilizando técnicas bien conocidas por aquellos expertos en la materia. Los métodos de aislamiento proteínico empleados pueden ser, por ejemplo, los descritos en Harlow & Lañe, Antibodies: A Laboratory Manual (Anticuerpos: Un manual de laboratorio) (Cold Spring harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1 988)). Para la producción de anticuerpos a una proteína codificada por uno de los genes descritos, diversos animales huésped pueden inmunizarse por inyección con el polipéptido, o una porción de los mismos. Tales animales huésped pueden incluir, pero no limitarse a, conejos, ratones y ratas. Pueden utilizarse diversos aditivos aditivos para incrementar la respuesta inmunológica, dependiendo de la especie huésped incluyendo, pero sin limitarse a, Freund (completa e incompleta), geles minerales, tales como hidróxido de aluminio; sustancias activas superficiales, tales como lisolecitina, polioles plurónicos, polianiones, péptidos, emulsiones de aceite, hemocianina de lapa californiana y dinitrofenol; y aditivos humanos potencialmente útiles, tales como el bacilo Camette-Guerin (BCG) y Corynebacterium parvum. Los anticuerpos monoclonales (mAbs), los cuales son poblaciones homogéneas de anticuerpos para un antígeno particular, pueden obtenerse por cualquier técnica que proporciona la producción de moléculas de anticuerpos por l íneas celulares continuas en cultivo. Estas incluyen , pero no se limitan a, la técnica del hibridoma de Kohier & Milstein, Nature 256: 495-497 ( 1 975); y la Patente de E. U. No. 4,376, 1 1 0; la técnica de hibridoma de células B humana de Kosbor ef al. , Immunol. Today 4: 72 ( 1983); Colé ef al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 80:2026-2030 ( 1 983); y la técnica de EBV-hibridoma de Colé ef al. , Monoclonal Antibodies and Cáncer Therapy (Anticuerpos monoclonales y terapia contra el cáncer) (Alan R. Liss, Inc. , 1 985) págs. 77-96. Además, pueden utilizarse las técnicas desarrolladas para la producción de "anticuerpos quiméricos" (ver Morrison ef al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 81 : 6851 -6855 ( 1 984); Neuberger ef al., Nature 31 2: 604-608 ( 1984); y Takeda ef al., Nature 314: 452-454 ( 1985)), al segmentar los genes provenientes de una molécula de anticuerpos de ratón de especificidad de antígeno apropiada junto con los genes provenientes de una molécula de anticuerpo humano de la actividad biológica apropiada. Un anticuerpo quimérico es una molécula en la cual se derivan diferentes porciones provenientes de diferentes especies animales, tales como aquellas que tienen una región variable o hipervariable derivada de un mAb murino y una región constante de inmunoglobulina humana. Alternativamente, las técnicas descritas para la producción de anticuerpos de cadena individual (Patente de E.U. No. 4,946,778; Bird , Science 242: 423-426 ( 1 988); Huston eí al., Proc. Nati. Acad. Sci.

