ME01002B - Vakcina i imunogenične kompozicije za virus plavog jezika, postupci za njihovu upotrebu i postupci za njihovu izradu - Google Patents

Abstract

Obezbeđene su imunogenične kompozicije i kompozicije vakcine ipostupci za njihovu izradu i upotrebu, pri čemu su kompozicije efektivne uzaštiti od maksimalnog umanjivanja ozbiljnosti, prevenciji i/ili odlaganjuinfekcije preživara sa virusom plavog jezika. Primena najmanje jedne dozekompozicije dvostruko inaktiviranog virusa plavog jezika sa adjuvantom naživotinji, kako je ovde otkriveno, je efikasna u obezbeđivanju imunitetaživotinje i zaštiti od infekcije sa virusom plavog jezika, na taj načinredukujući ozbiljnost i/ili prevenciju oboljenja izazvanih jednim ili višesojeva ili serotipova virusa plavog jezika.

Description

POLJE PRONALASKA

Pronalazak se odnosi na vakcinu i imunogeničnu kompoziciju za imunizaciju preživara na patogene sojeve i serotipove virusa plavog jezika (BTV) i na postupak za izradu vakcine i imunizaciju preživara sa ovim kompozicijama.

POREKLO PRONALASKA

Plavi jezik, virusno oboljenje antropoda, napada goveda, ovce, koze i divlje preživare. Lezije plavog jezika kod napadnutih životinja slične su virusnoj dijareji kod inficiranih goveda, virusnom vezikularnom stomatitisu, malignoj kataralnoj groznici, mikotičnom stomatitisu, stočnoj kugi. fotosenzitivnosti i oboljenju nogu i usta. Sumnja se da virus plavog jezika (BTV) izaziva hidraencefaliju kod goveda i neplodnost, pobačaj i rađanje mladih sa defektom kod goveda i ovaca. U literaturi je navedeno dvadeset i četiri serotipa koji izazivaju problem u rasponu od nejasne infekcije do akutne nagle infekcije. Poznato je hronično, perzistentno prenošenje virusa kod goveda. Kod životinja sa BTV je uočen značajan gubitak u telesnoj snazi a prodaja zaklanih životinja može da bude otežana. Kod ovaca inficiranih sa BTV, umanjenje rast vune zbog krzanja vune, što dovodi do manjeg prinosa ili oštećenog runa. Značajna slabost u toku BTV infekcija može da dovede do slabljenja otpornosti na sekundarne bakterijske ili klamidijalne infekcije i drugih predatomih faktora. Ovo se takođe negativno odražava na reproduktivnu efikasnost inficiranih životinja.

Kod inficiranih životinja se dešavaju abortusi i mladunci sa defektima, a neke životinje mogu da budu neplodne u jednoj ili više sezoni razmnožavanja. Najveća šteta koja nastaje kao posledica infekcije plavog jezika je ekonomski gubitak koji nastaje zbog zabrane i strogih zahteva testiranja koji su nametnuti proizvođačima i izvoznicima goveda, semene tečnosti goveda i ovaca iz endemičnih oblasti sa plavim jezikom.

Pod prirodnim uslovima, transmisija virusa se dešava preko ujeda najmanje četiri soja Culicoides, na primer, pešćane mušice, komaraca. Biološka transmisija BTV između goveda i ovaca istim vektorom kulikoida je pokazana eksperimentalno (Luedke i saradnici, 28 AJVR 457 (1967)). Goveda, ovce i brojne vrste divljih preživara mogu da igraju ulogu skladišta BTV stvarajući uslove za preživljavanje virusa u toku zime. Perzistentna BTV viremija, koja može da traje i do tri godine je identifikovana kod goveda (Hourrigan, 51 Aust Vet J 170 (1975)). Kada se BTV jedanput ustanovi u zemlji, virus je virtuelno nemoguće iskoreniti (Erasmus, 51 Aust Vet J 209). Etiološko sredstvo za plavi jezik pripada familiji Reoviridae, rodu Orbivirus.

Virusnu etiologiju plavog jezika je ustanovio Theiler, 1906, (Erasmus, 51 Aust Vet J 165 (1975)). Od tada se pojavilo nekoliko izveštaja u literature koji (a) potvrđuju izolovanje virusa plavog jezika iz goveda, ovaca, koza i brojnih divljih preživara i (b) potvrđuju kliničke i patološke karakteristike bolesti plavog jezika i (c) opisuju infekcije koje nastaju od različitih BTV serotipova. Na primer, videti Onderstepoort (J Vet Sci Anim Indus 7 (1944); Komarov and Goidsmit, Refuah Vet 96 (1951); Priče and Hardy, 124 J Am Med Assn 255 (1954); Shope i saradnici, 111 J Exp Med 155 (1960); Livingston and Hardy, 25 AJVR 1958 (1964); Luedke i saradnici, 30 AJVR 511 (1969); Hourrigan i saradnici, 51 Aust Vet J 170 (1975). Imunološku kontrolu plavog jezika u Sjedinjenim Državama je prvi put pokušao McKercher sa saradnicima 118 AJVR 310 (19 75), sa BTV Internacionalnom serotip 10 vakacinom razvijenom u zametku kokošijih jaja. Nakon toga je Alexander, (J V et Sci Indus 231 (1947)), konfigurisao ovaj produkt i prvi je uspeo u razmnožavnju virusa plavog jezika u embrionu pileta.

Rani protokoli vakcinacije su rutinski izvođeni u Južnoj Africi i Izraelu koristeći vakcinu iz jajeta zaraženog polivalentnim živim virusom koja sadrži brojne sojeve plavog jezika. Vakcina adaptiranog jajeta, koja je produkovana u Cutter laboratorij ama i korišćena u sjedinjenim Državama je povučena sa tržišta zbog ozbiljnih reakcija vakcinisanih ovaca. Nakon toga, Kemeny and Drehle, 22AJVR 921 (1961), su prilagodili BTV internacionalni tip 10 iz jaja u ćelijskim kulturama bubrega govečeta. Ova vakcina sa modifikovanim živim virusom, koju proizvodi Colorado Serum Company, se koristi za ovce u Sjedinjenim Državama.

Postoji potreba za poboljšanjima u razvoju vakcina za upotrebu u imunizaciji preživara, posebno ovaca i jagnjadi, protiv virusa plavog jezika. Ovaj pronalazak je odgovor

na tu potrebu. Citati bilo kojih ovde datih referenci ne treba da se smatraju priznanjem da su takve reference raspoložive kao stanje tehnike u ovom pronalasku.

KRATAK SADRŽAJ PRONALASKA

U skladu sa ovim pronalaskom, nađeno je da virusi plavog jezika mogu da budu dvostruko inaktivirani koristeći ovde opisane postupke, a ovi dvostruko inaktirivani virusi mogu da se koriste u izradi vakcine i imunogeničnih kompozicija za imunizaciju preživara protiv različitih sojeva i patogenih serotipova BTV. Osim toga, konstatovano je da su određene kombinacije adjuvanata i ekscipijenata efikasne za upotrebu u kombinacijama iz pronalaska za izazivanje efektivnog imunog odgovora kod preživara na kojima su primenjene kompozicije.

U skladu sa tim, jedan aspekt pronalaska obezbeđuje kompoziciju za izazivanje imunog odgovora na virus plavog jezika (BTV) kod životinja, pri čemu kompozicija uključuje imunogenično efektivnu količinu najmanje jednog soja dvostruko inaktiviranog virusa plavog jezika i biološki prihvatljive adjuvante.

U jednom aspektu, dvostruko inaktivirani BTV koji se koristi u kompozicijama je prvi put inaktiviran sa sredstvom za inaktiviranje u koncentraciji od približno 10 mM, a drugi put je inaktiviran sa sredstvom za inaktiviranje u koncentraciji od približno 5 mM.

U jednom aspektu, sredstvo za inaktiviranje koje se koristi za tretiranje BTV za upotrebu u kompozicijama, je binarni etilenimin (BEI).

U jednom aspektu, kompozicija uključuje soj BTV koji je serotip 4.

U jednom aspektu, kompozicija je kompozicija vakcine ili imunogenična kompozicija.

U jednom aspektu, životinja koja se tretira sa kompozicijom je preživar izabran iz grupe koja sadrži ovce, jagnjad, koze, goveda i jelensku divljač.

U jednom aspektu, životinja koja se tretira sa kompozicijom je ovca ili jagnje

U jednom aspektu, biološki prihvatljiv adjuvant koji se koristi sa kompozicijom je izabran iz grupe koja sadrži jedan ili više aluminijum hidroksida, saponina, SL-CD, karbopol i SP-ulje.

U jednom aspektu, biološki prihvatljiv adjuvane koji se koristi sa kompozicijom uključuje mešavinu aluminijum hidroksida i saponina. U jednom aspektu, aluminijum hidroksid se nalazi u koncentraciji između približno 1% do približno 10%. U jednom aspektu, aluminijum hidroksid se nalazi u koncentraciji između približno 2% i približno 5%. U jednom aspektu, aluminijum hidroksid se nalazi u koncentraciji od približno 3%.

U jednom aspektu, imuni odgovor izazvan sa kompozicijama iz pronalaska štiti životinje od infekcije ili smanjuje ozbiljnost najmanje jednog simptoma koji je u vezi sa infekcijom patogenim sojem virusa plavog jezika.

Drugi aspekt pronalaska obezbeđuje postupak za pojačavanje imunog odgovora kod životinja na virus plavog jezika, ili za sprečavanje ili smanjenje najmanje jednog simptoma koji je u vezi sa bolešću, pri čemu postupak uključuje fazu primene pojedinačne ili višestrukih doza kompozicije iz pronalaska, kako je prethodno opisano.

U jednom aspektu, postupci za pojačavanje imunog odgovora na virus plavog jezika kod životinja, ili za prevenciju ili smanjenje najmanje jednog simptoma koji je u vezi sa oboljenjem, su korisni u postizanju ovog efekta kod preživara izabranih iz grupe koja sadrži ovce, jagnjad, koze, goveda i jelensku divljač. U jednom aspektu, preživarje ovca ili jagnje.

U jednom aspektu, postupci za pojačavanje imunog odgovora na virus plavog jezika kod životinja, ili za prevenciju ili smanjenje najmanje jednog simptoma koji je u vezi sa oboljenjem, obezbeđuju mogućnost primene kompozicije parenteralnim putem. Parenteralna primena može da se postigne intramuskularnom injekcijom.

