MD3774879T2 - Variante de anticorpi C-terminali - Google Patents

Abstract

Invenţia se referă, în general, la anticorpi anti-sclerostină cu modificări C-terminale şi la compoziţii care cuprind astfel de anticorpi.

Description

[0001] DOMENIUL TEHNIC AL INVENŢIEI

[0002] Invenţia se referă, în general, la anticorpi anti-sclerostină care au cel puţin o modificare C-terminală şi la compoziţii care cuprind astfel de anticorpi.

[0003] STADIUL TEHNICII

[0004] Pierderea conţinutului mineral osos poate fi cauzată de o varietate largă de afecţiuni şi poate duce la probleme medicale semnificative. De exemplu, osteoporoza este o boală debilitantă la om şi se caracterizează prin scăderi marcate ale masei osoase scheletice şi ale densităţii minerale, deteriorarea structurală a oaselor, inclusiv prin degradarea microarhitecturii osoase şi creşteri corespunzătoare ale fragilităţii osoase, (adică, scăderea rezistenţei osoase) şi susceptibilitate la fracturi la persoanele afectate. Deşi osteoporoza a fost considerată o creştere a riscului de fractură din cauza scăderii masei osoase, puţine dintre tratamentele disponibile în prezent pentru afecţiunile scheletice pot creşte densitatea osoasă la adulţi şi majoritatea tratamentelor disponibile în prezent funcţionează în principal prin inhibarea resorbţiei osoase suplimentare, mai degrabă decât prin stimularea formării de os nou. Estrogenul este prescris acum pentru a întârzia pierderea osoasă. Cu toate acestea, există unele controverse cu privire la faptul dacă pacienţii obţin vreun beneficiu pe termen lung şi dacă estrogenul are vreun efect asupra pacienţilor cu vârsta peste 75 de ani. Mai mult, se crede că utilizarea estrogenului creşte riscul de cancer mamar şi endometrial. Calcitonina, osteocalcina cu vitamina K, sau doze mari de calciu alimentar, cu sau fără vitamina D, au fost, de asemenea, sugerate pentru femeile aflate la postmenopauză. Cu toate acestea, dozele mari de calciu au adesea efecte secundare gastrointestinale nedorite şi nivelurile de calciu seric şi urinar trebuie monitorizate continuu (de ex., Khosla şi Riggs, Mayo Clinic. Proc. 70:978982, 1995). Alte abordări terapeutice actuale pentru osteoporoză includ bifosfonaţii (de ex., Fosamax™Actonel™, Bonviva™, Zometa™, olpadronat, neridronat, skelidă, bonefos), hormonul paratiroidian, calciliticele, calcimimeticele (de ex., cinacalcet), statinele, steroizii anabolizanţi, sărurile de lantan şi stronţiu şi fluorura de sodiu. Cu toate acestea, astfel de terapii sunt adesea asociate cu efecte secundare nedorite (a se vedea Khosla şi Riggs, supra).

[0005] Sclerostina, produsul genei SOST, este absentă în sclerosteoză, o boală scheletică caracterizată prin creştere osoasă excesivă şi oase puternice şi dense (Brunkow ş.a., Am. J. Hum. Genet., 68:577-589, 2001; Balemans ş.a., Hum. Mol. Genet., 10:537-543, 2001). Secvenţa de aminoacizi a sclerostinei umane este raportată de Brunkow ş.a., ibid. şi este descrisă aici ca SECV ID NR: 1. Sclerostina este o ţintă valoroasă pentru medierea creşterii densităţii osoase. WO 2009/039175 A2 (Amgen Inc.) şi WO 2011/143307 A1 (Amgen Inc.) dezvăluie anticorpi anti-sclerostină şi utilizarea lor în tratarea afecţiunilor osoase.

[0006] REZUMAT

[0007] Invenţia este definită în revendicările anexate. Invenţia furnizează un anticorp care se leagă specific la sclerostina cu SECV ID NR: 1, în care anticorpul cuprinde un lanţ greu care cuprinde secvenţa de aminoacizi Pro-Ala-Arg-Gly (SECV ID NR: 8) la capătul C-terminal al lanţului greu, în care anticorpul cuprinde o secvenţă de aminoacizi a lanţului uşor prezentată în SECV ID NR: 12 şi o secvenţă de aminoacizi a lanţului greu prezentată în SECV ID NR: 13, sau SECV ID NR: 14. În unele exemple de realizare, anticorpul cuprinde secvenţa de aminoacizi Pro-Ala-Arg-Gly-Lys (SECV ID NR: 11) la capătul C-terminal al lanţului greu. În unele exemple de realizare, anticorpul cuprinde un prim lanţ greu care cuprinde secvenţa de aminoacizi Pro-Ala-Arg-Gly (SECV ID NR: 8) la capătul C-terminal al primului lanţ greu şi un al doilea lanţ greu care cuprinde o secvenţă de aminoacizi a lanţului greu de tip sălbatic (adică, fără Pro-Ala-Arg-Gly C-terminal). În unele exemple de realizare, anticorpul cuprinde secvenţa de aminoacizi a lanţului uşor prezentată în SECV ID NR: 12 şi secvenţa de aminoacizi a lanţului greu prezentată în SECV ID NR: 13. În unele exemple de realizare, anticorpul cuprinde secvenţa de aminoacizi Pro-Ala-Arg-Gly-Lys (SECV ID NR: 11) la capătul C-terminal al lanţului greu. În unele exemple de realizare, anticorpul cuprinde secvenţa de aminoacizi a lanţului uşor prezentată în SECV ID NR: 12 şi secvenţa de aminoacizi a lanţului greu prezentată în SECV ID NR: 14.

[0008] În unele exemple de realizare, capătul C-terminal al unuia dintre lanţurile grele ale anticorpului este amidat (adică, anticorpul este mono amidat). În unele exemple de realizare, capătul C-terminal al ambelor lanţuri grele ale anticorpului este amidat (adică, anticorpul este dublu amidat).

[0009] Dezvăluirea prezintă, de asemenea, compoziţii farmaceutice care cuprind o populaţie de anticorpi descrişi aici şi un purtător acceptabil farmaceutic. În unele exemple de realizare, compoziţia farmaceutică cuprinde un amestec de anticorpi care se leagă specific de sclerostina cu SECV ID NR: 1 şi un purtător acceptabil farmaceutic, în care 3-5% dintre anticorpii din compoziţie sunt o populaţie de anticorpi ai invenţiei. În unele aspecte, mai puţin de 70% din populaţia de anticorpi este amidată pe unul, sau pe ambele lanţuri grele. În unele aspecte, toată sau o parte din populaţia de anticorpi cuprinde un singur lanţ greu care cuprinde o secvenţă C-terminală Pro-Ala-Arg-Gly (SECV ID NR: 8), care este opţional amidată. În unele aspecte, toată, sau o parte din populaţia de anticorpi cuprinde o secvenţă C-terminală Pro-Ala-Arg-Gly (SECV ID NR: 8) în ambele lanţuri grele şi ambele lanţuri grele sunt, opţional, amidate. Opţional, mai puţin de 35% din populaţia de anticorpi este mono amidată şi/sau mai puţin de 35% din populaţia de anticorpi este amidată pe ambele lanţuri grele şi/sau mai puţin de 35% din populaţia de anticorpi cuprinde lanţuri grele care nu sunt amidate. În acest sens, în diverse aspecte, 33% din populaţia de anticorpi nu este amidată, 33% din populaţia de anticorpi cuprinde un lanţ greu amidat şi 33% din populaţia de anticorpi cuprinde două lanţuri grele amidate.

[0010] În unele exemple de realizare, compoziţia cuprinde, în plus, o sare de calciu, un tampon acetat, un poliol şi un surfactant. În unele exemple de realizare, sarea acetat cuprinde acetat de calciu, tamponul acetat cuprinde acetat de sodiu, poliolul cuprinde zaharoză şi surfactantul cuprinde polisorbat 20. În unele exemple de realizare, compoziţia cuprinde 55 mM acetat, 13 mm calciu, 6,0% (g/v) zaharoză şi 0,006% (g/v) polisorbat 20, pH 5,2.

[0011] De asemenea, este furnizată compoziţia farmaceutică a invenţiei pentru utilizare în tratamentul unei afecţiuni osoase a unui subiect.

[0012] SCURTĂ DESCRIERE A FIGURILOR

[0013] Figura 1 prezintă o secvenţă de acid nucleic care codifică o porţiune a capătului C-terminal al romosozumabului de tip sălbatic.

[0014] Figura 2 prezintă o secvenţă de acid nucleic care codifică o porţiune a capătului C-terminal al variantei C-terminale a romosozumabului (varianta PARG).

[0015] Figura 3 este un grafic care prezintă profilul UV mărit al romosozumabului de tip sălbatic (linie punctată) suprapus cu varianta PARG a romosozumabului (linie continuă) care a fost digerată de Lys-C şi analizată prin cartografiere peptidică LC/MS.

[0016] Figura 4 este un grafic care prezintă profilul de schimb cationic (CEX) al variantei PARG cu romosozumab tratată cu carboxipeptidază (linie punctată) suprapusă cu varianta PARG cu romosozumab netratată (linie continuă).

[0017] Figura 5 este un grafic care prezintă procentul de recuperare din modelul Scissor al unei injecţii subcutanate, prezentat în funcţie de timp. Romosozumab de tip sălbatic (cercuri) şi varianta c-terminală PARG a romosozumabului difuzează la viteze diferite pentru locul de injectare simulat.

[0018] Figura 6 este un grafic care arată că atât romosozumabul de tip sălbatic, cât şi varianta C-terminală a PARG a romosozumabului s-au legat similar de FcRn şi că legarea FcRn nu a fost afectată de mutaţia PARG.

[0019] Figura 7 este un grafic care arată că legarea relativă a variantei C-terminale a PARG a romosozumabului la FcyRIIa (131H) a fost mult mai mare decât cea a romosozumabului de tip sălbatic.

[0020] DESCRIERE DETALIATĂ

[0021] Invenţia oferă un anticorp care se leagă specific la sclerostină cu SECV ID NR: 1, în care anticorpul cuprinde un lanţ greu care cuprinde secvenţa de aminoacizi Pro-Ala-Arg-Gly (SECV ID NR: 8) la capătul C-terminal al lanţului greu, în care anticorpul cuprinde o secvenţă de aminoacizi a lanţului uşor prezentată în SECV ID NR: 12 şi o secvenţă de aminoacizi a lanţului greu prezentată în SECV ID NR: 13, sau SECV ID NR: 14. În unele exemple de realizare, anticorpul cuprinde un prim lanţ greu care cuprinde o secvenţă de aminoacizi care cuprinde Pro-Ala-Arg-Gly (SECV ID NR: 8) la capătul C-terminal al lanţului greu şi un al doilea lanţ greu care cuprinde o secvenţă de aminoacizi a lanţului greu de tip sălbatic. În unele exemple de realizare, anticorpul cuprinde o secvenţă de aminoacizi care cuprinde Pro-Ala-Arg-Gly-Lys (SECV ID NR: 11) la capătul C-terminal al lanţului greu. Sunt de asemenea furnizate compoziţii farmaceutice care cuprind anticorpul (sau amestecul de anticorpi) şi metode de utilizare a anticorpului.

[0022] Un "anticorp anti-sclerostină", sau un "anticorp care se leagă de sclerostină" este un anticorp care se leagă de sclerostina cu SECV ID NR: 1, sau de porţiuni ale acesteia. Sclerostina/SOST umană recombinantă este disponibilă comercial, de ex., de la R&D Systems (Minneapolis, Minn., SUA; Catalog 2006 #1406-ST-025). Brevetele U.S. nr. 6.395.511 şi 6.803.453 şi Publicaţiile brevetelor U.S. nr. 2004/0009535 şi 2005/0106683 se referă, în general, la anticorpi anti-sclerostină. Exemplele de anticorpi ai sclerostinei adecvaţi pentru utilizare în contextul invenţiei sunt descrise şi în Publicaţiile brevetelor U.S. nr. 2007/0110747 şi 2007/0072797. Informaţii suplimentare privind materialele şi metodele de generare a anticorpilor anti-sclerostină pot fi găsite în Publicaţia brevetului U.S. nr. 20040158045.