USA 85: 5879-5883 ( 1 988); y Ward ef al., Nature (Naturaleza) 334: 544-546 ( 1 989)) pueden adaptarse para producir anticuerpos monocatenarias de gen expresado diferencialmente. Las técnicas útiles para la producción de "anticuerpos humanizados" pueden adaptarse para producir anticuerpos para las proteínas, fragmentos o derivados de los mismos. Tales técnicas son descritas en las Patentes de E. U . Nos. 5,932,448; 5,693,762; 5,693,761 ; 5, 585,089; 5,530, 1 01 ; 5,569,825; 5,625, 126; 5,633,425; 5,789,650; 5,661 ,016; y 5,770,429. Los anticuerpos o fragmentos de anticuerpos pueden utilizarse en métodos, tales como análisis Western o técnicas de inmunofluoroscencia , para detectar las proteínas expresadas. En tales usos, generalmente es preferible inmovilizar sea el anticuerpo o las proteínas en un soporte sólido. Los soportes o portadores adecuados de fase sólida incluyen cualquier soporte capaz de unir un antígeno o un anticuerpo. Los soportes o portadores conocidos incluyen vidrio, poliestireno, polipropileno, polietileno, dextran, nylon, amilasas, celulosas naturales y modificadas, poliacrilamidas, gabros y magnetita. Un método útil, para facilidad de detección, es la ELISA intercalada, de la cual existe un número de variaciones, las cuales pretenden todas ser utilizadas en los métodos y pruebas de la presente invención. Como se utiliza en la presente, "prueba intercalada" pretende abarcar todas las variaciones en la técnica básica de dos sitios. Las técnicas de inmunofluorescencia y ElA se encuentran ambas bien establecidas en la materia. Sin embargo, también pueden emplearse otras moléculas relatoras, tales como los radioisótopos, moléculas quimioluminiscentes o bioluminiscentes. Será fácilmente aparente para aquellos expertos en la materia cómo variar el procedimiento a fin de adecuar el uso requerido. El monitoreo genómico entero de la proteína, es decir, el "proteinoma", puede realizarse al construir un microarreglo en el cual los sitios de unión comprenden anticuerpos inmovilizados, preferentemente monoclonales, específicos a una pluralidad de especies proteínicas codificadas por el genoma celular. Preferentemente, los anticuerpos se encuentran presentes para una fracción substancial de las proteínas codificada, o al menos para aquellas proteínas relevantes a las pruebas o confirmación de un modelo de red biológica de interés. Como se observaba con anterioridad, los métodos para realizar anticuerpos monoclonales son conocidos. Ver, por ejemplo, Harlow & Lañe, Antibodies: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York, 1988). En una modalidad preferida, surgen anticuerpos monoclonales contra fragmentos de péptidos sintéticos diseñados con base en la secuencia genómica de la célula. Con tal arreglo de anticuerpos, las proteínas derivadas de la célula se contactan al arreglo y su unión se mide con las pruebas conocidas en la materia. Detección de polipéptidos. Electroforesis de gel en dos dimensiones. La electroforesis de gel en dos dimensiones es conocida en la materia e involucra típicamente el enfoque isoeléctrico a lo largo de una primera dimensión seguida de una electroforesis de SDS-PAGE a lo largo de una segunda dimensión. Ver, por ejemplo, Hames ef al., Gel Electrophoresis of Proteins: A Practical Approach (Electroforesis de gel de proteínas: Un planteamiento práctico) (IRL Press, Nueva York, 1 990); Schevchenko ef al. , Proc. Nati. Acad. Sci. USA 93: 14440-14445 ( 1996); Sagliocco ef al., Yeast (Levadura) 12: 1 519-1 533 ( 1996); y Lander, Science 274: 536-539 ( 1 996). Detección de polipéptidos. Espectrometría de masa. La identidad así como también el nivel de expresión del polipéptido destinatario puede determinarse utilizando la técnica de espectroscopia de masa (MS - mass spectroscopy). La metodolog ía de análisis basado en MS es útil para el análisis del polipéptido objetivo aislado así como también el análisis del polipéptido destinatario en una muestra biológica. La MS se formatea para su uso en el análisis de un polipéptido destinatario incluyen técnicas de ionización (I), tales como, pero no limitadas a , la desorción de láser asistida por matriz ( MALDI - matrix assisted láser desorption), ionización de electrospray continua o por impulsos (ESl - electrospray ionization) y métodos relacionados, tales como ionspray o termospray, e impacto de grupo masivo (MCI - massive cluster impact). Tales fuentes iónicas pueden corresponder con formatos de detección, incluyendo el tiempo de vuelo (TOF - time of flight) del reflectrón lineal o no lineal, cuadrupolo individual o múltiple, sector magnético individual o múltiple, resonancia de ciclotrón iónico de transformada de Fourier (FTICR - Fourier transform ion cyclotron resonance), trampa iónica y combinaciones de los mismos tales como trampa iónica/TOF. Para ionización, pueden emplearse numerosas combinaciones de matriz/longitud de onda (por ejemplo, desorción de láser asistida por matriz (MALDI )) o combinaciones de solventes (por ejemplo, ESl ). Para el análisis de espectroscopia de masa (MS), el polipéptido destinatario puede solubilizarse en un sistema apropiado de solución o reactivo. La selección de un sistema de solución o reactivo, por ejemplo, un solvente orgánico o inorgánico, dependerá de las propiedades del polipéptido destinatario y el tipo de MS realizada , y se basa en métodos conocidos en la materia. Ver, por ejemplo, Vorm et al. , Anal. Chem. 61 : 3281 ( 1 994) para la MALDI ; y Valaskovic ef al., Anal. Chem. 67: 3802 ( 1 995), para la ESl . También se describe la MS de péptidos, por ejemplo, en la Solicitud de PCT Internacional No. WO 93/24834 y la Patente de E. U . No. 5,792,664. Se selecciona un solvente que minimiza el riesgo de que el polipéptido destinatario se descompondrá por la energ ía introducida para el proceso de vaporización. Puede alcanzarse un riesgo reducido de descomposición de polipéptidos destinatarios, por ejemplo, incorporando la muestra en una matriz. Una matriz adecuada puede ser un compuesto orgánico tal como azúcar, por ejemplo, una pentosa o hexosa, o un polisacárido tal como celulosa. Tales compuestos se descomponen térmicamente en CO2 y H2O de manera tal que no se forman residuos que puedan conducir a reacciones qu ímicas. La matriz también puede ser un compuesto inorgánico, tal como nitrato de amonio, el cual se descompone esencialmente sin dejar residuo alguno. El uso de estos y otros solventes es conocido por aquellos expertos en la materia . Ver, por ejemplo, la Patente de E. U. No. 5,062,935. La MS de electrospray se ha descrito por Fenn ef al., J. Phys. Chem. 88: 4451 -4459 ( 1 984); y la Solicitud de PCT No. WO 90/14148; y las aplicaciones actuales se resumen en artículos de revistas. Ver, Smith et al., Anal. Chem. 62: 882-89 ( 1 990) y Ardrey, Spectroscopy (Espectroscopia) 4: 10-18 ( 1 992). La masa de un polipéptido destinatario determinado por MS puede compararse con la masa de un polipéptido conocido correspondiente. Por ejemplo, cuando el polipéptido destinatario es una prote ína mutante, el polipéptido conocido correspondiente puede ser la proteína no mutante correspondiente, por ejemplo, proteína de tipo silvestre. Con la ESl , la determinación de los pesos moleculares en cantidades de femtomol de muestra es muy precisa debido a la presencia de múltiples picos de ion, todos los cuales pueden utilizarse para el cálculo de masa. Se han detectado niveles proteínicos de sub-attomol, por ejemplo, utilizando MS de ESl (Valaskovic ef al., Science 273: 1 199-1202 ( 1 996)) y MS de MALDI (Li eí al., J. Am. Chem. Soc. 1 18: 1662-1663 ( 1 996)). Desorción de láser asistida por matriz (MALDI). El nivel de la proteína destinataria en una muestra biológica, por ejemplo, fluido corporal o muestra de tejido, puede medirse mediante métodos espectroscópicos de masa (MS) que incluyen, pero que no se limitan a, aquellas técnicas conocidas en la materia como desorción/ionización de láser asistida por matriz, espectrometría de masa de tiempo de vuelo, (MALDI-TOF-MS - MALDI-time-of-flight-MAS) y superficies mejoradas para la desorción/ionización de láser, espectrometría de masa de tiempo de vuelo (SELD I-TOF-MS - surfaces enhanced for láser desorption/ionization , TOF-MS) como se describe detalladamente a continuación. Los métodos para realizar la MALDI son bien conocidos por aquellos expertos en la materia. Ver, por ejemplo, Juhasz ef al., Analysis, Anal. Chem. 68: 941 -946 ( 1996), y ver también, por ejemplo, la Patente de E. U . No. 5, 777,325; 5,742,049; 5,654,545; 5,641 ,959; 5,654,545 y 5,760,393 para las descripciones de MALDI y de los protocolos de extracción retrasada. También son conocidos numerosos métodos para mejorar la resolución. Se ha descrito la MALDI-TOF-MS por Hillenkamp et al., Biological Mass Spectrometry (Espectrometría de masa biológica) , Burlingame & McCIosky, eds. (Elsevier Science Publ. , Amsterdam , 1990) págs. 49-60. Puede utilizarse una variedad de técnicas para la detección de marcadores usando espectroscopia de masa. Ver Bordeaux Mass Spectrometry Conference Report (Reporte de la Conferencia de Espectrometría de Masa Bordeaux), Hillenkamp, ed. , págs. 354-362 ( 1 988); Bordeaux Mass Spectrometry Conference Report (Reporte de la Conferencia de Espectrometría de Masa Bordeaux), Karas & Hillenkamp, eds. , págs. 416-41 7 ( 1 988); Karas & Hillenkamp, Anal. Chem. 60: 2299-2301 ( 1 988); y Karas eí al., Biomed. Environ. Mass Spectrum (Espectro de Masa Ambient. Biomed.) 1 8: 841 -843 ( 1 989). Se muestra el uso de haces de láser en TOM-FS, por ejemplo, en las Patentes de E.U . Nos. 4,694, 167; 4,686, 366; 4,295,046 y 5,045,694, las cuales se incorporan en la presente para referencia en su totalidad. Otras técnicas de MS permiten la volatización exitosa de biopolímeros de peso molecular elevado, sin fragmentación , y han habilitado una amplia variedad de macromoléculas biológicas a analizarse por espectrometría de masa. Superficies mejoradas para la desorción/ionización de láser (SELDI). Se utilizan otras técnicas que emplean nuevas composiciones de elementos de sondas de MS con superficies que le permiten al elemento de sonda participar activamente en la captura y acoplamiento molecular de analitos específicos, descritos como Espectrometría de Masa de Afinidad (AMS - Affinity Mass Spectrometry). Ver las patentes de SELDI : Patentes de E. U . Nos. 5,719,060; 5,894,063; 6,020,208; 6,027,942; 6, 124,31 7; y la solicitud de Patente de E. U . publicada No. US 2003/0003465. Se han diseñado varios tipos de elementos de sonda de MS con Superficies mejoradas para Captura de Afinidad (SEAC -Surfaces Enhanced for Affinity Capture). Ver Hutchens & Yip, Rapid Commun. Mass Spectrom. (Espectrom. de Masa Com. Rápida) 7: 576-580 ( 1993). Se han utilizado exitosamente elementos de sonda de SEAC para recuperar y fijar diferentes clases de biopol ímeros, particularmente proteínas, al explotar lo que se sabe acerca de estructuras de superficie proteínica y reconocimiento molecular bioespecífico. Los dispositivos de captura de afinidad inmovilizados en la superficie del elemento de sonda de MS, es decir, SEAC, determina la ubicación y afinidad (especificidad) del analito para la superficie de sonda, por lo que el subsecuente proceso de MS analítico es eficiente. En la categoría general de SELDI hay tres subcategorías separadas. ( 1 ) Superficies Mejoradas para Desorción Limpia (SEND -Surfaces Enhanced for Neat Desorption), donde las superficies del elemento de sonda, es decir, los medios de presentación de la muestra, se encuentran diseñados para contener Moléculas de Absorción de Energ ía (EAM - Energy Absorption Molecules) en lugar de una "matriz" para facilitar la desorción/ionizaciones de los analitos añadidos directamente (limpios) a la superficie. (2) SEAC, donde las superficies del elemento de sonda, es decir, los medios de presentación de muestra, se encuentran diseñadas para contener dispositivos de captura de afinidad definidos qu ímicamente y/o definidos biológicamente a fin de facilitar sea la anexión o absorción específica o no específica (llamada acoplamiento molecular o fijación) de analitos a la superficie de la sonda, por una variedad de mecanismos (mayoritariamente no covalentes). (3) Superficies mejoradas para la anexión fotolábil y liberación (SEPAR - Surfaces Enhanced for Photolabile Attachment and Reléase), donde las superficies del elemento de sonda, es decir, los medios de presentación de muestra, se diseñan o modifican para contener uno o más tipos de moléculas de reticulación definidos químicamente a fin de servir como dispositivos covalentes de acoplamiento molecular. Las especificidades qu ímicas que determinan el tipo y número de los puntos de unión de molécula fotolábil entre los medios de presentación de la muestra de SEPAR (es decir, superficie de elemento de sonda) y el analito (por ejemplo, proteína) pueden incluir cualquiera de uno o más de entre un número de residuos diferentes o estructuras qu ímicas en el analito (por ejemplo, residuos de His, Lys, Arg , Tyr, Phe y Cys en el caso de proteínas y péptidos). Otros aspectos del estado biológico. En diversas modalidades de la invención, pueden medirse los aspectos del estado de la actividad biológica, o aspectos mixtos con objeto de obtener respuestas de medicamento y trayectoria. Pueden medirse las actividades de proteínas relevantes a la caracterización de la función celular, y las modalidades de la invención pueden basarse en tales mediciones. Las mediciones de actividad pueden realizarse por cualquier medio funcional, físico o bioquímico, apropiado para la actividad particular en cuestión. Cuando la actividad involucra una transformación qu ímica, la proteína celular puede contactarse con substratos naturales, y la tasa de transformación medida. Cuando la actividad incluye la asociación en unidades multiméricas, por ejemplo, puede medirse la asociación de un complejo de unión de ADN activado con ADN , la cantidad de proteína asociada o consecuencias secundarias de la asociación, tal como cantidades de ARNm transcrito. También, cuando solamente se conoce una actividad funcional, por ejemplo, como en el control del ciclo celular, puede observarse el rendimiento de la función. Sin embargo, los cambios conocidos y medidos en las actividades proteínicas forman los datos de respuesta analizados por los métodos de esta invención. En modalidades alternas y no limitantes, los datos de repuesta pueden formarse de aspectos mixtos del estado biológico de una celda. Los datos de respuesta pueden construirse a partir de, por ejemplo, cambios en algunas abundancias de ARNm , cambios en algunas abundancias proteínicas y cambios en algunas actividades proteínicas. El siguiente Ejemplo se presenta con objeto de ilustrar más plenamente las modalidades preferidas de la invención. Este Ejemplo no debe interpretarse como limitante al alcance de la invención, definido por las reivindicaciones anexas.

