MX2007010919A - El uso de acido tiofosfonoformico y nrtis para tratar infecciones virales. - Google Patents

Abstract

Esta invencion proporciona un metodo para reducir sinergisticamente la carga viral en un paciente infectado con un virus. El metodo comprende la co-administracion oral de una cantidad de acido tiofosfonoformico y una cantidad de un inhibidor de transcriptasa inversa de nucleosido o nucleotido en una combinacion sinergistica.

Description

El USO DE ACIDO TIOFOSFONOFOR ICO Y NRTIs PARA TRATAR INFECCIONES VIRALES REFERENCIAS CRUZADAS A SOLICITUDES RELACIONADAS Esta solicitud reivindica el beneficio de la solicitud provisional No. 60/659,136 presentada el 7 de Marzo de 2005, cuyo contenido total se incorpora en la presente mediante la referencia. ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Los NRTIs, que incluyen inhibidores de transcriptasa inversa de nucleósido (NsRTIs) e inhibidores de transcriptasa inversa de nucleótido (NtRTIs) se administran actualmente en tratamientos contra infecciones virales, incluyendo infecciones del virus de inmunodeficiencia humana (VIH) y virus de hepatitis (HBV, HCV) . Desafortunadamente, con frecuencia se desarrolla resistencia viral contra esta clase de fármacos. Ver, Daar y Richman, AIDS Res Hum Retroviruses, (2005) 21:343-57. Además diversos efectos secundarios de los NRTIs son dañinos al paciente y pueden desalentar la aceptación del paciente, disminuyendo la efectividad de esta clase de fármacos. Ver, por ejemplo, Raines et al., J. Assoc Nurses AIDS Care (2005) 16:35; Cherry et al., Sex Health (2005) 2:1; Abrescia, et al., Curr Pharm Des., (2005) 11:3697. El ácido tiofosfonofórmico ("Thiovir™") es un reemplazo oral que contiene azufre para foscarnet, un antiviral de amplio espectro altamente efectivo con un uso limitado debido a su toxicidad y baja biodisponibilidad. Una forma oral de ácido tiofosfonofórmico (Thiovir™) en desarrollo por el Cesionario de la presente, proporciona una mejorada eficacia y biodisponibilidad haciéndola un atractivo candidato clínico. Se ha sugerido combinar el ácido tiofosfonofórmico con otros compuestos antivirales tales como zidovudina (AZT) . Ver Patente de E.U. No. 5,183,812 (columna 21). Sin embargo, no se han reconocido los efectos antivirales sinergisticos logrados combinando el ácido tiofosfonofórmico con uno o más NRTIs, que podrían permitir la reducción de las dosis eficaces de uno o ambos de estos agentes activos. Existe la necesidad de mejorar la efectividad del ácido tiofosfonofórmico y los NRTIs previniendo o retardando la resistencia viral, y disminuyendo las dosis para reducir las toxicidades y los indeseables efectos secundarios mientras se mantiene aún la eficacia para reducir la carga viral en un paciente . La presente invención se dirige a esta y otras necesidades . BREVE SUMARIO DE LA INVENCIÓN La presente invención proporciona métodos y composiciones para el co-suministro a un individuo que lo necesita, de una combinación de ácido tiofosfonofórmico y un NRTI, en donde los agentes activos se suministran en proporciones y cantidades tales que su actividad antiviral combinada es sinergistica. Por consiguiente, en un primer aspecto, la invención proporciona métodos para reducir la carga viral o la titulación viral en un paciente infectado con un virus, comprendiendo el método la co-administración oral al paciente de una cantidad de ácido tiofosfonofórmico y una cantidad de uno o más de un inhibidor de transcriptasa inversa de nucleósido o nucleótido, o mezclas de los mismos, en donde las cantidades que se co-administran son suficientes para disminuir sinergisticamente la carga viral o la titulación viral y en donde el ácido tiofosfonofórmico se administra oralmente en un rango de dosis de entre 2 mg/kg y 50 mg/kg al dia. En otro aspecto, la invención proporciona métodos para prevenir o retardar la resistencia de un virus a un NRTI, comprendiendo el método la co-administración oral al paciente, de una cantidad de ácido tiofosfonofórmico y una cantidad de uno o más de un inhibidor de transcriptasa inversa de nucleósido o nucleótido, o mezclas de los mismos, en donde las cantidades que se co-administran son suficientes para disminuir sinergisticamente la carga viral o la titulación viral y en donde el ácido tiofosfonofórmico se administra oralmente en un rango de dosis de entre 2 mg/kg y 50 mg/kg al dia. El ácido tiofosfonofórmico puede administrarse eficazmente de acuerdo con los presentes métodos y en la presentes composiciones en dosis que son entre aproximadamente 10 veces y 100 veces menores en comparación con las dosis en las cuales el ácido tiofosfonofórmico se administra sin un NRTI. En algunas modalidades, el ácido tiofosfonofórmico se administra de acuerdo con la presente invención en dosis que son 200 veces, o 300 veces menores en comparación con las dosis en las cuales se administra el ácido tiofosfonofórmico sin un NRTI. En algunas modalidades, el ácido tiofosfonofórmico se administra en un rango de dosis de entre 2 mg/kg y 50 mg/kg al dia. En algunas modalidades, el ácido tiofosfonofórmico se administra en un rango de dosis de entre 15 mg/kg y 40 mg/kg o de 20 mg/kg a 35 mg/kg al dia. En algunas modalidades, el ácido tiofosfonofórmico se administra en una dosis de aproximadamente 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 mg/kg al dia. Cuando se co-administra con ácido tiofosfonofórmico, el NRTI puede administrarse eficazmente en dosis que son aproximadamente 2 veces, 5 veces, 10 veces, 20 veces, 50 veces, 100 veces menores en comparación con las dosis en las cuales se administra en NRTI sin ácido tiofosfonofórmico. En algunas modalidades, se co-administra un inhibidor de transcriptasa inversa de nucleósido. El inhibidor de transcriptasa inversa de nucleósido puede ser, por ejemplo, zidovudina, didanosina, stavudina, lamivudina, abacavir, emtricitabina, zalcitabina, dexelvucitabina, alovudina, amdoxovir, elvucitabina, AVX754, BCH-189, fosfazid, racivir, SP1093V, stampidina o mezclas de los mismos. En algunas modalidades, el inhibidor de transcriptasa inversa de nucleósido es zidovudina. En algunas modalidades, se co-administra un inhibidor de transcriptasa inversa de nucleótido. En algunas modalidades el inhibidor de transcriptasa inversa de nucleótido es tenofovir, adefovir o mezclas de los mismos. En algunas modalidades, el virus es un retrovirus. El retrovirus puede ser un lentivirus. El lentivirus puede ser, por ejemplo, VIH (virus de inmunodeficiencia humana) , VIB (virus de inmunodeficiencia bovino) , VEAC (virus de encefalitis-artritis caprina) , VAIE (virus de anemia infecciosa equina) , VIF (virus de inmunodeficiencia felina) , VLG (virus de leucoencefalitis de cabra) , VJD ( Jembrana) , VMV (virus maedi/visna) , VPP (virus de neumonía progresiva) , VIS (virus de inmunodeficiencia de simio) . En algunas modalidades, el lentivirus es un virus linfotrópico de célula T, por ejemplo, un virus de inmunodeficiencia humana (VIH).