[0023] Termenul "anticorp" se referă la o moleculă de imunoglobulină intactă (inclusiv versiuni policlonale, monoclonale, himerice, umanizate şi/sau umane care au lanţuri grele şi/sau uşoare de lungime completă).

[0024] "Se leagă specific", aşa cum s-a utilizat aici, înseamnă că anticorpul se leagă preferenţial la antigen comparativ cu alte proteine. În unele exemple de realizare, "se leagă specific" înseamnă că anticorpul are o afinitate mai mare pentru antigen decât pentru alte proteine. Anticorpii care se leagă specific de un antigen pot avea o afinitate de legare pentru antigen mai mică sau egală cu 1 x 10-7 M, mai mică sau egală cu 2 x 10-7 M, mai mică sau egală cu 3 x 10-7 M, mai mică sau egală cu 4 x 10-7 M, mai mică sau egală cu 5 x 10-7 M, mai mică sau egală cu 6 x 10-7 M, mai mică sau egală cu 7 x 10-7 M, mai mică sau egală cu 8 x 10-7 M, mai mică sau egală cu 9 x 10-7 M, mai mică sau egală cu 1 x 10-8 M, mai mică sau egală cu 2 x 10-8 M, mai mică sau egală cu 3 x 10-8 M, mai mică sau egală cu 4 x 10-8 M, mai mică sau egală cu 5 x 10-8 M, mai mică sau egală cu 6 x 10-8 M, mai mică sau egală cu 7 x 10-8 M, mai mică sau egală cu 8 x 10-8 M, mai mică sau egală cu 9 x 10-8 M, mai mică sau egală cu 1 x 10-9 M, mai mică sau egală cu 2 x 10-9 M, mai mică sau egală cu 3 x 10-9 M, mai mică sau egală cu 4 x 10-9 M, mai mică sau egală cu 5 x 10-9 M, mai mică sau egală cu 6 x 10-9 M, mai mică sau egală cu 7 x 10-9 M, mai mică sau egală cu 8 x 10-9 M, mai mică sau egală cu 9 x 10-9 M, mai mică sau egală cu 1 x 10-10 M, mai mică sau egală cu 2 x 10-10 M, mai mică sau egală cu 3 x 10-10 M, mai mică sau egală cu 4 x 10-10 M, mai mică sau egală cu 5 x 10-10 M, mai mică sau egală cu 6 x 10-10 M, mai mică sau egală cu 7 x 10-10 M, mai mică sau egală cu 8 x 10-10 M, mai mică sau egală cu 9 x 10-10 M, mai mică sau egală cu 1 x 10-11 M, mai mică sau egală cu 2 x 10-11 M, mai mică sau egală cu 3 x 10-11 M, mai mică sau egală cu 4 x 10-11 M, mai mică sau egală cu 5 x 10-11 M, mai mică sau egală cu 6 x 10-11 M, mai mică sau egală cu 7 x 10-11 M, mai mică sau egală cu 8 x 10-11 M, mai mică sau egală cu 9 x 10-11 M, mai mică sau egală cu 1 x 10-12 M, mai mică sau egală cu 2 x 10-12 M, mai mică sau egală cu 3 x 10-12 M, mai mică sau egală cu 4 x 10-12 M, mai mică sau egală cu 5 x 10-12 M, mai mică sau egală cu 6 x 10-12 M, mai mică sau egală cu 7 x 10-12 M, mai mică sau egală cu 8 x 10-12 M, sau mai mică sau egală cu 9 x 10-12 M.

[0025] În unele, sau oricare dintre exemplele de realizare, anticorpul se leagă de sclerostina cu SECV ID NR: 1, sau de o variantă naturală a acesteia, cu o afinitate (Kd) mai mică sau egală cu 1 x 10-7 M, mai mică sau egală cu 1 x 10-8 M, mai mică sau egală cu 1 x 10-9 M, mai mică sau egală cu 1 x 10-10 M, mai mică sau egală cu 1 x 10 -11 M, or mai mică sau egală cu 1 x 10 -12 M. Afinitatea este determinată folosind o varietate de tehnici, un exemplu fiind un test ELISA de afinitate. În diverse exemple de realizare, afinitatea este determinată printr-un test BIAcore. În diverse exemple de realizare, afinitatea este determinată printr-o metodă cinetică. În diverse exemple de realizare, afinitatea este determinată printr-o metodă de echilibru/soluţie. Publicaţia brevetului U.S. nr. 2007/0110747 conţine descrieri suplimentare ale testelor de afinitate adecvate pentru determinarea afinităţii (Kd) unui anticorp pentru sclerostină.

[0026] În unele sau oricare dintre exemplele de realizare, anticorpul (sau fragmentele de anticorp ale acestuia) se leagă de o polipeptidă sclerostină care cuprinde secvenţa de aminoacizi prezentată în SECV ID NR: 1 şi se leagă de o regiune a sclerostinei care cuprinde secvenţa SECV ID NR: 5 ((CGPARLLPNAIGRGKWWRPSGPDFRC; care corespunde aminoacizilor 86-111 din SECV ID NR: 1). Această regiune este denumită aici şi regiunea "bucla 2" a sclerostinei. Regiunile de sclerostină din afara regiunii bucla 2 sunt definite aici ca "regiuni non-bucla 2". Alternativ, sau suplimentar, anticorpul anti-sclerostină se leagă de o polipeptidă sclerostină care cuprinde aminoacizii 57-146 din SECV ID NR: 1. Alternativ, sau suplimentar, anticorpul anti-sclerostină se leagă de o polipeptidă sclerostină care cuprinde aminoacizii 89-103 din SECV ID NR: 1 şi/sau aminoacizii 137-151 din SECV ID NR: 1. În unele, sau oricare dintre exemplele de realizare, polipeptida sclerostină care este un fragment de sclerostină de lungime completă păstrează structura terţiară a regiunii polipeptidice corespunzătoare a sclerostinei umane din SECV ID NR: 1.

[0027] În unele, sau oricare dintre exemplele de realizare, anticorpul anti-sclerostină descris aici modulează de preferinţă funcţia sclerostinei în testul bazat pe celule descris în Publicaţia brevetului U.S. nr. 2007/0110747 şi/sau în testul in vivo descris în Publicaţia brevetului U.S. nr. 20070110747 şi/sau se leagă de unul, sau mai mulţi dintre epitopii descrişi în Publicaţia brevetului U.S. nr. 2007/0110747 şi/sau blochează încrucişat legarea unuia dintre anticorpii descrişi în Publicaţia brevetului U.S. nr. 2007/0110747 şi/sau sunt blocate încrucişat de legarea la sclerostină de către unul dintre anticorpii descrişi în Publicaţia brevetului U.S. nr. 2007/0110747.

[0028] "CDR" se referă la regiunea care determină complementaritatea din secvenţele variabile ale anticorpului. Există trei CDRs în fiecare dintre regiunile variabile ale lanţului greu şi ale lanţului uşor, denumite CDR1, CDR2 şi CDR3, pentru fiecare dintre regiunile variabile. Termenul "set de şase CDRs", aşa cum este utilizat aici, se referă la un grup de trei CDRs care apar în regiunea variabilă a lanţului uşor şi în regiunea variabilă a lanţului greu, care sunt capabile să se lege de antigen. Limitele exacte ale CDRs au fost definite diferit în funcţie de diferitele sisteme. Sistemul descris de Kabat (Kabat ş.a., Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987) şi (1991)) nu numai că oferă un sistem de numerotare a resturilor neechivoc, aplicabil oricărei regiuni variabile a unui anticorp, dar oferă şi limite precise ale resturilor care definesc cele trei CDRs. Aceste CDRs pot fi denumite CDRs Kabat. Chothia şi colegii (Chothia & Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987) şi Chothia ş.a., Nature 342:877-883 (1989)) au constatat că anumite subporţiuni din cadrul CDRs Kabat adoptă conformaţii aproape identice ale scheletului peptidic, în ciuda unei mari diversităţi la nivelul secvenţei de aminoacizi. Aceste subporţiuni au fost desemnate ca L1, L2 şi L3, sau H1, H2 şi H3, unde "L" şi "H" desemnează regiunile lanţului uşor şi respectiv ale lanţurilor grele. Aceste regiuni pot fi denumite CDRs Chothia, care au limite care se suprapun cu CDRs Kabat. Alte limite care definesc CDRs care se suprapun cu CDRs Kabat au fost descrise de Padlan (FASEB J. 9:133-139 (1995)) şi MacCallum (J Mol Biol 262(5):73245 (1996)). Alte definiţii ale limitelor CDR pot să nu urmeze strict unul dintre sistemele de mai sus, dar se vor suprapune totuşi cu CDRs Kabat, deşi pot fi scurtate, sau prelungite în lumina predicţiilor, sau descoperirilor experimentale conform cărora anumite resturi, sau grupuri de resturi, sau chiar CDRs întregi nu au un impact semnificativ asupra legării antigenului. Metodele utilizate aici pot utiliza CDRs definite conform oricăruia dintre aceste sisteme, deşi exemplele de realizare preferate utilizează CDRs definite de Kabat sau Chothia.

[0029] CDRs se obţin, de ex., prin construirea de polinucleotide care codifică CDR de interes. Astfel de polinucleotide sunt preparate, de exemplu, prin utilizarea reacţiei în lanţ a polimerazei pentru a sintetiza regiunea variabilă folosind mARN al celulelor producătoare de anticorpi ca model (vezi, de exemplu, Larrick ş.a., Methods: A Companion to Methods in Enzymology, 2:106 (1991); Courtenay-Luck, "Genetic Manipulation of Monoclonal Antibodies," în Monoclonal Antibodies Production, Engineering and Clinical Application, Ritter ş.a. (eds.), pagegina 166, Cambridge University Press (1995); şi Ward ş.a., "Genetic Manipulation and Expression of Antibodies," în Monoclonal Antibodies: Principles and Applications, Birch ş.a., (eds.), pagina 137, Wiley-Liss, Inc. (1995)).

[0030] În diverse aspecte ale dezvăluirii, un anticorp poate cuprinde cel puţin o secvenţă CDR care are o identitate de cel puţin 75% (de ex., cel puţin 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, sau 100%) cu un CDR selectat dintre CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2 şi CDR-L3, în care CDR-H1 are secvenţa dată în SECV ID NR: 2, CDR-H2 are secvenţa dată în SECV ID NR: 3, CDR-H3 are secvenţa dată în SECV ID NR: 4, CDR-L1 are secvenţa dată în SECV ID NR: 5, CDR-L2 are secvenţa dată în SECV ID NR: 6 şi CDR-L3 are secvenţa dată în SECV ID NR: 7. Un anticorp anti-sclerostină, în diverse aspecte, poate cuprinde două dintre CDRs, sau şase CDRs.

[0031] Un anticorp anti-sclerostină poate cuprinde un set de şase CDRs, după cum urmează: CDR-H1 din SECV ID NR: 2, CDR-H2 din SECV ID NR: 3, CDR-H3 din SECV ID NR: 4, CDR-L1 din SECV ID NR: 5, CDR-L2 din SECV ID NR: 6 şi CDR-L3 din SECV ID NR: 7.

[0032] Un anticorp poate cuprinde o regiune variabilă a lanţului uşor care cuprinde o secvenţă de aminoacizi care are o identitate de cel puţin 75% (de ex., cel puţin 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, sau 100%) cu secvenţa de aminoacizi prezentată în SECV ID NR: 9 şi o regiune variabilă a lanţului greu care cuprinde o secvenţă de aminoacizi care are o identitate de cel puţin 75% (de ex., cel puţin 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, sau 100%) cu secvenţa de aminoacizi prezentată în SECV ID NR: 10. În diverse aspecte, diferenţa de secvenţă comparativ cu SECV ID NR: 9, sau 10 se află în afara regiunii CDR în secvenţele corespunzătoare. Un anticorp poate cuprinde o regiune variabilă a lanţului uşor care cuprinde o secvenţă de aminoacizi prezentată în SECV ID NR: 9 şi o regiune variabilă a lanţului greu care cuprinde o secvenţă de aminoacizi prezentată în SECV ID NR: 10.