Ejemplo Comparación de Aliskiren con placebo e Irbesartan en pacientes con hipertensión arterial leve a moderada. Introducción y resumen. Se realizó un análisis farmacogenético retrospectivo en un intento por evaluar la asociación potencial entre la variación genética y el resultado cl ínico en una prueba cl ínica. Específicamente, se examinaron 48 polimorfismos en 1 2 genes derivados del sistema de renina-angiotensina-aldosterona (RAS) o incluidos con anterioridad en la regulación de la presión arterial. Las asociaciones significativas se observaron entre un polimorfismo en el gen de la enzima conversiva de angiotensina (ACE), dos polimorfismos en el gen receptor de la angiotensina I I tipo 2 (AGTR2), y parámetros clínicos de la disminución de la presión arterial diastólica y sistólica promedio en sedentación. Estos efectos no se encontraron en el tratamiento de irbesartan y placebo, sino que fueron más específicos al tratamiento de aliskiren en este análisis. La prueba clínica. Se diseñó una prueba cl ínica de grupo paralelo, de enmascaramiento doble, aleatorizada y multicéntrica para explorar la eficacia y seguridad del aliskiren en comparación con un placebo en una población de pacientes hipertensos leve a moderado. El tratamiento duró ocho semanas, es decir, el término de la prueba clínica fue ocho semanas después de la prueba particular. El objetivo principal de la prueba fue determinar los efectos de disminución de la presión arterial del aliskiren de 1 50 mg, aliskiren 300 mg , y el aliskiren 600 mg en comparación con 1 50 mg de irbesartan y placebo en pacientes con hipertensión esencial de leve a moderada. Las características demográficas generalmente fueron comparables en los grupos de tratamiento. La mayoría de los pacientes fueron caucásicos y menores a 65 años de edad, con una edad promedia ubicada a la mitad de los 50's. La distribución general de hombres y mujeres fue uniforme. La variable de eficacia primaria analizada fue el cambio de MSDBP (reducción en la MSDBP desde el inicio del estudio). Las variables de eficacia secundaria analizadas fueron el cambio de MSSBP (reducción en la MSSBP desde el inicio del estudio), relación de pacientes que responden al tratamiento, reducción de la actividad de renina de plasma (PRA) e incremento de la renina de plasma activo (AREN - active plasma renin) desde el inicio del estudio. Respecto a la eficacia primaria, las comparaciones par a par demostraron que todas las dosis de tratamiento activo fueron estad ísticamente superiores al placebo al reducir la presión arterial diastólica promedio de sedentación (MSDBP) al término del estudio y en la semana 8 en la población destinada a tratarse ( ITT - intend-to-treat), y al término del estudio en la población por protocolo. Se lograron reducciones similares de MSDBP con aliskiren de 1 50 mg e irbesartan 1 50 mg . El aliskiren de 300 mg y de 600 mg produjo las reducciones más grandes, pero no se observaron reducciones mayores con la dosis de 600 mg . Respecto a la eficacia secundaria, para la presión arterial sistólica promedio de sedentación (MSSBP), todas las dosis de tratamiento activo fueron estadísticamente superiores al placebo al término del estudio. En la semana 8, el aliskiren de 300 mg y el de 600 mg fueron estad ísticamente superiores al placebo e irbesartan al término del estudio. Se alcanzaron reducciones similares en la MSSBP con el aliskiren de 1 50 mg y el irbesartan de 1 50 mg. El aliskiren de 300 y de 600 mg produjo las reducciones más grandes, pero no se observaron reducciones mayores con la dosis de 600 mg. Para la proporción de pacientes que respondieron exitosamente al tratamiento (definido como una MSDBP < 90 mm de Hg o una reducción > 10 mm de Hg desde el inicio del estudio; o una MSSBP < 140 mm de Hg o una reducción > 20 mm de Hg desde el inicio del estudio) se demostró que todos los tratamientos activos fueron estad ísticamente superiores al placebo al término del estudio. Los resultados de la MSDBP para la población ITT al término del estudio fueron de 59-67% de pacientes que respondieron al tratamiento contra 56% para irbesartan y 38% para placebo. Los resultados de MSSBP para la población de ITT al término del estudio fueron de 57-68% de pacientes que respondieron al estudio para los grupos de aliskiren contra 59% para irbesartan y 36% para placebo. En la población de ITT, se observaron incrementos promedio relacionados con la dosis en la renina activa en los grupos aliskiren (20.8, 29.9 y 93.6 mu/mL para el aliskiren de 1 50, 300 y 600 mg , respectivamente). El aliskiren de 1 50 mg produjo un mayor incremento del promedio en la renina que en el irbesartan de 150 mg (1 1 .2 mu/mL). Esto es consistente con el mecanismo de acción para los inhibidores de renina. Los pacientes que participan en la prueba clínica fueron consultados a fin de proporcionar una autorización por separado para la participación en el análisis farmacogenético. Se recogieron las muestras sangu íneas derivadas de todos los pacientes que dieron su autorización en los sitios de prueba individuales y después se le enviaron a Covance ( Indianápolis, IN, EUA). El ADN genómico de cada paciente se extrajo de la sangre por Covance utilizando el Equipo de Aislamiento de ADN PU REGENE™ D-50 K) (Gentra, Minneapolis, EUA). En último término, se genotipificaron 51 1 pacientes, con proporciones aproximadamente iguales de cada brazo de tratamiento. Análisis y diseño farmacogenéticos objetivos. El análisis farmacogenético retrospectivo se realizó en todos los pacientes que dieron su autorización para proporcionar muestras para la investigación farmacogenética. La meta primaria fue identificar las asociaciones entre variación genética y las variaciones en la eficacia del tratamiento con aliskiren, evaluado en primer término por MSDBP y en segundo término por MSSBP y la relación de pacientes que responden al tratamiento. Se utilizó un planteamiento genético candidato para seleccionar 48 polimorfismos en 12 genes del sistema de angiotensina de renina (RAS) o asociado con anterioridad con la regulación de la presión arterial (Tabla 1 ). Todas las muestras disponibles se genotipificaron para cada SNP. Después se realizaron estudios de asociación como se describe a continuación.

TABLA 1 Genes candidatos seleccionados para el análisis farmacogenéticos.