U jednom aspektu, postupci za pojačavanje imunog odgovora na virus plavog jezika kod životinja, ili za prevenciju ili smanjenje najmanje jednog simptoma koji je u vezi sa oboljenjem obezbeđuju mogućnost primene kompozicije oralnim putem, što može da se postigne davanjem rukom ili masovnom primenom.

Treći aspekt pronalaska obezbeđuje postupak za prevenciju ili poboljšanje početka pojavljivanja virusa plavog jezika, koji uključuje fazu primene kompozicije iz pronalaska na životinji.

U jednom aspektu, postupak prevencije ili poboljšanja početka pojavljivanja virusa plavog jezika obezbeđuje lečenje životinje koja je preživar izabran iz grupe koja obuhvata ovce, jagnjad. koze, goveda i jelensku divljač. U jednom aspektu, preživarje ovca ili jagnje.

U jednom aspektu, postupak prevencije ili poboljšanja početka pojavljivanja virusa plavog jezika obezbeđuje fazu primene kompozicija iz pronalaska parenteralnim putem. Faza parenteralne primene može da se postigne intramuskularnom injekcijom.

U jednom aspektu, postupak prevencije ili poboljšanja početka pojavljivanja virusa plavog jezika obezbeđuje fazu primene kompozicija iz pronalaska oralnim putem. Faza oralne primene može da se postigne ručnim davanjem ili masovnom primenom.

Četvrti aspekt obezbeđuje postupak za produkciju inaktiviranog celog virusa plavog jezika (BTV), pri čemu postupak uključuje faze:

a) tretiranje BTV sa sredstvom za inaktiviranje koristeći odnos sredstva za inaktiviranje prema BTV od 1: 10;

b) Homogenizaciju mešavine sredstvo za inaktiviranje/BTV iz faze a) najmanje 15 minuta;

c) Dekantovanje mešavine iz faze b) u sterilni kontejner i agitaciju mešavine u toku približno 24 sata;

d) tretiranje BTV drugi put sa sredstvom za inaktiviranje koristeći odnos sredstvo za inaktiviranje prema BTV od 1: 20;

e) Homogenizaciju mešavine sredstvo za inaktiviranje/BTV iz faze d) najmanje 15 minuta;

f) Dekantovanje mešavine iz faze e) u sterilni kontejner i agitaciju mešavine u toku približno 48 sati; i

g) neutralizaciju sredstva za inaktiviranje da finalni pH bude podešen na približno 7 2-

pri čemu metod obezbeđuje inaktiviranje BTV uz održavanje imunogeničnosti BTV.

U jednom aspektu, obezbeđen je postupak za izradu dvostruko-inaktiviranog BTV, kako je prethodno opisano, upotrebom binarnog etilenimina (BEI) kao sredstva za inaktiviranje. U jednom aspektu, finalna koncentracija sredstva za inaktiviranje u fazi a), kako je prethodno navedeno, je približno 10 mM. U jednom aspektu, finalna koncentracija sredstva za inaktiviranje u fazi d), kako je prethodno navedeno, je približno 5 mM.

U jednom aspektu, prethodbno opisani postupak za izradu dvostruko inaktirivanog celog BTV koristi virus plavog jezika koji je serotip 4.

U petom aspektu, pronalazak obezbeđuje upotrebu najmanje jednog dvostruko inaktiviranog soja BTV za izradu medikamenta za imunizaciju preživara protiv različitih sojeva i serotipova BTV. U jednom aspektu, najmanje jedan dvostruko inaktivirani soj BTV za upotrebu u izradi medikamenta je serotip 4.

DETALJAN OPIS PRONALASKA

Pre nego što se opišu ovde dati postupci i metodologija tretmana, treba da se napomene da ovaj pronalazak nije ograničen na ovde opisane konkretne postupke i eksperimentalne uslove, jer ti postupci i uslovi mogu da se menjaju. Takođe treba da se razume da ovde korišćena terminologija ima za cilj samo da opiše određene aspekte, i ne treba da bude ograničavajuća.

Kako se koriste u ovoj specifikaciji i priključenim patentnim zahtevima, neodređeni članovi za jedninu uključuju i množinu, ukoliko kontekst jasno ne ukazuje na drugačije.

Prema tome, na primer, reference za "postupak" uključuju jedan ili više postupaka, I/ili faze ovde opisanog tipa i/ili koji će biti jasni stručnjacima sa iskustvom u tehnici nakon čitanja ovog otkrića i tako dalje.

U skladu sa tim, u ovoj prijavi mogu da se koriste uobičajene tehnike, imajući u vidu stanje tehnike, iz molekularne biologije, mikrobiologije i rekombiantne DNA. Ovakve tehnike su u potpunosti opisane u literaturi. Videti, na primer, Sambrook, Fritsch & Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (ovde "Sambrook i saradnici., 1989"); DNA Cloning: A Practical Approach, Volumes I and II (D. N. Glover ed. 1985); Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait ed. 1984); Nucleic Acid Hybridization (B. D. Hames & S. J. Higgins eds. (1985)); Transcription And Translation (B. D. Hames & S. J. Higgins, eds. (1984)); Animal Cell Culture (R. I. Freshney, ed. (1986)); Immobilized Cells And Enzymes (IRL Press, (1986)); B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984); F. M. Ausubei i saradnici. (eds. ), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Ine. (1994).

Mada bilo koji postupci i materijali slični ili ekvivalentni sa onima koji su ovde opisani mogu da se koriste u praksi ili testiranju pronalaska, ovde su opisani preferirani postupci i materijali. Sve publikacije koje su ovde pomenute su u celini ovde inkorporirane u reference.

Definicije

Ovde korišćeni nazivi imaju značenja koja stručnjak sa iskustvom u tehnici prepoznaje i zna, međutim, zbog pogodnosti i potpunosti, niže su navedeni određeni nazivi i njihova značenja.

Naziv "približno" ili "aproksimativno" označava statistički smislene opseg vrednosti. Ovakav opseg može da bude unutar određenog raspona, obično unutar 50%, još češće unutar 20%, čak još češće unutar 10%, a čak još mnogo češće unutar 5% date vrednosti ili opsega. Dozvoljena varijacija obuhvaćena nazivom "približno" ili "aproksimativno" zavisi od određenog sistema u studiji, i stručnjak sa uobičajenim iskustvom u tehnici može lako daje razume.

"Adjuvant" označava da kompozicija obuhvata jednu ili više supstanci koje pojačavaju imunogeničnost antigena u kompoziciji, obično u kompoziciji vakcine. Adjuvant može da služi kao depo u tkivu koji polako oslobađa antigen, a takođe kao aktivator limfoidnog sistema koji ne-specifično pojačava imuni odgovor (Hood, i saradnici, Immunology, Second Ed., Menlo Park, CA: Benjamin/Cummings, 1984. strana 384), Često, prvobitna vakcinacija sa samim antigenom, bez prisustva adjuvanta, neće izazvati humoralni ili celularni imuni odgovor. U adjuvante spadaju, ali bez ograničenja na, kompletni Freund-ovi adjuvanti, ne kompletni Freund-ovi adjuvanti, mineralni geli kao stoje aluminijum hidroksid, površinski aktivne supstance kao što su lizolecitin, pluronatni poboli, polianjoni, peptidi, ulja i ugljovodonične emulzije, osnovni povezani hemocijanini i potencijalno korisni humani adjuvanti kao što su N-acetil-muranil-Ltreonil-D-izoglutamin (thr-MDP), N-acetil-nor-muramil-L-alanil-D-izoglutamin, N-acetilmuramil-L-alanil-D-izoglutaminil-L-alanin-2-(l'-2'-dipalmitoil-sn-glicero-3-hidroksifosforiloksi)-etilamin, BCG (bacil Calmette-Guerin) i Corynebacterium parvum. Preferirano, adjuvant je biološki prihvatljiv. U jednom aspektu pronalaska, kompozicija se primenjuje sa kombinacijom dva adjuvanta, aluminijum hidroksida i saponina.

Adjuvanti korišćeni u ovde opisanim kompozicijama su obično "biološki prihvatljivi adjuvanti" i, prema tome, mogu da se koriste u kombinaciji sa inaktiviranim BTV, tako da dobijene kompozicije mogu da se primenjuju na životinji in vivo bez prateće toksičnosti.

Ovde su kao primeri date kompozicije koje uključuju dvostruko inaktivirani BTV u kombinaciji sa jednim ili više biološki prihvatljivih adjuvanata izabranih iz grupe koja sadrži aluminijum hidroksid, saponin, SP-ulje, SL-CD ili Carbopol. U izvesnim aspektima, dva adjuvanta se koriste da izazovu preferirani imuni odgovor na BTV. U drugim aspektima, može da se razmotri upotreba mešavine ulja koje može da se metaboliše, kao što su jedan ili više nezasićenih terpen ugljovodonika, na primer, skvalen ili skvalan i polioksietilen-polipropilen blok kopolimer, kao što je Pluronic®.

Inaktivirani soj BTV ili molekule koje potiču od njega je"antigeničan" kada je sposoban za specifičnu interakciju sa molekulom imunog sistema koja prepoznaje antigen, kao što su immunoglobulin (antitelo) ili receptor antigena T ćelije. Uobičajeno, antigenična molekula je polipeptid, ili njegova varijanta, koji sadrži "epitop" od najmanje približno 5, a obično od najmanje približno 10 amino kiselina. Antigenični deo polipeptida. ovde takođe označen kao "epitop, " može da bude onaj deo koji je imunodominantan za prepoznavanje od strane antitela ili receptora T ćelija, ili to može da bude deo koji je odgovoran za generisanje antitela u molekuli konjugacijom antigeničnog antitela sa nosačem polipeptida za imunizaciju. Molekula koja je antigenična ne mora sama da bude imunogenična, to jest, sposobna da bez nosača izazove imuni odgovor.

U ovom otkriću, nazivi kao što su "uključuje", "uključeno", "uključujući", "sadrži", "sadržavajući" i slično, mogu da imaju značenja koja su im dodeljena u U. S. zakonu o patentima, na primer, mogu da imaju značenja "obuhvata", "obuhvaćeno", "obuhvatajući" i slično. Nazivi kao što su "sadržavjući u osnovi" i "sadrži u osnovi", imaju značenja koja su im dodeljena u U. S. zakonu o patentima, na primer, mogu da uključe dodatne sastojke ili faze kojima ne odstupaju od novina ili osnovnih karakteristika pronalaska, to jest, isključuju dodatne ne-navedene sastojke ili faze koje odstupaju od novina ili osnovnih karakteristika pronalaska i isključuju sastojke ili faze iz stanja tehnike, kao što su dokumenta u tehnici koja su ovde navedena ili su inkoroprirana u referencama, posebno ako je cilj ovog dokumenta da defmiše aspekte koji mogu da se patentiraju, na primer, novine, ne-očigledne, inventivne u odnosu na stanje tehnike, na primer, u odnosu na dokumenta koja su ovde citirana ili inkorporirana u reference. I nazivi "sadržaj od" i "sadržavajući od" imaju značenja koja su im pridodata u U. S. zakonu o patentima; to jest, ovi nazivi su blizu kraja.