[0033] Un anticorp anti-sclerostină poate cuprinde tot, sau o parte dintr-un lanţ greu (de ex., două lanţuri grele) care cuprinde o secvenţă de aminoacizi care are o identitate de cel puţin 75% (de ex., cel puţin 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, sau 100%) cu secvenţa de aminoacizi prezentată în SECV ID NR: 16 şi tot, sau o parte dintr-un lanţ uşor (de ex., două lanţuri uşoare) care cuprinde o secvenţă de aminoacizi care are o identitate de cel puţin 75% (de ex., cel puţin 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, sau 100%) cu secvenţa de aminoacizi prezentată în SECV ID NR: 12.

[0034] Anticorpul conform invenţiei cuprinde un lanţ greu care cuprinde secvenţa de aminoacizi Pro-Ala-Arg-Gly (SECV ID NR: 8) la capătul C-terminal al lanţului greu. În unele exemple de realizare, capătul C-terminal al ambelor lanţuri grele ale anticorpului cuprinde secvenţa de aminoacizi Pro-Ala-Arg-Gly (SECV ID NR: 8). În unele exemple de realizare, anticorpul cuprinde un prim lanţ greu care cuprinde secvenţa de aminoacizi Pro-Ala-Arg-Gly (SECV ID NR: 8) şi un al doilea lanţ greu care cuprinde o secvenţă de aminoacizi de tip sălbatic. Un anticorp conform invenţiei cuprinde secvenţa de aminoacizi a lanţului uşor prezentată în SECV ID NR: 12 şi secvenţa de aminoacizi a lanţului greu prezentată în SECV ID NR: 13.

[0035] Alternativ, în unele sau oricare dintre exemplele de realizare, anticorpul cuprinde o secvenţă de aminoacizi care cuprinde Pro-Ala-Arg-Gly-Lys (SECV ID NR: 11) la capătul C-terminal al unui lanţ greu, opţional la capătul C-terminal al ambelor lanţuri grele. În unele exemple de realizare, anticorpul cuprinde un prim lanţ greu care cuprinde secvenţa de aminoacizi Pro-Ala-Arg-Gly-Lys (SECV ID NR: 11) şi un al doilea lanţ greu care cuprinde o secvenţă de aminoacizi de tip sălbatic (adică, fără Pro-Ala-Arg-Gly-Lys la C-terminal (SECV ID NR: 11)). Un anticorp al invenţiei cuprinde secvenţa de aminoacizi a lanţului uşor prezentată în SECV ID NR: 12 şi secvenţa de aminoacizi a lanţului greu prezentată în SECV ID NR: 14.

[0036] Exemplele de alţi anticorpi anti-sclerostină includ, dar nu se limitează la, anticorpii anti-sclerostină descrişi în publicaţiile internaţionale de brevete nr. WO 2008/092894, WO 2008/115732, WO 2009/056634, WO 2009/047356, WO 2010/100200, WO 2010/100179, WO 2010/115932 şi WO 2010/130830.

[0037] O persoană de specialitate în domeniu va înţelege că unele proteine, cum ar fi, anticorpii, pot suferi o varietate de modificări post-translaţionale. Tipul şi amploarea acestor modificări depind adesea de linia celulară gazdă utilizată pentru a exprima proteina, precum şi de condiţiile de cultură. Astfel de modificări pot include variaţii ale glicozilării, oxidarea metioninei, formarea dicetopiperizinei, izomerizarea aspartatului şi deamidarea asparaginei. O modificare frecventă este pierderea unui rest bazic carboxi-terminal (cum ar fi, lizina sau arginina) datorită acţiunii carboxipeptidazelor (aşa cum este descris în Harris, RJ. Journal of Chromatography 705:129-134, 1995).

[0038] Alte modificări includ hidroxilarea prolinei şi lizinei, fosforilarea grupărilor hidroxil ale resturilor de seril sau treonil, metilarea grupărilor α-amino ale lanţurilor laterale de lizină, arginină şi histidină (T. E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W. H. Freeman & Co., San Francisco, pp. 79-86 , acetilarea aminei N-terminale şi amidarea oricărei grupări carboxil C-terminale.

[0039] În unele, sau oricare dintre exemplele de realizare, capătul C-terminal al lanţului greu al anticorpului, care cuprinde secvenţa de aminoacizi Pro-Ala-Arg-Gly (SECV ID NR: 8), este amidat. În unele, sau oricare dintre exemplele de realizare, ambele lanţuri grele ale anticorpului cuprind secvenţa de aminoacizi Pro-Ala-Arg-Gly (SECV ID NR: 8) şi ambele lanţuri grele sunt amidate. În unele exemple de realizare, glicina este amidată. Amidarea poate avea loc, de ex., aşa cum este descris în Prigg, S. T. ş.a., "New insights into copper monooxygenases and peptide amidation: structure, mechanism and function", Cell. Mol. Life Sci. 57 (2000) 1236-1259. Enzima peptidilglicină α-amidantă monooxigenază (PAM) poate cataliza amidarea glicinei. PAM are două domenii active, peptidilglicină α-hidroxilantă monooxigenază (PHM) şi peptidil-α-hidroxilglicină α-amidantă liază (PAL). PHM catalizează conversia peptidilglicinei (împreună cu ascorbat şi oxigen) în peptidil α-hidroxilglicină (împreună cu semidehidrogenascorbat şi apă). La rândul său, PAL catalizează conversia peptidil α-hidroxilglicinei într-o peptidă amidată (şi glioxilat).

[0040] Amidarea unui anticorp poate fi controlată prin modificarea anumitor condiţii în timpul procesului de cultură celulară. De exemplu, nivelurile de cupru (de ex., în citratul feric de amoniu) şi/sau oxigen pot fi utilizate pentru a influenţa nivelurile de amidare. Se are în vedere faptul că creşterea concentraţiei de cupru (de ex., în mediu), sau a disponibilităţii oxigenului (de ex., în timpul cultivării) poate creşte amidarea prin influenţarea activităţii unei enzime, cum ar fi, PHM.

[0041] Compoziţii farmaceutice

[0042] Invenţia oferă o compoziţie farmaceutică care cuprinde o populaţie a anticorpului descris aici, împreună cu un diluant, purtător, solubilizant, emulgator, conservant şi/sau adjuvant eficient din punct de vedere farmaceutic. Compoziţiile farmaceutice ale invenţiei includ, dar nu se limitează la, compoziţii lichide, congelate şi liofilizate.

[0043] Invenţia oferă, de asemenea, o compoziţie farmaceutică care cuprinde un amestec de anticorpi care se leagă specific la sclerostina cu SECV ID NR: 1 şi un purtător acceptabil farmaceutic, în care 3-5% dintre anticorpii din compoziţie sunt o populaţie de anticorpi ai invenţiei (care au un lanţ greu (sau două lanţuri grele) care cuprinde secvenţa de aminoacizi Pro-Ala-Arg-Gly (SECV ID NR: 8) la capătul C-terminal al lanţului(urilor) greu(e)). Dezvăluirea are în vedere, de asemenea, compoziţii care cuprind cantităţi alternative (de ex., 5-10%, 1-3%, 3-15%, 2-10%, 4-20%, 1-5%) din populaţia de anticorpi descrişi aici (de ex., anticorpi care cuprind un set de şase CDRs prezentate în SECV ID: 2-7 şi care au un lanţ greu (sau două lanţuri grele) care cuprind secvenţa de aminoacizi Pro-Ala-Arg-Gly (SECV ID NR: 8) la capătul C-terminal al lanţului(urilor) greu(e)).

[0044] În unele exemple de realizare, mai puţin de 70% dintre anticorpii populaţiei (de ex., aproximativ 69%, aproximativ 68%, aproximativ 67%, aproximativ 66%, aproximativ 65%, aproximativ 64%, aproximativ 63%, aproximativ 62%, aproximativ 61%, aproximativ 60%, aproximativ 59%, aproximativ 58%, aproximativ 57%, aproximativ 56%, aproximativ 55%, aproximativ 54%, aproximativ 53%, aproximativ 52%, aproximativ 51%, aproximativ 50%, aproximativ 49%, aproximativ 48%, aproximativ 47%, aproximativ 46%, aproximativ 45%, aproximativ 44%, aproximativ 43%, aproximativ 42%, aproximativ 41%, aproximativ 40%, aproximativ 39%, aproximativ 38%, aproximativ 37%, aproximativ 36%, aproximativ 35%, aproximativ 34%, aproximativ 33%, aproximativ 32%, aproximativ 31%, aproximativ 30%, aproximativ 29%, aproximativ 28%, aproximativ 27%, aproximativ 26%, aproximativ 25%, aproximativ 24%, aproximativ 23%, aproximativ 22%, aproximativ 21%, aproximativ 20%, aproximativ 19%, aproximativ 18%, aproximativ 17%, aproximativ 16%, aproximativ 15%, aproximativ 14%, aproximativ 13%, aproximativ 12%, aproximativ 11%, aproximativ 10%, aproximativ 9%, aproximativ 8%, aproximativ 7%, aproximativ 6%, aproximativ 5%, aproximativ 4%, aproximativ 3%, aproximativ 2%, aproximativ 1%, sau mai puţin) cuprind un lanţ greu care cuprinde o secvenţă C-terminală Pro-Ala-Arg-Gly (SECV ID NR: 8), care este opţional amidată. În unele exemple de realizare, mai puţin de 35% (de ex., aproximativ 34%, aproximativ 33%, aproximativ 32%, aproximativ 31%, aproximativ 30%, aproximativ 29%, aproximativ 28%, aproximativ 27%, aproximativ 26%, aproximativ 25%, aproximativ 24%, aproximativ 23%, aproximativ 22%, aproximativ 21%, aproximativ 20%, aproximativ 19%, aproximativ 18%, aproximativ 17%, aproximativ 16%, aproximativ 15%, aproximativ 14%, aproximativ 13%, aproximativ 12%, aproximativ 11%, aproximativ 10%, aproximativ 9%, aproximativ 8%, aproximativ 7%, aproximativ 6%, aproximativ 5%, aproximativ 4%, aproximativ 3%, aproximativ 2%, aproximativ 1%, sau mai puţin) dintre anticorpii populaţiei cuprind o secvenţă C-terminală Pro-Ala-Arg-Gly (SECV ID NR: 8) pe ambele lanţuri grele, unde ambele lanţuri grele sunt opţional amidate. De asemenea, se are în vedere ca ambele lanţuri grele să cuprindă secvenţa C-terminală Pro-Ala-Arg-Gly (SECV ID NR: 8), dar numai unul dintre lanţuri este amidat. În unele exemple de realizare, mai puţin de 35% (de ex., aproximativ 34%, aproximativ 33%, aproximativ 32%, aproximativ 31%, aproximativ 30%, aproximativ 29%, aproximativ 28%, aproximativ 27%, aproximativ 26%, aproximativ 25%, aproximativ 24%, aproximativ 23%, aproximativ 22%, aproximativ 21%, aproximativ 20%, aproximativ 19%, aproximativ 18%, aproximativ 17%, aproximativ 16%, aproximativ 15%, aproximativ 14%, aproximativ 13%, aproximativ 12%, aproximativ 11%, aproximativ 10%, aproximativ 9%, aproximativ 8%, aproximativ 7%, aproximativ 6%, aproximativ 5%, aproximativ 4%, aproximativ 3%, aproximativ 2%, aproximativ 1%, sau mai puţin) dintre anticorpii din compoziţie cuprind o secvenţă C-terminală Pro-Ala-Arg-Gly (SECV ID NR: 8). care nu este amidată. În unele exemple de realizare, 33% dintre anticorpii populaţiei cuprind o secvenţă Pro-Ala-Arg-Gly (SECV ID NR: 8) C-terminală care este amidată, 33% dintre anticorpii populaţiei cuprind secvenţe Pro-Ala-Arg-Gly (SECV ID NR: 8) C-terminale pe ambele lanţuri grele, care sunt ambele amidate şi 33% dintre anticorpii populaţiei cuprind lanţ(uri) greu(e) cu o secvenţă Pro-Ala-Arg-Gly (SECV ID NR: 8) C-terminală, dar care nu sunt amidate.

