CN101146915A - 高血压药阿利克仑功效的生物标志物 - Google Patents

Abstract

进行了药物遗传学回顾性分析，试图评估在遗传变异和阿利克仑作为抗高血压剂的效果的临床试验结果间的潜在相关性。在来自肾素－血管紧张素－醛固酮系统(RAS)或以前证明牵涉血压调控的十二个基因中检测了四十八个多态性。在血管紧张素转化酶(ACE)基因中的一个多态性、血管紧张素II二型受体(AGTR2)基因中的两个多态性和平均坐位舒张压和收缩压压降的临床参数间可见显著相关性。在厄贝沙坦和安慰剂治疗中没有发现这些效应，但是却特异于阿利克仑治疗。

Description

高血压药阿利克仑功效的生物标志物

发明领域

本发明一般涉及体外组织样品的分析性测试，并且更具体地涉及指示作为抗高血压剂的阿利克仑(aliskiren)功效的遗传多态性。

发明背景

肾素血管紧张素系统(RAS)在血压和体积动态平衡调节中发挥着重要作用。肾响应于循环体积和血压的降低而分泌肾素，肾素切割底物血管紧张素形成无活性的十肽血管紧张素I(AngI)。AngI由血管紧张素转化酶(ACE)转换成活性八肽AngII。AngII和细胞受体相互作用，诱导血管收缩，并从肾上腺髓质及突触前神经末梢释放儿茶酚胺。它还促进醛固酮分泌及钠的再吸收。此外，AngII抑制肾素释放，从而对系统提供负反馈。因此，AngII在不同水平上(如脉管系统、交感神经系统、肾上腺皮质和髓质)发挥作用，增加血管抗性和血压。

肾素血管紧张素系统(RAS)能够在不同水平上被阻断。因为肾素抑制剂能比ACE抑制剂和AngII拮抗剂在更高水平上阻断RAS，它们对于RAS组分有不同的作用。在施用肾素抑制剂后，AngI和AngII的形成均被阻断。而在ACE抑制后，只有AngII形成被阻断，AngI水平上升。因而AngI还能通过其他通路如糜酶(chymase)系统被转化为AngII和其他血管紧张素肽。

阿利克仑(SPP100)是一种低分子量(609.8)的非肽类抗高血压剂，见Wood JM等，Biochem.Biophys.Res.Commun.308(4)：698-705(2003年9月5日)。作用机制和市场上的其他抗高血压药不同。阿利克仑在最初限速步骤阻断肾素血管紧张素系统(RAS)。在体外，阿利克仑是有效的人肾素抑制剂(IC₅₀＝0.6nM)。在体内，使用钠去除绒猴(marmoset)的几个研究中，口服(p.o.)或静脉内(i.v.)施用阿利克仑均导致了血浆肾素活性(PRA)的完全抑制、平均动脉压(MAP)的持续降低和活性总肾素血浆浓度的显著上升。在人体内，阿利克仑血浆浓度在施用后迅速上升，在3-5小时内到达峰值水平。C_max和AUC都随剂量增加，但以非线性方式增加。阿利克仑的半衰期大约为25小时，其生物利用度大约是2.7％。

传统的诊断和治疗疾病的医学方法单独基于临床数据，或结合诊断性试验。这样的传统实践通常会导致对于指定药物治疗的功效或对个体受试者副作用可能性最小化而言并不是最佳的治疗选择。治疗特异性诊断学(又名治疗诊断科技(theranostics))是个新兴的医学技术领域，它提供了用于诊断疾病、选择正确治疗方案并监控受试者应答的试验。就是说，治疗诊断科技用于在个体受试者水平上预测和评估药物反应，即因人施药。治疗诊断科技测试也用于选择特别有可能从治疗中获益的治疗受试者，或提供个体受试者治疗效果的早期、客观指示，以便以最短的拖延来改变治疗。

药物遗传学的进展在对特定药物的应答和个体患者的遗传分布型之间建立了相关性，是发展新的治疗诊断科技方法的基础。这样，在本领域有必要评估不同患者在基因序列和基因表达上的差异。基因分型的普遍形式依赖于DNA序列变异的鉴定，称为单核苷酸多态性(“SNP”)，它是一类遗传突变，导致不同患者在个体药物应答中的差异。从而在本领域鉴别和定义遗传突变如SNP成为必要，用于鉴定与药物应答性相关联的受试者的基因型。

发明概述

本发明对本领域的需求做出响应。在血管紧张素转化酶(ACE)基因多态性、血管紧张素II二型受体(AGTR2)基因多态性和作为抗高血压药的阿利克仑治疗后的平均坐位舒张压和收缩压压降的临床参数间确定有显著相关性。以厄贝沙坦(irbesartan)和安慰剂治疗没有发现这样的效果，但特异于阿利克仑的治疗。

因此，本发明提供了阿利克仑在制备用于在选定患者群中治疗高血压的药物中的用途。要治疗的患者群在患者体内呈现的生物标志物基因的遗传学多态性的基础上进行选择。生物标志物基因是血管紧张素转化酶(ACE)基因和血管紧张素II二型受体(AGTR2)基因。所述遗传多态性是阿利克仑治疗高血压功效的指示物。

本发明还提供了用于确定患高血压的个体对阿利克仑治疗的应答性的诊断方法，所述方法基于一个或多个本发明多态性遗传座位处的核苷酸对的鉴定。

本发明还提供了在个体中治疗高血压的治疗诊断科技方法。如果本发明多态性遗传座位处的核苷酸对显示个体对于抗高血压药治疗有反应，可以向该个体施用抗高血压药。在一实施方案中，该抗高血压药是阿利克仑。如果本发明多态性遗传座位处的核苷酸对显示个体对于抗高血压药治疗没有反应，则向该个体施用替代性治疗。

本发明一般提供用于降低白天动态舒张压(DADBP)的方法。在一特定实施方案中，本发明提供了降低平均坐位舒张压(MSDBP)的治疗诊断科技方法。

此外，本发明提供了用于降低白天动态收缩压(DASBP)的方法。在一特定实施方案中，本发明提供了降低平均坐位收缩压(MSSBP)的治疗诊断科技方法。

而且，本发明提供了为确定抗高血压药治疗高血压效果而选择纳入临床试验的个体的方法。如果个体的基因型是用于治疗该个体高血压的抗高血压药的效果指示物，在试验中可以纳入该个体。如果个体基因型不是用于治疗该个体高血压的抗高血压药的效果指示物，该个体就要从试验中予以排除。

本发明提供了用于实施本发明方法的试剂盒。本发明还提供了使用血管紧张素转化酶(ACE)基因产物和血管紧张素II二型受体(AGTR2)基因产物作为药物发现靶标的方法。

附图的简短说明

图1是一组柱型图，显示了三个阿利克仑治疗组一起、最高剂量阿利克仑组(600毫克)、厄贝沙坦组和安慰剂组通过SNP_4769基因型分开的应答率。在图下方的几行中，上行指代CT等位基因，下行指代TT等位基因。

发明详述

进行了药物遗传学回顾性分析，试图评价在遗传变异和临床试验中临床结果间潜在的相关性。在该临床试验中，阿利克仑以75、150或300毫克每日一次施用，显示出在轻度到中度高血压患者中是有效的抗高血压药，导致了白天动态收缩压(DASBP)统计学上显著的降低。所有剂量的主动治疗在临床试验的终点、在意向治疗(ITT)群体的第8周及在每种方案群体的临床试验终点在降低平均坐位舒张压(MSDBP)方面都在统计学上比安慰剂更强。使用150毫克阿利克仑和150毫克厄贝沙坦获得了近似的MSDBP降低。见下面的实施例I。

对于平均坐位收缩压(MSSBP)，在临床试验终点所有剂量的主动治疗都在统计学上强于安慰剂。在临床试验终点300和600毫克阿利克仑都在统计学上强于安慰剂和厄贝沙坦。用150毫克阿利克仑和150毫克厄贝沙坦得到了相似的MSSBP降低。300毫克和600毫克阿利克仑产生了最大的降低，见下面的实施例I。

在药物遗传学分析中，检查了来自肾素-血管紧张素-醛固酮系统(RAS)或以前证明牵涉血压调控的12个基因的48个多态性。在血管紧张素转化酶(ACE)基因(SNP_4769，SEQ ID NO：1)的一个多态性、血管紧张素II二型受体(AGTR2)基因的两个多态性(SNP_1445，SEQ ID NO：2和SNP_4795，SEQ ID NO：3)和平均坐位舒张压及收缩压压降的临床参数之间发现了显著的相关性。在厄贝沙坦和安慰剂治疗中没有发现这样的效果，相反效果特异于此分析中的阿利克仑治疗。

SNP_4769(SEQ ID NO：1)的核苷酸序列如下：

AGGACTTCCC AGCCTCCTCT TCCTGCTGCT CTGCTACGGG CACCCTCTGC

TGGTCCCCAG CCAGGAGGCA/Y CCCAACAGGT GACAGTCACC CATGGGACAA

GCAGCCAGGC AACAACCAGC AGCCAGACAA CCACCCACCA

SNP_4769是编码SNP，它将ACE酶第32个密码子处的氨基酸序列从脯氨酸变为丝氨酸。

SNP_1445(SEQ ID NO：2)的核苷酸序列如下：

TGGAAACTTC ATTTTTTTTG TTTGAGATTT ATTTGAATGA GCTGTTATGA

TTGGAGACAG TGAGAATTTC AGATTAATGT TTTGCAGACA AAAAAAAACC

TCTCTGGAAA GCTGGCAAGG GTTCATAAGT CAGCCCTAGA ATTATGTAGG

TTGAAGGCTC CCAGTGGACA GACCAAACAT ATAAGAAGGA AACCAGAGAT

CTGGTGCTAT TACGTCCCAG CGTCTGAGAG AACGAGTAAG CACAGAATTC

AAAGCATTCT GCAGCCTGAA TTTTGAAGGT AAGTATGAAC AATTTATATA

TAATTTACTT GGAAAGTAGA ACATACATTA AATGAAAATA TTTTTTATGG

ATGAACTTCT GTTTTTCCTG TGTTTTAACA CTGTATTTTG CAAAACTCCT/R

AATTATTTAG CTGCTGTTTC TCTTACAGGA GTGTGTTTAG GCACTAAGCA

AGCTGATTTA TGATAACTGC TTTAAACTTC AACAACCAGT AAGTCTTCAA

GTGGAATTTA TTATTGATTC TTTTATGTTA ATTTGTTAGG TCAAAAGAAA

AATCTTTAGA GCAAAATAAA AGTTTTGCTC TTTATTAGGA GGTTCTTTAG

ATATTACACT TTTAATTGGG TAGCTTATTT GCATGTATTT TGAAACTATC

TAAAGTAAAT AGTGTTTCCT TTGTATGCTT ATCTTTAGCT AATGTGTTTT

TTTTTTTGGT TTTAAAATAA TGCTTCTAGT GAAAAAAATC ACAAAAACCT

CAACACTGTA ACGTTTGAGA GCAACGGCTA TTCAGTTCGG TTAAACCGAA

SNP_1445处于AGTR2mRNA的非翻译区内(见表2B)。

SNP_4795(SEQ ID NO：3)的核苷酸序列如下：

ccaacacaaa agcacagcag ttgagaactg ggaaagcatc gcactacaac

tgctactgcc attaaccaca ttgtcctgga tgcccaagag cttaagagcc

cacttaccta cctggtacactgctactaca actgacatctgagaaagcca

cccaaaggaa caagaatttc cctgtctgga accaacagaa ttgtcactat/R

ttctgtacca gatcccaagg atacacatgc ttagcttact attactacca

ctgaaacttg caaaagaacc catcaagcat tccattcccc agcacaaatt

catcagtttc tatcaataac ctcacaatgc cacacagagg aatagacaga

tactactaag gctgtttata gccaatgaaa tcatacacag tcttcacca

SNP4795在AGTR2基因组区内(见表2B)。

应该理解下面于不同细节水平上描述的本发明的某些方面、方式、实施方案、变异及特征是为了提供对本发明的充分理解。一般来讲，此类公开提供了多核苷酸变异SNP用于对需要的受试者进行诊断和治疗的新用途。因此，本发明的不同方面涉及了编码本发明ACE和AGTR2基因多核苷酸变异的多核苷酸。本发明的不同方面还涉及诊断/治疗诊断科技方法和使用本发明多核苷酸变异来鉴定倾向患病的个体、或通过药物应答性、副作用或最佳药物剂量来分类个体的试剂盒。另一方面，本发明提供了化合物确认的方法及用于存储、分析涉及本发明多核苷酸变异的数据的计算机系统。因而，接下来有多个具体实施方案阐明这些方面。