"Imuni odgovor" na vakcinu ili imunogeničnu kompoziciju se razvija u predmet humoralnog i/ili ćelijski posredovanog imunog odgovora na molekule koje se nalaze u antigenu ili kompoziciji vakcine od interesa. U svrhu ovog pronalaska, "humoralni imuni odgovor" je antitelom-posredovani imuni odgovor i uključuje generaciju antitela sa afinitetom za antigen/vakcinu iz pronalaska, dok je "ćelijski posredovani imuni odgovor" onaj u kome su posrednici T-limfociti i/ili druge ćelije belih krvnih zrnaca. "Ćelijski posredovani imuni odgovor" je izazvan prisustvom antigeničnih epitopa u asocijaciji sa molekulama klase lili klase II glavnog klompleksa za histokompatibilnost (MHC). Ovo aktivira antigen-specifične CD4+ T pomoćne ćelije ili CD8+ citotoksične T limfocitne ćelije ("CTLs"). CTL su specifične za peptid antigena koji su prisutni zajedno sa proteinima enkodiranih pomoću glavnog kompleksa histokompatibilnosti (MHC) i pojavljuju se na površinama ćelija. CTL pomažu indukciju i unapređuju intracelularnu destrukciju intracelularnih mikroba, ili liziraju ćelije inficirane sa tim mikrobima. Naredni aspekt celularnog imuniteta uključuje antigen-specifični odgovor od strane pomoćnih T-ćelija. Pomoćne T-ćelije deluju tako da pomažu stimulaciju funkcije i fokusiraju aktivnost ne-specifičnih delujućih ćelija protiv ćelija koje pokazuju antigene peptide zajedno sa MHC molekulama na njihovoj površini. "Ćelijski posredovani imuni odgovor" se takođe odnosi na produkciju citokina, hemokina i drugih ovakvih molekula koje produkuju aktivirane T-ćelije i/ili druge ćelije belih krvnih zrnaca, uključujući one koje su dobijene od CD4+ i CD8+ T-ćelija. Sposobnost određenog antigena ili kompozicije da stimuliše ćelijski-posredovani imunološki odgovor može da se odredi brojnim analizama, kao stoje ispitivanje limfoproliferacije (aktiviranje limfocita), ispitivanje CTL citotoksičnih ćelija, ispitujući T-limfocite specifične za antigen kod senzitivnog subjekta ili merenjem produkcije citokina od strane T ćelija u odgovoru na restimulaciju sa antigenom. Ovakva ispitivanja su dobro poznata u tehnici. Videti, na primer, Erickson i saradnici., J. Immunol. (1993) 151: 4189-4199; Doe i saradnici., Eur. J. Immunol. (1994) 24: 2369-2376.

"Imunogenična efektivna količina" je količina celog inaktiviranog BTV koja će da izazove imuni odgovor kod životinja. Ova količina zavisi od vrste, pasmine, starosti, veličine, zdravstvenog statusa životinje koja je prima i zavisi od prethodne izloženosti životinje jednom ili više sojeva BTV bez obzira da li je taj jedan ili više sojeva virulentan soj ili nevirulentan soj. Kako se ovde koristi, "imunogenična efektivna količina " celog inaktiviranog BTV, kada se koristi u kombinaciji sa jednim ili više odgovarajućih adjuvanata, je ona količina BTV koja je dovoljna da pojača imunogeničnost BTV i na taj način obezbedi zaštitni imunitet protiv izazova sa patogeninim ili virulentnim BTV sojem ili serotipom.

Naziv "imunogenični" se odnosi na sposobnost antigena ili vakcine da izazove imuni odgovor, ili humoralni ili ćelijski posredovani, ili oba. Kako se ovde koristi, naziv "imunogenični" označava daje BTV sposoban da izazove humoralni i/ili celularni imuni odgovor. Imunogenični soj je takođe antigeničan. Imunogenična kompozicija je kompozicija koja iziaziva humoralni i/ili celularni imuni odgovor kada se primeni na životinji.

Naziv "imunogenična kompozicija" se odnosi na bilo koju farmaceutsku kompoziciju koja sadrži antigen, na primer, mikroorganizam, pri čemu kompozicija može da se koristi za izazivanje imunog odgovora kod životinja. Imuni odgovor može da uključi odgovor T ćelija, odgovor B ćelija, ili odgovor zajedno i T ćelija i B ćelija. Kompozicija može da služi za senzitizaciju sisara prisustvom antigena u asocijaciji sa MHC molekulama na površini ćelija. Pored toga, antigen-specifični T-limfociti ili antitela mogu da se generišu tako da omoguće buduću zaštitu imuniziranog domaćina. "Imunogenična kompozicija" može da sadrži živu, umrtvljenu ili ubijenu/inaktiviranu vakcinu koja uključuje ceo mikroorganizam ili iz njega izdvojeni imunogenični deo koji indukuje, ili ćelijski posredovani (T ćelija) imuni odgovor ili antitelom-posredovani (B ćelija) imuni odgovor, ili oba, i može da zaštiti životinju od jednog ili više simptoma povezanih sa infekcijom mikroorganizmom ili može da zaštiti životinju od smrti zbog infekcije sa mikroorganizmom.

Naziv "inaktiviran" se odnosi na ne-infektivnu prirodu mikroorganizama koji se koriste u vakcini ili imunogeničnoj kompoziciji pronalaska. Posebno, stručnjaci sa iskustvom u tehnici poznaju ovakve materijale koji mogu da se koriste za davanje ne-infektivnih mikroorganizama u svrhu vakcine, na primer, BEI. U ovom pronalasku, takođe su razvijeni određeni postupci za davanje ne-infektivnog virusa plavog jezika, ali su ovi postupci takođe razvijeni sa posebnim naglaskom na zadržavanju imunogeničnosti izrađene vakcine, a da se u isto vreme izvrši potpuna inaktivacija pripremljenog virusa.

Kako se ovde koristi, naziv "izolovan" označava daje određeni materijal uklonjen iz svoje prirodne sredine. Prema tome, izolovani biološki materijal može da se oslobodi neke ili svih ćelijskih komponenti, to jest, komponenti ćelije u kojima se nativni materijal prirodno nalazi (na primer, komponente citoplazme ili membrane). Materijal se izoluje ukoliko se nalazi u ekstraktu ili supernatantu ćelija. Izolovani protein može da bude u asocijaciji sa drugim proteinima ili nukleinskim kiselinama ili oba, sa kojima je povezan u ćeliji ili sa ćelijskim membranama ukoliko je to protein povezan sa membranom. Izolovane organele, ćelije ili tkiva se uklone sa anatomskog položaja u kome se nalaze u organizmu. Izolovani materijal može ali ne mora da bude prečišćen.

Naziv "parenteralna primena", kako se ovde koristi, označava primenu nekim drugim načinom, a ne preko gastrointestinalnog trakta, posebno za unošenje supstanci u organizam intravenoznom, subkutanom, intramuskularnom ili intramedulamom injekcijom, ali takođe i drugim ne-oralnim i ne-nazalnim načinima primene, kao što su intraperitonealna injekcija ili topična aplikacija.

Naziv "patogenični" se odnosi na sposobnost bilo kog sredstva infekcije, kao što su bakterije ili virus, da izazove bolest. Prema ovom pronalasku, naziv "patogeničan” se odnosi na sposobnost virusa plavog jezika (BTV), da izazove bolest kod preživara, posebno ovaca i jagnjadi. "Ne-patogenični" mikroorganizam se odnosi na mikroorganizam koji nema prethodno navedene karakteristike za "patogenične" sojeve BTV. Bolest izazvana sa BTV se često karakteriše lezijama kod inficirane životinje, koje nalikuju infekcijama virusom dijareje kod goveda, virusom vezikularnog stomatitisa, malignoj kataralnoj groznici, mikotičnom stomatitisu, goveđoj kugi, fotosenzitizaciji i bolesti nogu i usta. Smatra se daje virus plavog jezika (BTV) uzročnik hidranencefalije kod goveda i neplodnosti, abortusa i oštećenja mladunaca kod goveda i ovaca.

Naziv "farmaceutski prihvatljiv nosač" označava nosač koji je odobren od regulatorne agencije Federalne vlade, vlade država ili drugih regulatornih agencija, ili koji je na listi u

U. S. farmakopeji ili drugim opšte priznatim farmakopejama za upotrebu na životinjama, uključujući ljude, kao i ne-humane sisare. Naziv "nosač" se odnosi na razblaživač, adjuvant, ekscipijent ili vehikulum sa kojim se primenjuje farmaceutska kompozicija. Ovakvi farmaceutski nosači mogu da budu sterilne tečnosti kao što su voda i ulja, uključujući parafin, životinjska, biljna ili sintetička ulja, kao što su ulja od kikirikija, ulje od semena soje, mineralno ulje, sezamovo ulje i slično. Voda je preferirani nosač kada se farmaceutska kompozicija primenjuje intravenozno. Rastvori soli i vodeni rastvori dekstroze i glicerola mogu takođe da se koriste kao tečni nosači, posebno za injektibilne rastvore. U pogodne farmaceutske ekscipijente spadaju škrob, glukoza, laktoza, saharoza, želatin, slad, pirinač, brašno, kalcijum karbonat, silika gel, natrijum stearat, glicerol monostearat, talk, natrijum hlorid, sušeno obrano mleko, glicerol, propilen glikol, voda, etanol i slično. Ukoliko se želi, kompozicija može takođe da sadrži u minimalnim količinama sredstva za vlaženje ili emulgovanje ili sredstva za podešavanje pH. Ove kompozicije mogu da budu u obliku rastvora, suspenzija, emulzija, tableta, pilula, kapsula, praškova, formulacija sa kontinuiranim oslobađanjem i slično. Kompozicija može da bude formulisana kao supozitorija sa uobičajenim vezivnim sredstvima i nosačima, kao što su trigliceridi. Za oralne formulacije, mogu da se koriste standardni nosači kao što su manitol, laktoza, škrob, magnezijum stearat, natrijum saharin, celuloza, magnezijum karbonat, itd., farmaceutskog kvaliteta. Primeri odgovarajućih farmaceutskih nosača su opisani u "Remington's Pharmaceutical Sciences" od E. W. Martin. Formulacija treba da sadrži način primene.