El VIH puede ser tipo 1 (VIH-1), o tipo 2 (VIH-2). El VIH puede ser de cualquier clase, cepa o variante de VIH /e.g., A-G), incluyendo, por ejemplo, VIH-1 : RV-2/SF-2 ; VIH-1:VRU(LAI); VIH-1:CAM1; VIH-1:ELI; VIH-1:HXB2; VIH-1:IIIB; VIH-1:MAL; VIH-1:MN; VIH-1:NDK; VIH-1:PV22; VIH-1:RF; VIH-1:U455; VIH-1:Z2. En algunas modalidades, el virus es un virus de herpes. El virus de herpes puede ser un Alphaherpesvirus, por ejemplo, un Simplexvirus (e.g., virus de herpes 1 humano) o un Varicellovirus (e.g., virus de herpes 3 humano o virus 1 de Varicella-Zoster (VSV1)) . El virus de herpes puede ser un Betaherpesvirus, por ejemplo, un Cytomegalovirus (e.g., virus de herpes 5 humano) o un Roseolovirus (e.g., virus de herpes 6 humano) . En algunas modalidades, el virus de herpes es un Gammaherpesvirus, por ejemplo, un Lymphocryptovirus (e.g., virus de herpes 4 humano o virus Epstein-Barr (EBV) ) o un Rhadinovirus (e.g., virus de herpes 2 Ateline) . Según sea apropiado, el ácido tiofosfonofórmico y el NRTI pueden co-administrarse simultánea o secuencialmente. En algunas modalidades, el ácido tiofosfonofórmico y el NRTI se administran simultáneamente en una formulación combinada. El ácido tiofosfonofórmico y el NRTI pueden administrarse oral o parenteralmente. En algunas modalidades, al menos uno del ácido tiofosfonofórmico y el NRTI se administra oralmente. En algunas modalidades, al menos uno del ácido tiofosfonofórmico y el NRTI se administra parenteralmente, por ejemplo, de manera intravenosa. Las formulaciones orales pueden ser sólidas (e.g., tabletas, cápsulas, polvos) o liquidas (e.g., jarabe). En algunas modalidades el acido tiofosfonofórmico y el inhibidor de transcriptasa inversa de nucleósido o nucleótido se administran concurrentemente en una formulación oral combinada . La invención proporciona además un medicamento oral para disminuir la carga viral o la titulación viral en un paciente infectado con un virus, en donde el medicamento es una formulación combinada que comprende una cantidad de acido tiofosfonofórmico y una cantidad de un NRTI en donde el ácido tiofosfonofórmico y el NRTI se encuentran presentes en cantidades suficientes para disminuir sinergisticamente la carga viral o la titulación viral, y el medicamento contiene entre 150 mg y 750 mg de ácido tiofosfonofórmico por formulación combinada. La invención proporciona además el uso de acido tiofosfonoformico y un inhibidor de transcpptasa inversa de nucleosido o nucleotido en la manufactura de un medicamento para el tratamiento terapéutico y/o profiláctico de una infección viral en donde el ácido tiofosfonofórmico y el inhibidor de transcriptasa inversa de nucleósido o nucleotido se encuentran presentes en una cantidad suficiente para disminuir smergisticamente la carga viral o la titulación viral, y el medicamento contiene entre 150 mg y 750 mg de ácido tiofosfonofórmico por formulación combinada. La invención proporciona además el uso de ácido tiofosfonofórmico y un inhibidor de transcriptasa inversa de nucleósido o nucleótido en la preparación de un agente antiviral en una forma de fármaco listo para usarse para el tratamiento o prevención de infecciones por virus en donde el ácido tiofosfonofórmico y el inhibidor de transcriptasa inversa de nucleósido o nucleótido se encuentran presentes para disminuir sinergisticamente la carga viral o la titulación viral, y la forma de fármaco listo para usarse contiene entre 150 mg y 750 mg de ácido tiofosfonofórmico por forma . Las modalidades preferidas para las composiciones y los usos son los mismos descritos anteriormente. BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La Figura 1 ilustra un panel de VIH-1 resistentes a NRTI y NNRTI. Se probó la susceptibilidad al NRTI y NNRTI mediante un análisis informante PhenoSense™ como se describe en los Ejemplos. Los números que representan los rangos de cambio de duplicación de la susceptibilidad al fármaco son como sigue: 1:> 2.5 veces, 2:2.5 a 10 veces, 3:10 a 50 veces y 4:>50 veces. Panel Derecho: mutaciones especificas en cada virus variante que confieren resistencia a NRTI y NNRTI. La Figura 2 ilustra que el panel de virus VIH-1 resistentes a NRTI y NNRTI de la Figura 1 son sensitivos a foscarnet y Thiovir™. Panel Izquierdo: idéntico al de la Figura 1. Panel Derecho: susceptibilidad del virus resistente a stavudina, zidovudina, efavirenz, foscarnet.

Nevirapina y Thiovir™. El IC50 se determinó mediante un análisis informante PhenoSense™. El Cambio de Duplicación (FC) se determinó por IC50 paciente/IC5o referencia. La referencia IC50 es la de un virus estándar de tipo silvestre.

S/R indica si un virus se considera sensible (S) o resistente (R) a un fármaco. Corte clínico, el nivel al cual aumenta significativamente la probabilidad de falla, se encuentra resaltado en gris claro y la hipersensibilidad en gris oscuro. DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN 1. Introducción El ácido tiofosfonofórmico (TPFA) es un análogo de azufre del terapéutico antiviral de amplio espectro foscarnet (ácido fosfonofórmico; PFA) . Foscarnet, un inhibidor no nucleósido de transcriptasa inversa (NNRTI), es un análogo de pirofosfato con un modo único de acción entre los fármacos NNRTI. Foscarnet inhibe el intercambio de pirofosfato mediante ADN polimerasas virales a través de la unión competitiva por el sitio de unión de enzima de pirofosfato. Foscarnet y sus análogos, tales como Thiovir™, inhiben el alargamiento de la cadena de ADN catalizada por polimerasas de ADN viral que conducen a la inhibición de la replicación viral de virus tanto de ADN como de ARN, incluyendo VIH. Estudios de la eficacia anti-VIH in vitro indican que Thiovir™ tiene actividad antiviral contra diversas cepas complejas resistentes a NRTI y NNRTI. Todas las variantes de VIH-1 examinadas fueron sensibles a Thiovir™ y foscarnet. En la mayoria de los casos, las variantes de VIH-1 fueron hipersensibles a Thiovir™ en comparación con el virus de tipo silvestre . Estudios de eficacia que examinan la terapia de combinación de Thiovir™ más fármacos de NsRTI o NtRTI muestran la actividad antiviral sinergistica. En consecuencia, la dosis de Thiovir™ puede disminuirse permitiendo regímenes de fármaco adecuados combinando Thiovir™ con inhibidores nucleósido o nucleótido de transcriptasa inversa. Por ejemplo, Thiovir™ combinado con zidovudina (AZT) da como resultado una fuerte actividad sinergistica mientras que combinaciones de foscarnet y zidovudina solo exhiben un suave comportamiento de sinergistico a antagonistico. El perfil de resistencia de Thiovir™, como foscarnet, es único entre los NNRTIs reflejando el distinto mecanismo de acción de esta clase de fármaco. Los virus seleccionados por su resistencia a Thiovir™ in vitro muestran hipersensibilidad a AZT. En consecuencia, Thiovir™ puede permitir nuevamente el uso de AZT en pacientes resistentes a AZT. Además, no tuvieron éxito todos los intentos de selección de virus co-resistentes tanto a Thiovir™ como a AZT. Esto sugiere que los perfiles de resistencia de Thiovir™ y AZT son mutuamente exclusivos (i.e., son inhibidores competitivos entre si). En conjunto, estos datos proporcionan un soporte favorable para el tratamiento de combinación con Thiovir™ y AZT. 2. Definiciones el término "retrovirus" se refiere a una clase de virus envueltos de la familia Retroviridae (código 61 de la taxonomía) que tienen su material genético en forma de ARN y utilizan la enzima transcriptasa inversa para trasladar su ARN a ADN en la célula huésped (ver también, Coffin et al., Retroviruses, (1997) Cold Spring Harbor Laboratory Press). Los géneros de retrovirus incluyen Alpharetrovirus, Betaretrovirus, Gammaretrovirus, Deltaretrovirus, Epsilonretrovirus y Lentivirus. La taxonomía de virus se describe en la red mundial en ncbi-nlm.nih.gov/ICTVdb/ICTVdB. El término "virus de herpes" se refiere a un virus de ADN envuelto dentro de la familia del virus Herpesviridae (Código 31 de la taxonomía de virus). El término "carga viral" o "titulación viral" se refiere de manera intercambiable al número de partículas de virus en una muestra del fluido corporal (e.g., sangre, suero, plasma, saliva, orina) de un individuo afectado.

El término "sinergistico" o "sinergia" se refiere de manera intercambiable a la interacción de dos o más agentes a fin de que su efecto combinado sea mayor que la suma de sus efectos individuales. Las interacciones sinergisticas del fármaco pueden determinarse utilizando el principio del efecto medio (ver, Chou y Talalay (1984) Adv Enzyme Regul 22:27 y Synergism and Antagonism in Chemotherapy, Chou y Rideout, eds., 1996, Academic pp . 61.102) y se determinan cuantitativamente mediante Índices de combinación utilizando el programa computarizado Calcusyn (Chou y Hayball, 1996, Biosoft, Cambridge, MA) . Ver también, Reynolds y Maurer, Capitulo 14 en Methods in Molecular Medicine, vol. 110; Chemosensitivity, Vol. 1: In Vitro Assays, Blumenthal, ed., 2005, Humana Press. Los Índices de combinación (Cl) cuantifican la sinergia, adición y antagonismo como sigue: CKl (sinergia); CI=1 (adición); CI>1 (antagonismo). Un valor Cl de 0.7-0.9 indica un sinergismo de moderado a ligero. Un valor Cl de 0.3-0.7 indica sinergismo. Un valor Cl de 0.1-0.3 indica fuerte sinergismo. Un valor Cl de <0.1 indica muy fuerte sinergismo. La frase "suficiente para disminuir sinergisticamente la carga viral o la titulación viral" se refiere a una cantidad y proporción tal, de dos o más agentes activos, que sus efectos combinados disminuyen la titulación viral o la carga viral mayor que la suma de los agentes activos individuales. El efecto sinergistico en la carga viral se calcula in vitro o in vivo utilizando pruebas conocidas en la técnica, incluyendo las pruebas descritas en la presente (e.g., análisis MAGI, análisis p24). Las cantidades y proporciones suficientes de los dos o más agentes activos para operar sinergisticamente en la disminución de la carga viral, pueden determinarse por las cantidades administradas o por las concentraciones de los agentes activos en un fluido corporal (e.g., sangre, suero, plasma, saliva, orina) . El término "ácido tiofosfonofórmico" o "TPFA" o "Thiovir™" se refieren de manera intercambiable a un análogo tio de ácido fosfonofórmico que tiene la siguiente fórmula química (HO) 2P (S) COOH: El término "inhibidor de transcriptasa inversa de nucleósido" o "NsRTI", se refiere a un miembro de una clase de fármacos que son análogos químicos de un nucleósido que inhibe una enzima viral de transcriptasa o polimerasa inversa y en consecuencia, la capacidad de un virus para infectar a una célula huésped. Un inhibidor de transcriptasa inversa de nucleósido puede ser un análogo químico de un ribonucleósido o un desoxirribonucleósido.

