MX2007002571A - Anticuerpo receptor riib anti-fc-gama y sus usos - Google Patents

Abstract

La presente solicitud describe anticuerpos que ligan selectivamente Fc?RIIB humano, con poco o ningún enlace a otros Fc?Rs humanos, por ejemplo, Fc?RIIA humano. La invención también proporciona anticuerpos biespecíficos aislados que comprenden un anticuerpo que liga selectivamente Fc?RIIB, y un segundo anticuerpo que liga específicamente un receptor de activación. Diversos usos incluyendo usos terapéuticos, para aquellos anticuerpos son también descritos, incluyendo administración con anticuerpos anti-tumor y métodos para inhibir inmuno respuestas y suprimir liberación de histamina.

Description

ANTICUERPO RECEPTOR RIIB ANTI-FC-GAMA Y SUS USOS Esta solicitud es una solicitud no provisional I presentada bajo 37 CFR § 1.53(b) (1), que reclama prioridad bajo 35 U.S.C. § 119(e) de la solicitud provisional de patente de los E.U.A. No. de Serie 60/606,851, presentaba en septiembre 2, 2005, todos los contenidos de la cual aquí se incorporan por referencia. Caipo de la Hnvenciói La presente invención se refiere a anticuerpos que de preferencia ligan FcyRIIB humano sobre FcyRIIA humano, así como a usos para esos anticuerpos. Antecedentes de la Invención Un anticuerpo liga a un antígeno y lo neutraliza al evitar que lige a su diana endógena (¡por i ejemplo receptor o ligando) o al inducir respuestas efectoras que llevan a eliminación de antígeno. Para retirarse y/o destruir eficientemente antígenos ajenos al cuerpo, un anticuerpo deberá exhibir tanto alta afinidad por sus funciones efectoras eficientes y antígeno. Los i anticuerpos que tienen múltiples especificidades (tales como, por ejemplo anticuerpos biespecífieos) son útiles para mediar respuestas complementarias o sinergísticas de múltiples antígenos. Funciones efectoras de anticuerpo están mediadas por una región Fe de anticuerpo. Funciones efectoras se dividen en dos categorías: (1) funciones I efectoras que operan después de ligar el anticuerpo á un antígeno (estas funciones involucran la participación de i la cascada de complemento o receptor Fe (células ! que contienen (FcR) ) ; y (2) funciones efectoras que operan independientemente de enlace de antígeno (estas funciones confieren persistencia de anticuerpo en la circulación y su capacidad para ser transferido a través de barreras celulares por transcitosis) . Ver por ejemplo ard jand Ghetie, 1995, Therapeutic I munology 2:77-|94. i Interacciones de anticuerpos y complejos de anticuerpo-antígeno con células del sistema inmune, provocan estas respuestas tal como por ejemplo cititoxicidad mediada por células dependientes de anticuerpo (ADCC= antibody-dependent cell -mediated cytotoxicity) y cititoxicidad dependiente de complemento (CDC= complement dependent cytotoxicity) (reviewed in Daéron, 1997, Annu. Rev. I Immunol . 15:203-234; Ward et al., supra; Ravetch et al., 1991, Annu. Rev. Inmuno1. 9: 457-492; and Ravetch et al, 2000, Science 290: 84-89). Debido a que los receptores Fe median , la función efectora de anticuerpo al ligar a la región1 Fe del anticuerpo conato receptor, FcRs se definen por | su especificidad para isotipos de inmunoglobulina : receptores Fe específicos para anticuerpos IgG, se refieren como FcyR; receptores Fe para anticuerpos ^ IgE son FceR; receptores Fe para anticuerpos IgA son FcaR, y así en adelante. Se han identificado tres subclases de Fc/RI (CD64) , FcyRII (CD32) , y FcyRIII (CD16) . Cada subclase FcyR se codifica por dos o tres genes que¡ se someten a impregnación con RNA alterno, de esta manera llevando a múltiples transcripciones y la existenciaj de una amplia diversidad en isoformas FcyR. Los tres genes que codifican la subclase Fc/RI humana (Fe/ Ría, Fc/Rib, y Fe/ Ríe) están agrupados en la región lq21.1 del brazo I largo del cromosoma 1; los genes que codifican isoformas Fc/RII humanos {Fcy Rila, Fc/RIIb, y Fc RIIc) están: en la región lq23-24; y los dos genes que codifican Fcy RUI (Fc/RIIIa y Fc RIIIb) están agrupados en la región lq22. j Fc/RIIC se forma a partir de un cruce genético desigual entre Fc/RIIA y Fc/RIIB, y consiste de la región extracelular de FcRIIB, y la región citoplásmica ' de i Fc/RIIA. I Fc/RIIA codifica un receptor de transmembrana Fc/RIIAl. Combinación de RNA alternativa resulta ' en FC RIIA2 que carece de la región de transmembrana. Variantes alélicas del gen Fc/RIIA dan lugar a moléculas de alta respuesta (HR) o baja respuesta (LR) , que difieren en su capacidad para ligar IgG. Las moléculas í i I I HR y LRFc/RIIA difieren en dos aminoácidos correspondientes a las posiciones 27 y 131. Fc^RIIB í codifica variantes de combinación Fe ? RUBI, Fc^RIIB2 y Fc^RIIB3. Fc RIIBl y Fc RIIB2 difieren por juna inserción de 19 aminoácidos en el dominio citoplásmico de Fe ? RUBI ; FC/RIIB3 es idéntico a Fc^RIIB2, pero carece de información por el sitio de escisión de la señal i peptidasa putativa. Los receptores también se distinguen por| su I afinidad para IgG. Fcy^RI exhibe alta afinidad para IgG, Ka=108-109M"1 (Ravetch et al., 2001, Ann. Rev. I Tmmunol . 19:275-290) y puede ligar IgG monomérico. , En contraste, FCYRII y FCYRIII muestran una afinidad relativamente más débil para IgG Ka = lo'M"1 (RavetcbJ et i al., supra) , y sólo interactúa efectivamente jcon complejos inmunes multiméricos . Los diferentes subtipos FcyR se expresaba en diferentes tipos de células (revisado por Ravetch, J.V. et al, en Annu. J?ev. Immunol. 9:457-492). Por ejemplo, sólo FC7RIIIA se expresa! en células NK. El ligar anticuerpos a este receptor lleva a 1 una actividad ADCC típica de células NK. FCYRIIIB humano se encuentra sólo en neutrófilos, mientras que FCYRI'IIA se encuentra en macrófagos, monocitos, células destructoras naturales (NK) , y una subpoblación de células T. Por otra parte, receptores FcyRII con baja I 1 I afinidad para IgG monomérico son los FcRs más ampliamente distribuidos, y usualmente se co-expresan en las mismas células. FcyRII (codificado por CD32) se expresa fuertemente en células B, monocitos, granulocitos , células de mastocitos y plaquetas, mientras que algünas células T expresan el receptor a menores niveles (Mantzioris, B.X. et al., 1993, J. Immunol . 150:5175- 5184; and Zola, H. et al., 2000, J". Biol . Regul . Homeost.

Agents, 14: 311-316). Por ejemplo, receptor FcyRIIB humano se distribuye predominantemente en células ' B, células mieloides y células de mastocitos (Ravetch J.V. i and et al., 2000, Science 290:84-89). Isoformas FcyRIIA y FcyRIIB contienen dominios I extracelulares muy similares (aproximadamente 92% de identidad de secuencia de aminoácido) pero difieren' en sus regiones citoplásmicas , lo que lleva a diferencias funcionales como "receptores de activación" (FcyRIIA) y i "receptores inhibitorios" (FcyRIIB) . Los receptores FcyRI y FcyRIIB también funcionan como receptores de activación. Estos receptores de activación contienen un i motivo de activación basado en tirosina inmuno receptor de 19 aminoácidos (ITAM= immunoreceptor tyrosine-based i activation motif) en el dominio citoplásmico . Las secuencias ITAM disparan la activación de las familias src y syk de las tirosina cinasas, que a su vez activan i una variedad de mediadores celulares, tales como P13K, PLCy, y Tec cinasa. El resultado neto de estas etapas de activación es incrementar la liberación de calcio intracelular de los almacenamientos de retículo endoplásmico y abrir el canal de calcio acoplado a! la í capacitancia, de esta manera generando una respuesta de calcio sostenida. Estos flujos de calcio son importantes para la exocitosis de contenidos granulares, estímulos de fagositisis, respuestas ADCC y activación de factores de transmisión nucleares específicos. i Respuestas celulares mediadas al activar FcyRs se regulan por el receptor inhibitorio FcyRIIB en el mantenimiento de tolerancia periférica, regulación de umbrales de respuesta de activación y finalmente en terminar en estímulo efector mediado por IgG (Ravetch, J.V. et al, Annu. Rev. Immunol . 19: 275-290 (2001)). Esta regulación se inicia al entrelazar receptores de activación con receptores de inhibición FcyRIIB mediante un complejo inmune de anticuerpo antígeno-IgG (ver por ejemplo Ravetch, J.V. et al., 2000, supra) . El entrelazamiento de un receptor de activación que contiene ITAM lleva a una fosforilación de tirosina dentro del motivo de inhibición basado en tirosina inmuno receptora de 13 aminoácidos (ITIM= immunoreceptor tyrosine-based inhibition motif) en el dominio citoplásmico FcyRIIB.

Esta "activación" de FcyRIIB inicia reclutado de luna inositol polifosfato-5-fosfatasa que contiene SH2 (SHIP= SH2 -containing inositol polyphosphate-5-phosphatáse) especifica. SHIP cataliza la hidrólisis del lípido inositol de membrana PIP3, de esta manera evitando activación de PLCy y Tec cinasas y abrogando el flujo de calcio sostenido mediado por el flujo de ingreso de calcio a través del canal acoplado a la capacitancia. Mientras que FcyRIIB regula en forma negativa receptores de activación que contienen ITAM (Daéron, M. et al., 1995, Jmmunity 3: 635 - 646), también se ha mostrado que regulan negativamente tirosina cinasa receptora (RTK= receptor tyrosine kinase) c-kit en el control de proliferación de células mediadas por RTK (Malbec, 0. et al., 1999 J. Im unol . 162: 4424-4429). Anticuerpos que ligan receptores FcyRII se han descrito en: Looney et al., (1986) J. Immunol. 136:1641-1647; Zipf et al., (1983) J. Immunol. 131 : 3064-3?'72 ; Pulford et al., (1986) Immunology 57:71-76; Greenman et al., (1991) Mol. Immunol. 28:1243-1254; Ierino et al., (1993) J. Immunol. 150:1794-1803. Weinrich et al., (1996) tfyjbridoma, 15:109-116; Sonderman et al., (1999) Bioche istry, 38:8469-8477; Lyden, T. . et al. (2001) J. Immunol. 166:3882-3889; y la Publicación Internacional N° WO 2004/016750, publicada en febrero 26, 2004. El receptor IgERl de alta afinidad FceRI media la señalización para liberación de histamina inducida! al ligar IgE durante por ejemplo reacción alérgica (von Bubnoffy D. et al., (2003) Clinical & Experimental Dermatology. 28 (2) : 184-187) . Receptores FCYRIIB se han mostrado que interactúan con e inhiben la actividad de FceRI a través del dominio FCYRIIB ITIM (Daeron, M. et al. (1995) J. Clin. Invest . 95:577-585; Malbec, O. et'al. (1998) J. Immunol 160 : 1647-1658) ;y Tam, S.W. et al. (2004) Allergy 59:772-780). Anticuerpos que ligan específicamente FCYRIIB humana se requieren no sólo para investigación sino también para manipular la actividad FcyRIIB y FceRI, para tratar enfermedad. Compendio de la Invención. La invención proporciona un polipéptido | de enlace de antígeno o anticuerpo que liga selectivamente FCYRIIB humano. El anticuerpo o polipéptido de enlace de antígeno de la invención liga FCYRIIB humano con afinidad significativamente mejor que liga a otros FCTRS humanos, y en algunas modalidades, esencialmente es incapaz de reacción cruzada con FcyRIIA humano. En algunas modalidades, un anticuerpo1 o polipéptido de enlace de antígeno de la invención que liga selectivamente FcyRIIB humano, comprende al menos una o más regiones de determinación de complementareidad de anticuerpo (CDRs= Antibody Complementarityl determining regions) de SEQ ID NOs : 1, 2, 3, 4, 5, Y 6, y en modalidades adicionales, comprende los CDRs de cadena í pesada de SEQ ID NOs : 1, 2 y 3 y/o los CDRs de cadena ligera de SEQ ID NO: 4, 5, y 6. En modalidades adicionales, un anticuerpo de la invención comprende ' no o más CDRs que son variante de uno o más de los SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4, 5, y 6, esta variante tiene al menos i 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 97%, al menos 98%, o al menos 99% de identidad1 de secuencia de aminoácidos con uno o más de los CDRs SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4, 5, y 6. En modalidades adicionales, el anticuerpo o polipéptido de enlace de antígeno variante liga FcyRIIB con una afinidad que es de aproximadamente 10 veces menos a aproximadamente al menos 2 veces a' al menos aproximadamente 3 veces a al menos aproximadamente 5 veces a al menos aproximadamente 10 veces a al menos aproximadamente 50 veces mayor que la afinidad j de anticuerpo 5A6 para FCYRIIB, mientras que jaún esencialmente es incapaz de reacción cruzada con FCYR'IIA humano. En modalidades adicionales, un anticuerpo polipéptido de enlace de antígeno de la invención comprende un dominio variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 7 y/o un dominio variable de cadena ligera de SEQ i ID NO : 8. 1 i En algunas modalidades, un anticuerpo t polipéptido de enlace de antígeno de la invención es un anticuerpos monoclonal , un anticuerpo quimérico, o un anticuerpo humanizado, o un fragmento de un anticuerpo monoclonal, quimérico o humanizado. En algunas modalidades, un anticuerpo o polipéptido de enlace de antígeno de la invención, incluyendo anticuerpos monoclonales , quiméricos, humanizados, o multiespecíficos , o sus fragmentos, se deriva de un anticuerpo producido de una línea de células de hibridoma que tienen número de acceso ATCC PTA-4614. Polipéptidos o anticuerpos de enlace de antígeno de la invención se administran con anticuerpos terapéuticos o agentes quimioterapéuticos en métodos, de tratamiento de una enfermedad o desorden tratado por el I anticuerpo terapéutico o agentes quimio terapéutico. ' La invención proporciona anticuerpos biespecífieos aislados que comprenden un polipéptido 'que liga anticuerpo o antígeno que liga selectivamente FCYRIIB, incluyendo aquellos descritos anteriormente, y un segundo polipéptido que liga anticuerpo o antígeno que liga específicamente un receptor de activación tal como FceRI. En algunas modalidades, anticuerpos biespecífieos comprenden una región bisagra de cadena pesada variante incapaz de enlace disulfuro inter-cadena pesada.

I Anticuerpos biespecíficos de la invención I son i útiles en métodos para inhibir inmuno respuestas y suprimir liberación de histamina, por ejemplo asociada con alergia, asma e inflamación. En algunas modalidades de la invención, anticuerpos biespecíficos de \ la invención son útiles para activar receptor FCYRIIB1 en células de mamíferos por coagregación del receptor FCYRIIB con un receptor de activación en una célula. 1 En I algunas modalidades, las células de mamíferos son células humanas; en modalidades adicionales, las células humanas son células T, células B, mastocitos, basófilos, células que presentan antígeno, macrófagos y/o monolitos. í>ara modalidades que involucran inhibición mediada Ipor proteína ITIM en general, esta inhibición típicamente ocurre en células T, células B, mastocitos, basófilos y i células que presentan antígeno. Para modalidades! en donde la inhibición se media por FCYRIIB, esta inhibición I típicamente ocurre en mastocitos, basófilos, células 'que presentan antígeno, monocitos, macrófagos y células ? B. En algunas modalidades, anticuerpos biespecíficos de la invención son útiles para inactivación, inhibición de, la actividad de o reducción de la expresión del receptor FceRI. Para modalidades en donde FceRI se inhibe o i disminuye la expresión, la inhibición o disminución í de expresión típicamente ocurre en mastocitos de mamíferos, basófilos y células que presentan antígeno. En un aspecto, la invención abarca ( una composición que comprende un anticuerpo biespecífico anti-huFc7RIIB/anti-huFceRI aislado en un portador farmacéutico. En otras modalidades, la invención abarca una composición que comprende un anticuerpo biespecífico anti-huFc7RIIB/anti-huFceRI aislado y un anticuerpo anti-IgE aislado. Una proporción útil de anticuerpo biespecífico anti-huFcYRIIB/anti-huFceRI a anticuerpo anti-IgE en una composición de combinación se determina fácilmente para cada paciente. La proporción típicamente está en el rango de aproximadamente 0.01:1 a 100:1. Los anticuerpos de la composición puede ser monoclonales , humanos, humanizados, o quiméricos. En otro aspecto, la invención abarca un método terapéutico para tratar un desorden inmune en un mamífero, al administrar un anticuerpo biespecífico anti-huFcYRIIB/anti-huFceRI . En una modalidad, el mamífero es un paciente humano, tal como un paciente humano que requiere tratamiento para un desorden alérgico, asma y/o inflamación. En otra modalidad, el método terapéutico además comprende administrar a un mamífero que experimenta un desorden inmune, una alergia, asma, o que requiere inhibición de liberación de histamina, el anticuerpo biespecífico anti-huFcyRIIB/anti-huFceRI de la invención. En una modalidad adicional, el anticuerpo anti-huFcYRIIB/anti-huFceRI biespecífico de la invención se administra en combinación con un anticuerpo anti-IgE, en donde la administración es separada en tiempo o simultánea. En una modalidad, el anticuerpo anti-IgE es un anticuerpo monoclonal . En una modalidad adicional, el anticuerpo anti-IgE es Xolair®. En una modalidad aún adicional, el anticuerpo biespecífico se administra en combinación con el anticuerpo anti-IgE como parte de' un tratamiento terapéutico para un desorden inmune en curso (por ejemplo, como parte del mismo régimen terapéutico) , en donde el anticuerpo biespecífico se administra por separado de (no al mismo tiempo que) el anticuerpo anti-IgE. En otra modalidad, el anticuerpo biespecífico de la invención y un anticuerpo anti-IgE se administran ^ al mismo tiempo. Una proporción útil de anticuerpo biespecífico anti-huFcYRIIB/anti-huFceRI a anticuerpo anti-IgE en una administración de combinación (ya sea que la suministración se realice en tiempos separados o^ al mismo tiempo) se determina fácilmente para cada paciente. Para propósitos de la invención, la proporción es aproximadamente 0.01:1 a 100:1 y cualquier proporción útil dentro de ese rango como se determina para un paciente. Proporciones útiles pueden ser por ejemplo 0.05:1, 0.1:1, 0.5:1, 1:1, 1:0.5, 1:0.1, y 1:0.05, aunque I no se excluye una proporción útil que puede ser determinada por técnicas clínicas estándar. 1 La invención adicionalmente proporciona ácido nucleico aislado que codifica el anticuerpo, un vector o celular anfitriona que comprende ese ácido nucleico, y un método para elaborar un anticuerpo que comprende cultivar las celular anfitriona y opcionalmente además comprende recuperar anticuerpo del cultivo de célula anfitriona (por ejemplo de las célula anfitriona o medio del cultivo de célula anfitriona) . Breve Descripción de los Dibujos La Figura 1 es una representación esquemática de un IgG nativo. Enlaces disulfuro se representan por líneas gruesas entre los dominios CH1 y CL y los dos dominios CH2. V es un dominio variable; C es un dominio constante; L representa cadena ligera y H represe'nta cadena pesada. La Figura 2A es un alineamiento de las secuencias de aminoácido preferidas FcyRIIA humana (SEQ ID NO:9); FcyRIIB2 humana (SEQ ID NO:10). La Figura 2B muestra la secuencia de aminoácidos de FcyRIIBl (SEQ ID NO: 11) . La Figura 3 ilustra un alineamiento de secuencias de región Fe de anticuerpo humano de secuencia nativa. Las secuencias son IgGl humana de secuencia I nativa (SEQ ID N0:31), alotipo no-A; IgG2 humanai de secuencia nativa (SEQ ID NO:32); IgG3 humana de secuencia nativa (SEQ ID NO:33); e IgG4 humana de secuencia nativa (SEQ ID NO:34) . I La Figura 4 proporciona una gráfica de barras que indica enlace relativo de anticuerpos a GST-huFc7RIIB respecto a proteínas de fusión GST-huFcYRIIA y GST-huFcYRIII. 1 La Figura 5 muestra especificidad de enlace jpor enlace de inmunofluorescencia a los anticuerpos a células CHO que expresan GPI-huFcYRIIB respecto a células CHO que i expresan GPI-huFcYRIIA. j Las Figuras 6-9 presentan curvas de afinidad de enlace para enlazar diversos anti-Fc7RII (CD32) MAbs a GST-huFc7RIIB, GST-huFc7RI IA (H131 ) , o GST-huFcYRIIA(R131) . La Figura 10 ilustra secuencias de aminoácidos de cadenas ligeras y pesadas de anticuerpo monoclcjnal 5A6.2.1. '< Las Figuras 11-15 muestran que 5A6 no bloquea el hexaméro E27-IgE que liga a huFcyRIIA y 5A6 ; no bloquea enlace del hexámero E27-IgE que liga a huFcYRIÍB. La Figura 16 presenta análisis de enlace de inmunofluorescencia indirecta de 5A6 MAb en línea . de eritroleucemia K562 que expresa FcyRIIA nativo (ATCC No . I CCL-243) . ? La Figura 17 muestra efectos de entrelazamiénto de FCYRIIB a receptores de activación medidos cuantitativamente al bloquear liberación de histamina.' La Figura 18 ilustra resultados ; de transferencia Western anti-Fab para expresión Idel I componente anticuerpo p5A6.11.Knob (perilla anti-FcYRIIB) y p5A6.11.Hole (orificio anti-FceRI) . 1 I La Figura 19 ilustra resultados de transferencia Western anti-Fc para expresión 1 de componente de anticuerpo p5A6.11.Knob (perilla arlti-FCYRIIB) y p5A6.11.Hole (orificio anti-FceRI). ! La Figura 20 ilustra resultados ' de transferencia Western anti-Fab para expresión . de componentes de anticuerpos con secuencias bisagra de tipo silvestre o variantes. La Figura 21 ilustra resultados i de transferencia Western anti-Fc para expresión 1 de componentes de anticuerpo con secuencias bisagra de tipo silvestre o variante. La Figura 22 ilustra análisis de enfoque isoeléctrico de 5A6Knob, 22E7Hole, 5A6Knob y 22E7Hole mixto a temperatura ambiente y la mezcla calentada a 50 grados C por 5 minutos . La Figura 23 ilustra flujos pasantes de columna de afinidad FCYRIIB para anticuerpos 5A6Knob/22E7Hole biespecífico, 22E7Hole, y 5A6Knob. La Figura 24, muestra análisis de enfcaque isoeléctrico de mezcla 5A6Knob, 22E7Hole, y 5A6Knob y 22E7Hole calentaba a 50 grados C por 10 minutos. La Figura 25 ilustra una secuencias de ácido nucleico (SEQ ID NO: 35) que codifica el promotor fosfatasa alcalina (phoA) , secuencias de señales STM y toda la cadena ligera (dominios variable y constante) jdel anticuerpo 5A6. I La Figura 26 ilustra una secuencias de ácido í nucleico (SEQ ID NO:36) que codifica el promotor fosfatasa de alcalina (phoA) , secuencias de señal STII y toda la cadena ligera (dominios variable y constante) (del anticuerpo 22E7. I La Figura 27 ilustra una secuencias de ácido nucleico (SEQ ID NO: 37) que codifica los últimos 3 aminoácidos de la secuencias de señal STII de I aproximadamente 119 aminoácidos del dominios variable pensando murino del anticuerpo 5A6. La Figura 28 ilustra una secuencia de ácido nucleico (SEQ ID NO: 38) que codifica los últimos 3 aminoácidos! de la secuencia de señal STII y aproximadamente 123 aminoácidos del dominio variable pensando murino del anticuerpo 22E7.

La Figura 29 y 30 proporcionan resultados ELISA que ilustran la especificidad de enlace dual de un anticuerpo biespecífico sin bisagra 5A6/22E7. Las Figuras 31-33 presentan datos ELISA de ensayo de liberación de histamina que ilustran la capacidad de anticuerpo biespecífico 5A6/22E7 para entrelazar huFcYRIIB a huFceRI. La Figura 34 es una gráfica de resultados de ensayo de liberación de histamina ELISA que demuestran bloqueo de inhibición de liberación de histamina inducida por antígeno en células RBL-huFceRI+Fc7RIIBl por pre-incubación de anticuerpo biespecífico 5A6/22E7 con huFceRI ECD y huFcYRIIB ECD. La Figura 35 ilustra gráficas de datos FACS para enlace de anticuerpo biespecífico 5A6/22E7 en la presencia de huFceRI ECD y huFcyRIIB ECD a células RBL-huFceRI+FcYRIIBl . La Figura 36 es una gráfica de resultados de ensayo de liberación de histamina ELISA que demuestra bloqueo de inhibición de liberación de histamina inducida por antígeno en células RBL-huFceRI+Fc7RIIB2 por pre-incubación de anticuerpo biespecífico 5A6/22E7 con huFceRI ECD y huFcYRIIB ECD. La Figura 37 incluye gráficas de datos FACS para enlace de anticuerpo biespecífico 5A6/22E7 en la presencia en células huFceRI ECD y huFcYRIIB ECD a j RBL huFceRI+FcTRIIB2. 1 La Figura 38 incluye gráficas de datos FACS que ilustran bloqueo de anticuerpo biespecífico 5A6/22E7 que liga a células RBL huFceRI por huFceRI ECD, huFcYRIIB ECD, o a ambos ECDs . La Figura 39 incluye gráficas de datos FACS que ilustran bloqueo de anticuerpo biespecífico 5A6/22E7 que liga a células RBL huFciRIIB por huFceRI ECD, huFcyRIIB ECD, o ambos ECDs. La Figura 40 incluye gráficas de datos FACS que ilustran bloqueo de anticuerpo biespecífico 5A6/22E7 :que liga a células RBL huFceRI+huFcTRIIBl por huFceRI ECD, huFc7RIIB ECD, o ambos ECDs. La Figura 41 incluye gráficas de datos FACS ;que ilustran bloqueo de anticuerpo biespecífico 5A6/22E7 Ique I liga a células RBL huFceRI+huFc7RIIB2 por huFceRI ECD, huFcYRIIB ECD, o ambos ECDs. , La Figura 42 es una gráfica de resultados de ens'ayo de liberación de histamina de ELISA que demuestran inhibición de liberación de histamina inducida por antígeno en células RBL huFceRI+FcyRIIBl por anticuerpo i biespecífico 5A6/22E7 en concentraciones de suib-saturación . La Figura 43 son datos de citometría de flujo de anticuerpo biespecífico 5A6/22E7 que liga a células |RBL huFceRI+FcTRIIBl . ¡ La Figura 44 es una gráfica de resultados de ensayo I I de liberación de histamina ELISA que demuestran i inhibición de liberación de histamina inducida ¡por antígeno en células RBL huFceRI+Fc7RIIB2 por anticuerpo biespecífico 5A6/22E7 en concentraciones de sub-saturación. La Figura 45 son datos de citometría flujo | de anticuerpo biespecífico 5A6/22E7 que liga a células BL huFceRI+FcYRIIB2. Las Figuras 46A y 46B ilustran datos citometría| de i flujo de la titulación de anticuerpo biespecífico í 5A6/22E7 que enlaza a células RBL huFceRI, RBL FC7RIIB I ceulas, RBL huFceRI+Fc7RIIBl y células RBLhuFce+Fc7RIIB2.