Naziv "zaštititi" se odnosi na zaštitu, na primer, sisara, posebno preživara, na primer, ovaca, jaganjaca, koza ili krava od infekcije ili bolesti, indukcijom imunog odgovora na određeni patogen, na primer, virus plavog jezika. Ovakva zaštita se generalno postiže nakon tretiranja sisara sa ovde opisanim kompozicijama vakcine.

Kako se ovde koristi, naziv "prečišćen" se odnosi na materijal koji je izolovan pod uslovima koji redukuju ili eliminišu prisustvo nepoželjnih materijala, na primer, onečišćivača, uključujući nativne materijale iz kojih je materijal dobijen. Na primer, prečišćena bakterija ili protein je obično potpuno bez ćelije domaćina ili komponenti kulture, uključujući kulturu tkiva ili protein jajeta, ne-specifične patogene i slično. Kako se ovde koristi, naziv "skoro potpuno bez" se koristi operacionalno, u kontekstu analitičkog testiranja materijala. Uobičajeno, prečišćeni materijal skoro potpuno bez onečišćivača je najmanje 50% čist; još uobičajenije, najmanje 90% čist, a čak još više uobičajeno, najmanje 99% čist. Čistoća može da se proceni hromatografijom, gel elektroforezama, imunoispitivanjem, analizama kompozicije, biološkim ispitivanjem i drugim postupcima koji su poznati u tehnici. Postupci za prečišćavanje su dobro poznati u tehnici. Naziv "skoro potpuno čist" ukazuje na najveći stepen čistoće koji može da se postigne pomoću uobičajenih tehnika prečišćavanja koje su poznate u tehnici.

"Saponini" se proučavaju u: Lacailie-Dubois, M and Wagner H. (1996. A review of the biological and pharmacological activities of saponins. Phytomedicine vol 2 strane 363386). Saponini su steroidi ili triterpenski glikozidi široko rasprostranjeni u biljkama i životinjama morske sredine. Saponini su poznati po formiranju koloidnih rastvora u vodi koji pene mućkanjem i po precipitaciji holesterola. Kada se saponini nalaze blizu ćelijske membrane, formiraju strukture slične porama u membrani što dovodi do pucanja membrane. Hemoliza eritrocita je primer ovog fenomena, koji je karakterističan za izvesne, ali ne sve, saponine. Saponini su poznati kao adjuvanti u vakcinama za sistemsku primenu. Osobine pojedinih saponina kao adjuvanta i njihova hemolitička aktivnost je intenzivno proučavana u tehnici (Lacailie-Dubois and Wagner, supra). Na primer, "Quil A" (dobijen od kore južno američkog drveta Quillaja Saponaria Molina) i njegove frakcije su opisane u U. S. patentu broj 5, 057, 540 i "Saponins as vaccine adjuvants", Kensil, C. R., Crit Rev Ther Drug Carrier Syst, 1996, 12 (1-2): 1-55, i EP 0 362 279 BI. Određene strukture, nazvane imuni stimulirajući kompleksi (ISCOMS), koji uključuju frakcije Quil A su hemolitičke i koriste se u proizvodnji vakcina (Morein, B., EP 0 109 942 BI). Za ove strukture je objavljeno da imaju aktivnost adjuvanta (EP 0 109 942 BI; WO 96/11711). Hemolitički saponini QS21 i QS17 (frakcije Quil A prečišćene sa HPLC) su opisani kao potentni sistemski adjuvanti, a postupak za njihovu produkciju je otkriven u U. S. patentu broj 5, 057, 540 i EP 0 362 279 BI. U ovim referencama je takođe opisana upotreba QS7 (ne-hemolitička frakcija Quil-A) koji deluje kao potentni adjuvant za sistemske vakcine. Upotreba QS21 je dalje opisana od strane Kensil i saradnika. (1991, J. Immunology vol 146, strane 431-437). Takođe su poznate kombinacije QS21 i polisorbata ili ciklodekstrina (WO 99/10008). Određeni sistemi adjuvanta, koji uključuju frakcije QuilA. kao što su QS21 i QS7 su opisani u WO 96/33739 i WO 96/11711. Drugi saponini koji se koriste u studijama sistemske vakcinacije uključuju one koji su dobijeni od drugih biljnih vrsta, kao što su Gypsophiia i Saponaria (Bomford i saradnici., Vaccine, 10(9): 572-577, 1992). Takođe je poznato da se saponini koriste u studijama mukozno nanete vakcine, što ima promenljiv uspeh u indukciji imunog odgovora. Prethodno je pokazano da Quil-A saponin nema efekat na indukciju imunog odgovora kada se antigen primenjuje intranazalzno (Gizurarson i saradnici. 1994 Vaccine Research 3, 23-29), dok drugi autori koriste ovaj adjuvant sa uspehom (Maharaj i saradnici., Can. J. Microbiol, 1986, 32(5): 414-20. Chavaii and Campbell, Immunobiology, 174(3); 347-59). ISCOMs koji uključuje Quil A saponin se koristi u formulacijama intragastrične i intranazalne vakcine i pokazuje aktivnost adjuvanta (Mcl Mowat i saradnici., 1991, Immunology, 72, 317-322; Mcl Mowat and Donachie, Immunology Today, 12, 383-385). Ne toksična frakcija Quil A. je takođe opisana kao oralni ili intranazalni adjuvant (Sumino i saradnici., J. Virol., 1998, 72(6)4931-9, WO 98/56415). Opisana je i upotreba drugih saponina u studijama vakcinacije intranazalno. Na primer, Chenopodium quinoa saponini se koriste i u intranazalnim i u intragastičnim vakcinama (Estrada i saradnici., Comp. Immunol. Microbiol. Infect, Dis., 1998, 21(3): 225-36).

Naziv "SL-CD" se odnosi na sulfolipo-ciklodekstrin koji pripada grupi ciklodekstrin adjuvanta opisanih u U. S. patentima broj 6, 610, 310 i 6, 165, 995. Uobičajeno, SL-CD se formuliše kao mešavina sa uljima koji mogu da se metabolišu, kao što su jedan ili više nezasićenih terpen ugljovodonika, na primer, skvalen i preferirano sa ne-jonskim surfaktantom, kao što je polioksietilen sorbitan monooleat.

Naziv "SP-Ulje" se odnosi na adjuvant koji je emulzija ulja i koja uključuje: 1% do 3% v/v polioksietilen-polioksipropilen blok kopolimera; 2% do 6% v/v skvalena; 0. 1% do 0. 5% v/v polioksietilen sorbitan monoooleata; i puferovan rastvor soli.

Naziv "preživar" se odnosi na bilo koju grupu kopitara, čak papkare i obično rogate sisare za koje je karakteristično da imaju stomak podeljen na četiri dela, uključujući krave, ovce, žirafe, koze i jelensku divljač.

Kako se ovde koristi, naziv "tretman" (uključujući njegove varijante, na primer, "lečenje" ili "tretiranje") se odnosi na bilo koji ili više od sledećeg: (i) prevenciju infekcije ili reinfekcije, kao u tradicionalnim vakcinama: (ii) redukciju ozbiljnosti ili eliminaciju simptoma, i (iii) u većem delu ili potpunu eliminaciju patogena ili poremećaja o kojima se radi. Prema tome, tretman može da bude profdaktički (pre infekcije) ili terapeutski (nakon infekcije). U ovom pronalasku, profdaktički tretman je preferirani način. U skladu sa određenim aspektom ovog pronalaska, date su kompozicije i postupci koji leče životinju domaćina od virusne infekcije, uključujući profdaktičku i/ili terapeutsku imunizaciju. Postupci iz ovog pronalaska su korisni za postizanje profdaktičkog i/ili terapeutskog imuniteta kod sisara, preferirano preživara, kao što su ovce, jaganjci, krave ili koze. Postupci iz ovog pronalaska mogu takođe da se primene na sisarima za primenu u biohemijskim istraživanjima.

Naziv "dvostruko inaktiviran" se odnosi na upotrebu određenih postupaka kako je opisano u ovom pronalasku, za prevođenje BTV u ne-infektivan oblik, dok se u isto vreme zadržava imunogeničnost izrađenog virusa. Još preciznije, BTV iz ovog pronalaska je dva puta inaktiviran upotrebom dve faze inkubacije BTV sa BEI, pri čemu se prva faza inaktivacije postiže inkubacijom BTV sa BEI u koncentraciji od 10 mM u toku 24 sata, a dok se druga faza inaktivacije izvodi inkubacijom BTV sa BEI u koncentraciji od 5 mM, u toku 48 sati.

Nazivi "vakcina" ili "kompozicija vakcine", koji se koriste kao sinonimi, se odnose na farmaceutske kompozicije koje uključuju najmanje jednu imunogeničnu kompoziciju koja indukuje imuni odgovor kod životinja. Vakcina ili kompozicija vakcine može da zaštiti životinju od bolesti ili mogućeg uginuća zbog infekcije, i može ili ne mora, da uključi jednu ili više dodatnih komponenti koje pojačavaju imunološku aktivnost aktivne komponente. Vakcina ili kompozicija vakcine može dodatno da uključi druge komponente koje su uobičajene za farmaceutske kompozicije. Vakcina ili kompozicija vakcine može dodatno da uključi druge komponente koje su tipične za vakcine ili kompozicije vakcine, uključujući, na primer, adjuvant ili imunomodulator. Imunogenična aktivna komponenta vakcine može da sadrži potpuno žive organizme ili u njihovom originalnom obliku ili kao umrtvljene organizme u modifikovanoj živoj vakcini ili organizme inaktivirane odgovarajućim postupcima u mrtvoj ili inaktiviranoj vakcini, ili podgrupu vakcina koje uključuju jednu ili više imunogeničnih komponenti virusa, ili genetički izrađene, mutirane ili klonirane vakcine izrađene postupcima koji su poznati stručnjaku sa iskustvom u tehnici. Vakcina ili kompozicija vakcine može da uključi jedan ili istovremeno više od jednog prethodno opisanog elementa.