El término "inhibidor de transcriptasa inversa de nucleótido" o "NtRTI", se refiere a un miembro de una clase de fármacos que son análogos químicos de un nucleótido (un nucleósido 5' -monofosfato) que inhibe una enzima viral de transcriptasa o polimerasa inversa y en consecuencia, la capacidad de un virus para infectar a una célula huésped. Un inhibidor de transcriptasa inversa de nucleótido puede ser un análogo químico de un ribonucleótido o un desoxirribonucleótido . El término "inhibidor no nucleósido de transcriptasa inversa" o "NNRTI" se refiere a una clase de fármacos que no son análogos químicos de un nucleósido o nucleótido y que inhiben alostéricamente una enzima viral de transcriptasa o polimerasa inversa. Un NNRTI se une a una transcriptasa o polimerasa inversa en un sitio distinto al sitio de unión de un NRTI, i.e., el sitio activo de la enzima . El término "co-administrar" se refiere a la presencia simultánea de dos agentes activos en la sangre de un individuo. Los agentes activos que se co-administran pueden suministrarse concurrente o secuencialmente. 3. Composiciones La presente invención proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden un mezcla de una cantidad efectiva de ácido tiofosfonofórmico y una cantidad efectiva de uno o más inhibidores nucleósido/nucleótido de transcriptasa inversa, de tal manera que las cantidades y proporciones de los agentes activos disminuyen sinergisticamente la carga viral en un individuo. i . Agentes Activos 1. Ácido tiofosfonofórmico Como se utiliza en la presente, ácido tiofosfonofórmico /TPFA) o "Thiovir™" se refiere a un agente activo que tiene la siguiente fórmula química: Se describen tiofosfonatos, incluyendo Thiovir, y métodos para su sintesis, por ejemplo, en las Patentes de E.U. Nos. 5,072,032; 5,183,812; 6,147,244 y 6,284,909, cuyo contenido completo se incorpora en la presente por la referencia para todo propósito. El ácido tiofosfonofórmico también puede sintetizarse a través de proveedores de servicio comercial, por ejemplo, Natland International Corp., Morrisville, NC; Custom Synthesis Inc., Delray Beach, FL; D Pharm Innovative Biopharmaceuticals, Princeton, NJ y Chemshop, Weert, Paises Bajos . 2. Inhibidores de transcriptasa inversa de nucleósido Cualquier inhibidor de transcriptasa inversa de nucleósido (NsRTI), o sus mezclas, encuentra su uso en los presentes métodos y composiciones. Los NsRTIs ejemplificados incluyen, sin limitación, zidovudina (AZT) , didanosina, estavudina, lamivudina, abacavir, emtricitabina, zalacitabina, dexelvucitabina, alovudina, amdoxovir, elvucitabina, AVX754, BCH-189, fosfazid, racivir, SP1093V, estampidina, fosfonovir, y sus combinaciones. Los expertos en la técnica reconocerán que otros análogos de adenosina, guanosina, citidina, timina y uridina funcionarán como NsRTIs. Los NsRTIs útiles adicionales se describen por ejemplo, en las Patentes de E.U. Nos. 6,514,979; 6,503,890; 6,995,283; y las Publicaciones de Patente de E.U. Nos. 2004/0235869 y 2004/0127436, cuyas descripciones se incorporan en la presente por la referencia en su totalidad para todo propósito. Un inhibidor de transcriptasa inversa de nucleósido puede determinarse por su función para inhibir la actividad enzimática de una transcriptasa inversa (RT) . Son muy conocidos en la técnica los análisis para la determinación de la inhibición de una transcriptasa inversa. Por ejemplo, en un análisis, se determina la actividad de la transcriptasa inversa monitoreando la formación del producto de ácido de núcleos marcados de manera radiactiva absorbido sobre discos de papel de intercambio iónico en presencia o ausencia de un inhibidor de RT candidato. (Ver, por ejemplo, Canard, et al., (1999) 274:35768; Meyer et al., (2000) EMBO J. 19:3520; Selmi et al., (2001) J. Biol Chem 276:13965; y Deval et al., (2004) J. Biol. Chem 279:25489). 3. Inhibidores de transcriptasa inversa de nucleótido Cualquier inhibidor de transcriptasa inversa de nucleótido (NtRTI), o sus mezclas, encuentra su uso en los presentes métodos y composiciones. Los NtRTIs ejemplificados incluyen, sin limitación, tenofovir, adefovir y combinaciones de los mismos. Los expertos en la técnica reconocerán que otros análogos de adenosina 5' -monofosfato (AMP), guanosina 5' -monofosfato (GMP), citidina 5' -monofosfato (CMP), timina 5' -monofosfato (dTMP) y uridina 5' -monofosfato (UMP funcionarán como NtRTIs. Además los NsRTIs antes tratados pueden encontrarse en forma de nucleótido. Los NtRTIs útiles adicionales se describen, por ejemplo, en la Publicación de Patente de E.U. No. 2004/0127436, cuya descripción se incorpora en la presente por la referencia en su totalidad para todo propósito. Un inhibidor de transcriptasa inversa de nucleótido puede determinarse por su función para inhibir la actividad enzimática de una transcriptasa inversa (RT) , por ejemplo, utilizando los análisis antes descritos. 4. Otros Ingredientes Activos Combinaciones de ácido tiofosfonofórmico y uno o más inhibidores nucleósido/nucleótido de transcriptasa inversa pueden administrarse con ingredientes activos adicionales utilizados en el tratamiento contra infección viral. Por ejemplo, pueden co-administrarse combinaciones de ácido tiofosfonofórmico y uno o más inhibidores nucleósido/nucleótido de transcriptasa inversa, con inhibidores proteasa, o con uno o más NNRTIs adicionales, como parte de una terapia anti-retroviral altamente activa (HAART) en el tratamiento de VIH. En algunas modalidades, las composiciones farmacéuticas comprenden uno o más inhibidores de transcriptasa inversa de nucleósido seleccionados del grupo que consiste de zidovudina (AZT) , didanosina, estavudina, lamivudina, abacavir, emtricitabina, zalacitabina, dexelvucitabina, alovudina, amdoxovir, elvucitabina, AVX754, BCH-189, fosfazid, racivir, SP1093V, estampidina, fosfonovir, idoxuridina. En algunas modalidades, las composiciones farmacéuticas comprenden uno o más inhibidores de transcriptasa inversa de nucleótido seleccionados del grupo que consiste de tenofovir y adefovir. Una combinación de ácido tiofosfonofórmico y un inhibidor nucleósido/nucleótido de transcriptasa inversa de esta invención, puede incorporarse en una variedad de formulaciones para administración terapéutica. Más particularmente, una combinación de la presente invención puede formularse en composiciones farmacéuticas, conjuntamente o por separado, mediante su formulación con vehiculos o diluyentes apropiados farmacéuticamente aceptables, y puede formularse en preparaciones en formas sólidas, semisólidas, liquidas o gaseosas, tales como tabletas, cápsulas, pildoras, polvos, granulos, pastillas, geles, mezclas, ungüentos, soluciones, supositorios, inyecciones, inhalantes y aerosoles. Como tal, la administración de una combinación de ácido tiofosfonofórmico e inhibidor nucleósido/nucleótido de transcriptasa inversa puede lograrse de varias maneras incluyendo la administración oral, bucal, parenteral, intravenosa, intradérmica (e.g., subcutánea, intramuscular), tópica, transdérmica, etc. además, el compuesto puede administrarse de manera local en lugar de sistémica, por ejemplo, en una formulación de depósito o de liberación sostenida. En una modalidad preferida, la invención proporciona una composición farmacéutica comprendida de ácido tiofosfonofórmico y uno o más inhibidores nucleósido/nucleótido de transcriptasa inversa para suministro oral (e.g., una tableta, un cápsula, un polvo, un liquido, un jarabe etc.). Las formulaciones adecuadas para su uso en la presente invención pueden encontrarse en Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20a y 21a ediciones, supra.