La Figura 47 es una gráfica de niveles I de anticuerpos biespecífieos detectados por ELISA en medio de cultivo celular de células RBL FceRI , RBL FceRI + FC7RIIBI y RBL FceRI + FC7RIIB2, sobre el curso de siete días después de tratamiento con IgE en la presencia o ausencia de anticuerpo biespecífico que indica que los anticuerpos no se agotaron. La Figura 48 es una gráfica de niveles IgE detectados por ELISA en medio de cultivo celular de células RBL FceRI, células RBL FceRI + FCYRIIB I y células RBL FceRI + FCYRIIB2 sobre el curso de siete días después de tratamiento con IgE en la presencia o ausencia de anticuerpo biespecífico que indica que los anticuerpos no se agotaron. Las Figuras 49 y 50 presentan datos de citometría de flujo para incremento de expresión inducido por IgE de expresión de superficie FceRI en células RBL FceRI. Las Figuras 51 y 52 presentan datos de citometría de flujo para incremento de expresión inducido por IgE de expresión de superficie de FceRI en células RBL FceRI + FCYRIIBI. Las Figuras 53 y 54 presentan datos de citometría de flujo para aumento de expresión inducido por IgE de la expresión de superficie FcfRI en células i RBL FceRI + FCYRIIB2. La Figura 55 presenta datos de citometría! de flujo que muestran efecto de anticuerpo biespecífico pjara disminución de expresión de superficie Fc RI en células RBL FcfRI después de retirar IgE. | La Figura 56 presenta datos de citometría' de flujo que muestran el efecto de anticuerpo biespecífico para reducir la expresión de superficie Fc RI en células RBL FceRI + FCTRIIBI después de retirar IgE. ' La Figura 57 presenta datos de citometría de i flujo que muestran el efecto de anticuerpo biespecífico I en reducir expresión de superficie FceRI en células RBL FceRI + FC7RIIB2 después de retirar IgE. Las Figuras 58-61 presentan datos RT-PCRi de expresión mRNA de huFceRIa, FcyRIIBl, FCYRIIB2, huRPL19 I (control), y FceRIa de rata en mastocitos RBL huFceRI designados huFcERIa) , células RBL huFceRI+FcyRIIBl (designados huFcGRIIbl) , y células RBLhuFceRI +FCYRIIB2 (designadas huFcGRIIb2) y en los basófilos humanos! de tres donadores diferentes. ' I La Figura 62 presenta resultados de un ensayo en donde la liberación de histamina inducida por anti-IgE en basófilos humanos primarios se inhibe por | el I anticuerpo biespecífico Fc7RIIB-anti-FceRI 5A6/22E7. La Figura 63 representa gráficamente datos de citometría de flujo que muestran el efecto de anticuerpo biespecífico en reducción de la expresión de superficie Fe e RI inducida por IgE en células RBL FceRI + Fc7Rl!lB2 cuando el anticuerpo biespecífico Fc^RIIB anti-Fc!fRI I 5A6/22E7 se agrega el día cero, día 3 y día 4. j La Figura 64 presenta resultados de ensayos; en donde liberación de citocina inducida por IgE/antígeno1 en células RBL FceRI + FCYRIIB2 se inhibe por el anticuerpo biespecífico anti- FcyRIIB-anti-FceRI 5A6/22E7. Para cada gráfica de barras: antígeno/IgE solo (NP(ll)-OVA + IgE), barras gris oscuro; anticuerpo biespecífico + antígeno/IGE (NP(ll)-OVA +IgE + BsAb) , barras gris claro. i i La Figura 65 presenta los resultados de ensayos I en donde estímulo de cascada de ácido araquidónico indicido por IgE/antígeno en células RBL FceRI + FcyRIIBl se inhibe por el anticuerpo biespecífico anti- FCYRIIB-anti-FceRI 5A6/22E7. Descripción Detallada I. Definiciones Alergia se refiere a ciertas enfermedades! en donde respuestas inmunes a antígenos ambientales provocan I inflamación de tejido y disfunción de órgano. Un i alérgeno es cualquier antígeno que provoca alergia. Gomo tal, ya puede ser la propia molécula antigénica o' su fuente, tal como grano de polen, caspa de animales, veneno de insectos o producto alimenticio. IgE juegai un papel central en desordenes de alergia. Receptores de alta afinidad IgE (FceRI) se ubican en los mastocitos y basófilos que sirven como dianas antigénicas que estimulan la adicional liberación de mediadores i inflamatorios que producen muchas de las manifestaciones de enfermedad alérgica. Inflamación mediada por IgE ocurre cuando el antígeno se liga a los anticuerpos IgE que ocupan ¡ el receptor FcsRI en los mastocitos. En minutos, este enlace provoca que el mastocito se desgranule, liberando ciertos mediadores preformados. Subsecuentemente, la célula desgranulada empieza a sintetizarse y liberar mediadores adicionales de novo. El resultado es una respuesta en dos fases: un efecto inmediato inicial en los vasos sanguíneos, músculo liso y secreción glandular (hipersensibilidad inmediata) , seguido por unas cuantas horas después por infiltración celular del sitio involucrado. Inflamación mediada por IgE es el mecanismo subyacente a alergia atópica (tal como fiebre de heno, asma y dermatitis atópica) , reacciones anafiláticas sistémicas y urticaria alérgica (ronchas) . Normalmente puede jugar un papel en una primer línea de defensa inmunológica ya que provoca rápida vaso-dilatación, facilitando la entrada de factores solubles en circulación y células al sitio de contacto del antígeno. Muchos de los atributos más destructivos de la enfermedad alérgica se deben a las acciones de los leucocitos' de quimio-atracción . Los términos "anticuerpo" e inmunoglobulina se emplean en forma intercambiable en el amplio sentido e incluyen anticuerpos monoclonales (por ejemplo anticuerpos monoclonales de longitud íntegra o intactos) , anticuerpos policlonales , anticuerpos multiespecífieos (por ejemplo anticuerpos biespecífieos siempre que exhiban la actividad biológica deseada) , y también pueden incluir ciertos fragmentos de anticuerpo (como se describe con mayor detalle aquí) , tal como por ejemplo polipéptidos de enlace de antígeno, estos polipéptidos pueden ser fragmentos de un anticuerpo. En una modalidad, anticuerpos e inmunoglobulinas de la presente invención tienen reducidos enlaces disulfuro (menos) .' En una modalidad, anticuerpos e inmunoglobulinas de la invención comprenden una región bisagra en donde al menos un residuo cisteína se vuelve incapaz de formar un enlace disulfuro, en donde el enlace disulfuro de preferencia es intermolecular, de preferencia entre dos cadenas pesadas. I Una cisteína bisagra puede hacerse incapaz de formar un enlace disulfuro por cualquiera de una variedad de métodos convenientes conocidos en la técnica, algunos, de los cuales aquí se describen, incluyendo pero no limitados a eliminación del residuo de cisteína o sustitución de la cisteína con otro aminoácido. Anticuerpos (inmunoglobulinas) se asignan a diferentes clases, dependiendo de las secuencias de aminoácido de los dominios constantes de cadena pesada. I Cinco clases principales de inmunoglobulina se han descrito: IgA, IgD, IgE, IgG y IgM. Estas además puejden dividirse en subclases (isotipos) por ejemplo IgG-1, IgG-2, IgA-1, IgA-2, y semejantes. Los dominios constantes de cadena pesada correspondientes a cada clase de inmunoglobulina se denominan a, ß, e, ? y µ para D, E, G, y M, respectivamente. Las estructuras de seguridad y configuraciones tridimensionales de las diferentes clases de inmunoglobulinas, son bien conocidas y se describen1 en Í I general por ejemplo en Abbas et al., 2000, Cellular and Mol. Immunology, cuarta edición. Un anticuerpo puede ser parte de una mayor molécula de fusión formada i por asociación covalente o no covalente del anticuerpo I con i una o más otras proteínas o péptidos. Los términos "anticuerpo de longitud íntegra", "anticuerpo ''intacto" y "anticuerpo entero", aquí se emplean en forma intercambiable para referirse a un anticuerpo en forma intacta sustancial, y no a fragmentos de anticuerpo como se define a continuación. Los términos particularmente se refieren a un anticuerpo con cadenas pesadas que contienen regiones Fe. Una variante ' de anticuerpo de la invención puede ser un anticuerpo, de longitud íntegra. Un anticuerpo de longitud íntegra puede ser humano, humanizado, quimérico y/o madurado por afinidad. , Un anticuerpo "madurado por afinidad" es aquel que tiene una o más alteraciones en uno o más CDRs del i mismo, que resulta en una mejora en la afinidad del anticuerpo por el antígeno, en comparación con 1 un anticuerpo precursor que no posee esa o esas alteraciones. Anticuerpos madurados de afinidad preferidos tendrán afinidades nanomolares o incluso picomolares para el antígeno diana. Anticuerpos madurados por afinidad se producen por procedimientos conocidos. Ver por ejemplo Marks et al., 1992, Biotechnology 10:779-783, que describe maduración1 de afinidad por entremezclado de dominio de cadena pesada variable (VH) y cadena ligera variable (VL) . Mutagénesis aleatoria de CDR y/o residuos marco, se describen! en Barbas, et al. 1994, Proc . Nat. Acad. Sci, USA 91:3809-3813; Shier et al., 1995, Gene 169:147-155; Yeltom et al., 1995, J. Iwmunol. 155:1994-2004; Jackson et al., 1995, J. Immunol. 154 (7) : 3310 - 9 ; and Hawkins et al, 1992, J. Mol. Biol. 226:889-896, por ejemplo. Un "anticuerpo agonista" es un anticuerpo que liga y activa un antígeno tal como un receptor. ' En general, la capacidad de activación de receptor del anticuerpo agonista será al menos cualitativamente similar (y puede ser en esencia cualitativamente similar) al de un ligando agonista nativo del receptor. ' "Fragmentos de anticuerpo" comprenden solo |Una porción de un anticuerpo intacto, en donde la porc'ión retiene cuando menos uno y retiene la mayoría o todas,J de las funciones normalmente asociadas con la porción cuando está presente en un anticuerpo intacto. Un fragmento I de I anticuerpo de la invención puede comprender una porción suficiente de la región constante, para permitir dimerización (o multimerización) de cadenas pesadas ¾ue i tienen capacidad de enlace disulfuro reducida, por ejemplo cuando al menos una de las cisteínas bisagra i normalmente involucrada en enlace disulfuro de ínter- I cadena pesada, se altera como se describe aquí. En i una I modalidad, un fragmento de anticuerpo comprende un sitio de enlace de antígeno o dominios variables del anticuerpo intacto y de esta manera retiene la habilidad para ligar al antígeno. En otra modalidad, un fragmento 1 de anticuerpo por ejemplo aquel que comprende la región Fe, retiene al menos una de las funciones biológicas normalmente asociadas con la región Fe cuando está presente en un anticuerpo intacto, tal como enlace FcRn, modulación de vida media de anticuerpo, función ADCC y/o enlace de complemento (por ejemplo cuando el anticuerpo tiene un perfil de glicosilación necesario para función ADCC o enlace de complemento. Ejemplos de fragmentos de anticuerpo incluyen anticuerpos lineales; moléculas de anticuerpo de cadena sencilla; y anticuerpos multi-específieos formados de fragmentos de anticuerpo. I "Citotoxicidad de diana por células dependientes de anticuerpo" y "ADCC" se refieren a una reacción mediada por células a la cual células I citotóxicas no específicas que expresan FcRs (tales cpmo células destructoras naturales (NK= Natural Killér) neutrófilos y macrófagos (reconocen antígeno ligado en una célula diana y subsecuentemente provocan la lisis de la célula diana. Células NK, las células primarias para mediar ADCC expresan solo Fe/ RUI, mientras que monocitos expresan Fc/RI, Fc RII y Fe RUI. Expresión i i FcR en células hematopoyéticas se resume en la tabla 3 en la página 464 de Ravetch et al., 1991, Annu. Rev. I munol 9:457-92. Para estimar la actividad ADCC de una molécula i de interés puede realizarse un ensayo in Vi tro ADCC j tal como el descrito en las patentes de los E.U.A. Números ,500,362 o 5,821,337. Células efectores para estos ensayos incluyen células mononucleares de sangre periférica (PBMC= Peripheral Blood Mononuclear Cells y células destructoras naturales (NK) . En forma alterna o adicionalmente , la actividad ADCC de la molécula ^ de interés puede estimarse in vivo, por ejemplo en un modelo animal tal como lo descrito en Clynes et al., 1998, PNAS í (USA) 95:652-656. Una "quimera de inmunoadhesina-anticuerpo" I comprende una molécula que combina al menos un dominio de enlace de un anticuerpo (como se define aquí) con cuando al menos una inmunoadhesina (como se define en esta solicitud) . Quimeras de anticuerpo-inmunoadhesina ejemplares son las quimeras CD4-IgG biespecíficas descritas en Berg et al., 1991, PNAS (USA) 88: 4723 -and Chamow et al., 1994, J. Inmuno1. 153:4268. Una "enfermedad autoinmune" como se emplea aquí, es una enfermedad o desorden no maligno que surge y i se dirige contra los propios tejidos de un individuo. Las enfermedades autoinmunes aquí descritas excluyen I específicamente enfermedades o condiciones malignas, o cancerosas, particularmente excluyen linfoma de célula B, i leucemia linfoblástica aguda (ALL= Acute Lymphoblastic Leukemia) , leucemia linfocítica crónica (CLL= Chronic Lymphocytic Leukemia) , leucemia de células pilosas y leucemia mieloblástica crónica. Ejemplos de enfermedades o desordenes autoinmunes incluyen pero no están limitados a respuestas inflamatorias tales como enfermedades inflamatorias de la piel, incluyendo psoriasis y dermatitis (por ejemplo dermatitis atópica) ; escleroderma sistémico y esclerosis; respuestas asociadas con enfermedad intestinal inflamatoria (tales como enfermedad de Crohn y colitis ulcerativa) ; síndrome de tensión respiratoria (incluyendo síndrome de tensión respiratoria de adultos; ARDS= adult respiratory distress síndrome); dermatitis, meningitis, encefalitis, uveitis, colitis, glomerulonefritis ; condiciones alérgicas tales como eczema y asma y otras condiciones que involucran infiltración de células T y respuestas inflamatorias crónicas; arteriosclerosis ; enfermedad de adhesión ; de leucocitos; artritis reumatoide; lupus sistémico eritematoso (SLE= systemic lupus erythematosus) , diabetes mellitus (por ejemplo diabetes mellitus tipo I o diabetes mellitus dependiente de insulina), esclerosis múltiple; síndrome de Reynaud; tiroiditis autoinmune; encefalomielitis alérgica; síndrome de Sjorgen; diabetes de inicio juvenil; e inmunorespuestas asociadas con hipersensibilidad aguda y retardada mediada por citocinas y T-linfocitos, que se encuentran típicamente t en tuberculosis, arcoidosis, polimiocitis , granulomatosils y vasculitis; anemia perniciosa (enfermedad de Addisón) ; enfermedades que involucran leucocito diapedesis; desorden inflamatorio de sistema nervioso central (GNS= Central Nervous System) ; síndrome de lesión de múltiples órganos, anemia hemolítica (incluyendo pero no limitada a crioglobinemia o anemia Coombs positiva) ; miastenia I gravis; enfermedades mediadas por complejo antígeno-anticuerpo; enfermedad de membrana basal antiglomerular; síndrome de antifosfolípido; neuritis alérgica; enfermedad de Graves; síndrome miasténico de Lambert- Eaton, penfigoide bullosa; penfigus; poliendocrinopat as autoinmunes; enfermedad de Reiter; síndrome de rigidez muscular; enfermedad de Behcet ; arteritis de células gigantes; nefritis inmunocomplej a ; neuropatía IgA; polineuropatías IgM; púrpura trombocitopénica inmune (ITP= Immune Thrombocytopenic Purpura) o trombocitopenia autoinmune, etc. Una inmunoglobulina "biológicamente activa" o "funcional" es aquella capaz de ejercer una o más de sus actividades naturales en eventos estructurales regulatorios bioquímicos o biofísicos. Por ejemplo, un anticuerpo biológicamente activo puede tener la capacidad para ligar específicamente un antígeno y el enlace puede I producir o alterar un evento celular o molecular tal como una transducción de señalización o actividad enzimática. Un anticuerpo biológicamente activo también puede bloquear activación de ligando de un receptor o actSuar como un anticuerpo agonista. La capacidad de un anticuerpo para ejercer una o más de sus actividades naturales depende de varios factores, incluyendo adecuado plegado y ensamblado de las cadenas polipeptido. "Afinidad de enlace" en general se refiere a la fuerza de la suma total de interacciones no covalentes entre un sitio de enlace sencillo de una molécula dpor ejemplo un anticuerpo) y su socio de enlace (por ejemplo un antígeno o receptor FcRn) . La afinidad de una molécula X para su socio Y, en general puede presentarse por la constante de disociación (Kd) . La afinidad puede medirse por métodos comunes conocidos en la técnijca, incluyendo aquellos aquí descritos. Anticuerpos de baja i afinidad ligan antígeno (o receptor FcRn) débilmente y tienden a disociarse fácilmente, mientras que antiocuerpos de alta afinidad ligan antígeno (o receptor FcRn) más firmemente y permanecen ligados por más tiempo. Un anticuerpo "de bloqueo" o anticuerpo "antagonista" es aquel que inhibe o reduce actividad biológica del antígeno que liga. Este bloqueo puede ocurrir por cualquier medio, por ejemplo, por interferencia con enlace de ligando al receptor, formación de complejo receptor, actividad de tirosina cinasa de un receptor de tirosina cinasa en un complejo í receptor y/o fosforilación del o de los residuos tirosina cinasa en o por el receptor. Por ejemplo, un anticuerpo antagonista Fc^RIIB liga Fc^RIIB e inhibe la habilidad de IgG en ligar Fc^RIIB de esta manera inhibiendo respuesta efectora inmune. Anticuerpos de bloqueo o anticuerpos antagonistas preferidos inhiben en forma sustancial o completa la actividad biológica del antígeno . Los términos "cáncer" y "canceroso" se refieren a o describen la condición fisiológica en mamíferos que típicamente se caracteriza por un crecimiento celular no regulado. Ejemplos de cáncer incluyen pero no están limitados a carcinoma, linfoma, blastoma, sarcoma1 y leucemia. Ejemplos más particulares de estos cánceres incluyen cáncer de células escamosas, cáncer pulmonar de pequeñas células, cáncer pulmonar de células no pequeñas, adenocarcinoma de pulmón, carcinoma escamoso del pulmón, cáncer del peritoneo, cáncer hepatocelular, cáncer gastrointestinal, cáncer pancreático, glioblastoma, cáncer cervical, cáncer de ovarios, cáncer de hígado, i cáncer de vejiga, hepatoma, cáncer de mama, cáncer de colon, cáncer colorectal, carcinoma endometrial i o uterino, carcinoma de glándulas salivares, cáncer ' de riñon, cáncer de hígado, cáncer de próstata, cáncer vulvar, cáncer tiroideo, carcinoma hepático y diversos tipos de cáncer de cabeza y cuello. i El término anticuerpos "quiméricos" se refiere I a anticuerpos en donde una porción de la cadena pesada y/o ligera es idéntica con u homologa a secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de una especie particular o que pertenecen a una clase o subclase de anticuerpo particular, mientras que el resto de la o las cadenas es idéntico con u homólogo a secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de otra especie o que pertenecen a otra clase o subclase de anticuerpo, así como fragmentos de estos anticuerpos, siempre que exhiben la actividad biológica deseada (ver por ejemplo la Patente de los E.U.A. Número 4,816,567 y Morrison et al., 1984, Proc . Nati. Acad. Sci . USA 81:6851-6855). Como se emplea aquí, las expresiones "célula", "línea celular" y "cultivo celular" se emplean en forma intercambiable y todas estas designaciones incluyen progenie. De esta manera, las palabras "transformantes" y "células transformadas" incluyen la célula objeto i primaria y cultivos derivados de la misma sin considerar i el número de transferencia. También se entiende que l la progenie puede no ser precisamente idéntica en contenido de DNA debido a mutaciones deliberadas o accidentales. Progenie mutante que tiene la misma función o actividad biológica como se supervisa en la célula transformada originalmente se incluye. Cuando se pretenden designaciones distintas, será claro del contexto. j La expresión "secuencias de control" se refiere a secuencias de DNA, necesarias para la expresión de una secuencia de codificación enlazada operativamente en un organismo anfitrión particular. Las secuencias de control que son adecuadas para procariotas, por ejemplo incluyen un promotor, opcionalmente una secuencia operadora, y un sitio de enlace ribosoma . Células eucarióticas se conoce que utilizan promotores, señales de poliadenilación y mej oradores . Un "desorden" es cualquier condición que se beneficie del tratamiento con un anticuerpo terapéutico. Esto incluye desórdenes o enfermedades crónicas y agudas, incluyendo aquellas condiciones patológicas que predisponen al mamífero al desorden en cuestión. En una modalidad, el desorden es cáncer o una enfermedad autoinmune . Un "dominio extracelular " se define aquí como aquella región de un polipéptido de transmembrana tal como FcR, que es externo a una célula. 1 Los términos "receptor Fe" o "FcR" se emplean para describir un receptor que liga a la región Fe de i un anticuerpo. El FcR preferido es un FcR humano de I secuencia nativa. Aún más, un FcR preferido es aquel que liga un anticuerpo IgG (un receptor gamma) e incluye receptores , de las subclases FcyRI , FcyRII y FcyRIII, incluyendo variantes alélicas y formas alternativamente combinadas de estos receptores. Otros FcRs, incluyendo aquellos que se identificarán en el futuro, están abarcados por el término "FcR" aquí. El término también incluye el receptor neonatal, FcRn, que es responsable por la transferencia de IgGs maternales al feto (ver Guyer et al. ,1976, J. Immunol . 117:587 and Kim et al., 1994, J. Immunol. 24:249). El término "región Fe" se emplea para definir una región C-terminal de una cadena pesada inmunoglobulina . La "región Fe" puede ser una región Fe de secuencia nativa o una región Fe variante. Aunque las fronteras de la región Fe de una cadena pesada inmunoglobulina pueden variar, la región Fe de cadena pesada IgG humana usualmente se define para recorrer desde un residuo aminoácido en la posición Cys226 o desde Pro230, a su extremo carboxilo. La región Fe de una inmunoglobulina, en general comprende dos dominios constantes, CH2 y CH3 , como se ilustra en la Figura 1. Una "región Fe funcional" posee una "función efectora" de una región Fe de secuencia nativa. "Funciones efectorás" ejemplares incluyen enlace Clq; citotoxicidad dependiente de complemento; enlace de receptor Fe; citotoxicidad mediada por células dependientes de anticuerpo (ADCC) ; fagocitosis; reducción de expresión de receptores ( de superficie celular (por ejemplo receptor de célula' B; BCR) , y semejantes. Estas funciones efectoras en general requieren que la región Fe se combine con un dominio de enlace (por ejemplo un dominio variable de anticuerpo) y pueden ser estimadas utilizando diversos ensayos tales como por ejemplo aquellos aquí descritos. Una "región Fe de secuencia nativa" comprende una secuencia de aminoácidos idéntica a la secuencia de aminoácidos de una región Fe que se encuentra en la naturaleza. Regiones Fe humanas de secuencia nativa se ilustran en la Figura 3 e incluyen una región Fe IgGl humana de secuencia nativa (alotipos no A y A) ; región IgG2 Fe humana de secuencia nativa) ; región IgG3 Fe humana de secuencia nativa; y región IgG4 Fe humana de secuencia nativa al igual Ique sus variantes de origen natural. Una "región Fe variante" comprende una secuencia de aminoácidos que difiere de una región Fe de secuencia nativa en virtud de al menos una "modificación de aminoácido" como se define aquí . La región Fe variante puede tener al menos una sustitución de aminoácidos en comparación con una región Fe de secuencia nativa o a la región Fe de un anticuerpo precursor, y por ejemplo, puede tener de aproximadamente 1 a aproximadamente 10 sustituciones aminoácido o de aproximadamente 1 a aproximadamente 5 sustituciones aminoácido en una región Fe de secuencia nativa o en la región Fe del anticuerpo precursor. La región Fe variante puede poseer al menos aproximadamente 80% de identidad con una región Fe de secuencia nativa y/o con una región Fe de un anticuerpo precursor, y pueden tener al menos I aproximadamente 90% de identidad, o pueden tener al menos aproximadamente 95% de identidad. El término " FcyRIIA", a menos que se indique; de otra forma, se refiere al FcyRIIA humano (huFcyRIIA) , 1 un i polipéptido codificado por el gen FcyRIIa humano e incluye pero no está limitado a FcyRIIAl y FcyRIIA2, y ,sus variantes alélicas. El FcyRIIA humano es un FcR de "activación" y contiene un motivo de activación basado en tirosina inmunoreceptora (ITAM = Immunoreceptor Tyrosine-based Activation Motif) en su dominio citoplásmico . El FcyRIIA humano más preferido es FcRIIAl humano que i comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 9 o sus variantes alélicas, incluyendo sus variantes alélicas de alta respuesta (HR = High Responder) y de baja respuesta (LR = Low Responder) . El término "FcyRIIB", a menos que se indique de otra forma, se refiere un polipéptido codificado por | el gen FcRIIB humano e incluye pero no está limitado a, i I FcyRIIBl, FcyRIIB2, FcyRIIB3, y sus variantes alélicasj El FcyRIIB preferido es un receptor FcR de "inhibición" ! que i contienen un motivo de inhibición basado en tirosina inmunoreceptora y (ITIM) (I/V/LxYxxL/V) (Sathish, et al., i 2001, J. Inmuno1. 166, 1763) en su dominio citoplásmico . I El FcyRIIB humano preferido es FcyRIIB2 (huFcyRIIB2) humano o FcyRIIBl (huFcyRIIBl) que tiene la secuencia! de aminoácidos de SEQ ID NO: 10, o SEQ ID NO:111, respectivamente, y sus variantes alélicas. Las secuencias FcyRIIBl y B2 difieren entre sí en una inserción I de secuencia de 19 aminoácidos en el dominio citoplásmico FcyRIIBl, LPGYPECREMGETLPEKPA (SEQ ID NO: 29) . Una "condición dependiente de FcR" como 1 se emplea aquí, incluye inflamación tipo II, una alergia mediada por IgE, asma, anafilaxis, enfermedad autoinmune, citotoxicidad mediada por IgG o un salpullido. 1 i Una "región bisagra" y sus variantes, como se emplean aquí, incluyen el medio conocido en la técnica que se ilustra por ejemplo en Janeway et al. , 19^99, I Inmuno Biology: The Inmune System in Health and Diseáse, Elsevier Science Ltd., NY. 4th ed. ; Bloom et al. , 19:97, Protein Science, 6:407-415; Humphreys et al. , 1997, J". Im unol. Methods, 209:193-202. "Homología" se define como el por ciento | de residuos en la variante de secuencia de aminoácidos jjue I i son idénticos después de alinear las secuencias e i introducir espacios, de ser necesario para lograr^ el máximo por ciento de homología. Métodos y programas de computadora para el alineamiento son bien conocidos en la técnica. Un programa de computadora tal es "Align 2", de autor Genentech, Inc., y presentada con documentación de usuario en la Oficina de Derechos de Autor de los E.U.A. (United States Copyright Office) , Washington, DC 20559, en diciembre 10, 1991. El término "célula anfitriona" (o "célula anfitriona recombinante" ) , como se empla aquí, se refiere a una célula que se ha alterado genéticamente, o es capaz de ser alterada genéticamente, al introducir un polinucleótido exógeno, tal como un vector o plásmido recombinante. Habrá de entenderse que estos términos se pretende que no sólo se refieran a la célula objetivo particular sino a la progenie de esta célula. Debido a que ciertas modificaciones pueden ocurrir en sucesivas generaciones ya sea por mutación o por influencias ambientales, dicha progenie puede de hecho no ser idéntica a la célula precursora pero aún se incluye dentro del alcance del término "célula anfitriona" cómo se emplea aquí. "Células afectoras humanas" son leucocitos que expresan uno o más FcRs y realizan funciones efectoras.

De preferencia, las células expresan al menos FCYRIÍI y realizan función efectora ADCC. Ejemplos de leucocitos humanos que median ADCC incluyen células mononucleares de sangre periférica (PBMC = Peripheral Bood Mononuclear Cells) , células destructoras naturales (NK = Natural Killer) , monocitos, células C citotóxicas y neutrófilos ; con PBMCs y células NK que se prefieren. Las células efectoras pueden aislarse de una fuente nativa, por ejemplo de la sangre o PBMCs como se describe aquí. Formas "humanizadas" de anticuerpos no humanos (por ejemplo murinos) son anticuerpos quiméricos que contienen secuencia mínima derivada de inmunoglobulina no humana. En su mayoría, anticuerpos humanizados son inmunoglobulinas humanas (anticuerpo receptor) , en donde residuos de una región hipervariable del recipiente, se reemplazan por residuos de una región hipervariable de una especie no humana (anticuerpo donador) tal como ratón, rata, conejo o primate no humano que tenga las deseadas especificidad, afinidad y capacidad. En algunos casos, residuos de región marco Fv (FR) de la inmunoglobulina humana, se reemplazan por residuos 1 no humanos correspondientes. Además, anticuerpos humanizados pueden comprender residuos que no se encuentran en el anticuerpo de recipiente o en > el anticuerpo de donador. Estas modificaciones se hacen para refinar adicionalmente el desempeño de anticuerpos.1 En I general, el anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente todo de al menos uno y típicamente 2 dominios variables, en donde o sustancialmente todos los bucles hipervariables corresponden a aquellos de una inmunoglobulina no humana y todas o sustancialmente todas las regiones FR son aquellas de una secuencia inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado opcionalmente también comprenderá cuando menos una porción de una región constante de inmunoglobulina (Fe) , típicamente, la de una inmunoglobulina humana. Para detalles ver Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); y Presta, Curr. Op. Struct. Biol . 2:593-596 (1992). Un "anticuerpo humano" es un anticuerpo que posee una secuencia de aminoácidos que corresponde a la de un anticuerpo producido por un humano y/o se ha elaborado utilizando cualquiera de las técnicas para producir anticuerpos humanos descritas aquí. Esta definición específicamente excluye un anticuerpo humanizado que comprende residuos de enlace antígeno no humano . Como se emplea aquí, el término "desórdenes hiperglicémicos" se refiere a todas las formas de diabetes y desórdenes que resultan de resistencia a insulina, tal como diabetes Tipo I y Tipo II, así como severa resistencia a insulina, hiperinsulinemia e hiperlipidemia, por ejemplo sujetos obesos y diabetes resistente a insulina, tal como síndrome de Mendenh ll, síndrome de erner, leprechaunismo, diabetes lipoatrófica y otras lipoatrofias . Un desorden hiperglicémico particular aquí descrito es diabetes, en especial diabetes Tipo I y Tipo II. "Diabetes" por sí misma se refiere a una enfermedad progresiva del metabolismo de carbohidratos que involucra producción o utilización inadecuada de insulina y se caracteriza por hiperglicemia y glicosuria. El término "región hipervariable " , como se emplea aquí, se refiere a los residuos aminoácidos de un anticuerpo que son responsables para enlace de antígeno. La región hipervariable comprende residuos aminoácido de una "región de determinación de complementareidad" o "CDR", definida por el alineamiento de secuencia, por ejemplo, los residuos 24-34 (Ll) , 50-56 (L2) y 89-97 (L3) en el dominio variable de cadena ligera y 31-35 (Hl) , 50-65 (H2) y 95-102 (H3) en el dominio variable de cadena pesada; ver Kabat et al., 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. y/o aquellos residuos de un "bucle hipervariable" (HVL) , como se define estructuralmente , por ejemplo residuos 26-32 (Ll) , 50-52 (L2) y 91-96 (L3) en el dominio variable de cadena i ligera y 26-32 (Hl) , 53-55 (H2) y 96-101 (H3) en le dominiop variable de cadena pesada; ver Chothia and Leskl, 1987, J. Mol. Biol . 196:901-917. Residuos "FR" o "marco" son aquellos residuos de dominio variable diferentes a los residuos de región hipervariable como aquí se define. Enfermedades inmunes e inflamatorias incluyen: artritis reumatoide, osteoartrit is , artritis crónica juvenil, espondiloartropatías, esclerosis sistémica (escleroderma) , miopatías inflamatorias idiopáticas (dermatomiositis) , vasculitis sistémica, sarcoidosis, anemia hemolítica autoinmune (pancitopenia inmune, hemoglobinuria nocturna paroxismal) , trombocitopenia autoinmune (púrpura trombocitopénica idiopática, trombocitopenia inmunomediada) , tiroiditis (enfermedad de Grave, tiroiditis de Hashimoto, tiroiditis linfocítica juvenil, tiroiditis atrófica) , enfermedades inflamatorias autoinmunes (por ejemplo encefalomielitis alérgica, esclerosis múltiple, diabetes mellitus dependiente! a insulina, uveoretinitis autoinmune, tirotoxicosis , enfermedad de tiroides autoinmune, anemia perniciosa, rechazo de autoinjerto, diabetes mellitus y enfermedad renal inmunomediada (glomerulonefritis , nefritis ¡ I tubulointersticial) ) , enfermedades desmielinantes de los í sistemas nervioso central y periférico tales como esclerosis mútliple, polineuropátía desmielinante ideopática o síndrome de Guillain-Barré y polineuropátía desmielinante inflamatoria crónica; enfermedades hepatobilires tales como hepatitis infecciosa (hepatitis A, B, C, D, E y otros virus no hepatotrópicos) , hepatitis activa crónica autoinmune, cirrosis biliar primaria, hepatitis granulomatosa y colangitis esclerosante, enteropatía sensible a glúten y enfermedad de Whipple; enfermedades de la piel autoinmunes o inmunomediadas incluyendo enfermedad de piel bulosa, eritema multiforme y dermatitis de contacto, psoriasis; enfermedades alérgicas tales como asma, rinitis alérgica, dermatitis atópica, conjuntivitis vernal, eczema, hipersensibilidad a alimentos y urticaria; enfermedades inmunológicas del pulmón tales como neumonía eosinofílica, fibrosis pulmonar idiopática y neumonitis de hipersensibilidad; enfermedad asociada a transplante, incluyendo rechazo a injerto y enfermedad de injerto-contra-anfitrión; Como se emplea aquí, el término " inmunoadhesina" designa moléculas tipo anticuerpo, que se combinan en "dominio de enlace" de una proteína "adhesina" heteróloga (por ejemplo un receptor ligando o enzima) con las funciones efectoras de un dominio constante de inmunoglobulina . Estructuralmente , las i inmunoadhesinas comprenden una fusión de la secuencia de aminoácidos de adhesina con la especificidad de enlace deseada que es diferente al sitio de enlace de reconocimiento de antígeno (sitio de combinación de antígeno) de un anticuerpo (es decir es "heterólogo" ) y una secuencia de dominio constante de inmunoglobulina.' La secuencia de dominio constante de inmunoglobulina en la inmunoadhesina de preferencia se deriva de cadenas pesadas yl, y2 , o ?4 , ya que las inmunoadhesinas que comprenden estas regiones pueden purificarse por cromatografía de proteína A. Ver por ejemplo Lindmark et al., 1983, J. Immunol. Meth. 62:1-13. Un anticuerpo "aislado" es aquel que se ha identificado y separado y/o recuperado de un componente de su ambiente natural. Componentes contaminantes de¡ su ambiente natural son materiales que interfieren con usos de diagnóstico terapéuticos para el anticuerpo y pueden incluir enzimas, hormonas y otros solutos proteináceos y no proteináseos . En algunas modalidades, el anticuerpo, se purificará (1) a más de 95% en peso de anticuerpo comoi se determina por el método de Lowry, y más preferiblemente i más de 99% en peso, (2) a un grado suficiente para obtener al menos 15 residuos de secuencia de aminoácidos interna o N-terminal por uso de un secuenciador de copa de centrifugado, o (3) a homogeneidad por SDS-PAGE bajo condiciones reductoras o no reductoras incluyendo azul de Coomassie o de preferencia tinción con plata. Anticuérpo aislado incluye el anticuerpo in si tu dentro de células recombinantes ya que al menos un componente del ambiente natural del anticuerpo no estará presente. Ordinariamente, sin embargo, anticuerpo aislado 1 se preparará por al menos una etapa de purificación. Una molécula de ácido nucleico "aislada" es ,una molécula de ácido nucleico que se identifica y separa' de al menos una molécula de ácido nucleico contaminante Icón el cual ordinariamente está asociada en la fuente natural del ácido nucleico anticuerpo. Una molécula de ácido nucleico aislado es diferente en el ambiente donde se encuentre en la naturaleza. Moléculas de ácido nucleico aisladas por lo tanto se distinguen de la molécula de ácido nucleico como sale en células naturales. Sin embargo, una molécula de ácido nucleico aislada incluye una molécula de ácido nucleico contenida en células que i ordinariamente expresa el anticuerpo en donde por ejemplo la molécula de ácido nucleico está en un sitio cromosofnal diferente al de las células naturales. i El término "mamífero" incluye cualesquiera animales clasificados como mamíferos, incluyendo humanos, vacas, caballos, perros y gatos. En una modali8dad de1 la i invención, el mamífero es un humano. El término "anticuerpo monoclonal" como I se emplea aquí, se refiere a un anticuerpo que se obtiene de una población de substancialmente homogénea, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos excepto por mutaciones de origen natural posibles, que pueden estar presentes en cantidades menores. Anticuerpos monoclonales son altamente específicos, dirigidos contra un solo sitio antigénico. Además, en contraste con preparaciones de anticuerpo convencionales (policlonales) que típicamente incluyen diferentes anticuerpos dirigidos contra diferentes determinantes (epítopes) , cada anticuerpo monoclonal se dirige contra un solo determinante en el antígeno. El modificador "monoclonal" indica el carácter del anticuerpo obtenido de una población de anticuerpos substancialmente homogénea, y no habrá de considerarse que requiere producción del anticuerpo por ningún método particular. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales a utilizarse de acuerdo con la presente invención pueden elaborarse por el método de hibridoma primero descrito por Kohler et al., 1975, Nature 256:495, o pueden elaborarse por métodos de DNA recombinante (ver, por ejemplo, La Patente de los E.U.A. No. 4,816,567). Los "anticuerpos monoclonales" también pueden aislarse de bibliotecas anticuerpo fago utilizo las técnicas descritas en Clackson et al. ,1991, Nature 352:624-628 y Marks et al., 1991, J. Mol. Biol . 222:581-597, por ejemplo. i Los anticuerpos monoclonales aquí específicamente incluyen anticuerpos "quiméricos" (inmunoglobulinas) en donde una porción de la cadena pesada y/o ligera es idéntica con u homologa a secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de una especie particular o que pertenecen a una clase o subclase de anticuerpo particular, mientras que el resto de la o las cadenas es idéntico con u homólogo a secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de otras especies o que pertenecen a otra clase o subclase de anticuerpo, así como fragmentos de estos anticuerpos, siempre que exhiben la actividad biológica deseada (Patente de los E.U.A. No. 4,816,567; y Morrison et al., 1984, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 81:6851-6855). Un ácido nucleico es "enlazado operativamente," como se emplea aquí, cuando se coloca en una relación funcional con otra secuencia de ácido nucleico. Por ejemplo, DNA para un líder secretorio o de pre-secuencia se enlaza operativamente a DNA para un anticuerpo si se expresa como una preproteína que participa en la secreción del anticuerpo; un promotor o mej orador ! se I I ! enlaza operativamente a una secuencia de codificación si i afecta la transcripción de la secuencia; o un sitio, de enlace de ribosoma se enlaza operativamente con una secuencia de codificación si se ubica a fin de facilitar la traducción. En general, "enlazado operativamente" significa que las secuencias de DNA enlazadas son contiguas y en el caso de un líder secretorio, contiguas y en fase de lectura. Sin embargo, un agente de mejora no tiene que ser contiguo. El enlace se logra por ligación en sitios de restricción convenientes. Si estos sitios no existen, se emplean enlazadores o adaptadores de oligonucleótidos sintéticos, de acuerdo con la práctica convencional. Para los presentes propósitos, una "composición farmacéutica" es aquella que se adapta y es adecuada para administración a un mamífero, especialmente un humano. De esta manera, la composición pu¡ede emplearse para tratar una enfermedad o desorden en ' el mamífero. Aún más, la proteína en la composición se^ ha sometido a una o más etapas de purificación o aislamiento, tal que el o los contaminantes que puedan interferir con su uso terapéutico se han separado de ahí. En general, la composición farmacéutica comprende la proteína terapéutica y un portador o diluyente farmacéuticamente aceptable. La composición usualmente es estéril y puede estar liofilizada. Preparaciones farmacéuticas se describen con más detalle ' a continuación. "Polinucleótido, " o "ácido nucleico, " se emplean en forma intercambiable aquí, se refieren a polímeros de nucleótidos de cualquier longitud, e incluyen DNA y RNA. Los nucleótidos pueden ser desoxirribonucleotidos, ribonucleótidos , nucleótidos modificados o bases, y/o sus análogos, o cualquier substrato que puede incorporarse en un polímero por DNA o RNA polimerasa o por una reacción sintética. Un polinucleótido puede comprender nucleótidos modificados, tales como nucleótidos metilados y sus análogos. De estar presente, la modificación a la estructura de nucleótido puede impartirse antes o después de ensambl'ado I del polímero. La secuencia de nucleótidos puede interrumpirse por componentes no nucleótidos. Un polinucleótido además puede modificarse después ! de síntesis tal como por conjugación con una etique'ta. I Otros tipos de modificaciones incluyen por ejemplo, "tapas", substitución de uno o más de nucleótidos ¡ de origen natural con un análogo, modificaciones ínter nucleótido tales como por ejemplo, aquellas con enlaces sin carga con enlaces cargados (por ejemplo, metil fosfonatos, fosfotriésteres , fosfoamidatos, carbamatos, I I . i I etc.) y con enlaces cargados (por ejemplo, I fosforotioatos , fosforoditioatos, etc.) , aquellos j que contienen porciones secundarias, tales como por ejemplo, proteínas (por ejemplo, nucleasas, toxinas, anticuerpos, péptidos de señal, ply-L-lisina, etc.) , aquellos con intercaladores (por ejemplo, acridina, psoraleno, etc.) , aquellos que contienen queladores (por ejemplo, metales, metales radioactivos, boro, metales oxidativos, etc.) , aquellos que contienen alquilantes, aquellos con enlaces modificadores (por ejemplo, ácidos nucleicos alfa anoméricos, etc.) , así como formas no modificadas del o los polinucleótidos . Además, cualquiera de los grupo hidroxilo ordinariamente presentes en los azúcares pueden ser reemplazados, por ejemplo, por grupos fosfonáto, grupos fosfato protegidos por grupos protectores estándar I o activados para preparar enlaces adicionales , a nucleótidos adicionales, o pueden conjugarse a soporjtes sólidos o semisólidos. El OH 5' y 3' terminal OH pu'ede í ser fosforilado o substituido con aminas o porciones j de grupos de terminación de extremo orgánicos de 1 a 20 átomos de carbono. Otros hidroxilos también pueden i derivatizarse en grupos protectores estándar. Polinucleótidos también pueden contener formas análogas de azúcares desoxirribosa o ribosa que en general . se conocen en la técnica, incluyendo por ejemplo, 2 ' -0-metil-, 2'-0-alil, 2' -flúor- o 2 ' -azido-ribosa, análogos I de azúcar carbocíclicos , azúcares a-anoméricos , azúcares epiméricos tales como arabinosa, xilosas o lixosas, azúcares de piranosa, azúcares de furanosa, sedoheptulosas, análogos acíclicos y análogos de nucleótido abásicos, tales como metil ribósidos. Uno o más enlaces fosfodiéster pueden reemplazarse por grupos de enlace alternos. Estos grupos de enlace alternos incluyen pero no están limitados a modalidades en donde fosfato se reemplaza por P (O) S ( " tioato" ) , P(S)S ("ditioato") , "(0)NR2 ( "amidato" ) , P(0)R, P(0)OR', CO o CH2 ( "formacetal" ) , en donde cada R o R' es independientemente H o alquilo substituido o sin sustituir (1-20 C) opcionalmente que contienen un enlace I éter (-0-) , arilo, alquenilo, cicloalquilo, cicloalquenilo, o araldilo. No todos los enlaces en un polinucleótido requieren ser idénticos. La descripción precedente aplica a todos los polinucleótidos aquí referidos, incluyendo RNA y DNA. "Oligonucleótido" como se emplea aquí, en I general se refiere a oligonucleótidos sintéticos cortos, en general de una sola hebra, generalmente sintéticos, que en general pero no necesariamente son menos ' de aproximadamente 200 nucleótidos de longitud. Los términos "oligonucleótido" y "polinucleótido" no son i i I ! i mutuamente excluyentes. La descripción anterior para polinucleótidos es aplicable por igual y completamente a oligonucleótidos . "Secuencia de señal de secreción" o "secuencia i de señal" se refiere a una secuencia de ácido nucleico que codifica un péptido de señal corto que puede ser empleado para dirigir una proteína de interés recientemente sintetizada a través de una membrana celular, usualmente la membrana interior o ambas membranas interior y exterior de procariotas. Como tal, la proteína de interés tal como el polipéptido de cadena ligera o pesada inmunoglobulina se secreta en el periplasma de las células anfitrionas procarióticas o en medio de cultivo. El péptido de señal codificado por la secuencia de señal de secreción puede ser endógeno a la célula anfitriona o puede ser exógeno, incluyendo péptidos de señal nativos al polipéptido a expresar. Secuencias de señal de secreción típicamente están presentes en el extremo amino de un polipéptido a expresarse, y típicamente se retiran enzimáticamente entre biosíntesis y secreción del polipéptido desde el citoplasma. De esta manera, el péptido de señal usualmente no está presente en un producto de proteína madura . El término "dominio de enlace de receptor" se emplea para designar cualquier ligando nativo para un receptor, incluyendo moléculas de adhesión celular, o cualquier región o derivado de este ligando nativo 'que retiene al menos una habilidad de enlace de receptor cualitativo de un ligando nativo correspondiente. Esta definición, entre otras, específicamente incluye secuencias de enlace de ligandos para los receptores anteriormente mencionados. Como se emplea aquí, un "anticuerpo terapéutico" es un anticuerpo que es efectivo para tratar una enfermedad o desorden en un mamífero con o predispuesto a la enfermedad o desorden. Anticuerpos terapéuticos ejemplares incluyen el anticuerpo anti-FCYRIIB 5 a 6 de la invención y el anticuerpo anti-FcYRIIB/anti-FceRI biespecífico de la invención, así como anticuerpos incluyendo rhuMAb 4D5 (HERCEPTEN®) (Cárter et al., 1992, Proc. Nati. Acad. Sci . USA, 89:4285-4289, Patente de los E.U.A. No. 5,725,856); anticuerpos anti-CD20 tales como anti-CD20 quiméricos "C2B8" como en la Patente de los E.U.A. No. 5,736,137 (RITUXAN®) , una variante quimérica o humanizada del anticuerpo 2H7 como en la Patente de los E.U.A. No. 5,721,108, Bl ! o Tositumomab (BEXXAR®) ; anti-IL-8 (St John et al., 1993, Chest, 103:932, y la Publicación Internacional No. , 0 95/23865) ; anticuerpos anti-VEGF incluyendo anticuerpos anti-VEGF madurados por afinidad tales como el anticuérpo i anti-VEGF humanizado huA4.6.1 AVASTEN™ (Kim et al., 1992, Growt Factors, 7:53-64, Publicaciones Internacionales Nos. WO 96/30046, y O 98/45331, publicadas en octubre 15, 1998) ; anticuerpos anti-PSCA (WO01/40309) ; anticuerpos anti-CD40, incluyendo S2C6 y sus variantes humanizadas (WO00/75348) ; anti-CDlla (Patente de los E.U.A. No. 5,622,700, WO 98/23761, Steppe et al., 1991, Transplant Entl. 4:3-7, y Hourmant et al., 1994, Transplantation 58:377-380) ; anti-IgE (Presta et al., 1993, J. Immunol. 151:2623-2632, y la Publicación Internacional No. WO 95/19181) ; anti-CD18 (Patente de los E.U.A. No. 5,622,700, otorgada en abril 22, 1997, o como en WO 97/26912, publicada en julio 31, 1997) ; anti-IgE (Patente de los E.U.A. No. 5,714,338, otorgada en febrero 3, 1998 o Patente de los E.U.A. No. 5,091,313, otorgada en febrero 25, 1992, WO 93/04173 publicada en marzo 4, 1993, o la Publicación Internacional No. PCT/US98/13410 presentada en junio 30, 1998, Patente de los E.U.A. No. 5,714,338) ; anticuerpo receptor anti-Apo-2 (WO 98/51793 publicada en noviembre 19, 1998) ; anticuerpos anti-TNF-a incluyendo cA2 (REMICADE®) , CDP571 y MAK-195 (Ver, Patente de los E.U.A. No. 5,672,347 otorgada en septiembre 30, 1997, Lorenz et al. 1996, J. Inmuno1. 156 (4) : 1646-1653 , y Dhaenaut et al. 1995, Crit. Care Med. 23 (9) : 1461-1469) ; factor anti-tejido (TF) (Patente i Europea No. 0 420 937 Bl otorgada en noviembre 9, 1994) ; a4-/37 integrina anti-humana (WO 98/06248 publicada en j febrero 19, 1998); anti-EGFR (anticuerpo 225 humanizado o quimerizado como en WO 96/40210 publicada en diciembre 19, 1996) ; anticuerpos anti-CD3 tales como OKT3 (Patente de los E.U.A. No. 4,515,893 otorgada en mayo 7, 1985); anticuerpos anti-CD25 o anti-tac tales como CHI-621 (SIMULECT®) y (ZENAPAX®) (Ver Patente de los E.U.A. No. 5,693,762 otorgada en diciembre 2, 1997); anticuerpos anti-CD4 tales como anticuerpo cM-7412 (Choy et al. 1996, Arthritis Rheu 39 (1) : 52-56) ; anticuerpos anti-CD52 tales como CAMPATH-1H (Riechmann et al. 1988, Nature 332:323-337; anticuerpos de receptor anti-Fc tales como anticuerpo M22 dirigido contra Fc(RI como en Graziano' et al.1995, J". I munol. 155 (10) : 4996-5002 ; anticuerpos de antígeno anti-carcinoma embriónico (CEA) tales como hMN-14 (Sharkey et al. 1995, Cáncer Res. 55 (23Suppl) : 5935s-5945s; anticuerpos dirigidos contra células epiteliales de mama incluyendo huBrE-3, hu-Mc 3 y CHL6 (Ceriani et i al. 1995, Cáncer Res. 55(23): 5852s-5856s ; y Richman et al. 1995, Cáncer Res. 55(23 Supp) : 5916s-5920s) ; anticuerpos que ligan a células de carcinoma de colon tales como C242 (Litton et al. 1996, Eur J. Immunol. 26(1) :l-9); anticuerpos anti-CD38 por ejemplo AT 13/5 I i i .