Símbolo del gen Nombre del gen RENBP proteína de unión de renina REN renina ACE enzima conversiva de angiotensina I (peptidil-dipeptidasa A) 1 ACE2 enzima conversiva de angiotensina I (peptidil-dipeptidasa A) 2 AGT angiotensinógeno AGTR1 receptor de angiotensina I I, tipo 1 AGTR2 receptor de angiotensina I I , tipo 2 ABCC2/MRP2 cásete de unión de ATP, sub-familia C (CFTR/MRP), miembro 2 AGTRAP Proteína asociada con el receptor de angiotensina I I CYP1 1 B2 citocroma P450, familia 1 1 , subfamilia B, polipéptido 2, sintasa de aldosterona TGFB1 factor de crecimiento transformador, beta 1 NOS3/eNOS Sintasa 3 de óxido n ítrico (célula endotelial) Genotipificación. Se diseñaron pruebas de polimorfismo de nucleótido individual (SNP) utilizando información proveniente de la base de datos dbSNP pública y la base de datos propietaria de Celera/ABI . Se generaron los conjuntos de sonda resultantes para la prueba de genotipificación para la plataforma Assays-by-Design® de ABI . Livak KJ , Marmaro J , & Todd JA, Nature Genetics 9: 341 -2 ( 1995). Se realizó la genotipificación en 10 ng de ADN genómico de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La lista de polimorfismos genotipificados en este análisis, incluyendo el código de lugar interno de CPG, gen, trayectoria, referencia de la base de datos y efecto, se determina en la Tabla 2.

TABLA 2A Polimorfi smos genotioificados Id locus Pg Gen número rs Descripción 5284 ABCC2 hCV1 1305436 intrónico 4786 ABCC2 rs2273697 A>G I41 7V 4783 ABCC2 rs2756104 intrónico 4784 ABCC2 rs2756109 Intrónico 4785 ABCC2 rs3740066 T>C 11 3241 4782 ABCC2 rs71 7620 no traducido A>G 4797 ABCC2 rs818771 0 Y1 51 5C 5286 ACE hCV1247681 intrónico 4766 ACE rs4293 intrónico 4769 ACE rs431 7 C>T P32S 4767 ACE rs4329 intrónico 4768 ACE rs4362 C>T F1 129F 400 ACE rs4364 A>C S712R 1345 ACE ins/del 4746 ACE2 rs2285666 intrónico 1669 ACE2 rs879922 intrónico 4773 AGT rs1926723 intrónico 1667 AGT rs4762 T>C M207T 2 AGT rs699 C>T T268M 4772 AGT rs943580 genómico 4796 AGTR1 rs2638362 intrónico 4780 AGTR1 rs3772616 intrónico 41 1 AGTR1 rs5182 C>T L191 L TABLA 2B Polimorfismos genotipificados Id locus Pg Gen número rs Descripción 5287 AGTR2 hCV1841569 1445 AGTR2 rs1403543 no traducido 186 AGTR2 rs5193 no traducido 4795 AGTR2-LD rs4497127 genómico 5288 AGTRAP hCV516817 intrónico 4787 AGTRAP rs4073574 genómico 4789 CYP11B2 rs4539 G>A R173K 575 CYP11B2 rs4544 C>T T339I 4788 CYP11B2 rs4545 intrónico 3541 CYP11B2 rs6431 intrónico 4792 NOS3 rs1007311 intrónico 482 NOS3 rs1799983 G>T E298D 4791 NOS3 rs1800779 genómico 4464 NOS3 rs1800780 intrónico 4793 NOS3 rs891512 intrónico 5292 REN rs11571092 intrónico 1513 REN rs1464816 intrónico 4771 REN rs3730103 intrónico 4794 REN rs6704321 C>G P403A 4770 RENBP rs2269371 G>A G274D 2407 RENBP rs2269372 intrónico 1676 RENBP rs762656 genómico 5282 TGFB1 hCV11707868 intrónico 4790 TGFB1 rs2241717 intrónico 4798 TGFB1 rs8105161 intrónico Análisis estadístico. Se realizaron estudios de asociación genotipo-fenotipo y los análisis relacionados en SAS (Cary, NC, EUA) utilizando Analyst®. Las pruebas de asociación utilizaron genotipos categóricos como variable independiente, sin suposiciones acerca de la dominancia, y las diversas variables de eficacia como variables dependientes. Las pruebas de variables dependientes continuas utilizaron un análisis ANCOVA, y la regresión log ística se utilizó para variables dependientes categóricas. Las covariables en el análisis de asociación genotipo-fenotipo fueron: tratamiento, región de prueba y medición al inicio del estudio. El análisis ANCOVA se repitió con el mismo modelo para cada grupo de tratamiento. Además, se analizó el porcentaje de pacientes que responden al tratamiento por medio de un modelo de regresión log ística con tratamiento y región como factores y el inicio del estudio como covariable. Las asociaciones con p<0.05 en todo el conjunto de datos se consideraron significativas. Enzima conversiva de angiotensina (ACE). El Ang I se convierte en el octapéptido activo Ang I I por la enzima conversiva de angiotensina (ACE). El SNP_4769 se genotipificó en los pacientes junto con otros seis polimorfismos en esta enzima crítica en el RAS. Se observó una asociación significativa entre el SNP_4769 y la variable de eficacia primaria de reducción de MSDBP desde el inicio del estudio (p=0.0058), y con la variable secundaria de la relación de pacientes que responden al estudio (p=0.001 ). Para la otra variable secundaria de reducción de MSSBP desde el inicio del estudio, no hubo asociación significativa sino solamente la misma tendencia observada (p=0.0745). Cuando el análisis ANCOVA se repitió para cada grupo de tratamiento, la asociación solamente se detectó para los grupos tratados con aliskiren, pero no el ibesartan o los grupos placebo. No se encontró ninguna asociación significativa entre los SNPs y los parámetros secundarios de actividad de renina plasma (PRA) y la renina activa (AREN). Los efectos específicos de aliskiren se observan en la Tabla 3.