Las composiciones farmacéuticas descritas en la presente pueden manufacturarse de la manera conocida por los de experiencia ordinaria en la técnica, i.e., por medio de procesos de mezclado, disolución, granulado, preparación de pastillas, levagación, emulsificación, encapsulación, atrapamiento o liofilización convencionales. Los siguientes métodos y excipientes son meramente ejemplares y de ninguna manera limitantes. En una modalidad preferida, una combinación de ácido tiofosfonofórmico e inhibidor nucleósido/nucleótido de transcriptasa inversa se prepara para suministro en una formulación de liberación sostenida, liberación controlada, liberación extendida, liberación por tiempo o liberación retardada, por ejemplo, en matrices semi-permeables de polimeros hidrófobos sólidos que contienen el agente terapéutico. Se han establecido diversos tipos de materiales de liberación sostenida y son muy conocidos por los expertos en la técnica. Las formulaciones actuales de liberación extendida incluyen tabletas recubiertas con películas, sistemas de multiparticulas o pildoras, tecnologías de matriz que utilizan materiales hidrófilos o lipófilos y tabletas a base de ceras con excipientes formadores de poro (ver, por ejemplo, Huang et al., Drug Dev. Ind. Pharm. 29:79 (2003); Pearnchob et al., Drug Dev. Ind. Pharm., 29:925 (2003); Maggi et al., Eur. J. Pharm. Biopharm. , 55:99 (2003); Khanvilkar et al., Drug Dev. Ind. Pharm., 228:601 (2002); y Schmidt et al., Int. J. Pharm., 216:9 (2001)). Los sistemas de suministro de liberación sostenida, dependiendo de su diseño, pueden liberar los compuestos durante el curso de horas o dias, por ejemplo, durante 4, 6, 8, 10, 12, 16, 20, 24 horas o más. Por ejemplo, las formulaciones de liberación sostenida pueden prepararse utilizando polimeros de origen natural o sintéticos, por ejemplo, vinil pirrolidonas poliméricas, tales como polivinil pirrolidona (PVP); polimeros hidrófilos de carboxivinilo; hidrocoloides hidrófobos y/o hidrófilos, tales como metilcelulosa, etilcelulosa, hidroxipropilcelulosa, y hidroxipropilmetilcelulosa; y carboxipolimetileno . Las formulaciones de liberación sostenida o extendida también pueden prepararse utilizando ingredientes naturales, tales como minerales, incluyendo dióxido de titanio, dióxido de silicona, óxido de zinc, y arcilla (ver, Patente de E.U. No. 6,638,521, incorporada en la presente por la referencia). Las formulación de liberación extendida ejemplificadas que pueden utilizarse en el suministro de una combinación de ácido tiofosfonofórmico e inhibidor nucleósido/nucleótido de transcriptasa inversa de la presente invención, incluyen aquellas descritas en las Patentes de E.U. Nos. 6,635,680; 6,624,200; 6,613,361; 6,613,358; 6,596,308; 6,589,563; 6,562,375; 6,548,084; 6,541,020; 6,537,579; 6,528.080 y 6,524,621, cada una de las cuales se incorpora en la presente por la referencia. Las formulaciones de liberación controlada de interés particular incluyen aquellas descritas en las Patentes de E.U. Nos. 6,607,751; 6,599,529; 6,569,463; 6,565,883; 6,482,440; 6,403,597; 6,319,919; 6,150,354; 6,080,736; 5,672,356; 5,472,704; 5,445,829; 5,312,817 y 5,296,483, cada una de las cuales se incorpora en la presente por la referencia. Los expertos en la técnica reconocerán fácilmente otras formulaciones de liberación sostenida aplicables. Para administración oral, una combinación de ácido tiofosfonofórmico e inhibidor nucleósido/nucleótido de transcriptasa inversa puede formularse fácilmente combinando con vehiculos farmacéuticamente aceptables muy conocidos en la técnica. tales vehiculos permiten formular los compuestos como tabletas, pildoras, grageas, cápsulas, emulsiones, suspensiones lipófilas e hidrófilas, líquidos, geles, jarabes, mezclas, suspensiones y lo similar para ingestión oral por el paciente que va a tratarse. Las composiciones farmacéuticas para uso oral pueden obtenerse mezclando los compuestos con un excipiente sólido, opcionalmente pulverizando una mezcla resultante, y procesando la mezcla de granulos, después de agregar auxiliares adecuados, si se desea, para obtener núcleos de tabletas o pastillas. Los excipientes adecuados son, en particular, rellenadores tales como azúcares, incluyendo lactosa, sucrosa, manitol, o sorbitol; preparaciones de celulosa tales como, por ejemplo, almidón de maiz, almidón de trigo, almidón de arroz, gelatina, goma tragacanto, metil celulosa, hidroxipropilmetil celulosa, carboximetilcelulosa de sodio y/o polivinilpirrolidona (PVP). Si se desea, pueden agregarse agentes de desintegración, tales como polivinil pirrolidona reticulada, agar, o ácido alginico o una sal del mismo tal como alginato de sodio. Las preparaciones farmacéuticas que pueden utilizarse oralmente incluyen cápsulas de ajuste a presión hechas de gelatina, asi como cápsulas suaves selladas hechas de gelatina y un plastificador, tal como glicerol o sorbitol. Las cápsulas de ajuste a presión pueden contener los ingredientes activos en mezcla con un rellenador tal como lactosa, enlazadores tales como almidones y/o lubricantes tales como talco o estearato de magnesio y, opcionalmente, estabilizadores. En cápsulas suaves, los compuestos activos pueden disolverse o suspenderse en líquidos adecuados, tales como aceites grasos, parafina liquida, o polietileno glicoles líquidos. Adicionalmente, pueden agregarse estabilizadores. Todas las formulaciones para administración oral deben encontrarse en dosis adecuadas para tal administración. Los núcleos de pastillas se proveen con recubrimientos adecuados. Para este propósito, pueden utilizarse soluciones concentradas de azúcar, que pueden contener opcionalmente, goma arábica, talco, polivinil pirrolidona, gel carbopol, polietileno glicol y/o dióxido de titanio, soluciones de laqueado, y solventes orgánicos adecuados o mezclas de solventes. Pueden agregarse colorantes o pigmentos a los recubrimientos de tabletas o pastillas para su identificación, para caracterizar diferentes combinaciones de dosis del compuesto activo. Los compuestos pueden formularse para administración parenteral mediante inyección, e.g., mediante inyección en bolo o infusión continua. Para inyección, una combinación de ácido tiofosfonofórmico e inhibidor nucleósido/nucleótido de transcriptasa inversa puede formularse en preparaciones disolviéndolos, suspendiéndolos o emulsificándolos en un solvente acuoso o no acuoso, tal como aceite vegetales u otros similares, glicéridos sintéticos de ácido alifático, esteres de ácidos alifáticos mayores o propileno glicol; y si se desea, con aditivos convencionales tales como solubilizadores, agentes isotónicos, agentes de suspensión, agentes de emulsificación, estabilizadores y preservativos. Preferentemente, la combinación de la invención puede formularse en soluciones acuosas, preferentemente en amortiguadores fisiológicamente compatibles tales como solución de Hank, solución de Ringer, o amortiguador de salina fisiológica. Las formulaciones para inyección pueden presentarse en forma de dosis unitaria, e.g., en ampolletas o en envases de dosis múltiple, con un preservativo agregado. Las composiciones pueden tomar formas tales como suspensiones, soluciones o emulsiones en vehiculos oleaginosos o acuosos, y pueden contener agentes de formulación tales como agentes de suspensión, estabilización y/o dispersión. Las formulaciones farmacéuticas para administración parenteral incluyen soluciones acuosas de los compuestos activos en forma soluble en agua. Adicionalmente, las suspensiones de los compuestos activos pueden prepararse como suspensiones oleaginosas para inyección apropiadas. Los solventes o vehiculos lipófilos adecuados incluyen aceites grasos tales como aceite de ajonjolí, o esteres sintéticos de ácido graso, tales como etil oleato o triglicéridos, o liposomas. Las suspensiones acuosas para inyección pueden contener sustancias que incrementan la viscosidad de la inyección, tales como carboximetilcelulosa de sodio, sorbitol o dextran. Opcionalmente, la suspensión puede contener también estabilizadores o agentes adecuados que incrementan la solubilidad de los compuestos para permitir la preparación de soluciones altamente concentradas. Alternativamente, el ingrediente puede encontrarse en forma de polvo para reconstitución con un vehiculo adecuado, e.g., agua estéril libre de pirógeno, antes de su uso.