(Ellis et al. 1995, J. Immunol . 155 (2) : 925-937) ; I anticuerpos anti-CD33 tales como Hu 195 (Jurcic et,al. 1995, Cáncer Res 55(23 Suppl) : 5908s-5910s y CMA-676 o CDP771; anticuerpos anti-CD22 tales como LL2 o LymphoGide (Juweid et al. 1995, Cáncer Res 55(23 Suppl) : 5899s-5907s; anticuerpos anti-EpCAM tales como 17-1A (PANOREXj®) ; anticuerpos anti-GpIIb/lIIa tales como abciximab o c7E3 Fab (REOPRO®) ; anticuerpos anti-RSV tales como MEDI -493 (SYNAGIS®) ; anticuerpos anti-CMV tales como PROTOVIR®; anticuerpos anti-HIV tales como PR0542; anticuerpos antihepatitis tales como el anticuerpo anti-Hep B OSTAV R®; anticuerpo anti-CA 125 OvaRex; anticuerpo BEC2 epitope GD3 anti-idiotípico; anticuerpo anti-av?3 VITAXEN®; anticuerpo de carcinoma de célula renal anti-humano tal como ch-G250; ENG-1; anticuerpo anti-humano 17-1A (3622W94) ; anticuerpo de tumor colorectal anti-humano (A33) ; anticuerpo de melanoma anti-humano R24 dirigido contra gangliósido GD3 ; carcinoma de célula escamosa anti-humano (SF-25) ; y anticuerpos de antígeno de leucocito anti-humano (HLA) tales como el anticuerpo Smart ID10 y anti-HLA DR Oncolym (Lym-1) . El término "cantidad terapéuticamente efectiva" se refiere a una cantidad de una composición de esta invención efectiva para "aliviar" o "tratar" una enfermedad o desorden en un sujeto o mamífero. En una I modalidad, si la enfermedad inmune a tratar es una enfermedad mediada por célula B, es una cantidad 1 que resulta en la reducción en el número de células B (agotamiento de célula B) en el mamífero. "Tratamiento" se refiere al uso de esta invención efectivo para "Tratamiento" o "tratar" de ' una enfermedad o desorden en un sujeto o mamífero. En general el tratamiento de una enfermedad o desorden involucra la reducción de uno o más síntomas o problemas médicos asociados con la enfermedad o desorden. En algunas modalidades, anticuerpos y composiciones de esta invención puede emplearse para evitar el inicio o recurrencia de la enfermedad o desorden en un sujeto o mamífero. Por ejemplo, en un sujeto con enfermedad autoinmune, un anticuerpo de esta invención puede utilizarse para evitar o tratar recrudecimientos o reactivaciones. Administración o tratamiento consecutivo se refieren a tratamiento al menos en una base diaria sin interrupción en el tratamiento por uno o más dí'as . Administración al tratamiento intermitente o tratamiento de administración en una forma intermitente se refieren a tratamiento que no es consecutivo sino más bien cíclico en naturaleza. El régimen de tratamiento aquí puede' ya ser consecutivo o intermitente. Una cadena pesada "variante" o "alterada" como se emplea aquí, en general se refiere a una cadena pesada con capacidad de enlace disulfuro reducida, para por ejemplo, cuando al menos un residuo cisteína se ha vuelto incapaz de formación de enlace disulfuro. De preferencia, la cisteína como mínimo está en la región bisagra de la cadena pesada. El término "vector," como se emplea aquí, se pretende para referirse a una molécula de ácido nucleico capaz de transportar otro ácido nucleico al cual se ha enlazado. Un tipo de vector es un "plásmido" , un bucle DNA de doble hebra circular en el cual pueden ligarse segmentos de DNA adicionales. Otro tipo de vector es un vector fago. Otro tipo de vector es un vector viral, en donde segmentos de DNA adicionales pueden ligarse en el genoma viral . Ciertos vectores son capaces de replicación autónoma en una célula anfitriona en la cual se introducen (por ejemplo, vectores bacterianos que tienen un origen de replicación bacteriano y vectores de mamífero episomales) . Otros vectores (por ejemplo, vectores de mamífero no-episomales) pueden integrarse en el genoma de una célula anfitriona ante introducción en la célula anfitriona, y de esta manera se replican junto con el genoma anfitrión. Aún más, ciertos vectores son capaces de dirigir la expresión de genes a los cuales se enlazan operativamente. Estos vectores aquí se refieren como "vectores de expresión recombinante" (o simplemente, "vectores recombinantes" ) . En general, vectores de expresión de utilidad en técnicas de DNA recombinantes están a menudo en la forma de plásmido. En la presénte especificación "plásmido" y "vector" pueden emplearse en forma intercambiable como el plásmido en la forma más comúnmente empleada de vector. Un anticuerpo que "liga selectivamente FcyRIIB humano" liga a FcyRIIB humano con afinidad significativamente mejor que liga a otros FcyRs humanos. En algunas modalidades, un anticuerpo que liga selectivamente FCYRIIB humano, liga tanto FcyRIIBl como FCYRIIB2 y demuestra poco o ningún enlace a FcyRIIA, FcyRI y FcyRIII, y sus variantes alélicas. El enlace relativo y/o afinidad de enlace pueden demostrarse en una variedad de métodos aceptados en la técnica, incluyendo pero no limitados a: ensayo inmunosolvente enlazado con enzima (ELISA) y clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) . En general, esto significa que el anticuerpo de la invención liga a FcyRIIB con al menos aproximadamente 1 log de reactividad de concentración superior que liga a FcyRIIA, como se determina para 1 un ELISA. De preferencia, el anticuerpo que liga FcyRIIB humano selectivamente sobre FcyRIIA humano esencialmente es incapaz de reacción cruzada con FcyRIIA humano.

Como se emplea aquí, un anticuerpo | que "esencialmente es incapaz de reacción cruzada icón FcyRIIA humano" es aquel en el que la extensión de enlace a FcyRIIA humano será menos de 10% del nivel de enlace FcyRIIB, en forma alterna menos de 8%, en forma alterna menos de 6%, en forma alterna menos de 4%, en forma alterna menos de 2%, en forma alterna menos de 1% de enlace a FcyRIIA humano respecto a enlace FcyRIIB humano como se determina por análisis de clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS) o ensayo' de radioinmunoprecipitación (RIA) . Como se emplea aquí, un anticuerpo ,que "antagoniza el enlace de una región Fe a FcyRIIB humano" bloquea o interfiere con el enlace de una región Fe (por ejemplo, región Fe de un anticuerpo, tal como IgG, o inmunoadhesina , u otra construcción que contiene Fe) a FC FcyRIIB. Esta actividad antagonista puede determinarse por ejempo por ELISA. I.Modos para Llevar a Cabo la Invención A. Producción del anticuerpo Anti-FcyRIIB ! (i) Antígeno FcyRIIB FcyRIIB humano soluble o sus fragmentos, opcionalmente conjugados a otras moléculas, pueden emplearse como inmunógenos para generar anticuerpos. Inmunógenos ejemplares incluyen proteínas de fusión que I comprenden un dominio extracelular de FCYRIIBI O FcyRÍIB2 con una proteína portadora o etiqueta de afinidad ' tal I como GST o His6. En forma alterna o adicionalmente , células que expresan FcyRIIB humano, pueden emplearse como e inmunogeno . Estas células pueden derivarse de una fuente natural o pueden ser células que se han transformado por técnicas recombinantes para exprésar FcyRIIB humano. Otras formas de FcyRIIB humano útiles para preparar anticuerpos, serán aparentes para aquellos con destreza en la técnica. (ii) Anticuerpos Policlonales Anticuerpos policlonales de preferencia 1 se desarrollan en animales por múltiples inyecciones subcutáneas (se) o intraperitoneales (ip) del antígeno relevante y un adyuvante. Pueden ser útiles para conjugar el antígeno relevante a una proteína que es inmunogénica i en la especie a inmunizar, por ejemplo hemocianina | de í erizo de mar, albúmina de suero, tiroglobulina bovina o inhibidor de tripsina de soya utilizando un agente i bifuncional o derivatizado, por ejemplo maleimidobenzpil sulfosuccinimida éster (conjugación a través de residuos i cisteína) , N-hidroxisuccinimida (a través de residuos lisina) , glutaraldehído, anhídrido succínico, S0C12, o R1N=C=NR, en donde R y R1 son grupos diferentes alquilo' Los animales se inmunizan contra el antígeno, conjugados inmunogénicos , o derivados al combinar ! por ejemplo 100 µg o 5 µg de la proteína o conjugado (para I conejos o ratones, respectivamente) con 3 volúmenes1 de adyuvante completo de Freund, e inyectar la solución i intradérmicamente en múltiples sitios. Aproximadamente un mes después, los animales se refuerzan con 1/5 a l/ló de la cantidad original de péptido conjugado en adyuvante completo de Freund por inyección subcutánea en múltiples sitios. Siete a 14 días después los animales son sangrados y el suero se ensaya para título de anticuerpo. Los animales se refuerzan hasta que el título alcanza una meseta. De preferencia, el animal se refuerza con el conjugado del mismo antígeno, pero conjuga a una proteína diferente y/o a través de un reactivo de entrelazamiento diferente. Los conjugados también pueden hacerse 1 en cultivo celular recombinante como fusiones de proteíjna.

También, agentes de agregación tales como alumbre se I emplean convenientemente para mejorar la inmunorespuesta. i (iii) Anticuerpos monoclonales Anticuerpos monoclonales pueden elaborarse utilizando el método de hibridoma primer descrito por Kohler et al., 1975, Nature, 256:495, o pueden elaborarse por métodos de DNA recombinante (ver por ejemplo Patente de los E.U.A. Número 4,816,567). En el método de hibridoma, un ratón u otro animal anfitrión apropiado tal como un hámster o mono macaco, se inmuniza como se describió con anterioridad para producir linfocitos que producen o son capaces de producir anticuerpos que ligaran específicamente a la proteína empleada para inmunización. En forma alterna, pueden inmunizarse linfocitos in vi tro. Después se fusionan linfocitos con células de mieloma utilizando un agente de fusión conveniente tal como polietilen glicol, para formar una célula de hibridoma (Goding, 1986, Monoclonal Antibodies : Principies and Practice, pp.59-103 (Academic Press) ) . Las células de hibridoma así preparadas son sembradas y desarrolladas en un medio de cultivo conveniente que de preferencia contiene una o más sustancias que inhiben el crecimiento o supervivencia de las células de mieloma precursoras, sin fusionar. Por ejemplo, si la célula de mieloma precursora carece de la enzima hipoxantina guanina fosforibosil transferasa (HGPRT o HPRT) , el medio de cultivo para los hibridomas típicamente incluirá hipoxantina, aminopterina y timidina (medio HAT) , estas sustancias evitan el crecimiento , de células deficientes en HGPRT. Células de mieloma preferidas son aquellas que se fusionan eficientemente, soportan producción de alto nivel estable de anticuerpo por las células productoras de anticuerpo selectas y son sensibles a un medio tal I como medio HAT. Entre estas, líneas celulares de mieloma preferidas son líneas de mieloma murino, tales como aquellas derivadas de tumores de ratón MOPC-21 y PC-11 disponibles de Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, California USA, y las células SP-2 o X63-Ag8-653 disponibles de American Type Culture Collection, Rockville, aryland USA. Líneas celulares de mieloma humano y heteromieloma de ratón-humano, también se han descrito para la producción de anticuerpos monoclonales humanos (Kozbor, 1984, J". Immunol . , 133:3001; Brodeur et al., 1987, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York)). Medio de cultivo en donde se desarrollan células de hibridoma se ensaya para la producción de anticuerpos monoclonales dirigidos contra el antígeno. De preferencia, la especificidad de enlace de anticuerpos monoclonales producidos por células de hibridoma, se determina por inmunoprecipitacion o por un ensayo de enlace in vitro, tal como radioinmunoensayo (RIA) o ensayo inmunoabsorbente enlazado por enzima (ELISA) . Después de que las células de hibridoma ! se identifica que producen anticuerpos de las deseadas especificidad, afinidad y/o actividad, los clones pueden se subclonados por procedimientos dilución limitante' y desarrollados por métodos estándar (Goding, supra) . Medios de cultivo convenientes para este propósito incluye por ejemplo, medio D-MEM o RPMI-1640. Además, las células de hibridoma pueden desarrollarse in vivo como tumores ascitis en un animal. Los anticuerpos monoclonales secretados por los subclones se separan convenientemente del medio de cultivo, fluido ascitis o suero por procedimientos de purificación de inmunoglobulina convencionales tales como por ejemplo, proteína A-sefarosa, cromatografía de hidroxilapatita, electroforésis en gel, diálisis o cromatografía de afinidad. DNA que codifica los anticuerpos monoclonales se aisla fácilmente y secuencia utilizando procedimientos convencionales (por ejemplo al utilizar sondas oligonucleótido que son capaces de ligar específicamente a genes que codifican las cadenas pesada y ligera de los anticuerpos monoclonales) . Las células de hibridoma sirven como una fuente preferida de este DNA. Una vez aislado, el DNA puede colocarse en vectores de expresión que después se transfectan en células anfitrionas tales como células de E. coli, a células COS de simio, células de ovario de hámster chino (CHO= Chínese hámster ovary) o células de mieloma que de otra forma no producen proteína inmunoglobulina, para obtener la síntesis de anticuerpos monoclonales en las células anfitrionas recombinantes . Producción recombinante de anticuerpo se describirá con más detalle a continuación. En una modalidad adicional, anticuerpos o fragmentos de anticuerpo pueden aislarse de bibliotecas fago de anticuerpo generadas utilizando las técnicas descritas en cCafferty et al., 1990, Nature, 348:552-554. Clackson et al., 1991, Nature, 352:624-628, y Marks et al., 1991, J. Mol. Biol . , 222:581-597 describe el aislamiento de anticuerpos murinos y humanos, respectivamente utilizando bibliotecas fago.

Publicaciones subsecuentes describen la producción de anticuerpos humanos de alta afinidad (rango nM) por entre mezclado de cadena (Marks et al., 1992, Bio/Technology, 10:779-783), así como infección combinatoria y recombinación in vivo como una estrategia para construcción de bibliotecas fago muy grandes (Waterhouse et al., 1993, Nuc. Acids. Res., 21:2265-2266). De esta manera, estas técnicas son alternativas viables a técnicas de hibridoma de anticuerpo monoclonal tradicionales para aislamiento de anticuerpos monoclonales. El DNA también puede ser modificado por ejemplo al sustituir la secuencia de codificación por dominios constantes de cadena ligera y pesada humana en lugar de las secuencias murinas homologas (Patente de los E.U.A. número 4,816,567; Morrison, et al., 1984, Proc.

Nati Acad. Sci . USA, 81:6851), o por unión covalente a la secuencia de codificación de inmunoglobulina de todo o ? parte de la secuencia de codificación para material que no es de inmunoglobulina (por ejemplo dominios de proteína) . Típicamente, este material no-inmunoglobulina se sustituye por los dominios constantes del anticuerpo o se sustituye por los dominios variables de un sitio de combinación de antígeno de un anticuerpo para crear un anticuerpo bivalente quimérico que comprende un sitio de combinación de antígeno que tiene especificidad para1 un antígeno y otro sitio de combinación de antígeno que tiene especificidad para un antígeno diferente. (iv) Anticuerpos Humanizados y Humanos Un anticuerpos humanizado tiene uno o ¡más residuos amino ácido de una fuente que no es humana. 'Los residuos amino ácido no humanos a menudo se refieren como residuos de "importación", y típicamente se toman de un I dominio variable de "importación". La humanización puede realizarse en general siguiendo el método de Winter y colaboradores (Jones et al., 1986, Nature, 321:522-525; Riechmann et al., 1988, Nature, 332:323-327; Verhoeyen et al., 1988, Science, 239:1534-1536), al sustituir CDRs de roedores o secuencia CDR por las secuencias correspondientes de un anticuerpo humano. De acuerdo con esto, estos anticuerpos "humanizados" son anticuerpos I quiméricos (Patente de los E.U.A. Número 4,816,567),; en donde substancialmente menos que un dominio variable humano intacto sea sustituido por la secuencia correspondiente de una especie no humana. En la práctica, anticuerpos humanizados típicamente son anticuerpos humanos en donde algunos residuos CDR y posiblemente algunos residuos FR se sustituyen por residuos de sitios análogos en anticuerpos no humanos, por ejemplo de roedores. La selección de dominios variables humanos, tanto ligeros como pesado a utilizarse en producir los anticuerpos humanizados, es muy importante para reducir antigenicidad . De acuerdo con el método de "mejor ajuste" así denominado, la secuencia del dominio variable de un anticuerpo de roedor se supervisa contra toda la biblioteca de secuencias de dominio variable humanas conocidas. La secuencia humana que es más cercana a la del roedor se acepta entonces como el marco humano (FR) para el anticuerpo humanizado (Sims et al., 1987, J. Immunol., 151:2296; Chothia et al., 1987, J. Mol. Biol . , 196:901). Otro método utiliza un marco particular derivado de la secuencia de consenso de todos los anticuerpos humanos de un subgrupo particular de cadenas ligeras o pesadas. El mismo marco puede utilizarse para I I varios anticuerpos humanizados diferentes (Cárter et al., 1 í 1 1992, Proc. Nati. Acad. Sci . USA, 89:4285; Presta et al., 1993, J. Immnol., 151:2623) . Es además importante que anticuerpos se humanicen con retención de alta afinidad para el antígeno y otras propiedades biológicas favorables. Para lograr esta meta, de acuerdo con un método preferido, se preparan anticuerpos humanizados por un proceso de análisis de las secuencias precursoras y diversos productos humanizados conceptuales utilizando modelos tridimensionales de secuencias precursoras y humanizadas. Modelos de inmunoglobulina tridimensionales están comúnmente disponibles y son familiares para aquellos con destreza en la técnica. Programas de computadoras están disponibles que ilustran y exhiben probables estructuras de conformación tridimensionales de secuencias de inmunoglobulina candidatos selectas. Inspección de estas exhibiciones permite análisis del papel probable de los residuos en el funcionamiento de la secuencia de inmunoglobulina candidato, es decir el análisis de residuos que influencian la habilidad de la inmunoglobulina candidato para ligar a su antígeno. De esta manera, residuos FR pueden seleccionarse y combinarse de las secuencias de importación y recipiente, de manera tal que la característica de anticuerpo deseada I I tal como afinidad incrementada para el o los antígenos diana, se logra. En general, los residuos CDR están involucrados directa y más substancialmente j en influenciar enlace de antígeno. En forma alterna, ahora es posible producir animales transgénicos (por ejemplo ratones) que son capaces ante inmunización, de producir un repertorio completo de anticuerpos humanos en la ausencia de producción de inmunoglobulina endógena. Por ejemplo, se ha descrito que la eliminación homocigota del gen de la región de unión de cadena pesada (JH) de anticuerpo en ratones mutantes de línea germinal y quiméricos, resulta en inhibición completa de producción de anticuerpo endógeno. La transferencia del conjunto de genes de inmunoglobulina de línea germinal humana en estos ratones mutantes de línea germinal, resultará en la producción! de I anticuerpos humanos ante prueba con antígeno. ¡Ver Jakobovits et al., 1993, Proc. Nati. Acad. Sci . USA, i 90:2551; Jakobovits et al., 1993, Nature, 362:255-258; Bruggermann et al., 1993, Year in Inmuno., 7:33; and Duchosal et al., 1992, Nature 355:258. Anticuerpos I humanos también pueden derivarse de bibliotecas 1 de exhibición fago (Hoogenboom et al., 1991, J". Mol. Biol., 227:381; Marks et al., J. Mol. Biol., 1991, 222:581-597; i Vaughan et al., 1996, Nature Biotech 14:309). i (v) Anticuerpos multiespecífieos Anticuerpos multiespecífieos tienen especificidades de enlace para cuando menos dos antigénos diferentes. Mientras que estas moléculas normalmente solo ligan dos antigénos (es decir anticuerpos bi-específicos , BsAbs) , anticuerpos con especificades adicionales tales como anticuerpos triespecífieos se abarcan por esta expresión cuando se emplean aquí. Ejemplos BsAbs incluyen aquellos con un sitio de enlace de antígeno dirigido contra FcyRIIB y otro sitio de enlace de antígeno dirigido contra por ejemplo: receptor de célula B (BCR) , CD79a y/o CD79(S, un antígeno expresado en luna célula de tumor, receptor IgE (FceR) , IgE acoplado a IgER tal como en mastocitos y/o basófilos, receptores IgG RI (FcyRI) y RUI (FCYRIII) tales como en NK y monocitos y macrófagos, equipos de receptor tirosina cinasa c-kit. En algunas modalidades, los BsAbs comprenden una primer especificidad de enlace para FcyRIIB y una segunda especificidad de enlace para un receptor de activación que tiene un motivo ITAM citoplásmico . Una estructura de motivo ITAM posee dos tirosinas separadas por un espaciador de 9 a 11 amino ácidos. Una secuencia concehso general es YxxL/I (x) 6-8YxxL (Isakov, N. , 1997, J. Leukoc. Biol . , 61:6-16). Receptores de activación ejemplares incluyen FceRI , FCYRIII, FcyRI , FCTRIIA, y FCYRIIC. Otros receptores de activación incluyen CD3 , CD2 , CD10, CD161, DAP-12, KAR, KARAP, FceRII, Trem-1, Trem-2, CD28, p44, p46, receptor de célula B, LMP2A, STAM, STAM-2, GPVI , y CD40 (Ver Azzoni, et al., 1998, J". Immunol . 161:3493; Kita, et al., 1999, J". Immunol . 162:6901; Merchant , et al., 2000, J. Biol. Che . 74:9115; Pandey, et al., 2000, J". Biol. Chem. 275:38633; Zheng, et al., 2001, J". Biol Chem. 216:12993; Propst, et al., 2000, J". Immunol. 165 :2214) . En una modalidad, un BsAb comprende una primera especificidad de enlace para FCYRIIB y una segunda especificad de enlace para FceRI. Anticuerpos biespecífieos pueden prepararse como anticuerpos de longitud íntegra o fragmentos de anticuerpo (por ejemplo anticuerpos biespecíficos F(ab' )2) - Anticuerpos biespecíficos pueden prepararse adicionalmene como perilla-en-orificios o anticuerpos sin bisagra. Anticuerpos biespecífieos se revisan por Segal et al., 2001, J". Immunol. Methods 248:1-6. Métodos para producir anticuerpo biespecíficos se conocen en la técnica. Producción tradicional de anticuerpos biespecíficos de longitud íntegra se basa en la coexpresión de dos pares de cadena pesada- cadena ligera de inmunoglobulina, en donde dos cadenas tienen diferentes especificidades (Millstein et al., 1983, Nature, 305:537-539). Debido al surtido aleatorio de cadenas pesadas y ligeras de inmunoglobulina, estos hibridomas (cuadromas) producen una mezcla potencial1 de 10 moléculas de anticuerpo diferentes, de los cuales sólo uno tiene la estructura biespecífica correcta. La purificación de la molécula correcta, usualmente que se realiza por etapas de cromatografía de afinidad, es más bien problemática y los rendimientos de productos son bajos. Procedimientos similares se describen en WO 93/08829, y en Traunecker et al., 1991, EMBO J. , 10:3655-3659. De acuerdo con un enfoque diferente, dominios variables de anticuerpo con las especificades de enlace deseadas (sitios de combinación de anticuerpo-antígeno) se fusionan a secuencias de dominio constante de inmunoglobulina. La fusión puede ser con un dominio constante de cadena pesada de inmunoglobulina, que comprende al menos parte de la bisagra, regiones CH2 y CH3. Se prefiere tener la primer región constante de cadena pesada (CH1) que contiene el sitio necesario para enlace de cadena ligera, presente en al menos una de las fusiones. DNAs que codifican las fusiones de cadena pesada de inmunoglobulina y si se desea, la cadena ligera de inmunoglobulina, se insertan en vectores de expresión separados y se cotransectan en un organismo anfitrión conveniente. Esto proporciona gran flexibilidad para ajustar las proporciones mutuas de los tres fragmentos de anticuerpo en modalidades cuando proporciones distintas de las tres cadenas de anticuerpo utilizadas en la construcción proporciona los rendimientos óptimos. Sin embargo, es posible insertar las secuencias de codificación para dos o todas las tres cadenas de anticuerpo en un vector de expresión cuando la expresión de al menos dos cadenas de anticuerpo en proporciones iguales resulta en altos rendimientos o cuando las proporciones no son de significancia particular. En otra modalidad de este enfoque, los anticuerpos biespecífieos están compuestos por una cadena pesada de inmunoglobulina híbrida con una primer especificidad de enlace en un brazo, y un par de cadena i ligera-cadena pesada de inmunoglobulina híbrida (que proporciona una segunda especificidad de enlace) en1 el otro brazo. Se encontró que esta estructura asimétrica facilita la separación del compuesto biespecífico dese'ado de combinaciones de cadena inmunoglobulina indeseadas, i como la presencia de una cadena ligera de inmunoglobulina en solo una mitad de la molécula biespecífica proporciona un método fácil de separación. Este enfoque se describe en WO 94/04690. Para mayores detalles de métodos para generar anticuerpos biespecífieos, ver por ejemplo, I Suresh et al., 1986, Methods in Enzymology, 121:210. De acuerdo con otro enfoque descrito en W096/27011,, la interfase entre un par de moléculas de anticuerpo puede someterse a ingeniería para llevar al máximo el por ciento de heterodímeros que se recuperan del cultivo celular recombinante . La interfase preferida comprende al menos parte del dominio CH3 de un dominio constante de anticuerpo. En este método, una o más cadenas laterales de amino ácido pequeño de la interfase de la primer molécula anticuerpo se reemplazan con cadenas laterales más grandes (por ejemplo tirosina o triptofano) . "Cavidades" compensatorias de tamaño idéntico o similar a la o las cadenas grandes se crean en la interfase de la segunda molécula de anticuerpo al reemplazar grandes cadenas laterales de amino ácido con más pequeñas (alanina o trionina) . Esto proporciona un mecanismo para incrementar el rendimiento del heterodímero sobre ottos productos finales indeseados tales como homodímeros. Anticuerpos biespecífieos incluyen anticuerpos entrelazados o "heteroconjugados" . Por ejemplo, uno de los anticuerpos en el heteroconjugado puede acoplarse a avidina, el otro a biotina. Estos anticuerpos, por ejemplo se han propuesto para ser diana en células del sistema inmune a células indeseadas (patente de los E.U.A. No. 4,676,980), y para tratamiento de infección de HIV (WO 91/00360, O 92/200373, y EP 03089) . Anticuerpos heteroconjugados pueden elaborarse utilizando cualesquiera métodos de entrelazamiento conveniente. Agentes de entrelazamiento convenientes son bien conocidos en la técnica y se describen por ejemplo en la patente de los E.U.A. No. 4,676,980, junto con una cantidad de técnicas de entrelazamiento. Anticuerpos con más de dos valencias también se contemplan. Por ejemplo, anticuerpos triespecíficos pueden prepararse de acuerdo con Tutt et al., 1991, J". Immunol. 147: 60. (vi) Anticuerpos con regiones bisagra variantes Los anticuerpos de la presente invención también pueden comprender cadenas pesadas variantes, por ejemplo como se describe en la solicitud de patente de los E.U.A. No. de Serie 10/697,995, presentada en octubre 30, 2003. Anticuerpos que comprenden cadenas pesadas variantes, comprenden una alteración de al menos un residuo cisteína formador de disulfuro, tal que el i residuo cisteína sea incapaz de formar un enlace disulfuro. En un aspecto, la o las cisteínas son de! la región bisagra de la cadena pesada (de esta manera, ta región bisagra se refiere aquí como "región bisagra i variante" y adicionalmente puede ser referida como "sin bisagra") . 1 En algunos aspectos, estas inmunoglobulinas carecen del repertorio completo de residuos cisteína de cadena pesada que son normalmente capaces de formar enlaces disulfuro, ya sea intermolecularmente (tal como entre dos cadenas pesadas) o intramolecularmente (tal como entre dos residuos cisteína en una sola cadena polipéptido) . En general y de preferencia, el enlace disulfuro formado por el o los residuos cisteína que se altera (es decir, se hace incapaz de formar enlaces disulfuro) es aquel que, cuando no está presente en un anticuerpo, no resulta en una pérdida substancial de las características fisicoquímicas y/o biológicamente normales de la inmunoglobulina . De preferencia, aunque no necesariamente, el residuo cisteína que se hace incapaz de formar enlaces disulfuro es una cisteína de la región bisagra de una cadena pesada. Un anticuerpo con cadenas pesadas variantes o región bisagra variante en general se produce al expresar en una célula anfitriona un anticuerpo en donde al menos i uno, al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, o entre dos y once enlaces disulfuro de inter-cadena pesada se eliminan, y recuperar el anticuerpo de la célula anfitriona. Expresión del anticuerpo puede ser a partir de un polinucleótido que codifica un anticuerpo, el anticuerpo comprende una región pesada variante con I reducida capacidad de enlace disulfuro, seguido por recuperar el anticuerpo de la célula anfitriona ique comprende el polinucleótido . De preferencia, la cadena pesada comprende una región bisagra variante de ;una cadena pesada de inmunoglobulina, en donde al meno suna cisteína de la región bisagra variante se hace incapaz de formar un enlace disulfuro. Además se anticipa que cualquier cisteína en una cadena pesada inmunoglobulina puede hacerse incapaz de formación de enlace disulfuro, similarmente a las cisteínas bisagra aquí descritas, siempre que dicha alteración no reduzca substancialmente la función biológica de la inmunoglobulina. Por ejemplo, Ig y IgE carecen de una región bisagra, pero cada una contiene un dominio de cadena extra-pesado ; al menos una (en algunas modalidades, todas) las cisteínas de la cadena pesada pueden hacerse incapaces de formación de enlace disulfuro en métodos de la invención siempre que no reduzban substancialmente la función biológica de la cadena pesada y/o el anticuerpo que comprende la cadena pesada. Cisteínas de bisagra de cadena pesada son bien conocidas en la técnica, como se describe por ejemplo, en Kabat, 1991, "Sequences of proteins of immunological interest", supra. Como se conoce en la técnica, el número de cisteínas bisagra varía dependiendo de la clase i y subclase de inmunoglobulina . Ver, por ejemplo, Janeway, 1999, Immunobiology, 4th Ed. , (Garíand Publishing, NY) . Por ejemplo, en IgGIs humanas, 'dos cisteínas bisagra se separan por dos prolinas, y estas normalmente se aparean con sus contra-partes en una cadena pesada adyacente en enlaces disulfuro intermoleculares. Otro ejemplos incluyen IgG2 humanos que contienen 4 cisteínas bisagra, IgG3 que contiene1 11 cisteínas bisagra, y IgG4 que contiene 2 cisteínas bisagra. I De acuerdo con esto, métodos de la invención incluyen expresar en una célula anfitriona, una cadena pesada de inmunoglobulina que comprende una región bisagra variante, en donde al menos una cisteína de, la región bisagra variante se hace incapaz de formar' un enlace disulfuro, permitiendo que la cadena pesada fc^rme complejo con una cadena ligera para formar un anticuerpo i biológicamente activo, y recuperar el anticuerpo de ^ la célula anfitriona. ¡ Modalidades alternas incluyen aquellas en donde al menos 2, 3, o 4 cisteínas se hacen incapaces de formar un enlace disulfuro; en donde aproximadamente dos1 a aproximadamente once cisteínas se hacen incapaces; y, en donde todas las cisteínas de la región bisagra variante se hacen incapaces. i Cadenas ligeras y cadenas pesadas ¡ que constituyen anticuerpos de la invención como se produce de acuerdo con métodos de la invención, pueden codificarse por un solo polinucleótido o por polinucleotidos separados. Cisteínas normalmente involucradas en formación de enlace disulfuro pueden hacerse incapaces de formar enlaces disulfuro por cualquiera de una variedad! de métodos conocidos en la técnica, o aquellos que ' se I hicieran evidentes a una persona con destreza en, la técnica en vista de los criterios aquí descritos. Por ejemplo, una cisteína bisagra puede substituirse con otro I amino ácido, tal como serina que no es capaz de unión disulfuro. Substitución de amino ácidos puede lograrse por técnicas de biología molecular estándar, tal como mutagénesis dirigida de sitio de la secuencia de ácido nucleico que codifica la región bisagra que va' a modificarse. Técnicas convenientes incluyen aquellas descritas por Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a Edición. Otras técnicas para generar una inmunoglobulina con una región bisagra variante incluyen síntesis de un oligonucleótido que codifica una región bisagra, en donde el codón para ; la cisteína a substituirse se reemplaza por un codón para el amino ácido substituido. Este oligonucleótido puede entonces ligarse en una estructura principal de vector que comprende otras secuencias de anticuerpo apropiadas tales como regiones variables y secuencias Fe, según i sea apropiado . En otra modalidad, puede eliminarse una cisteína bisagra. Eliminación de amino ácidos puede lograrse por técnicas de biología molecular estándar, tal como mutagénesis dirigida de sitio de la secuencia1 de ácido nucleico que codifica la región bisagra que se va a modificar. Técnicas convenientes incluyen aquellas descritas por Sambrook et al., Supra. Otras técnicas para generar una inmunoglobulina con una región bisagra variante incluyen sintetizar un oligonucleotido que comprende una secuencia que codifica una región bisagra en donde el codón para la cisteína a modificar se elimina. Este oligonucleotido puede entonces ligarse en una estructura principal de vector que comprende otras secuencias de anticuerpo apropiadas tales como regiones variables y secuencias Fe, según sea apropiado. (vii) Anticuerpos biespecífieos formddos utilizando estrategia "protuberancia-dentro-de-cavidad" . En algunas modalidades, anticuerpos biespecífieos de la invención se forman utilizando una estrategia de "protuberancia-dentro-de-cavidad" , también referidos como "perillas en orificios" que sirven para I I manipular o someter a ingeniería una interfase entré un primer y segundo polipéptidos para hetéro- I oligomerización. La interfase preferida comprende al menos una parte del dominio CH3 de un dominio constante de anticuerpo. Las mutaciones de "perillas en orificios" en el dominio CH3 de una secuencia Fe se ha reportado . que reduce enormemente la formación de homodímeros (Ver, por ejemplo, Merchant et al., 1998, Nature Biotechnology, 16:677-681). "Protuberancias" se construyen al reemplazar cadenas laterales de amino ácido pequeño de la interfase del primer polipéptido con cadenas laterales más grandes (por ejemplo tirosina o triptofano) . "Cavidades" compensatorias de tamaño idéntico o similar a las protuberancias se crean opcionalmente en la interfase del segundo polipéptido al reemplazar cadenas laterales de amino ácido grande con más pequeñas (por ejemplo, alanina o treonina) . Cuando una protuberancia o cavidad dimensionada y ubicada convenientemente existe en , la interfase ya sea del primer o segundo polipéptido, solo es necesario someter a ingeniería una cavidad o protuberancia correspondiente, respectivamente en la interfase adyacente. La protuberancia y cavidad a elaborarse por medio sintéticos, tales como alterar el ácido nucleico que codifica los polipéptidos o por síntesis de péptido. Para adicional descripción 1 de perillas en orificios, ver patente de los E.U.A. Nos. i ,731,168; 5,807,706; 5,821,333. En algunas modalidades la tecnología de "perillas en orificios" se emplea para promover heterodimerización para generar anticuerpo anti-Fc/RIIB biespecífico de longitud íntegra y anti- "receptor de activación" (por ejemplo IgER) . En una modalidad, se prepararon construcciones para el componente anti-Fc^IIB (por ejemplo, p5A6.11. Knob) al introducir la mutación "perilla" (knob) (T366 ) en la región Fe, y el componente anti-IgER (por ejemplo, p22E7.11. Hole) al introducir la mutación "orificio" (hole) (T366S, L368A, Y407V) . En otra modalidad, se preparan construcciones para el componente anti-Fc/IIB (por ejemplo, p5A6.11. Hole) al introducir una mutación "orificio" (hole) en su región Fe, y el componente anti-IgER (por ejemplo, p22E7.11. Knob) al introducir una mutación "perilla" en su región Fe tal como por los procedimientos aquí descritos o los procedimientos descritos por Merchant et al., (1998), supra, o en las patentes de los E.U.A. Nos. 5,731,168; 5,807,706; 5,821,333. Un método general para preparar un heteromultímero que utiliza la estrategia de "protuberancia-dentro-de-cavidad" comprende expresar, en una o separadas células anfitrionas, un polinucleótido i que codifica un primer polipéptido que se ha alterado de un polinucleótido original para codificar una protuberancia, y un segundo polinucleótido que codifica un segundo polipéptido que se ha alterado del polinucleótido original para codificar la cavidad. Los polipéptidos se expresan, ya sea en una célula anfitriona común con recuperación del heteromultímero del cultivo de célula anfitriona, o en células anfitrionas separadas, con recuperación y purificación, seguido por formación del heteromultímero. En algunas modalidades, el heteromultímero formado es un anticuerpo multimérico, por ejemplo un anticuerpo biespecífico . En algunas modalidades, anticuerpos de la presente invención combinan una estrategia de perillas en orificios con construcciones de región bisagra variantes, para producir anticuerpos biespecíficos sin bisagras. B. Vectors, Células Anfitrionas y Métodos Recombinantes La invención también proporciona polinucleótidos aislados que codifican los anticuerpos como se describe aquí, vectores y células anfitrionas que comprenden los polinucleótidos, y técnicas recombinantes para la producción de los anticuerpos. Para producción recombinante del anticuerpo, un polinucleótido que codifica el anticuerpo se aisla e I inserta en un vector replicable para mayor clonación (amplificación del DNA) o para expresión. DNA 'que codifica el anticuerpo se aisla y secuencia fácilménte utilizando procedimientos convencionales, por ejemplo al utilizar sondas oligonucleótido capaces de ligar específicamente a genes que codifican el anticuerpo.