Opšti opis

Zbog svog potencijalnog uticaja na veliku industriju u vezi sa životinjama, razvoj vakcine protiv virusa plavog jezika je veoma važan, posebno za industriju u vezi sa govedima i ovcama. Patogeni sojevi, čak iako su umrtvljeni, bi verovatno imali ograničenu vrednost zbog uobičajene tendencije živih virusa da pređu u svoje virulentno stanje. Osim toga. obaveza je da ukoliko se inaktivirana vakcina koristi na tržištu, virus mora da bude potpuno inaktiviran kako bi se osigurao adekvatan profil bezbednosti za životinju. Pored toga, takođe je važno da inaktivacija nema neželjen efekat na imunogeničnost virusa ili komponenti virusa odgovornih za indukciju imunog odgovora.

U skladu sa tim, ovaj pronalazak se odnosi na kompozicije i postupke za imunizaciju životinje, posebno preživara kao što su ovca, ili jagnje, ili krava, protiv infekcije virusom plavog jezika (BTV) ili za smanjenje ozbiljnosti najmanje jednog simptoma bolesti. Kompozicija uključuje najmanje jedan dvostruko inaktivirani soj BTV i biološki prihvatljiv adjuvant. U nekim aspektima, koristi se kombinacija najmanje dva biološki prihvatljiva adjuvanta.

U jednom aspektu ovog pronalaska, obezbeđeni su postupci za imunizaciju preživara protiv patogenih BTV i za zaštitu životinja od ove infekcije.

Posebno, u ovom pronalasku su obezbeđeni postupci za upotrebu vakcine ili imunogenične kompozicije koja uključuje najmanje jedan ceo i dvostruko inaktivirani soj BTV za imunizaciju preživara od infekcije sa BTV. U jednom aspektu, ovaj pronalazak obezbeđuje postupke za upotrebu vakcine ili imunogenične kompozicije koja uključuje serotip 4 BTV za imunizaciju preživara od infekcije sa BTV.

Virus plavog jezika, koji se koristi u kompozicijama i postupcima iz pronalaska, može da se dobije iz bilo kog poznatog izvora koji zadržava zalihe različitih serotipova BTV, kao stoje American Type Culture Collection (ATCC). Na primer, ATCC održava nekoliko različitih sojeva BTV koji su navedeni u njihovom katalogu i označeni sledećim pristupnim brojevima: VR-187 (serotip 10), VR-872 (serotip 11), VR-873 (serotip 13), VR-875 (serotip 17), VR-983 (serotip 2), VR-1231 (serotip 10), VR-1231 AF (serotip 10) i VR-1231CAF (serotip 10 pacova). Osim toga, serotip 4 su opisali Mertens i suradnici. (Mertens, PP, i suradnici. (Virology, 161(2): 438-447, (1987)) i Breard i suradnici. (Breard, E. i suradnici. Virus Res., 125(2): 191-197, (2007)).

Postupci inaktivacije

Vakcine ili imunogenične kompozicije sa inaktiviranim virusom mogu da se izrade tretiranjem BTV sa sredstvima za inaktivaciju, kao što su formalin ili hidrofobni rastvarači, kiseline, itd., zračenjem sa ultravioletnom svetlošću ili X-zracima, zagrevanjem, itd. Inaktivacija se izvodi na način koji je poznat u tehnici. Na primer, u hemijskoj inaktivaciji, uzorak odgovarajućeg virusa ili uzorak seruma koji sadrži virus se dovoljno dugo tretira sa odgovarajućom količinom ili koncentracijom sredstva za inaktivaciju na dovoljno visokoj (ili niskoj, u zavisnosti od sredstva za inaktivaciju) temperaturi ili pH za inaktiviranje virusa. Inaktivacija zagrevanjem se izvodi na temperaturi i u vremenskom periodu koji je dovoljan da inaktivira virus. Inaktivacija zračenjem se izvodi koristeći talasnu dužinu svetlosti ili drugi

izvor energije onoliko vremena koliko je dovoljno da se inaktivira virus. Virus se smatra inaktiviranim ukoliko nije sposoban da inficira ćeliju podložnu infekciji. U određenom aspektu, sredstvo koje se koristi za inaktiviaciju je binarni etilenimin (BEI).

U nekim aspektima pronalaska, obezbeđeni su postupci za produkciju dvostruko inaktiviranog oblika najmanje jednog celog BTV. Postupak uključuje faze:

a) tretiranje BTV sa sredstvom za inaktiviranje uzimajući odnos sredstva za

inaktiviranje prema BTV od 1: 10;

b) Homogenizaciju mešavine sredstvo za inaktiviranje/BTV iz faze a) najmanje 15 minuta;

c) Dekantovanje mešavine iz faze b) u sterilni kontejner i agitaciju mešavine u toku približno 24 sata;

d) tretiranje BTV drugi put sa sredstvom za inaktiviranje koristeći odnos sredstvo za inaktiviranje prema BTV od 1: 20;

e) Homogenizaciju mešavine sredstvo za inaktiviranje/BTV iz faze d) najmanje

15 minuta;

f) Dekantovanje mešavine iz faze e) u sterilni kontejner i agitaciju mešavine u toku približno 48 sati; i

g) neutralizaciju sredstva za inaktiviranje da finalni pH bude podešen na približno 7 2-

pri čemu metod obezbeđuje inaktiviranje BTV dok se održava imunogeničnost BTV.

U jednom aspektu, obezbeđen je postupak za izradu dvostruko inaktiviranog BTV, kako je prethodno opisano, uz upotrebu binarnog etilenimina (BEI) kao sredstva za inaktiviranje. U jednom aspektu, finalna koncentracija sredstva za inaktiviranje u fazi a), kako je prethodno navedeno, je približno 10 mM. U jednom aspektu, finalna koncentracija sredstva za inaktiviranje u fazi d), kako je prethodno navedeno, je približno 5 mM.

U jednom aspektu, prethodno opisani postupak za izradu dvostruko inaktiviranog celog BTV koristi virus plavog jezika koji je serotip 4.

Vakcina ili imunogenične kompozicije i postupci za upotrebu

Imunogenično efektivna količina vakcine iz ovog pronalaska se primenjuje na preživaru koji treba da se zaštiti od infekcije sa virusom plavog jezika (BTV). Imunogenična efektivna količina ili imunogenična količina koja se daje preživaru može jednostavno da se odredi ili lako titrira rutinskim testiranjem. Efektivna količina je ona sa kojom se postiže dovoljan imunološki odgovor na vakcinu da zaštiti životinju koja je izložena virusu. Preferirano, životinja je zaštićena do nivoa u kome su jedan do svi neželjeni fiziološki simptomi ili efketi virusne bolesti značajno redukovani, popravljeni ili potpuno sprečeni.

Vakcina ili imunogenična kompozicija može da se primeni u pojedinačnoj dozi ili u ponovljenim dozama. Postupci su poznati u tehnici za određivanje ili titraciju odgovarajućih doza aktivnog antigeničnog sredstva na bazi težine životinje, koncentracije antigena i drugih uobičajenih faktora.

Poželjno je da se vakcina ili imunogenična kompozicija primeni na preživaru koji još uvek nije izložen virusu. Vakcina koja sadrži ceo i dvostruko inaktivirani virus ili neki drugi njegov antigenični oblik, može pogodno da se primeni intranazalno, transdermalno (to jest, nanese na ili u površinu kože za sistemsku apsorpciju, parenteralno, itd. Parenteralni način primene uključuje, ali bez ograničenja, intramuskularni, intravenozni, intraperitonealni, intradermalni (to jest, injektira se ili na drugi način nanese pod kožu) način i slično. Od kako su intramuskularni i intradermalni načini inokulacije postali uspešni u drugim studijama koje koriste DNA klonove inficirane virusom (E. E. Sparger i saradnici, "Infection of cats by injection with DNA of feline immunodeficiency virus molecular done, " Virology 238: 157-160 (1997); L. Willems i saradnici., "In vivo transfection of bovine leukemia provirus into sheep, " Virology 189: 775-777 (1992)), ovi načini su najpoželjniji, zajedno sa praktičnim intranazalnim načinom primene.

Kada se primenjuje kao tečnost, ova vakcina može da se izradi u obliku vodenog rastvora, sirupa, eliksira, tinkture i slično. Ovakve formulacije su poznate u tehnici i obično se izrađuju rastvaranjem antigena i drugih uobičajenih aditiva u odgovarajućem nosaču ili sistemima rastvarača. U pogodne "fiziološki prihvatljive" nosače ili rastvarače spadaju, ali bez ograničenja na, voda, rastvor soli, etanol, etilen glikol, glicerol, itd. Uobičajeni aditivi su, na primer, dozvoljena sredstva za bojenje, korigensi ukusa, zaslađivači i antimikrobni konzervansi, kao što su timerosal (natrijum etilmerkuritiosalicilat). Ovi rastvori mogu da se stabilizuju, na primer, dodatkom delimično hidrolizovanog želatina, sorbitola ili medijuma ćelijske kulture, i mogu da se puferuju uobičajenim postupcima koristeći reagense koji su poznati u tehnici, kao što su natrijum hidrogen fosfat, natrijum dihidrogen fosfat, kalijum hidrogen fosfat, kalijum dihidrogen fosfat, njihova mešavina i slično.

U tečne formulacije takođe mogu da se uključe suspenzije i emulzije koje sadrže sredstva za suspendovanje ili emulgovanje, u kombinaciji sa drugim standardnim ko-formulantima. Ovi tipovi tečnih formulacija mogu da se izrade uobičajenim postupcima. Suspenzije, na primer, mogu da se izrade upotrebom koloidnog mlina. Emulzije, na primer, mogu da se izrade upotrebom homogenizatora.

Parenteralne formulacije, namenjene za injekciju u tečne sisteme organizma, zahtevaju odgovarajuću izotoničnost i pH puferovanje do odgovarajućih vrednosti telesnih tečnosti svinje. Izotoničnost može na odgovarajući način da se podesi sa natrijum hloriđom i drugim solima, ukoliko je potrebno. Odgovarajući rastvarači, kao što su etanol ili propilen glikol, mogu da se koriste za povećanje rastvorljivosti sastojaka u formulaciji i za poboljšanje stabilnosti tečnog preparata. U ostale aditive koji mogu da se koriste u ovoj vakcini spadaju, ali bez ograničenja na, dekstroza, uobičajeni antioksidansi i uobičajena helatna sredstva kao što je etilendiamin tetraacetatna kiselina (EDTA). Parenteralni dozni oblici moraju takođe da budu sterilisani pre upotrebe.