定义

下面提供了在此说明书中使用的某些术语的定义。其他术语的定义可以在美国能源部科学办公室人类基因组计划提供的术语表<http://www.ornl.gov/sci/techresources/Human Genome/glossary/>中找到。医学定义由Chobanian等“JNC-7-Complete Version”Hypertension42：1206-1252(2003)提供。美国心脏协会的高血压定义可以在网址<http://www.americanheart.org/presenter.jhtml？identifier＝4623>找到。所有这些参考文献在此引入作为参考。

在此使用的术语“等位基因”意为在特定染色体位置(座位)处特殊形式的基因或DNA序列。

在此使用的术语“抗体”包括但不局限于：多克隆抗体、单克隆抗体、人源化或嵌合抗体及足以将抗体片断结合到蛋白质的生物功能抗体片断。

在此使用的术语“临床反应”意指下述的所有或任意一种：应答、无应答及不利应答(即副作用)的定量测定。

在此使用的术语“临床试验”指设计用于收集对于特定治疗的反应的临床数据的研究计划，包括(但不局限于)一期、二期和三期临床试验。使用标准方法定义患者群、登记受试者。

在此使用的术语化合物的“有效量”是足以得到期望的治疗和/或预防效果的量，例如导致预防或减轻高血压相关症状的量。在优选的实施方案中，化合物是阿利克仑。

施用于受试者的化合物的量要取决于疾病的类型和严重度，并取决于个体的特征，如一般健康状况、年龄、性别、体重和对药物的耐受性。这还取决于病症的程度、严重性和类型。依赖于这些和其他因素，技术人员将能够确定合适的剂量。通常，本发明化合物足以获得治疗或预防效果的有效量范围从每天每公斤体重约0.000001mg到每天每公斤体重约10,000mg。优选的剂量范围自每天每公斤体重约0.0001mg到每天每公斤体重约100mg。本发明的化合物也能彼此联合施用，或与另外的一个或多个治疗化合物联合施用。在优选的实施例中，阿利克仑的有效量是以每天一次75、150或300mg施用。

在此使用的术语“表达”包括(但不局限于)下述的一种或多种：转录基因到前体RNA、前体mRNA剪接或其他加工以产生成熟mRNA、mRNA稳定性、翻译成熟mRNA成蛋白质(包括密码子使用和tRNA的可用性)、以及(若正确的表达和功能需要的话)翻译产物的糖基化和/或其他修饰。

在此使用的术语“基因”指包含调控性生物合成RNA产物的所有信息的DNA区段，包括启动子、外显子、内含子及调控表达的其他非翻译区。

在此使用的术语“基因型”是指个体同源染色体对座位上的一个或多个多态性位点处发现的不定型5’到3’核苷酸对序列。在此使用的基因型包括完整基因型和/或亚基因型。

在此使用的术语“座位”指染色体上或DNA分子上与基因或物理或表型特征相对应的位置。

在此使用的术语“ACE调节剂”或“AGTR2调节剂”是与无调节剂时多肽的表达水平或生物活性相比，分别改变(如增加或降低)ACE多肽或AGTR2多肽的表达水平或生物活性的任意化合物。调节剂可以是小分子、多肽、糖类、脂类、核苷酸或其组合。调节剂可以是有机化合物或无机化合物。

在此使用的术语“突变体”意指因为突变造成的野生型的任意可遗传变异，如单核苷酸多态性。贯穿本说明书，术语“突变体”可以和术语“标志物”、“生物标志物”和“靶标”互换使用。

在此使用的术语“医学状况”包括(但不局限于)表现为需要治疗的一个或多个身体和/或心理症状的任意状况或病症，并且包括以前和新近鉴定的疾病和其他紊乱。在优选的实施方案中，医学状况是高血压。

在此使用的术语“核苷酸对”意指见于个体两拷贝染色体多态性位点上的核苷酸。

在此使用的术语“多态性位点”意指座位内的位置，在群体内该位置处能发现至少两个可选序列，其中最频繁出现的有不超过99％的频率。

在此使用的术语“多态现象”意指在群体内以大于1％的频率出现的序列变体。序列变体可能呈现显著大于1％的频率，如5％或10％或更高。本术语还可用于指在个体的多态性位点上观察到的序列变异。多态现象包括核苷酸取代、插入、缺失及微卫星，并且可能(但不必须)导致基因表达或蛋白质功能可检测的差异。

在此使用的术语“多核苷酸”意指任意RNA或DNA，可能是未修饰的或修饰的RNA或DNA。多核苷酸包括(并非限定)单链和双链DNA、单链和双链区域混合的DNA、单链和双链RNA、单链和双链区域混合的RNA以及可能是单链、或更普遍为双链或单链和双链区域混合的、DNA和RNA组成的杂合分子。此外，多核苷酸指由RNA或DNA或既有RNA又有DNA组成的三链区。术语多核苷酸还包括包含一个或多个修饰碱基的DNA或RNA及具有为稳定性或其他原因修饰的骨架的DNA或RNA。

在此使用的术语“多肽”意指由两个或多个氨基酸通过肽键或修饰肽键(也就是肽等排物)彼此连接组成的任意多肽。多肽既指短链(一般称为肽、糖肽或寡肽)，也指长链(一般称为蛋白质)。多肽可能包含不同于20个基因编码氨基酸的氨基酸。多肽包括通过本领域广为人知的自然过程如翻译后加工、或通过化学修饰技术修饰的氨基酸序列。此类修饰在基础教科书和更详细的专论以及大量研究文献中有详细描述。

在此使用的术语“SNP核酸”意指核酸序列，由个体间或个体群间否则将完全相同的核苷酸序列内可变的核苷酸组成，从而以等位基因形式存在。此类SNP核酸在长度上优选约15到约500个核苷酸。SNP核酸可能是染色体的一部分，或它们可能是染色体一部分的精确拷贝，例如通过PCR或克隆扩增此类染色体的一部分。SNP核酸此后简单地称为“SNP”。SNP是在基因组的单个位置上出现的核苷酸变异，在群体中其中的两个可选碱基以可评估的频率(也就是大于1％)出现。SNP可能出现在基因内部或基因组基因间区域内部。根据本发明的SNP探针是互补于SNP核酸的寡核苷酸。

在此使用的术语“受试者”意思是优选哺乳动物如人类受试者，但也可以是动物，例如家畜(如狗、猫等)、农场动物(如牛、羊、猪、马等)及实验动物如猴子(如cynmologous猴、大鼠、小鼠、豚鼠等)。

在此使用的施用试剂或药物给受试者或患者包括自体施用及由他人施用。还应理解所述医学状况治疗或防治的不同模式旨在意味着“显著”，包括完全、也包括并非完全的治疗或防治，并且其中得到了一些生物或医学相关结果。

基因序列变异的鉴定和表征

因为其流行和广泛分布的本性，SNP有潜力成为定位人类疾病状况相关基因的重要工具，见例如Wang等，Science280：1077-1082(1998)。越来越清楚的是许多常见紊乱的发展风险和用于治疗这些状况的药物的代谢实质上受潜在的基因组变异所影响，尽管任意一个变异的效果可能很小。

所述SNP是“等位基因的”，由于多态性的存在，种属的一些成员可能具有未突变序列(也即原始等位基因)，而另外的成员可能具有突变的序列(即变异或突变等位基因)。

SNP和特定表型间的相关性不一定表明或需要该SNP是该表型的致因。相反，相关可能只是由于SNP和那些实际上造成给定表型的遗传因子间的基因组邻近性，这样SNP和所说的遗传因子是紧密连锁的。换句话说，SNP可能是和“真正的”功能变体处于连锁不平衡(“LD”)。在基因组的两个不同位置的等位基因比预期的关联度更高时，则存在LD(又名等位基因关联)。因而，SNP由于其与引起特定表型的突变邻近可以做为有价值的标志物。

在本发明多态性位点的描述中，为方便以基因的有义链作为参照。然而，正如技术人员所认识到的那样，包含基因的核酸分子可能是互补双链分子，因此述及有义链上的特定位点也指互补反义链上的相应位点。即可以参照任一链上的同一多态性位点，可以设计寡核苷酸与任一链在含多态性位点的特定区域特异性杂交。因而，本发明也包括互补于在此描述的基因组变体有义链的单链多核苷酸。

SNP的鉴定和表征

可以使用许多不同技术来鉴定和表征SNP，包括单链构象多态性(SSCP)分析、通过变性高效液相层析(DHPLC)进行的异源双链体分析及直接DNA测序和计算机方法(Shi等，Clin.Chem.47：164-172(2001))。在公共数据库中有很多序列信息。

现在最普遍的SNP分型方法包括杂交、引物延伸和切割法。这些方法的每一种必须和适当的检测系统相连。检测技术包括荧光偏振(Chan等，Genome Res.9：492-499(1999))、发光检测焦磷酸释放(焦磷酸测序(pyrosequencing))(Ahmadiian等，Anal.Biochem.280：103-10(2000))、基于荧光共振能量转移(FRET)的切割测试、DHPLC和质谱分析(Shi，Clin.Chem.47：164-172(2001)；美国专利No.6,300,076B1)。检测和表征SNP的其它方法是在美国专利No.6,297,018和6,300,063中公开的那些方法。

多态性现象也可用商品化产品检测，如INVADERTM技术(可从ThirdWave Technologies Inc.Madison，Wisconsin，USA得到)。在此测试中，当特异性上游“侵入”寡核苷酸和部分重叠的下游探针结合于互补DNA模板时一起形成了特异性结构。此结构为切割酶所识别并在特异位点切割，导致探针寡核苷酸5’侧翼的释放。然后这个片段作为包含在反应混合物中的合成二级靶标和二级荧光标记信号探针的“侵入”寡核苷酸，也见RyanD等，Molecular Diagnosis4(2)：135-144(1999)和Lyamichev V等，NatureBiotechnology17：292-296(1999)，也见美国专利No.5,846,717和6,001,567。

也可以使用错配检测技术来确定多态性特征，包括(但不局限于)使用核糖探针(Winter等，Proc.Natl.A cad.Sci.USA82：7575(1985)，Meyers等，Science230：1242(1985))和识别核苷酸错配的蛋白质如E.coli mutS蛋白(Modrich P，Ann Rev Genet25：229-253(1991))的RNA酶保护法。可选的，变体等位基因可以利用单链构象多态性(SSCP)分析(Orita等，Genomics5：874-879(1989)，Humphries等，in Molecular DiagnosisofGenetic Diseases，Elles R编辑，pp.321-340(1996))或变性梯度凝胶电泳(DGGE)(Wartell等，Nucl.Acids.Res.18：2699-2706(1990)，Sheffield等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA86：232-236(1989))来鉴定。聚合酶介导的引物延伸法也可以用于鉴定多态性。几种此类方法已经在专利和科技文献中描述，包括“遗传位元分析”法(WO92/15712)和连接酶/聚合酶介导的遗传位元分析(美国专利No.5,679,524)。相关方法在WO91/02087、WO90/09455、WO95/17676和美国专利No.5,302,509及5,945,283中公开。包括多态性的延伸引物可以通过美国专利No.5,605,798描述的质谱检测。另一引物延伸方法是等位基因特异性PCR(Ruafio等，Nucl.Acids.Res.17：8392(1989)，Ruafio等，Nucl.A cids.Res.19：6877-6882(1991)，WO93/22456，Turki等，J.Clin.Invest.95：1635-1641(1995))。此外，多个多态性位点可以通过使用如公开的PCT专利申请WO89/10414所述的套式等位基因特异性引物同时扩增核酸多个区域来研究。

寡核苷酸单倍体分型和基因分型

本发明提供了用于对个体基因进行单倍体分型和/或基因分型的方法和组合物。在此使用的术语“基因型”和“单倍型”意指分别包含核苷酸对或核苷酸的基因型或单倍型，所述核苷酸对或核苷酸出现在在此所述的新多态性位点的一处或多处，还可以任选地包括出现在基因一个或多个另外的多态性位点的核苷酸对或核苷酸。另外的多态性位点可能是现在已知的多态性位点或后来发现的位点。