TABLA 3 Efecto de las variaciones de ACE v AGTR2 sobre el MSDBP. MSSBP v la relación de pacientes gue responden al tratamiento en los grupos tratados con aliskiren SNP 4769 SNP 1445 SNP 4795 TT CT CC AA AG GG GG GA AA n 278 14 0 106 69 118 106 72 115 Reducción de -11.1 -4.7 ND -11.2 -13.2 -9.3 -11.1 -13.3 -9.0 MSDBP (mm de Hg) P 0.0058* 0.0074* 0.0022* Reducción de -13.7 -6.2 ND -13.9 -15.7 -11.8 -13.6 -16.3 -11.5 MSSBP P 0.0384* 0.1360 0.0479* Relación de 69% 14% ND 74% 71% 58% 74% 73% 56% pacientes que responden al tratamiento P 0.0024* 0.1399 0.0382* El SNP_4769 es un SNP de codificación que cambia la secuencia de aminoácidos de prolina a serina en el codón 32 en la enzima ACE. El polimorfismo de l/D de ACE (presencia o ausencia de una secuencia de repetición Alu de 287 bp en el intrón 16) se ha asociado con la regulación del nivel y actividad de ACE y sus ramificaciones en el RAS. Rigat B ef al., J. Clin. Invest. 86(4): 1343-6 ( 1 990). Receptor de angiotensina II, tipo 2 (A G TR2). El AGTR2 codifica el receptor de angiotensina II , tipo I I. El receptor de angiotensina I I tipo I es el destinatario de varios medicamentos antihipertensivos. El Ang I I señala a través de la unión al receptor de tipo I para inducir el incremento de la vasoconstricción y la presión arterial. El receptor de angiotensina I I de tipo I I ha demostrado inhibir la actividad de ACE y atenuar las acciones mediadas con el receptor de tipo I , ocasionando consecuentemente la vasodilatación. Hunley TE ef al., Kidney Int. 57(2): 570-7 (2000); Ichiki T et al., Nature 377(6551 ): 748-50 ( 1 995). Se observó una asociación significativa entre los SNPs de AGTR2 desde el inicio del estudio (p=0.0078 y 0.0004, respectivamente). El SNP_4795 demostró también una asociación significativa con la variable secundaria de la reducción de MSSBP desde el inicio del estudio (p=0.0245), pero no con el otro parámetro secundario de la relación de pacientes que responden al tratamiento. Mientras tanto, el SNP_1445 no mostró una asociación significativa con los parámetros secundarios. No se encontró asociación significativa entre ningún SNP y los parámetros secundarios de actividad de renina de plasma (PRA) y renina activa (AREN). Cuando se repitió el análisis ANCOVA para cada grupo de tratamiento, la asociación solamente detectó los grupos tratados con aliskiren, pero no el ibesartan o los grupos placebo. Los efectos de genotipo en los pacientes tratados con aliskiren se muestran arriba en la Tabla 3. Estos dos SNPs son no codificantes. El SNP_1445 se encuentra en la región no traducida del gen AGTR2, y el SNP_4795 proviene de la región genómica con desequilibrio de enlace al gen AGTR2. Descripción. En resumen, una variante en el gen ACE y dos SNPs en el gen AGTR2 mostraron una asociación significativa con el parámetro primario MSDBP. La variante de ACE y una de las variantes de AGTR2 demostraron también una asociación significativa con los parámetros secundarios de MSSBP y la relación de pacientes que responden al tratamiento. La segunda variante AGTR2 no mostró una asociación significativa , sino solamente la misma tendencia a los parámetros secundarios. Este efecto de genotipo se observó solamente en los grupos tratados con aliskiren, pero no en los grupos de ibesartan o placebo. Por lo tanto, el efecto descrito con anterioridad es un efecto farmacogenético específico al aliskiren. El efecto variante de ACE es particularmente interesante, debido a que la diferencia entre los genotipos TT y CT parece ser bastante dramática (reducción de MSDBP 1 1 .1 contra 4.7 mm de Hg, reducción de MSSBP 1 3.7 contra 6.2 mm de Hg, y la relación de pacientes que responden al tratamiento de 69% contra 14% ). No se observó ningún genotipo homocigótico de CC entre los pacientes, que hace la frecuencia de alelo detectada mucho menor que la frecuencia de alelo reportada del DB de SNP de 0.1 . Cuando se segrega la respuesta de aliskiren por el genotipo, la relación de pacientes que responden al tratamiento para el genotipo de TT se incrementa aproximadamente 70% . La implicación es que este resultado puede ayudar a colocar el aliskiren en el competido mercado antihipertensivo al apoyar la mayor parte de la población general (aproximadamente 80% de acuerdo con la frecuencia de alelo de DB de SNP, pero aún mayor como se observa en este análisis) teniendo una mejor relación de pacientes que responden al tratamiento, como se observa en la Figura 1 . También puede proporcionarse una manera de ayudar a reclutar pacientes que responden potencialmente "mejor" al tratamiento de aliskiren en futuros estudios. Los dos SNPs en el gen AGTR2 son propensos al desequilibrio de acoplamiento. Estos SNPs reportados no observaron asociación con las mediciones al inicio del estudio de MSDBP y MSSBP, sugiriendo siempre que el efecto genético es un efecto farmacogenético relacionado con aliskiren.

Ejemplo I I Análisis farmacogenéticos cl ínicos para la prueba clínica A2203 Introducción y resumen. Un análisis farmacogenético retrospectivo se realizó un intento de evaluar la asociación potencial entre la variación genética y el resultado cl ínico en una prueba cl ínico. Ver el Ejemplo I . Subsecuentemente, se consideraron los resultados de otra prueba clínica (A2203) para el análisis de replicación. Específicamente, examinamos 48 polimorfismos en 12 genes derivados del sistema de renina-angiotensina-aldosterona (RAS) o incluido anteriormente en la regulación de la presión arterial. En el Ejemplo I , se observaron asociaciones significativas entre un polimorfismo en el gen de la enzima conversiva de angiotensina (ACE), dos polimorfismos en el gen receptor de angiotensina I I tipo 2 (AGTR2), y los parámetros cl ínicos de la disminución de la presión arterial diastólica y sistólica promedio en sedentación. Estos efectos no se encontraron con el tratamiento de irbesartan y placebo. Además, para la variante sin detección de ACE (Pro32Ser) asociada con la respuesta reducida, encontramos una frecuencia de alelo C (Pro) mucho mayor en negros que en caucásicos ( 19/1 54 contra 2/790). En este Ejemplo, los cuatro pacientes con el residuo de serina (alelo C) fueron negros. Debido al número extremadamente pequeño de pacientes con alelo C, no pudo realizarse un análisis para este SNP con el mismo modelo que en el Ejemplo I . Además, no se replicaron la asociación de los dos SNPs en AGTR2 encontrados en el Ejemplo I . La prueba clínica en este Ejemplo (A2203) fue un estudio de grupo en paralelo, controlado por placebo, multifactorial, multicéntrico, de enmascaramiento doble y aleatorizada para evaluar la eficacia y seguridad de combinaciones de aliskiren y valsartan en comparación con sus monoterapias componentes y la combinación de valsartan e hidroclorotiazida (HCTZ) en pacientes hipertensos. Los objetivos primarios de este Ejemplo fueron evaluar los efectos de la disminución de la presión arterial de la combinación de aliskiren y valsartan (75/80 mg , 1 50/160 mg y 300/320 mg) en comparación con sus monoterapias componentes administradas durante 6 semanas en pacientes con presión arterial cl ínica diastólica promedio de sedentación ([MSDBP] = 95 mm de Hg y < 1 1 0 mm de Hg) y evaluar los efectos de la disminución de la presión arterial del aliskiren de 75 mg, 1 50 mg y 300 mg administrado solo contra el placebo administrado durante 6 semanas en pacientes con presión arterial diastólica promedio de sedentación ([MSDBP] > 95 mm de Hg y < 1 1 0 mm de Hg). Los grupos de tratamiento generalmente fueron comparables en cuanto a características demográficas y al inicio del estudio, con una edad promedio de 56 años, el 56% hombres y 6.8% negros. La variable del efecto primario, cambio desde el inicio del estudio en MSDBP para la monoterapia de aliskiren contra placebo fue estadísticamente significativa para el grupo de aliskiren de 300 mg. La magnitud general de la disminución de la presión arterial para ambos monoterapias fue consistente con la observada en estudios anteriores. Sin embargo, la magnitud del efecto de placebo fue mayor q ue la esperada y mayor que la observada en los estudios de aliskiren anteriores. La disminución de la presión arterial con la combinación del aliskiren y valsartan fue menor que la observada con la hidroclorotiazida (HCTZ) 12.5 mg/valsartan, y la actividad fue menor con la dosis máxima de aliskiren de 300 mg/valsartan 320 mg que con concentraciones menores de resistencia. Objetivos de análisis farmacogenéticos. El análisis farmacogenético retrospectiva se realizó en todos los pacientes que dieron su autorización para proporcionar las muestras para la investigación farmacogenética. La meta primaria fue identificar las asociaciones entre la variación genética y las variaciones en la eficacia del tratamiento con aliskiren, evaluadas básicamente por MSDBP y en segundo término por MSSBP y la relación de pacientes que responden al tratamiento. Se utilizó un planteamiento de gen candidato para seleccionar 48 polimorfismos en 1 2 genes derivados del RAS o asociados con anterioridad con la regulación de la presión arterial (Tabla 4). Todas las muestras disponibles se genotipificaron para cada SNP. Los estudios de asociación se realizaron después como se describe en el Ejemplo I .