Para administración tópica, los agentes se formulan en ungüentos, cremas, pomadas, polvos y geles. La administración sistémica también puede ser por medios transmucosos o transdérmicos. Para la administración transmucosa o transdérmica, se utilizan en la formulación penetrantes apropiados para permear la barrera. En una modalidad, el agente de suministro transdérmico puede ser, por ejemplo, DMSO, urea, l-metil-2-pirrolidona, ácido oleico, o un terpeno (e.g., 1-mentol, d-limoneno, RS- (+/-) -beta-citronelol, geraniol). Se describen mejoradores de penetración percutánea adicionales, por ejemplo, en Percutaneous Penetration Enhancers, Smith y Maibach, eds., 2a edición, 2005, CRC Press. Los sistemas de suministro transdérmico pueden incluir, e.g., parches. Para administración transmucosa, se utilizan en la formulación penetrantes apropiados para permear la barrera. Tales penetrantes se conocen generalmente en la técnica. Las formulaciones de suministro transdérmico ejemplificadas que pueden utilizarse en la presente incluyen aquellas descritas en las Patentes de E.U. Nos. 6,589,549; 6,544,548; 6,517,864; 6,512,010; 6,465,006; 6,379,696; 6,312,717 y 6,310,177, cada una de las cuales se incorpora en la presente por la referencia . Para administración bucal, las composiciones pueden tomar la forma de tabletas o pastillas formuladas de manera convencional . Además de las formulaciones descritas previamente, la combinación de ácido tiofosfonofórmico e inhibidor nucleósido/nucleótido de transcriptasa inversa de la presente invención puede formularse también como una preparación de depósito. Tales formulaciones de acción prolongada pueden administrarse mediante implantación (por ejemplo, de manera subcutánea o intramuscular) o mediante inyección intramuscular. Por consiguiente, por ejemplo, los compuestos pueden formularse con materiales poliméricos o hidrófobos adecuados (por ejemplo, como una emulsión en un aceite aceptable) o resinas de intercambio iónico, o como derivados solubles de reserva, por ejemplo, como una sal soluble de reserva . La composición farmacéutica también puede comprender vehiculos o excipientes en fase sólida o de gel apropiados. Ejemplos de tales vehiculos o excipientes incluyen, pero no se limitan a, carbonato de calcio, fosfato de calcio, diversos azúcares, almidones, derivados de celulosa, gelatina y polimeros tales como polietileno glicoles . Las composiciones farmacéuticas adecuadas para su uso en la presente invención incluyen composiciones en las cuales los ingredientes activos se encuentran contenidos en una cantidad terapéuticamente efectiva. La cantidad de la composición administrada, por supuesto, dependerá del sujeto que se trata, del peso del sujeto, la severidad de la aflicción, la manera de administración y el juicio del médico que prescribe. La determinación de una cantidad efectiva se encuentra en la capacidad de los expertos en la técnica, especialmente a la luz de la descripción detallada proporcionada en la presente. Generalmente, una cantidad eficaz o efectiva de la combinación de ácido tiofosfonofórmico e inhibidor nucleósido/nucleótido de transcriptasa inversa se determina administrando primero una dosis baja de uno o ambos agentes activos y después incrementando en aumento la dosis o las dosis administradas hasta observar un efecto deseado de reducción de la titulación viral en el sujeto tratado, con efectos secundarios mínimos o no tóxicos. Los métodos aplicables para determinar la dosis apropiada y el programa de dosificación para la administración de la combinación de la presente invención se describen, por ejemplo, en Goodman y Gilman, The Pharmacological Basis of Therapeutics, 11a edición, supra, y en Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20a y 21a ediciones, supra. La cantidad de dosis y los intervalos pueden ajustarse individualmente para proporcionar niveles en plasma de los compuestos activos, suficientes para mantener el efecto terapéutico. Preferentemente, se lograrán niveles en suero terapéuticamente efectivos administrando dosis diarias únicas, pero se incluyen en la invención programas eficaces de dosis diarias múltiples. En los casos de administración local o absorción selectiva, la concentración local efectiva del fármaco puede no relacionarse con la concentración en plasma. El experto en la técnica será capaz de optimizar las dosis locales terapéuticamente efectivas sin experimentación indebida . . Métodos a . Co-administración de ácido tiofosfonofórmico y un inhibidor nucleósido/nucleótido de transcriptasa inversa Los presentes métodos se dirigen a la coadministración de ácido tiofosfonofórmico (TPFA) y uno o más inhibidores nucleósido/nucleótido de transcriptasa inversa (NrRTI y/o NtRTI) . El ácido tiofosfonofórmico y el NrRTI y/o NsRTI pueden suministrarse concurrentemente o secuencialmente, siempre que tanto el ácido tiofosfonofórmico como el NrRTI y/o NsRTI se encuentren presentes en la sangre, i. Vias de Administración Como se trató anteriormente, el ácido tiofosfonofórmico y uno o más inhibidores nucleósido/nucleótido de transcriptasa inversa pueden coadministrarse independientemente mediante cualquier via de administración apropiada. Los ingredientes activos pueden administrarse mediante la misma o diferente via de administración, según sea apropiado. En algunas modalidades, al menos uno de los ingredientes activos se administra oralmente. En algunas modalidades, la combinación de los ingredientes activos se administra oralmente de manera concurrente. En algunas modalidades, al menos uno de los ingredientes activos se administra parenteralmente, por ejemplo, de manera intravenosa, intramuscular, subcutánea, tópica, intravaginal, rectal, intranasal, intratecal, intraocular . La combinación de ácido tiofosfonofórmico y uno o más inhibidores nucleósido/nucleótido de transcriptasa inversa puede administrarse a un sujeto, e.g., un paciente humano, un animal doméstico (e.g., un gato o un perro), un animal agrícola (e.g., un caballo, una vaca, una oveja o una cabra) , independientemente o conjuntamente en forma de sus sales farmacéuticamente aceptables, o en forma de una composición farmacéutica en la cual los compuestos se encuentran mezclados con vehículos o excipientes adecuados en una cantidad terapéuticamente efectiva, e.g., en dosis efectivas para efectuar sinergísticamente la reducción deseada en la carga viral o en la titulación viral, ii. Dosificación Como se trató anteriormente, los expertos en la técnica reconocerán que las dosis apropiadas de ácido tiofosfonofórmico y uno o más inhibidores nucleósido/nucleótido de transcriptasa inversa dependerán de diversos factores, incluyendo sin limitación, la via de administración seleccionada, la edad, el peso y el pronóstico del paciente, el progreso de la enfermedad, etc. Las consideraciones generales de dosificación y la formulación de ácido tiofosfonofórmico y uno o más inhibidores nucleósido/nucleótido de transcriptasa inversa individuales o combinadas, pueden encontrarse en Goodman y Gilman, The Pharmacological Basis of Therapeutics, Goodman et al., eds. 11a edición, 2005, McGraw Hill y Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20a y 21a ediciones, Gennaro y University of the Sciences en Philadelphia, Eds., Lippencott Williams & Wilkins (2003 y 2005) . El ácido tiofosfonofórmico puede administrarse en una cantidad de desde aproximadamente 2 mg/kg hasta aproximadamente 50 mg/kg al día, aunque las dosis pueden ser mas o menos, dependiendo de la via de administración. Por ejemplo, las dosis pueden ser menos si el TPFA se administra de manera intravenosa. En algunas modalidades el ácido tiofosfonofórmico se administra en una cantidad de desde aproximadamente 20 mg/kg hasta aproximadamente 35 mg/kg al día. En algunas modalidades, el ácido tiofosfonofórmico se administra en una cantidad de aproximadamente 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 mg/kg al dia, o cualquier entero dentro del rango de 2-50 mg/kg al día.