本发明的组合物包含设计用于特异性杂交于一个或多个包含有或接近多态性位点的靶区域的寡核苷酸探针和引物。本发明的寡核苷酸组合物用于对个体基因进行基因分型和/或单倍体分型的方法。在此所述的用于在新多态性位点建立个体的基因型或单倍型的方法和组合物可用于研究受蛋白质表达和功能影响的疾病病因中多态性的作用，研究药物靶向的效果，预测个体对于受蛋白质表达和功能影响的疾病的易感性，预测对于靶向基因产物的药物的个体应答性。

本发明的基因分型寡核苷酸可以固定在或合成在固相表面如微芯片、珠或玻璃片上，见例如WO98/20020和WO98/20019。

基因分型寡核苷酸可以杂交于定位在在此所鉴定的新多态性位点之一下游一个到几个核苷酸的靶区域。此类寡核苷酸用于聚合酶介导的引物延伸法，用来检测在此所述的新多态性之一，所以此类基因分型寡核苷酸在此称作“引物延伸寡核苷酸”。

本发明的直接基因分型方法

本发明的基因分型法可以包括从个体分离含有两拷贝目的基因或其片段的核酸混合物，确定在两拷贝中一个或多个多态性位点的核苷酸对的特征。技术人员应该很容易理解，个体基因的两个“拷贝”可以是相同的等位基因或不同的等位基因。在特别优选的实施方案中，基因分型法包括确定每个多态性位点处的核苷酸对的特征。一般而言，核酸混合物从取自个体的生物学样品如血液样品或组织样品中分离。合适的组织样品包括全血、精液、唾液、眼泪、尿液、排泄物、汗液、口腔涂片、皮肤和毛发。

在下面实施例中，为ABI的Assays-by-Design平台产生了用于基因分型测试的单核苷酸多态性(SNP)测定探针集合(Livak KJ，Marmaro J &Todd JA，Nature Genetics9：341-2(1995))。根据厂商说明书用10ng基因组DNA进行基因分型。

本发明的直接单倍体分型法

本发明的单倍体分型法可以包括从个体分离只含有目的基因或其片段的两个拷贝之一的核酸分子，确定在该拷贝中一个或多个多态性位点的核苷酸的特征。直接单倍体分型法包括，例如，CLASPER SystemTM技术(美国专利No.5,866,404)或等位基因特异性长程PCR(Michalotos-Beloin等，Nucl.Acids.Res.24：4841-4843(1996))。核酸可以用能分离基因或片段的两拷贝的任意方法来分离。为本领域技术人员所熟知的是，任何单个克隆应该只提供个体内存在的两个基因拷贝之一的单倍型信息。在一个实施方案中，通过鉴定个体内存在基因的每个拷贝的一个或多个多态性位点处分型的核苷酸序列确定个体的单倍型。在优选的实施方案中，单倍体分型法包括鉴定基因每个拷贝中每个多态性位点处分型的核苷酸序列。

在基因分型和单倍体分型方法中，在多态性位点处的核苷酸(或核苷酸对)的特征都可以通过直接从基因或其片段的一个或两个拷贝中扩增包含多态性位点的靶区域、并用传统方法测序扩增区域来确定。个体基因的基因型或单倍型也可通过杂交包含一个或两个基因拷贝的核酸样品于如WO95/11995所述的核酸阵列和亚阵列来确定。

使用与靶多态性处于连锁不平衡的多态性位点的间接基因分型法

此外，在本发明新多态性位点的任意一处存在的等位基因的特征可以通过对与那些目的位点处于连锁不平衡的其它多态性位点进行基因分型来间接确定。如上所述，如果在一个位点处的一特殊变体的存在指示在第二位点处另一变体的存在，则所说的两个位点连锁不平衡(Stevens JC，Mol.Diag.4：309-317(1999))。与本发明多态性位点处于连锁不平衡的多态性位点可能位于同一基因的区域中或其它基因组区域。

扩增靶基因区域

靶区域可以用任意寡核苷酸指导的扩增方法扩增，包括但不局限于聚合酶链式反应(PCR)(美国专利No.4,965,188)、连接酶链式反应(LCR)(Barany等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA88：189-193(1991)，公开的PCT专利申请WO90/01069)和寡核苷酸连接分析(OLA)(Landegren等，Science241：1077-1080(1988))。在此类方法中用作引物或探针的寡核苷酸应该特异性杂交于包含或接近多态性位点的核酸区域。一般寡核苷酸长度为10到35个核苷酸，优选15到30个核苷酸，最优选20到25个核苷酸。寡核苷酸的精确长度应取决于技术人员惯常考虑和使用的许多因素。

可以使用其它已知的核酸扩增方法来扩增靶区域，包括基于转录的扩增系统(美国专利No.5,130,238，EP 329,822，美国专利No.5,169,766，公开的PCT专利申请WO89/06700)及等温方法(Walker等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：392-396(1992))。

等位基因特异性寡核苷酸与靶基因杂交

靶区域的多态性可以在扩增之前或之后使用本领域已知的几种基于杂交的方法之一来测定。一般在进行此类方法时使用等位基因特异性寡核苷酸。等位基因特异性寡核苷酸可以用做不同标记的探针对，探针对的一个成员显示出完全匹配于靶基因的一个变体，而另一成员显示完全匹配于不同的变体。在一些实施方案中，用一套等位基因特异性的寡核苷酸或寡核苷酸对可以一次检测不止一个多态性位点。优选地，当杂交于所检测的每个多态性位点时，该套成员的熔解温度相互之间的差异在5℃之内，更优选2℃之内。

等位基因特异性寡核苷酸与靶多核苷酸的杂交可以用两实体在溶液中进行，或者当寡核苷酸或靶多核苷酸共价或非共价固定于固相支持物时进行此类杂交。例如，可以通过抗体-抗原相互作用、多聚L赖氨酸、链霉亲和素或亲和素-生物素、盐桥、疏水相互作用、化学连接、UV交联、烘焙等介导附着。等位基因特异性寡核苷酸可以直接合成于固相支持物或在合成后附着于固相支持物。适用于本发明检测方法的固相支持物包括硅、玻璃、塑料、纸等制成的基质，例如，所述基质可以塑形成孔(像在96孔板中)、载片、薄片、膜、纤维、芯片、盘及珠。固相支持物可以处理、包被或衍生，以促进等位基因特异性寡核苷酸或靶核酸的固定。

确定群体基因型和单倍型，并将其与性状相关联

本发明提供了确定群体中基因型或单倍型的频率的方法。该方法包括确定群体中每个成员存在的基因的基因型或单倍型，其中所述基因型或单倍型包含该基因中一个或多个多态性位点处检测到的核苷酸对或核苷酸，并计算群体中该基因型或单倍型的发现频率。群体可以是参照群体、家族群体、同性群体、群组或性状群体(例如具有目的性状如医学状况或对治疗有应答的个体群)。

本发明的另一方面，参照群体中基因型和/或单倍型的发现频率数据被用于鉴定性状和基因型或单倍型之间相关性的方法。性状可以是任意可检测的表型，包括(但不局限于)对疾病的易感性或对治疗的反应。所述方法包括：在参照群体中获得目的基因型或单倍型的频率的数据，并将该数据和具有所述性状的群体内基因型或单倍型的频率数据相比较。参照和性状群体之一或两者的频率数据可以通过使用上述方法之一对群体中的每一个体进行基因分型或单倍体分型而获得。性状群体的单倍型可以直接确定，或可选地通过上述预测基因型或单倍型的方法确定。

参照和/或性状群体的频率数据可以通过访问以前确定的频率数据(可能是书面形式或电子形式)来得到。例如，频率数据可能存在于计算机可及的数据库中。一旦得到了频率数据，就可比较参照和性状群体中目的基因型或单倍型的频率。

当分析多态性时，可以执行计算来校正可能偶然发现的显著相关性。本发明方法中使用的统计学方法，见《生物学统计方法》第三版(BaileyNTJ，Cambridge Univ.Press，1997)，《计算生物学简介》(Waterman MS，CRC Press，2000)和《生物信息学》(Baxevanis AD & Ouellette BFF编辑，John Wiley & Sons，Inc.，2001)。

在另一实施方案中，检查不同组别的单倍型频率数据来确定它们是否与哈迪-温伯格平衡一致(Hartl DL等《人口基因组学原理》第三版，Sinauer Associates，Sunderland，MA，1997))。

在另一实施方案中，通过用带Bonferoni修正的标准ANOVA检验或是模拟基因型表型相关性的自举法(bootstrapping method)来进行多次统计学分析并计算显著性数值。使用ANOVA来检验关于应答变量是否由一个或多个可测量的性状或变量导致或与之相关的假定(Fisher LD &vanBelle G，《生物统计学：卫生科学的方法学》Wiley-Interscience，NewYork，1993，第10章)。

在预测单倍型对的一个实施方案中，分析包括下述分配步骤：首先，将每一个可能的单倍型对与参照群体的单倍型对相比较，一般，参照群体单倍型对中只有一个匹配可能的单倍型对，并将该单倍型对分配至该个体。偶尔，仅仅参照单倍型对呈现的一个单倍型和个体可能的单倍型对一致，在此类情况下向个体分配这样的单倍型对：其含有已知的这个单倍型和从可能的单倍型对中扣除已知单倍型所得到的新单倍型。

在另一个实施方案中，与目的基因型或单倍型处于连锁不平衡的可检测基因型或单倍型可以用作代替标志物。若给定基因的特定基因型或单倍型在也显示潜在代替标志物基因型的群体中比在参照群体中更频繁，则意味着此基因型与另一基因型处于连锁不平衡。如果频率是统计学显著的，则该标志物基因型可预测所述基因型或单倍型，可用作代替标志物。

另外一个用于找寻单倍型内容和临床反应间相关性的方法使用基于误差最小化优化算法(其中之一是遗传算法)的预测模型(见Lipkowitz KB &Boyd DB编辑的《计算机化学综述》第十章中Judson R《遗传算法及其在化学领域的用途》VCH Publishers，New York，1997，1-73页)、模拟退火(Press等Numerical RecipesinC：The Art of Scientific Computing，第10章，Cambridge University Press，Cambridge，1992)、神经网络(Rich E &Knight K，《人工智能》第2版第10章，McGraw-Hill，New York，1991)、标准梯度下降方法(Press等，同前，第10章)。也可使用其它整体或局部优化方法(见Judson的讨论，同前)。

在下面的实施例中，基因型-表型相关性研究和相关分析在SAS(Cary，NC，USA)用Analyst进行。相关性检验用分类基因型作为自变量(不带优势性假定)并用不同的功效变量作为因变量。连续因变量检验使用ANCOVA分析，而分类因变量使用逻辑回归。基因型-表型相关性分析的共变量为：治疗、试验区域及基线测定。对各治疗组的同一模型重复进行ANCOVA分析。此外，通过逻辑回归模型分析了应答者的百分数，治疗和区域作为因子，基线作为共变量。整个数据集中p<0.05的相关性认为是显著的。

将受试者基因型或单倍型与治疗应答相关联

在优选实施方案中，性状是对于疾病的易感性、疾病严重性、疾病所处阶段或药物反应性。此类方法适用于开发用于所有药物遗传学应用(其中基因型和治疗结果间有潜在相关性)的诊断测试和治疗，包括功效测定、药物动力学测定和副作用测定。

在另一个优选的实施方案中，目的性状是患者表现出的对于治疗的临床反应，例如对于药物靶向的反应或对于医学状况治疗的反应。

为推导治疗的临床反应和基因型或单倍型间的相关性，在接受治疗的个体群(下文称“临床群体”)所表现出的临床反应的基础上获得基因型或单倍型的数据。可以通过分析已进行过的临床试验的结果和/或设计并执行一个或多个新临床实验来获得临床数据。

临床群体中纳入的个体通常以目的医学状况的存在来分级。潜在患者的分级能使用标准的体检或一种或多种实验室测试来进行。可选地，在单倍型对与疾病易感性或严重性间强相关的情况下，患者分级可使用单倍体分型。

目的治疗施用于试验群的每一个体，并且每一个体对于治疗的反应用一种或多种预设标准来测定。预期在许多情况下，试验群将表现出一定范围的反应，研究者将选择由不同反应构成的应答组的数目(例如低度、中度、高度)。此外，对测试群中每一个体的基因进行基因分型和/或单倍体分型，这可以在施用治疗之前或之后进行。