Están disponibles muchos vectores. Los componentes' de i vector generalmente incluyen, pero no están limitados a, uno o más de los siguientes: una secuencia de señal,j un origen de replicación, uno o más genes marcadores,) un I elemento mejorador, un promotor, y una secuencia ¡ de terminación de transcripción. I (i) Componente de secuencia de señal Los anticuerpos de esta invención pueden producirse en forma recombinante, no solo directamente sino también como anticuerpos de fusión con anticuerpos heterólogos. En una modalidad, el anticuerpo heteról'ogo I es una secuencia de señal u otro anticuerpo que tiene¡ un sitio de escisión específico en el extremo-N del anticuerpo o proteína madura. La secuencia de señal heteróloga selecta de preferencia es aquella que se reconoce y procesa (es decir, escinde por una señal peptidasa) por la célula anfitriona. Para células anfitrionas procarioticas que no reconocen y procesan' la secuencia de señal de anticuerpo nativo, la secuencia, de seña se substituye por una secuencia de señal procariótica seleccionada por ejemplo, del grupo de fosfatasa alcalina, penicilinasa, lpp, o líderes, de enterotoxina II termo-estable. Para secreción de levadura, la secuencia de señal nativa puede substituirse por, ejemplo mediante el líder de levadura invertasa, líder de factor a (incluyendo líderes de factor a Saecharomyees y Kluyveromyces) , o líder de fosfatasa ácida, el líder de glucoamilasa C. albicans, o la señal descrita en WO 90/13646. En expresión de células de mamífero, secuencias de señal de mamífero así como líderes de secreción viral, por ejemplo, la señal gD de herpes simplex, están disponibles. El DNA para ésta región precursora se liga en un cuadro de lectura para DNA que codifica el anticuerpo. En otra modalidad, producción de anticuerpos puede ocurrir en el citoplasma de la célula anfitriona, y por lo tanto no requiere la presencia de secuencias de señal de secreción dentro de cada cistrón. En ¡ese aspecto, se expresan cadenas ligeras y pesadas de inmunoglobulina, pliegan y ensamblan para for¡mar inmunoglobulinas funcionales dentro del citoplasma. Ciertas cepas anfitrionas (por ejemplo, las cepas E. coli trxB) proporcionan condiciones de citoplasma que son i favorables para formación de enlace disulfuro, de esta manera permitiendo un adecuado plegado y ensambladq de sub-unidades de proteína expresadas. (Proba 1 and Plukthun, 1995, Gene, 159:203.) (ii) Origen de componente de replicacion Tanto vectores de expresión y clonación contienen una secuencia de ácido nucleico que permite al vector replicar en una o más células anfitrionas selectas. En general, en vectores de clonación esta secuencia es aquella que permite al vector replicar independientemente el DNA cromosomal anfitrión, e incluye orígenes de replicacion de secuencias de replicacion autónoma. Estas secuencias son bien conocidas para una variedad de bacterias, levadura y virus. El origen de replicacion del plásmido pBR322 es adecuado para la mayoría de las bacterias Gram-negativas , el origen de plásmido 2 µ es adecuado para levadura y diversos orígenes virales (SV40, polioma, adenovirus, VSV o BPV) son útiles para clonar vectores en células de mamífero. En general, el origen del componente de replicacion no se requiere para vectores de expresión de mamífero (el origen SV40 puede típicamente utilizarse solo debido a que contiene el promotor temprano) . (iii) Componente de gen de selección Vectores de expresión y clonación pueden contener un gen de selección, también denominado i un I marcador seleccionable . Genes de selección típicos i codifican proteínas que (a) confieren resistencia a i antibióticos u otras toxinas, por ejemplo ampicilina, neomicina, metotrexato o tetraciclina, (b) complementan deficiencias auxotróficas , o (c) suministran nutrientes críticos no disponibles de medio complejo, por ejemplo el gen que codifica D-alanina racemasa para Bacilos . Un ejemplo de un esquema de selección utiliza una droga para frenar el crecimiento de una célula anfitriona. Esas células que se transforman exitosamente con un gen heterólogo producen una proteína que confiere resistencia a droga y de esta manera sobrevive al régimen de selección. Ejemplos de esta selección dominante utilizan las drogas neomicina, ácido micofenólico e higromicina . Otro ejemplo de marcadores de selección convenientes para células de mamíferos son aquellos que permiten la identificación de células competentes para absorber el ácido nucleico-anticuerpo, tal como DHFR, timidina cinasa, metalotioneína- I y -II, de preferencia genes de metalotioneína de primate, adenosina deaminasa, ornitina decarboxilasa y semejantes. Por ejemplo, células transformadas con gen de selección DHFR primero se identifican al cultivar todos los transformantes en un medio de cultivo que contiene metotrexato (Mtx) , un antagonista competitivo de DHFR. Una célula anfitriona apropiada cuando se emplea DHFR tipo silvestre es la línea celular de ovario de hámster chino (CHO) deficiente en actividad de DHFR. En forma alterna, células anfitrionas (particularmente anfitriones de tipo silvestre que contienen DHFR endógeno) , transformados o co-transformados con secuencias de DNA que codifican anticuerpo, proteína DHFR tipo silvestre y otro marcador seleccionable tal como aminoglicosido 3 ' -fosfotransferasa (APH) puede seleccionarse por crecimiento celular en medio que contiene un agente de selección para el marcador seleccionable tal como un antibiótico aminoglicosídico, por ejemplo canamicina, neomicina o G418. Ver la Patente de los E.U.A. número 4,965,199. Un gen de selección conveniente para utilizar en levaduras es el gen trpl presente en el plásmido1 de levadura YRp7 (Stinchcomb et al., 1979, Nature, 282:39). El gen trpl proporciona un marcador de selección para una cepa mutante de levadura que carece de la capacidad por desarrollar en triptofano, por ejemplo ATCC No. 44076 o PEP4-1. Jones, 1977, Genetics, 85:12. La presencia de la lesión en el genoma de célula anfitriona de levadura proporciona entonces un ambiente efectivo para detectar la transformación por crecimiento en la ausencia de triptofano. Símilármente , cepas de levadura deficientes en Leu2 (por ejemplo cepas que tienen número de acceso ATCC 20,622 o 38,626) se complementan por plásmidos conocidos que contienen el gen Leu2. Además, vectores derivados del plásmido circular pKDl de 1.6 µp? pueden utilizarse para transformación de levaduras Kluyveromyces. En forma alterna, un sistema de expresión para producción a gran escala de quimosina de ternero recombinante se reporta para K. lactis. Ver Van den Berg, 1990, Bio/Technology, 8:135. Vectores de expresión de múltiples copias estables para secreción de albúmina de suero humano recombinante maduro por cepas industriales de Kluyveromyces también se ha descrito. Ver Fleer et al., 1991, Bio/Technology, 9:968-975. (iv) Componente promotor Vectores de expresión y clonación usualmente contienen un promotor que se reconoce por el organismo anfitrión y se enlaza operativamente con el ácido nucleico anticuerpo. Promotores adecuados para utilizar con anfitriones procarióticos incluyen el sistema promotor phoA, promotor ß-lactamasa y lactosa, fosfatasa alcalina, un sistema promotor de triptofano (trp) y promotores híbridos tales como el promotor tac- Sin embargo, otros promotores bacterianos conocidos son I i convenientes. Promotores para utilizar en sistemas bacterianos también contienen una secuencia Shine-Dalgarno (S.D.) enlazado operativamente con el DNA que codifica el anticuerpo. Secuencias promotoras se conocen para eucariotas. Virtualmente todos los genes eucarióticos tienen una región rica en AT, ubicada aproximadamente 25 a 30 bases corriente arriba del sitio en donde se inicia la transcripción. Otra secuencia encontrada 70 a 80 bases corriente arriba del inicio de transcripción de muchos genes es una región CNCAAT en donde N puede ser cualquier nucleótido. En el extremo 3' de la mayoría de los genes eucarióticos está una secuencia AATAAA que puede ser la señal para adición de la cola poli A al extremo 3' de la secuencia de codificación. Todas estas secuencias son adecuadamente insertadas en vectores de expresión eucarióticos . Ejemplos de secuencias promotoras para utilizar con anfitriones de levadura incluyen los promotores para 3 -fosfoglicerato cinasa u otras enzimas glicolíticas i tales como enolasa, gliceraldehido-3-fosfato dihidrogenasa, hexocinasa, piruvato dicarboxilasa, fosfo- i fructocinasa, glucosa-6-fosaato isomerasa, 3- fosfoglicerato mutasa, piruvato cinasa, triosefosfato i isomerasa, fosfoglucosa isomerasa, y glucocinasa.

Otros promotores de levadura que son promotores inducibles tienen la ventaja adicional de transcripción controlada por condiciones de crecimiento, son 1 las I regiones promotoras para alcohol dihidrogenasa 2, isocitocromo C, fosfatasa ácida, enzimas degradativas asociadas con metabolismo de nitrógeno, metalotioneína, gliceraldehído-3-fosfato dihidrogenasa, y enzimas responsables por utilización de maltosa y galactosa. Vectores y promotores convenientes para utilizar en' la expresión de levadura además se describen en EP 73,657. i Agentes de mejora de levadura también se emplean ventajosamente con los promotores de levadura. Transcripción de anticuerpo a partir de vectores en células anfitrionas en mamífero es controlada por ejemplo por promotores obtenidos de los genomas1 de virus tales como virus polioma, virus de pustulación avícola, adenovirus (tal como Adenovirus 2), virus1 de papiloma bovino, virus de sarcoma aviario, citomegalovirus , un retrovirus, virus de hepatitis B y más preferiblemente virus de simio 40 (SV40) , de promotores de mamíferos heterólogos, por ejemplo el promotor actina o un promotor de inmunoglobulina, p'ara promotores de choque térmico, siempre que eS|tos promotores sean compatibles con los sistemas de células anfitrionas.

Los promotores tempranos y tardíos del virus i SV40 se obtienen convenientemente como un fragmento de restricción SV40 que también contiene el origen de replicación viral SV40. El promotor inmediatamente previo del citomegalovirus humano convenientemente se obtiene como un fragmento de restricción HindIII E. Un sistema para expresión de DNA en anfitriones mamíferos que utilizan el virus papiloma bovino como vector, se describe en la Patente de los E.U.A. número 4,419,446. Una modificación de este sistema se describe en la Patente de los E.U.A. número 4,601,978. Ver también Reyes et al., 1982, Nature 297:598-601 en expresión de cDNA ß-interferona humana en células de ratón bajo el control de un promotor timidina cinasa de virus herpes simples. En forma alterna, la repetición terminal larga de virus rous sarcoma puede emplearse como promotor. (v) Componente de elemento mejorador Transcripción de DNA que codifica el anticuerpo de esta invención por superiores eucariotas a menudo se incrementa al insertar una secuencia mej oradora en el vector. Muchas secuencias mej oradoras ahora se conocen de genes de mamífero (globina, elastasa, albúmina, -fetoproteína, e insulina) . Típicamente, sin embargo se utilizará un agente de mejora de un virus de célula eucariótica. Ejemplos incluyen el agente mej orador SV40 en el lado posterior del origen de replicación (bp 100- i 270) , el agente de mejora promotor temprano j de citomegalovirus , el agente de mejora de polioma en' el I lado tardío del origen de replicación y agentes de mejora de adenovirus. Ver también Yaniv, 1982, Nature 297:17-18, en elementos de mejora para activar promotores eucarióticos . El agente de mejora puede ser combinado en el vector en una posición 5' o 3' a la secuencia que codifica anticuerpo, pero de preferencia se ubica en un sitio 5' del promotor. (vi) componente de terminación de transcripción Vectores de expresión utilizados en células anfitrionas eucarióticas (células de levadura, de hongo, insecto, planta, animal, humano o nucleadas de otros organismos multicelulares) también contendrán secuencias necesarias para la terminación de transcripción y para estabilizar el mR A. Estas secuencias están comúnmente disponibles de las regiones sin traducción 5' y ocasionalmente 3', de DNAs o cDNAs eucarióticos o vírale. Estas regiones contienen segmentos de nucleótido transcritos como fragmentos poliadenilados en la porción no traducida del mRNA que codifica el anticuerpo. Un componente de terminación de transcripción útil es la región de poliadenilación de la hormona de crecimiento bovino. Ver WO94/11026 y el vector de expresión ahí descrito . (vii) Modulación de fuerza de traducción Inmunoglobulinas de la presente invención también pueden ser expresadas de un sistema de expresión en donde la proporción cuantitativa de las cadenas ligera y pesada expresadas pueden modularse a fin de llevar al máximo el rendimiento de anticuerpos de longitud íntegra secretados y adecuadamente ensamblados. Esta modulación se logra al modular simultáneamente las fuerzas de traducción para cadenas ligeras y pesadas. Una técnica para modular la fuerza de traducción se describe en Simmons et al . , Patente de los E.U.A. número 5, 840,523 y Simmons et al., 2002, J. Immunol. Methods, 263: 133-147. Utiliza variantes de la región de inicio de traducción (TIR) dentro de un cistrón. Para una TIR, una serie de variantes de secuencia de aminoácido o ácido nucleico, pueden crearse con un rango de fuerzas de traducción, proporcionando de esta manera un medio conveniente por el cual se ajusta este factor para el nivel de expresión deseado de la cadena específica. Variantes TIR pueden generarse por técnicas de mutagénesis convencional que resultan 1 en cambios de codón que pueden alterar la secuencia de aminoácidos, aunque cambios silenciosos en la secuencia de nucleótidos se prefieren. Alteraciones en la TIR pueden incluir por ejemplo alteraciones en el número o espaciamiento de secuencias Shine-Dalgarno, junto con alteraciones en la secuencia de señal. I Un método preferido para generar secuencias de señal mutantes es la generación de un "banco de codones" al inicio de una secuencia de codificación que no cambia la secuencia de aminoácidos de la secuencia de señal (es decir los cambios son silenciosos) . Esto puede lograrse al cambiar la tercer posición de nucleótido de cada codón; adicionalmente algunos aminoácidos tales como leucina, serina y arginina tienen múltiples primeras y segundas posiciones que pueden agregar complejidad para i producir el banco. Este método de mutagénesis se describe en detalle en Yansura et al., 1992, METHODS: A Companion to Methods in Enzymol . , 4:151-158. De preferencia un conjunto de vectores se genera con un rango de fuerzas de TIR para cada cistrón. Este conjunto limitado proporciona una comparación de niveles de expresión de cada cadena así como el rendimiento de productos de longitud íntegra bajo diversas combinaciones de fuerza TIR. Las fuerzas TIR pueden ser determinadas al cuantificar el nivel de expresión de un gen reportero como se describe en Simmons et al., Patente de los E.U.A. número 5, 840,523 y Simmbns et al., 2002, J. Inmuno1. Methods, 263: 133-147. Para1 el propósito de esta invención, la combinación de la fuerza de traducción para un par particular de TIRs dentro de un vector, se representa por (N-ligero, M-pesado) , en dónde N es la fuerza TIR relativa de la cadena ligera y M es la fuerza TIR relativa de la cadena pesada. Por ejemplo (3-ligera, 7-pesada) significa que el vector proporciona una fuerza TIR relativa de aproximadamente 3 para expresión de cadena ligera y una fuerza TIR relativa de aproximadamente 7 para expresión de cadena pesada. Con base en la comparación de fuerza de producción, los TIRs individuales deseados se eligen para combinarse en las construcciones de vector de expresión de la invención. (vii) Selección y transformación de células anfi trionas Células anfitrionas convenientes para clonar o expresar el DNA en los vectores aquí, son las células procariotas, de levadura o eucariotas superiores descritas anteriormente. Procariotas convenientes p^ra este propósito incluyen Arqueobacterias y Eubacterias, tales como organismos Gram negativos o Gram positivos, I por ejemplo Enterobacteriaceae tales como Escherichia, por ejemplo, E. coli, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, e.g., Salmonella typhimurium, i Serratia, e.g., Serratia arcescans, y Shigella, así cómo Bacilli tales como B. subtilis y B. licheniformis (por i ejemplo B. licheniformis 41P descrito en DD 266,(710, publicada el 12 de abril 1989) , Pseudomonas tales como P. aeruginosa, y Streptomyces . Un anfitrión de clonación de E. coli preferido es E. coli 294 (ATCC 31,446), aunque otras cepas tales como E. coli B, E. coli X1776 (ATCC i 31,537), y E. coli W3110 (ATCC 27,325) son convenientes.

Estos ejemplos son ilustrativos en vez de limitan¿es.

También se prefiere que la célula anfitriona secrete cantidades mínimas de enzimas proteolíticas , ' e inhibidores de proteasa adicionales puedan convenientemente ser incorporados en el cultivo celular. Células anfitrionas procarióticas también pueden comprender una o varias mutaciones en las rutas de tioredoxina y/o glutationa. Además de procariotas, microbios eucarióticos tales como hongos filamentosos o levadura son anfitriones de expresión o clonación convenientes para vectores 'que codifican anticuerpo. Saccharomyces cerevisiae, o , la levadura de pastelero común es la más comúnmente empleada entre microorganismos anfitriones eucarióticos menores. Sin embargo, una cantidad de otros géneros especies y cepas están comúnmente disponibles y útiles aquí tales como Schizosaccharomyces pombe; cepas Kluyveromyces tales como, por ejemplo, K. lactis, K. fragilis (ATCC 12,424), K. bulgaricus (ATCC 16,045), K. wickeramii (ATCC 24,178), I i ¡ I K. waltii (ATCC 56,500), K. drosophilarum (ATCC 36,906), K . thermotolerans, y K. marxianus; yarrowia (EP 402,226); Pichia pastoris (EP 183,070); Candida; Trichoderma reesia (EP 244,234); Neurospora crassa; Schwanniomyces tales como Schwanniomyces occidentalis; y hongos filamentosos tales como por ejemplo, Neurospora, Penicillium, Tolypocladium, y anfitriones de Aspergillus tales como A. nidulans y A. niger. Células anfitrionas convenientes para { la expresión de anticuerpo glicosilado, se derivan \ de organismos multicelulares. Ejemplos de células invertebradas incluyen células de plantas y de insectos.

Numerosas cepas de baculovirus y variantes y células anfitrionas de insectos permisivas correspondientes ' de anfitriones tales como Spodoptera frugiperda (oruga) Aedes aegypti (mosquito) , Drosophila melanogaster (mo^ca de las frutas) y Bowbyx mori , se han identificado. Una variedad de cepas virales para transfección están disponibles públicamente, por ejemplo la variante L-l Autographa californica NPV y la cepa Bm-5 de Bombyx mori NPV, y estos virus pueden emplearse como el virus actual de acuerdo con la presente invención, particularmente para transfección de células de Spodoptera frugiperda . Cultivos de células de plantas de algodón, maíz, papa, soya, petunias, tomate y tabaco también pueden emplearse como anfitriones. Células anfitrionas de vertebrados se emplean ampliamente, y la propagación de células de vertebrados en cultivo (cultivo de tejido) se ha convertido en un procedimiento rutinario. Ejemplos de líneas de células anfitrionas de mamífero son líneas CV1 de riñon de mono transformada por SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); línea de riñon embriónico humano (293 o células 293 subclonadas para crecimiento en cultivo de suspensión, Graham et al., J. Gen Virol . 36:59 (1977)); células de riñon de hámster bebé (BHK, ATCC CCL 10) ; células de ovario de hámster chino / -DHFR (CHO, Urlaub et al., 1980, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 77:4216); células sertoli de ratón (TM4, Mather, 1980, Biol . Reprod. 23:243-251); células de riñon de mono (CV1 ATCC CCL 70) ; células de riñon de mono verde africano (VERO-76, ATCC CRL-1587) ; células de carcinoma cervical humano (HELA, ATCC CCL 2) ; células de riñon canino (MDCK, ATCC CCL 34) ; células de hígado de rata búfalo (BRL 3A, ATCC CRL 1442) ; células de pulmón humano ( 138, ATCC CCL 75); células de hígado humano (Hep G2 , ' HB 8065); tumor de mama de ratón (MMT 060562, ATCC CCL51) ; células TR1 (Mather et al., 1982, Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68); células MRC 5; células FS4 ; células 'de mieloma de ratón tales como NSO (por ejemplo RCB0213, 1992, Bio/Technology 10:169) y células SP2/0 (por ejemplo SP2/0-Agl4, células, ATCC CRL 1581); células de mieloma de rata tales como células YB2/0 (por ejemplo células YB2/3HL.P2.G11.16Ag.20, ATCC CRL 1662); y una línea, de hepatoma humano (Hep G2) . Las células CHO son una línea celular preferida para practicar la invención con CHO-Kl, DUK-B11, CHO-DP12, CHO-DG44 (Somatic Cell and Molecular Genetics 12:555 (1986)) y Lecl3 que son líneas de células anfitrionas ejemplares. En el caso de células anfitrionas CHO-Kl, DUK-B11, DG44 o CHO-DP12, estas pueden ser alteradas de manera tal que sean eficientes en su habilidad para fucosilar las proteínas ahí expresadas. La invención también aplica a células de hibridoma. El término "hibridoma" se refiere a una línea celular híbrida producida por la fusión de una línea de células inmortales de origen inmunológico y una célula productora de anticuerpos. El término abarca progenie de fusiones de mieloma heterohíbridas , que son el resultado de una fusión con células humanas y una línea celular de mieloma murino subsecuentemente fusionada con una célula de plasma, comúnmente conocida como línea celular trioma. Además, el término se pretende que incluya cualquier línea celular híbrida inmortalizada que produce anticuerpos tales como por ejemplo cuadromas (ver, por ejemplo Milstein et al., 1983, Nature, 537:3053). Las líneas celulares híbridas pueden ser de cualquier especie incluyendo humana y de ratón. En una modalidad más preferida, la célula de mamífero es una célula que no es de hibridoma, que se ha transformado con ácido nucleico aislado exógeno que codifica el anticuerpo de interés. Por "ácido nucleico exógeno" o "ácido nucleico heterólogo" se entiende una secuencia de ácido nucleico que es ajena a la célula, u homologa a la célula pero en una posición dentro del ácido nucleico de la célula huésped en donde el ácido nucleico ordinariamente no se encuentra. (viii) Cultivar las células anfitrionas . Células anfitrionas se transforman con los vectores de clonación o expresión anteriormente descritos para producción de anticuerpo y cultivan en medio nutriente convencional modificado según sea apropiado para inducir promotores, seleccionar transformantes, o amplificar los genes que codifican las subsecuencias deseadas . Las células anfitrionas empleadas para producir anticuerpo de esta invención pueden ser cultivadas en una variedad de medios. Medio comercialmente disponible tal como Ham' s FIO (Sigma) , medio esencial mínimo ( (MEM) , (Sigma) , RPMI-1640 (Sigma)), y medio eagle modificado con dulbecco ( (DMEM) , Sigma) son adecuados para cultivar las células anfitrionas. Además, cualquiera de los medios I I descritos en Ham et al., 1979, Meth. Enz . 58:44, Barnes et al., 1980, Anal. Bioche . 102:255, patentes de [los E.U.A. Números 4,767,704; 4,657,866; 4,927,762; 4,560,655; o 5,122,469; O 90/03430; WO 87/00195; o patente de Re. de los E.U.A. Número 30,985 pueden utilizarse como medio de cultivo para las células anfitrionas. Cualquiera de estos medios puede ser suplementado según sea necesario con hormonas y/o otros factores de crecimiento (tales como insulina, transferrina o factor de crecimiento epidérmico) , sales (tales como cloruro de sodio, calcio, magnesio y fosfato) , amortiguadores (tales como HEPES) , nucleótidos (tales como adenosina y timidina) antibióticos (tales como la droga gentamicinaMR) elementos en trazas (definidos como compuestos inorgánicos usualmente presentes a concentración finales en el rango micro molar) y glucosa o una fuente de energía equivalente. Cualesquiera otro suplemento necesarios también pueden incluirse en concentraciones apropiadas que serán conocidas para aquellos con destreza en la técnica. Las condiciones de cultivo tales como temperatura, pH; y semejantes son aquellos previamente empleadas con la célula anfitriona seleccionada para expresión y serán aparentes a la persona con destreza en la técnica. I Todos los medios de cultivo típicamente i proporcionan cuando menos un componente de uno o más de las siguientes categorías: 1 1) una fuente de energía, usualmente en la forma de un carbohidrato tal como glucosa; 2) todos los aminoácidos esenciales, y usualmente el conjunto básico de 20 aminoácidos mas cistina; 3) vitaminas y/u otros compuestos orgánicos requeridos a bajas concentraciones; 4) ácidos grasos libres; y 5) elementos en trazas, en donde los elementos en trazas se definen como compuestos inorgánicos o elementos de origen natural que se requieren típicamente muy bajas concentraciones, usualmente en el rango micro molar. El medio de cultivo de preferencia está libre de suero, por ejemplo menos de aproximadamente 5%, de preferencia menos de 1%, más preferible 0 a 0.1% en suero y otras proteínas derivadas de animales. Sin embargo, pueden emplearse si se desean. En una modalidad preferida de la invención, el medio de cultivo celular comprende exceso de aminoácidos. Los aminoácidos que se i proporcionan en exceso por ejemplo pueden seleccionarse de Asn, Asp, Gly, lie, Leu, Lys, Met, Ser, Thr, Trp, Tyr, y Val. De preferencia Asn, Asp, Lys, Met, Ser, y Trp se proporcionan en exceso. Por ejemplo, aminoácidos vitaminas elementos en trazas y otros componentes I de I I medio en uno o dos veces los rangos especificados en la patente europea 307,247 o en la patente de los E.U.A. Número 6,180,401 pueden emplearse. Estos dos documentos se incorporan aquí por referencia. Para el cultivo de células de mamífero ique expresan la proteína deseada y capaces de agregar los carbohidratos deseados en específicas posiciones, numerosas condiciones de cultivo pueden emplearse dedicando atención particular a la célula anfitriona ^ue se cultiva. Condiciones de cultivo convenientes para células de mamíferos son bien conocidas en la técnica (W. Louis Cleveland et al., 1983, J. Im unol . Methods 56:221-234) o pueden determinarse fácilmente por la persona con destreza en la técnica (ver, por ejemplo Animal Cell Culture: A Practical Approach 2nd Ed. , Rickwood, D. and Hames, B.D., eds . Oxford University Press, New York (1992) ) , y varían de acuerdo con la célula anfitriona particular selecta. (ix) Purificación de anticuerpo Cuando se utilizan técnicas recombinantes , el anticuerpo puede producirse intracelularmente , en , el espacio periplásmico, o directamente secretadas en 1 el medio. Si el anticuerpo se produce intracelularmente, como una primera etapa, los desechos de partículas, ya sea células anfitrionas o fragmentos lisados, se retiran, por ejemplo por centrifugación o ultrafiltración . Cárter et al. ,1992, Bio/Technology 10:163-167 describen i un procedimiento para aislar anticuerpos que se secretan al espacio periplásmico de E. coli. Brevemente, se descongela pasta celular en la presencia de acetato de sodio (pH 3.5), EDTA, fenilmetilsulfonilfluoruro (PMSF) sobre aproximadamente 30 minutos. Desechos celulares pueden retirarse por centrifugación. Cuando el anticuerpo se secreta en el medio, sobrenadantes de estos sistemas de expresión en general primero se concentran utilizando un filtro de concentración de proteína comercialmente disponible, por ejemplo una unidad de ultrafiltración Amicon o Milipor Pelicon. Un inhibidor de de proteasa tal como PMSF puede incluirse en cualquiera de las etapas anteriores para inhibir proteorisis y antibióticos pueden incluirse para evitar el crecimiento de contaminantes adventicios . La composición de anticuerpo preparada a partir de las células puede purificarse utilizando por ejemplo cromatografía de hidroxilapatita, electroforesis de gél, diálisis y cromatografía de afinidad, con cromatografía de afinidad que es la técnica de purificación preferidas. La conveniencia de proteína A como un ligando de afinidad depende de las especies e isotipo de cualquier región 'Fe de inmunoglobulina que esta presente en el anticuerpo . ¡ La proteína A puede emplearse para purificar anticuerpos i que se basan en cadenas pesadas ??, ?2 , o ?4 humanas (Lindmark et al., 1983, J. Iw unol . Meth. 62:1-13) . La proteína G se recomienda para todos los isotipos de ratón y para ?3 humano (Guss et al., 1986, EMBO J. 5:15671575) . La matriz a la cual se conecta el ligando de afinidad mas a menudo es agarosa, pero están disponibles otras matrices. Matrices mecánicamente estables como vidrio de poro controlado o poli (estirendivinil ) benceno permiten gastos de flujo más rápidos y tiempos de procesamiento más cortos que pueden lograrse con agarosa. Cuando el anticuerpo comprende un dominio CH3 , la resina Bakerbond ABXMR (J. T. Baker, Phillipsburg, NJ) es útil para purificación. Otras técnicas para purificación de proteína tales como fraccionación en una columna de intercambio de iones, precipitación con etanol, HPLC de fase inversa, cromatografía en sílice, cromatografía en heparina, cromatografía de SEPHAROSEMR en una resina de intercambio de aniones o cationes (tal como columna de ácido poliaspártico) , cromato enfoque, SDS-PAGE, y precipitación de sulfato de aminio, también están disponibles dependiendo del anticuerpo a recuperar. En una modalidad, la glicoproteína puede purificarse utilizando adsorción en un sustrato de lectina (por ejemplo una columna de afinidad de lectiha) I para retirar glicoproteína que contiene fucosa a partir de la preparación y de esta manera enriquecer ' la glicoproteína libre de fucosa. (x) Ensayos de actividad de anticuerpo Las inmunoglobulinas de la presente invención pueden caracterizarse por sus propiedades físicas/químicas y funciones biológicas por diversos ensayos conocidos en la técnica. En un aspecto de la invención, es importante comparar la selectividad de un anticuerpo de la presente invención para ligar el inmunógeno contra otras dianas de enlace. Particularmente, un anticuerpo que liga selectivamente FCYRIIB de preferencia no ligará o exhibirá débil o deficiente actividad de enlace a otros FcyRs particularmente FcyRIIA. En ciertas modalidades de la invención, las inmunoglobulinas producidas aquí se analizan por su actividad biológica. En algunas modalidades, las inmunoglobulinas de la presente invención se prueban por su actividad de enlace antigénico. Los ensayos de enlace antigénico que se conocen en la técnica y pueden utilizarse aquí incluyen sin limitación cualesquiera ensayos de enlace directos o competitivos utilizando técnicas tales como transferencias Western, radioinmunoensayos , ELISA (enzyme linked immnosorbent i I assay) inmunoensayos "emparedados", ensayos de inmunoprecipitación, inmunoensayos fluorescentes i e inmunoensayos de proteína A. Ensayos de enlace antígeno ilustrativos se proporcionan a continuación en la sección de ejemplos. Las inmunoglobulinas purificadas además pueden caracterizarse por una serie de ensayos que incluyen pero no están limitados a secuenciado N-terminal, análisis de animoácidos, cromatografía de líquido con alta presión (HPLC) y exclusión de tamaño sin desnaturalización, espectrometría de masas, cromatografía de intercambio de iones y digestión con papaína. Métodos para cuantificación de proteínas son bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, muestras de las proteínas expresadas pueden compararse por sus intensidades cuantitativas en un SDS-PAGE teñido con Coomassie.. De forma alterna, a o las bandas específicas de interés (por ejemplo la banda de longitud íntegra) pueden detectarse por ejemplo por análisis en gel de transferencia western y/o ensayo AME5-RP. C. Formulaciones Farmacéuticas Formulaciones terapéuticas del anticuerpo, pueden prepararse al mezclar el anticuerpo que tiene el grado de pureza deseado con portadores excipientes o i estabilizantes fisiológicamente aceptables opcionales (Re ington ' s Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol , i A. Ed. (1980) ) en la forma de soluciones acuosas o formulaciones liofilizadas . Portadores excipientes o estabilizantes aceptables no son tóxicos a los recipientes, a las dosis y concentraciones empleadas, e incluyen amortiguadores tales como fosfato, citrato y otros ácidos orgánicos; antioxidantes incluyendo ácido ascórbico y metionina; conservadores (tales como cloruro de octadecildimetilbencil amonio; cloruro de exametonio; cloruro de benzalconio; cloruro de bencetonio, fenol, butil o benzilalcohol ; alquil parabenos tales como metil o propil parabeno; catecol ; resorcinol, ciclohexanol , 3 pentanol y m-cresol) ; anticuerpo de bajo peso molecular (menos de aproximadamente 10 residuos) ; proteínas tales como albúmina de suero, gelatina o inmunoglobulinas ; polímeros hidrofílicos tales como polivinilpirrolidona; aminoácidos tales como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina o lisina; monosacáridos , disacáridos í y otros carbohidratos incluyendo glucosa, mañosa i o dextrinas; agentes quelantes tales como EDTA; azúcares tales como sacarosa, manitol, trealosa o sorbítol; contra iones formadores de sales tales como sodio; complejo de metal (por ejemplo complejo de proteína-Zn) y/o sufactantes no iónicos tales como T EEN™, PLURONICST,C o polietileno glicol (PEG) .

La formulación aquí también puede contener i más i de un compuesto activo según sea necesario para, la indicación particular a tratar, de preferencia aquellas con actividades complementarias que no afectan adversamente entre sí. Por ejemplo, la formulación además puede comprender otro anticuerpo o agente quimioterapéutico . Estas moléculas están convenientemente presentes en combinación en cantidad que son efectivas para el propósito pretendido. Los ingredientes activos también pueden atraparse en microcápsulas preparadas por ejemplo por técnicas de coacervación o por polimerización interfacial, por ejemplo hidroximetil celulosa o microcápsulas de gelatina y microcápsulas de polimetilmetacrilato (respectivamente) en sistemas de suministro de droga coloidal (por ejemplo liposomas, microesferas de albúnima, microelmulsiones, nanopartículas y nanocápsulas) o en macroemulsiones . Estas técnicas se describen en Remington ' s Pharmaceut cal Sciences 16th edition, Osol , A. Ed. (1980) . Las formulaciones a utilizarse para administración in vivo deben ser estériles. Esto se logra fácilmente por filtración a través de membranas t de filtración estériles. Pueden elaborarse preparaciones de liberación sostenida. Ejemplos adecuados de preparaciones de liberación sostenida incluyen matrices semipermeables de polímeros hidrofóbicos sólidos que contienen el i anticuerpo, estas matrices están en la forma de artículos conformados, por ejemplo películas o microcápsulas . Ejemplos de matrices de liberación sostenida incluyen poliésteres hidrogeles (por ejemplo poli (2 -hidroxietil -metacrilato) , o poli (vinilalcohol) ) , polilactidas (Patente de los E.U.A. Número 3,773,919), copolímeros de ácido L-glutámico y ? etil-L-glutamato, etilen vinil acetato no-degradable, copolímeros de ácido láctico-ácido glicólico degradables tales como LUPRON DEPOT™ (microesferas inyectables compuestas por copolímero de ácido láctico-ácido glicólico y leuprolida acetato) , y ácido poli-D- ( - ) -3 -hidroxibutírico . Mientras que polímeros tales como etilen vinil acetato y ácido láctico-ácido glicólico permiten liberación de moléculas por más de 100 días, ciertos hidrogeles liberan proteínas por periodos de tiempo más cortos. Cuando anticuerpos encapsulados permanecen en el cuerpo por largo tiempo, pueden desnaturalizarse o agregar como resultado de exposición a la humedad a 37 grados C, resultando en pérdida de actividad biológica y posibles cambios ¦ en i inmunogenicidad. Estrategias racionales pueden diseñarse para estabilización dependiendo del mecanismo involucrado. Por ejemplo, si el mecanismo de agregación se descubre que es formación de enlace S-S intermolecular a través de intercambio tio-disulfuro, puede lograrse estabilización al modificar residuos sulfhidrilo, liofilización de soluciones acídicas, controlar contenido de humedad, utilizando aditivos apropiados y desarrollando composiciones de matrices poliméricas específicas . D. Usos no terapéuticos para el anticuerpo El anticuerpo de la invención puede utilizarse como un agente de purificación de afinidad. En este proceso, el anticuerpo se inmoviliza en una fase sólida tal como resina Sephadex™ o papel filtro, utilizando métodos bien conocidos en la especialidad. El anticuerpo inmovilizado se contacta con una muestra que contiene el antígeno a purificar, y posteriormente el soporte se lava con un solvente conveniente que retirará substancialmente todo el material en la muestra excepto el antígeno a purificar, que se liga al anticuerpo inmovilizado . Finalmente, el soporte se lava con otro solvente conveniente, tal como amortiguador glicina, pH 5.0, que liberará el antígeno del anticuerpo. El anticuerpo puede ser también útil en ensayos de diagnóstico, por ejemplo para detectar expresión de un antígeno de interés en específicas células, tejidosj o suero. Para aplicaciones de diagnóstico, el anticuerpo típicamente se etiquetará con una porción detectable. Numerosas etiquetas están disponibles que en general pueden agruparse en las siguientes categorías: (a) Radioisótopos tales como 35S, 14C, 125? , 3H, y 131I .