[0045] În unele exemple de realizare, compoziţia farmaceutică conţine materiale de formulare pentru modificarea, menţinerea, sau conservarea, de exemplu, a pH-ului, osmolarităţii, viscozităţii, clarităţii, culorii, izotonicităţii, mirosului, sterilităţii, stabilităţii, vitezei de dizolvare sau eliberare, adsorbţiei sau penetrării compoziţiei. În astfel de exemple de realizare, materialele de formulare adecvate includ, dar nu se limitează la, aminoacizi (cum ar fi, glicina, glutamina, asparagina, arginina, prolina, sau lizina); agenţi antimicrobieni; antioxidanţi (cum ar fi, acidul ascorbic, sulfitul de sodiu, sau bisulfitul de sodiu); agenţi tampon (cum ar fi, boratul, bicarbonatul, Tris-HCl, citraţii, fosfaţii, sau alţi acizi organici); agenţi de încărcare (cum ar fi, manitolul sau glicina); agenţi de chelare (cum ar fi, acidul etilendiamină tetraacetic (EDTA)); agenţi de complexare (cum ar fi, cafeina, polivinilpirolidona, beta-ciclodextrina, sau hidroxipropil-beta-ciclodextrina); agenţi de umplutură; monozaharide; dizaharide; şi alţi carbohidraţi (cum ar fi, glucoza, manoza, sau dextrinele); proteine (cum ar fi. albumina serică, gelatina, sau imunoglobulinele); agenţi de colorare, aromatizare şi diluare; agenţi de emulsionare; polimeri hidrofilici (cum ar fi, polivinilpirolidona); polipeptide cu greutate moleculară mică; contraioni formatori de sare (cum ar fi, sodiu); conservanţi (cum ar fi, clorura de benzalconiu, acidul benzoic, acidul salicilic, timerosalul, alcoolul fenetilic, metilparabenul, propilparabenul, clorhexidina, acidul sorbic, sau peroxid de hidrogen); solvenţi (cum ar fi glicerina, propilen glicolul sau polietilen glicolul); alcooli zaharaţi (cum ar fi, manitol sau sorbitol); agenţi de suspendare; surfactanţi, sau agenţi de umectare (cum ar fi, pluronicii, PEG, esterii sorbitanului, polisorbaţii, cum ar fi, polisorbatul 20, polisorbatul, tritonul, trometamina, lecitina, colesterolul, tiloxapalul); agenţi de creştere a stabilităţii (cum ar fi, zaharoza sau sorbitolul); agenţi de creştere a tonicităţii (cum ar fi, halogenurile metalelor alcaline, de preferinţă clorura de sodiu sau potasiu, manitol sorbitolul); vehicule de administrare; diluanţi; excipienţi şi/sau adjuvanţi farmaceutici. A se vedea, REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, 18" Edition, (A. R. Genrmo, ed.), 1990, Mack Publishing Company.

[0046] Selecţia materialelor specifice de formulare descrise aici poate fi determinată, de exemplu, de calea de administrare intenţionată, formatul de livrare şi doza dorită. Vezi, de exemplu, REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, supra. Purtătorul, sau vehiculul principal într-o compoziţie farmaceutică poate fi de natură apoasă, sau neapoasă. De exemplu, un vehicul, sau un purtător adecvat poate fi apa pentru injecţii, soluţia salină fiziologică, sau lichidul cefalorahidian artificial, eventual suplimentat cu alte materiale comune în compoziţiile pentru administrare parenterală. Soluţia salină tamponată neutră, sau soluţia salină amestecată cu albumină serică sunt alte vehicule exemplificative. În exemple de realizare specifice, compoziţiile farmaceutice cuprind tampon Tris cu pH de aproximativ 7,0-8,5, sau tampon acetat cu pH de aproximativ 4,0-5,5 şi pot include, în plus, sorbitol sau un înlocuitor adecvat al acestuia. În anumite exemple de realizare, compoziţia poate fi preparată pentru depozitare prin amestecarea compoziţiei selectate care are gradul de puritate dorit cu agenţi de formulare opţionali (REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, supra) sub formă de turtă liofilizată, sau soluţie apoasă. În plus, în unele exemple de realizare, anticorpul, sau fragmentul poate fi formulat ca liofilizat folosind excipienţi adecvaţi, cum ar fi, zaharoza.

[0047] Compoziţiile farmaceutice ale invenţiei pot fi selectate pentru administrare parenterală. Alternativ, compoziţiile pot fi selectate pentru inhalare, sau pentru administrare prin tractul digestiv, cum ar fi, pe cale orală. Prepararea unor astfel de compoziţii farmaceutic acceptabile este în sfera de competenţă a persoanelor de specialitate în domeniu. Componentele formulării sunt prezente de preferinţă în concentraţii acceptabile pentru locul de administrare. În anumite exemple de realizare, se utilizează tampoane pentru a menţine compoziţia la un pH fiziologic, sau la un pH uşor mai scăzut, de obicei într-un interval de pH de la aproximativ 5 până la aproximativ 8.

[0048] Când se are în vedere administrarea parenterală, compoziţiile terapeutice pentru utilizare în această invenţie pot fi furnizate sub forma unei soluţii apoase apirogene, acceptabile parenteral, care cuprind anticorpul sau fragmentul dorit într-un vehicul acceptabil farmaceutic. Un vehicul particular adecvat pentru injecţia parenterală este apa distilată sterilă în care anticorpul, sau fragmentul este formulat ca o soluţie sterilă, izotonică, conservată corespunzător. În anumite exemple de realizare, se pot utiliza dispozitive implantabile de administrare a medicamentelor pentru a introduce anticorpul, sau fragmentul dorit.

[0049] În unele, sau oricare dintre exemplele de realizare, compoziţia farmaceutică descrisă aici cuprinde o sare de calciu, un tampon acetat, un poliol şi un surfactant. Sărurile de calciu exemplificative includ, dar nu se limitează la, acetat de calciu, carbonat de calciu şi clorură de calciu. În unele exemple de realizare, sarea de calciu are o concentraţie de cel puţin 0.5 mM, cel puţin 1 mM, cel puţin 2 mM, cel puţin 3 mM, cel puţin 4 mM, cel puţin 5 mM, cel puţin 6 mM, cel puţin 7 mM, cel puţin 8 mM, cel puţin 9 mM, sau cel puţin 10 mM. În anumite exemple de realizare, concentraţia sării de calciu este nu mai mare 11 mM, nu mai mare 12 mM, nu mai mare 13 mM, nu mai mare 14 mM, nu mai mare 15 mM, nu mai mare 16 mM, nu mai mare 17 mM, nu mai mare 18 mM, nu mai mare 19 mM, nu mai mare 20 mM, nu mai mare 21 mM, nu mai mare 22 mM, nu mai mare 23 mM, nu mai mare 24 mM, sau nu mai mare 25 mM. Se are în vedere orice interval care prezintă o combinaţie a criteriilor de evaluare menţionate anterior, inclusiv, dar fără a se limita la, de la aproximativ 0,5 mM până la aproximativ 10 mM, aproximativ 5 mM până la aproximativ 10 mM, sau aproximativ 5 mM până la aproximativ 15 mM.

[0050] În unele exemple de realizare, compoziţia farmaceutică cuprinde un tampon acetat (de ex., acetat de sodiu) care are o concentraţie cuprinsă de la aproximativ 0,1 mM până la aproximativ 1000 mM (1 M). În unele exemple de realizare, concentraţia tamponului acetat este de cel puţin 5 mM, cel puţin 6 mM, cel puţin 7 mM, cel puţin 8 mM, cel puţin 9 mM, cel puţin 10 mM, cel puţin 15 mM, cel puţin 60 mM, cel puţin 70 mM, cel puţin 80 mM, cel puţin 90 mM, cel puţin 100 mM, cel puţin 200 mM, cel puţin 500 mM, cel puţin 700 mM, sau cel puţin 900 mM. În unele exemple de realizare, concentraţia tamponului acetat este nu mai mare 10 mM, nu mai mare 15 mM, nu mai mare 20 mM, nu mai mare 25 mM, nu mai mare 30 mM, nu mai mare 35 mM, nu mai mare 40 mM, nu mai mare 45 mM, nu mai mare 50 mM, nu mai mare 55 mM, nu mai mare 60 mM, nu mai mare 65 mM, nu mai mare 70 mM, nu mai mare 75 mM, nu mai mare 80 mM, nu mai mare 85 mM, nu mai mare 90 mM, nu mai mare 95 mM, sau nu mai mare 100 mM. Se are în vedere orice interval care prezintă o combinaţie a criteriilor de evaluare menţionate anterior, inclusiv, dar fără a se limita la, de la aproximativ 5 mM până la aproximativ 15 mM, sau de la aproximativ 5 mM până la aproximativ 10 mM, sau de la aproximativ 10 mM până la aproximativ 25 mM. Tamponul este adăugat de preferinţă la o concentraţie care menţine pH-ul în jurul valorii de 5-6 sau 5-5,5, sau 4,5-5,5. Când sarea de calciu din formulare este acetat de calciu, în unele exemple de realizare, concentraţia totală de acetat este de aproximativ 10 mM până la aproximativ 55 mM, sau aproximativ 20 mM până la aproximativ 40 mM.

[0051] În anumite aspecte, compoziţia farmaceutică cuprinde o concentraţie totală de acetat care este de cel puţin aproximativ 10 mM, cel puţin aproximativ 15 mM, cel puţin aproximativ 20 mM, cel puţin aproximativ 25 mM, cel puţin aproximativ 30 mM, cel puţin aproximativ 35 mM, cel puţin aproximativ 40 mM, 45 mM, sau 50 mM. În unele exemple de realizare, concentraţia de acetat este nu mai mare aproximativ 30 mM, 35 mM, 40 mM, 45 mM, 50 mM, 55 mM, 60 mM, 65 mM, 70 mM, 75 mM, 80 mM, 85 mM, sau 90 mM. Se are în vedere orice interval care prezintă o combinaţie a criteriilor de evaluare menţionate anterior, inclusiv, dar fără a se limita la: aproximativ 10 mM până la aproximativ 50 mM, aproximativ 20 mM până la aproximativ 50 mM, aproximativ 20 mM până la aproximativ 40 mM, aproximativ 30 mM până la aproximativ 50 mM, sau aproximativ 30 mM până la aproximativ 75 mM. În unele exemple de realizare, sarea de calciu este acetatul de calciu şi tamponul acetat este acetatul de sodiu. Ca exemplu nelimitativ, o soluţie care conţine 10 mM acetat de calciu va avea 20 mM anion acetat şi 10 mM cation de calciu, datorită naturii divalente a cationului de calciu, în timp ce o soluţie care conţine 10 mM acetat de sodiu va avea 10 mM cation de sodiu şi 10 mM anion acetat.

[0052] În unele exemple de realizare, concentraţia totală de ioni (cationi şi anioni) în soluţie este de cel cel puţin 10 mM, cel puţin aproximativ 15 mM, cel puţin aproximativ 20 mM, cel puţin aproximativ 25 mM, cel puţin aproximativ 30 mM, cel puţin aproximativ 35 mM, cel puţin aproximativ 40 mM, cel puţin aproximativ 45 mM, cel puţin aproximativ 50 mM, cel puţin aproximativ 55 mM, cel puţin aproximativ 60 mM, cel puţin aproximativ 65 mM, cel puţin aproximativ 70 mM, cel puţin aproximativ 75 mM, cel puţin aproximativ 80 mM, sau cel puţin aproximativ 85 mM. În unele exemple de realizare, concentraţia totală de ioni este nu mai mare de aproximativ 30 mM, nu mai mare aproximativ 35 mM, nu mai mare aproximativ 40 mM, nu mai mare aproximativ 45 mM, nu mai mare aproximativ 50 mM, nu mai mare aproximativ 55 mM, nu mai mare aproximativ 60 mM, nu mai mare aproximativ 65 mM, nu mai mare aproximativ 70 mM, nu mai mare aproximativ 75 mM, nu mai mare aproximativ 80 mM, nu mai mare aproximativ 85 mM, nu mai mare aproximativ 90 mM, nu mai mare aproximativ 95 mM, nu mai mare aproximativ 100 mM, nu mai mare aproximativ 110 mM, nu mai mare aproximativ 120 mM, nu mai mare aproximativ 130 mM, nu mai mare aproximativ 140 mM, nu mai mare aproximativ 150 mM, nu mai mare aproximativ 160 mM, nu mai mare aproximativ 170 mM, nu mai mare aproximativ 180 mM, nu mai mare aproximativ 190 mM, sau nu mai mare aproximativ 200 mM. Se are în vedere orice interval care prezintă o combinaţie a criteriilor de evaluare menţionate anterior, inclusiv, dar fără a se limita la: aproximativ 30 mM până la aproximativ 60 mM, sau aproximativ 30 mM până la aproximativ 70 mM, sau aproximativ 30 mM până la aproximativ 80 mM, sau aproximativ 40 mM până la aproximativ 150 mM, sau aproximativ 50 mM până la aproximativ 150 mM. Cu titlu de exemplu nelimitativ, o soluţie de acetat de calciu 10 mM va avea o concentraţie totală de ioni de 30 mM (10 mM cationi şi 20 mM anioni).