TABLA 4 Genes candidatos seleccionados para análisis farmacogenéticos Símbolo del gen Nombre del gen RENBP proteína de unión de renina REN renina ACE enzima conversiva de angiotensina I (peptidil- dipeptidasa A) 1 ACE2 enzima conversiva de angiotensina I (peptidil- dipeptidasa A) 2 AGT angiotensinógeno AGTR1 receptor de angiotensina I I , tipo 1 AGTR2 receptor de angiotensina I I , tipo 2 ABCC2/MRP2 cásete de unión de ATP, sub-familia C (CFTR/MRP), miembro 2 AQTRAP proteína asociada al receptor de angiotensina I I CYP1 1 B2 citocromo P450, familia 1 1 , subfamilia B, polipéptido 2, sintasa de aldosterona TGFB1 factor de crecimiento de transformación, beta 1 NOS3/eNOS sintasa 3 de óxido n ítrico (célula endotelial)) Muestras. A los pacientes que participan en la prueba clínica A2201 (ver el Ejemplo I ) y la prueba clínica A2203 se les solicitó proporcionar su autorización por separado para la participación en el análisis farmacogenético. Se recogieron muestras sangu íneas de todos los pacientes que dieron su autorización en los sitios de prueba individual y después se enviaron a Covance (Indianápolis, IN). El ADN genómico de cada paciente se extrajo de la sangre por Covance utilizando el Equipo de Aislamiento de ADN de PUREGENE ™ (D-50K), (Gentra, Minneapolis, MN) y se enviaron a NIBR para genotipificar. En último término, se genotipificaron 51 1 pacientes de la prueba clínica en el Ejemplo I (A2201 ), con relaciones aproximadamente iguales de cada rama de tratamiento. Se genotipificaron seiscientos ochenta y cuatro pacientes de A2203, con una proporción de 3: 1 en los pacientes en placebo y ramas de monoterapia de aliskiren a otras ramas del tratamiento. La variable de eficacia primaria fue un cambio de la MSDBP (reducción en la MSDBP desde el inicio del estudio hasta el final del estudio). Las variables de eficacia secundaria son el cambio de MSSBP (reducción en la MSSBP desde el inicio del estudio hasta el final del estudio), relación de pacientes que responden al tratamiento, reducción de la actividad de renina de plasma (PRA) e incremento de la renina de plasma activa (AREN) desde el inicio del estudio. Genotipificar. Se diseñaron pruebas de SNP utilizando información derivada de la base de datos de dbSNP y la base de datos propietaria de Celera/ABI . Los conjuntos de sondas resultantes para la prueba de genotipificación se generaron para la plataforma Assays-by-Design® de ABI . Lívak KJ ef al., Nat. Genet. 9: 341 -2 ( 1 995). La genotipificación se realizó en 1 0 ng de ADN genómico de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Polimorfismos genotipificados. La lista de polimorfismos genotipificados en este estudio, incluyendo el código de lugar, gen, referencia de base de datos y efecto, se determina en la Tabla 5. TABLA 5 Polimorfismos qenotipificados id luaar oa gen número rs Descripción 5284 ABCC2 hCV1 1 305436 intrónico 4786 ABCC2 rs2273697 A>G I417V 4783 ABCC2 rs2756104 intrónico 4784 ABCC2 rs27561 09 intrónico 4785 ABCC2 rs3740066 T>C 11 3241 4782 ABCC2 rs71 7620 no traducido 4797 ABCC2 rs8187710 A>G Y1 51 5C 5286 ACE hCV1247681 intrónico 4766 ACE rs4293 intrónico 4769 ACE rs431 7 C>T P32S 4767 ACE rs4329 intrónico 4768 ACE rs4362 OT F1 129F 400 ACE rs4364 A>C S712R 1 345 ACE ins/del 4746 ACE2 rs2285666 intrónico 1669 ACE2 rs879922 intrónico 4773 AGT rs1926723 intrónico 1667 AGT rs4762 T>C M207T 2 AGT rs699 C>T T268M id lugar pg qen número rs Descripción 4772 AGT rs943580 genómico 4796 AGTR1 rs2638362 intrónico 4780 AGTR1 rs3772616 intrónico 411 AGTR1 rs5182 OT L191L 5287 AGTR2 hCV1841569 1445 AGTR2 rs1403543 no traducido 186 AGTR2 rs5193 no traducido 4795 AGTR2-LD rs4497127 genómico 5288 AGTRAP hCV516817 intrónico 4787 AGTRAP rs4073574 genómico 4789 CYP11B2 rs4539 G>A R173K 575 CYP11B2 rs4544 OT T339I 4788 CYP11B2 rs4545 A>G S435G 3541 CYP11B2 rs6431 intrónico 4792 NOS3 rs1007311 intrónico 482 NOS3 rs1799983 G>T E298D 4791 NOS3 rs1800779 genómico 4464 NOS3 rs1800780 intrónico 4793 NOS3 rs891512 intrónico 5292 REN rs11571092 intrónico 1513 REN rs1464816 intrónico 4771 REN rs3730103 intrónico id lugar pg qen numero rs Descripción 4794 REN rs6704321 C>G P403A 4770 RENBP rs2269371 G>A G272D 2407 RENBP rs2269372 intrónico 1676 RENBP rs762656 genómico 5285 TGFB1 hCV1 1 707868 intrónico 4790 TGFB1 rs2241 71 7 intrónico 4798 TGFB 1 rs8105161 intrónico Análisis estadístico. Los estudios de asociación de genotipo-fenotipo y los análisis relacionados se realizaron en SAS (Cary, Carolina del Norte) utilizando Analyst. Las pruebas de asociación utilizaron genotipos categóricos como variable independiente, sin suposiciones acerca de la dominancia, y las diversas variables de eficacia como variables dependientes. Las pruebas de variables dependientes continuas utilizaron un análisis ANCOVA, y la regresión log ística se utilizó para variables dependientes categóricas. Observe que ninguno de los resultados se ha ajustado para múltiples pruebas de hipótesis. Se utilizó un umbral de p < 0.05 para definir asociaciones sugestivas. Las covariables en el análisis de asociación de genotipo-fenotipo fueron: ( 1 ) el nivel de dosificación de tratamiento; (2) región de prueba codificada como STU 1 A en A2201 (ver el Ejemplo 1 ) o Región en A2203; (3) medición al inicio del estudio de MSDBP y MSSBP; y (4) raza. El análisis se realizó en todas las muestras a partir de las tres ramas tratadas con aliskiren primeramente. Cuando se observaron las asociaciones sugerentes, se realizó el mismo análisis en las ramas de irbesartan y placebo.

TABLA 6 Características demográficas y de MSDBP al inicio del estudio de pacientes genotipificados (media±SE) A2201 (ver el Eiemplo I) A2203 (este Ejemplo) Tratmto. N= BMI Edad Inicio del Tratmto. N= Edad Inicio estudio del MSDBP estudio MSDBP Aliskiren 99 31.01 54.15C 98.76 ± Aliskiren 102 54.73 98.69 ± 150 mg ± 0.67 1.30 0.34 75 mg ± 1.37 0.28 Aliskiren 96 30.79 55.93 99.16 ± Aliskiren 115 55.83 99.47 ± 300 mg ± 0.58 ± 1.03 0.36 150 mg ± 1.18 0.35 Aliskiren 101 30.53 55.97 98.90 ± Aliskiren 102 57.09 99.26 ± 600 mg ± 0.65 ± 1.08 0.38 300 mg ± 1.22 0.34 Irbesartan 99 31.81 56.66 99.41 ± Valsartan 39 58.08 99.30 ± 150 mg ± 0.72 ± 1.21 0.40 80 mg ± 1.77 0.61 Placebo 103 30.65 58.21 98.89 ± Valsartan 33 53.45 98.87 ± ± 0.60 ± 1.15 0.33 160 mg ± 2.15 0.69 Valsartan 34 55.50 99.16 + 320 mg ± 1.65 0.57 Aliskiren 75 mg y 35 55.43 99.73 ± Valsartan 80 mg ± 1.95 0.64 Aliskiren 150 mg y 34 56.26 99.32 ± Valsartan 160 mg ± 1.94 0.61 Aliskiren 300 mg y 41 57.10 98.82 ± Valsartan 320 mg ± 1.86 0.46 Aliskiren 160 mg y 41 55.41 98.83 ± HCTZ 12.5 mg ± 1.93 0.55 Placebo 108 55.80 98.86 ± ± 1.24 0.29 ACE. El SNP 4769 se genotipificó en los pacientes junto con otros seis polimorfismos en esta enzima crítica en el RAS. Se observó una asociación significativa entre el SNP 4769 y la variable de eficacia primaria, la reducción de la MSDBP desde el inicio del estudio (p=0.023), y con la variable secundaria, tasa de paciente con respuesta al tratamiento (p=0.0048). Para la otra variable secundaria, la reducción de la MSSBP desde el inicio del estudio, no hubo asociación significativa sino solamente la misma tendencia observada (p=0.14). Cuando se repitió el análisis ANCOVA con el mismo modelo para cada grupo de tratamiento, solamente se detectó la asociación para los grupos tratados aliskiren, pero no el ibesartan o los grupos placebo. Los efectos específicos de aliskiren se observan en la Tabla 7. No se encontró ninguna asociación significativa entre los SNPs y los parámetros secundarios de actividad de renina de pasma (PRA) y la renina activa (AREN).