然后分析这些结果，以确定观察到的多态性群组间临床反应的差异是否是统计学显著的。可能用到的统计学分析方法如Fisher LD & vanBelle G《生物统计学：卫生科学的方法学》(Wiley-lnterscience，New York，1993)所述。此分析可能还包括关于哪些个基因多态性位点对表型差异贡献最显著的回归计算。

在获得临床和多态性数据之后，创建个体反应与基因型或单倍型内容间的相关性。可以用几种方式产生相关性。一个方法中，通过个体的基因型或单倍型(或单倍型对)对个体进行分组(也称为多态性群组)，然后计算出每个多态性群组成员所表现出的临床反应的平均值和标准偏差。

根据上述分析，技术人员预测临床反应为基因型或单倍型内容的函数，可以很容易地构建数学模型。临床反应和基因的基因型或单倍型(或单倍型对)间相关性的鉴定可以作为设计诊断方法的基础，来确定个体能或不能对于治疗有反应，或另外地，个体反应水平更低因而需要更多治疗(即更高剂量药物)。诊断方法可能采用几种方式之一：例如直接的DNA测试(即对基因中一个或多个多态性位点进行基因分型或单倍体分型)、血清学测试或体检测定。唯一的条件是在诊断测试结果和潜在基因型或单倍型间有很好的相关性。在优选的实施方案中，诊断方法使用上述预测性单倍体分型法。将受试者归属于基因型群组

本领域技术人员应理解，此归属决定涉及一定程度的不确定性。因此，对照组水平的标准偏差将被用于做出概率决定，本发明的方法将可应用于很大范围的基于概率的基因型群组决定。因而，例如(并不作为限制)在一个实施方案中，如果基因表达产物的测定水平落在任意对照组中值(mean)的2.5标准偏差范围内，那么该个体可以归属于该基因型群组。在另一实施方案中，如果基因表达产物的测定水平落在任意对照组中值的2.0标准偏差范围内，那么该个体可以归属于该基因型群组。又在另一个实施方案中，如果基因表达产物的测定水平落在任意对照组中值的1.5标准偏差范围内，那么该个体可以归属于该基因型群组。而在另一个实施方案中，如果基因表达产物的测定水平在任意对照组中值的1.0或更低标准偏差范围内，那么该个体可以归属于该基因型群组。

因此此方法能够以不同程度的概率确定应将特定受试者归入哪个群组，而此类基因型群组的归属随之能够确定应将该个体归入何种风险范畴。临床反应与基因型或单倍型间的关联

为推导对于治疗的临床反应与基因型或单倍型之间的关联，需要得到接受治疗的个体群(下文中称为“临床群体”)所表现出的临床反应数据。临床数据可以通过分析已经进行过的临床试验结果来获得，和/或临床数据可以通过设计并执行一个或多个新临床试验来获得。

在不同对照组中如此测定的基因表达产物的标准对照水平将随之与给定患者基因表达产物的测定水平相比较。此基因表达产物可以是与该特定基因型群组关联的特征性mRNA，或是该基因型群组的多肽基因表达产物。然后，可以基于测定水平与给定群组对照水平相比的相似度，将该患者分类或归属于特定的基因型群组。

用于存储或显示多态性数据的计算机系统

本发明还提供了用于存储和显示测定的基因多态性数据的计算机系统。该计算机系统包含计算机处理单元、显示器以及含多态性数据的数据库。多态性数据包括多态性、参照群体中所鉴定的给定基因的基因型和单倍型。在优选的实施方案中，计算机系统能够显示依据进化关系所组织的单倍型。计算机可以执行实施本发明方法所涉及的任意或全部分析操作和数学操作。此外，计算机可以执行程序以产生在显示装置上呈现的视图(或影像)，用户借此能够互动观看并分析大量有关基因及其基因组变异的信息，包括染色体定位、基因结构、以及基因家族、基因表达数据、多态性数据、遗传序列数据和临床群体数据(例如一个或多个群体的种族地理来源、临床反应、基因型和单倍型方面的数据)。在此所述的多态性数据可能存储为相关数据库的一部分(例如Oracle数据库的一个进程或一组ASCII静态文档)。这些多态性数据可能存储在计算机硬盘上，或者可能保存在例如CD-ROM或一个或多个计算机可及的其他存储设备中。例如，数据可以存储在一个或多个通过网络与计算机交流的数据库中。

基于核酸的诊断

在另一方面，本发明提供了SNP探针，用于根据受试者遗传变异的类型对其进行分类。根据本发明的SNP探针为寡核苷酸，其有别于传统等位基因辨别测定中的SNP。在某些优选实施方案中，根据本发明这一方面的寡核苷酸互补于SNP核酸的一个等位基因，但不互补于该SNP核酸的任何其他等位基因。根据本发明此实施方案的寡核苷酸能以不同方式区分开SNP。例如，在严谨杂交条件下，合适长度的寡核苷酸将与一个SNP杂交，但不与任何其他SNP杂交。寡核苷酸可以用放射性标记或荧光分子标签来标记。可选地，合适长度的寡核苷酸能用作PCR引物，其中3’末端核苷酸互补于含SNP的一个等位基因，但不互补于任何其他等位基因。在此实施方案中，PCR扩增的有或无决定了该SNP的单倍型。

本发明的基因组和cDNA片段包含至少一个在此鉴定的新多态性位点，长度至少为10个核苷酸，并且范围可长达全长基因。优选地，依据本发明的片段长度为100到3000个核苷酸，更优选长度为200到2000个核苷酸，最优选长度为500到1000个核苷酸。

本发明的试剂盒

本发明提供了用于对个体基因进行单倍体分型和/或基因分型的核酸和多肽检测试剂盒。此类试剂盒出于为个体分类目的对个体进行分类。具体地，本发明涵盖这样的试剂盒：用于检测生物学样品中相应于本发明标志物的多肽或核酸的存在，例如，生物学样品为任何体液，包括但不局限于血清、血浆、淋巴、囊液、尿液、大便、脑脊髓液、腹水或血液，还包括身体组织的活检样品。例如，试剂盒能可以包含：能够检测生物学样品中相应于本发明标志物的多肽或多肽编码mRNA的标记的化合物或试剂，以及用于测定样品中多肽或mRNA量的工具，例如与多肽结合的抗体，或与编码多肽的DNA或mRNA结合的寡核苷酸探针。试剂盒还可以包括用于解释使用该试剂盒得到的结果的说明书。

在另一实施方案中，本发明提供了包括包装于单独容器中的至少两个基因分型寡核苷酸的试剂盒。试剂盒还可以含有其他组分，如包装在单独容器中的杂交缓冲液(其中寡核苷酸将被用作探针)。可选地，当寡核苷酸将用作扩增靶区域时，试剂盒可以包含包装于单独容器中的聚合酶和优化的用于聚合酶介导的引物延伸的反应缓冲液，例如PCR的情况。在优选实施方案中，此类试剂盒还可以包含DNA样品收集工具。

对于基于抗体的试剂盒，试剂盒可以包括，例如：(1)第一抗体，例如附着在固相支持物上，其结合相应于本发明标志物的多肽，和任选的(2)不同的第二抗体，其与多肽或第一抗体结合，且缀合于可检测的标记。

对于基于寡核苷酸的试剂盒，试剂盒可以包括，例如：(1)寡核苷酸，例如可检测地标记的寡核苷酸，其与相应于本发明标志物多肽的编码核酸序列杂交，或(2)引物对，用于扩增相应于本发明标志物的核酸分子。

试剂盒也可以包括，例如：缓冲剂、防腐剂或蛋白质稳定介质。试剂盒还可以包括用于检测可检测标记的必需组分，例如酶或底物。试剂盒还可以含有一个对照样品或一系列对照样品，其能够进行测定并与测试样品相比较。试剂盒的每一组分可以装在独立容器内，且所有不同容器，连同用于解释用此试剂盒所作测定结果的说明书一起，放在单个包装内。

本发明的核酸序列

本发明一方面包含一个或多个分离的多核苷酸。本发明还涵盖其等位基因变体，也就是，所述分离多核苷酸天然存在的可变形式，所述等位基因变体编码与所述多核苷酸编码的那些多肽相同、同源或相关的突变多肽。可选地，可以通过诱变技术或本领域熟知的直接合成技术产生非天然存在的变体。

因此，能够在低严谨条件下和编码本发明突变多肽的任何核酸序列杂交的核酸序列被视为落在本发明范围之内。标准严谨条件在标准分子生物学克隆教科书中有充分的表征，见例如《分子克隆：实验室指南》第二版(Sambrook，Fritsch & Maniatis，冷泉港实验室出版社，1989、《DNA克隆》卷1、卷2(Glover DN编，1985)、《寡核苷酸合成》(Gait MJ编，1984)、《核酸杂交》(Hames BD & Higgins SJ编，1984)。

基因表达水平的表征

检测和测定mRNA水平(即基因转录水平)和多肽基因表达产物水平(即基因翻译水平)的方法为本领域所熟知，包括使用核苷酸微阵列，而多肽检测方法包括质谱分析和/或抗体检测和定量技术，也见Strachan T &Read A《人类分子遗传学》第2版(John Wiley and Sons，Inc.Publication，New York，1999)。

靶基因转录的测定

生物学样品例如个体的组织或体液中基因表达产物水平的测定可以用多种方法进行。术语“生物学样品”意指包括分离自受试者的组织、细胞、生物液和其分离物，也包括受试者体内存在的组织、细胞和液体。许多表达检测方法使用分离的RNA。对于体外方法，任何不会妨碍mRNA分离的RNA分离技术都可用作从细胞中纯化RNA，见例如Ausubel等编Curr.Prot.Mol.Biol.(John Wiley & Sons，New York，1987-1999)。

在一实施方案中，测定靶基因mRNA表达产物的水平。测定特定mRNA水平的方法为本领域所熟知，包括Northern印迹分析、逆转录PCR及实时定量PCR或通过杂交至寡核苷酸阵列或微阵列。在其他更优选的实施方案中，测定表达水平可以通过测定体液或组织样品(包括但不局限于血液或血清)中基因表达产物蛋白质或多肽的水平来进行。使用本领域技术人员熟知的技术(如美国专利No.4,843,155的一步RNA分离法)可以容易地处理大量的组织样品。

分离的mRNA能够用于杂交或扩增测定，所述测定包括(但不局限于)Southern或Northern分析、PCR分析和探针阵列。检测mRNA水平的一种优选的诊断方法包括将分离的mRNA和能与检测基因所编码的mRNA杂交的核酸分子(探针)进行接触。核酸探针可以是例如全长cDNA或其一部分，例如长度至少为7、15、30、50、100、250或500个核苷酸的寡核苷酸，足以在严谨条件下与编码本发明标志物的mRNA或基因组特异性杂交。在此描述了用于本发明诊断测定的其他合适探针。mRNA和探针的杂交表明所讨论标志物得以表达。

在一种形式中，探针是固定在固相表面，而mRNA与该探针接触，例如Affymetrix基因芯片阵列(Affymetrix，Calif.USA)中的探针。技术人员很容易改造已知的mRNA检测方法，使之适用于检测本发明标志物所编码的mRNA的水平。

用于确定样品中相应于本发明标志物的mRNA水平的可选方法包括核酸扩增步骤，例如通过RT-PCR(美国专利No.4,683,202中阐述的实验方案)、连接酶链式反应(Barany等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：189-193(1991))、自我持续序列复制(Guatelli等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87：1874-1878(1990))、转录扩增系统(Kwoh等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：1173-1177(1989))、Qβ复制酶(Lizardi等，Biol.Technology6：1197(1988))、滚环复制(美国专利No.5,854,033)或任何其他核酸扩增方法，接着是用本领域那些技术人员熟知的技术检测扩增分子。当此类核酸分子以很低数目存在时，这些检测方案特别适用于检测核酸分子。在此使用的“扩增引物”定义为能够退火至基因(分别为正链和负链，或反之亦然)5’或3’区的核酸分子对，且在两者之间包含小段区域。通常扩增引物在长度上是大约10-30核苷酸，并位于长度大约50-200核苷酸区域的两侧。