Los uno o más inhibidores nucleósido/nucleótido de transcriptasa inversa pueden administrarse en dosis de acuerdo con las aprobadas por la FDA, aunque las dosis pueden ser menos. Las dosis apropiadas para inhibidores nucleósido/nucleótido de transcriptasa inversa pueden encontrarse, por ejemplo, en el FDA Orange Book, disponible en la red mundial en fda . gov/cder/ob/default-htm. Por ejemplo, las dosis orales aprobadas para los inhibidores nucleósido/nucleótido de transcriptasa inversa aprobados se establecen en la tabla siguiente. Las tabletas o cápsulas de inhibidores nucleósido/nucleótido de transcriptasa inversa pueden administrarse una, dos, tres, cuatro, o cinco veces al dia, según sea apropiado. Dosis Orales de NsRTIs/NtRTIs Aprobados En algunas modalidades, al menos un ácido tiofosfonofórmido y los uno o más inhibidores nucleósido/nucleótido de transcriptasa inversa se administran en dosis sub-terapéuticas de los agentes activos individuales. Una dosis sub-terapéutica se refiere a una cantidad de un agente activo individual insuficiente para producir un efecto antiviral, medida in vivo o in vitro, utilizando uno de los análisis descritos en la presente. Una dosis sub-terapéutica se refiere también a una cantidad de dosis que es 80% o menos de la cantidad más pequeña de la dosis de referencia de un agente activo aprobado. Las cantidades de dosis de referencia se encuentran disponibles para los expertos en la técnica, por ejemplo, en Goodman y Gilman, supra y en Physician' s Desk Reference, 2006, Thompson Publishing. Sin enlazarse a una teoría, los efectos sinergisticos antivirales de una combinación de ácido tiofosfonofórmico y uno o más inhibidores nucleósido/nucleótido de transcriptasa inversa, pueden permitir la administración de una cantidad sub-terapéutica de al menos un ácido tiofosfonofórmico y los uno o más inhibidores nucleósido/nucleótido de transcriptasa inversa. La administración de dosis sub-terapéuticas de ácido tiofosfonofórmico y los inhibidores nucleósido/nucleótido de transcriptasa inversa individualmente, no produce un efecto antiviral significativo. Sin embargo, la administración de una dosis sub-terapéutica de al menos un agente activo en una combinación de ácido tiofosfonofórmico y uno o más inhibidores nucleósido/nucleótido de transcriptasa inversa puede producir un efecto antiviral, con menor riesgo de efectos secundarios. La dosis de ácido tiofosfonofórmico y los uno o más inhibidores nucleósido/nucleótido de transcriptasa inversa también puede expresarse en términos del índice de reducción de dosis (DRl) . El Índice de reducción de dosis es una determinación de la reducción de dosis en duplicado permitida para cada fármaco al proporcionarse en una combinación sinergística, en comparación con la concentración de un solo agente necesaria para lograr el mismo nivel de efecto. Los efectos sinergísticos antivirales entre el ácido tiofosfonofórmico y los uno o más NRTIs proporcionan un DRl para el ácido tiofosfonofórmico de al menos aproximadamente 10, 50, 100, 150, 200, 250, 300 o más. Los efectos sinergísticos antivirales entre el ácido tiofosfonofórmico y uno o más NRTIs proporcionan un DRl para los uno o más NRTIs menor que aproximadamente 2, 5, 10, 20, 50, 100, o más. La combinación de ácido tiofosfonofórmico y uno o más inhibidores nucleósido/nucleótido de transcriptasa inversa se administra en cantidades tales que las relaciones molares de los ingredientes activos permiten efectos antivirales sinergísticos. El ácido tiofosfonofórmico puede administrarse en una relación equimolar a los uno o más NsRTI/NtRTIs (relación molar 1:1). El ácido tiofosfonofórmico puede administrarse a una relación molar de diez veces (10:1) o de cien veces (100:1) más para el uno o más NsRTI/NtRTIs, o cualquier relación molar de aproximadamente 1:1 a aproximadamente 100:1 (TPFA/NRTI), por ejemplo, 1:1, 5:1, 10:1, 20:1, 50:1, 100:1. La combinación de ácido tiofosfonofórmico y uno o más inhibidores nucleósido/nucleótido de transcriptasa inversa se administra en cantidades tales que el valor Índice de la combinación (Cl), determinado, por ejemplo, en un análisis MAGI, un análisis PhenoSense™ o análisis de captura de antigeno p24, es menor que 1.0. Preferentemente, la combinación de ácido tiofosfonofórmico y uno o más inhibidores nucleósido/nucleótido de transcriptasa inversa se administra en cantidades tales que el valor Índice de la combinación es menor que aproximadamente 0.9. Más preferentemente, la combinación de ácido tiofosfonofórmico y uno o más inhibidores nucleósido/nucleótido de transcriptasa inversa se administra en cantidades tales que el valor índice de la combinación es menor que aproximadamente 0.6. ii. Programas El ácido tiofosfonofórmico y los uno o más inhibidores nucleósido/nucleótido de transcriptasa inversa pueden administrarse concurrentemente o independientemente, una, dos, tres, cuatro o más veces en un periodo de 24 horas, según sea necesario. En una modalidad, el ácido tiofosfonofórmico y los uno o más inhibidores nucleósido/nucleótido de transcriptasa inversa se administran concurrentemente. En una modalidad, el ácido tiofosfonofórmico y los uno o más inhibidores nucleósido/nucleótido de transcriptasa inversa se administran concurrentemente una vez al dia, por ejemplo, en una formulación de liberación sostenida o de liberación retardada. En una modalidad, el ácido tiofosfonofórmico y los uno o más inhibidores nucleósido/nucleótido de transcriptasa inversa se administran concurrentemente múltiples veces al dia, por ejemplo, dos, tres o cuatro veces al dia. 5. Análisis por Actividad Sinergística Los siguientes análisis pueden utilizarse para determinar la actividad antiviral sinergistica de las combinaciones de ácido tiofosfonofórmico y uno o más inhibidores nucleósido/nucleótido de transcriptasa inversa. a . In vitro Las cantidades y proporciones de las combinaciones de ácido tiofosfonofórmico y uno o más inhibidores nucleósido/nucleótido de transcriptasa inversa que reducen sinergisticamente la titulación viral pueden determinarse utilizando análisis in vitro. i. Análisis MAGI La actividad antiviral puede medirse cuantitativamente utilizando una activación multinuclear de un análisis indicador de galactosidasa (MAGI). Ver, Kimpton y Emerman (1992) J. Virol., 66:2232. Las células objetivo, (e.g., una célula de mamífero, por ejemplo, células HeLa) que se han transfectado de manera estable con un receptor viral de superficie celular objetivo (e.g., CD4, un receptor de quimiosina) y una construcción informante que expresa una proteina beta galactosidasa se modificaron para localizar al núcleo bajo el control de elementos de transcripción viral (e.g., VIH-1 LTR y VIH-1 Tat). Para conducir la expresión de la proteina beta galactosidasa modificada, el virus de infección debe producir elementos de transcripción viral (e.g., VIH-1 Tat). Los núcleos de las células objetivo que se han infectado e inducido para expresar la proteina beta galactosidasa modificada se teñirán en azul, y esto puede visualizarse fácilmente utilizando un microscopio luminoso (e.g., magnificación 100X) . El análisis MAGI se lee comúnmente en el dia 2 o el día 3 posterior al inicio de la infección. El número de células azules indica el número de partículas de virus infeccioso en el inoculado. Los núcleos azules pueden contarse utilizando el microscopio luminoso. Se determina entonces una concentración inhibidora del 50% (IC50) a partir de un esquema de inhibición % contra la concentración de fármaco logio. Los efectos antivirales sinergísticos del ácido tiofosfonofórmico y uno o más inhibidores nucleósido/nucleótido de transcriptasa inversa pueden determinarse utilizando el principio de efecto medio (ver, Chou y Talalay, 1984, supra, Chou y Rideout, 1996, supra, y Reynolds y Maurer, supra) y determinarse cuantitativamente mediante los Índices de la combinación (Cl). Un valor Índice de combinación menor que 1.0 indica sinergismo entre los agentes activos. Los valores Índice de la combinación pueden graduarse además como sigue: ii. Análisis PhenoSense™ La actividad antiviral también puede medirse cuantitativamente utilizando un análisis PhenoSense TM Un análisis PhenoSense™ utiliza amplificación de ácido nucleico para derivar secuencias de ácido nucleico de VIH proteasa y transcriptasa inversa del plasma. Las secuencias derivadas del paciente se incorporan en un vector viral para construir un vector de prueba de resistencia (RTV) . El vector viral contiene también un gen informante o indicador (e.g., proteina verde fluorescente, luciferasa, beta galactosidasa, etc.) insertado dentro de una porción suprimida del gen de VIH de envoltura. El gen informante se encuentra bajo el control de un fuerte promotor (e.g., un promotor CMV) en el RTV. El análisis PhenoSense™ se lleva a cabo introduciendo la secuencia de ácido nucleico del RTV en células huésped, recolectando partículas del virus después de la transfección, y utilizando las partículas de virus para infectar las células objetivo. La susceptibilidad al fármaco se calcula comparando la actividad del gen informante producida en presencia y ausencia de fármacos. La presencia de fármaco puede ser una o más diferentes concentraciones, por ejemplo, diversas concentraciones tituladas. Los datos se analizan trazando la inhibición porcentual de la replicación viral medida por la actividad del gen informante, contra la concentración logio del fármaco para el virus del paciente (en el RTV) y un virus de referencia sensible al fármaco. La curva de susceptibilidad al fármaco resultante se utiliza para calcular la concentración de fármaco requerida para inhibir la replicación viral por 50% (IC50). Un desplazamiento en la curva de inhibición del paciente hacia una más alta concentración del fármaco, en comparación con la curva del virus de referencia sensible al fármaco, se interpreta como reducida susceptibilidad al fármaco. Un desplazamiento en la curva de inhibición del paciente hacia una más baja concentración del fármaco, en comparación con la curva del virus de referencia sensible al fármaco, se interpreta como aumentada susceptibilidad al fármaco. El PhenoSense™ puede conducirse por medio de un proveedor comercial de servicios, por ejemplo, Monogram Biosciences, South San Francisco, CA. El sinergismo de uno o más agentes activos puede calcularse utilizando Valores índice de la Combinación, como se describió anteriormente. iii. Análisis de Detección p24 La reducción en la titulación viral puede medirse también utilizando un análisis de captura ELISA con anticuerpos específicos para proteínas cápsido virales (e.g., VIH-1, p24) . Los equipos ELISA para medir VIH-1 p24 se encuentran comercialmente disponibles de, por ejemplo, Zeptometrix, Buffalo, NY; PerkinElmer, Wellesley, MA; y Aalto Bio Reagents, Dublin, Irlanda. La reducción sinergística de la carga viral mediante las combinaciones de ácido tiofosfonofórmico y uno o más inhibidores nucleósido/nucleótido de transcriptasa inversa también puede medirse in vivo. Las titulaciones virales pueden detectarse a partir de muestras de un paciente (e.g., sangre, suero, plasma) y compararse con una muestra de referencia, por ejemplo, una muestra tomada en un punto de tiempo anterior del mismo paciente.