El anticuerpo puede etiquetarse con el radioisótopo utilizando las técnicas descritas en Current Protocols in Immunology, Volumes 1 and 2, Coligen et al., Ed. Wiley-Interscience, New York, New York, Pubs . (1991), por ejemplo y radioactividad puede medirse utilizando conteo de destelleo. (b) Etiquetas fluorescentes tales como quelatos de tierras raras (quelatos de europio) o fluoresceína y sus derivados, rodamina y sus derivados, dansil, Lissamina, ficoeritrina y Rojo Tejas están disponibles. Las etiquetas fluorescentes pueden conjugarse al anticuerpo utilizando las técnicas descritas en Current Protocols in Immunology, supra, por ejemplo. La fluorescencia puede cuantificarse utilizando un fluorímetro. (c) Diversas etiquetas de enzima-sustrato están disponibles y la Patente de los E.U.A. Número 4,275,149 proporciona una revisión de algunas de estas. La enzima generalmente cataliza una alteración química del sustrato cromogénico que puede medirse utilizando diversas técnicas. Por ejemplo, la enzima puede catalizar un i cambio de color en un sustrato, que puede medi|rse espectrofotométricamente . En forma alterna, la enzjima puede alterar la fluorescencia o quimioluminiscencia ¡del sustrato. Técnicas para cuantificar un cambio en fluorescencia se describieron anteriormente. El sustrato quimioluminiscente se vuelve electrónicamente excitado por una reacción química y puede entonces emitir luz que puede medirse (utilizando un quimioluminómetro, por ejemplo) o donar energía a un aceptor fluorescente. Ejemplos de etiquetas enzimáticas incluyen luciferasas (por ejemplo luciferasa de luciérnaga y luciferasa bacteriana; Patente de los E.U.A. número 4,737,456), luciferina, 2 , 3 -dihidroftalazindionas , malato dehidrogenasa, ureasa, peroxidasa tal como peroxidasa de rábano (HRPO) , fosfatasa alcalina, ß-galactosidasa, glucoamilasa, lisozima, sacárido oxidasas (por ejemplo, glucosa oxidasa, galactosa oxidasa, y glucosa-6-fosfáto dehidrogenasa) , oxidasas heterocíclicas (tales como uricasa y xantina oxidasa) , lactoperoxidasa, microperoxidasa . Técnicas para conjugar enzimas . en anticuerpos se describen en O'Sullivan et al., Methpds for the Preparation of Enzyme-Antibody Conjugates for use in Enzyme Immunoassay, in Met ods in Enzym. (ed j J. Langone and H. Van Vunakis) , Academic press, New York, 73 : 147-166 (1981) .

Ejemplos de combinaciones de enzima-sustrato incluyen por ejemplo: ! 1) Peroxidasa de rábano (HRPO) utiliza peróxido de hidrógeno para oxidar un precursor de colorante (por ejemplo, ortofenilen diamina (OPD) o hidrocloruro de 3 , 3 ' , 5 , 5 ' -tetrametil benzidina (TMB) ) ; 2) fosfatasa alcalina (AP) con para-Nitrofenil fosfato como sustrato cromogénico; y 3) ß-D-galactosidasa (ß-D-Gal) con un sustrato promogénico (por ejemplo, p-nitrofenil -ß-D-galactosidasa) o sustrato fluorgénico 4 -metilumbeliferil -ß-D-galactosidasa . Numerosas otras combinaciones de enzima-sustrato están disponibles para aquellos con destreza en la técnica. Para una revisión general de estas ver las Patentes de los E.U.A. números 4,275,149 y 4,318,980. En ocasiones, la etiqueta se conjuga indirectamente con el anticuerpo. La persona con destreza estará al tanto de diversas técnicas para lograr esto. Por ejemplo, el anticuerpo puede conjugarse con biotina y cualquiera de las tres amplias categorías de etiquetas anteriormente mencionadas pueden conjugarse con avidina o viceversa. Biotina liga selectivamente ¦ a avidina y de esta manera, la etiqueta puede conjugarse con el anticuerpo en esta forma indirecta. En forma I alterna, para lograr conjugado indirecto de la etiqueta con el anticuerpo, el anticuerpo se conjuga con pequeño hapteno (por ejemplo digoxina) y uno de los diferentes tipos de etiquetas anteriormente mencionados se conjuga con un anticuerpo anti-hapteno (por ejemplo anticuerpo anti-digoxina) . De esta manera, conjugación indirecta en la etiqueta con el anticuerpo puede lograrse. En otra modalidad de la invención, j el anticuerpo no requiere estar etiquetado, y su presencia I puede detectarse utilizando un anticuerpo etiquetado que liga al anticuerpo. El anticuerpo de la presente invención puede emplearse en cualquier método de ensayo conocido tal como ensayo de enlace competitivos, ensayos de emparedado directo e indirecto, y ensayo de inmunoprecipitación .

Zola, Monoclonal Antibodies : A Manual of Techniques, pp.147-158 (CRC Press, Inc. 1987). El anticuerpo también puede emplearse para ensayos de diagnóstico in vivo. En general, el anticuerpo se etiqueta con un radionúclido (tal como 11 ??, 99Tc, 14C, 131I, 125I, 3H, 32P o 35S) de manera tal que el antígeno o células que lo expresan pueden localizarse utilizando gammagrafía . E. Usos In Vivo para el anticuerpo (i) Reducir actividad inhibitoria de FcyRIIB (CD32B) : Interferencia con enlace Fe de anticuerpo . \ En otra modalidad, el anticuerpo anti-FcyRIIB se coadministra con un agente terapéutico para mejorar la función del agente terapéutico. Por ejemplo, anti-FcyRIIB se administra a un mamífero para bloquear enlace IgG a FcyRIIB, de esta manera evitando inhibición mediada por FcyRIIB de una inmunorespuesta . Esto resulta en citotoxicidad mejorada de un anticuerpo terapéutico IgG. Por ejemplo, cuando un anticuerpo terapéutico es específico para un antígeno de tumor, la coadministración de FcyRIIB de la invención con el anticuerpo de antígeno antitumor mejora la citotoxicidad del anticuerpo de antígeno antitumor. Anticuerpos terapéuticos, una cantidad de los cuales se describieron anteriormente, se han desarrollado y aprobado para tratamiento de diversas enfermedades incluyendo cáncer. Por ejemplo, RITUXAN® (Rituximab) (IDEC Pharm/Genentech, Inc.) se utilizan para tratar linfómas de célula B, AVASTIN™ (bevacizumab) (Genenteph, Inc.) se utiliza para tratar cáncer colorectal metastásico y HERCEPTIN® (Trastumab) (Genentech, Inc.) es un anticuerpo monoclonal anti-HER2 humanizado que se utiliza para tratar cáncer de mama metastásico. Aunque los mecanismos para tratamiento de cáncer por todos los anticuerpos monoclonales desarrollados para ejste I tratamiento pueden no ser comprendidos por completo, ¡ al menos en algunos casos, una porción de la efectividadj de la terapia de anticuerpo puede atribuirse al reclutamiento de la función efectora inmune (Houghton et al., 2000, Nature Medicine, 6:373-374; Clynes et al., 2000, iVature Medicine, 6:433-446). XOLAIR® (Omalizumab) (Genentech, Inc.) es un anticuerpo anti-IgE utilizado para tratar alergias. FCYRIIB se expresa en células de linaje mieloide y linfoide, pero no en células destructoras naturales y es un receptor inhibitorio. Cuando se activa, FcyRIIB, por ejemplo puede inhibir la señalización FC7RIII que de otra forma activará macrófagos, células destructoras naturales y mastocitos. La inhibición de FcyRIIB, (por ejemplo bloqueo de enlace Fe a FcyRIIB) atenúa su efecto inhibitorio en función efectora inmune, asistiendo de esta manera a terapias Mab. Ravetch, J. , (WO01/79299) describe un método para mejorar la citotoxicidad de un anticuerpo anti-tumor al reducir la afinidad de la región Fe para FcyRIIB y de esta manera limitar la inhibición mediada por SHIP de activación celular . En una modalidad, un anticuerpo que liga selectivamente FcyRIIB se administra con un anticuerpo anti-tumor en un mamífero que requiere este tratamiento.

La selectividad para FcyRIIB se desea de manera tal que I la activación de respuesta efectora inmune por otros FcyRs, incluyendo FcyRIIA no se deteriora. Al faliar| en i hacer reacción cruzada con FcyRIIA, la función inhibitoria de FcyRIIB se bloquea más eficientemente, de esta manera mejorando adicionalmente el efecto del agente co-terapéutico . En una modalidad, el anticuerpo anti-FcyRIIB se administra a un mamífero para bloquear el enlace de anticuerpos IgG, de esta manera bloqueando los efectos inhibitorios de FcyRIIB y, por ejemplo mejorando la proliferación de células B. (ii) Mejorar actividad inhibitoria de FcyRIIB: Co-agregación con receptor de activación : In vivo, FCYRIIB puede co-agregarse con una variedad de receptores de activación incluyendo como ejemplo no limitantes, el receptor de antígeno de célula ? (BCR) , el receptor de alta afinidad para IgE (IgER o FceRI) , FcyRIIA, y el receptor de c-kit (FCYRIII) . Los receptores de activación, como ejemplos no limitantes, son proteínas transmembrana con actividades de activación para respuesta inmunoefectora y comprenden un motivo de activación ITAM. FcyRIIB se activa por co-agregación de FcyRIIB con un receptor de activación que atenúa las señales suministradas a través de los receptores! de activación. A la fecha, FcyRIIB no se ha mostrado que ¡ se fosforila por autoagregación u homodimerización . El receptor FcyRIIB se ha heterodimerizado o co-agregado experimentalmente (o co-ligado) con otros receptores que expresan un ITAM fosforilado (motivo de activación) y por asociación indirecta con proteínas tirosina cinasas (PTKs) , el FcyRIIB ITIM puede ser fosforilado. El FCYRIIB ITIM fosforilado recluta el dominio SH2 que contiene fosfatasa SHIP (inositol polifosfato 5 ' -fosfatasa) e inhibe movilización de calcio activada por ITAM y proliferación celular (Daeron et al., 1995, Immunity 3, 635; Malbec et al., 1998, J. Immunol . 169, 1647; Ono et al., 1996, Nature, 383, 263). El efecto neto es bloquear flujo de ingreso de calcio y evitar señalización de calcio sostenida, que evita los procesos dependientes de calcio tales como desgranulación, fagocitosis, ADCC, liberación de citocina (Ravetch et al., 2000, Science, 290:84-89) aunque algunos bloques de señalización mediados por FC7RIIB también pueden ser independientes del calcio. El freno de la proliferación en células B también depende de las rutas y ITIM. Activación de actividad inhibitoria FCYRIIB se ha logrado por entrelazamiento indirecto de anticuerpos monoclonales específicos para FCYRIIB y un receptor de activación asociado. Reactivos de entrelazamiento indirectos incluyen avidina para monoclonales biotinilados , anticuerpos policlonales específicos para la porción Fe de IgG monoclonal murino y antígeno multivalente que forma un complejo inmune que liga tanto inhibidores como receptores de activación. La mayoría de los modelos experimentales han descrito el uso de células B murina o mastocitos y un anticuerpo monoclonal (rata G4.2) que reaccionan en forma cruzada con ambos receptores FcyRII y FCYRIII murinos . De acuerdo con la invención, un anticuerpo hetero-bifuncional que comprende un FC7RIIB Fab antihumano monoclonal y un Fab monoclonal específico para un receptor de activación, se prepara por métodos de ingeniería química o genética y conocidos en la técnica. El potencial terapéutico para ese anticuerpo bifuncional incluirá atenuación de señales involucradas en inflamación y alergia. Cuando se activa por IgE y alérgeno (mediante FceR) , mastocitos y basófilos secretan mediadores inflamatorios y citocinas que actúan en células basculares y musculares y reclutan células inflamatorias. Las células inflamatorias a su vez secretan mediadores inflamatorios y reclutan células inflamatorias, en un proceso continuo que resulta en inflamación de larga duración. Consecuentemente, medios para controlar activación de mastocitos inducida por IgE proporciona un enfoque terapéutico para tratar enfermedades alérgicas al interrumpir el inicio de respuesta inflamatoria. Como se describió anteriomente , i un anticuerpo bifuncional además comprende un anticuerpo, o su fragmento que liga selectivamente FCYRIIB y comprende un anticuerpo o su fragmento que liga, por ejemplo FceRI o FceRI ligado por IgE, atenúa activación mediada por IgE mediante la actividad inhibitoria de FCTRIIB . Ejemplos de anticuerpo bifuncionales adicionales (por ejemplo anticuerpos biespecífieos) comprenden combinaciones de un anticuerpo o su fragmento que liga selectivamente FCYRIIB y un segundo anticuerpo o su fragmento, que liga un receptor de activación involucrado en: asma (FCYRIIB Fab antihumano monoclonal y un Fab monoclonal específico para i FceRI, FceRI ligado por IgE, o CD23) , artritis reumatoide y lupus sistémico eritematoso (FcyRIIB Fab anti-humano monoclonal y un Fab monoclonal específico para FcyRI) , psoriasis (FCYRIIB Fab anti-humano monoclonal y un Fab monoclonal específico para CDlla) , trombositopenia inmuno mediada, artritis reumatoide y lupus sistémico eritematoso (FC7RIIB Fab anti-humano monoclonal y un Fab monoclonal específico para FCYRIII (CD16) o CD4) , enfermedad de Crohn y colitis ulcerativa (FCYRIIB Fab anti-humano monoclonal y un Fab monoclonal específico para alpha4beta7 integrina, sub-unidad beta7 integrina, o sub-unidad alpha 4 integrina, o una porción de enlace de estos anticuerpos monoclonales) y otros desórdenes autoinmunes en donde células tales tales como mastocitos, basófilos, células B, monocitos, células de estructuras naturales, neutrófilos y células dendríticas se acoplan activamente. Diversas enfermedades autoinmunes se describen en la sección de definiciones anterior. El anticuerpo también puede utilizarse para tratar enfermedades autoinmunes para las cuales hay un componente inmuno complejo significante asociado con la enfermedad . En algunas modalidades, el anticuerpo de la invención se utiliza para activar receptores FCYRIIB inhibitorios en un mamífero tratado con el anticuerpo, para inhibir señales pro- inflamatorias y/o activación de célula B mediada por receptores de activación. Aquí, el anticuerpo se utiliza para tratar desordenes inflamatorios y/o enfermedades auto inmunes tales como aquellas anteriormente identificadas. La activación de la función inhibitoria FCYRIIB se logra por un anticuerpo biespecífico de la invención, que entrelaza directamente FCYRIIB y un receptor de activación o por un anticuerpo que indirectamente entrelaza FcyRIIB y un receptor 'de I. activación. En algunas modalidades, el anticuerpo de1 la I invención inhibe desgranulación asociada por activación. Inhibición de desgranulación asociada por activación se asocia con y puede medirse por supresión de liberación de histamina. En algunas modalidades, el anticuerpo de la invención inhibe liberación de histamina al menos 70% respecto al total de histamina. En modalidades adicionales, la inhibición de liberación de histamina. es al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, incluyendo cada entero sucesivo de 70% a 100%, en donde 100% de reducción de liberación de histamina es equivalente a liberación de histamina de fondo . Para la prevención o tratamiento de enfermedades, la dosis apropiada de anticuerpo dependerá del tipo de enfermedad a tratar, la severidad y curso de la enfermedad, ya sea que el anticuerpo se administre para propósitos preventivos o terapéuticos, terapia previa, la historia clínica del paciente y respuesta al anticuerpo, y la discreción del médico que atiende. El anticuerpo se administra convenientemente al paciente en un tiempo o sobre una serie de tratamientos. Dependiendo del tipo y severidad de la enfermedad, aproximadamente 1 µg/kg a 15 mg/kg (por ejemplo, 0.1-20 mg/kg) de anticuerpo es una dosis ? candidato inicial para administración al paciente, , ya sea, por ejemplo, por una o más administraciones separadas, o por infusión continúa. Una dosis diaria típica puede estar en el rango de aproximadamente 1 µg/kg a 100 mg/kg o más, dependiendo de los factores anteriormente mencionados. Para administraciones repetidas durante varios días o más, dependiendo de la condición, el tratamiento se sostiene hasta que ocurre una supresión deseada de los síntomas de la enfermedad. Sin embargo, pueden ser útiles otros regímenes de dosis. El avance de esta terapia se supervisa fácilmente por técnicas y ensayos convencionales. La composición de anticuerpo deberá ser formulada, dosificada y administrada en una forma consistente con la buena práctica médica. Factores para consideración en este contexto incluyen el desorden particular a tratar, el mamífero particular a tratar, ' la í condición clínica del paciente individual, la causa del desorden, el sitio de suministro del agente, el método de administración, la programación de administración y otros factores conocidos por los practicantes médicos. La "cantidad terapéuticamente efectiva" del anticuerpo a administrarse será regulada por estas consideraciones, y es la cantidad mínima necesaria para evitar, mejorar o i I i tratar una enfermedad o desorden. El anticuerpo no requiere ser, pero opcionalmente se formula con uno o ¡más agentes actualmente empleados para evitar o tratar el desorden en cuestión. La cantidad efectiva de estos otros agentes depende de la cantidad de anticuerpo presente en la formulación, el tipo de desorden o tratamiento, y otros factores anteriormente discutidos. Estos en general se emplean en las mismas dosis y con rutas de administración como se emplearon previamente o aproximadamente 1 a 99% de las dosis empleadas hasta la fecha . Composiciones de anticuerpo terapéuticas, en general se colocan en un recipiente que tiene una compuerta de acceso estéril, por ejemplo, una ampolleta o bolsa de solución intravenosa que tiene un tapón perforable por una aguja de inyección hipodérmica. La invención además proporciona un artículo' de manufactura y equipo que contiene materiales útiles para el tratamiento de cáncer, por ejemplo. El artículo de manufactura comprende un recipiente con una etiqueta. Recipientes convenientes incluyen, por ejemplo, botellas, ampolletas, y tubos de ensayo. Los recipientes pueden formarse de una variedad de materiales tales como vidrio o plástico. El recipiente contiene una composición que comprende el anticuerpo aquí descrito. El agente activo en la composición es el anticuerpo particular. i La etiqueta en el recipiente indica que la composición; se utiliza para el tratamiento o prevención de una enfermedad o desorden particular, y también puede indicar instrucciones para manejo in vivo, tales como aquellas descritas anteriormente. El equipo de la invención comprende el recipiente anteriormente descrito y un segundo recipiente que comprende un amortiguador. Además puede incluir otros materiales convenientes desde un punto de vista comercial y de usuario, incluyendo otros amortiguadores diluyentes, filtros, agujas, jeringas e insertos de empaque con instrucciones para uso. Por ejemplo, para tratar enfermedades auto inmunes en donde hay la participación de adhesión, migración y activación de una célula inflamatoria (por ejemplo, leucocito), tales como artritis reumatoide y lupus, el anticuerpo aquí puede ser co-administrado por ejemplo, con un anticuerpo anti-LFA-1 (tal como un anticuerpo anti-CDlla o anti-CD18) o un anticuerpo anti-ICAM tal como ICAM-1, -2, o -3. Agentes adicionales para tratar artritis reumatoide en combinación con el presente anticuerpo incluyen Enbrel , DMARDS, por ejemplo, metotrexato, y NSAIDs (drogas anti-inflamatorias no-esteroidales) . Más de uno de estos otros agentes 1 de activación aparte del anticuerpo presente, también pueden I ser empleados. Adicionalmente , puede utilizarse insulina para tratar diabetes, anti-IgE para asma, anti-CDlla para soriasis, anti-alpha4beta7 y hormona de crecimiento (GH) para enfermedad de intestino inflamatorio . Además, la formulación se administra convenientemente junto con una cantidad efectiva de un agente hipoglicémico . Para los presentes propósitos, el término "agente hipoglicémico" se refiere a compuestos que son útiles para regular el metabolismo de glucosa, de preferencia agentes orales. Más se prefieren aquí para uso humano insulina y la clase sulfonilurea de agentes hipoglicémicos orales, que provocan la secreción de insulina por el páncreas. Ejemplos incluyen gliburida, glipizida, y gliclazida. Además, agentes que mejoran la sensibilidad de insulina o sensibilizan insulina, tales como biguanidas (incluyendo metformina y fenformina) y tiazolidendionas tales como agente sensibilizante de insulina marca REZULIN (troglitazona) y otros compuestos que ligan al receptor PPAR-gamma nuclear están dentro, de esta definición, y también se prefieren. El agente hipoglicémico se administra al mamífero por cualquier técnica conveniente incluyendo en forma parenterál , intranasal, oral, o por cualquier otra ruta efectiva.

Más preferiblemente, la administración es por la ruta oral. Por ejemplo, tabletas MICRONASE™ (gliburida) comercializada por Upjohn en concentraciones de tabletas de 1.25, 2.5, y 5 mg son adecuadas para administración oral. La dosis de mantenimiento usual para diabéticos tipo II aplicada en esta terapia, generalmente está en el rango desde o aproximadamente 1.25 a 20 mg por día, que puede suministrarse como una sola dosis o dividida a través del día como se considere apropiado. Physician's Desk Reference, 2563-2565 (1995) . Otros ejemplos de tabletas basadas en gliburida disponibles para receta incluyen la droga marca GLYNASE™ (Upjohn) y la droga marca DIABETA™ (Hoechst-Roussel) . GLUCOTROL™ (Pratt) es la marca de una tableta de glipizida (l-ciclohexil-3- (p- (2 - (5-metilpirazina carboxamida) etil ) fenil ) sulfonil ) urea) disponible tanto en concentraciones de 5 y 10-mg y también se receta a diabéticos tipo II quienes requieren terapia hipoglicémica después de control de dieta o1 en I pacientes que han cesado de responder a otras sulfonilureas . Physician's Desk Reference, 1902-1903 (1995) . Otros agentes hipoglicémicos diferentes a sulfonilureas , tales como las biguanidas (por ejemplo, metformina y fenformina) o tiazolidindionas (por ejemplo, troglitozona) , u otras drogas que afectan la acción de insulina también pueden ser empleados. Si se emplea úna tiazolidindiona con el péptido, se utiliza al mismo nivel que se emplea actualmente en o a niveles algo menores, que puede ajustarse para efectos vistos con el péptido solo o junto con la diona. La dosis típica de troglitazona (REZULINMR) empleada por si misma es aproximadamente 100-1000 mg por día, más preferiblemente 200-800 mg/día, y este rango aquí es aplicable. I ver por ejemplo, Ghazzi et al., Diabetes, 46: 433-439 (1997). Otras tiazolidindionas que son más fuertes agentes sensibilizantes de insulina que troglitazona serán empleadas en dosis menores. F. Depósito de Materiales La siguiente línea celular de hibridoma se ha depositado con la American Type Culture Collection, 10801 University Blvd. , Manassas, VA 20110-2209 USA (ATCC) : Designación de hibridoma/anticuerpo ATCC No. Fecha de Depósito FcyRIIB 5A6.2.1 PTA-4614 agosto 28, 2002 Este depósito se realizó bajo las disposiciones del Tratado de Budapest en el reconocimiento Internacional del Depósito de Microorganismos para el propósito de procedimientos de Patentes y sus reglamentos (Tratado de Budapest) . Esto asegura mantenimiento de j un cultivo viable por 30 años a partir de la fecha de depósito. La línea celular se hará disponible por TCC i bajo los términos tratado de Budapest, y sujeto a un convenio entre Genentech, Inc. y ATCC, que asegura (a)i el acceso al cultivo estará disponible durante la vigencia de la solicitud de patente a uno determinado por el comisionado que tenga derecho bajo 37 CFR §1.14 y 35 USC §122, y (b) que todas las restricciones en la disponibilidad de cultivo al público así depositado serán retiradas en forma irrevocable al otorgar la patente. El cesionario de la presente solicitud ha convenido que si el cultivo en depósito muriera o se perdiera o destruyera cuando se cultiva bajo condiciones convenientes, rápidamente lo reemplazará ante notificación con un espécimen viable del mismo cultivo. Disponibilidad de la línea celular depositada no habrá de considerarse como una licencia para practicar la invención en contravención con los derechos otorgados bajo la autoridad de cualquier gobierno de acuerdo con sus leyes de patentes. La especificación descrita anterior se considera suficiente para permitir a una persona con destreza en la técnica el practicar la invención. La presente invención no habrá de limitarse en alcance por el cultivo depositado, ya que la modalidad depositada' se pretende como una sola ilustración de un aspecto de la invención y cualquier cultivo que sea funcionalmente equivalente está dentro del alcance de esta invención. El depósito de material aquí no constituye una admisión de que la descripción descrita aquí contenida sea inadecuada para permitir la práctica de cualquier aspecto de la invención, incluyendo el mejor modo de la misma ni habrá de considerarse como limitante del alcance de las reivindicaciones a la ilustración específica que representa. Sin duda, diversas modificaciones de la invención además de aquellas mostradas y descritas aquí serán aparentes a aquellas con destreza en la técnica de la descripción anterior y caen dentro del alcance de las reivindicaciones anexas. La invención será más completamente comprendida por referencia a los siguientes ejemplos. Sin embargo, no habrán de considerarse como limitantes del alcance de esta invención. Toda la literatura y citas de patentes aquí mencionadas se incorporan expresamente por referencia . II. Ejemplos Aunque funcionalmente opuestos, FCYRIIA humano (receptor de activación) y FCYRIIB humano (receptor de inhibición) son proteínas altamente homologas (regiones de homología están encasilladas en la Figura 2A) , difieren en aproximadamente nueve amino ácidos en el IgGl y 3 dominios de enlace. Anticuerpos monoclonales comercialmente disponibles ligan tanto FCYRIIA como FCYRIIB humano. Un anticuerpo monoclonal que liga específicamente FC7RIIB será útil, y la capacidad adicional para bloquear enlace de IgG también es conveniente . En los ejemplos y figuras de soporte, FC7RIIB es FCYRIIB humano, y en general se refiere a FC7RIIBI humano, a menos de que se anote específicamente. FC7RIIB puede referirse en forma intercambiable como FcgRIIB, FcGRIIb, huFciRIIB, hu FcGRIIb, hFcRIIB, Fcy-Rllb, FC7R2B, Fc7R2b, o IgGR . Variantes alélicas específicas se designan por la adición de un número 1, 2, o 3, por ejemplo hu FcGRIIbl. FceRI es FceRI humano, y se refiere a FceRIa humano. FceRI puede ser referido en forma intercambiable como FceRI, FceRIa, FcERI , IgER, IgE-R FceRIa, Fce-RI o FceRIa. Anticuerpos de cualquiera de las proteínas anteriores se designan ya sea por nombre o en general, por al agregar previamente "anti"- al antígeno de proteína relacionada, por ejemplo anti-Fc7RIIB, anti-IgER, etc.. Dominios extracelulares de una proteína, se designan por la adición de ECD al nombre de proteína, por ejemplo FC7RIIB ECD. Una o varias proteínas de células que expresan una o varias proteínas de interés pueden nombrarse descriptivamente para incluir variaciones del nombre de proteína en el nombre de la línea celular y se designan "células" . , EJEMPLO 1.0 Materiales y Métodos 1.1 Materiales Transcriptasa inversa-PCR se realizó utilizando GeneAmpMR de Perkin Elmer Life Sciences. Columnas y reactivos de plásmido pGEX-4T2, Proteína A, y columnas y Proteína G FC7RIII: se obtuvieron de Amersham Pharmacia Biotech. Columnas y reactivos Ni-NTA fueron de Qiagen, Valencia, CA. Concentradores Centriprep-30 fueron de Millipore, Bedford, MA. Geles SDS-poliacrilamida y membranas de difluoruro de polivinilideno se obtuvieron de NOVEX, San Diego, CA. FuGENE® 6 se obtuvo de Roche., Los cDNAs que codifican dominios extracelulares y de transmembrana de FCYRIIA humano (CD32A; His13i alotipo) , FCYRIIB (CD32B) , y FCYRIIIA (CD16A; Vali58 alotipo) ; y isoformas de glucosa-6-fosfato-isomerasa (GPI) de FC7RIIB, y FcyRIIA se proporcionaron por Dr. J. Ravetch (Rockefeller University, New York) . FCYRIIA-Arg13i alotipo y Fc7RIIIA-Phei58 alotipo se generaron por mutagénesis dirigida de sitio (31) . Información de secuencia para: FCYRIIBI (SEQ ID NO: 11) también está I disponible el número de acceso No: NP_003992; FCYRIIB2 (SEQ ID NO:10) y número de acceso No: NP_0010022Í73 ; FC7RIIA (SEQ ID NO: 9) y número de acceso No: NP_067674' y FCYRIII (dos isoformas) en números de acceso Nos: NP_000560 y NP_000561. Anticuerpo AT10 se obtuvo de Biosource International, Camirillo, CA. El anticuerpo mopc21 se obtuvo de BD Pharmagen. Anticuerpos monoclonales murino se obtuvieron de las siguientes fuentes: 32.2 (anti-FCYRI) , IV.3 (anti-FcYRII) , y 3G8 (anti -FCTRIII ) de Medarex, Annyale, NJ; y B1G6 (anti-b2 -microglobulina) de Beckman Coulter, Palo Alto, CA. Anticuerpo Anti-GST fue de Zymed Laboratories Inc. Anti -GST-biotin fue clon de Genentech 15H .1.1. JW8.5.13 se obtuvo de Serotec Inc., Raleigh, NC. Placas de ELISA por ejemplo, placas Nunc® maxisorb se obtuvieron de (Nalge-Nunc, Naperville, IL) . Placas de cultivo de tejido pueden obtenerse por ejemplo, de Linbro o Fisher. Albúmina de suero bovino (BSA) , Tween 20®, Tritón X-100, EMEM (medio esencial mínimo de Tagle, ionomicina, sulfato de protamina y dihidrocloruro de o-fenilendiamina (OPD) , yoduro de propidio fueron de Sigma (St. Louis, MO) . Estreptavidina y bloqueador de caseína (Prod # 37528) fueron de Pierce (Rockford, IL) . Conjugado anticuerpo IgG anti-ratón conejo peroxidasa ' de rábano y fragmento F(ab' )2 conjugado con peroxidasa ; de IgG específico F(ab' )2 anti-humano cabra se obtuvieron! de Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA.

Proteína peroxidasa conjugada G fue de Bio-¡Rad. Estreptavidina-HRP fue de ya sea Boehringer Mannheim o Zymed. Substrato TMB (Prod # TMBW-0100-01) y solución de parada (Prod # BSTP-0100-01) fueron de Bidex Laboratory. IgG-Fluoresceína anti-ratón cabra se obtuvieron de American Qualex Labs. NP- (11) -OVA y TNP- (11) -OVA se obtuvieron de Biosearch Technologies, Inc., Novado, Ca. Estreptavidina-PE y IgG-PE anti-ratón rata o conjugados de Fluoresceína se obtuvieron de BD Pharmagen, Franklin, Lakes, NJ. Citometría de flujo se realizó en un citómetro de flujo FACScan™ o FACSCalibur™ de BD, Franklin Lakes, NJ. Absorbancias se leyeron utilizando un lector de placas Vtnax de Molecular Devices, MountainView, CA. ELISA de histamina ELISA se realizó utilizando un Histamine ELISA Kit obtenido de IBL Immunobiological Labs (Hamburgo, Alemania), distribuido por RDI, Inc (NJ) . 1.2 Producción de proteínas de fusión de receptor GST-Fc El cDNA para FcyRI (CD64) se aisló por transcriptasa inversa-PCR de RNA cebado con oligo(dT)-de células U937 utilizando cebadores que generan un fragmento que codifica el dominio extracelular cadena'-a. Las regiones decodificación de todos los receptores se sub-clonaron en vectores de expresión de células de mamífero pRK descritas previamente (Eaton, D. et ,al . , 1986, Biochemistry 25:8343-8347). Para todos los plásmidos FcyR pRK, los dominios intracelulares' de transmembrana se reemplazaron por DNA que codifica una etiqueta Gly-His6 y glutationa S-transferasa (GST) humana. La secuencia GST de 234-amino ácidos se obtuvo por PCR a partir del plásmido pGEX-4T2 con sitios de restricción Nhel y Xbal en los extremos 5 ' y 3 ' respectivamente. De esta manera, las proteínas expresadas contienen los dominios extracelulares de la cadena fusionada en sus extremos carboxilo en Gly/His6/GST en las posiciones amino ácido como sigue: FCYRI, His292; FCYRIIA, Met216; FcyRIIB, Metl95; FCYRIIIA, Glnl91 (números de residuo incluyen péptidos de señal) . Se transíectaron plásmidos en la línea de células de riñon embriónico humano 293 transformado con adenovirus por precipitación con fosfato de calcio (Gorman et al., 1990, DNA Prot. Eng. Tech. 2:3-10). Se recolectaron sobrenadantes 72 horas después de conversión a medio PS0 libre de suero suplementado con 10 mg/litro de insulina bovina recombinante , 1 mg/litro de transferina humana y elementos en trazaS. Se purificaron proteínas por cromatografía de níquel-ácido nitrilotriacético (Ni-NTA) e intercambiaron con amortiguador en salino amortiguado con fosfato (PBS) utilizando concentradores Centriprep-30. Se analizaron proteínas en geles de SDS-poliacrilamida 4-20%, transfirieron a membranas de difloruro de polivinilideno y sus extremos amino secuenciaron para asegurar adecuada decisión de secuencia de señal . Conformación de receptor se evalúa por ELISA utilizando monoclonales murinos 32.2 (anti-FcryRI) , IV.3 (anti-FcTRII ) , 3G8 (anti-FcyRIII ) , y B1G6 (anti-b2 -microglobulina) . Concentraciones de receptor se determinaron por absorción a 280nm utilizando coeficientes de extinción derivados por análisis de composición de aminoácidos. 1.3 Producción de anticuerpos FcyRIIB Anticuerpos específicos de FCYRIIB humanos que bloquean enlace de IgG Fe por el receptor se generaron contra proteínas de fusión Fc7RIIB-His6-GST . Ratones BALB/c se inmunizaron en la planta de la pata con 2 µg de huFcYRIIB-His6-GST . Esplenocitos de los ratones inmunizados se fusionaron con células de mieloma P3X63Ag8Ul (células descritas en Oi VT, Herzenberg LA., 1981, Immunoglobulin producing hybrid cell Unes. In: Selected methods in cellular immunology (Mishell BB, Shiigi SM, eds) , pp 351-372. San Francisco: Freeman.) resultando en aproximadamente 900 hibridomas. ELISA generalmente se realiza como sigue:; la proteína de fusión receptora a aproximadamente 1.5 mg/ml i en PBS, pH 7.4, se revistió en placas ELISA por 18 horas a 4 grados C. Se bloquearon placas con amortiguador de ensayo a 25 grados C por una hora. Diluciones de 3 veces en serie de anticuerpos a supervisar y anticuerpos de control (10.0-0.0045 mg/ml) se agregaron a placas e incubaron por 2 horas. Después de lavar placas con amortiguador de ensayo, ligadas a IgG a los receptores se detectaron con fragmento F(ab')2 conjugado con peroxidasa de IgG específico de F(ab')2 antihumano cabra o con proteína conjugada con peroxidasa G. El sustrato empleado fue dihidrocloruro de o-fenilenediamina . Absorbancia a 490 nm se leyó utilizando un lector de placas Vrnax. 1.4 Supervisión primaria para anticuerpos específicos de FcyRIIB En una supervisión primaria, sobrenadantes que contienen anticuerpos expresados de los subclones de hibridoma se supervisaron para enlace positivo a FCYRIIB-His6-GST. Anticuerpos reactivos a Fc7RIIB-His6-GST por ELISA se volvieron a supervisar para enlace a FCYRIIB- His6-GST y enlace negativo a FciRIIA (variante R131) -His6- i GST y FCYRIII (variante F158) -Hiss-GST por ELISA. ; Aproximadamente 50 anticuerpos se seleccionaron de la supervisión primaria para mayores análisis. 1.5 Supervisión secundaria para anticuerpos específicos de Fc RIIB En una supervisión secundaria, los anticuerpos se volvieron a supervisar para especificiar receptor por ELISA y ensayos de enlace de células utilizando líneas celulares CHO que expresan glucosa-6-fosfato-isomerasa (GPI) con FC7RIIB y FcyRIIA. Se realizó ELISA y describió anteriormente y los resultados se ilustran en la Figura 4. En la Figura 4, una gráfica de barras indica enlace relativo de los anticuerpos a GST-huFcYRIIB respecto a proteínas de fusión GST-huFcyRIIA y GST-huFc7RIII . Los anticuerpos 1D1 , 5A6 , 5H11 y 6A5 selectivamente ligan GST-huFcYRIIB sobre las proteínas de fusión GST-huFc7;RIIA y GST- huFcYRIII. El anticuerpo 5B9 liga tanto GST-huFcYRIIB como GST-huFcTRIIA selectivamente sobre GST-huFcYRIII. La Figura 5 muestra especificidad de enlace por enlace de inmunofluorescencia de los anticuerpos a célula CHO que expresan GPI -huFcYRIIB respecto a células CHO que expresan GPI-huFcYRIIA. Alícuotas separadas de células CHO se tiñieron ya sea con el control de isotipo mlgGl (mopc 21) , o anticuerpos monoclonales (FCYRIIB antihumano) , 1D1, 5A6 , 5B9, 5D11 y 6A5. El enlace se detectó indirectamente por una segunda incubación con IgG anti ratón cabra F(ab)'2 conjugado con fluoresceína anticuerpo I específico (F(ab) '2) y analizaron por citometríaj de I i flujo. El anticuerpo 5A6 de preferencia liga a célula CHO que expresan GPI-huFcYRIIB respecto a células CHO que expresan GPI-huFcYRIIA. Los resultados son similares a enlace a construcciones GST. Datos de enlace de ELISA adicionales se ilustran en las Figuras 6-9. Las Figuras 6-9 presentan curvas de afinidad de enlace para ligar diversos MAbs anti-Fc7RII (CD32) a GST-huFcYRIIB, GST-huFc7RIIA(H131) , o GST-huFcyRIIA(R131) . AT10 es un mlgG específico para FCYRIIA y mopc21 es un control de isotipo mlgG. 5A6 mlgGl tiene un EC50 de 0.06nM para ligar a GST-huFcyjRIIB mostrado en la Figura 6. En contraste, el EC50 de 5A6 mlgGl para ligar a GST-huFcyRIIA (H131) es mayor que 5(^g/ml (Figura 9) y para ligar a GST-huFc7RIIA (R131) es 2^g/ml (Figura 8). 1.6 Expresión y purificación de anticuerpo El anticuerpo 5A6.2.1 (aquí referido en forma intercambiable como 5A6.2.1 o 5A6) se elige para ascitos y purifica utilizando cromatografía de proteína G (Amersham Pharmacia Biotech) . DNA que codifica el 5A6.2.1 se aisla y secuencia utilizando procedimientos convencionales. La secuencia de aminoácidos y CDRs de la cadena pesada (SEQ ID NO: 7) y cadena ligera (SEQ ID NO: 8) se proporcionan en la Figura 10. Los CDRs de cadena pesada son: DAWMD (SEQ ID NO:l), EIRSKPNNHATYYAESVKG (SEQ ID NO: 2), y FDY (SEQ ID NO : 3 ) . Los CDRs de caden aligera son: RASQEISGYLS (SEQ ID NO:4), AASALDS (SEQ ID NO:5:), y LQYVSYPL (SEQ ID NO: 6). Los epítopos de enlace putativos para anticuerpo monoclonal 5A6 incluyen residuos aminoácidos K158-V161 y F174-N180, en donde la numeración se indica para FCYRIIB2 en la Figura 2A (FCYRIIB2, SEQ ID NO:10). Los receptores FcyRIIBl y FcyRIIB2 tienen dominios estructurales indicados en las Figuras 2A y 2B (ilustrados por FcyRIIB2) como un dominio tipo IgGl en los residuos T43-P123 y domino tipo IgG3 en los residuos W132-P217. El motivo ITIM se ilustra en la Figura 2A para FCYRIIB2 y comprende los residuos N269-M277. Recientemente se reportó que la secuencia de aminoácidos de FCTRIIA F165-T171 indicada como FSRLDPT (SEQ ID NO: 39) en la Figura 2A, puede ser FSHLDPT (SEQ ID NO: 0) , de esta manera indicando una diferencia de secuencia mayor entre FcyRIIA y FCYRIIB en el epítope de enlace putativo FC7RIIB para el anticuerpo 5A6 (ver Figura 2 y número de acceso: NP_067674, SEQ ID NO:30, esta secuencia de aminoácidos también incluye cambios de residuo en . la porción N-terminal de FcyRIIA) . 1.7 Competencia con complejos E27:IgE Este ensayo supervisa la capacidad de 5A6 MAb para interferir con enlace de IgGl en FcyRIIA y FCYRI|IB.