Tabla 7 Efecto de variaciones de ACE y AGTR2 sobre la MSDBP. MSSBP v la relación de pacientes que responden al tratamiento en todos los grupos tratados con aliskiren en A2201 (* denota la significativdad. p<0.05) S NP 4769 S N P 1445 S N P 4795 TT CT ce AA AG GG GG GA AA n 278 14 0 106 69 118 106 72 115 LSMEAN de -11.4 -5.6 ND -11.0 -13.3 -9.4 -10.8 -13.4 -9.2 reducción de MSDBP (mm de Hg ) P 0.023* 0.0071* 0.0026* LSMEAN de -11.7 -5.9 ND -11.2 -13.8 -9.8 -10.8 -14.2 -9.5 reducción de MSSBP (mm de Hg) P 0.14 0.13 0.046* Relación de 70% 14% ND 75% 71% 58% 75% 74% 57% pacientes que responden al tratamiento P 0.0048* 0.17 0.060 El SNP_4769 es un SNP de codificación que cambia la secuencia de aminoácidos de prolina a serina en el codón 32 en las isoformas 2 y 3 de la enzima ACE. El polimorfismo de ACE l/D (presencia o ausencia de una secuencia de repetición Alu de 287 bp en el intrón 16) se ha asociado con la regulación del nivel de ACE y la actividad y sus ramificaciones en el RAS. Rigat B ef al., J. Clin. Invest. 86(4): 1 343-6 ( 1 990). Probamos la ACE l/D en este ejercicio y no se observó ninguna asociación a la respuesta al aliskiren. El SNP_4769 se encuentra ubicado en el 12° intrón de la codificación del gen ACE para la isoforma somática, y su ubicación en el primer exón de la codificación genética para las isoformas segunda y tercera. La ACE l/D se encuentra ubicada en el 16° intrón , el cual se encuentra en el mismo bloq ue de desequilibrio de acoplamiento que el SNP_4769 en poblaciones caucásicas, africanas, americanas y chinas caracterizadas (SNPbrowser, Applied Biosystems, Foster City, California). A GTR2. Se ha demostrado que el receptor de angiotensina I I tipo I I inhibe la actividad de ACE y atenúa las acciones mediadas por el receptor de tipo I , ocasionando así la vasodilatación. Ichiki T ef al. , Nature 377 (6551 ):748-50 ( 1995); Hunley TE et al. , Kidney Int. 57(2):570-7 (2000). Se observó una asociación significativa entre los SNPs 1445 y 4795 y la variable de eficacia primaria, la reducción de la MSDBP desde el inicio del estudio (p=0.0071 y 0.0026, respectivamente). El SNP_4795 demostró una asociación significativa con la variable secundaria, la reducción de la MSSBP desde el inicio del estudio (p=0.046), pero no con el otro parámetro secundario, tasa de pacientes que responden al tratamiento. Mientras tanto, el SNP 1445 no se observó una asociación significativa con los parámetros secundarios. No se encontró asociación significativa entre ningún SNP y los parámetros secundarios PRA y AREN. Cuando el análisis ANCOVA se repitió con el mismo modelo para cada grupo de tratamiento, se detectó la asociación solamente para los grupos tratados con aliskiren, pero no los grupos ibesartan o placebo. Los efectos del genotipo en los pacientes tratados con aliskiren se muestran con anterioridad en la Tabla 7. Cuando se intenta replicar las asociaciones observadas con estos dos SNPs en A2203 en las ramas tratadas con aliskiren, los resultados no se replicaron (p>0.05). Tampoco se observó la tendencia de asociación. En el resumen preeliminar de resultados del estudio clínico, debido a una respuesta al placebo mayor que la anterior (8.6 mm de Hg), la respuesta a la dosis y magnitud de los efectos sin placebo para el tratamiento de aliskiren fue menor a lo esperado. Esta inconsistencia podría haber contribuido, al menos parcialmente, a la falta de replicación de la asociación de AGTR2. Estos dos SNPs son no codificantes. El SNP 1445 se encuentra en la región no traducida del gen AGTR2, y el SNP_4795 proviene de la región genómica con el desequilibrio de acoplamiento al gen AGTR2. Al menos en chinos, estos dos SNPs se encuentran en el mismo bloque de desequilibrio de acoplamiento (SNPbrowser, Applied Biosystems, Foster City, Calif. ). Descripción. Este análisis identificó polimorfismos en dos genes con asociaciones significativas con variables de resultado clínico en el estudio A22201 (ver el Ejemplo 1 ). Una variante en el gen ACE y dos SNPs en el gen AGTR2 mostraron asociación significativa con el parámetro primario MSDBP. La variante de ACE y una de las variantes de AGTR2 también presentó asociación significativa con los parámetros secundarios de MSSBP y relación de pacientes que responden al tratamiento. La segunda variante de AGTR2 no mostró asociación significativa sino solamente la misma tendencia a los parámetros secundarios. Este efecto genotípico solamente se observó en los grupos tratados con aliskiren, pero no en los grupos ibesartan o placebo. Por lo tanto, el efecto descrito con anterioridad sugiere que es un efecto farmacogenético específico al aliskiren. El efecto de la variante ACE Pro32Ser es particularmente interesante, dado que la diferencia entre los genotipos TT y CT parece ser bastante dramática (reducción de la MSDBP de 1 1 .4 contra 5.6 de mm de Hg. , reducción de MSSBP de 1 1 .7 contra 5.9 mm de Hg . , y la relación de pacientes que responden al tratamiento de 70% contra 1 4%). Sin embargo, no se observó ningún genotipo homocigótico de CC entre todos los pacientes. Esto hace a la frecuencia de alelo detectada mucho menor que la frecuencia de alelo reportada de DB de SNP de 01 , y el número general de pacientes con el genotipo de CT en el costado muy pequeño. Encontramos una frecuencia de alelo C mucho más alta en negros que en caucásicos ( 1 9/1 54 contra 2/790). En A2203, los 4 pacientes con el residuo de serina (alelo C) fueron negros. Debido al número extremadamente pequeño de pacientes con el alelo C, el análisis A2203 podría no llevarse a cabo con el mismo modelo. Los polimorfismos de Ace y su influencia sobre la concentración de plasma de enzima ACE y la presión arterial se han observado mayoritariamente en poblaciones africanas y afroamericanas. Bouzekri N eí al., Eur. J. Hum. Genet. 1 2(6):460-8 (2004); Cox R eí al., Hum. Mol. Genet. 1 1 (23):2969-77 (2002); Zhu X et al., Am. J. Hum.

Genet. 68(5): 1 1 39-48 (2001 ). La observación de una frecuencia de alelo más alta del SNP_4769 en el gen ACE en pacientes negros derivada de los dos estudios de SPP100 garantiza una investigación adicional de la influencia funcional que puede tener este polimorfismo sobre el nivel o actividad de ACE. Además, se especula que el cambio de aminoácido en el codón 32 en la prueba es la isoforma de la enzima. Cuando se segrega la respuesta de aliskiren por genotipo, la relación de pacientes que responden al tratamiento para el genotipo de TT se incrementa hasta aproximadamente 70%. La implicación es que este resultado puede ayudar a colocar el medicamento en el competido mercado de antihipertensivos al seleccionar como destinatario a la mayoría de la población general (aproximadamente 80% de acuerdo con la frecuencia de alelo de DB de SNP, puede incluso ser más alta que lo observado en este estudio) que tiene el genotipo de TT asociado con la mejore relación de pacientes que responden al tratamiento, como se observa en la Figura 2. También puede proporcionar una manera de ayudar a reclutar potencialmente pacientes que responden "mejor" al tratamiento con aliskiren en futuros estudios. Los dos SNPs en el gen AGTR2 son muy propensos al desequilibrio de acoplamiento, dado que la región cromosómica alrededor de este lugar es principalmente un bloque de desequilibrio de acoplamiento. La función de la señalización de Ang II mediante el receptor de tipo I I se ha estudiado menos en comparación con el receptor de tipo I . Este descubrimiento puede sugerir además la intervención de AGTR2 en función de Ang I I en la regulación de la presión arterial corriente debajo de la inhibición de renina. Estos SNPs reportados no mostraron asociación con las mediciones al inicio del estudio de MSDBP y MSSBP. Esto sugiere que el efecto genético es un efecto farmacogenético relacionado con aliskiren.