Adjuvanti

Dvostruko inaktivirani virus plavog jezika može da se oslobodi sa adjuvantom. U jednom aspektu, vakcina je ceo i dvostruko ubijeni/inaktivirani BTV koji se primenjuje sa adjuvantom. Adjuvant je supstanca koja pojačava imunološki odgovor životinje na vakcinu. Adjuvant može da se primeni u isto vreme i na istom mestu kao vakcina, ili u različito vreme, na primer, kao pobuđivač. Adjuvanti takođe mogu uspešno da se primene na preživaru na način ili na mestu različitom od načina ili mesta gde se primenjuje vakcina. U pogodne adjuvante spadaju, ali bez ograničenja na, aluminijum hidroksid (alum), Alhydrogel® (Brenntag Biosector, Frederikssund, Denmark), imunostimulirajući kompleksi (ISCOMS), ne-jonski blok polimera ili kopolimera, citokini (kao IL-1, 1L-2, 1L-7, IFN-α, IFN--β, IFN-γ, itd. ), saponini (uključujući Quillaia A, ili Quil A (Brenntag Biosector, Frederikssund, Denmark)), monofosforil lipid A (MLA), muramil dipeptidi (MDP) i slično. U druge pogodne adjuvante spadaju, na primer, aluminijum kalijum sulfat, termo labilini ili termo stabilni enterotoksin izolovan iz Escherichia coli, kolera toksin ili njegova B podgrupa, toksin difterije, toksin tetanusa, toksin velikog kašlja, Freund-ov nekompletan ili kompletan adjuvant, itd. Adjuvanti na bazi toksina, kao što su toksin difterije, toksin tetanusa i toksin velikog kašlja, mogu pre upotrebe da se inaktiviraju, na primer, tretmanom sa formaldehidom. U jednom aspektu, kompozicija vakcine se oslobađa sa kombinacijom najmanje dva adjuvanta. U jednom aspektu, kompozicija vakcine se oslobađa sa kombinacijom aluminijum hidroksida (Alhydrogel®) i saponina (Quil A).

Analize za merenje imunih odgovora

Funkcionalni ishod vakcinacije preživara na BTV može da se proceni odgovarajućim analizama koje prate indukciju celularnog ili humoralnog imuniteta ili aktivnost T ćelije. Ova ispitivanja su poznata stručnjaku sa iskustvom u tehnici, ali mogu da uključe merenje citotoksične aktivnosti T ćelije koristeći, na primer, ispitivanje oslobađanja hroma. Atemativno, ispitivanje proliferacije T ćelije može da se koristi kao indikacija postojanja ili ne postojanja njene imune reakcije. Osim toga, studije in vivo mogu da se izvedu kako bi se procenio nivo zaštite kod sisara vakcinisanih na patogene, koristeći postupke iz ovog pronalaska. Tipična ispitivanja in vivo mogu da uključe vakcinaciju životinje sa antigenom, kao stoje ovde opisani virus. Nakon vremena koje je dovoljno da dođe do indukcije antitela ili da se izazove odgovor T ćelije, generalno od približno jedne do dve nedelje nakon injekcije, životinje se nadraže sa antigenom, kao stoje neki od virusa, i prati se poboljšanje jednog ili više simptoma povezanih sa virusnom infekcijom ili preživljavanje životinje. Uspešan režim vakcinacije na BTV imaće za rezultat značajno smanjenje jednog ili više simptoma povezanih sa virusnom infekcijom, ili smanjenje viremije, ili smanjenje broja i ozbiljnosti lezija povezanih sa virusnom infekcijom, ili preživljavanje, kada se uporedi sa nevakcinisanim kontrolama. Takođe može da se sakuplja serum za praćenje nivoa antitela generisanih kao odgovor na injekcije vakcine, što se meri postupcima poznatim stručnjaku sa iskustvom u tehnici.

PRIMER1

Naredni primeri pokazuju izvesne aspekte ovog pronalaska. Međutim, jasno je da su ovi primeri samo za ilustraciju i ne podrazumeva se da su u celosti završeni u smislu uslova i okvira pronalaska. Jasno je da kada su dati uobičajeni uslovi reakcije (na primer, temperature, vreme reakcije, itd. ), takođe mogu da se koriste i uslovi i iznad i ispod navedenih opsega, mada su generalno oni manje pogodni. Svi delovi i procenti koji su ovde dati su na bazi težine, a sve temperature su iskazane u stepenima Celzijusa, ukoliko nije drugačije navedeno.

PRIMER 1: PROCES PROIZVODNJE

OPŠTI OPIS

Proces proizvodnje se vrši u uslovima sterilnosti, po uputstvima niže opisanog Postupka Standardne Proizvodnje. Pre početka operacija defmisanih kao aseptične u

Postupku Standardne Proizvodnje, utvrde se tačni uslovi rada instalacija za filtriranje vazduha i u komori sa laminamim protokom, i potvrdi se da su materijali koji se koriste u procesu propisno sterilisani u autoklavu ili filtracijom ili dezinfikovani u skladu sa utvrđenim postupcima. Aseptične operacije se izvode po utvrđenim tehnikama rada pod sterilnim uslovima.

OPIS SVAKE FAZE PROCESA PROIZVODNJE

POSTUPAK PROIZVODNJE FINALNOG ANTIGENA (FAZA 3)

Pobijanje kultura BHK-21 ćelija

BHK-21 ćelije (zaliha ćelija za rad, WCS) se čuvaju zamrznute u tečnom azotu. WCS kriokivete se otope brzim otopljavanjem na +37°C, a nakon toga se inokuliraju u bocu za kulture koja sadrži medijum za kulturu (MEM-Glasgow + ozračeni serum mladog govečeta).

Boca za kulturu se inkubira na +37±1°C. Nakon najmanje 5 sati od momenta inokulacije, medijum se ukloni iz boce a doda se novi medijum za kulturu istog sastava koji je prethodno zagrejan na temperaturu od +37 ± 1 °C.

Kultura se posmatra periodično i ovaj razvoj (širenje) i morfologija ćelija se beleže.

Iz ove boce za kulturu, kako bi se dobile neophodne boce za produkciju, tražene subkulture se razvijaju u intervalima od 3-5 dana.

Subkulture se stvaraju pomoću tripsinizacije kulture sa rastvorom sveže pripremljenog tripsina; broj ćelija u suspenziji se utvrđuje vitalnim bojenjem (Trypan Blue) u Neubauer komori. Suspenzija ćelija se nakon toga razblaži u sterilnom medijumu za kulturu, koji se nalazi u tankovima ili bocama, pomoću magnetne agitacije, i distribuira se u boce za kulturu.

Medijum za kulturu je podešen na pH 7. 2 ± 0. 2 na početku operacije kulture u rotirajućim bocama.

Kada je i poslednja kultura tripsinizirana i centrifugirana, ćelijska suspenzija se podeli po delovima gde se proizvode antigeni.

PROIZVODNJA FINALNOG ANTIGENA (FAZA 3)

Produkcija antigena u fazi 2 (inokulum)

Za produkciju serije finalnog antigena (faza 3), inokulum (antigen faze 2) se izrađuje u skladu sa sledećim postupkom:

Virus zasejan za rad (WSV) se čuva zamrznut na -70 ± 10°C. Iz WSV se vrši druga faza kako bi se dobio inokulum. U prvoj fazi se izvrši moguća kontrola, a u drugoj se nakon operacije zamrzavanja vrše kontrole sterilnosti i potencije.

Antigen 1. faze (Pre-inokulum)

U jednoj boci sa BHK-21 ćelijama starosti kulture od 2-3 dana. medijum za kulturu se ukloni i supstituiše sa inficiranim medijumom (suspenzija WSV u MEM-Glasgow).

Kultura se inkubira na +37±1°C.

Kada je citopatološki efekat (CPE) završen sa 60%, boca se podvrgne agitaciji kako bi se omogućilo odvajanje ćelije u jednom sloju, a nakon toga zamrzne na -70 ± 10°C.

Antigen faze 2 (Inokulum)

Antigen faze 1 se razblaži u MEM-Glasgow. Medijum kulture, koji je potreban za rast u boci sa BHK-21 ćelijama u kulturi staroj 2-3 dana, se ukloni i supstituiše sa pripremljenom suspenzijom virusa, a nakon toga stavi u inkubator na +37±1°C.

Kada je (CPE) završen sa 60%, boca se podvrgne agitaciji kako bi se omogućilo odvajanje ćelije u jednom sloju, a nakon toga zamrzne na -70 ± 10°C.

Inokulacija kulture, infekcija i kolekcija finalnog antigena (faza 3)

MEM-Glasgow, suspenzija BHK-21 ćelija iz boca za kulturu i ozračeni serum mladog govečeta se izmešaju i homogeniziraju u sterilnom kontejneru pod uslovima agitacije.

Kada je suspenzija homogenizovana, ćelije se broje u Neubauer komori.

Neophodne boce sa ovom suspenzijom se inokuliraju i inkubiraju na +37±1°C.

Iz kulture stare 2-3 dana, medijum za kulturu se ukloni iz svake boce i supstituiše sa medijumom za infekciju; MEM-Glasgow + antigen iz faze 2 (inokulum). Inficirane boce se nakon toga uz rotaciju inkubiraju na +37±1°C.

Kada je CPE završen sa preko 60%, boce se podvrgnu agitaciji kako bi se omogućilo odvajanje jednog sloja ćelija, kulture se sakupe i homogenizuju i proveri se pH. Ukoliko je potrebno, vrši se podešavanje sa hidrohloridnom kiselinom kako bi se dobio pH od 7. 2 ±0. 2, a sakupljeni finalni antigen (faza 3) se nakon toga inaktivira.

Karakteristike procesa za kulturu

- Kultura se pripremi u kivetama za centrifugu.

- Brojanje ćelija se vrši u Neubauer komori nakon što je uzorak razblažen na 1/2

sa Tripan plavim.

- Kulture se inkubiraju na +37 ±1 °C, uz okretanje 12-14 puta po satu.

- Stanje i razvoj kulture se prati periodično, a morfologija ćelija se prati invertnim mikroskopom.

- U toku procesa proizvodnje finalnog antigena (faza 3), kontrole sredine se vrše u radnim prostorijama uzimanjem uzorka vazduha u toku perioda odmora i perioda proizvodnje, a takođe se ispituju ekspozicija i kontaktne ploče kako bi se kontrolisala radna sredina.

UZORKOVANJE

Antigen faze 1: Uzorci antigena iz faze 1 se uzimaju za kontrolu potencije u Sektoru za kontrolu kvaliteta.

Antigen faze 2: Uzorci antigena iz faze 2 se uzimaju za kontrolu potencije i sterilnosti u Sektoru za kontrolu kvaliteta.

Antigen faze 3: Uzorci antigena iz faze 3 se uzimaju za kontrolu potencije, sterilnosti i identifikacije u Sektoru za kontrolu kvaliteta.