[0053] În unele, sau oricare dintre exemplele de realizare, compoziţia farmaceutică cuprinde un poliol. Poliolii cuprind o clasă de excipienţi care include zaharuri (de ex., manitol, zaharoză, sorbitol) şi alţi alcooli polihidrici (de ex., glicerol şi propilen glicol). Poliolii exemplificaţi includ, dar fără a se limita la, propilen glicol, glicerină (glicerol), treoză, treitol, eritroză, eritritol, riboză, arabinoză, arabitol, lixoză, maltitol, sorbitol, sorboză, glucoză, manoză, manitol, levuloză, dextroză, maltoză, trehaloză, fructoză, xilitol, inozitol, galactoză, xiloză, fructoză, zaharoză, 1,2,6-hexanetriol şi alţii asemenea. Zaharurile de ordin superior includ, dar fără a se limita la, dextran, propilen glicol, sau polietilen glicol. Zaharurile reducătoare, cum ar fi, fructoza, maltoza, sau galactoza, se oxidează mai uşor decât zaharurile nereducătoare. Alte exemple de alcooli zaharaţi sunt glucitolul, maltitolul, lactitolul, sau izo-maltuloza. Alte exemple de lioprotectori includ glicerina şi gelatina, precum şi zaharurile melibioză, melezitoză, rafinoză, manotrioză şi stahioză. Exemplele de zaharuri reducătoare includ glucoza, maltoza, lactoza, maltuloza, izo-maltuloza şi lactuloza. Exemplele de zaharuri nereducătoare includ glicozidele nereducătoare ale compuşilor polihidroxi selectaţi dintre alcoolii zaharaţi şi alţi polialcooli cu catenă liniară. Monoglicozidele includ compuşii obţinuţi prin reducerea dizaharidelor, cum ar fi, lactoza, maltoza, lactuloza şi maltuloza.

[0054] În unele, sau oricare dintre exemplele de realizare, compoziţia farmaceutică cuprinde un poliol la o concentraţie cuprinsă de la aproximativ 0% până la aproximativ 40% g/v. În unele, sau oricare dintre exemplele de realizare, compoziţiile cuprind un poliol la o concentraţie de cel puţin 0,5, cel puţin 1, cel puţin 2, cel puţin 3, cel puţin 4, cel puţin 5, cel puţin 6, cel puţin 7, cel puţin 8, cel puţin 9, cel puţin 10, cel puţin 11, cel puţin 12, cel puţin 13, cel puţin 14, cel puţin 15, cel puţin 16, cel puţin 17, cel puţin 18, cel puţin 19, cel puţin 20, cel puţin 30, sau cel puţin 40% w/v. În unele, sau oricare dintre exemplele de realizare, compoziţia cuprinde un poliol la o concentraţie de aproximativ 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9% până la aproximativ 10% g/v. În unele, sau oricare dintre exemplele de realizare, compoziţia cuprinde un poliol la o concentraţie de aproximativ 2% până la aproximativ 6% g/v. În unele, sau oricare dintre exemplele de realizare, compoziţia cuprinde un poliol la o concentraţie de aproximativ 4% g/v. În unele, sau oricare dintre exemplele de realizare, compoziţia cuprinde un poliol la aproximativ 6% g/v.

[0055] În unele, sau oricare dintre exemplele de realizare, compoziţia farmaceutică cuprinde un surfactant. Surfactanţii exemplificativi includ, dar fără a se limita la, surfactanţi anionici, cationici, neionici, zwitterionici şi amfoteri, inclusiv surfactanţi derivaţi din aminoacizi naturali. Surfactanţii anionici includ, dar fără a se limita la, laurilsulfat de sodiu, dioctilsulfosuccinat de sodiu şi dioctilsulfonat de sodiu, acid chenodeoxicolic, sarea de sodiu a N-lauroilsarcozinei, dodecilsulfat de litiu, sarea de sodiu a acidului 1-octansulfonic, colatul de sodiu hidratat, deoxicolat de sodiu şi sarea de sodiu a acidului glicodeoxicolic. Surfactanţii cationici includ, dar fără a se limita la, clorură de benzalconiu, sau clorură de benzetoniu, clorură de cetilpiridiniu monohidrat şi bromură de hexadeciltrimetilamoniu. Surfactanţii zwitterionici includ, dar fără a se limita la, CHAPS, CHAPSO, SB3-10 şi SB3-12. Surfactanţii neionici includ, dar fără a se limita la, digitonină, Triton X-100, Triton X-114, TWEEN-20 şi TWEEN-80. Într-un alt exemplu de realizare, surfactanţii includ, dar fără a se limita la, lauromacrogol 400, polioxil 40 stearat, ulei de ricin hidrogenat polioxietilenic 10, 40, 50 şi 60, monostearat de glicerol, polisorbat 20, polisorbat 40, polisorbat 60, polisorbat 65 şi polisorbat 80, lecitină din soia şi alte fosfolipide cum ar fi, DOPC, DMPG, DMPC şi DOPG; esterul acidului gras cu zaharoza, metilceluloză şi carboximetilceluloză. În unele, sau oricare dintre exemplele de realizare, surfactantul este polisorbatul 20.

[0056] Surfactanţii pot fi incluşi în compoziţii fie individual, fie ca amestec în diferite proporţii. În unele, sau oricare dintre exemplele de realizare, compoziţia cuprinde un surfactant la o concentraţie de aproximativ 0% până la aproximativ 5% g/v (de ex., aproximativ 0,001, aproximativ 0,002, aproximativ 0,005, aproximativ 0,007, aproximativ 0,01, aproximativ 0,05, aproximativ 0,1, aproximativ 0,2, aproximativ 0,3, aproximativ 0,4, aproximativ 0,5, aproximativ 0,6, aproximativ 0,7, aproximativ 0,8, aproximativ 0,9, aproximativ 1,0, aproximativ 1,5, aproximativ 2,0, aproximativ 2,5, aproximativ 3,0, aproximativ 3,5, aproximativ 4,0, sau aproximativ 4,5% g/v). În unele, sau oricare dintre exemplele de realizare, compoziţia cuprinde un surfactant la o concentraţie de aproximativ 0,001% până la aproximativ 0,5% g/v. În unele, sau oricare dintre exemplele de realizare, compoziţia cuprinde un surfactant la o concentraţie de aproximativ 0,004, aproximativ 0,005, aproximativ 0,007, aproximativ 0,01, aproximativ 0,05 sau aproximativ 0,1% g/v până la aproximativ 0,2% g/v. În unele, sau oricare dintre exemplele de realizare, compoziţia cuprinde un surfactant la o concentraţie de aproximativ 0,01% până la aproximativ 0,1% g/v.

[0057] În unele, sau oricare dintre exemplele de realizare, compoziţia farmaceutică cuprinde 55 mM acetat, 13 mM calciu, 6,0% (g/v) zaharoză, 0,006% (g/v) polisorbat 20, pH 5,2.

[0058] Compoziţii farmaceutice suplimentare vor fi evidente pentru persoanele de specialitate în domeniu, inclusiv formulări care implică proteine care leagă antigenul în formulări cu eliberare susţinută, sau controlată. Tehnicile pentru formularea unei varietăţi de alte mijloace de eliberare susţinută, sau controlată, cum ar fi, purtătorii de lipozomi, microparticulele bioerodabile, sau sferele poroase şi injecţiile depot, sunt, de asemenea, cunoscute persoanelor de specialitate în domeniu. A se vedea, de exemplu, cererea internaţională de brevet nr. PCT/US93/00829, care descrie eliberarea controlată a microparticulelor polimerice poroase pentru administrarea compoziţiilor farmaceutice. Preparatele cu eliberare prelungită pot include matrici polimerice semipermeabile sub formă de articole modelate, de ex., filme, sau microcapsule. Matricile cu eliberare prelungită pot include poliesteri, hidrogeluri, polilactide (aşa cum sunt dezvăluite în brevetul U.S. nr. 3773919 şi publicaţia cererii de brevet european nr. EP058481), copolimeri ai acidului L-glutamic şi gama-etil-L-glutamatului (Sidman ş.a., 1983, Biopolymers 2:547-556), poli (2-hidroxietil-metacrilat) (Langer ş.a., 1981, J. Biomed. Mater. Res. 15:167-277 şi Langer, 1982, Chem. Tech. 12:98-105), acetat de etilen-vinil (Langer ş.a., 1981, supra), sau acid poli-D(-)-3-hidroxibutiric (publicaţia cererii de brevet european nr. EP133988). Compoziţiile cu eliberare prelungită pot include, de asemenea, lipozomi care pot fi preparaţi prin oricare dintre metodele cunoscute în domeniu. A se vedea, de ex., Eppstein ş.a., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82:3688-3692; publicaţiile cererilor de brevet european nr. EP036676; EP088046 şi EP143949.

[0059] Compoziţiile farmaceutice utilizate pentru administrare in vivo sunt furnizate, uzual, sub formă de preparate sterile. Sterilizarea se poate realiza prin filtrare prin membrane de filtrare sterile. Când compoziţia este liofilizată, sterilizarea utilizând această metodă poate fi efectuată fie înainte, fie după liofilizare şi reconstituire. Compoziţiile pentru administrare parenterală pot fi depozitate sub formă liofilizată, sau într-o soluţie. Compoziţiile parenterale sunt, în general, plasate într-un recipient care are un orificiu de acces steril, de exemplu, o pungă, sau un flacon pentru soluţie intravenoasă care are un dop care poate fi perforat de un ac de injecţie hipodermică.

[0060] Aminoacizii liberi, sau fragmente ale acestora, se pot utiliza în formulările de anticorpi, în conformitate cu diverse exemple de realizare ale invenţiei, ca agenţi de încărcare, stabilizatori şi antioxidanţi, precum şi alte utilizări standard. Lizina, prolina, serina şi alanina pot fi utilizate pentru stabilizarea proteinelor într-o formulare. Glicina este utilă în liofilizare pentru a asigura structura şi proprietăţile corecte ale turtei. Arginina poate fi utilă pentru a inhiba agregarea proteinelor, atât în formulări lichide, cât şi în cele liofilizate. Metionina este utilă ca antioxidant.

[0061] Exemplele de realizare de formulări de anticorpi pot include, în plus, unul sau mai mulţi antioxidanţi. Într-o oarecare măsură, oxidarea dăunătoare a proteinelor poate fi prevenită în formulările farmaceutice prin menţinerea unor niveluri adecvate de oxigen şi temperatură în mediul ambiant şi prin evitarea expunerii la lumină. Excipienţii antioxidanţi pot fi, de asemenea, utilizaţi pentru a preveni degradarea oxidativă a proteinelor. Printre antioxidanţii utili în acest sens se numără agenţii reducători, captatorii de oxigen/radicali liberi şi agenţii de chelare. Antioxidanţii pentru utilizare în formulările terapeutice de proteine, în conformitate cu invenţia, sunt de preferinţă solubili în apă şi îşi menţin activitatea pe toată durata de valabilitate a unui produs. În acest sens, conform invenţiei, un antioxidant preferat este EDTA.