实时定量PCR(RT-PCR)是评估基因表达水平的一种方式，例如本发明的基因的表达，例如那些含有目的SNP及多态性的基因。RT-PCR测定使用RNA逆转录酶催化从RNA链(包括mRNA链)合成DNA链。产生的DNA可以特异性地检测和定量，这个过程可用于测定特定mRNA物质的水平。实施RT-PCR的一个方法是TAQMAN(PE Applied Biosystems，Foster City，Calif.，USA)并在PCR反应期间使用AMPLITAQ GOLDTMDNA聚合酶的5’核酸酶活性来切割特定形式的探针。其称作TAQMANTM探针，见Luthra等，Am.J.Pathol.153：63-68(1998)，Kuimelis等，Nucl.Acids Symp.Ser.37：255-256(1997)及Mullah等，Nucl.Acids Res.26(4)：1026-1031(1998)。反应期间，探针的切割分开报告染料和淬灭染料，导致报告染料荧光的增加。PCR产物的积累通过报告染料荧光的增加来直接检测(Heid等，Genome Res.6(6)：986-994(1996))。核酸靶标的起始拷贝数越高，越快地观察到荧光的显著增加，见Gibson，Heid & Williams等，GenomeRes.6：995-1001(1996)。

测量细胞转录状态的其他技术产生有限复杂度的限制性片段库用于电泳分析，如组合限制性双酶切和分型引物的方法(见例如EP 0 534858 A1)，或用最接近于指定mRNA末端的位点选择限制性片段的方法(见例如Prashar & Weissman，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93(2)659-663(1996))。

其他方法统计学上取样cDNA库，如通过对多个cDNA的每一个测序足够的碱基(如20-50个碱基)，或通过测序例如9-10个碱基的、在相对于指定mRNA末端通路模式已知位置上产生的短标签来鉴定每一cDNA，见例如Velculescu，Science 270：484-487(1995)。定量样品中的cDNA水平，并用本领域那些技术人员熟知的标准统计学方法确定每个cDNA的中值、平均值和标准偏差(Norman T.J.Bailey，《生物学统计方法》第三版(剑桥大学出版社，1995))。

多肽的检测：免疫学检测方法

本发明基因编码的蛋白质的表达可以通过可检测地标记的或能随后标记的探针来检测。就探针或抗体而言的术语“标记的”意指包括通过将可检测物质偶联(即物理连接)至探针或抗体而直接标志物探针或抗体，以及通过与直接标记的其他试剂反应而间接标记探针或抗体。间接标记的实例包括使用荧光标记的二抗来检测一抗，以及用生物素末端标记DNA探针以便其可以用荧光标记的链霉亲和素检测。一般来讲，探针是识别表达蛋白质的抗体。可以使用多种形式来确定样品中是否含有结合于给定抗体的靶蛋白质。用于检测本发明靶多肽的免疫测定法包括，但不局限于，例如点印迹、western印迹、蛋白质芯片、竞争性及非竞争性蛋白质结合试验、酶联免疫吸附试验(ELISA)、免疫组化、荧光激活细胞分选(FACS)及其它常用并在科技和专利文献中广为描述的方法、以及许多商业化使用方法。技术人员可以很容易地运用已知的蛋白质/抗体检测方法，确定细胞是否表达本发明标志物，以及血液或其他身体组织内该特定多肽表达产物的相对浓度。来自个体的蛋白质可以用本领域那些技术人员熟知的技术来分离。使用的蛋白质分离方法可以是例如在Harlow & Lane，Antibodies：ALaboratory Manual(冷泉港实验室出版社，冷泉港实验室，NY，1988))中所叙述的方法。

为生产针对公开基因之一所编码蛋白质的抗体，可以通过用多肽或其一部分注射免疫不同的宿主动物。此类宿主动物可以包括，但不局限于，兔子、小鼠和大鼠。可以根据宿主类型使用不同的佐剂来提高免疫反应，包括但不局限于：(完全和不完全)弗氏佐剂、矿物胶如氢氧化铝、表面活性物质如溶血卵磷脂、聚醚多元醇、聚阴离子、肽类、油乳状液、匙孔血蓝蛋白及二硝基酚、以及潜在有用的人类佐剂如卡介苗(BCG)和短小棒状杆菌(Corynebacterium parvum)。

单克隆抗体(mAb)为特定抗原的均质抗体群，可以利用供用于通过连续细胞系培养生产抗体分子的任何技术来获得。这些方法包括(但不局限于)Kohler & Milstein的杂交瘤技术(Nature256：495-497(1975)，美国专利No.4,376,110)、人类B细胞杂交瘤技术(Kosbor等，Immunol.Today4：72(1983)，Cole等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80：2026-2030(1983))以及EBV杂交瘤技术(Cole等，《单克隆抗体和癌症治疗》，Alan R.Liss，Inc.，1985，77-96页)。

此外，可以将具有合适抗原特异性的小鼠抗体分子的基因与具有合适生物学活性的人抗体分子基因一起剪接，来开发用于生产“嵌合抗体”的技术(见Morrison等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81：6851-6855(1984)，Neuberger等，Nature 312：604-608(1984)及Takeda等，Nature 314：452-454(1985))。嵌合抗体是在其中不同部分来源于不同动物物种的分子，如具有鼠单抗来源的可变区或高变区及人免疫球蛋白恒定区的那些抗体。

可选地，可以改造用于生产单链抗体的技术来生产差异表达基因单链抗体(美国专利No.4,946,778，Bird，Science 242：423-426(1988)，Huston等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：5879-5883(1988)及Ward等，Nature 334：544-546(1989))。

用于生产“人源化抗体”的技术可以改造用于生产针对蛋白质、片断或其衍生物的抗体。此类技术公布于美国专利No.5,932,448、5,693,762、5,693,761、5,585,089、5,530,101、5,569,825、5,625,126、5,633,425、5,789,650、5,661,016和5,770,429。

抗体或抗体片断可以用于例如Western印迹或免疫荧光技术等方法，来检测表达的蛋白质。在此类用途中，一般优选将抗体或蛋白质固定在固相支持物上。合适的固相支持物或载体包括任何能结合抗原或抗体的支持物。熟知的支持物或载体包括玻璃、聚苯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、右旋糖苷、尼龙、淀粉酶、天然和修饰的纤维素、聚丙烯酰胺、辉长岩和磁铁矿。

易于检测的有用方法是夹心ELISA，其中存在多种变通形式，所有这些意在用于本发明的方法和测定。如在此所用的“夹心试验”意在包括基于基础双位点技术的所有变通形式。免疫荧光和EIA技术都是本领域充分确立的技术。然而，也可以使用其他报告分子，例如放射性同位素、化学发光或生物发光分子。对于技术人员而言，很容易弄清楚如何改变操作来适应所需。

蛋白质的全基因组监测，即“蛋白质组”，可以通过构建微阵列来进行，其中结合位点包括特异于细胞基因组编码的多数蛋白质物质的固定抗体，优选单克隆抗体。优选存在大部分编码蛋白质的抗体，或至少是与测试或证实目的生物网络模型相关的蛋白质的抗体。如上文所指出的那样，制作单克隆抗体的方法广为人知，见例如Harlow & Lane，《抗体：实验室指南》(冷泉港实验室出版社，冷泉港实验室，纽约，1988)。在优选的实施方案中，针对基于细胞基因组序列设计的合成肽段产生单克隆抗体。拥有此抗体阵列，可将来自细胞的蛋白质与阵列接触，并用本领域已知的测定法测定其结合。

多肽检测：二维凝胶电泳

二维凝胶电泳为本领域所熟知，通常包括沿第一向进行等电聚焦，接着是沿第二向进行SDS-PAGE电泳，见例如Hames等，《蛋白质凝胶电泳：实用方法》(IRL Press，New York，1990)、Shevchenko等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93：14440-14445(1996)、Sagliocco等，Yeast 12：1519-1533(1996)及Lander，Science 274：536-539(1996)。

多肽检测：质谱分析

靶多肽的特征及表达水平可以用质谱分析技术(MS)来确定。基于MS的分析方法学用于分析分离的靶多肽，以及分析生物学样品中的靶多肽。用于分析靶多肽的MS形式包括电离(I)技术，例如(但不局限于)基质辅助激光解吸(MALDI)、连续或脉冲电子喷射电离(ESI)及相关方法，例如离子喷射或热喷射及massive cluster impact(MCI)。此类离子源可以与检测形式适配，包括线性或非线性反射式飞行时间(TOF)、单个或多个四极管、单个或多个扇形磁场、傅立叶变换离子回旋共振(FTICR)、离子阱及其组合如离子阱/TOF。关于离子化，可以使用众多的基质/波长组合(例如基质辅助激光解吸(MALDI))或溶剂组合(例如ESI)。

关于质谱(MS)分析，靶多肽可以溶解于合适的溶液或试剂体系。溶液或试剂体系(例如有机或无机溶剂)的选择依赖于靶多肽的性质和所作MS的类型，并基于本领域熟知的方法，MALDI见例如Vorm等，Anal.Chem.61：3281(1994)，ESI见Valaskovic等，Anal.Chem.67：3802(1995)。多肽MS还见国际PCT申请No.WO93/24834和美国专利No.5,792,664所述。所选的溶剂能使靶多肽被在气化过程产生的能量降解的风险最小化。例如，通过将样品包埋在基质中可以降低靶多肽降解的风险。合适的基质可以是有机化合物如糖(例如戊糖或己糖)或多糖(例如纤维素)。此类化合物能被热分解为CO₂和H₂O，从而不形成能导致化学反应的残留物。基质还可以是无机化合物，例如铵硝酸盐，它分解后基本上无残留。这些和其他溶剂的使用为本领域那些技术人员熟知，见例如美国专利No.5,062,935。电子喷射MS还见Fenn等，J.Phys.Chem.88：4451-4459(1984)和PCT申请WO90/14148所述；当前的应用总结于综述文章中，见Smith等，Anal.Chem.62：882-89(1990)及Ardrey，Spectroscopy 4：10-18(1992)。

通过MS确定的靶多肽的质量可以与相应已知多肽的质量相比较。例如，当靶多肽是突变蛋白质时，相应的已知多肽可以是相应的非突变蛋白质，例如野生型蛋白质。使用ESI确定飞摩尔量样品的分子量是很精确的，因为存在多个离子峰，所有都能用作质量计算。例如，已经使用ESI MS(Valaskovic等，Science273：1199-1202(1996))和MALDI MS(Li等，J.Am.Chem.Soc.118：1662-1663(1996))检测亚埃摩尔水平的蛋白质。

基质辅助激光解吸(MALDI)

生物学样品(如体液或组织样品)中靶蛋白质的水平可以通过质谱(MS)方法来测定，包括(但不局限于)那些本领域熟知的技术，如基质辅助激光解吸/离子化、飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)及下面进一步详细说明的表面增强用于激光解吸/离子化、飞行时间质谱(SELDI-TOF-MS)。进行MALDI的方法在本领域内广为人知，见例如Juhasz等，Analysis，Anal.Chem.68：941-946(1996)，还有例如美国专利No.5,777,325、5,742,049、5,654,545、5,641,959、5,654,545及5,760,393描述了MALDI和延时抽提方法。许多提高分辨率的方法也已知。MALDI-TOF-MS已经由Hillenkamp等《生物学质谱》(Burlingame&McCloskey编，Elsevier Science Publ.，Amsterdam，1990，49-60页)描述。

可以使用多种使用质谱进行标志物检测的技术，见Bordeaux MassSpectrometry Conference Report，Hillenkamp编辑，第354-362页(1988)、Bordeaux Mass Spectrometry Conference Report，Karas & Hillenkamp编辑，第416-417页(1988)、Karas & Hillenkamp，Anal.Chem.60：2299-2301(1988)及Karas等，Biomed.Environ.MassSpectrum 18：841-843(1989)。在TOF-MS中使用激光束显示于例如美国专利No.4,694,167、4,686,366、4,295,046和5,045,694中，在此引入其整体作为参考。其他MS技术允许高分子量生物聚合物成功挥发，而不会片断化，使得大量的生物高分子可以通过质谱分析。

表面增强激光解吸/离子化(SELDI)