PROIZVODNJA INAKTIVIRANOG ANTIGENA

Proces inaktivacije finalnog antigena traje ukupno 72 sata, a koncentracija upotrebljenog BEI je 15 mM.

Finalni antigen se inaktivira dodavanjem 0. 1M BEI u odnosu 100 ml 0. 1 M BEI na litar antigena koji se inaktivira (finalna koncentracija 10 mM).

Nakon dodavanja BEI, mešavina se homogenizuje najmanje 15 minuta, a pH se proveri. Nakon procesa homogenizacije, mešavina se dekantuje u sterilni kontejner gde se podvrgava agitaciji u toku 24 sata na 37±1°C.

Nakon 24 sata, vrši se druga inaktivacija finalnog antigena dodavanjem 0. 1M BEI u odnosu 50 ml BEI na litar antigena koji se inaktivira (finalna koncentracija 5 mM). Nakon drugog dodavanja BEI, process se ponovi pod istim uslovima koji su prethodno opisani ali održavajući mešavinu u uslovima agitacije u toku 48 sati.

NEUTRALIZACIJA REZIDUALNOG BEI NEUTRALIZACIJA

Kada je proces inaktivacije završen, doda se IM rastvor natrijum tiosulfata u odnosu 5 ml ovog rastvora na litar inaktiviranog antigena (finalna koncentracija 5 mM), kako bi se neutralisao BEI.

Nakon stoje mešavina homogenizovana, proveri se pH. Ukoliko je potrebno, vrši se podešavanje sa hidrohloridnom kiselinom da se dobije pH od 7. 2±0. 2.

IZRAČUNAVANJE TEORETSKOG TITRA INAKTIVIRANOG I NEUTRALISANOG ANTIGENA

Za izračunavanje teoretskog titra inaktiviranog i neutralisanog antigena uzimaju se u obzir titar antigena pre inaktivacije i faktor razblaženja koji predstavlja dodavanje BEI u procesu inaktivacije i dodavanje natrijum tiosulfata u procesu neutralizacije.

Za svaki litar antigena, u prvoj inaktivaciji se doda 100 ml 0. 1 M rastvora BEI i dodatnih 55 ml za drugu inaktivaciju. Na ovaj način, 1000 ml finalnog antigena postaje 1155 ml inaktiviranog antigena. Odmah zatim, u procesu neutralizacije, 5 ml 1M rastvora natrijum tiosulfata se doda po litri inaktiviranog antigena. Na ovaj način, 1155 ml inaktiviranog antigena postaje 1161 ml inaktiviranog i neutralisanog antigena.

Procesi inaktivacije i neutralizacije predstavljaju ukupno razblaženje finalnog antigena od 1/1. 16 (1000 ml finalnog antigena postajel 161 ml inaktiviranog i neutralisanog antigena). Iz ovog razloga, smatra se da antigen sa standardnim titrom pre inaktivacije od 107.2 TCID50/ml, ima teoretski titar nakon inaktivacije i neutralizacije od 107.2/l. 16. UZORKOVANJE

Uzimaju se uzorci inaktiviranog i neutralisanog antigena za kontrolu sterilnosti i inaktivacije u Sektoru za kontrolu kvaliteta.

PRIMER 2: IZBOR ADJUVANTA U SKLADU SA EFEKTOM NA REDUKCIJU VIREMIJE NAKON NADRAŽAJA

EKSPERIMENT PRE-IMUNOGENIČNOSTI KOD JAGNJADI STARIH 2 MESECA Životinje se vakcinišu subkutano (2 ml) i revakcinišu 3 nedelje kasnije.

Životinje vakcinisane sa vakcinama A-3, B-3 i C-3 se nadraže 7-8 nedelja nakon revakcinacije (doza nadražaja = 107 TCID50 živog virusa/životinja). Ni jedna od nadraženih životinja nije zaštićena. Međutim, uočena je redukcija viremije samo kod životinja koje su vakcinisane sa Alhydrogel-om (aluminijum hidroksid) i Quil-A (saponin) kao adjuvantom.

TABELA 1. KOMPOZICIJA VAKCINA PRE-IMUNO BTV

ODGOVOR ANTITELA NAKON VAKCINACIJE

TABELA 2. PROCENAT POZITIVNIH ŽIVOTINJA (ELISA TEST)

REZULTATI NADRAŽAJA

Životinje vakcinisane sa serijama A-3, B-3 i C-3 su nadražene (5 životinja u svakoj grupi) 7-8 nedelja nakon revakcinacije. Dve nevakcinisane kontrolne grupe su takođe nadražene.

Virus plavog jezika (BTV) se detektuje u uzorcima krvi ispitivanjem reakcije stvarnog vremena reverzne transkripcije lanca polimeraze (RT-PCR) koja je vršena u Laboratorio Central de Veterinaria (Algete, Spain). (Miguel Angel Jimenez-Clavero i suradnici. (2006). J Vet Diagn Invest 18: 7-17). Uzorci krvi su uzeti četiri i sedam dana nakon infekcije (D+4 p. i. i D+7 p. i). Tretman uzoraka krvi, potpuna ekstrakcija nukleinske kiseline nakon postupka ekstrakcije nukleinske kiseline u 96 otvora i stvarno vreme RT-PCR, se vrše kako su opisali Miguel Angel Jimenez-Clavero i suradnici 2006 (J. Vet. Diagn. Invest. 18: 7-17). Za analize PCR. dat je početni ciklus (Ct). Uzorci se smatraju pozitivnim za BTV ukoliko imaju Ct vrednosti manje od 36. Uzorci koji imaju Ct vrednosti između 36 i 40 se smatraju nepouzdanim.

Tabela 3

Ref. FDV= Referentni broj životinje

Tabela 4

Ref. FDV= Referentni broj životinje

Za poređenje između vakcinisanih i nevakcinisanih životinja uzimaju se u obzir rezultati stvarnog vremena RT-PCR. srednja vrednost Ct iz kontrolne grupe se oduzima od prosečne Ct vrednosti od svake različito vakcinisane grupe. (Miguel Angel Jimenez-Clavero i suradnici. (2006)). J Vet Diagn Invest 18: 7-17) su pokazali da detekcija postignuta analizom stvarnog vremena RT-PCR pokazuje linearni odnos između signala i količine virusne RNA prisutne u uzorku (ekvivalent TCID50 inficiranih jedinica po mililitru) na log skali (koeficijent korelacije od 0. 9948 i nagib od -3. 334). Iz ovog razloga, razlika srednje vrednosti Ct između

svake definisane grupe i kontrolne grupe se deli sa 3. 334 i izračunava se logaritam dobijenog broja.

Tabela 5

ZAKLJUČAK

Izračunati brojevi [log (Ct raz/3, 334)] pokazuju odnos između kontrolnih i vakcinisanih grupa. 7 dana nakon adražaja:

1. Životinje vakcinisane sa adjuvantom Alhydrogel-om i Quil-A imaju 3 puta manje virusa u krvi nego kontrolna grupa (dati su podaci samo za 1 nevakcinisanu životinju).

2. Životinje vakcinisane sa SP-ulje ili SL-CD adjuvantom ne pokazuju bilo kakvu redukciju viremije u poređenju sa kontrolnom grupom (dati su podaci samo za 1 nevakcinisanu životinju).

3. Alhydrogel (aluminijum hidroksid) i Quil-A (saponin) je bolji adjuvant nego SP-ulje ili SLCD.

PRIMER 3: EFEKAT KONCENTRACIJE ANTIGENA NA REDUKCIJU VIREMIJE

EKSPERIMENT PRE-IMUNOGENIČNOSTI NA JAGNJADIMA STARIM 2 MESECA Životinje se vakcinišu subkutano (2 ml) a revakcinišu 3 nedelje kasnije.

Životinje vakcinisane sa vakcinama A-l, A-2 i A-3 su nadražene 5-6 nedelja nakon revakcinacije (doza nadražaja = 107 TCID50 živih virusa/životinja). Nijedna od nadraženih životinja nije zaštićena. Međutim, uočena je redukcija viremije u zavisnosti od doze antigena. *

TABELA 6. KOMPOZICIJA VAKCINA PRE-IMUNO BTV

ODGOVOR ANTITELA NAKON VAKCINACIJE

TABELA 7. PROCENAT POZITIVNIH ŽIVOTINJA (ELISA TEST)

REZULTATI NADRAŽAJA

Životinje vakcinisane sa serijama A-l, A-2 i A-3 su nadražene (5 životinja u svakoj grupi) 5-6 nedelja nakon revakcinacije. Dve nevakcinisane kontrolne grupe su takođe nadražene.

Virus plavog jezika (BTV) se detektuje u uzorcima krvi ispitivanjem reakcije stvarnog vremena reverzne transkripcije lanca polimeraze (RT-PCR) koja je vršena u Laboratorio Central de Veterinaria (Algete, Spain). (Miguel Angel Jimenez-Clavero i suradnici. (2006). J Vet Diagn Invest 18: 7-17). Uzorci krvi su uzeti tri i pet dana nakon infekcije (D+3 p. i. i D+5 p. i). Tretman uzoraka krvi, potpuna ekstrakcija nukleinske kiseline nakon postupka ekstrakcije nukleinske kiseline u 96 otvora i stvarno vreme RT-PCR, se vrše kako su opisali Miguel Angel Jimenez-Clavero i suradnici 2006 (J. Vet. Diagn. Invest. 18: 7-17). Za analize PCR, dat je početni ciklus (Ct). Uzorci se smatraju pozitivnim za BTV ukoliko imaju Ct vrednosti manje od 36. Uzorci koji imaju Ct vrednosti između 36 i 40 se smatraju nepouzdanim.

Tabela 8

Ref. FDV= Referentni broj životinje Tabela 9

Ref. FDV= Referentni broj životinje

Za poređenje između vakcinisanih i nevakcinisanih životinja uzimaju se u obzir rezultati stvarnog vremena RT-PCR, srednja vrednost Ct iz kontrolne grupe se oduzima od prosečne Ct vrednosti od svake različito vakcinisane grupe. (Miguel Angel Jimenez-Clavero i suradnici. (2006)). J Vet Diagn Invest 18: 7-17) su pokazali da detekcija postignuta analizom stvarnog vremena RT-PCR pokazuje linearni odnos između signala i količine virusne RNA prisutne u uzorku (ekvivalent TCIDso inficiranih jedinica po mililitru) na log skali (koeficijent korelacije od 0. 9948 i nagib od -3. 334). Iz ovog razloga, razlika srednje vrednosti Ct između svake defmisane grupe i kontrolne grupe se deli sa 3. 334 i izračunava se logaritam dobijenog broja.