FCYRIIS tienen una débil afinidad para IgGl monomérico, consecuentemente, enlace IgGl se ensaya utilizando un complejo examérico estable de tres IgE y tres mpoléculas anti-IgE, por ejemplo E27, un anticuerpo IgGl humanizado que liga IgE (Shields, R.L., et al., J". Biol . Chem. , 276:6591-6604 (2001)). El 5A6 MAb se supervisa para neutralizar enlace de IgG al estimar la capacidad del anticuerpo para competir con enlace de complejos de hexámero E27-IgE con FcyRIIA y FCYRIIB humanos. El ensayo de competencia se realiza como sigue y los resultados se ilustran en las Figuras 11 y 12. Las proteínas de fusión FcyRIIB y FcyRIIA en 1 mg/ml en PBS, pH 7.4, se revistieron en placas de ELISA por 48 horas a 4 grados C. Se bloquearon placas con salino amortiguado con Tris, albúmina de suero bovino 0.5%, polisorbato-20 0.05%, EDTA 2 mM, pH 7.45 (amortiguador de ensayo), a 25 grados C por 1 hora. Se prepararon complejos hexaméricos E27-IgE en amortiguador de ensayo al mezclar cantidades equimolares de E27 y :IgE de mieloma humano (Nilsson, K. , Bennich, H. , Johansson, S.G.O., and Ponten, J. , (1970) Clin. Exp. Immunol . 7:477-489) a 25 grados C por 1 hora. E27-IgE (10.0 mg/ml en amortiguador de ensayo) se agrega a placas e incuba por 2 horas. Las placas se lavaron para retirar E27-IgE 'sin ligar. 5A6 MAb, 5A6 F(ab)2, 5A6 Fab, mlgGl (control); y i 5B9 (anti-FcYRIIA/B) se preparan en amortiguador 1 de ensayo a diversas concentraciones desde O.OlnM a lOÓnM. Los anticuerpos se agregaron a pozos individuales e incubaron por una hora. Después de lavar las placas con amortiguador de ensayo, la detección de compléjos hexaméricos E27-IgE que permanecen ligados FcyRIIA O FcyRIIB en la presencia de anticuerpos competentes, se realiza. La detección involucra enlace a la porción IgGl de E27, un fragmento F(ab')2 conjugado con peroxidasa de IgG específico de F(ab')2 anti-humano de cabra. El sustrato de peroxidasa detectable empleado fue dihidrocloruro de o-fenilenediamina . La absorbancia a 490 nm se leyó utilizando un lector de placas Vmax. La Figura 11 muestra que 5A6 no bloquea el enlace de hexámero E27-IgE a huFcYRIIA como se indica por enlace continuo del hexámero E27-IgE con FcyRIIA con concentraciones crecientes del anticuerpo de competencia (5A6 MAb, SA6 F(ab)2, 5A6 Fab, mlgGl , y 5B9) . Sólo el anticuerpo 5B9, que se sabe liga tanto a FcyRIIA como a FcyRIIB (ver Figuras 4 y 5) fue capaz de competir con enlace de hexámero E27-IgE. La Figura 12 muestra que 5A6 no compite con el enlace de hexámero con E27-IgE con FcyRIIB como1 se indica por la reducción en enlace de hexámero E27-IgE:al incrementar anticuerpo 5A6, Fab o F(ab)2. Como se esperó, el anticuerpo de control IgGl antibody no compite. Enlace de anticuerpos a huFcYlIB (5A6, 5A5, 5H11.1 y 5A6 Fab'2) y IgGl (E27-IgE hexámero) a FcyRIIB, FCYRIIA (R131)¡, O FCYRIIA (H131) se muestra adicionalmente en las Figuras 13-16. La Figura 14 muestra que IgG se evita que ligue a FCYRIIB en la presencia de anticuerpos 5A6.2.1 y 6A5 mientras que enlace IgG a FCYRIIA (R131) , mostrado en la Figura 13, y enlace de IgG a FCYRIIA (H131) , mostrado en la Figura 15 no se bloquea. 1.8 Análisis de enlace de inmuno-fluorescencia Análisis de enlace de inmunofluorescencia indirecta de 5A6 MAb con FcyRIIA nativo expresado en células de eritroleucemia K562 (ATCC No. CCL-243) se presenta en la Figura 16. Alícuotas separadas de células K562 se tiñieron ya sea con control de isotipo mlgGl (mopc 21) , 5A6 (FCYRIIB anti-humano) anticuerpo monoclonal o Medarex 4.3 MAb (FCYRIIA/B anti-humano) anticuerpo monoclonal. El enlace se detecta indirectamente por una segunda incubación con anticuerpo específico IgG F(ab)'2 anti ratón cabra F(ab)'2 conjugado con fluoresceína y analiza por citometría de flujo. Medarex 4.3 MAb ligó a huFcYRIIA (CD32A) como se ilustra en la Figura 16. 5A6, anticuerpo anti-huFc7RIIB (anti-CD32B) , no liga huFcYRIIA (CD32A) , consistente con control de isotipo, anticuerpo mopc 21, que tampoco liga huFcYRIIA (CD32A) se ilustra por la línea punteada en la I Figura 4. EJEMPLO 2.0 Propiedades del anticuerpo anti- FcyRIIB 2.1 Materiales Anti-FceRI MAb, 22E7 MAb ligan FceRI con o , sin IgE ligado al receptor. 22E7 MAb se purifica a partir de la línea celular de Hoffman-LaRoche IGE4R : 22E7.2D2.1D11 (Risek, F., et al., 1991, J. Biol . Chem. 266: 11245-11251) . Células Hoffman-LaRoche que expresan 22E7 MAb de desarrollaron en medio Dulbecco modificado con Iscove con lOx FBS , lxPen-Strep, y lxGlutamine. Los 22E7 MAb1 se purifican utilizando cromatografía de proteína A y proteína G. Los extractos 22E7 se recolectaron y se verificó la afinidad para FceRI. 2.2 Lineas celulares RBL Línea celular RBL48 derivada de la línea de mastocitos de rata precursora RBL-2H3 (ATCC# CRL-2256) , expresó la a-subunidad del receptor IgE de alta afinidad (FceRI). (Gilfillian A.M. et al., 1992, Immunology, 149, 2445-2451) . La línea celular RBL48 se transecta por electroporacion con un clon cDNA de longitud íntegra ot-subunidad de FcyRIIBl humano (Muta T., et al., 1994, Nature 368:70-73.) que se ha subclonado en un vector' de expresión seleccionable de puromicina (Morgenstern, J. P., et al., 1990, Nucleic Acid Research, 18:3587-3596).

Se eligieron clones en puromicina ?µ? y analizaron para expresión de superficie celular FCYRIIB por tinción de inmunofluorescencia con anticuerpo monoclonal FcyRIIB anti-humano, 5A6.2.1. El subclon selecto se designó RBL48.C.4. 2.3 Liberación de histamina Efectos de entrelazamiento de FCYRIIB (también referido en forma intercambiable aquí como coentrelazamiento, co-agregación o co-ligado) en receptores de activación se mide en forma cuantitativa con base en la habilidad del anticuerpo para bloquear liberación de histamina de células RBL48.C.4 sensibilizadas con alérgeno. Métodos de ensayo se describen a continuación con resultados ilustrados adicionalmente en la Figura 17. El clon RBL48.C.4 se incubó en una placa de microtitulación de fondo plano de 96 pozos en amortiguador de ensayo (EMEM (medio esencial mínimo de Tagle con BSS de Earle) con L-glutamina 2mM, piruvato de sodio lmM, aminoácido no esencial O.lmM, bicarbonato de sodio 1.5 g/L, penicilina, estreptomicina, suero bovino fetal 15%) con 2/Ltg/ml de anti-FceRI MAb 22E7 y ya sea un control de isotipo mlgGl (mopc21) o 5A6 MAb a diver'sas concentraciones de 0.002 a 2 g/ml a 37 grados C por 30 minutos en un incubador de C02 - Células se lavaron dos i veces en amortiguador de ensayo e incubaron con i j anticuerpo de entrelazamiento específico Fe anti-ratón cabra F(ab) '2 por 30 minutos a 37 grados C. Sobrenadantes se recolectaron y ensayaron por contenido de histamina por ELISA como se describe generalmente con anterioridad utilizando el equipo histamina ELISA. Valores de liberación de histamina se expresan como el promedio ISEM de pozos triplicados y presnetaron gráficamente en la Figura 5. Tanto 5A6 como 22E7 con el anticuerpo de entrelazamiento se requirieron para inhibición de liberación de histamina. La liberación de histamina se suprime al ligar 5A6 con FC7RIIB y ligar 22E7 con FceRI en donde 5A6 y 22E7 también se entrelazan por anticuerpo de entrelazamiento específico de Fe antiratón cabra. Una proporción 1:1 de 5A6 a 22E7 fue la más efectiva para inhibir la liberación de histamina, con su presión discernible también vista en las proporciones de 1:10, 1:100 y 1:1000. EJEMPLO 3.0 Producción de anticuerpo biespecífico Este ejemplo describe construcción y purificación de anticuerpos biespecíficos que tienen una región bisagra variante que carece de residuos cisteínas que forman disulfuro ("sin bisagra"). La construcción, de anticuerpos biespecíficos que tienen secuencia bisagra! de tipo silvestre también se describe; estos anticuerpos I pueden utilizarse para estimar la eficiencia de obtener diversas especies de complejos de anticuerpo. 3.1 Construcción de vectores de expresión Todos los plásmidos para expresión de anticuerpos de longitud integra se basaron en un sistema cistron separado (Simmons et al., 2002, J. Immunol . Methods, 263: 133-147; Simmons et al., patente de los E.U.A. número 5, 840,523) que se basa en promotores pohA separados (AP) (Kikuchi et al., 1981, Nucleic Acids Res., 9: 5671-5678) para la transcripción de cadenas pesadas y ligeras, seguido por las secuencias Shine-Dalgarno trp para inicio de traducción (Yanofsky et al., 1981, Nucleic Acids Res., 9: 6647-6668 and Chang et al., 1987, Gene, 55: 189-196) . Adicionalmente , la secuencia de señal enterotoxina II termo-estable (STII) (Picken et al., 1983, Infect. Immun. , 42: 269-275 and Lee et al., 1983, Jnfect. Immun., 42: 264-268) se utiliza para la secreción peroplásmica de cadenas pesadas y ligeras. Control fino de traducción para ambas cadenas se logra con variantes de secuencia de señal STII previamente descritas de fuerzas de traducción relativas medidas, que contienen cambios de codón silenciosos en la región de inicio de traducción (TIR) (Simmons and Yansura, 1996, Nature Biotechnol . , 14: 629-634 and Simmons et al., supra) . Para propósitos de esta invención, la combinación de fuerza' de traducción para un par particular de TIRs dentro de ¡ un I vector, se representa por (N-ligero, M-pesado) en donde N es la fuerza TIR relativa de cadena ligera y M es1 la fuerza TIR relativa de cadena pesada. Finalmente, el terminador de transcripción Dto (Schlosstissek and Grosse, 1997, Nucleic Acids Res., 15: 3185) se coloca corriente debajo de las secuencias de codificación para ambas cadenas. Todos los plásmidos utilizan el marco de un sistema vector basado en pBR322 (Sutcliffe, 1978, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol . , 43: 77-90). Para mejorar la asociación de cadenas polipéptido biespecíficas se introdujeron mutaciones de "perilla-y-orificio" en regiones de dimerización . Se entiende que cualquier cadena puede comprender una mutación "perilla" mientras que otra cadena comprende una mutación "orificio" complementarias. La invención comprende ambas modalidades. En el presente ejemplo ilustrativo, el brazo 5A6 del anticuerpo biespecífico se construye para comprender una mutación "perilla" y el brazo 22E7 del anticuerpo biespecíficos se construye para comprender una mutación de "orificio" complementario, (i) Plásmido p5A6.11.Knob.Hg- Dos plásmidos intermedios se requirieron para generar el plásmido p5A6.11. Knob . Hg- deseado. El dominio variable de la cadena ligera quimérica 5A6 (anti-FcDRIÍB) i primero se transfirió en el plásmido pVGll . VNERK. Knob para generar el plásmido intermedio p5A6.1. L . VG .1. H . Knob .

I El dominio de la cadena pesada quimérica 5A6 ¡ se transfiere entonces al plásmido p5A6.1. L .VG .1. H . Knob para generar el plásmido intermedio p5A6.11. Knob. Lo siguiente describe la preparación de estos plásmidos intermedios p5A6.1.LC.VG.1.HC.Knob y p5A6.11.Knob seguido por' la construcción de p5A6.11. Knob.Hg-p5A6.1.L. VG.1.H.Knob. ¦ Este plásmido se construye para transferir el dominio variable ligero murino del anticuerpo 5A6 a un plásmido compatible para generar el anticuerpo monomérico de cadena ligera-cadena pesada (H/L) anticuerpo de longitud íntegra. La construcción de este plásmido involucra la ligación de dos fragmentos DNA. El primero fue el vector pVGll . VNERK. Knob en donde el fragmento pequeño EcoRI-PacI se retiró. El plásmido pVGll .VNERK. Knob es un derivado de el vector cistron separado con fuerzas TIR relativas de 1 -ligero y 1 -pesado (Simmons et al., 2002, supra) en donde los dominios variables ligero y pesado se han cambiado a un anticuerpo anti- VEGF (VNERK) con la mutación "perilla" (knob) (T366W) (Merchant et al., 1998, Nature Biotechnology, 16:677-681) y todos los elementos de control anteriormente descritos. La segunda parte de la ligación involucró ligación de la secuencia ilustrada en la Fig ra 25 (SEQ ID NO: 35) en el vector pVGll .VNERK. Knob digerido con EcoRI-Pacl descrito anteriormente. La secuencia codifica el promotor fosfatasa alcalina (phoA) , i la secuencia de señal STII y toda la cadena ligera (dominios variable y constante) del anticuerpo 5A6. p5A6.11. Knob. Este plásmido se construye para introducir el dominio variable pesado murino del anticuerpo 5A6 en un marco de cadena pesada humano para generar el anticuerpo monomérico de cadena pesada/cadena ligera (H/L) de longitud íntegra quimérico. La construcción de p5A6.11.Knob involucra la ligación de dos fragmentosi de DNA. El primer fragmento fue el vector i p5A6.1. L .VG .1. H . Knob de anteriormente, en donde el fragmento luI -PspOMI pequeño se ha retirado. El segundo fragmento involucra ligación de la secuencia ilustrada' en I la Figura 27 (SEQ ID NO: 37) y en el ve tor p5A6.1.L.VG.1.H.Knob digerido con Mlul -PspOMI . ' La secuencia codifica los últimos tres aminoácidos de la I secuencia de señal STII y aproximadamente 119 aminoácidos del dominio variable pesado murino del anticuerpo 5A6. ; p5A6.11.Knob.Hg- El plásmido p5A6.11. Knob . Hg- se construye para expresar el anticuerpo monomérico de cadena ligera/cadena pesada (H/L) Knob sin bisagra 5A6 quimérico de longitud íntegra. La construcción del plásmido involucra la ligación de dos fragmentos de DNA. El primer fragmento fue el vector p5A6.11. Knob, anterior, en donde el fragmento pequeño PspOMI-SacII se ha retirado. El segundo fragmento fue el fragmento PspOMI -SacII de 514 pares base aproximadamente a partir de la codificación p4D5.22.Hg de aproximadamente 171 aminoácidos de la cadena pesada humana en donde dos cisteínas bisagra se han convertido a serinas (C226S, C229S, esquema de numeración E.U. de Kabat, E.A. et al. (eds.), 1991, página 671 en Sequences of proteins of Immunological interest, 5th ed. Vol . 1. NIH, Bethesda MD.). El plásmido p4D5.22.Hg- es un derivado del vector cistron separado con fuerzas TIR relativas de 2-ligero y 2-pesado (Simmons et al., J. Immunol. Methods, 263: 133-147 (2002)) en donde los dominios variables ligero y pesado se han cambiado a un anticuerpo anti-HER2 y las dos cisteínas bisagras se han convertido en serinas (C226S, C229S) . (ii) Plásmido p5A6.22. Knob.Hg- Un plásmido intermedio se requirió que genere el plásmido p5A6.22. Knob . Hg- deseado. El promotor phoA y la secuencia de señal STII (fuerza relativa TIR de 2 para cadena) primero se transfirieron en el plásmido p5A6.11.Knob.Hg- para generar el plásmido intermedio p5A6.21.Knob.Hg- . Lo siguiente describe la preparación del plásmido intermedio p5A6.21. Knob . Hg- seguido por la construcción de p5A6.22. Knob . Hg- . p5A6.21. Knob.Hg- Este plásmido se construye para introducir ¡ la secuencia de señal STII (fuerza TIR relativa de 2) para la cadena ligera. La construcción de p5A6.21. Knob . Hg-involucra la ligación de tres fragmentos de DNA. El primer fragmento fue el vector p5A6.11.Knob.Hg- en donde el fragmento pequeño EcoRI-PacI se ha retirado. El segundo fragmento fue un fragmento Nsil-PacI de 658 pares base aproximadamente a partir del plásmido p5A6.11. Knob . Hg- que codifica la cadena ligera para el anticuerpo 5A6 quimérico. La tercer parte de la ligación fue un fragmento EcoRI-Nsil PCR de 489 pares base aproximadamente generado a partir del plásmido plH1.22.Hg- utilizando los siguientes cebadores: 5' - AAAGGGAAAGAATTCAACTTCTCCAGACTTTGGATAAGG (SEQ ID NO:27) 5' - AAAGGGAAAATGCATTTGTAGCAATAGAAAAAACGAA (SEQ ID NO:28) El plásmido plH1.22.Hg- es un derivado 'del vector cistron separado con fuerzas TIR relativas de 2-ligero y 2-pesado (Simmons et al., J. Immunol . Methojds, i 263: 133-147 (2002)) en donde los dominios variables ligero y pesado se han cambiado a un anticuerpo factor1 de anti -tejido rata en donde las dos cisteínas bisagras! se han convertido a serinas (C226S, C229S) . p5A6.22. Knob.Hg- Este plásmido se construye para introducir la secuencia de señal STII- con una fuerza TIR relativa de 2 para la cadena pesada. La construcción de p5A6.22.Knob involucra la ligación de dos fragmentos de DNA. El primero fue el vector p5A6.21. Knob.Hg- en donde el fragmento PacI-MluI pequeño se ha retirado. La segunda parte de la ligación fue un fragmento Pacl-MluI de 503 pares base aproximadamente a partir del plásmido plH1.22.Hg- que codifica el terminador de transcripción A o para la cadena ligera, el promotor phoA y la secuencia de señal STII (fuerza TIR relativa de 2 para la cadena pesada) . (iii) plásmido p22E7.11.Hole. Hg- Dos plásmidos intermedios se requirieron para generar el plásmido p22E7.11.Hole .Hg- deseado. El dominio variable de la cadena ligera quimérica 22E7 (anti-FceRI) primero se transfirió en el plásmido pVGll .V ERK. Hole para generar el plásmido intermedio p22E7.1.L.VG.l.H.Hole. El dominio variable de la cadena pesada quimérica 22E7 después se transfirió en el plásmido p22E7.1.L.VG.1.H.Hole para generar el plásmido intermedio p22E7.11.Hole . Lo siguiente describe la preparación de estos plásmidos intermedios p22E7.1.L.VG.1.H.Hole y p22E7.11. Hole seguido por la construcción de p22E7.11. Hole . Hg- . p22E7.1. L.VG.1. H.Hole Este plásmido se construyó a fin de transferir dominio variable ligero murino del anticuerpo 22E7 a un plásmido compatible para generar el anticuerpo monomérico de cadena pesada/cadena ligera (H/L) de longitud íntegra. La construcción de este plásmido involucra la ligación de dos fragmentos de DNA. El primer fragmento fue el vector pVGll .VNERK.Hole en donde el fragmento pequeño (¿?) EcoRI-PacI se ha retirado. El plásmido pVGll . VNERK. Hole es un derivado del vector cistrón separado con fuerzas TIR relativas de 1-ligero y 1-pesado (Simmons et al., J. Immunol. Methods, 263: 133-147 (2002)) en donde los dominios variables ligero y pesado se han cambiado a un anticuerpo anti-VEGF (VNERK) que tiene las mutaciones "orificio" (hole) (T366S, L368A, Y407V) (Merchant et al., Nature Biotechnology, 16:677-681 (1998)) y todos los elementos de control descritos anteriormente. La segunda parte de la ligación involucra ligar la secuencia ilustrada en la Figura 26 (SEQ ID NO: 36) en el vector pVGll .VNERK.Hole digerido con EcoRI-PacI descrito anteriormente. La secuencia codifica el promotor fosfatasa alcalina (phoA) , secuencia de señal STII y toda la cadena ligera (dominios variable y constante) del anticuerpo 22E7. p22E7.11. Hole Este plásmido se construye parta introducir , el dominio variable pesado murino del anticuerpo 22E7 en I un i marco de cadena pesada humana para generar el anticuerpo monomérico cadena pesada/cadena ligera H/L de longitud I integra quimérico. La construcción de p22E7.11. Knob involucra la ligación de dos fragmentos de DNA. El primero fue el vector p22E7.1.L.VG.1.H.Hole donde el fragmento pequeño MluI-PspOMI se ha retirado. La segunda parte de la ligación involucra el ligar la secuencia ilustrada en la Figura 28 (SEQ ID NO:38) en el vecbtor p22. E7.1.L.VG.1. H.Hole digerido con MluI-PspOMI. j La secuencia codifica los últimos tres aminoácidos dei la secuencia de señal STII y aproximadamente 123 aminoácidos del dominio variable pesado murino del anticuerpo 22E7L i p22E7. H.Hole. Hg- El plásmido p22E7.11. Hole . Hg- se construye para expresar el anticuerpo monomérico de cadena pesada/cadena ligera (H/L) orificio (hole) sin bisagra 22E7 quimérico de longitud íntegra. La construcción del plásmido i involucra la ligación de dos fragmentos de DNA. t El primero fue el vector p22E7.11. Hole en donde el pequeño fragmento PspOMI-SacII se ha retirado. La segunda parte de la ligación fue un fragmento PspOMI-SacII de 514 pares base aproximadamente del p4D5.22.Hg- que codifica aproximadamente 171 aminoácidos de la cadena pesada humana en donde las dos cisteínas bisagra se han convertido en serinas (C226S, C229S) .

I (iv) plásmido p22E7.22. Hole . Hg- { Se requirió un plásmido intermedio para generar el plásmido p22E7.22.Hole .Hg- deseado. El promotor phoA y la secuencia de señal STII (fuerza TIR relativa de 2) para cadena ligera primero se transfirieron en el plásmido p22E7.11.Hole .Hg- para generar el plásmido intermedio p22E7.21. Hole . Hg- . Lo siguiente describe la preparación del plásmido intermedio p22E7.21. Hole . Hg-seguido por la construcción de p22E7.22. Hole . Hg- . p22E7.21.Hole. Hg- Este plásmido se construye para introducir la secuencia de señales STII (con una fuerza TIR relativa de 2) para la cadena ligera. La construcción de p22E7.21.Hole .Hg- involucra la ligación de tres fragmentos DNA. El primer fragmento fue el vector p22E7.11.Hole .Hg- en donde el pequeño fragmento se ha retirado. El segundo fragmento fue un fragmento EcoRI-PacI de aproximadamente 647 pares base a partir del plásmido p22E7.11. Hole . Hg- que codifica la cadena ligera para el anticuerpo 22E7 quimérico. El tercer fragmento fue un fragmento EcoRI-EcoRV de 500 pares base aproximadamente del plásmido plH1.22.Hg- que codifica el promotor fosfatosa alcalina (phoA) y la secuencia de señal STII: p22E7.22.Hole.Hg- I Este plásmido se construye para introducir la secuencia de señal STII (con una fuerza TIR relativa de 2) para la cadena pesada. La construcción de p22E7.22.Hole .Hg- involucra la ligación de tres fragmentos de DNA. El primer fragmento fue el vector p22E7.21.Hole .Hg- en donde el fragmento pequeño EcóRI-MluI se ha retirado. El segundo fragmento fue un fragmento EcoRI-PacI de aproximadamente 1414 pares base a partir del plásmido p22E7.21.Hole .Hg- que codifica el promotor fosfatasa alcalina, secuencia de señal STII y la cadena ligera para el anticuerpo 22E7 quimérico. El tercer fragmento fue un fragmento PacI-MluI de 503 pares base aproximadamente a partir del plásmido plH1.22.Hg-que codifica el terminador de transcripción t0 para la cadena ligera y la secuencia de señal STII (con una fuerza TIR relativa de 2) para la cadena pesada. 3.2 Expresión de anticuerpo- 5A6 Knob y 22E7 Hole Anticuerpo biespecífico de longitud integral' se forma al explotar la tecnología de "perillas en orificios" para promover heterodimerización en la generación de anticuerpo anti-Fc7RIIB (5A6) /anti-Fc'eRI i (22E7) . Las mutaciones de "perillas en orificios" en' el dominio CH3 de secuencia Fe se ha reportado que reduce enormemente la formación de homodímeros (Merchant et a!l . , I Nature Biotechnology, 16:677-681 (1998)) . Se prepararon construcciones para el componente anti-Fc7RIIB , al introducir la mutación "perilla" (p5A6.11. Knob) en la región Fe, y el componente anti-FceRI (p22E7.11. Hole) al introducir las mutaciones "orificio" (hole) (T366S, L368A, Y407V) (Merchant, 1998, supra) . Síntesis a pequeña escala de los anticuerpos se llevó a cabo utilizando el plásmido p5A6.11.Knob para la producción del anticuerpo monomérico anti-FcYRIIB perilla y p22E7.11. Hole para el anticuerpo monomérico anti-FceRI orificio. Cada plásmido posee fuerzas TIR relativas de 1 para ambas cadenas ligeras y pesadas. Para expresión a pequeña escala de cada construcción, la cepa de E.coli 33D3 (W3110 AfhuA (AtonA) ptr3 lac Iq lacL8 AompT A(nmpc-fepE) degP41 kan ) se empleó como células anfitrionas. Después de transformación, transformantes selectos se inoculan en 5ml de medio Luria-Bertani suplementado con carbenicilina (50 /¿g/mL) y desarrollado a 30 grados C en una rueda de cultivo durante la noche. Cada cultivo' se diluye entonces (1:100) en medio limitante de fosfato C.R.A.P. (Simmons et al., J. Immunol . Methods 263:133-147 (2002)) . Carbenicilina después se agrega al cultivo ' de inducción a una concentración de 50 µg/mL y el cultivo se desarrolla por aproximadamente 24 horas a 30 grados C en una rueda de cultivos. A menos que se anote de otra i forma, todas las inducciones de matraz de agitación se realizaron en un volumen de 5 mi. Lisados de células entras no reducidos de cultivos indicados se preparan como sigue: (1) 1 OD6oo-mL de muestras de inducción se centrifugan en un tubo de micro centrífuga; (2) cada precipitado se resuspende en 90 /iL de TE (10 mM Tris pH 7.6, 1 mM EDTA) ; (3) 10 µ?, de ácido yodoacético 100mm (Sigma 1-2512) se agregan a cada muestra para bloquear cualesquiera cisteínas libres y evitar entremezclado de disulfuro; (4) 20 µ?? de SDS al 10% se agrega a cada muestra. Las muestras se someten a torbellino, calientan a aproximadamente 90 grados C por 3 minutos y después se someten de nuevo a torbellino. Después de que las muestras se han enfriado a temperatura ambiente, 750 /¿L de acetona se agrega para precipitar la proteína. Las muestras se someten a torbellino y se dejan a temperatura ambiente por aproximadamente 15 minutos. Después de centrifugación por 5 minutos en una microcentrífuga, el sobrenadante a cada muestra se retira por aspiración, y cada precipitado de proteína se resuspende en 50 /¿L de dH20 más 50 µL de amortiguador de muestra 2X NOVEX SDS. Las muestras después se calientan por 4 minutos a aproximadamente 90 grados C, someten a torbellino y dejan que enfríen a temperatura ambiente. Una centrifugación de 5 minutos final se realiza y los sobrenadantes se transfieren a tubos limpios. > Lisados de células enteras reducidos ¦ de cultivos inducidos se prepararon como sigue: (1) 1 OD6oo_ mL de muestras de inducción se centrifugaron en un tubo de microcentrífuga; (2) cada gránulo se resuspendió en 90 µ L TE (10 mM Tris pH 7.6, 1 mM EDTA) ; (3) 10 /L de ditiotreitol 1M (Sigma D-5545) se agrega a cada muestra para reducir enlaces disulfuro; (4) 20 //L de SDS al 10% se agregan a cada muestra. Las muestras se sometieron a torbellino, calentaron a aproximadamente 90 grados C por 3 minutos y después se sometieron a torbellino de nuevo. Después que las muestras se enfriaron a temperatura ambiente, 750 µ1> de acetona se agregan para precipitar la proteína. Las muestras se sometieron a torbellino y dejaron a temperatura ambiente por aproximadamente 15 minutos. Siguiendo centrifugación por 5 minutos en una microcentrífuga, el sobrenadante de cada muestra se retira por aspiración y cada gránulo de proteína se resuspende en 10 µ?? de ditiotreitol 1M más 40 ^L de dH20 más 50 µL de amortiguador de muestra NOVEX SDS 2X. Las muestras después se calientan por 4 minutos a aproximadamente 90 grados C, someten a torbellino y deja que enfríen a temperatura ambiente. Una centrifugación final de cinco minutos se realiza y los sobrenadantes 1 se transfieren a tubos limpios. i Siguiendo preparación, 5 a 8 µ?? de cada muestra se cargan en un Tris-Glicina SDS-PAGE al 12% de 10 pozos, 1.0 mm (NOVEX y electroforesis a aprox. 120 volts por 1.5 - 2 horas. Los geles resultantes ya se tiñeron con Azul Coomassie Blue o utilizan para análisis de transferencia Western. Para análisis de transferencia Western, los geles SDS-PAGE se electrotransfirieron a una membrana de nitrocelulosa (NOVEX) en amortiguador CAPS 10 mM, pH 11 + metanol al 3%. La membrana se bloquea utilizando una solución de IX NET (150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 50 mM Tris pH 7.4, 0.05% Tritón X-100) más gelatina al 0.5% por aproximadamente 30 minutos - 1 hora de sacudida a temperatura ambiente. Siguiendo la etapa de bloqueo, la membrana se coloca en una solución de IX NET/gelatina 0.5%/anticuerpo anti-Fab (fracción IgG de cabra conjugada con peroxidasa a IgG Fab humano; CAPPEL #55223) para un análisis de transferencia Western anti-Fab. La dilución anticuerpo anti-Fab estuvo en el rango de 1:50,000 a 1:1,000,000 dependiendo del lote de anticuerpo. En forma alterna, la membrana se colocó en una solución de IX NET/gelatina al 0.5%/anticuerpo anti-Fc fracción IgG cabra conjugada con peroxidasa a fragmento Fe humano; BETHYL #A80-104P-41) para un análisis de transferencia Western anti-Fc. La dilución anticuerpo anti-Fc estuvo en el rango de 1:50,000 a 1:250,000 dependiendo del lote I del anticuerpo. La membrana en cada caso se dejó en la solución de anticuerpo durante la noche a temperatura ambiente con sacudida. La siguiente mañana, la membrana se lavó en un mínimo de 3 x 10 minutos en IX NET/gelatina al 0.5% y después 1 x 15 minutos en TBS (20 mM Tris pH 7.5, 500 mM NaCl) . Las bandas de proteína ligadas por el anticuerpo anti-Fab y el anticuerpo anti-Fc se visualizaron utilizando el equipo de detección Amersham Pharmacia Biotech ECL, seguido por exposición de la membrana a película de Rayos X. Los resultados de transferencia expression de anticuerpo Western anti-Fab para p5A6.11.Knob (knob ariti-FcDRIIB) y p22E7.11. Hole (hole anti-Fc^RI) se ilustran en la Figura 18. Revelan la expresión de especies de cadena pesada-ligera (HL) totalmente plegadas y ensambladas para el anticuerpo perilla anti-FcDRIIB en la pista 1 y el anticuerpo orificio anti-FceRI en la pista 2. El anticuerpo anti-Fab tiene diferentes afinidades para diferentes dominios variables de la cadena ligera. El anticuerpo anti-Fab en general tiene menor afinidad para la cadena pesada. Para las muestras no reducidas, la expresión de cada anticuerpo resulta en la detección' de i las especies de cadena pesada-ligera. En forma notable, las especies de homodímero anticuerpo de lontigud íntegra son detectables para el anticuerpo agujero anti-Fc¿RI, sin embargo solo es una pequeña proporción de las especies de anticuerpo totalmente plegadas y ensambladas. El plegado y ensamblado de especies de homodímero de anticuerpo de longitud íntegra no se favorece como resultado de la inclusión de la mutación "knob" (perilla) para el anticuerpo anti-FceRIIB y las mutaciones "hole" (orificio) para el anticuerpo anti-Fc^RI. Para las muestras reducidas, la cadena ligera se detecta para el anticuerpo perilla anti-FcsRIIB y el anticuerpo orificio anti-Fcf RI . En forma similar, los resultados de transferencia Western anti-Fc se ilustra en la Figura 19 y también revela la expresión de especies de cadena pesada-ligera (HL) totalmente plegadas y ensambladas para el anticuerpo perilla anti-FcfRIIB en pista 1 y el anticuerpo orificio anti-Fc^RI en pista 2. El anticuerpo anti-Fc no es capaz de ligar la cadena ligera y por lo tanto la cadena ligera, no se detecta. Para las muestras no reducidas, la expresión de cada anticuerpo de nuevo resulta en la detección de las especies de cadena pesada-ligera, pero no las especies homodímero de anticuerpo: de longitud íntegra. Para las muestras reducidas, hay cantidades similares de cadena pesada detectadas para1 el I anticuerpo perilla anti-Fc^RIIB y el anticuerpo orificio I anti-Fc£-RI. ' 3.3 Expresión de Variante Bisagra Perilla 5A6 y Anticuerpos Variantes Orificio Bisagra 22?? Las especies de anticuerpo primario obtenidas de la expresión de construcciones p5A6.11.Knob y p22E7.11.Hole fueron especies de cadena pesada-ligera (HL) totalmente plegada y ensamblada. Sin embargo, a fin de facilitar el método de preparación aquí descrito para i el anticuerpo biespecífico anti-Fcy RIIB/anti-Fc £ RI I (5A6/22E7) , la secuencia bisagra de las dos cadenas pesadas se modificó al substituir las dos cisteínas bisagra con serinas (C226S, C229S, esquema de numeración EU de Kabat, E.A. et al., supra) . Variantes bisagra también se refieren a continuación como "sin bisagra" . Construcciones plásmido se prepararon para' el anticuerpo perilla anti-Fc e -Rllb (5A6) y el anticuerpo orificio anti-Fc^RI (22E7) comprende variantes bisagras que tienen substituciones C226S, C229S. pos construcciones de plásmido se prepararon para cada anticuerpo. Una construcción tuvo una fuerza ;TIR relativa de 1 para ambas cadenas ligeras y pesadas la segunda construcción tuvo una fuerza relativa TIR dé 2 para ambas cadenas ligeras y pesadas. El anticuerpo perilla anti-Fc e RIIB (del plásmido p5A6.11. Knob) , el anticuerpo orificio an'ti- I Fe e RI (p22E7.11.Hole) , los anticuerpos perillas i sin bisagra anti-Fc e -Rllb (p5A6.11. Knob . Hg- y p5A6.22.Knob.Hg-) , y los anticuerpos sin bisagra anti-Fc e RI (p22E7.11.Hole.Hg- y p22E7.22. Hole . Hg- ) se expresaron entonces de sus plásmidos respectivos como se describió previamente. Se prepararon Usados celulares enteros, se separaron por SDS-PAGE, transferidos a nitrocelulosa, y detectados con el anticuerpo conjugado Fab anti-humano cabra y el anticuerpo conjugado Fe anti-humano cabra descritos anteriormente. Los resultados de transferencia Western anti-Fab se ilustra en la Figura 20 y muestran una mejora significante en plegado y ensamblado de las especies de cadena pesada- ligera (HL) para el anticuerpo monomérico anti-Fc £ -RIIB (fuerzas TIR relativas - 1 para cadena ligera y 1 para cadena pesada) en pista 2 y el anticuerpo monomérico anti-Fc £ RI orificio sin bisagra (fuerzas TIR relativas - 1 para cadena ligera y 1 para cadena pesada) en pista 5. Además, los resultados de transferencia Western anti-Fab muestran un aumento en el plegado y ensamblado de las especies de cadena pesada-ligera (HL) para el anticuerpo anti-Fc e -RIIB orificio sin bisagra Hl monomérico (pista 3) y el anticuerpo anti-Fc £ RI sin bisagra orificio HL monomérico (pista 6) cuando las fuerzas TIR relativas para cadena ligera y pesada 1 se aumentan de 1 a 2. El anticuerpo anti-Fab t'iene diferentes afinidades para diferentes dominios variables de la cadena ligera y generalmente tiene menor afinidad para la cadena pesada. Para las muestras no reducidas, la expresión de cada anticuerpo resulta en la detección de las especies de cadena pesada-ligera, pero no las especies de anticuerpo de longitud íntegra como resultado de la conversión de las cisteínas bisagra a serinas . ( Hay mejoras significantes en el plegado y ensamblado de ¡ las especies de cadena pesada-ligera (HL) para cada uno de los anticuerpos anti-Fc e -Rllb perilla sin bisagra y anti-FcfRI orificio sin bisagra en donde las 'dos cisteínas bisagra se convierten en serinas y de nuevo cuando las fuerzas TIR relativas para las cadenas ligeras y pesadas se aumentan de 1 a 2. Para las muestras reducidas, las cadenas pesadas así como las ligeras,1 se detectan por los diferentes anticuerpos anti-Fc e -Rllb y anti-Fc^RI. El aumento en cantidades de cadenas pesádas y ligeras se detecta cuando las fuerzas TIR relatives se aumentan de 1 a 2. Similarmente, los resultados de transferencia Western anti-Fc en la Figura 21 muestran mejpra significante en el plegado y ensamblado de las especies monoméricas de cadena pesada-ligera (HL) para ambos anticuerpos anti-Fc e -RIIB perilla sin bisagra y anti-Fe e RI orificios sin bisagra cuando las dos cisteínas i bisagra de cadena pesada (HC) se convierten en serin s y de nuevo con las fuerzas TIR relativas para cadenas ligeras y pesadas se aumentan de 1 a 2. El anticuerpo anti-Fc no es capaz de ligar cadena ligera, y por lo tanto la cadena ligera no se detecta. Para las muestras reducidas, la cadena pesada se detecta para los diferentes anticuerpos anti-Fc e -Rllb y anti-Fc £ RI . El aumento en las cantidades de cadenas pesadas se detecta cuando las fuerzas TIR relativas se aumentan de 1 a 2. 3.4 Purificación de componentes de anticuerpo biespecífico Se estiman adicionalmente la facilidad y eficiencia de obtener anticuerpos biespecífieos, purificados y funcionales en el contexto de anticuerpos que tienen una región bisagra variante como se describe anteriormente . 1. Extracción de pasta E. coli Pasta de E. coli congelada se descongela y suspende en 5 volúmenes (v/p) de agua destilada, ajustan a pH 5 con HCl , centrifugan, y se descarta , el sobrenadante. El precipitado o gránulos insolubles se resuspenden en 5 - 10 volúmenes de un amortiguador a pH 9 utilizando un polytron (Brinkman) , y el sobrenadante retenido después de centrifugación. Esta etapa se repite una vez. I El precipitado insoluble después se resuspende en 5 - 10 volúmenes del mismo amortiguador, y las células se rompen por paso a través de microfluidizador (Microfluidics) . El sobrenadante se retiene después de centrifugación. ' Los sobrenadantes se evalúan por electroforesis en gel SDS poliacrilamida (SDS-PAGE) y transferencias Western, y aquellos que contienen el anticuerpo de un solo brazo (es decir una banda que corresponde al peso molecular de una sola cadena pesada más cadena ligera) se recolectaron. 2. Cromatografía de Afinidad de Proteína-A Los sobrenadantes recolectados se ajustan a pH8, y perlas ProSep™-A (Millipore) se agregan (aproximadamente 250 mi de perlas por 10 litros) . La mezcla se agita por 24 - 72 horas a 4 grados C, las perlas se deja que sedimenten, y el sobrenadante se decanta. Las perlas se transfieren a una columna de cromatografía (Amersham Biosciences XK50™) , y lavan con amortiguador Tris 10 mM pH 7.5. La columna después j se eluye utilizando un gradiente de pH en citrato 50 mM, amortiguador NaCl 0.1M. El amortiguador de partida se ajusta a pH 6, y el gradiente formado por dilución lineal con amortiguador pH 2.