Se entiende que los ejemplos y modalidades descritos en la presente son sólo con propósitos ilustrativos y que se sugerirán diversas modificaciones o cambios a la luz de la misma a las personas expertas en la técnica y deben incluirse dentro de la esencia y contenido de esta solicitud y del alcance de las reivindicaciones anexas. Todas las publicaciones, patentes y solicitudes de patente citadas en la presente se incorporan por la referencia en su totalidad para todo propósito. EJEMPLOS Los siguientes ejemplos se ofrecen para ilustrar, pero no para limitar la invención reivindicada. Materiales y Métodos Los siguientes materiales y métodos se utilizaron en los ejemplos proporcionados en la presente. Lineas Celulares y Virus Se mantuvieron células MAGI en medio DMEM conteniendo suero fetal de ternera al 10% y 5 mM de glutamina. Las células H9 se mantuvieron en medio RPMI 1640 conteniendo suero fetal de ternera al 10%. Se obtuvo VIH-IIIIB y VIH-lLA? a través del AIDS Research and Reference Reagent Program, División of AIDS, NIAID, NIH. El Dr . Jean-Marie Bechet y el Dr . Luc Montagnier contribuyeron originalmente con el VIH-lLA?, cortesía del MRC AIDS Directed Programme. El HTLV-IIB/H9 se recibió del Dr . Robert Gallo.

Las reservas de virus VIH- 1IIIB, VIH-lH?B2 y VIH-1LAI se prepararon a partir de células H9 infectadas . Fármacos El ácido tiofosfonofórmico (Thiovir™) se produjo en deCODE genetics (Lemont, IL) . El foscaret se obtuvo de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) . La infusión i.v. de azidotimidina ("AZT") o zidovudina ("Retrovir") , se obtuvo de Glaxo Welcome (Research Triangle Park, NC) . La nevirapina se obtuvo a través de AIDS Research and Reference Reagent Program, NIAID, NIH: Nevirapine. Determinación IC50 Se probaron VIH de tipo silvestre y resistente al fármaco antiviral por su sensibilidad a los fármacos antivirales utilizando ya sea análisis MAGI o análisis PhenoSense™. La concentración inhibidora del 50%, IC50 se determinó entonces a partir de un esquema de inhibición porcentual contra la concentración de fármaco logio-Análisis MAGI Se sembraron células MAGI a aproximadamente 5 x 104 células por pozo en una placa de 12 pozos en DMEM con suero fetal de ternera al 10% y se incubaron durante la noche a 37°C en C02 al 5%. El fármaco se agregó en varias concentraciones y se incubó durante aproximadamente 30 a 60 minutos. Las células se infectaron ya sea con VIH-1 HXB2 o VIH-IIIIB en presencia ya sea de 4 microgramos/ml de polibreno o 60 microgramos/ml de dextran. La infección continuó durante 48 horas y las células se fijaron utilizando glutaraldehido 0.05%. Las células se lavaron tres veces con PBS y se tiñeron con 4 mM de ferrocianuro de potasio, 4 mM de ferricianuro de potasio, 2 mM de MgCl2 y 0.8 mg/ml X-gal. Los núcleos azules se contaron bajo un microscopio a una magnificación de 100X. Infección de H9 y Análisis de Captura de Antigeno p24 Las células T H9 se pre-trataron con polibreno a 4 ug/ml y fármaco en concentraciones indicadas en RPMI más suero fetal de ternera 10% durante 30 minutos previo a la absorción del virus a multiplicidades de infección (MOI) de 0.1 durante 2 horas a 37°C, C02 al 5%. Las células se lavaron 3 veces con PBS y se resuspendieron en medio fresco más fármaco. La incubación a 37°C, C02 al 5%, continuó durante 4-6 días y las células se centrifugaron a 1200 rpm. Los sobrenadantes se removieron y se detectó el p24 mediante un equipo de captura cuantitativa de antigeno (Zeptometrix, Buffalo, NY) . Análisis Phenosense™ Todos los análisis Phenosense™ se llevaron a cabo en Virologic Inc., como se describe (Petropoulos et al., (2000) Antimicrob Agents Chemother 44:920). Brevemente, el gen de envoltura se suprime del VIH-1 de tipo silvestre y del informante luciferasa insertado bajo el control de un fuerte promotor CMV. Las reservas virales se producen mediante cotransfección de células productoras con el ADN viral recombinante y un vector que expresa la proteina de envoltura a partir de un virus de leucemia murina anfotrópico. Las partículas virales pseudo clasificadas son de replicación defectuosa y solo experimentan una ronda de infección. La expresión del gen de luciferasa en células objetivo depende de una sola ronda de infección. Selección de variantes resistentes a fármacos Para seleccionar variantes resistentes a fármacos, se pre-trataron 1 x 109 células H9 durante dos horas en tres concentraciones de AZT (0.5, 1 y 2 uM) , Nevirapine (0.5, 1 y 2 uM) , foscarnet (25 y 50 uM) y Thiovir™ (25 y 50 uM) previo a la infección en MOI de 0.1 de VIHIIIB o VIHLA?. Los cultivos con el más alto nivel de fármacos que mostraron un efecto citopático y al menos un incremento de 100 veces en el nivel p24 a los 7 días posteriores a la infección, se cosecharon y se utilizaron los sobrenadantes para infectar células H9 frescas al doble de la concentración de fármaco. El virus pasó a una concentración de fármaco aumentada y se monitoreó por incremente en IC50. El gen de transcriptasa inversa se amplificó por PCR a partir de células H9 infectadas con virus resistentes utilizando iniciadores 881For' (AATTAACCCTCACTAAAGGGAGACAGAGCCAACAGCCCCACCA) Y 929T7Rev' (ATTTAATACGACCTCACTATAGGGATTTCCCCACTAACTTCTGATGTCATTGACA) conteniendo secuencias T7. El gen de transcriptasa inversa se secuenció a partir del producto de PCR utilizando iniciador universal T7 y se comparó con el virus pasado en ausencia del fármaco y la secuencia publicada. Ejemplo 1: Actividades de Thiovir™ contra Virus resistentes a NRTI y NNRTI Se evaluó la actividad de Thiovir™ contra virus resistentes a fármacos NRTI y NNRTI comunes utilizando el sistema informante Phenosense™ (Petropoulos, supra) . Se examinó un panel de diez virus con múltiples mutaciones que les confieren resistencia variable a NRTI y NNRTI (Figura 1). Adicionalmente, se incluyeron dos virus de tipo silvestre en el panel viral. Cada virus se probó contra Thiovir™, foscarnet, dos NRTI (estavudina y zidovudina) y dos NNRTI (efavirenz y nevirapina) . Thiovir™ y foscarnet mostraron valores IC50 similares contra el virus de tipo silvestre (Figura 2). Los valores IC50 para el virus mutante se compararon con los valores IC50 del virus de tipo silvestre para determinar el cambio duplicado en resistencia o sensibilidad. El valor clínico de corte (Figura 2, valores resaltados en gris claro) se define como el nivel al cual aumenta significativamente la probabilidad de falla de la terapia en pacientes resistentes. Aproximadamente la mitad de los virus variantes son resistentes al NRTI probado y casi todos son resistentes al NNRTI probado. El virus más resistente se encuentra por arriba del corte clínico tanto en NRTI como en NNRTI . En contraste, todos los virus fueron sensibles tanto a foscarnet y Thiovir™, siendo la mayoria hipersensibles (Figura 2, valores resaltados en gris oscuro) . Los datos son consistentes con la conclusión de que Thiovir™ es efectivo contra virus resistentes tanto a NRTI como a NNRTI. Ejemplo 2: Inhibición Sinergística de VIH mediante análisis MAGI con Thiovir™ y Zidovudina (AZT) Estudios previos han mostrado una sinergia de ligera a moderada entre foscarnet y zidovudina en proporciones que varían de 1:300 a 1:3000 (Hostetler et al., (2000= Antivir Chem Chemother 11:213). Investigamos combinaciones de Thiovir™ o foscarnet y zidovudina mediante análisis MAGI (Klimpton y Emerman, supra) . Se determinaron las interacciones del fármaco utilizando el principio de efecto medio (Chou y Talalay (1984) Adv Enzyme Regul 22:27). Los índices de combinación (Cl) cuantifican la sinergia, adición y antagonismo como sigue: CK1 (sinergia); CI^l (adición) ; CI>1 (antagonismo) . Dado que las relaciones de dosis-efecto de Thiovir™ o foscarnet con zidovudina no son paralelas en el trazo del efecto medio, no puede establecerse la exclusividad de los efectos y se muestran los datos para suposiciones tanto mutuamente exclusivas (i.e., inhibidores competitivos) como mutuamente no exclusivas (i.e., inhibidores no competitivos). Los índices de combinación promedio son de aproximadamente 0.55 para zidovudina más Thiovir™ mezclados a una relación de 1:1, indicando un fuerte sinergismo (Tabla 1). En contraste, los Índices de zidovudina más foscarnet varían de solo ligeramente sinergisticos a antagonisticos, con Índices de combinación promedio de aproximadamente 1.5. la fuerte sinergia entre zidovudina y Thiovir™ implica que puede incrementarse la eficacia antiviral, incluso en una dosis de fármaco reducida, permitiendo regímenes de fármaco adecuados combinando Thiovir™ con un NRTI. Tabla 1 Valores del índice de Combinación para Zidovudina Combinada con Thiovir™ o Foscarnet (Análisis MAGI) Ejemplo 3: Inhibición Sinergística del VIH mediante análisis p24 con Thiovir™ y Zidovudina (AZT) La sinergia entre Thiovir™ y zidovudina se investigó adicionalmente mediante infección de células T H9 en presencia de una relación fija de fármaco y análisis mediante el análisis p24 (Tabla 2). Similar al análisis MAGI, los Índices de combinación indican fuerte sinergia de Thiovir™ combinado con zidovudina en relaciones de 1:1 y ¡.10. en contraste con Thiovir™, la combinación de foscarnet y zidovudina da como resultado un antagonismo en una relación de 1:1 y sinergia en una relación de 1:10. Los datos son consistentes con la conclusión de que Thiovir™ tiene una dosis efectiva menor que foscarnet en la terapia de combinación con zidovudina . Tabla 2 Valores del índice de Combinación para Zidovudina Com inada con Thiovir™ o Foscarnet (Análisis p2 ) Ej emplo 4 : Inhibición Sinergistica del VIH mediante análisis p24 con Thiovir™ y Tenofovir Tenofovir es un análogo de fosfonato aciclico de un inhibidor de transcriptasa inversa de nucleótido (NtRTI) que se utiliza ampliamente como reemplazo o complemento para un NRTI en combinación con terapia de VIH. La sinergia entre Thiovir™ y tenofovir se investigó mediante el análisis p24. Thiovir™ mostró sinergia en una relación de 1:1 con tenofovir. En contraste, foscarnet mostró un comportamiento de aditivo a antagonistico al combinarse con tenofovir en la misma relación (Tabla 3). Los datos son consistentes con la conclusión de que Thiovir tiene una dosis efectiva menor que foscarnet en terapia de combinación con tenofovir. Tabla 3 Valores del índice de Combinación para Tenofovir Combinado con Thiovir™ o Foscarnet (Análisis p2 ) Ejemplo 5 Perfil de Resistencia de VIH Tipo Silvestre para Thiovir Se seleccionaron virus resistentes a Thiovir™ y foscarnet mediante el paso in vitro de VIHLAI en células H9 en presencia de concentraciones escalonadas de fármaco. El virus resistente se evaluó por cambios fenotipicos mediante determinación del IC50 utilizando el análisis MAGI. Además, el ADN viral se secuenció para determinar las variaciones genotipicas (Tabla 4). Se efectuaron dos selecciones independientes de 13 a 15 rondas. Tabla 4 Susceptibilidad al Fármaco y Mutaciones Genéticas de VIH Resistente a Thiovir™ y Foscarnet Se seleccionaron dos virus resistentes que exhiben una resistencia de 4.8 veces y 85 veces a Thiovir™. El virus resistente a Thiovir™ también mostró una resistencia similar a foscarnet, indicando resistencia cruzada. Además, los virus seleccionados por resistencia a foscarnet tuvieron una resistencia similar a Thiovir™, indicando de nuevo una resistencia cruzada. Consistente con los datos previos, los virus seleccionados tanto para Thiovir™ como para foscarnet fueron sensibles a nevirapina e hipersensibles para zidovudina. La prolongada selección in vitro de cepas de VIH-1 resistentes al tipo silvestre o AZT con la combinación de AZT y Thiovir™, o AZT y foscarnet, falló en generar un virus co-resistente, sugiriendo que los perfiles de resistencia de Thiovir™ y AZT son mutuamente exclusivos. Los virus resistentes tanto a Thiovir™ como a foscarnet contuvieron las variaciones L214F y R172K para la selección 1. Una mutación adicional, Q174R, se encontró presente solo en el virus resistente a Thiovir™. Para la selección 2, tanto Thiovir™ como foscarnet contuvieron mutaciones L214F y M184I. L214F y M184I se han asociado previamente con foscarnet y resistencia a prodroga de foscarnet. (Hammond, et al., (2001) Antimicrob Agents Chemother 45:1621). R172K y Q174R son nuevas mutaciones que no se han relacionado previamente con la resistencia a foscarnet o alguno de los derivados de foscarnet. Los resultados son consistentes con la conclusión de que el perfil de resistencia de Thiovir™ es similar a foscarnet. El perfil de mutación de virus resistentes a Thiovir™ y foscarnet es consistente con la supresión del fenotipo de resistencia de zidovudina. En conclusión, los Ejemplos demostraron las actividades sinergísticas de combinaciones de ácido tiofosfonofórmico y un NRTI, permitiendo dosis reducidas de uno o ambos agentes activos.