ZAKLJUČCI

Izračunati brojevi [log (Ct raz/3, 334)] pokazuje odnos između kontrolnih i vakcinisanih grupa. 5 dana nakon nadražaja:

1. Životinje vakcinisane sa 106TCID50/doza imaju dva puta manje virusa u krvi nego kontrolna grupa (ne-vakcinisane životinje)

2. Životinje vakcinisane sa IO6 7TCID50/doza imaju 6 puta manje virusa u krvi nego kontrolna grupa (ne-vakcinisane životinje).

3. Životinje vakcinisane sa 107TCID50/doza imaju 13-puta manje virusa u krvi nego kntrolna grupa (ne-vakcinisane životinje)

PRIMER 4: KOMPOZICIJA ADJUVANTA I DOZE

EKSPERIMENT IMUNOGENIČNOSTI NA JAGNJADIMA STARIM 1 MESEC Životinje se vakcinišu subukutano (2 ml) i revakcinišu 3 nedelje kasnije.

Životinje vakcinisane sa vakcinama Kl, K2, K6 i K8 su nadražene 3-4 nedelje nakon revakcinacije (doza nadražaja = IO7 TCID50 živog virusa/životinja). Zaštićene su samo životinje vakcinisane sa vakcinama Kl i K2.

Tabela 12. KOMPOZICIJE BTV PRE-IMUNO VAKCINA SERIJE K

• BTVi antigen: kompletna kultura, proces ukupne inaktivacije 72h (10 mM BEI x 24h + 5 mM BEI x 48 h)

ODGOVOR ANTITELA NAKON VAKCINACIJE Tabela 13. *EL1SA serološki rezultati

Tekst u bold-u i Italiku: nadražene životinje su iskrvarile 45 dana nakon revakcinacije * SN test: Na bazi SN testa u Vero ćelijama opisanim sa OIE sa malim modifikacijama. Zadatak tehnike je da odredi najveće sero razblaženje koje je sposobno da blokira infekciju 100 TCID50 BTV u Vero ćelijama. Izvršene su dve kontrole: uzimajući u obzir 100% citopatični efekat redukcije i 90% citopatični efekat redukcije.

NADRAŽAJ

U skladu sa ELISA rezultatima, vakcinc formulisane sa SP-ulje i Drakeol-om nisu uzete u obzir za nadražaj. Na osnovu rezultata sigurnosti iz prethodnih eksperimenata, takođe su isključene vakcine formulisane sa Montanide™ ISA 206.

Jaganjci vakcinisani sa serijama Kl, K2, K7 i K8 su nadraženi 24 dana nakon revakcinacije. Uključena je grupa od 5 nevakcinisanih kontrola.

Virus plavog jezika (BTV) je detektovan u uzorcima krvi pomoću reakcije stvarnog vremena reverzne transkripcije-lanca polimeraze (RT-PCR)

*2 uzastopna nepouzdana rezultata

ZAKLJUČCI

Jedina vakcina sposobna da spreči viremiju je serija K2 formulisana sa 1 x 107 TCID50/doza i Alhydrogel-om i Quil-A kao adjuvantom. Viremija je registrovana samo kod

jedne od pet životinja vakcinisanih sa serijom Kl formulisanom sa istim adjuvantom ali sa nižom koncentracijom antigena (3 x 106 TCID50/doza).

Rezultati dobijeni sa vakcinama serija K7 i K8 formulisanih sa Montanide™ ISA 206 (Seppic) nisu zadovoljili.

Nisu dobijeni rezultati nadražaja za Montanide™ ISA 207 (Seppic) koja pokazuje slične serološke rezultate.

PRIMER 5. FINALNA KOMPOZICIJA VAKCINE Tabela 16

Claims (32)

1.    Kompoziciju za izazivanje imunog odgovora na virus plavog jezika (BTV) kod životinja, naznačenu time što uključuje imunogenično efektivnu količinu najmanje jednog soja dvostruko inaktiviranog virusa plavog jezika i biološki prihvatljiv adjuvant.

2.    Kompoziciju u skladu sa patentnim zahtevom 1, naznačenu time što je dvostruko inaktivirani BTV prvi put inaktiviran sa sredstvom za inaktivaciju u koncentraciji od približno 10 mM, a drugi put je inaktirivan sa sredstvom za inaktivaciju u koncentraciji od približno 5 mM.

3.    Kompoziciju u skladu sa patentnim zahtevima 1 ili 2, naznačenu time što je sredstvo za inaktivaciju binarni etilenimin (BEI).

4. Kompoziciju u skladu sa patentnim zahtevom 1, naznačenu time što je soj serotip 4.

5. Kompoziciju u skladu sa bilo kojim patentnim zahtevom 1-4, naznačenu time što je to kompozicija vakcine ili imunogenična kompozicija.

6.    Kompoziciju u skladu sa bilo kojim patentnim zahtevom 1-5, naznačenu time što je životinja preživar izabrana iz grupe koja sadrži ovce, jaganjce, koze, goveda i jelensku divljač.

7.    Kompoziciju u skladu sa patentnim zahtevom 6, naznačenu time što je preživar ovca ili jagnje.

8. Kompoziciju u skladu sa bilo kojim patentnim zahtevom 1 -7, naznačenu time što je biološki prihvatljiv adjuvant izabran iz grupe koja sadrži jedan ili više aluminijum hidroksid, saponin, SL-CD, karbopol i SP-ulje.

9.    Kompoziciju u skladu sa patentnim zahtevom 8, naznačenu time što biološki prihvatljiv adjuvant uključuje mešavinu aluminij um hidroksida i saponina.

10.    Kompoziciju u skladu sa patentnim zahtevom 9, naznačenu time što je aluminijum hidroksid prisutan u koncentraciji između približno 1% i približno 10%.

11.    Kompoziciju u skladu sa patentnim zahtevom 10, naznačenu time što je aluminijum hidroksid prisutan u koncentraciji između približno 2% i približno 5%.

12.    Kompoziciju u skladu sa patentnim zahtevom 11, naznačenu time što je aluminijum hidroksid prisutan u koncentraciji od približno 3%.

13.    Kompoziciju u skladu sa bilo kojim patentnim zahtevom 1-12, naznačenu time što izazvani imuni odgovor štiti životinju od infekcije sa, ili redukuje ozbiljnost najmanje jednog simptoma povezanog sa infekcijom patogenim sojem virusa plavog jezika.

14.    Postupak za pojačavanje imunog odgovora kod životinja na virus plavog jezika, ili za prevenciju ili redukciju najmanje jednog simptoma povezanog sa oboljenjem, naznačen time što postupak uključuje fazu primene pojedinačne ili višestrukih doza kompozicije u skladu sa bilo kojim patentnim zahtevom 1-13.

15.    Postupak u skladu sa patentnim zahtevom 14, naznačenu time što je životinja preživar izabran iz grupe koja sadrži ovce, jaganjce, koze, goveda i jelensku divljač.

16.    Postupak u skladu sa patentnim zahtevom 15, naznačen time što je preživar ovca ili jagnje.

17.    Postupak u skladu sa bilo kojim patentnim zahtevom 14-16, naznačen time što se faza primene postiže parenteralnom primenom.

18.    Postupak u skladu sa patentnim zahtevom 17, naznačen time što se faza parenteralne primene postiže intramuskularnom injekcijom.

19.    Postupak u skladu sa bilo kojim patentnim zahtevom 14-16, naznačen time što se faza parenteralne primene postiže oralnom primenom.

20.    Postupak u skladu sa patentnim zahtevom 19, naznačen time što se faza oralne primene postiže ručnim davanjem ili masovnom primenom.

21.    Postupak za prevenciju ili ublažavanje pojavljivanja virusa plavog jezika, naznačen time što uključuje fazu primene kompozicije u skladu sa bilo kojim patentnim zahtevom 1-13 na životinji.

22.    Postupak u skladu sa patentnim zahtevom 21, naznačen time što je životinja preživar izabran iz grupe koja sadrži ovce, jaganjce, koze, goveda i jelensku divljač.

23.    Postupak u skladu sa patentnim zahtevom 22, naznačen time što je preživar ovca ili jagnje.

24.    Postupak u skladu sa patentnim zahtevom 22 ili 23, naznačen time što se faza primene postiže parenteralnom primenom.

25.    Postupak u skladu sa patentnim zahtevom 24, naznačen time što se faza parenteralne primene postiže intramuskularnom injekcijom.

26.    Postupak u skladu sa bilo kojim patentnim zahtevom 21-23, naznačen time što se faza primene postiže oralnom primenom.

27.    Postupak u skladu sa patentnim zahtevom 26, naznačen time što se faza oralne primene postiže ručnim davanjem ili masnovnom primenom.

28.    Postupak za produkciju inaktiviranog celog virusa plavog jezika (BTV), naznačen time što uključuje faze: a) tretiranje BTV sa sredstvom za inaktivaciju koristeći odnos sredstva za inaktivaciju i BTV od 1: 10; b)    homogenizaciju mešavine sredstvo za inaktivaciju/BTV iz faze a) najmanje 15 minuta; c)    dekantovanje mešavine iz faze b) u sterilni kontejner i agitaciju mešavine u toku približno 24 sata; d)    tretiranje BTV drugi put sa sredstvom za inaktivaciju koristeći odnos sredstva za inaktivaciju i BTV od 1: 20; e)    homogenizaciju mešavine sredstvo za inaktivaciju/BTV iz faze d) najmanje 15 minuta; f)    dekantovanje mešavine iz faze e) u sterilni kontejner i agitaciju mešavine u toku približno 48 sati; i g)    neutralizaciju sredstva za inaktivaciju da se finalni pH podesi na približno 7. 2; pri čemu postupak za rezultat ima inaktivaciju BTV uz održavanje imunogeničnosti BTV.

29.    Postupak u skladu sa patentnim zahtevom 28, naznačen time stoje sredstvo za inaktivaciju binarni etilenimin (BEI).

30.    Postupak u skladu ili sa patentnim zahtevom 28 ili 29, naznačen time sto je finalna koncentracija sredstva za inaktivaciju u fazi a) približno 10 mM.

31.    Postupak u skladu ili sa patentnim zahtevom 28 ili 29, naznačen time što je finalna koncentracija sredstva za inaktivaciju u fazi d) približno 5 mM.

32. Postupak u skladu sa bilo kojim patentnim zahtevom 28-31, naznačen time što je ceo virus plavog jezika serotip 4.