Se ajustaron fracciones a pH 5 y urea 2 Mj por adición de urea 8M y base tris, después se evalúan! por Í SDS-PAGE y recolectan. 3. Cromatografía de intercambio de cationes Una columna S-Sepharose Fast FlowMR (Amersham Biosciences) se equilibra con urea 2 M, MES 25 mM pH 5.5. La recolección de eluato ProSepR-A se diluye con un volumen igual de amortiguador de equilibrio, y cargan en la columna. Después de lavar con el amortiguador de equilibrio, entonces con MES 25 mM pH 5.5, la columna se revela con un gradiente lineal de NaCl 0 - 1M en MES 25 mM, pH 5.5. Las fracciones se recolectaron con base en análisis SDS-PAGE. 4. Cromatografía de Interacción Hidrofóbica Una columna HI-PropylMR (J.T. Baker) se equilibra con sulfato de sodio 0.5 M, Mes 25 mM pH 6. El eluato S-Fast Flow"1* se ajusta a sulfato de sodio 0.5 M, pH 6, carga en la columna, y la columna se revela con un gradiente de sulfato de sodio 0.5 - 0M?? en MES 25 mM,¡ pH i 6. Las fracciones se recolectan con base en análisis SDS-PAGE. 5. Cromatografía de Exclusión de Tamaño La recolección de eluato HI-PropylMR se concentra utilizando un concentrador CentriPrepMR YM10 (Amicon) , y carga en una columna SuperdexMR SX200 (Amersham Biosciences) equilibrada con succinato lOmM o histi&ina I 10 mM en NaCl 0.1 M, pH 6, y la columna se revela ai 2.5 ml/m. Las fracciones se recolectaron con base en SDS-PAGE. 3.5 Alineamiento de Componentes de Anticuerpo para Generar Anticuerpos Biespecífieos Dos métodos de alineamiento similares (pero no idénticos) se describen a continuación, ambos de los cuales resultaron con buenos rendimientos de anticuerpos biespecíficos . Cadenas pesadas de los anticuerpos y componentes de anticuerpo descritos a continuación contienen una región bisagra variante como se describió anteriormente . Alineamiento de 5A6Knob variante bisagra y 22E7Hole variante bisagra - Método 1 Anticuerpos monoméricos de cadena pesada/ligera 5A6Knob y 22E7Hole purificados en MES 25 mM pH 5.5, NaCl 0.5 M, se mezclaron en proporciones molares iguales con base en sus concentraciones. La mezcla después se calentó a 50 grados C por 5 minutos a 1 hora. Esta temperatura de alineamiento se deriva de las curvas' de fusión previamente descritas para estas variantes 'CH3 (Atwell, S., et al, 1997, J. Mol. Biol . , 270:26-35). El anticuerpo alineado después se somete a análisis para determinar su biespecificidad . , I Análisis de biespecificidad 1 1) Enfoque Isoeléctrico Anticuerpo alineado se verifica como biespecífico al aplicar muestras para análisis de enfoque isoeléctrico. El anticuerpo 5A6Knob tiene un pl de 7.13 mientras que 22E7Hole tiene un pl de 9.14. El anticuerpo biespecífico 5A6Knob/22E7Hole tiene un pl de 8.67. La Figura 22 muestra el movimiento de los anticuerpos 5A6Knob, 22E7Hole y biespecífico 5A6Knob/22E7Hole (antes y después de calentar) en un gel de enfoque isoeléctrico (Invitrogen, Novex pH3-10 IEF) después de tinción con Azul de Coomassie. Mientras que hay cierto alineamiento al mezclar a temperatura ambiente, el calentamiento 50 grados C parece promover terminación de proceso. La apariencia de una nueva banda de proteína con un pl intermedio al de 5A6Knob y 22E7Hole verifica la formación del anticuerpo biespecífico. 2) Análisis de columna de afinidad Los compartimientos de los anticuerpos 5A6Kriob, 22E7Hole, y 5A6Knob/22E7Hole biespecífieos se observaron en columna de afinidad FcfRIIB. Una proteína de fusión FcfRIIB (dominio extracelular) -GST humana se acopló a un soporte sólido en una pequeña columna de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Pierce, UltraLinkMR Immobilization Kit #46500) . Anticuerpos 5A6Knob, 22E7Hole, y 5A6Knob/22E7Hole biespecificos en PBS (137 mM NaCl, 2.7 mM KC1 , 8 mM Na2HP04, 1.5 mM KH2P04, pH 7.2)! se cargaron en tres columnas de afinidad FcfRIIB a aproximadamente 10-20% de la capacidad de enlace teórico de cada columna. Las columnas después se lavaron con 16 volúmenes de columna de PBS. Los flujos pasantes de columna para la carga y lavado se recolectaron, combinaron y concentraron aproximadamente 10-veces en Microconcentradores CentriconMR (Amicon) . Cada concentrado en el mismo volumen después se diluye 2 veces con amortiguador de muestra SDS 2X y analiza por SDS-PAGE (Invitrogen, Novex Tris-Glycine) . Las bandas de proteína se transfieren a nitrocelulosa por electro transferencia en Na2HP04 20mM pH 6.5, y sondean con un anticuerpo conjugado peroxidasa IgG Fab antihumano (CAPPELL#55223) . Las bandas de anticuerpo después se detectan utilizando el equipo Amersham Pharmacia Biotech ECLMR de acuerdo con las instrucciones del fabricante . Los resultados de este análisis se ilustran en la Figura 23. La columna de afinidad FCYRIIB deberá retener el anticuerpo 5A6Knob y el anticuerpo biespecífico 5A6Knob/22E7Hole . El anticuerpo 22E7Hple deberá pasar fluyendo como se muestra en la Figura 23. La I falta de anticuerpo detectado en la pista biespecífica 5A6Knob/22E7Hole indica biespecificidad. 1 Los comportamientos de los anticuerpos 5A6Knob, 22E7Hole, y 5A6Knob/22E7Hole biespecífico también pujeden observarse en columnas de afinidad FceRI. La columna de afinidad de fusión IgE puede prepararse y utilizarse como se describe anteriormente para la columna de afinidad FCYRIIB. La columna de afinidad FceRI deberá retener el anticuerpo 22E7Hole y el anticuerpo 5A6Knob/22E7Hole . El anticuerpo 5A6Knob deberá fluir en forma pasante. La falta de anticuerpo detectado en la pista de anticuerpo 5A6Knob/22E7Hole indica biespecificidad . Alineado 5A6Knob variante bisagra y 22E7Hole variante bisagra - Método 2 Los componentes de anticuerpo (brazo sencillo 5A6Knob y 22E7Hole) se purifica como se describió anteriormente . El "heterodimero" se forma por alineamiento a 50 grados C, utilizando un ligero exceso molar de 5A6 , después purifica en una columna de intercambio de cationes. Anticuerpos monómericos 5A6 (Knob) 5mg y 22E7 (Hole) 4.5mg H/L se combinan en un volumen total de succinato 10ml 8mM, amortiguador NaCl 80mM, ajustado a 20mM tris, pH7.5. Los anticuerpos monómeroicos se alinean i al i calentar la mezcla a 50 grados C en un baño de agua I or I 10 minutos, después de enfrían a 4 grados C para formar el anticuerpo biespecífico . Análisis de biespecificidad 1. Enfoque Isoeléctrico Análisis en un gel de enfoque isoeléctrico (Cambrex, pH7-ll) mostró formación de una sola banda a pl -8.5 en la mezcla de alineamiento, que corresponde1 al i anticuerpo biespecífico (que tiene un pl calculado ^ de 8.67). Ver Figura 24. 1 2. Purificación en una columna intercambio de cationes Una columna 5ml C -Fast Fluir (HiTrap, Amers'ham Biosciences) se equilibra con un amortiguador a pH5.5 (MES 30mM, hepes 20mM, imidazol 20mM, tris 20mM, NiaCl I 25mM) . El recolectado alineando se diluye con un volumen igual de amortiguador de equilibrio y ajusta a pH5.5, carga en la columna, y lava con amortiguador de equilibro. La columna se revela a 1 ml/m con un gradiente de pH5.5 a pH9.0 en el mismo amortiguador, durante 30 minutos. Las fracciones se analizaron por IEF, que i revela que 5A6 se eluye antes que el heterodímero . Análisis por dispersión de luz de las fracciones I recolectadas que contienen el heterodímero no reveló monómero . EJEMPLO 4.0 Caracterización de Anticuerpo Biespecífico 5A6/22E7 (Knob in Holes) perilla en orificios El propósito de este ejemplo es demostrar que 5A6/22E7, no 5A6 o 22E7 solos, es un anticuerpo biespecífico. 5A6/22E7 tiene doble especificidad de enlace human Fc7RIIB-Hise-GST y FceRI-ECD-Fc en un ensayo de Elisa emparedado. Los resultados se presentan en las Figuras 29 y 30. 5A6 (A) y 5A6 (B) designan dos preps de proteína de 5A6. Anticuerpos biespecífico 5A6/22E7 descritos a continuación son anticuerpos en heterodimeroicos de perilla en orificios ya sea con bisagra tipo silvestre o sin bisagras. Anticuerpo biespecífico se refiere en forma intercambiable como BsAb. Especificidad de enlace dual de 5A6/22E7 anticuerpo biespecífico sin bisagras huFcYRIIB- His6-GST y huFceRI -ECD-Fc (IgE fusión de receptor) demuestra por ELISA con resultados presentados en la Figura 29. Placas ELISA se revisten durante la noche a 4 grados C con ???µ? de una solución 1 µg/ml de Fc7RIIB-His6-GST en PBS, pH 7.4. La placa se lava con PBS y bloquea con bloqueador de Caseína 1% en PBS. Los pozos se lavaron tres veces con PBS/TWEEN® 0.05%. 10 Mg/ml de CD4-IgG se prepararen amortiguador Diluyente Elisa (Tris-HCl50 mM, pH7.5 , NaCl 150 mM, Tween-20 0.05%, BSA 0.5%, EDTA 2mM) y agregán a pozos a 100 µ?/???? para bloquear enlace Fc7RIIB-His6-GST a la porción Fe de cada uno de los anticuerpos deprueba: anticuerpo biespecífico 5A6 (A)/22E7 perilla en orificios, bisagra tipo silvestre; 5A6 (B) /22E7 perilla en orificios, bisagra tipo silvestre, BsAb; 5A6/22E7 perilla en orificios, BsAb; 5A6 MAb sin bisagras; y 22E7 MAb. Después de lavar la placa tres veces con PBS/TWEEN® 0.05%, diluciones en series de los tres 5A6/22E7 BsAb, 5A6 MAb, y 22E7 MAb se prepararon en amortiguador Diluyente ELISA y agrega a pozos a 100 µ?/???? de cada dilución. Las placas se incubaron para 1 hora a temperatura ambiente. Después lavar la placa tres ve¡ces con PBS/TWEEN® 0.05%, ???µ? de 1 µg/ml huFceRI -ECD-Fc! se agrega a cada pozo y las placas se incubaron por 1 hora a temperatura ambiente. Después lavar la placa tres veces con PBS/TWEEN® 0.05%, 100 µ? de 1 ¿¿g/ml IgE-biotina j se agrega a cada poso e incuba por 1 hora a temperatura ambiente. La placa se lava con PBS/TWEEN® 0.05% e incubaron durante 30 minutos con 100 µ?/???? de 1:2000 Streptavidina-HRP en amortiguador diluyente ELISA. Después lavar con PBS/TWEEN® 0.05% la placa se incuba a 5 minutos con 100 µ? de substrato TMB. La reacción ¡ se neutraliza con 100 µ?/???? de solución de parada (stop) y el lector de placas a 630 nm en un densitometro de p:laca con 96 pozos (Molecular Devices) . Los resultados muestran IgE ligado en pozos que contienen anticuerpos biespecífico 5A6/22E7. Los anticuerpos biespecífieos : 5A6 (A) + 22E7 BsAb, 5A6 (B) + 22E7 BsAb, y 5A6+22E7 sin bisagras perilla-orificio BsAb ligados exitosamente a FC7RIIB-GST y IgE-biotina. Ver Figura 29. Un experimento ELISA complementario se realiza como sigue con resultados presentados en la Figura 30. Placas ELISA se revistieron durante la noche a 4 grados C con 100 µ? de una solución 1 µg/ml de huFceRI -ECD-Fc en PBS, pH 7.4. La placa se lava con PBS y bloquea con bloqueador de Caseína al 1% en PBS. Los pozos se lavaron tres veces con PBS/TWEEN® 0.05%. Diluciones en serial de 5A6/22E7 anticuerpos biespecífieos , 5A6 anticuerpos, o 22E7 anticuerpo se prepararon en amortiguador Diluyente ELISA y agrega a pozos a 100 µ?/???? de cada dilución. Las placas se incubaron por 1 hora a temperatura ambiente. Después de lavar la placa tres veces con PBS/TWEEN® 0.05%, Fc7RIIB-His6-GST se agrega a cada poso a 100 µ? de 1 µg/ml en la presencia de 10 µg/ml de CD4-IgG para bloquear enlace Fc7RIIB-His6-GST a porción Fe del anticuerpo de prueba, huFceRI-ECD-Fc y anticuerpo secundario (anti-GST-biotina) e incuba por 1 hora a temperatura ambiente. Después de lavar la placa tres veces con PBS/T EEN® 0.05%, 100 µ? de 1 /¿g/ml a'nti-GST-biotina se agrega a cada pozo e incubaron por 1 'hora a temperatura ambiente. La placa se lava con PBS/TWEEN® 0.05% e incuba por 30 minutos con 100 µ?/???? de 1:2000 Streptavidin-HRP en amortiguador diluyente Elisa. Después lavar con PBS/TWEEN® 0.05%, la placa se incuba 5 minutos con 100 µ? de substrato TMB. La reacción se neutraliza con 100 µ?/???? de solución de parada y la placa se lee a 630 nm. Los resultados muestran anti-GST biotina ligado en pozos que contienen los anticuerpos biespecífico 5A6/22E7. Los anticuerpos biespecífico : 5A6 (A) + 22E7 y 5A6 (B) + 22E7 anticuerpos biespecífieos sin bisagras, y 5A6+22E7 anticuerpo biespecífico perilla-orificio ligados exitosamente a huFceRI-ECD-Fc y FC7RIIB-GST. Ver Figura 30. Gráficas de las curvas para ambos experimentos se presentan en las Figuras 29 y 30. Enlace exitoso tanto FCYRIIB-GST y huFceRI-ECD-Fc se demuestran solo por 5A6 (A) + 22E7 y 5A6 (B) + 22E7 anticuerpos biespecífieos ,sin bisagras. Valores IC50 para los resultados mostrados en las Figuras 29 y 30 se proporcionan en la Tabla 1. Tabla 1.

Valores IC50 para FCYRIIB- Valores IC50 para huFceRI- GST (ng/ml) (Figura 29) ECD-Fc (ng/ml) (Figura 30!) BsAb-perilla en orificio, BsAb-perilla en orificio, bisagra tipo silvestre bisagra tipo silvestre 5A6 (A)+22E7 : 5A6 (A) +22E7 : 55.2 490 5A6 (B)+22E7: 5A6 (B) +22E7 : 76.0 291.5 MAb MAb 5A6 (A) : 5A6 (A) : 3.3e+06 5.3e+06 5A6 (B) : 5A6 (B) : 1.4e+07 1. Oe+07 22E7 : 22e7 : 1. Oe+05 2.8e+06 BsAb-perilla en orificio, BsAb-perilla en orificio, sin bisagra sin bisagra 5A6+22E7 Perilla-orificio 5A6+22E7 Perilla -orificio : sin bisagras: 23 76.5 EJEMPLO 5.0 Propiedades de Anticuerpo Biespecífico 5A6/22E7 sin Bisagras, Perilla en Orificios, .1 Materiales En los ejemplos previos, FcyRIIB referido a huFcYRIIBl, uno de tres variantes de FcyRIIB combinación.

En los ejemplos restantes, FCYRIIBI y una variante i de I combinación adicional, FC7RIIB2 se utilizan y así 1 se designan. J 8.5.13 es un anticuerpo quimérico que consiste de una región variable de ratón específica para NP (Nitrofenol, un antígeno) y una región IgE Fe humana. La región variable de J 8.5.13 IgE es específica para NP y no reacciona en forma cruzada con TNP. La porción IgE humana de J 8.5.13 liga específicamente a huFceRI y no liga a FceRI de rata endógena en líneas celulares derivadas de RBL . El enlace de JW8.5.13 a huFceRI incrementa la expresión y la carga con IgE específico de antígeno . Células RBL-2H3 (ATCC# CRL-2256) que expresan FceRIa, la a-subunidad del receptor IgE humano de alta (FceRI) (Gilfillan et al., (1995) Int Arch Allergy Immunol . 107 (1-3) : 66-68) se trasfirieron con combinaciones de (es decir con y sin) , huFc7RIIBl y/o huFc7RIIB2 para generar líneas celulares de derivadas de RBL. Variantes de línea celular RBL 2H3 se generaron por transducción retroviral de células RBL 2H3 con FCYRIIBI humano o FCYRIIB2 utilizando un vector de expresión retroviral obteniendo de Lavarton University, MO, que| es similar a las series de vectores pQCXIR (Retro-x' Q vectors) disponibles de BD-Clontech. cDNA de los genes humanos de de longitud integral subclonan en el vector retroviral ya sea en forma sencilla o en combinación con I una secuencia de entrada ribosomal interna (IRES Internal Ribosomal Entry Sequence) para permitir co- transfección bicistronica y co-expresión de dos genes. Mayor descripción del método de transducción retroviral se proporciona a continuación. Células de empaque PG13 (ATCC CRL-10686) se siembran en una placa de cultivo de tejido 10 cm a 2xl06 células por placa (DMEM de alta glucosa, FCS 10%, penicilina, estreptomicina, L-glutamina 2 mM) por 24 horas. Se transfectaron células con construcciones pMSCV DNA utilizando FuGENE 6 y cultivaron por 2 días a 37 grados C, C02 al 5%. Sobrenadante de cultivo celular que contienen partículas retrovirales se recolecta y filtra a través de un filtro de 0.4 mieras. Sulfato de protamina estéril se agrega a una concentración final de 10 y 4 mi de supernadante se emplea para infectar aproximadamente lxl O6 células RBL por infección de centrifugado a 32 grados C por 90 minutos, seguido ¡por cultivo continuo en sobrenadante retroviral por 3-4 horas a 37 grados C en C02 5%. Células RBL infectadas se recuperan, transfieren a medio RBL, y expanden para clasificación. Células transfectadas positivamente se identificaron por FACS utilizando anticuerpos 22E7 y/o 5A6 para detectar FceRIA humano y FCYRIIB humano, respectivamente. 1 ! I Las líneas celulares resultantes se designaron í como sigue: FcsRIa humana expresada en superficie, de células RBL huFceRI; FCYRIIBI humana expresada en superficie de células RBL huFcYRIIB, FcsRIa humana expresada en superficie de células RBL huFceRI+huFcYRIIBl y FcyRIIBl humana; y FcsRIa humana expresada en superficie de células RBL huFceRI+huFc7RIIB2y FCYRIIB2 humana . Anticuerpo biespecífico 5A6/22E7 biotinilado (perilla en orificios, sin bisagras) se prepara al acoplar un exceso 20x molar de EZ-link™ NHS-PE04-Biotina (Pierce, Rockford, IL) a anticuerpo biespecífico en PBS. El domino extracelular huFceRIa (huFceRIa ECD) se produce al subclonar en un sistema de expresión de báculo virus y purifica utilizando columna enlazada con CNBr-sefarosa y columna de exclusión de tamaño de sephadez. El dominio extracelular huFcyRIIB (huFcYRIIB ECD) se produce al subclonar en cuadro con una etiqueta Hise C-terminal con subsecuente expresión en un sist'ema de expresión de báculo virus. huFcYRIIB ECD se purifica por resina NiNTA. 5.2 Ensayo de Liberación de Histamina La habilidad del anticuerpo biespecífico 5A6/22E7 para entrelazar huFcYRIIBl o huFcYRIIB2 con huFceRI en una superficie celular se demuestra por i i I bloqueo selectivo de liberación de histamina de acuerdo con el siguiente ensayo. La siguiente descripción| se soporta adicionalmente por las Figuras 31-33. Células RBL 48 transfectadas (supra) se desarrollan en (medio esencial mínimo de Eagle (EMEM con BSS Earle's) con L-glutamina 2mM, piruvato de sodio lmM, amino ácidos no esencialesO . lmM, bicarbonato de sodio 1.5 g/L, penicilina, estreptomicina, suero bovino fetal al 15%) en un matraz de cultivo de tejido estándar a 37 grados C en un incubador de C02 al 5% humidificado . Las células se recolectaron por exposición a 4 mL de solución de PBS/0.05% tripsina/0.53 mM EDTA por 2 minutos a 37 grados C, seguido por centrifugación (400 x g, 10 minutos.) y resuspensión en EMEM fresco. Las células en suspensión se contaron con un hemocitómetro (Reichert-Jung) y la densidad se ajusto a aproximadamente 105 a 106 células/ml . Células RBL transfectadas descritas anteriormente, células RBL huFceRI, RBL huFceRI+huFc7RIIBl, y células RBL huFceRI+huFcYRIIB2 , se sembraron en una placa de cultivo de tejido de fondo plano 96 pozos, a 105 células/pozo en 200µ1 de EMEM. Las células se incubaron por 24 horas a 37 grados C ya sea con o sin ^g/ml de J 8.5.13 ("IgE humano específico de NP") . A continuación, las células se lavan tres veces con medio fresco para retirar IgE humano específico d'e NP no ligado. Algunas células se trataron con 1-5 µg/mi de anticuerpo biespecífico, bajo condiciones de saturación, e incubaron por 1 hora a 37 grados C, antes de activar con antígeno. Células se incubaron con ovalbumina conjugada con Nitrofenol (NP) (NP (11) -OVA) , un antígeno que liga JW8.5.13, un IgE, o TNP (11) -OVA, un antígeno irrelevante, por 1 hora a 37 grados C. Desgranulación asociada con activación (liberación de histamina) de células RBL huFceRI, RBL huFceRI+huFcyRIIBl , y células de RBL huFceRI+huFc7RIIB2 , con o sin anticuerpo biespecífico, por NP- (11) -OVA y TNP se prueba sobre' un rango de concentraciones de antígeno de 0.0001 a 10 /¿g/ml . Después de incubación, el nivel de histamina en los supernadantes celulares (medio de cultivo celular) se mide por ELISA como se describe anteriormente. Niveles totales de histamina para las células, para servir como controles positivos independiente de activación, también se obtuvieron ya sea al lisar células ya sea con Tritón X-100 o disparar liberación total histamina por estímulo con ionomicina. Histamina de fondo liberada por células RBL también se obtuvo. Niveles de liberación de histamina se cuantificaron por ELISA utilizando un equipo Histamina ELISA (KMI, Diagnostics inneapolis, MN) .

Resultados del ensayo de liberación de Histamina se presentan en la Figuras 31-33. La liberación de histamina se espera que aumente en la presencia de hlgE (JW8.5.13) y antígeno NP (11) -OVA ("NP"), a menos que se inhiba específicamente. La Figura 31 presenta datos de liberación de histamina en células RBL huFceRI a variantes concentraciones de TNP o NP (11) -OVA. En células RBL huFceRI, la liberación de histamina se activa por NP y hlgE. Como se espera, el anticuerpo biespecífico no afecta (es decir suprime o inhibe) la liberación de histamina en la ausencia de huFcYRIIB (ver "+hIgE+NP+biespecífico" , columna gris oscuro en el extremo derecho de cada muestra en la Figura 31 gráfica A) . La Figura 32 presenta datos de liberación de histamina en células RBL huFceRI+huFcYRIIBl y La Figura 33 presenta datos de liberación de histamina en células RBL huFceRI+huFc7RIIB2. En células RBL huFceRI+huFc7RIIBl y RBL huFceRI+huFc7RIIB2 , el anticuerpo biespecífico inhibe liberación de histamina (compare barra "+hIgE+NP" gris claro a barra gris oscuro "+hIgE+NP+biespecífico" en gráfica A de la Figura 32 ?· en gráfica A de la Figura 33) . La activación de liberación de histamina en todas las líneas celulares RBL es específica de antígeno en una forma dependiente de dosis a través de IgE humano ligado a FceRI humano. Células no se activaron eri la ausencia de IgE humano, ni se activaron cuando se disparan con un antígeno irrelevante (es decir TNP) . Adición de anticuerpo biespecífico 5A6/22E7 inhibe liberación de histamina (a niveles de fondo) en células RBL huFceRI+huFcYRIIBl y RBL huFceRI+huFc7RIIB2 , pero no en células RBL huFceRI indicando que la presencia de FCTRIIB es necesaria para función inhibitoria. Resultados similares se ven tanto por huFcYRIIBl como huFc7RIIB2 en la presencia de huFceRI. El anticuerpo biespecífico de la invención también inhibe la liberación de histamina inducida por anti-IgE en basófilos humanos primarios. Basófilos primarios se aislaron de seis donadores de sangre humana normales, de los cuales se obtuvo consentimiento informado. Se enriquecieron basófilos sangre humana utilizando un protocolo de sedimentación de dextrano. Brevemente, por cada 40 mi de sangre de donador a sedimentar, se mezclan en un tubo cónico de 50 mi, 375 mg de dextrosa, 5.0 mi de EDTA 0.1 M y 12.5 mi de dextrano clínico al 6%. Se divide la mezcla en dos tubos cónicos de 50 mi y agregan 20 mi de sangre por tubo. La sangre se deja que sedimente por 60-90 minutos, en ese tiempo, la capa de plasma se retira y centrifuga a 110 x g por 8 i minutos, 4 grados C y las células precipitadas' se retienen, resuspenden, lavan con PAG (dextrosa lg/L:lX PIPES, pH7.3 : albúmina de suero humano al 0.003%), y resuspenden en PAG. Las células se estimularon con anticuerpo anti-IgE ya sea como una preparación enriquecida con dextrano o después de subsecuente purificación utilizando separación de perlas magnéticas Miltenyi (Miltenyi Biotec, Auburn, CA; ver, por ejemplo, Kepley, C. et al., J. Allergy Clin. Immunol . 102:304-315 (1998)) por incubación a 37 grados C por una hora, seguido por centrifugación para precipitar o granular las células. El sobrenadante se retiene para análisis. Pueden aislarse basófilos por procedimientos estándar tales como los descritos por Kepley, C.L. et al., J. Allergy Clin. Immunol. 106(2): 337-348 (2000). Basófilos enriquecidos pueden además ser purificados por separación de perlas magnéticas (Miltenyi Biotec, Auburn, CA; Kepley, C. et al., J. Allergy Clin. Immunol. 102:304-315 (1998) y/o por clasificación de citometría de flujo (Kepley, C. et al. (1994), supra) . IgE anti-humano cabra se obtiene de Caltag (Caltag Laboratories, Burlingame, CA, USA) . Los basófilos aislados, que co-expre'san huFcYRIIB y huFceRI, se incubaron con anti-IgE (IgE antihumano cabra (Caltag Laboratories) ) o con la adición extra de anticuerpo biespecífico 5A6/22E7 por una hora a 37 grados C. Una dilución 1:100 (en volumen) de ahti-IgE cabra se utiliza para estimular los basófilos en la presencia de anticuerpo biespecífico 5A6/22E7 en el rango de 0 a 20000 ng/ml en la solución de prueba. La liberación de histamina se ensayó como se describió aquí previamente. La gráfica de barras de la Figura 62 indica que la liberación de histamina se indujo en la presencia de IgE anti-humano. La adición de anticuerpo biespecífico 5A6/22E7 inhibe la liberación de histamina en una forma aproximadamente dependiente de dosis. Hubo liberación de histamina de fondo limitada en la ausencia ya sea de anticuerpo o en la presencia de anticuerpo biespecífico 5A6/22E7 solo. Con base en el análisis de muestras de basófilos de seis donadores de sangre humana normales, la inhibición promedio de liberación ' de histamina por el anticuerpo biespecífico 5A6/22E7 fue 67% + 9. Se ha reportado que la liberación de histamina promedio de basófilos de pacientes Xolair® se inhibió a aproximadamente 50% después de 90 días (MacGlashan, D.W. et al., J. Immunol . 158:1438-1445 (1997) con base en la reducción de expresión FceRI. Estos resultados demuestran que un anticuerpo biespecífico anti-huFc7RIIB/anti-huFceRI es útil como una molécula terapéutica para inhibir rápidamente una reacción inmune (tales como liberación de histamina en basófilos) de 1 un I paciente humano al inhibir la actividad de FceRI a través de entrelazamiento con FcyRIIB. Un anticuerpo biespecífico anti-huFcYRIIB/anti-huFceRI también es útil en terapia de combinación con un anticuerpo anti-IgE. Por uso de terapia de combinación, un anticuerpo biespecífico anti-huFcYRIIB/anti-huFceRI actúa para inhibir rápidamente liberación de histamina al entrelazar con FcyRIIB seguido por reducción de la expresión de FceRI por el anticuerpo anti-IgE (tal como el anticuerpo anti-IgE Xolair®, Genentech, Inc.). 5.3 Entrelazamiento de huFceRI y huFcyRIIB por Anticuerpo Biespecífico El propósito de este ejemplo es mostrar la dependencia de inhibición de histamina ante co-entrelazamiento de FceRI humano y FCYRIIB humano en la superficie de células, por anticuerpo biespecífico 5A6/22E7. El método de ensayo se describe a continuación con resultados ilustrados adicionalmente en las Figuras 34-41. Células RBL huFceRI+huFc7RIIBl y RBL huFceRI+huFc7RIIB2 se incubaron por 24 horas a 37 grados C con 5 µg/ml de IGE humano específico NP y subsecuentemente lavaron tres veces con EMEM de medio fresco para retirar IgE humano especifico NP no ligado. Antes de adición a células RBL anticuerpo biespecífico 5A6/22E7 se preincuba por 30 minutos con huFceRIa 1 ECD purificado y huFc7RIIB ECD en diversas proporciones molares. Anticuerpo biespecífico 5A6/22E7 preincubado se agrega a medio de cultivo celular RBL a una concentración final de 5 g/ml de anticuerpo biespecífico 5A6/22E7 y además se incuba por 1 hora a 37 grados C.