[0062] Formulările conform invenţiei pot include ioni metalici care sunt cofactori proteici şi care sunt necesari pentru a forma complecşi de coordinare a proteinelor, cum ar fi, zincul necesar pentru a forma anumite suspensii de insulină. Ionii metalici pot, de asemenea, inhiba unele procese care degradează proteinele. Cu toate acestea, ionii metalici catalizează şi procesele fizice şi chimice care degradează proteinele.

[0063] Ionii de magneziu (10-120 mM) pot fi utilizaţi pentru a inhiba izomerizarea acidului aspartic la acid izoaspartic. Ionii de Ca+2(până la 100 mM) pot creşte stabilitatea dezoxiribonucleazei umane. Mg+2, Mn+2 şi Zn+2, totuşi, pot destabiliza rhDNaza. În mod similar, Ca+2 şi Sr+2 pot stabiliza Factorul VIII, acesta poate fi destabilizat de Mg+2, Mn+2 şi Zn+2, Cu+2 şi Fe+2 şi agregarea sa poate fi crescută cu ionii Al+3.

[0064] Exemplele de realizare ale formulărilor de anticorpi pot cuprinde, în plus, unul sau mai mulţi conservanţi.

[0065] Odată ce compoziţia farmaceutică a fost formulată, aceasta poate fi depozitată în flacoane sterile sub formă de soluţie, suspensie, gel, emulsie, solid, cristal, sau sub formă de pulbere deshidratată sau liofilizată. Astfel de formulări pot fi depozitate fie într-o formă gata de utilizare, fie într-o formă (de ex., liofilizată) care este reconstituită înainte de administrare. Invenţia oferă, de asemenea, kituri pentru producerea unei unităţi de administrare cu doză unică. Kiturile invenţiei pot conţine fiecare atât un prim recipient care are o proteină uscată, cât şi un al doilea recipient care are o formulare apoasă. În anumite exemple de realizare ale acestei invenţii, sunt furnizate kituri care conţin seringi preumplute cu una, sau mai multe camere (de ex., seringi pentru lichide şi lioseringi).

[0066] Cantitatea eficientă terapeutic dintr-o compoziţie farmaceutică care conţine anticorpi, care urmează a fi utilizată, va depinde, de exemplu, de contextul şi obiectivele terapeutice. O persoană de specialitate în domeniu va înţelege că nivelurile de dozare adecvate pentru tratament vor varia în funcţie, în parte, de molecula administrată, indicaţia(e) pentru care este utilizat anticorpul, calea de administrare şi dimensiunea (greutatea corporală, suprafaţa corporală, sau dimensiunea organului) şi/sau starea (vârsta şi starea generală de sănătate) a pacientului.

[0067] Stabilitate

[0068] Termenii "stabilitate" şi "stabil", aşa cum sunt utilizaţi aici în contextul unei compoziţii care cuprinde un anticorp (sau un fragment de legare a antigenului al acestuia) se referă la rezistenţa anticorpului (sau a fragmentului de legare a antigenului al acestuia) din compoziţie la agregare, degradare, sau fragmentare în anumite condiţii de fabricaţie, preparare, transport şi/sau depozitare. Formulările de anticorpi care cuprind un grad ridicat de stabilitate demonstrează o fiabilitate şi o siguranţă sporite şi, ca atare, sunt avantajoase pentru utilizarea clinică.

[0069] Stabilitatea anticorpilor într-o compoziţie este evaluată opţional prin examinarea unui parametru dorit al anticorpului din compoziţie (de ex., agregarea, degradarea lanţurilor grele şi/sau uşoare, modificarea chimică, etc.) în timp. În acest sens, un parametru este examinat de obicei la un moment iniţial (T0) şi la un moment de evaluare (T1), opţional în timp ce anticorpul este expus la oricare dintre o serie de condiţii de mediu, şi comparat. Un moment iniţial poate fi, de exemplu, momentul în care anticorpul este formulat pentru prima dată într-o compoziţie, sau examinat pentru prima dată pentru calitate (adică, examinat pentru a determina dacă compoziţia anticorpilor îndeplineşte specificaţiile de reglementare, sau de fabricaţie în ceea ce priveşte agregarea sau degradarea). Un moment iniţial poate fi, de asemenea, momentul în care anticorpul este reformulat într-o compoziţie (de ex., reformulat la o concentraţie mai mare, sau mai mică în comparaţie cu un preparat iniţial). Un moment de evaluare este, în diverse exemple de realizare, la aproximativ 1 săptămână (sau aproximativ 2 săptămâni, sau aproximativ 3 săptămâni, sau aproximativ 4 săptămâni, sau aproximativ 5 săptămâni, sau aproximativ 6 săptămâni, sau aproximativ 7 săptămâni, sau aproximativ 8 săptămâni, sau aproximativ 10 săptămâni, sau aproximativ 3 luni, sau aproximativ 6 luni, sau aproximativ 1 an) după momentul iniţial de evaluare. Parametrul dorit (de ex., agregarea, sau degradarea) al anticorpului sau fragmentului acestuia din compoziţie poate fi evaluat într-o varietate de condiţii de depozitare, cum ar fi, temperaturi de -30°C, 4°C, 20°C, sau 40°C, agitare, pH, depozitare în diferite materiale de recipient (de ex., flacoane de sticlă, seringi preumplute, etc.) şi altele asemenea.

[0070] Printre metodele exemplificative pentru determinarea gradului de agregare şi/sau a tipurilor şi/sau dimensiunilor agregatelor prezente într-o compoziţie care cuprinde anticorpul se numără, dar nu se limitează la, cromatografia de excludere dimensională (SEC), cromatografia de excludere dimensională de înaltă performanţă (HPSEC), difracţia statică a luminii (SLS), spectroscopia în infraroşu cu transformare Fourier (FTIR), dicroismul circular (CD), tehnicile de depliere a proteinelor induse de uree, fluorescenţa intrinsecă a triptofanului, calorimetria diferenţială de scanare şi tehnicile de legare a proteinelor cu acid 1-anilino-8-naftalensulfonic (ANS). Cromatografia de excludere dimensională (SEC) poate fi efectuată pentru a separa moleculele pe baza dimensiunii lor, prin trecerea moleculelor peste o coloană umplută cu răşina corespunzătoare; moleculele mai mari (de ex., agregatele) vor elua înaintea moleculelor mai mici (de exemplu., monomerii). Moleculele sunt în general detectate prin absorbanţă UV la 280 nm şi pot fi colectate pentru caracterizare ulterioară. Coloanele cromatografice lichide de înaltă presiune sunt adesea utilizate pentru analiza SEC (HP-SEC). Alternativ, se poate utiliza ultracentrifugarea analitică (AUC). AUC este o tehnică ortogonală care determină coeficienţii de sedimentare ai macromoleculelor dintr-o probă lichidă. La fel ca SEC, AUC este capabilă să separe şi să detecteze fragmente/agregate de anticorpi din monomeri şi este, de asemenea, capabilă să ofere informaţii despre masa moleculară. Agregarea anticorpilor într-o compoziţie poate fi, de asemenea, caracterizată prin analiza contorului de particule folosind un contor Coulter, sau prin măsurători de turbiditate folosind un turbidimetru. Turbiditatea este o măsură a cantităţii cu care particulele dintr-o soluţie împrăştie lumina şi, prin urmare, poate fi utilizată ca indicator general al agregării proteinelor. În plus, electroforeza pe gel de poliacrilamidă nereducătoare (PAGE), sau electroforeza capilară pe gel (CGE) pot fi utilizate pentru a caracteriza starea de agregare şi/sau fragmentare a anticorpilor, sau a fragmentelor de anticorpi dintr-o compoziţie.

[0071] Printre metodele exemplificative pentru determinarea degradării anticorpilor se numără, dar nu se limitează la, cromatografia de excluziune dimensională (SEC), electroforeza pe gel de poliacrilamidă cu dodecil sulfat de sodiu (SDS-PAGE) şi electroforeza capilară cu SDS (CE-SDS) şi HPLC cu fază inversată cu detecţie MS în linie.

[0072] În diverse exemple de realizare, mai puţin de 5% din anticorpul descris aici în compoziţie este sub formă agregată în condiţii de interes. De exemplu, mai puţin de 4%, sau mai puţin de 3%, sau mai puţin de 2%, sau mai puţin de 1% din anticorpul din compoziţie este sub formă agregată după depozitare la -30°C, 4°C, 20°C, sau 40°C pentru o perioadă de aproximativ 1 săptămână (sau aproximativ 2 săptămâni, sau aproximativ 3 săptămâni, sau aproximativ 4 săptămâni, sau aproximativ 5 săptămâni, sau aproximativ 6 săptămâni, sau aproximativ 7 săptămâni, sau aproximativ 8 săptămâni, sau aproximativ 10 săptămâni, sau aproximativ 3 luni, sau aproximativ 6 luni, sau aproximativ 1 an). În unele exemple de realizare, mai puţin de 5% (sau mai puţin de 4%, sau mai puţin de 3%, sau mai puţin de 2%, sau mai puţin de 1%, sau mai puţin) din anticorpul descris aici din compoziţie este sub formă agregată după depozitare timp de două săptămâni la aproximativ 4°C.

[0073] De exemplu, cel puţin 85% (sau cel puţin 90%, sau cel puţin 91%, sau cel puţin 92%, sau cel puţin 93%, sau cel puţin 94%, sau cel puţin 95%, sau cel puţin 96%, sau cel puţin 97%, sau cel puţin 98%, sau cel puţin 99%) din anticorpul dintr-o compoziţie este opţional prezent sub formă neagregată (adică monomerică) după depozitare la -30°C, 4°C, 20°C, sau 40°C timp de aproximativ 1 săptămână (sau aproximativ 2 săptămâni, sau aproximativ 3 săptămâni, sau aproximativ 4 săptămâni, sau aproximativ 5 săptămâni, sau aproximativ 6 săptămâni, sau aproximativ 7 săptămâni, sau aproximativ 8 săptămâni, sau aproximativ 10 săptămâni, sau aproximativ 3 luni, sau aproximativ 6 luni, sau aproximativ 1 an). În unele exemple de realizare, cel puţin 85% (sau cel puţin 90%, sau cel puţin 91%, sau cel puţin 92%, sau cel puţin 93%, sau cel puţin 94%, sau cel puţin 95%, sau cel puţin 96%, sau cel puţin 97%, sau cel puţin 98%, sau cel puţin 99%, sau mai mult) din anticorp este prezent în compoziţie sub formă neagregată după două săptămâni de depozitare la aproximativ 4°C. În unele exemple de realizare, cel puţin 99% din anticorp este prezent în compoziţie sub formă neagregată după depozitare timp de două săptămâni la aproximativ 4°C şi/sau cel puţin 95% din anticorpul prezent în compoziţie este sub formă neagregată după depozitare timp de două săptămâni la 40°C.

[0074] În diverse exemple de realizare, mai puţin de 5% din anticorpul descris aici în compoziţie este degradat. De exemplu, mai puţin de 4%, sau mai puţin de 3%, sau mai puţin de 2%, sau mai puţin de 1%, sau mai puţin din anticorpul din compoziţie este degradat în condiţiile de interes. De exemplu, opţional, cel puţin 85% (sau cel puţin 90%, sau cel puţin 91%, sau cel puţin 92%, sau cel puţin 93%, sau cel puţin 94%, sau cel puţin 95%, sau cel puţin 96%, sau cel puţin 97%, sau cel puţin 98%, sau cel puţin 99%) din anticorp este intact (adică nu este degradat) într-o compoziţie depozitată la aproximativ -30°C, aproximativ 4°C, aproximativ 20°C, sau aproximativ 40°C pentru o perioadă de aproximativ 1 săptămână (sau aproximativ 2 săptămâni, sau aproximativ 3 săptămâni, sau aproximativ 4 săptămâni, sau aproximativ 5 săptămâni, sau aproximativ 6 săptămâni, sau aproximativ 7 săptămâni, sau aproximativ 8 săptămâni, sau aproximativ 10 săptămâni, sau aproximativ 3 luni, sau aproximativ 6 luni, sau aproximativ 1 an). În anumite aspecte, cel puţin 85% (sau cel puţin 90%, sau cel puţin 91%, sau cel puţin 92%, sau cel puţin 93%, sau cel puţin 94%, sau cel puţin 95%, sau cel puţin 96%, sau cel puţin 97%, sau cel puţin 98%, sau cel puţin 99%, sau mai mult) din anticorp este intact (adică nedegradat) după depozitarea într-o compoziţie la aproximativ 4°C timp de o perioadă de două săptămâni. În unele exemple de realizare, cel puţin 99% din anticorp rămâne intact atunci când este depozitat într-o compoziţie la aproximativ 4°C timp de două săptămâni şi/sau cel puţin 95% rămâne intact atunci când este depozitat într-o compoziţie la aproximativ 40°C timp de două săptămâni.