Equivalentes Los detalles de una o más modalidades de la invención se exponen en la descripción anexa descrita con anterioridad . Aunque algunos métodos y materiales similares o equivalentes a aq uellos descritos en la presente pueden utilizarse en la práctica o prueba de la presente invención, se describen ahora los métodos y materiales preferidos. Otras características, objetos, y ventajas de la invención serán aparentes a partir de la descripción y las reivindicaciones. En la especificación y reivindicaciones anexas, las formas singulares incluyen referentes plurales a menos que el contexto se establezca claramente de otra manera . A menos que se define de otra manera, todos los términos técnicos y científicos utilizados en la presente tienen el mismo significado que el comprendido comúnmente por el experto en la materia a la cual pertenece esta invención. Todas las referencias citadas en la presente se incorporan en la presente para referencia en su totalidad y para todo propósito al mismo alcance que si cada publicación individual, patente, o solicitud de patente se indicase específicamente e individualmente para incorporarse por referencia en su totalidad para todo propósito.

La presente invención no se encuentra limitada en términos de las modalidades particulares descritas en esta solicitud, los cuales pretenden ser ilustraciones individuales de aspectos individuales de la invención. Pueden realizarse muchas modificaciones y variaciones de esta invención sin aislarse del espíritu y alcance, como será aparente para aquellos expertos en la materia. Los métodos y aparatos funcionalmente equivalentes dentro del alcance de la invención, además de aquellos enumerados en la presente, serán aparentes para aquellos expertos en la materia a partir de las descripciones anteriores. Tales modificaciones y variaciones pretenden ubicarse dentro del alcance de las reivindicaciones anexas. La presente invención se encuentra limitada solamente por los términos de las reivindicaciones anexas, junto con el alcance total de los equivalentes a los cuales comprenden tales reivindicaciones.

Claims (10)

REIVI NDICACIONES

1 . El uso de aliskiren en la elaboración de un medicamento para el tratamiento de la hipertensión en una población de pacientes seleccionados, donde la población de pacientes se selecciona en base a los polimorfismos genéticos en los genes de biomarcador presentes en el paciente, donde los polimorfismos genéticos son indicativos de la eficacia del aliskiren para tratar la hipertensión .

2. El uso según la reivindicación 1 , donde los polimorfismos genéticos se seleccionan a partir del grupo consistente en SNP_4769 en el gen de la enzima conversiva de angiotensina (ACE); el SNP_1445 en el gen receptor de angiotensina I I , tipo 2 (AGTR2); el SNP_4795 en el gen AGTR2; y combinaciones de los mismos.

3. Un método para determinar la capacidad de respuesta de una persona con hipertensión al tratamiento con un agente hipertensivo, que comprende los pasos para: (a) obtener, para las dos copias de los genes presentes en la persona, la identidad de los pares de nucleótidos en uno o más lugares genéticos polimórficos, donde los lugares genéticos se selecciona a partir del grupo que consiste en el gen de la enzima conversiva de angiotensina (ACE), el gen receptor de angiotensina I I de tipo 2 (AGTR2), y combinaciones de los mismos; y (b) asignarle a la persona un grupo "alto" de pacientes que responden al tratamiento si los pares de nucleótidos en los lugares polimórficos indican que la persona es sensible al tratamiento con el agente hipertensivo.

4. El método según la reivindicación 3, donde los polimorfismos genéticos se seleccionan a partir del grupo que consiste en SNP_4769 en el gen de la enzima conversiva de angiotensina (ACE); el SNP_1445 en el gen receptor de la angiotensina I I , tipo 2 (AGTR2); el SNP 4795 en el gen AGTR2; y las combinaciones de los mismos.

5. El método según la reivindicación 3, donde el agente antihipertensivo es aliskiren.

6. Un método para tratar hipertensión en una persona, que comprende los pasos para: (a) obtener, para las dos copias de genes presentes en la persona, la identidad de un par de nucleótidos en uno o más lugares genéticos polimórficos, donde los lugares genéticos se seleccionan a partir del grupo que consiste en el gen de la enzima conversiva de angiotensina (ACE), el gen receptor de angiotensina I I de tipo 2 (AGTR2), y combinaciones de los mismos; y (b) sea (i) administrar un agente antihipertensivo a la persona si el par de nucleótidos en los lugares polimórficos indica que la persona es sensible al tratamiento con un agente antihipertensivo, o (ii) administrar una terapia alterna a la persona si el par de nucleótidos en los lugares polimórficos indica que la persona no es sensible al tratamiento con un agente hipertensivo.

7. El método según la reivindicación 6, donde los polimorfismos genéticos se seleccionan a partir del grupo que consiste en SNP_4769 en el gen de la enzima conversiva de angíotensina (ACE); el SNP_1 445 en el gen receptor de angiotensina I I , tipo 2 (AGTR2); SNP_4795 en el gen AGTR2; y combinaciones de los mismos.

8. El método según la reivindicación 6, donde el agente hipertensivo es aliskiren.

9. Un método para reducir la presión arterial sistólica promedio de sedentación (MSSBP) en una persona, que comprende los pasos para: (a) obtener, para las dos copias de los genes presentes en la persona, la identidad de un par de nucleótidos en SNP_4795 del gen receptor de angiotensina I I de tipo 2 (AGTR2); y (b) sea (i) administrar un agente antihipertensivo a la persona si el par de nucleótidos en SNP_4795 indica que la persona es sensible al tratamiento con un agente antihipertensivo, o (ii) administrar una terapia alterna a la persona si el par de nucleótidos en el SNP_4795 indica que la persona no es sensible al tratamiento con un agente hipertensivo

10. El método según la reivindicación 9, donde el agente antihipertensivo es aliskiren. 1 1 . Un método para reducir la presión arterial diastólica en una persona, que comprende los pasos para: (a) obtener, para las dos copias de genes presentes en la persona que tiene una presión arterial diastólica con necesidad de una reducción, la identidad de los pares nucleótidos en uno o más lugares genéticos polimórficos, donde los lugares genéticos se seleccionan a partir del grupo que consiste en el gen de la enzima conversiva de angiotensina (ACE), el gen receptor de angiotensina I I de tipo 2 (AGTR2), y combinaciones de los mismos; y (b) sea (i) administrar un agente antihipertensivo a la persona si la identidad de los pares de nucleótidos en uno o más lugares genéticos polimórficos indica que la persona es sensible al tratamiento con un agente antihipertensivo, o (ii) administrar una terapia alterna a la persona si la identidad de los pares de nucleótidos en uno o más lugares genéticos polimórficos indica que la persona no es sensible al tratamiento con un agente hipertensivo. 12. El método según la reivindicación 1 1 , donde el agente antihipertensivo es aliskiren. 1 3. El uso de un producto genético de un gen seleccionado a partir del grupo que consiste en el gen de la enzima conversiva de angiotensina (ACE) y el gen receptor de angiotensina I I de tipo 2 (AGTR2) como destinatario para la actividad del medicamento, donde el uso comprende los pasos para: (a) contactar el medicamento con un primer producto genético codificado por un polinucleótido que tiene un par de nucleótidos en un sitio polimórfico en la región de un gen seleccionado que indica una gran capacidad de respuesta al tratamiento con aliskiren para la hipertensión ; (b) identificar la actividad del medicamento en el primer producto genético; (c) contactar el medicamento con un segundo producto genético cod ificado por un polinucleótido que tiene un par de nucleótidos en un sitio polimórfico en la región del gen seleccionado que indica una baja capacidad de respuesta al tratamiento con aliskiren para la hipertensión; (d) identificar la actividad del medicamento en el segundo producto genético; (e) identificar las similitudes y diferencias entre la actividad identificada en el paso (b) y la actividad identificada en el paso (d).