使用的其他技术采用新MS探针元件组成和允许探针元件积极参与捕获和锚定特定分析物的表面，如亲和质谱(AMS)所述，见SELDI专利：美国专利No.5,719,060、5,894,063、6,020,208、6,027,942、6,124,137、及公开的美国专利申请号U.S.2003/0003465。几类新MS探针元件用表面增强亲和捕获(SEAC)设计，见Hutchens & Yip，Rapid Commun.MassSpectrom.7：576-580(1993)。通过使用已知的蛋白质表面结构和生物特异性分子识别，SEAC探针元件已被成功用于搜寻并锁定不同类别的生物聚合物，特别是蛋白质。在MS探针元件表面的固定化亲和捕获装置(即SEAC)决定了分析物在探针表面的定位和亲合性(特异性)，因此之后的MS分析过程是有效的。

在一般的SELDI种类中有三个不同的亚类：(1)表面增强型整齐解吸(SEND)，其探针元件表面(即样品呈递工具)设计包含能量吸收分子(EAM)而非“基质”，以利于直接(整齐)加到表面的分析物的解吸/离子化；(2)SEAC，其探针元件表面(即样品呈递工具)设计包含化学明确的和/或生物学明确的亲和捕获装置，以通过多种机制(多数为非共价)利于将分析物特异性或非特异性吸附或吸收(所谓锚定或锁定)到探针表面；(3)表面增强型光敏附着和释放(SEPAR)，其探针元件表面(即样品呈递工具)设计或修饰成包含一类或多类化学明确的交联分子，用作共价锚定装置。决定光敏分子在SEPAR样品呈递工具(即探针元件表面)和分析物(例如蛋白质)之间的附着点的类型及数目的化学特异性可能涉及分析物中许多不同残基或化学结构(例如在蛋白质和肽类的情况中的His、Lys、Arg、Tyr、Phe和Cys残基)的任何一个或多个的特异性。

生物学状态的其它方面

在本发明多种实施方案中，为获得药物和通路应答，可以测定生物活性态的方面或混合方面。可以测定与细胞功能的表征相关的蛋白质活性，本发明的实施方案可以基于此类测定。可以通过适于表征的具体活性的任何功能、生化或物理方法来进行活性测定。在活性涉及化学转化时，可将细胞蛋白质与天然底物接触，并测定转化率。当活性涉及多聚体单位的结合时(例如激活的DNA结合复合物与DNA的结合)，可以测定结合蛋白质的量或结合的间接结果(如转录的mRNA的量)。同样，当只有功能活性已知时(例如在细胞周期调控中)，可以观察功能的表现。不管已知还是测定，蛋白质活性的变化构成通过本发明方法分析的应答数据。在可选的非限制性实施方案中，应答数据可由细胞生物状态的混合方面构成。例如，应答数据可根据某mRNA丰度变化，某蛋白质丰度变化和某蛋白质活性变化予以组建。

下面呈现的实施例用于更全面地说明本发明的优选实施方案。此实施例绝不应解释成限制如附加权利要求书所定义的本发明的范围。

实施例

在轻度到中度原发性高血压患者中比较阿利克仑和安慰剂及厄贝沙坦引言与概述

进行了药物遗传学回顾性分析，试图评价遗传变异和临床实验中临床结果间的潜在相关性。具体地，在来自肾素-血管紧张素-醛固酮系统(RAS)或以前证明牵涉到血压调控的12个基因中检测了48个多态性。在血管紧张素转化酶(ACE)基因中的一个多态性、血管紧张素II二型受体(AGTR2)基因中的两个多态性和平均坐位舒张压和收缩压压降的临床参数间可见显著相关性。在厄贝沙坦和安慰剂治疗中没发现这些效果，相反在此分析中效果特异于阿利克仑治疗。

临床试验

设计了多通道的随机双盲平行群组临床试验，以探究阿利克仑相比于安慰剂在轻度到中度高血压患者群体中的效果和安全性。治疗进行了8周，即临床试验的终点为此特定试验第8周。试验的主要目标是确定150mg、300mg、600mg阿利克仑相较于150mg厄贝沙坦和安慰剂在轻度到中度原发性高血压患者中的血压降低的效果。治疗群组间的人口统计学特征大致相当。多数患者是白种人、65岁以下、平均年龄约50岁。男、女的整体分布一致。

分析的初级功效变量是MSDBP变化(MSDBP自基线的下降)。分析的次级功效变量是MSSBP变化(MSSBP自基线的下降)、应答率、血浆肾素活性(PRA)下降及活性血浆肾素(AREN)自基线的上升。

关于初级功效，成对比较显示：所有剂量的主动治疗在终点、意向治疗群体(ITT)的第8周、每种治疗方案群体的终点，在降低平均坐位舒张压方面在统计学上都优于安慰剂。150mg阿利克仑、150mg厄贝沙坦获得了相似的MSDBP降低。300mg及600mg阿利克仑产生了最大的降低，但是在600mg剂量处没观察到更大的降低。

对于次级功效，就平均坐位收缩压(MSSBP)而言，所有剂量的活性治疗在终点处在统计学上优于安慰剂。在第8周，300mg、600mg阿利克仑在统计学上优于终点处的安慰剂和厄贝沙坦。150mg阿利克仑与150mg厄贝沙坦获得了相似的MSSBP降低。300mg及600mg阿利克仑产生了最大的降低，但在600mg剂量处没观察到更大的降低。

对于成功应答者的比例(定义为MSDBP<90mm Hg或比基线降低≥10mm Hg、或MSSBP<140mm Hg或比基线降低≥20mm Hg)显示了所有活性治疗在终点处统计学上优于安慰剂。ITT群体终点处的MSDBP结果是阿利克仑组应答者为59-67％，而厄贝沙坦为56％，安慰剂为38％。ITT群体终点处的MSSBP结果是阿利克仑组应答者为57-68％，而厄贝沙坦为59％，安慰剂为36％。在ITT群体中，阿利克仑组可观察到剂量相关的活性肾素中值升高(对于150、300、600mg阿利克仑分别为20.8、29.9和93.6mu/mL)。150mg阿利克仑比150mg厄贝沙坦(11.2mu/mL)产生了更大的肾素中值升高。这与肾素抑制剂的作用机理相符。

要求参加临床试验的患者提供参与药物遗传学分析的个人同意书。在各自的试验点收集来自所有知情患者的血样，然后运送到Covance(Indianapolis，IN，USA)。Covance利用PUREGENETM DNA分离试剂盒(D-50K)(Gentra，Minneapolis，Minnesota，USA)从血中抽提每个患者的基因组cDNA。最终以每种治疗措施大致相等的比例对511个患者进行了基因分型。

药物遗传学分析目标和设计

对同意提供药物遗传学研究样品的所有患者进行了药物遗传学回顾性分析。主要目的是鉴定遗传变异和阿利克仑治疗效果的差异间的相关性，主要通过MSDBP、其次通过MSSBP和应答率来评估。

利用候选基因方法在来自肾素-血管紧张素系统(RAS)或以前证明与血压调控相关的12个基因中选择48个多态性(表1)。对所有可用的样品作了每个SNP的基因分型。然后按下文所述进行了相关性研究。

                                 表1

                 进行药物遗传学分析所选择的候选基因

基因记号         基因名称

RENBP            肾素结合蛋白

REN              肾素

ACE              血管紧张素I转化酶(肽酰二肽酶A)1

ACE2             血管紧张素I转化酶(肽酰二肽酶A)2

AGT              血管紧张素酶原

AGTR1            血管紧张素II受体，一型

AGTR2            血管紧张素II受体，二型

ABCC2/MRP2       ATP结合盒，C亚家族(CFTR/MRP)，成员2

AGTRAP           血管紧张素II受体相关蛋白

CYP11B2          细胞色素P450，家族11，B亚家族，多肽2，醛固酮合酶

TGFB1            转化生长因子β1

NOS3/eNOS        一氧化氮合酶3(内皮细胞)

基因分型

运用来自公开dbSNP数据库和专有Celera/ABI数据库的信息设计了单核苷酸多态性(SNP)测定。为ABI的Assays-by-Design平台(Livak KJ，Marmaro J，& Todd JA，Nature Genetics 9：341-2(1995))生成所得的基因分型测定探针集合。根据制造商的说明对10ng基因组DNA进行基因分型。

表2中给出了在此分析中进行了基因分型的多态性列表，包括内部CpG座位代码、基因、通路、数据库索引号和效应。

表2A

进行了基因分型的多态性

pg locus id	基因	rs number	说明
				528447864783478447854782479752864766476947674768400134547461669477316672477247964780411	ABCC2ABCC2ABCC2ABCC2ABCC2ABCC2ABCC2ACEACEACEACEACEACEACEACE2ACE2AGTAGTAGTAGTAGTR1AGTR1AGTR1	hCV11305436rs2273697rs2756104rs2756109rs3740066rs717620rs8187710hCV1247681rs4293rs4317rs4329rs4362rs4364rs2285666rs879922rs1926723rs4762rs699rs943580rs2638362rs3772616rs5182	内含子区A>G I417V内含子区内含子区T>C I1324I非翻译区A>G Y1515C内含子区内含子区C>T P32S内含子区C>T F1129FA>C S712R插入/缺失内含子区内含子区内含子区T>C M207TC>T T268M基因组区内含子区内含子区C>T L191L

表2B

进行了基因分型的多态性

pg locus id	基因	rs number	说明
				5287144518647955288478747895754788354147924824791446447935292151347714794477024071676528547904798	AGTR2AGTR2AGTR2AGTR2-LDAGTRAPAGTRAPCYP11B2CYP11B2CYP11B2CYP11B2NOS3NOS3NOS3NOS3NOS3RENRENRENRENRENBPRENBPRENBPTGFB1TGFB1TGFB1	hCV1841569rs1403543rs5193rs4497127hCV516817rs4073574rs4539rs4544rs4545rs6431rs1007311rs1799983rs1800779rs1800780rs891512rs11571092rs1464816rs3730103rs6704321rs2269371rs2269372rs762656hCV11707868rs2241717rs8105161	非翻译区非翻译区基因组区内含子区基因组区G>A R173KC>T T339IA>G S435G内含子区内含子区G>T E298D基因组区内含子区内含子区内含子区内含子区内含子区C>G P403AG>A G274D内含子区基因组区内含子区内含子区内含子区

统计学分析

基因型-表型相关性研究和相关分析在SAS(Cary，NC，USA)使用Analyst进行。

相关性检验用分类基因型作为自变量(不带优势性假定)，并用不同的功效变量作为因变量。连续因变量检验使用ANCOVA分析，而分类因变量使用逻辑回归。基因型-表型相关性分析的共变量为：治疗、试验区域及基线测定。

对各治疗组的同一模型重复进行ANCOVA分析。此外，通过逻辑回归模型分析了应答者的百分数，治疗和区域作为因子，基线作为共变量。整个数据集中p<0.05的相关性认为是显著的。

血管紧张素转化酶(ACE)

Ang I被血管紧张素转化酶(ACE)转化成活性八肽AngII。对患者RAS中的此关键酶的SNP_4769和其他6个多态性一起进行了基因分型。在SNP_4769与初级功效变量MSDBP自基线的降低(p＝0.0058)、与次级变量应答率(p＝0.001)之间可见显著的相关性。至于另一次级变量MSSBP自基线的降低，没有显著相关性而只看到相同的趋势(p＝0.0745)。

当对各治疗组重复做ANCOVA分析时，只在阿利克仑治疗组中检测到相关性，但在厄贝沙坦或安慰剂组中没有检测到。在任何SNP和次级参数血浆肾素活性(PRA)及活性肾素(AREN)之间都没发现显著相关性。阿利克仑特异性效应显示于表3。

表3

ACE、AGTR2变异对于阿利克仑治疗组中

MSDBP、MSSBP及应答率的效果

	SNP4769			SNP1445			SNP4795
										TT	CT	CC	AA	AG	GG	GG	GA	AA
	n	278	14	0	106	69	118	106	72										115
MSDBP降低(mmHg)										-11.1	-4.7	NA	-11.2	-13.2	-9.3	-11.1	-13.3	-9.0
	p	0.0058＊			0.0074＊			0.0022＊
MSSBP降低											-13.7	-6.2	NA	-13.9	-15.7	-11.8	-13.6	-16.3	-11.5
	p	0.0384＊			0.1360			0.0479＊
应答率											69％	14％	NA	74％	71％	58％	74％	73％	56％
	p	0.0024＊			0.1399			0.0382＊

SNP4769是个编码的SNP，它将ACE酶32位密码子处的氨基酸序列从脯氨酸变为丝氨酸。已将ACE I/D多态性(在内含子16中287bp Alu重复序列的存在与否)与ACE水平和活性的调控及其对RAS的影响后果关联起来(Rigat B等，J.Clin.Invest.86(4)：1343-6(1990)。