[0075] Stabilitatea funcţională, sau a activităţii anticorpului într-o compoziţie este, de asemenea, avută în vedere aici. Testele pentru detectarea şi/sau cuantificarea, de exemplu, a legării anticorpului la o ţintă, sau a neutralizării sclerostinei sunt cunoscute în domeniu. Opţional, anticorpul demonstrează o activitate de aproximativ 50-100% în condiţii de interes, comparativ cu activitatea anticorpului la momentul iniţial. De exemplu, anticorpul îşi păstrează un nivel de activitate între aproximativ 60-90%, sau 70-80%, comparativ cu activitatea la momentul iniţial. În consecinţă, stabilitatea funcţională a anticorpului include o reţinere a activităţii de cel puţin aproximativ 50%, 55%., 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, sau 100% şi pot include măsurători ale activităţii mai mari de 100%, cum ar fi, 105%, 110%, 115%, 120%, 125%, sau 150%, sau mai mult faţă de activitatea la momentul iniţial.

[0076] Viscozitate

[0077] În unele exemple de realizare, se determină viscozitatea unei compoziţii care cuprinde unul, sau mai mulţi dintre anticorpii descrişi aici. Termenul "viscozitate", aşa cum este utilizat aici, se referă la "viscozitate absolută". Viscozitatea absolută, uneori numită viscozitate dinamică, sau simplă, este produsul dintre viscozitatea cinematică şi densitatea fluidului (Viscozitate absolută = Viscozitate cinematică x Densitate). Dimensiunea viscozităţii cinematice este L2/T unde L este o lungime şi T este un timp. În mod obişnuit, viscozitatea cinematică este exprimată în centistokes (cSt). Unitatea SI a viscozităţii cinematice este mm2/s, care este egal cu 1 cSt. Viscozitatea absolută este exprimată în unităţi de centipoise (cP). Unitatea SI a viscozităţii absolute este milipascalul-secundă (mPa-s), unde 1 cP = 1 mPa-s.

[0078] Viscozitatea unei compoziţii poate fi măsurată în ore (de ex., 1-23 ore), zile (de ex., 1-10 zile), săptămâni (de ex., 1-5 săptămâni), luni (de ex., 1-12 luni), sau ani (de ex., 1-2 ani, 1-3 ani) după adăugarea anticorpului la compoziţie. Măsurătorile de viscozitate pot fi efectuate la o temperatură de depozitare, sau administrare, de ex., 2-8°C, sau 25°C (temperatura camerei). În unele exemple de realizare, viscozitatea absolută a lichidului sau a compoziţiei lichide reconstituite la temperatura de depozitare şi/sau administrare este de 15 cP, sau mai mică, sau de 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, sau 4 cP, sau mai mică. În unele exemple de realizare, viscozitatea absolută a lichidului sau a compoziţiei lichide reconstituite este de 6 cP sau mai mică.

[0079] În unele exemple de realizare, viscozitatea compoziţiei de anticorpi este măsurată înainte şi după adăugarea anticorpului. Metodele de măsurare a viscozităţii sunt bine cunoscute în domeniu şi includ, de exemplu, utilizarea unui viscozimetru capilar, sau a unui reometru cu placă conică. Se poate utiliza orice metodă, cu condiţia ca aceeaşi metodă să fie utilizată pentru a compara formulările de testare şi de referinţă.

[0080] Metode terapeutice

[0081] Referinţele la metodele de tratament din paragrafele următoare ale acestei descrieri trebuie interpretate ca referinţe la compuşii, compoziţiile farmaceutice, sau medicamentele prezentei invenţii pentru utilizare într-o metodă de tratament a corpului uman (sau animal) prin terapie (sau pentru diagnosticare).

[0082] Anticorpii şi compoziţiile farmaceutice descrise aici sunt utile pentru tratarea, sau prevenirea afecţiunilor osoase, cum ar fi, afecţiunile osoase asociate cu activitatea anormală a osteoblastelor, sau osteoclastelor. Anticorpul poate fi administrat unui subiect care suferă de o afecţiune osoasă selectată din grupul care constă din acondroplazie, disostoză cleidocraniană, encondromatoză, displazie fibroasă, boala Gaucher, rahitism hipofosfatemic, sindromul Marfan, exotoze ereditare multiple, neurofibromatoză, osteogeneză imperfectă, osteopetroză, osteopoiciloză, leziuni sclerotice, pseudoartroză, osteomielită piogenă, boală parodontală, pierdere osoasă indusă de medicamente antiepileptice, hiperparatiroidism primar şi secundar, sindroame de hiperparatiroidism familial, pierdere osoasă indusă de imponderabilitate, osteoporoză la bărbaţi, pierdere osoasă postmenopauză, osteoartrită, osteodistrofie renală, tulburări infiltrative osoase, pierdere osoasă orală, osteonecroză a maxilarului, boala Paget juvenilă, melorheostoză, boli metabolice osoase, mastocitoză, anemie/boală falciformă, pierdere osoasă asociată transplantului de organe, pierdere osoasă asociată transplantului de rinichi, lupus eritematos sistemic, spondilită anchilozantă, epilepsie, artrită juvenilă, talasemie, mucopolizaharidoze, boala Fabry, sindromul Turner, sindromul Down, sindromul Klinefelter, lepră, boala Perthe, scolioză idiopatică adolescentină, boală inflamatorie multisistemică cu debut infantil, sindromul Winchester, boala Menkes, boala Wilson, boală osoasă ischemică (cum ar fi boala Legg-Calve-Perthes şi osteoporoza migratorie regională), stări anemice, afecţiuni cauzate de steroizi, pierdere osoasă indusă de glucocorticoizi, pierdere osoasă indusă de heparină, afecţiuni ale măduvei osoase, scorbut, malnutriţie, deficit de calciu, osteoporoză, osteopenie, alcoolism, boală hepatică cronică, stare postmenopauză, afecţiuni inflamatorii cronice, artrită reumatoidă, boală inflamatorie intestinală, colită ulcerativă, colită inflamatorie, boala Crohn, oligomenoree, amenoree, pierdere osoasă asociată sarcinii, diabet zaharat, hipertiroidism, afecţiuni tiroidiene, afecţiuni paratiroidiene, boala Cushing, acromegalie, hipogonadism, imobilizare, sau neutilizare, sindrom de distrofie simpatică reflexă, osteoporoză regională, osteomalacie, pierdere osoasă asociată cu protezarea articulară, pierderea osoasă asociată cu HIV, pierderea osoasă asociată cu pierderea hormonului de creştere, pierderea osoasă asociată cu fibroza chistică, pierderea osoasă asociată cu chimioterapia, pierderea osoasă indusă de tumoră, pierderea osoasă asociată cancerului, pierderea osoasă ablativă hormonală, mielom multiplu, pierderea osoasă indusă de medicamente, anorexia nervoasă, pierderea osoasă facială asociată bolii, pierderea osoasă craniană asociată bolii, pierderea osoasă a maxilarului asociată bolii, pierderea osoasă craniană asociată bolii, pierderea osoasă asociată îmbătrânirii, pierderea osoasă facială asociată îmbătrânirii, pierderea osoasă craniană asociată îmbătrânirii, pierderea osoasă a maxilarului asociată îmbătrânirii, pierderea osoasă craniană asociată cu îmbătrânirea şi pierderea osoasă asociată cu călătoriile în spaţiu.

[0083] În unele exemple de realizare, anticorpii descrişi aici sunt utili pentru îmbunătăţirea rezultatelor în procedurile ortopedice, procedurile stomatologice, chirurgia implantară, înlocuirea articulaţiilor, grefarea osoasă, chirurgia cosmetică osoasă şi repararea osoasă, cum ar fi, vindecarea fracturilor, vindecarea neconsolidaţiilor, vindecarea întârziată a consolidării şi reconstrucţiei faciale. O compoziţie care cuprinde unul, sau mai mulţi anticorpi poate fi administrată înainte, în timpul şi/sau după procedură, înlocuire, grefă, intervenţie chirurgicală, sau reparare.

[0084] În unele exemple de realizare, anticorpii descrişi aici sunt utili pentru tratamentul oricărei fracturi care cuprinde un spaţiu între două segmente de os (de ex., un spaţiu de cel puţin aproximativ 1 mm între două segmente de os). În unele, sau oricare exemple de realizare, spaţiul este de cel puţin aproximativ 2 mm, cel puţin aproximativ 3 mm, cel puţin aproximativ 4 mm, cel puţin aproximativ 5 mm, cel puţin aproximativ 6 mm, cel puţin aproximativ 7 mm, cel puţin aproximativ 8 mm, cel puţin aproximativ 9 mm, sau cel puţin aproximativ 1 cm, sau mai mult. În unele, sau oricare exemple de realizare, spaţiul este de aproximativ 5 mm până la 1 cm, sau până la 1 cm. Termenii "defect al spaţiului osos" şi "defect scheletic segmentar" sunt utilizaţi sinonim aici şi se referă la un spaţiu între două segmente de os (de ex., un spaţiu de cel puţin 1 mm).

[0085] Printre exemplele de defecte ale breşei osoase se numără, dar nu se limitează la, o fractură cominutivă, o fractură de neconsolidare, un defect scheletic segmentar, defecte osoase create chirurgical, defecte osoase tratate chirurgical şi defecte osoase create în urma unor leziuni traumatice ale osului, sau a unei boli (inclusiv, dar fără a se limita la, artrită, îndepărtarea tumorii (rezecţie), sau îndepărtarea infecţiei). În unele, sau în oricare dintre exemplele de realizare, defectul breşei osoase este produs prin îndepărtarea secţiunilor infectate de os, sau prin îndepărtarea cancerului din os din cauza cancerelor osoase, inclusiv, dar fără a se limita la, osteosarcom, sarcom Ewing, condrosarcom, histiocitom fibros malign, fibrosarcom şi cordom. În unele, sau în oricare dintre exemplele de realizare, defectul breşei osoase este o deformare de dezvoltare, de ex., din cauza unui defect genetic.

[0086] În unele, sau oricare dintre exemplele de realizare, defectul de breşă osoasă este produs prin îndepărtarea secţiunilor de os care conţin o tumoră benignă. Exemplele de tumori osoase benigne includ, dar nu se limitează la, osteom, osteom osteoid, osteoblastom, osteocondrom, encondrom, fibrom conrdomixoid, chist osos anevrismal, chist osos unicameral, displazie fibroasă osoasă şi tumoare cu celule gigant a osului.