Claims (22)

1. REIVINDICACIONES 1. Un método para reducir la carga viral en un paciente infectado con un virus, comprendiendo el método la co-administración oral al paciente de una cantidad de ácido tiofosfonofórmico y una cantidad de un inhibidor de transcriptasa inversa de nucleósido o nucleótido, en donde las cantidades co-administradas son suficientes para disminuir sinergísticamente la carga viral y en donde el ácido tiofosfonofórmico se administra oralmente en un rango de dosis de entre 2 mg/kg a 50 mg/kg al dia.
2. 2. El método de la reivindicación 1, en donde la dosis de ácido tiofosfonofórmico se administra en un rango de dosis entre 15 mg/kg a 40 mg/kg al dia.
3. 3. El método de la reivindicación 1, en donde la dosis de ácido tiofosfonofórmico se administra en un rango de dosis de entre 20 mg/kg a 35 mg/kg al dia.
4. 4. El método de la reivindicación 1, en donde la dosis del inhibidor de transcriptasa inversa de nucleósido o nucleótido se reduce por al menos 10 veces en comparación a cuando el inhibidor de transcriptasa inversa de nucleósido o nucleótido se administra sin ácido tiofosfonofórmico.
5. 5. El método de la reivindicación 1, en donde el inhibidor de transcriptasa inversa de nucleósido se selecciona del grupo que consiste de zidovudina, didanosina, estavudina, lamivudina, abacavir y emtricitabina .
6. 6. El método de la reivindicación 5, en donde el inhibidor de transcriptasa inversa de nucleósido es zídovudina .
7. 7. El método de la reivindicación 1, en donde el inhibidor de transcriptasa inversa de nucleótido es tenofovir .
8. 8. El método de la reivindicación 1, en donde el virus es un retrovirus.
9. 9. El método de la reivindicación 8, en donde el retrovirus es el virus de inmunodeficiencia humana (VIH) .
10. 10. El método de la reivindicación 1, en donde el virus es un virus de herpes.
11. 11. El método de la reivindicación 1, en donde el ácido tiofosfonofórmico y el inhibidor de transcriptasa inversa de nucleósido o nucleótido se administran simultáneamente en una formulación combinada.
12. 12. El método de la reivindicación 1, en donde el ácido tiofosfonofórmico y el inhibidor de transcriptasa inversa de nucleósido o nucleótido se administran simultáneamente en una tableta de formulación combinada.
13. 13. Un medicamento oral para disminuir la carga viral en un paciente infectado con un virus, en donde el medicamento es una formulación combinada que comprende una cantidad de ácido tiofosfonofórmico y una cantidad de un inhibidor de transcriptasa inversa de nucleósido o nucleótido en donde el ácido tiofosfonofórmico y el inhibidor de transcriptasa inversa de nucleósido o nucleótido se encuentran presentes en cantidades suficientes para disminuir sinergísticamente la carga viral y el medicamento contiene entre 150 mg y 750 mg de ácido tiofosfonofórmico por formulación combinada.
14. 14. El medicamento de la reivindicación 13, en donde el inhibidor de transcriptasa inversa de nucleósido es zidovudina .
15. 15. El medicamento de la reivindicación 13, en donde el ácido tiofosfonofórmico y el inhibidor de transcriptasa inversa de nucleósido o nucleótido se encuentran en una cápsula.
16. 16. El medicamento de la reivindicación 13, en donde el ácido tiofosfonofórmico y el inhibidor de transcriptasa inversa de nucleósido o nucleótido se encuentran en una tableta.
17. 17. El medicamento de la reivindicación 13, en donde el ácido tiofosfonofórmico y el inhibidor de transcriptasa inversa de nucleósido o nucleótido se encuentran en un fluido.
18. 18. El medicamento de la reivindicación 13, en donde el virus es un retrovirus.
19. 19. El medicamento de la reivindicación 18, en donde el retrovirus es el virus de inmunodeficiencia humana (VIH) .
20. 20. El medicamento de la reivindicación 13, en donde el virus es un virus de herpes.
21. 21. El uso de ácido tiofosfonofórmico y un inhibidor de transcriptasa inversa de nucleósido o nucleótido en la manufactura de un medicamento para el tratamiento terapéutico y/o profiláctico de una infección viral, en donde el ácido tiofosfonofórmico y el inhibidor de transcriptasa inversa de nucleósido o nucleótido se encuentran presentes en cantidades suficientes para disminuir sinergisticamente la carga viral y el medicamento contiene entre 150 mg y 750 mg de ácido tiofosfonofórmico por formulación combinada.
22. 22. El uso de ácido tiofosfonofórmico y un inhibidor de transcriptasa inversa de nucleósido o nucleótido en la preparación de un agente antiviral en forma de fármaco listo para usarse, para el tratamiento o prevención de infecciones por virus, en donde el ácido tiofosfonofórmico y el inhibidor de transcriptasa inversa de nucleósido o nucleótido se encuentran presentes en cantidades suficientes para disminuir sinergísticamente la carga viral, y la forma de fármaco listo para usarse contiene menos de 500 mg de ácido tiofosfonofórmico por forma.