Las células se activaron por incubación con ovalbúmina conjugada con NP por 1 hora a 37 grados ¡ C. Desgranulación asociada por activación se mide . al cuantificar liberación de histamina en el medio 1 de cultivo celular utilizando procedimientos ELISA descritos en general previamente. La dependencia de inhibición de liberación de histamina en entrelazamiento de FceRI humano y FCYRIIB humano por el anticuerpo biespecífico de la invención, se ilustra en la Figura 34 (para células RBL huFceRI+huFcYRIIBl) y en la Figura 36 (células ¡RBL huFceRI+huFc7RIIB2 ) . Enlace de anticuerpo biespecífico a células derivadas RBL también se estimó en la presencia , de huFceRIa ECD y huFc7RIIB ECD, utilizando citometría de flujo. Las células y materiales son como describió anteriormente. Las células se recolectan y clasifican en alícuotas de 105-10s células. Las células se lavaron y resuspendieron en amortiguador FACS (PBS con FCS) al 2%. Las células se lavaron por segunda vez y resuspendieron en amortiguador FACS suplementado con suero de rata al i %, 2 ¿¿g/ml de IgG humano y 1 µg/mL de anticuerpo i biespecifico biotinilado. Las células se incubaron por 30 minutos en hielo, lavaron y resuspendieron en amortiguador FACS con estreptavidina-PE . Después de incubación por 30 minutos adicionales en hielo, la mezcla se lava con amortiguador FACS frío, centrifuga y I resuspende en amortiguador FACS con yoduro de propidio al i 0.1%. Las muestras se analizaron por citometríaj de flujo y resultados se expresan como unidades de fluorescencia relativa (RFU = Relative Fluorescence Units) . Los resultados de estos estudios de enlace1 se ilustran en las Figuras 35, y 37-41, con proporcionesi de ECD a anticuerpo biespecífico indicadas. Las Figuras, 35 y 37 incluyen gráficas de datos de citometría de flujo para el enlace de anticuerpo biespecífico 5A6/22E7 a cualquiera de células RBL huFceRI+FcYRIIBl (Figura 35) o i células RBL huFceRI+Fc7RIIB2 (Figura 37) en la presentía de huFceRI ECD y huFciRIIB ECD. Como se espera, superiores proporciones de ECDs a anticuerpo biespecífico reducen el enlace del anticuerpo biespecífico a las células. Se compare el pico claro (célula ligada por BsAb en la presencia de ECDs) contra pico oscuro (control positivo-células ligadas por BsAb en la ausencia de ECDs) . i En las Figuras 38-41, se utiliza citometría de flujo para analizar enlace de anticuerpo biespecífico 5A6/22E7 a diversas células derivadas de RBL en la presencia de huFceRI ECD, huFcYRIIB ECD o tanto huFceRI ECD como huFcYRIIB ECD. En las Figuras 38-41, el pico negro es un receptor de superficie celular que liga 5A6/22E7 en la presencia de ECDs . Compare al pico gris claro (células no ligadas por BsAb) y el pico gris oscuro (células ligadas por BsAb en la ausencia de ECDs) . Como se espera, el enlace 5A6/22E7 a células RBL huFceRI (ver Figura 38) se bloquea al aumentar las concentraciones de huFceRI ECD, pero no huFcyRIIB ECD, con el bloqueo de ambos ECDs que tiene resultados similares a huFceRI ECD. Enlace 5A6/22E7 a células RBL huFcTRIIB (ver Figura 39) no se afecta por huFceRI ECD, con bloqueo por huFciRIIB ECD. Resultados de enlace similares se ven en células RBL huFceRI+huFcyRIIBl (Figura 40) y células RBL huFceRI+huFc7RIIB2 (Figura 41) . Como se espera, el enlace de 5A6/22E7 disminuye en una proporción de: V0 : 1 ya sea de huFceRI ECD o huFcYRI IB ECD, con bloqueo completo de 5A6/22E7 a RBL huFceRI+huFcyRI IB (1 o 2) células solo en una proporción de 10:1 (concentración de saturación) de ambos ECDs. Estos experimentos demuestran que la inhibición de liberación de histamina dependen de co-entrelazamiento de FceRI y FCYRIIB de superficie celular ya que no se observa inhibición de respuesta de histainina ante preincubación del anticuerpo biespecífico 5A6/22E7 con exceso molar de 10 veces de dominios extracelulares huFceRIo; y huFcyRIIB. Bajo estas condiciones, el enlace de anticuerpo biespecífico 5A6/22E7 a la superficie celular se bloqueó por completo, como se estima por citometría de flujo. Pre-incubación con menores proporciones molares de huFceRI ECD y huFcYRIIB ECD (2:2: 1, 1:1:1, o 0.1:0.1:1 huFceRI : huFciRIIB :biespecífico) llevó a bloqueo incompleto de enlace biespecífico 5A6/22E7 a células RBL e inhibición incompleta de liberación de histamina. Por lo tanto, la supresión de liberación de histamina en mastocitos requiere entrelazamiento de FceRIa y FC7RIIB de superficie celular . La inhibición de liberación de histamina por anticuerpo biespecífico 5A6/22E7 a concentraciones por debajo de saturación sugiere que una completa ocupación de los receptores no se requiere para lograr , la inhibición deseada. 5.4 Inhibición de anticuerpo biespecífico a concentraciones de sub-saturación Inhibición de anticuerpo biespecífico 5A6/22E7 de liberación de histamina y el enlace de células RBL 1 i. huFceRI+huFcYRIIBl , se mide a concentraciones por debajo i de la saturación de enlace por el siguiente método1 con resultados presentados en las Figuras 42-46. Células RBL huFceRI+huFcYRIIBl o RBL huFceRI+huFc7RIIB2 se incuban por 24 horas a 37 grados C con 5 g/ml de IgG humano específico NP y subsecuentemente lavan tres veces con medio fresco para retirar IgG humano específico NP no ligado. Antes de activación con antígeno, se incubaron adicionalmente células por 1 hora a 37 grados C con concentraciones variantes de anticuerpo biespecífico 5A6/22E7. Las células se dividieron para análisis por citometría de flujo o expresión de histamina. La extensión de enlace de anticuerpo biespecífico se estima por citometría de flujo como se describió anteriormente. La citometría de flujo se realiza utilizando concentraciones comparables de anticuerpo biespecífico biotinilado detectado con estreptavidina-PE . Las células preincubadas anteriores, se activaron por activación ya sea con 0.1 µg/ml o 1 /¿gVml de ovalbúmina conjugada con NP por una hora a 37 grádos C. Desgranulación asociada por activación se mide al cuantificar niveles de histamina liberados en el medio de cultivo celular como se describió anteriormente.

Los datos de liberación de histamina y enlace de anticuerpo biespecífico 5A6/22E7 para células 1 RBL huFceRI + huFc7RIIBl se presentan en las Figuras 42 y 43 respectivamente, mientras que la liberación de histamina y enlace de anticuerpo biespecífico 5A6/22E7 para células RBL huFceRI + huFc7RIIBl se presenta en las Figuras 44 y 45 respectivamente. La supresión de liberación de histamina a niveles de fondo se demuestra a concentración de anticuerpo biespecífico mayor a 0.0025 µg/mL en ambas células RBL huFceRI + huFcTRIIBl y células RBL huFceRI + huFcTRIIB2. Estudios de citometría de flujo de anticuerpo biespecífico a células RBL huFceRI+huFcYRIIBl y RBL huFceRI+huFc7RIIB2 indican que la saturación de enlace se alcanza a aproximadamente 2.5 µg/ml de anticuerpo biespecífico. La Figura 46 presenta titulación por citometría de flujo de anticuerpo biespecífico a partir de 0.1 µg/ml a 2.5 µg/ml a través de cuatro líneas celulares derivadas de RBL huFceRI, células, RBL huFcYRIIB, células RBL huFceRI + huFcYRIIBl, y células RBL huFceRI + huFc7RIIB2. El pico sólido corresponde a células ligadas con anticuerpo biespecífico biotinilado . Titulación de enlace de anticuerpo biespecífico a líneas celulares derivadas de RBL indica enlace del anticuerpo biespecífico a células RBL huFceRI + huFcYRIIBl1 y células RBL huFceRI + huFc7RIIB2 se disminuye a menores í concentraciones de anticuerpo biespecífico e indetectable a menos que 0.0025 /¿g/ml . Inhibición de anticuerpo biespecífico de liberación de RBL de histamina comd se muestra en las Figuras 42 y 44 se mantiene1 a concentraciones de anticuerpo biespecífico por debajo de i la saturación de enlace, utilizando dos concentraciones diferentes de estímulo de antígeno-NP. 1 5.5 Efectos Biespecífieos en Niveles { de Expresión de Superficie FeeRía Reducción de modulación de niveles de expresión FceRI en mastocitos y basófilos es un medio para reducir sensibilidad de mastocito y basófilo hacia activación inducida por antígeno y es un mecanismo por el cual un agente terapéutico puede tener un efecto benéfico en asma o alergia. La habilidad del anticuerpo biespecífico para modular niveles de expresión de superficie de FceRI,' se I estima al realizar experimentos de aumento y disminución de expresión de FceRI inducido por IgE en la presencia y ausencia de anticuerpo biespecífico utilizando los siguientes procedimientos. Células RBL huFceRI+huFcYRIIBl y RBL huFceRI+huFcYRIIB2 se incuban con 1 µg/ml de U266 IgE (ATCC TIB196) en la presencia o ausencia de 2 g/ml de anticuerpo biespecífico por 1, 2, 3, o 7 días. 'Las ? Figuras 47 y 48 muestran que las concentraciones| de anticuerpo biespecífico 5A6/22E7 e IgE permanecen sin cambio, como se detecta por ELISA utilizando IgG 1 humano e IgE para detección durante el curso de tiempo de 7 días, indicando que los reactivos no se agotaron del medio de cultivo celular. Niveles totales de FceRI humano en superficie de células se determinaron por citometría de flujo utilizando un anticuerpo contra IgE humano, (Caltag Laboratories) después de' saturación de todos los receptores FceRI en hielo con U266 IgE. Datos de citometría de flujo para aumento de expresión de FceRI se ilustran en las Figuras 49-54. Anticuerpo biespecífico no tiene efecto en aumento de expresión inducida por IgE de niveles de expresión de superficie FceRI en dos muestras de células RBL huFce'RI, como se muestra en las Figuras 49 y 50, y en 2 muestras de células RBL huFceRI+huFcYRIIBl , como se muestra en las Figuras 51 y 52. Sin embargo, anticuerpo biespecífico disminuyó la extensión de aumento de expresión FceRI ante co-entrelazamiento de huFceRI y huFcYRIIB2 en dos muestras de células RBL huFceRI+huFc7RIIB2 como ' se ilustra en las Figuras 53 y 54. El efecto de anticuerpo biespecífico en reducción de la expresión FceRIa después de retirar IgE, i también se midió con resultados mostrados en las Figuras 55-57. FceRIa en células RBL se incrementa la expresión i por 7 días con 1 de U266 IgE. El IgE después se lava por arrastre del medio de cultivo celular y se observa la disminución de expresión FceRIa por citometría de flujo en la presencia o ausencia de anticuerpo biespecífico a l, 2, 3, y 7 días después de retirar IgE. Anticuerpo biespecífico no tuvo efecto en reducción de la expresión de FceRIa en células RBL huFceRI y RBL huFceRI+huFc7RIIBl , como se muestra en la Figuras 55 y 56. Sin embargo, la velocidad de reducción de la expresión de FceRIa se incrementó por anticuerpo biespecífico en células RBL huFceRI+huFcYRIIB2 como se muestra en la Figura 57. El experimento utilizando células RBL huFceRI+huFcYRIIB2 se repitió, pero anticuerpo biespecífico 5A6/22E7 se agrega en la presencia de IgE a cero, tres o cuatro días (ver Figura 63) . Los resultados muestran que el anticuerpo biespecífico disminuye la expresión inducida por IgE de FceRI en estas células. También se descubrió por estos estudios que la isoforma huFcYRIIBl no reduce la expresión de huFceRI. Estos estudios indican que el anticuerpo biespecífico puede disminuir el nivel de expresión superficial de FceRI en mastocitos y basófilos ante co-entrelazamiento de FceRI con la isoforma B2 de FcyRIIB. Datos RT-PCR de huFceRIa, FcyRIIBl, FCYRIIB2, huRPL19 (control) , y FceRIa de rata, expresión mRNA en mastocitos: RBL huFceRI (designado huFcERIa) , células RBL huFceRI+FcyRIIBl (designado huFcGRIIbl) , y células RBLhuFce+FCYRIIB2 (designado huFcGRIIb2) ; y en basófilos humanos de tres donadores diferentes. Identificación RT-PCR de tiempo real de isoformas FCYRIIBI y FC7RIIB2 se realiza en mRNA preparado a partir de basófilos de sabgre periférica purificada de tres donadores humanos diferentes. Basófilos de sangre humana se aislaron de 100 mi de sangre utilizando purificación de perlas magnéticas (equipo de aislamiento de basófilos humanos MACs (MACs human basophil isolation kit) Miltenyi) . mRNA de 106 basófilos se prepara utilizando el RNeasy™ (Qiagen) . Los siguientes conjuntos de cebador/sonda empleados para análisis RT-PCR de tiempo real se citan en la Tabla 2. Tabla 2. Adelante: GGT GAA GCT CTC AAG TAC TGG TAT (SEQ ID NO: 12) huFceRI Inverso: GTA GGT TCC ACT GTC TTC AAC TGT (SEQ ID NO: 13) Sonda: AGA ACC ACA ACA TCT CCA TTA CAA ATG CC (SEQ ID NO: 14) RNA se analizó en el sistema de detección de secuencia ABI PRISM® 7700 utilizando TaqMan® One-Step'RT-PCR Master Mix (Applied Biosystems) siguiendo el protocolo recomendado por el fabricante. Ambas isoformas Bl y B2 de FC7RIIB se expresan en basófilos humanos como se muestra en las Figuras 58-61, la habilidad demostrada del anticuerpo biespecífico para reducir los niveles de expresión de superficie FceRI cuando se co-entrelaza a FCYRIIB2 en células hace métodos de utilizar el anticuerpo biespecífico anti -FcyRIIB-anti -FceRI de la invención, particularmente útiles para tratamiento de pacientes que experimentan un desorden para el cual la inhibición y/o reducción de FceRI proporcionan alivio de ese desorden. 5.6 El anticuerpo biespecífico inhibe liberación de citocina en línea celular RBL La liberación de citocina MCP-1 (protelna quimiotáctica monolito-1) , IL-4 (interleucina-4) , y TNF-a (factor de necrosis de tumor ) se inhibe en la presencia de anticuerpo biespecífico anti-FcYRIIB-anti-Fc!eRI 5A6/22E7 como se demuestra por el siguiente ensayo. Células RBL se transíectaron con cDNA que codifica huFc7RIIB2 o huFcYRIIBl y huFceRI y cultiva de acuerdo con los procedimientos descritos anteriormente en este ejemplo 5. Se estimularon células para liberar citocinas por exposición a ovalbúmina conjugada con nitrofénol (NP) (NP(ll)-OVA) y un IgE (IgE humano anti-NP) como se describe en este ejemplo 5 para el ensayo de liberación de histamina. El anticuerpo biespecífico 5A6/22E7 se agrega a las muestras de prueba a una concentración de 5 µg/ml . Detección y cuantificación de cada una de las citocinas de interés se realizan como sigue para las citocinas de interés. CP-1 y IL-4 se detectaron utilizando un Beadlyte Rat Multi -cytokine Beadmaster kit (No. de catálogo 48-200, Upstate, Charlottesville , VA, USA) . Se detectó TNF alfa de rata utilizando un anti-rata TNF alpha ELISA kit de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los ensayos se realizaron de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La Figura 64 ilustra los resultados para liberación de citocina en células RBL transíectadas con huFc7RIIB2 y huFceRI, aunque los resultados fueron los mismos para células RBL transíectadas con huFcYRIIBl y huFceRI. La liberación de citocina de mastocitos de rata, se inhibe en la presencia de anticuerpo biespecífico 5A6/22E7 (5 µg/ml, barras claras) , mientras que la liberación de citocina no se inhibió y aumentó durante un periodo de cinco horas en cultivo celular (barras oscuras) . 5.7 El anticuerpo biespecífico inhibe síntesis y liberación de metabolitos de ácido araquidónico en I línea celular RBL La presencia de alérgeno inicia múltiples inmunorespuestas , incluyendo la liberación de los así denominados mediadores inflamatorios "pre-formados" tales como histamina para mastocitos, la producción de ácido araquidónico y su conversión en los así denominados mediadores "eicosanoides" tales como prostaglandinas y la producción y liberación de citocinas y quimiocinas. Mediadores pre-formados se liberan inmediatamente ante exposición, mientras que mediadores eicosanoides se retrasan aproximadamente 30 minutos a 2 horas y citocinas y quimiosinas se retrasan aproximadamente 5 a 24 horas . Uno de los mecanismos de defensa del cuerpo, referido como la cascada de ácido araquidónico, produce tres mediadores inflamatorios recientemente formados-prostaglandinas , tromboxanos y leucotrienos—que se conocen colectivamente como eicosanoides. La liberación de metabolitos de ácido arquidónico se supervisa para probar la habilidad del anticuerpo biespecífico 5A6/22E7 para inhibir este efecto corriente abajo de exposición al alérgeno. Células RBL se transíectaron con cDNA que codifica huFc7RIIBl o huFcYRIIB2 y huFceRI y cultivan como se describió anteriormente en este Ejemplo 5. La cascada de ácido araquidónico se estimuló por exposición a ovalbúmina conjugada con nitrofenol (NP) (NP (11) -OVA) como un antígeno en combinación con un IgE (IgE humano I anti-NP) como se describe en este Ejemplo 5 paral el i ensayo de liberación de histamina. La cuantificación del metabolito leucotrieno C4 (LTC4) se realiza con un kit EIA (catálogo #520211, Cayman Chemical Company, Ann Arbor, MI, USA) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La cuantificación del metabolito prostaglandina D2 (PGD2) se realiza con un MOX EIA kit (catálogo #212011 (Cayman Chemical Company, supra) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los resultados en la Figura 65 mostraron que en células RBL que expresan huFc7RIIBl y FceRI, el metabolismo de ácido araquidónico, como se evidencia por la producción de LTC4 y PGD2 , aumenta con el tiempo en la presencia de IgE más antígeno, pero no en la presencia de un antígeno irrelevante (TNP (11) -OVA) . En la presencia de 5 µg/ml del anticuerpo biespecífico 5A6/22E7, el metabolismo de ácido araquidónico fue inhibido. Los mismos resultados se obtienen utilizando células RBL que expresan huFc7RIIB2 y FceRI (datos no mostrados) . Estos resultados demuestran que una ruta inmune importante se inhibe por el anticuerpo biespecífico anti-FcYRIIB-anti-FceRI . 5.8 El anticuerpo biespecífico inhibe supervivencia de mastocitos inducida por IgE supervivencia de mastocitos derivados médula ósea humana (huBMMC) se induce por IgE muro.no. Para probar si el anticuerpo biespecífico 5A6/22E7 inhibe esta supervivencia, puede realizarse el siguiente ensayo. Células madre progenitoras hematopoyéticas humanas (CD34+) se obtuvieron de Allcells (catálogo # AB 012, Allcells, LLC, Berkeley, CA, USA) . Las células de cada uno de tres donadores se cultivaron dos semanas en medio libre de suero StemPro-34® (Gibco Cell Culture Systems, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) que contiene IL-3 (a 30 ng/ml) , IL-6 (a 200 ng/ml) y factor de célula madre (SCF, a 100 ng/ml) . La supervivencia de mastocitos se estima por tinción de Annexina/7-AAD (7-Amino-Actinomicina D) (BD/Pharmingen flow cytometry kit, Becton Dickenson & Company, Franklin Lakes, NJ, USA) bajo las siguientes condiciones de prueba: (1) medio StemPro® solo, (2) medio StemPro® + 30 ng/ml de IL-3, 200 ng/ml IL-6, y ilOO ng/ml de SCF, (3) medio StemPro® + 5 g/ml de SPE-7 (anticuerpo monoclonal anti-DNP de IgE de ratón (SPE-7, Sigma, St. Louis, MO, USA), (4) medio StemPro® + 5 ^g/ml de SPE-7 desnaturalizado, hervido, y (5) medio StemPro® + 5 /¿g/ml SPE-7 + 5 µg/ml de anticuerpo biespecífico 5A6/22E7. La superviviencia celular se supervisa por 10 días después del periodo de cultivo de dos semanas inicial. Se mantuvieron células a 37 grados C, C02 al 5% durante ambas fases. En un tiempo entre 4 y 7 días I I Ii después del inicio de cultivo de prueba, se determinó la supervivencia celular. El por ciento promedio , de i inhibición de supervivencia celular para muestras de células de tres donadores, fue 65% ± 9. Estos resultados indican que la inhibición de actividad de receptor FceRI por entrelazamiento con receptor FCYRIIB utilizando un anticuerpo biespecífico anti-Fc7RIIB-anti-FceRI , inhibe la superviviencia inducida por IgE murina de mastocitos derivados de médula ósea humana. La especificación, ejemplos y datos anteriores, proporcionan una descripción completa de la fabricación y uso de la composición de la invención. Ya que muchas modalidades de la invención pueden realizarse sin apartarse del espíritu y alcance de la invención, la invención reside en las reivindicaciones anexas a continuación .

Claims (86)

1. REIVINDICACIONES 1. Un polipéptido o anticuerpo de enlace de antígeno aislado, que comprende al menos uno, dos, tres, cuatro, cinco o seis CDRs seleccionados del grupo que consiste de: SEQ ID N0:1, 2, 3, 4, 5, y 6, en donde el anticuerpo liga selectivamente al receptor FCYRIIB.
2. 2. El anticuerpo o polipéptido de enlace de antígeno aislado de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque los CDRs de cadena pesada del anticuerpo o polipéptido de enlace de antígeno comprenden SEQ ID NO:l y/o SEQ ID NO: 2 y/o SEQ ID NO : 3.
3. 3. El anticuerpo o polipéptido de enlace de antígeno aislado de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque los CDRs de cadena ligera del polipéptido o anticuerpo de enlace de antígeno comprenden SEQ ID NO: 4 y/o SEQ ID NO : 5 y/o SEQ ID NO: 6.
4. 4. El anticuerpo o polipéptido de enlace de antígeno aislado de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el polipéptido o anticuerpo de enlace de antígeno comprende un dominio variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 7.
5. 5. El anticuerpo o polipéptido de enlace de antígeno aislado de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el polipéptido o anticuerpo de enlace de antígeno comprende un dominio variablei de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8.
6. 6. El anticuerpo o polipéptido de enlace de antígeno aislado de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el polipéptido o anticuerpo de enlace de antígeno comprende las secuencias de aminoácidos SEQ ID NOs : 7 y 8.
7. 7. El polipéptido o anticuerpo de enlace de antígeno de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el polipéptido o anticuerpo de enlace de antígeno es un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo quimérico, o un anticuerpo humanizado o su fragmento .
8. 8. El polipéptido o anticuerpo de enlace de antígeno de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el polipéptido o anticuerpo de enlace de antígeno antagoniza el enlace de una región Fe de anticuerpo a FCYRIIB.
9. 9. El polipéptido o anticuerpo de enlace de antígeno de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque tiene las características de enlace de un anticuerpo producido de una línea celular de hibridoma que tiene el número de acceso ATCC PTA-4614.
10. 10. Un polipéptido o anticuerpo de enlace de I antígeno aislado que tiene las características de enlace de un anticuerpo producido a partir de una línea celular de hibridoma que tiene el número de acceso ATCC PTA-4614.
11. 11. Un anticuerpo aislado, o fragmento polipéptido de enlace de antígeno del mismo, producido a partir de una línea celular de hibridoma que tiene el número de acceso ATCC PTA-4614.
12. 12. Un método para reducir la actividad FCYRIIB que comprende: ligar FCYRIIB con un polipéptido o anticuerpo de enlace de antígeno de la reivindicación 1.
13. 13. El método de conformidad con la reivindicación 12 caracterizado porque la actividad FCYRIIB se reduce al reducir la actividad FCYRIIA.
14. 14. Un método de tratamiento de una enfermedad o desorden en un mamífero, caracterizado porque comprende: a) administrar un polipéptido, anticuerpo de enlace de antígeno o agente quimioterapéutico; y b) administrar un polipéptido o anticuerpo de enlace de antígeno de conformidad con la reivindicación 1.
15. 15. Un método para tratar una enfermedad o desorden en un mamífero, que comprende la administración de un polipéptido o anticuerpo de enlace de antígeno de conformidad con la reivindicación 1.
16. 16. Un anticuerpo biespecífico aislado, caracterizado porque comprende: a) un primer polipéptido I o anticuerpo de enlace de antígeno de conformidad con la reivindicación 1; y b) un segundo polipéptido o anticuerpo de enlace de antígeno que liga específicamente un receptor de activación.
17. 17. El anticuerpo biespecífico aislado de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque el segundo polipéptido o anticuerpo de enlace de antígeno liga FceRI.
18. 18. El anticuerpo biespecífico aislado de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque el segundo polipéptido o anticuerpo de enlace de antígeno es un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo quimérico o anticuerpo humanizado o su fragmento.
19. 19. El anticuerpo biespecífico aislado de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque los CDRs de cadena pesada 1, 2, y 3 del primer polipéptido o anticuerpo de enlace de antígeno, comprenden las secuencias SEQ ID NOs : 1 , 2, y 3, respectivamente .
20. 20. El anticuerpo biespecífico aislado de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque los CDRs de cadena ligeral, 2, y 3 del primer polipéptido o anticuerpo de enlace de antígeno comprenden las secuencias SEQ ID NO: 4, 5, y 6, respectivamente.
21. 21. El anticuerpo biespecífico aislado de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque el primer polipéptido o anticuerpo de enlace de antígeno comprende una cadena pesada de dominio variable que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO : 7.
22. 22. El anticuerpo biespecífico aislado de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque el primer polipéptido o anticuerpo de enlace de antígeno comprende una cadena ligera de dominio variable que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8.
23. 23. El anticuerpo biespecífico aislado de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque el primer polipéptido o anticuerpo de enlace de antígeno tiene las características de enlace de un anticuerpo producido a partir de una línea celular de hibridoma que tiene el número de acceso ATCC PTA-4614.
24. 24. Un método para tratamiento de una enfermedad o desorden en un mamífero que comprende la administración de un anticuerpo de cualquiera de , la reivindicación 16.
25. 25. Un anticuerpo biespecífico aislado que comprende: a) un primer polipéptido o anticuerpo de enlace de antígeno producido a partir de una línea celular de hibridoma que tiene el número de acceso ATCC I I I PTA-4614 o su fragmento, o un anticuerpo quimérico o anticuerpo humanizado, derivados del primer anticuerpo, o su fragmento, que liga selectivamente FCYRIIB; y b) 1 un segundo polipéptido o anticuerpo de enlace de antígeno que liga específicamente un receptor de activación.
26. 26. El anticuerpo biespecífico aislado, de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado porque el segundo polipéptido o anticuerpo de enlace de antígeno es un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo humanizado o su fragmento.
27. 27. El anticuerpo biespecífico aislado de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado porque el primer polipéptido o anticuerpo de enlace, de antígeno o su fragmento, comprende CDRs de cadena pesada o ligera del anticuerpo producido de una línea celular de hibridoma que tiene el número de acceso ATCC PTA-4614.
28. 28. El anticuerpo biespecífico aislado de I conformidad con la reivindicación 25, caracterizado porque el primer polipéptido o anticuerpo de enlace1 de antígeno, o su fragmento, comprende CDRs de cadena pesiada y ligera del anticuerpo producido de la línea celular' de I hibridoma con número de depósito ATCC PTA-4614.
29. 29. El anticuerpo biespecífico aislado de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado porque el primer anticuerpo, o su fragmento o segundo i 1 I anticuerpo, o su fragmento es un fragmento de anticuerpo seleccionado del grupo que consiste de Fab, Fab', Fab2, Fab'2, Fd, Fd', scFv, scFv2, dAb.
30. 30. El anticuerpo biespecífico aislado de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque el receptor de activación es un receptor IgE.
31. 31. El anticuerpo biespecífico aislado de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque el receptor IgE es FceRI.
32. 32. El anticuerpo biespecífico aislado de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque el primer anticuerpo se liga covalentemente al segundo anticuerpo.
33. 33. El anticuerpo biespecífico aislado de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque el primer y segundo polipeptidos o anticuerpos de enlace de antígeno se ligan covalentemente mediante un enalazador que comprende al menos cinco amino ácidos.
34. 34. El anticuerpo biespecífico aislado de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque el anticuerpo biespecífico comprende una región bisagra de cadena pesada variante incapaz de enlace disulfuro intercadena pesada.
35. 35. El anticuerpo biespecífico aislado de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado I I i porque el primer polipéptido o anticuerpo de enlace de antígeno, liga FCYRIIB humano y demuestra poco o ningún enlace a FcyRIIA humano.
36. 36. El anticuerpo biespecífico aislado de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado porque el receptor de activación es un receptor IgE.
37. 37. El anticuerpo biespecífico aislado de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado porque el receptor de activación es FceRI.
38. 38. El anticuerpo biespecífico aislado de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado porque el primer anticuerpo se ligan covalentemente al segundo anticuerpo.
39. 39. El anticuerpo biespecífico aislado de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado porque el primer y segundo polipéptidos o anticuerpos de enlace de antígeno se ligan covalentemente mediante un enlazador que comprende al menos cinco amino ácidos.
40. 40. El anticuerpo biespecífico aislado de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado porque el anticuerpo biespecífico comprende una región bisagra de cadena pesada variante incapaz de enl|ace disulfuro inter-cadena pesada.
41. 41. El anticuerpo biespecífico aislado de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado I I porque el primer polipéptido o anticuerpo de enlacé de antígeno, liga FcyRIIB humano y demuestra poco o ningún enlace a FCYRIIA humano.
42. 42. Un método para inhibir una inmuno respuesta en un mamífero, que comprende administrar un anticuerpo biespecífico de la reivindicación 16.
43. 43. Un método para suprimir liberación de histamina asociada con una inmunorespuesta en un mamífero, caracterizado porque comprende administrar un anticuerpo biespecífico de la reivindicación 16.
44. 44. Un método de conformidad con la reivindicación 43, caracterizado porque la liberación de histamina se asocia con alergia, asma o inflamación.
45. 45. Un método para activar FcyRIIB en una célula de mamífero, caracterizado porque comprende: a) contactar una célula que expresa FCYRIIB con un anticuerpo biespecífico de acuerdo con la reivindicación 16; y b) coagregar el FCYRIIB y un receptor de activación con el anticuerpo biespecífico, de esta manera activando el FCYRIIB.
46. 46. Un método de conformidad con la reivindicación 45, caracterizado porque el receptor de activación comprende un motivo de activación ITAM.
47. 47. Un método de conformidad con la reivindicación 46, caracterizado porque el receptor de activación es FceRI.
48. 48. Un método de conformidad con la reivindicación 47, caracterizado porque la coagregación de FCYRIIB y FceRI reduce la expresión de FceRI.
49. 49. Un método de conformidad con la reivindicación 48, caracterizado porque las células son células B o mastocitos.
50. 50. Un método de conformidad con la reivindicación 48, caracterizado porque las células son células humanas.
51. 51. Un método para inhibir expresión de receptor FceRI en una célula al administrar una célula que comprende el receptor FceRI y el receptor FcyRIIB una cantidad efectiva del anticuerpo biespecífico de la reivindicación 16.
52. 52. Un método de conformidad con la reivindicación 45, caracterizado porque la célula es una célula de un mamífero que experimenta un desorden aliviado por inhibición de expresión de FceRI en 1 la célula.
53. 53. Un método de conformidad con la reivindicación 52, caracterizado porque el desorden es un desorden crónico.
54. 54. Un método de conformidad con la reivindicación 53, caracterizado porque el mamífero es, un i I humano .
55. 55. Un método de conformidad con la reivindicación 53, caracterizado porque el desorden es ateriosclerosis ; deficiencia de adhesión de leucocitos; artritis reumatoide; lupus sistémico eritematoso (SLE) ; diabetes mellitus; esclerosis múltiple; síndrome de Reynaud; tiroiditis autoinmune; encefalomielitis alérgica; síndrome de Sjorgen; y diabetes de inicio juvenil .
56. 56. Un método de conformidad con la reivindicación 45, caracterizado porque el método mejora el tratamiento de un desorden crónico asociado con una actividad FceRI.
57. 57. Un método para activar FC7RIIB en una célula de mamífero, caracterizado porque comprende O contactar una célula que expresa FCYRIIB con una anticuerpo biespecífico de acuerdo con la reivindicación 25; y d) coagregar el FCYRIIB y un receptor de activación con el anticuerpo biespecífico, de esta manera activando el FCYRIIB.
58. 58. Un método de conformidad con la reivindicación 57, caracterizado porque el receptor de activación comprende un motivo de activación ITAM.
59. 59. Un método de conformidad con la reivindicación 57, caracterizado porque el receptor 1 de ! activación es FceRI.
60. 60. Un método de conformidad con la reivindicación 59, caracterizado porque la coagregación de FcyRIIB y FceRI reduce la expresión de FceRI.
61. 61. Un método de conformidad con la reivindicación 57, caracterizado porque las células son células B o mastocitos.
62. 62. Un método de conformidad con la reivindicación 61, caracterizado porque las células son células humanas.
63. 63. Un método para inhibir expresión del receptor FceRI en una célula, al administrar a una célula que comprende el receptor FceRI y el receptor FcyRIIB, una cantidad efectiva del anticuerpo biespecífico de la reivindicación 25.
64. 64. Un método de conformidad con la reivindicación 57, caracterizado porque la célula es una célula de un mamífero que experimenta un desorden aliviado por inhibición de expresión de FceRI en la célula.
65. 65. Un método de conformidad con ? la reivindicación 64, caracterizado porque el desorden esl un desorden crónico.
66. 66. Un método de conformidad con la reivindicación 64, caracterizado porque el mamífero esj un í . humano .
67. 67. Un método de conformidad con la reivindicación 64, caracterizado porque el desorden es ateriosclerosis ; deficiencia de adhesión de leucocitos; artritis reumatoide; lupus sistémico eritematoso (SLE) ; diabetes mellitus; esclerosis múltiple; síndrome de Reynaud; tiroiditis autoinmune; encefalomielitis alérgica; síndrome de Sjorgen; y diabetes de inicio i juvenil.
68. 68. Un método de conformidad con ^ la reivindicación 57, caracterizado porque el método mej'ora el tratamiento de un desorden crónico asociado Icón actividad FceRI.
69. 69. Una composición que comprende 1 un anticuerpo biespecífico anti-Fc7RIIB/anti-FceRI y un portador farmacéutico para uso terapéutico, en combinación con un polipéptido de enlace anti-IgE o anticuerpo anti-IgE.
70. 70. La composición de conformidad con 1 la reivindicación 69, caracterizada porque la región de enlace anti-FcyRIIB comprende al menos uno, dos, tres, cuatro, cinco, o seis CDRs seleccionados del grupo que consiste de SEQ ID NOs : 1, 2, 3, 4, 5, y 6.
71. 71. La composición de conformidad con la reivindicación 69, caracterizada porque además comprende un anticuerpo anti-IgE o polipéptido de enlace anti-IgE.
72. 72. La composición de conformidad con la reivindicación 69, caracterizada porque el anticuerpo anti-IgE es Xolair®.
73. 73. La composición de conformidad con la reivindicación 71, caracterizada porque el anticuerpo anti-IgE es Xolair®.
74. 74. Un equipo que comprende la composición de conformidad con la reivindicación 69, caracterizado porque además comprende una etiqueta que indica qué el I anticuerpo biespecífico es para administración ¡ en combinación con un anticuerpo anti-IgE o polipéptido de enlace anti-IgE para el tratamiento de alergia, asma, ly/o inflamación en un mamífero.
75. 75. El equipo de conformidad con la reivindicación 74, caracterizado porque el mamífero es un humano . '
76. 76. El equipo de conformidad con la reivindicación 75, caracterizado porque la administración del anticuerpo biespecífico se separa del anticuerpo anti-IgE o polipéptido de enlace anti-IgE.
77. 77. El equipo de conformidad con la reivindicación 76, caracterizado porque la administración del anticuerpo biespecífico es simultánea con ; la administración del anticuerpo anti-IgE o polipéptido de enlace anti-IgE.
78. 78. El equipo de conformidad con 1 la reivindicación 74, caracterizado porque el anticuerpo anti-IgE es Xolair®.
79. 79. Un equipo que comprende la composición de conformidad con la reivindicación 71, caracterizado i porque además comprende una etiqueta que indica que, el anticuerpo biespecífico y anticuerpo anti-IgE o el polipéptido de enlace anti-IgE son para el tratamiento de alergia, asma y/o inflamación en un mamífero.
80. 80. El equipo de conformidad con la reivindicación 79, caracterizado porque el mamífero es un humano .
81. 81. El equipo de conformidad con la reivindicación 80, caracterizado porque el anticuerpo anti-IgE es Xolair®.
82. 82. Un método para tratamiento que comprende administrar un anticuerpo biespecífico FcYRIIB/anti-FceRI en combinación con un anticuerpo anti-IgE o polipéptido de enlace anti-IgE a un mamífero que experimenta l un i desorden seleccionado del grupo que consiste de alergia, asma y inflamación.
83. 83. El método conformidad con la reivindicación 82, caracterizado porque la administración del anticuerpo biespecífico y el anticuerpo anti-IgE o, el polipéptido de enlace anti-IgE, es separada. j
84. 84. El método conformidad con la reivindicación 82, caracterizado porque la administración del anticuerpo biespecífico y el anticuerpo anti-IgE o polipéptido de enlace anti-IgE es simultánea.
85. 85. El método conformidad con la reivindicación 82, caracterizado porque el mamífero es1 un humano .
86. 86. El método conformidad con la reivindicación 82, caracterizado porque el anticuerpo anti-IgE y polipéptido de enlace anti-IgE es Xolair®. ' I