血管紧张素II二型受体(AGTR2)

AGTR2编码血管紧张素II二型受体。血管紧张素II一型受体是几个抗高血压药的靶点。Ang II信号通过结合于一型受体来诱导血管收缩和血压上升。曾表明血管紧张素II二型受体抑制ACE活性并削弱一型受体介导的反应，由此导致血管舒张(Hunley TE等，KidneyInt.57(2)：570-7(2000)，Ichiki T等，Nature 377(6551)：748-50(1995))。

AGTR2SNP(SNP_1445和SNP_4795)和初级功效变量MSDBP自基线的降低间可见显著相关性(分别是p＝0.0078和0.0004)。SNP_4795也证实了与次级变量MSSBP自基线的降低间有显著相关性(p＝0.0245)，但与另一个次级参数应答率间没有相关性。而SNP_1445与次级参数间没有显示显著相关性。在任何SNP与次级参数血浆肾素活性(PRA)和活性肾素(AREN)间都没发现有显著相关性。

对每个治疗组重复进行ANCOVA分析时，只在阿利克仑治疗组检测到了相关性，而在厄贝沙坦或安慰剂组没有检测到。阿利克仑治疗患者的基因型效应显示于上表3。

这两个SNP都是非编码的。SNP_1445是在AGTR2基因的非翻译区，而SNP_4795是来自于与AGTR2基因处于连锁不平衡的基因组区域。

讨论

总的来说，ACE基因的一个变体和AGTR2基因的两个SNP显示了与初级参数MSDBP的显著相关性。ACE变体和一个AGTR2变体也显示了与次级参数MSSBP和应答率之间的显著相关性。第二个AGTR2变体没有显示显著相关性，只是和次级参数具有同一趋势。只在阿利克仑治疗组内发现了这个基因型效应，在厄贝沙坦或安慰剂组没有。因此，上述效应是特异于阿利克仑的药物遗传学效应。

ACE变体效应特别有意义，因为TT和CT基因型间的差异看起来非常有戏剧性(MSDBP降低为11.1对4.7mm Hg，MSSBP降低为13.7对6.2mm Hg，而应答率为69％对14％)。在患者当中没看到CC纯合基因型，这使得检测的等位基因频率比SNP DB报道的等位基因频率0.1低得多。

通过基因型对阿利克仑反应进行分离，TT基因型的应答率上升了大约70％，暗示着这个结果可能有助于阿利克仑立足于拥挤的抗高血压市场，因该药物能帮助有更佳应答率的大多数普通群体(按照SNP DB等位基因频率约为80％，但甚至可能更高，如在此分析中所见的那样)(如图1所示)。这还可以提供有助于在未来研究中招募潜在“更佳”应答者的方法。

AGTR2基因中的两个SNP极可能处于连锁不平衡状态。

这些报道的SNP未显示与基线测定MSDBP和MSSBP间的显著相关性，再次提示遗传学效应是个阿利克仑相关的药物遗传学效应。

实施例II

临床试验A2203的临床药物遗传学分析

引言和概述

进行了药物遗传学回顾性分析，试图评估遗传变异和临床试验中临床结果间的潜在相关性，见实施例I。随后，为重复分析，考虑了另一临床试验(A2203)的结果。具体地，我们检查了来自肾素-血管紧张素-醛固酮系统(RAS)及以前证明牵涉到血压调控的12个基因中的48个多态性。

在实施例I中，在血管紧张素转化酶(ACE)基因中的一个多态性、血管紧张素II二型受体(AGTR2)基因的两个多态性与临床参数平均坐位舒张压和收缩压压降之间可见显著相关性。这些效应在厄贝沙坦和安慰剂治疗中未见。此外，对于与反应降低相关的ACE错义变体(Pro32Ser)而言，我们发现黑人比白种人有更高的C(Pro)等位基因频率(19/154对2/790)。

在此实施例中，具有丝氨酸残基(C等位基因)的所有4个患者都是黑人。因为有C等位基因的患者的数目极小，不能用实施例I中的同一模型对于此SNP进行分析。此外，没有重复实施例I中发现的AGTR2的两个SNP的相关性。

此实施例(A2203)的临床试验是随机、双盲、多通道、多因子、安慰剂为对照的平行群组研究，用来在高血压患者中评估阿利克仑和缬沙坦(valsartan)联合相对于其组分的单一治疗以及缬沙坦与双氢氯噻嗪(HCTZ)联合的功效和安全性。此实施例的主要目标是评价阿利克仑和缬沙坦联合(75/80mg，150/160mg和300/320mg)在有临床平均坐位舒张压([MSDBP]≥95mmHg和<110mmHg)的患者中相比于其组分单一治疗施用6周后的降血压效果，并评价在具有临床平均坐位舒张压([MSDBP]≥95mmHg和<110mmHg)的患者中单独给以75mg、150mg和300mg阿利克仑相比于施用6周安慰剂的降血压效果。治疗组在人口统计学和基线特征方面大致相当，平均年龄56岁，男性为56％，黑人占6.8％。

对于阿利克仑单一治疗相比于安慰剂，初级功效变量MSDBP自基线的变化在300mg阿利克仑组中是统计学上显著的。两种单一治疗的血压降低的总幅度与以前研究所观察到的一致。然而安慰剂效果的幅度比预期的高，并高于以前阿利克仑研究中可见的效果。用阿利克仑和缬沙坦联合的血压降低要小于以12.5mg双氢氯噻嗪(HCTZ)/缬沙坦观察到的，并且在最大剂量300mg阿利克仑/320mg缬沙坦时的累加效应比较低强度的联合更小。

药物遗传学分析目标

对所有同意提供药物遗传学研究样品的患者进行了药物遗传学回顾性分析。主要目标是通过初级MSDBP和次级MSSBP及应答率评估来鉴定遗传变异和阿利克仑治疗功效变化间的相关性。

使用候选基因方案从来自RAS或以前与血压调控相关的12个基因中选择了48个多态性(表4)。对所有可及样品的每个SNP进行了基因分型。然后如实施例I中所述进行了相关性研究。

                               表4

                    用于药物遗传学分析的备选基因

基因记号            基因名称

RENBP               肾素结合蛋白

REN                 肾素

ACE                 血管紧张素I转化酶(肽酰二肽酶A)1

ACE2                血管紧张素I转化酶(肽酰二肽酶A)2

AGT                 血管紧张素酶原

AGTR1               血管紧张素II受体，一型

AGTR2               血管紧张素II受体，二型

ABCC2/MRP2          ATP结合盒，C亚家族(CFTR/MRP)，成员2

AGTRAP              血管紧张素II受体相关蛋白

CYP11B2             细胞色素P450，家族11，B亚家族，多肽2，醛固酮合酶

TGFB1               转化生长因子β1

NOS3/eNOS           一氧化氮合酶3(内皮细胞)

样品

要求参与临床试验A2201(见实施例I)和临床试验A2203的患者提供参与药物遗传学分析的个人同意书。在各自的试验点收集了来自所有同意患者的血样，随后运送到Covance(Indianapolis，IN)。Covance用PUREGENETM DNA分离试剂盒(D-50K)(Gentra，Minneapolis，MN)从血样中抽提了每个患者的基因组DNA，并运送到NIBR进行基因分型。最终对来实施例I(A2201)的511个患者以每个治疗方案大致相等的比例进行了基因分型。对A2203的684个患者以安慰剂和阿利克仑单一治疗方案患者数与其他治疗方案相比3∶1的比例进行了基因分型。

初级功效变量是MSDBP变化(在终点时MSDBP自基线的下降)。次级功效变量是MSSBP变化(在终点时MSSBP自基线的下降)、应答率、血浆肾素活性(PRA)降低和活性血浆肾素(AREN)自基线的增加。

基因分型

使用来自公共dbSNP和专有Celera/ABI数据库的信息设计了SNP测定。为ABI的Assays-by-Design平台(Livak KJ等，Nat.Genet.9：341-2(1995))而生成所得的基因分型测定探针集合。根据制造商的说明对10ng基因组进行基因分型。

进行了基因分型的多态性

表5给出了此研究中进行了基因分型的多态性列表，包括座位代码、基因、数据库索引号及效应。

表5

进行了基因分型的多态性

pg locus id	基因	Rs number	说明
				5284478647834784478547824797528647664769476747684001345474616694773166724772479647804115287	ABCC2ABCC2ABCC2ABCC2ABCC2ABCC2ABCC2ACEACEACEACEACEACEACEACE2ACE2AGTAGTAGTAGTAGTR1AGTR1AGTR1AGTR2	hCV11305436rs2273697rs2756104rs2756109rs3740066rs717620rs8187710hCV1247681rs4293rs4317rs4329rs4362rs4364rs2285666rs879922rs1926723rs4762rs699rs943580rs2638362rs3772616rs5182hCV1841569	内含子区A>G I417V内含子区内含子区T>C I1324I非翻译区A>G Y1515C内含子区内含子区C>T P32S内含子区C>T F1129FA>C S712R插入/缺失内含子区内含子区内含子区T>C M207TC>T T268M基因组区内含子区内含子区C>T L191L

表5

进行了基因分型的多态性

pg locus id	基因	Rsnumber	说明
				144518647955288478747895754788354147924824791446447935292151347714794477024071676528547904798	AGTR2AGTR2AGTR2-LDAGTRAPAGTRAPCYP11B2CYP11B2CYP11B2CYP11B2NOS3NOS3NOS3NOS3NOS3RENRENRENRENRENBPRENBPRENBPTGFB1TGFB1TGFB1	rs1403543rs5193rs4497127hCV516817rs4073574rs4539rs4544rs4545rs6431rs1007311rs1799983rs1800779rs1800780rs891512rs11571092rs1464816rs3730103rs6704321rs2269371rs2269372rs762656hCV11707868rs2241717rs8105161	非翻译区非翻译区基因组区内含子区基因组区G>A R173KC>T T339IA>G S435G内含子区内含子区G>T E298D基因组区内含子区内含子区内含子区内含子区内含子区C>G P403AG>A G274D内含子区基因组区内含子区内含子区内含子区

统计学分析

基因型-表型相关性研究和相关分析在SAS(Cary，North Carolina)用Analyst进行。

相关性检验用分类基因型作为自变量(不带优势性假定)并用不同的功效变量作为因变量。连续因变量检验使用ANCOVA分析，而分类因变量使用逻辑回归。注意未因多重假设检验而对任一结果进行调整。使用p<0.05的阈值来定义暗示的相关性。基因型-表型相关性分析的共变量为：(1)治疗的剂量水平，(2)A2201(见实施例I)中代码为STU1A或A2203中为REGION的试验区域，(3)MSDBP和MSSBP的基线测定和(4)种族。首先进行来自三个阿利克仑治疗方案的所有样品进行分析。当看到暗示的相关性时，在厄贝沙坦和安慰剂方案作同样的分析。

表6

基因分型患者的人口统计学和基线MSDBP特征(中值±SE)

A2201(见实施例I)					A2203(本实施例)
									治疗	N＝	BMI	年龄	MSDB P基线	治疗	N＝	年龄	MSDBP 基线
阿利克仑150mg阿利克仑300mg阿利克仑600mg厄贝沙坦150mg安慰剂	999610199103	31.01±0.6730.79±0.5830.53±0.6531.81±0.7230.65±0.60	54.15C1.3055.93±1.0355.97±1.0856.66±1.2158.21±1.15	98.76±0.3499.16±0.3698.90±0.3899.41±0.4098.89±0.33	阿利克仑75mg阿利克仑150mg阿利克仑300mg缬沙坦80mg缬沙坦160mg	1021151023933	54.73±1.3755.83±1.1857.09±1.2258.08±1.7753.45±2.15	98.69±0.2899.47±0.3599.26±0.3499.30±0.6198.87±0.69

缬沙坦320mg阿利克仑75mg和缬沙坦80mg阿利克仑150mg和缬沙坦160mg阿利克仑300mg和缬沙坦320mg缬沙坦160mg和HCTZ12.5mg安慰剂

3435344141108

55.50±1.6555.43±1.9556.26±1.9457.10±1.8655.41±1.9355.80±1.24

99.16±0.5799.73±0.6499.32±0.6198.82±0.4698.83±0.5598.86±0.29

ACE

对患者RAS此关键酶的SNP4769和六个其他多态性进行了基因分型。在SNP4769与初级功效变量MSDBP自基线的降低(p＝0.023)、与次级变量应答率(p＝0.0048)之间可见显著的相关性。至于另一次级变量MSSBP自基线的降低，未发现显著相关性而只有同样的趋势(p＝0.14)。

对每一治疗组以同样的模型重复进行ANCOVA分析时，只在阿利克仑治疗组中检测到了相关性，但在厄贝沙坦或安慰剂组没有检测到。阿利克仑特异性效果见表7。在任何SNP与次级参数血浆肾素活性(PRA)和活性肾素(AREN)间未发现显著相关性。

表7

ACE和AGTR2变异对于A2201所有阿利克仑治疗组中

MSDBP、MSSBP和应答率的效果( ^* 表示显著性，p<0.05)

	SNP 4769			SNP 1445			SNP 4795
										TT	CT	CC	AA	AG	GG	GG	GA	AA
	n	278	14	0	106	69	118	106	72										115
MSDBP  降低LSMEAN(mmHg)										-11.4	-5.6	NA	-11.0	-13.3	-9.4	-10.8	-13.4	-9.2
	p	0.023＊			0.0071＊			0.0026＊
MSSBP 降 低LSMEAN(mmHg)											-11.7	-5.9	NA	-11.2	-13.8	-9.8	-10.8	-14.2	-9.5
	p	0.14			0.13			0.046＊
应答率											70％	14％	NA	75％	71％	58％	75％	74％	57％
	P	0.0048＊			0.17			0.060

SNP 4769是个编码SNP，它在ACE酶同工型2和3的第32位密码子处将氨基酸序列从脯氨酸变为丝氨酸。ACE I/D多态性(内含子16中287bp的Alu重复序列存在与否)已与ACE水平和活性的调控及其对RAS的影响后果相关(Rigat B等，J.Clin.Invest.86(4)：1343-6(1990))。我们在此测试中检验了ACE I/D，未观察到和阿利克仑应答间的相关性。SNP 4769定位于体细胞同工型ACE编码基因笫12个内含子中，并定位于第2个和第3个同工型编码基因的第一个外显子内。ACE I/D定位于第16个内含子中，在所表征的白种人、非裔美洲人和中国人群体中与SNP 4769处于同一连锁不平衡区段内(SNPbrowser，Applied Biosystems，Foster City，California)。

AGTR2

已表面血管紧张素II二型受体抑制ACE活性，并削弱一型受体介导的作用，由此导致血管舒张(Ichiki T等，Nature 377(6551)：748-50(1995)，Hunley TE等，Kidney Int.57(2)：570-7(2000)。

在SNP1445和4795与初级功效变量MSDBP自基线的降低间可见显著相关性(分别为p＝0.0071和0.0026)。SNP4795和次级变量MSSBP自基线的降低间也显示了显著相关性(p＝0.046)，但和另一次级参数应答率间没有相关性。而SNP1445未显示与次级参数间的显著相关性。在任何SNP与次级参数PRA和AREN间均未发现显著相关性。

对每一治疗组以同样的模型重复进行ANCOVA分析时，只有阿利克仑治疗组中检测到了相关性，但在厄贝沙坦或安慰剂组没有检测到。阿利克仑治疗患者的基因型效应见上表7。

在试图重复A2203中的这两个SNP在阿利克仑治疗组中看到的相关性时，结果未能重复(p>0.05)。两者都没观察到相关性的趋势。在初步临床研究结果总结中，因为安慰剂反应高于以前可见的反应(8.6mmHg)，阿利克仑治疗扣除安慰剂效应后的剂量应答和幅度低于预期值。这种不一致可能至少部分地解释了AGTR2相关性何以未重复。

这两个SNP都是非编码的。SNP1445处于AGTR2基因的非翻译区，而SNP_4795来自与AGTR2基因处于连锁不平衡的基因组区域。至少在中国人中，这两个SNP处于同一连锁不平衡区段(SNPbrowser，AppliedBiosystems，Foster City，Calif.)。

讨论

这个分析确定了在A2201研究中与临床结果变量间有显著相关性的两个基因中的多态性(见实施例I)。ACE基因的一个变体和AGTR2基因中的两个SNP显示了与初级参数MSDBP有显著相关性。ACE变体和一个AGTR2变体也显示了与次级参数MSSBP和应答率具有显著相关性。第二个AGTR2变体未显示显著相关性，但只与次级参数具有同样的趋势。此基因型效应只在阿利克仑治疗组中可见，但在厄贝沙坦或安慰剂组中未见。因此，上述效应暗示了特异于阿利克仑的药物遗传学效应。

ACE Pro32Ser变体效应是特别有意义的，因为TT和CT基因型之间的差异看来非常有戏剧性(MSDBP降低为11.4对5.6mm Hg，MSSBP降低为11.7对5.9mm Hg，而应答率为70％对14％)。然而，在所有患者当中未见CC纯合基因型。这使得检测出的等位基因频率比SNP DB报道的等位基因频率0.1低得多，并且具有CT基因型的患者的总数极小。我们发现黑人中C等位基因频率比白种人高得多(19/154比2/790)。在A2203中具有丝氨酸残基(C等位基因)的所有4个患者都是黑人。因为具有C等位基因的患者数目很少，不能用同样的模型进行A2203分析。

ACE多态性及其对于ACE酶血浆浓度和血压的影响主要是在非洲人和非裔美洲人群体中观察到(Bouzekri N等，Eur.J.Hum.Genet.12(6)：460-8(2004)，Cox R等，Hum.Mol.Genet.11(23)：2969-77(2002)，ZhuX等，Am.J.Hum.Genet.68(5)：1139-48(2001))。在两个SPP100研究的黑种人患者中观察到ACE基因SNP_4769的高等位基因频率，可确保进一步研究此多态性对ACE水平或活性可能的功能性影响。此外，在32位密码子处的氨基酸变化推测发生在该酶的睾丸同工型内。

当通过基因型对阿利克仑应答进行分离时，TT基因型的应答率增加至大约70％，这暗示了此结果可能有助于使该药物立足于于拥挤的抗高血压市场，因其针对的是与更佳应答率相关的TT基因型的大多数普通群体(根据SNP DB等位基因频率大约为80％，可能甚至更高，如本研究中所见的那样)(如图2显示)。这可能也提供了有助于在将来研究中招募潜在“更佳”阿利克仑应答者的方法。

AGTR2基因中的两个SNP极有可能处于连锁不平衡状态，因为此座位周围的染色体区域大部分位于连锁不平衡区段中。经由二型受体的AngII信号传导功能要比一型受体研究得少。本发现可能还提示AGTR2参与肾素抑制下游的Ang II血压调控功能。

这些报道的SNP未显示和MSDBP及MSSBP基线测定间的相关性。这提示此遗传效应是阿利克仑相关的药物遗传学效应。

等同方案

本发明的一个或多个实施方案的细节在上面所附的说明书中列出。这里描述了优选的方法和材料，虽说在本发明的实施或检验中可以使用类似或等同于此处描述的任何方法和材料。根据所述说明和权利要求书，本发明的其他特征、目标和优势将是显而易见的。在说明书和所附权利要求书中，除非上下文明确另行规定，单数形式包括复数指代。除非另行定义，在此使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员一般理解的相同含义。在此引用的所有文献以其整体作为参考、并且为了所有的目的以相同的程度在此引入，就如同每一出版物、专利或专利申请为了所有目的被明确和单独地以其整体引入作为参考一样。

本发明不受限于在此申请中描述的特定实施方案，实施方案仅作为本发明个别方面的举例说明。对本领域那些技术人员而言显而易见的是，可以对本发明进行许多修改和改变而不背离本发明的精神或范围。根据前面的说明，除在此列举的那些之外，本发明范围内的功能等同方法和仪器对本领域那些技术人员是显而易见的。此类修改和变化旨在落入所附权利要求书的范围内。本发明仅受限于所附权利要求书的用语以及这些权利要求书所享有的所有范围的等同体。

Claims (13)

1.阿利克仑在制备治疗选定患者群体高血压的药物中的用途，其中患者群体基于患者体内存在的生物标志物基因的遗传多态性进行选择，其中所述遗传多态性指示阿利克仑治疗高血压的功效。

2.权利要求1的用途，其中遗传多态性选自：血管紧张素转化酶(ACE)基因中的SNP_4769、血管紧张素II二型受体(AGTR2)基因中的SNP_1445、AGTR2基因中的SNP_4795以及它们的组合。

3.用于确定高血压个体对抗高血压药治疗的应答的方法，包括步骤：

(a)获得对于个体中存在的两拷贝基因而言的一个或多个多态性遗传座位处的核苷酸对的特征，其中遗传座位选自：血管紧张素转化酶(ACE)基因、血管紧张素II二型受体(AGTR2)基因以及它们的组合，和

(b)如果多态性座位处的核苷酸对显示该个体对于抗高血压药治疗有应答，则将个体归属为“高”应答群组。

4.权利要求3的方法，其中遗传多态性选自：血管紧张素转化酶(ACE)基因中的SNP_4769、血管紧张素II二型受体(AGTR2)基因中的SNP_1445、AGTR2基因中的SNP_4795以及它们的组合。

5.权利要求3的方法，其中抗高血压药是阿利克仑。

6.用于治疗个体高血压的方法，包括步骤：

(a)获得对于个体中存在的两拷贝基因而言的一个或多个多态性遗传座位处的核苷酸对的特征，其中遗传座位选自：血管紧张素转化酶(ACE)基因、血管紧张素II二型受体(AGTR2)基因以及它们的组合；和

(b)(i)如果在多态性座位处的核苷酸对显示该个体对于抗高血压药治疗有应答，则向该个体施用抗高血压药；或者(ii)如果在多态性座位处的核苷酸对显示该个体对于抗高血压药治疗没有应答，则向该个体施用替代性治疗。

7.权利要求6的方法，其中遗传多态性选自：血管紧张素转化酶(ACE)基因中的SNP_4769、血管紧张素II二型受体(AGTR2)基因中的SNP_1445、AGTR2基因中的SNP_4795以及它们的组合。

8.权利要求6的方法，其中抗高血压药是阿利克仑。

9.用于降低个体平均坐位收缩压(MSSBP)的方法，包括步骤：

(a)获得对于个体中存在的两拷贝基因而言的血管紧张素II二型受体(AGTR2)基因SNP_4795处的核苷酸对的特征；和

(b)(i)如果SNP_4795处的核苷酸对显示该个体对于抗高血压药治疗有应答，则向该个体施用抗高血压药；或者(ii)如果SNP_4795处的核苷酸对显示该个体对于抗高血压药治疗没有应答，则向该个体施用替代性治疗。

10.权利要求9的方法，其中抗高血压药是阿利克仑。

11.降低个体舒张压的方法，包括步骤：

(a)获得对于需要降低舒张压的个体中存在的两拷贝基因而言的一个或多个多态性遗传座位处的核苷酸对的特征，其中遗传座位选自：血管紧张素转化酶(ACE)基因、血管紧张素II二型受体(AGTR2)基因以及它们的组合；和

(b)(i)如果所述一个或多个多态性遗传座位处的核苷酸对的特征显示该个体对于抗高血压药治疗有应答，则向该个体施用抗高血压药；或者(ii)如果所述一个或多个多态性遗传座位处的核苷酸对的特征显示该个体对于抗高血压药治疗没有应答，则向该个体施用替代性治疗。

12.权利要求11的方法，其中抗高血压药是阿利克仑。

13.选自血管紧张素转化酶基因(ACE)和血管紧张素II二型受体基因(AGTR2)的基因的基因产物作为药物活性靶标的用途，其中所述用途包括步骤：

(a)将药物与多核苷酸编码的第一基因产物接触，所述多核苷酸在选定基因区域的多态性位点处具有这样的核苷酸对：其指示对阿利克仑高血压治疗的高度应答性；

(b)鉴定药物对于所述第一基因产物的活性；

(c)将药物与多核苷酸编码的第二基因产物接触，所述多核苷酸在选定基因区域的多态性位点处具有这样的核苷酸对：其指示对阿利克仑高血压治疗的低应答性；

(d)鉴定该药物对于所述第二基因产物的活性；

(e)鉴定在步骤(b)中鉴定到的活性与步骤(d)中鉴定到的活性之间的相似性和差异。

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