[0087] Administrarea anticorpului îmbunătăţeşte, sau accelerează vindecarea defectului de fisură osoasă, "tratând" astfel defectul. "Îmbunătăţirea" vindecării osoase înseamnă medierea unui nivel de vindecare osoasă dincolo de (adică, mai mare decât) nivelul de vindecare osoasă experimentat la subiecţii (de ex., mamifere, cum ar fi. oamenii) cărora nu li s-a administrat inhibitorul de sclerostină (adică, subiecţii din grupul de control). Vindecarea osoasă este evidenţiată, de exemplu, prin starea punţii osoase, volum osos îmbunătăţit, conţinut mineral osos şi densitate îmbunătăţite în fisura fracturii (adică, formarea de os de punte), calus osos matur, rezistenţă osoasă îmbunătăţită (opţional însoţită de un nivel acceptabil din punct de vedere medical de rigiditate osoasă), sau utilizare îmbunătăţită a zonei afectate de către pacient. Prin "îmbunătăţit" se înţelege o creştere, sau o scădere (după dorinţă) a parametrului măsurat. Creşterea poate fi o revenire, totală sau parţială, a parametrului măsurat la nivelul iniţial (de ex., nivelul anterior defectului de breşă osoasă), la valorile furnizate în bazele de date normative utilizate în domeniu, sau la nivelul funcţional contralateral (de ex., revenirea, totală sau parţială, la capacităţile funcţionale, de exemplu, ale membrului contralateral). În unele cazuri, creşterea poate fi o îmbunătăţire dincolo de nivelul iniţial. Dacă se doreşte, parametrii măsuraţi la pacienţii cărora li s-au administrat una, sau mai multe doze de anticorp pot fi comparaţi cu aceiaşi parametri la pacienţii cu fracturi (opţional, adecvaţi în funcţie de vârstă şi sex) cărora nu li s-a administrat anticorpul pentru a analiza în continuare eficacitatea metodelor descrise aici.

[0088] Formarea osului de punte, conţinutul mineral osos şi densitatea osoasă şi/sau calusul osos matur la locul defectului osos pot fi măsurate utilizând radiografia (de ex., absorbtomometria radiografică), absorbtomometria cu raze X cu energie simplă şi/sau duală, tomografia computerizată cantitativă (QCT), ultrasonografia, radiografia (de ex., absorbtomometria radiografică) şi imagistica prin rezonanţă magnetică. În unele exemple de realizare, anticorpul poate fi administrat într-o doză şi pentru o perioadă de timp eficiente pentru a creşte formarea osului de punte, formarea calusului osos, sau densitatea (sau volumul) osos la locul defectului cu cel puţin aproximativ 5% (aproximativ 6%, aproximativ 7%, aproximativ 8%, sau aproximativ 9%). În unele exemple de realizare, formarea osului de punte, formarea calusului osos, sau densitatea osoasă la locul defectului sunt crescute cu cel puţin aproximativ 10% (de ex., cel puţin aproximativ 10%, cel puţin aproximativ 12%, cel puţin aproximativ 15%, cel puţin aproximativ 18%, cel puţin aproximativ 20%, sau cel puţin aproximativ 22%). În alte exemple de realizare, formarea osului de punte, formarea calusului osos, sau densitatea osoasă la locul defectului sunt crescute de inhibitorul de sclerostină cu cel puţin aproximativ 25% (de ex., cel puţin aproximativ 26%, sau cel puţin aproximativ 28%). În alte exemple de realizare, formarea osului de punte, formarea calusului osos, sau densitatea osoasă la locul defectului este crescută cu cel puţin aproximativ 30% (de ex., cel puţin aproximativ 32%, cel puţin aproximativ 35%, cel puţin aproximativ 38%, sau cel puţin aproximativ 40%), sau cu cel puţin aproximativ 50% (de ex., cel puţin aproximativ 60%, cel puţin aproximativ 70%, cel puţin aproximativ 80%, cel puţin aproximativ 90%, sau aproximativ 100%). Creşterea sau restabilirea formării osului de punte poate fi determinată la 1 săptămână, 2 săptămâni, 3 săptămâni, sau 4 săptămâni după administrarea iniţială a anticorpului. Alternativ, nivelul densităţii osoase poate fi determinat după încheierea perioadei de tratament (de ex., la 1 săptămână, 2 săptămâni, 3 săptămâni, sau 4 săptămâni după încheierea perioadei de tratament). Într-un aspect, metoda reduce timpul necesar pentru a stabili un nivel dorit de formare osoasă, volum osos, calus osos, sau densitate osoasă (de ex., orice creştere procentuală a formării osoase, densităţii minerale osoase, calusului osos, sau volumului osos descrisă aici) în comparaţie cu pacienţii de aceeaşi vârstă şi sex care nu primesc anticorpul, reducând astfel timpul de recuperare pentru un subiect. De exemplu, într-o formă de realizare, anticorpul reduce timpul necesar pentru a creşte densitatea, sau volumul osos la locul defectului cu cel puţin aproximativ 10% (de ex., cel puţin aproximativ 20%, cel puţin aproximativ 25%, cel puţin aproximativ 30%, cel puţin aproximativ 35%, cel puţin aproximativ 40%, cel puţin aproximativ 45%, sau cel puţin aproximativ 50%).

[0089] Anticorpul nu trebuie neapărat să vindece subiectul tulburării, sau să protejeze complet împotriva apariţiei unei tulburări osoase pentru a obţine un răspuns biologic benefic. Anticorpul poate fi utilizat profilactic, adică pentru a proteja, în totalitate sau parţial, împotriva unei tulburări osoase, sau a unui simptom al acesteia. Anticorpul poate fi, de asemenea, utilizat terapeutic pentru a ameliora, în totalitate sau parţial, o tulburare, sau un simptom al acesteia legat de os, sau pentru a proteja, în totalitate sau parţial, împotriva progresiei ulterioare a unei tulburări osoase, sau a unui simptom al acesteia legat de os. Într-adevăr, materialele şi metodele invenţiei sunt deosebit de utile pentru creşterea densităţii minerale osoase şi, opţional, pentru menţinerea densităţii minerale osoase crescute pe o perioadă de timp.

[0090] Una, sau mai multe administrări ale unui anticorp descris aici pot fi efectuate pe o perioadă terapeutică de, exemplu, aproximativ 1 săptămână până la aproximativ 18 luni (de ex., aproximativ 1 lună până la aproximativ 12 luni, aproximativ 1 lună până la aproximativ 9 luni, sau aproximativ 1 lună până la aproximativ 6 luni, sau aproximativ 1 lună până la aproximativ 3 luni). Unui subiect i se pot administra una, sau mai multe doze ale unui anticorp descris aici pe o perioadă terapeutică de, exemplu, aproximativ 1 lună până la aproximativ 12 luni (52 de săptămâni) (de ex., aproximativ 2 luni, aproximativ 3 luni, aproximativ 4 luni, aproximativ 5 luni, aproximativ 6 luni, aproximativ 7 luni, aproximativ 8 luni, aproximativ 9 luni, aproximativ 10 luni, sau aproximativ 11 luni).

[0091] În plus, poate fi avantajos să se administreze doze multiple de anticorp, sau să se spaţieze administrarea dozelor, în funcţie de regimul terapeutic selectat pentru un anumit subiect. Anticorpul, sau fragmentul acestuia poate fi administrat periodic pe o perioadă de un an (12 luni, 52 de săptămâni), sau mai puţin (de ex., 9 luni sau mai puţin, 6 luni sau mai puţin, sau 3 luni sau mai puţin). În acest sens, anticorpul, sau fragmentul acestuia este administrat omului o dată la aproximativ 3 zile, sau la aproximativ 7 zile, sau la 2 săptămâni, sau la 3 săptămâni, sau la 4 săptămâni, sau la 5 săptămâni, sau la 6 săptămâni, sau la 7 săptămâni, sau la 8 săptămâni, sau la 9 săptămâni, sau la 10 săptămâni, sau la 11 săptămâni, sau la 12 săptămâni, sau la 13 săptămâni, sau la 14 săptămâni, sau la 15 săptămâni, sau la 16 săptămâni, sau la 17 săptămâni, sau la 18 săptămâni, sau la 19 săptămâni, sau la 20 de săptămâni, sau la 21 de săptămâni, sau la 22 de săptămâni, sau la 23 de săptămâni, sau la 6 luni, sau la 12 luni.

[0092] Una, sau mai multe doze de anticorp pot fi administrate într-o cantitate şi pentru o perioadă de timp eficiente pentru a creşte densitatea minerală osoasă, sau pentru a trata o afecţiune osoasă asociată cu scăderea densităţii minerale osoase. Una, sau mai multe doze pot cuprinde de la aproximativ 50 de miligrame până la aproximativ 1.000 de miligrame de anticorp administrate pe săptămână unui subiect (de ex., un subiect uman). De exemplu, o doză de anticorp poate cuprinde cel puţin aproximativ 5 mg, 15 mg, 25 mg, 50 mg, aproximativ 60 mg, aproximativ 70 mg, aproximativ 80 mg, aproximativ 90 mg, aproximativ 100 mg, aproximativ 120 mg, aproximativ 150 mg, aproximativ 200 mg, aproximativ 210 mg, aproximativ 240 mg, aproximativ 250 mg, aproximativ 280 mg, aproximativ 300 mg, aproximativ 350 mg, aproximativ 400 mg, aproximativ 420 mg, aproximativ 450 mg, aproximativ 500 mg, aproximativ 550 mg, aproximativ 600 mg, aproximativ 650 mg, aproximativ 700 mg, aproximativ 750 mg, aproximativ 800 mg, aproximativ 850 mg, aproximativ 900 mg, aproximativ 950 mg, sau până la aproximativ 1.000 mg de anticorp. Sunt avute în vedere şi intervale între oricare şi toate aceste valori finale, de ex., aproximativ 50 mg până la aproximativ 80 mg, aproximativ 70 mg până la aproximativ 140 mg, aproximativ 70 mg până la aproximativ 270 mg, aproximativ 75 mg până la aproximativ 100 mg, aproximativ 100 mg până la aproximativ 150 mg, aproximativ 140 mg până la aproximativ 210 mg, sau aproximativ 150 mg până la aproximativ 200 mg, sau aproximativ 180 mg până la aproximativ 270 mg, sau aproximativ 280 până la aproximativ 410 mg. Doza se administrează la orice interval, cum ar fi, de mai multe ori pe săptămână (de ex., de două, sau trei ori pe săptămână), o dată pe săptămână, o dată la două săptămâni, o dată la trei săptămâni, sau o dată la patru săptămâni. O doză de anticorp care variază de la aproximativ 120 mg până la aproximativ 210 mg poate fi administrată de două ori pe săptămână. O doză de aproximativ 140 mg de anticorp poate fi administrată de două ori pe săptămână. În diverse aspecte, o doză de aproximativ 210 mg de anticorpi este administrată o dată pe lună.

[0093] Una, sau mai multe doze de anticorp pot cuprinde între aproximativ 0,1 până la aproximativ 50 de miligrame (de ex., între aproximativ 5 şi aproximativ 50 de miligrame), sau aproximativ 1 până la aproximativ 100 de miligrame de anticorp pe kilogram corp (mg/kg). De exemplu, doza de anticorp poate cuprinde cel puţin aproximativ 0,1 mg/kg, 0,5 mg/kg, 1 mg/kg, aproximativ 2 mg/kg, aproximativ 3 mg/kg, aproximativ 4 mg/kg, aproximativ 5 mg/kg, aproximativ 6 mg/kg, aproximativ 7 mg/kg, aproximativ 8 mg/kg, aproximativ 9 mg/kg, aproximativ 10 mg/kg, aproximativ 20 mg/kg, aproximativ 25 mg/kg, aproximativ 26 mg/kg, aproximativ 27 mg/kg, aproximativ 28 mg/kg, aproximativ 29 mg/kg, aproximativ 30 mg/kg, aproximativ 31 mg/kg, aproximativ 32 mg/kg, aproximativ 33 mg/kg, aproximativ 34 mg/kg, aproximativ 35 mg/kg, aproximativ 36 mg/kg, aproximativ 37 mg/kg, aproximativ 38 mg/kg, aproximativ 39 mg/kg, aproximativ 40 mg/kg, aproximativ 41 mg/kg, aproximativ 42 mg/kg, aproximativ 43 mg/kg, aproximativ 44 mg/kg, aproximativ 45 mg/kg, aproximativ 46 mg/kg, aproximativ 47 mg/kg, aproximativ 48 mg/kg, sau aproximativ 49 mg/kg, sau aproximativ 50 mg/kg, aproximativ 55 mg/kg, aproximativ 60 mg/kg, aproximativ 65 mg/kg, aproximativ 70 mg/kg, aproximativ 75 mg/kg, aproximativ 80 mg/kg, aproximativ 85 mg/kg, aproximativ 90 mg/kg, aproximativ 95 mg/kg, sau până la aproximativ 100 mg/kg. Sunt avute în vedere şi intervale între oricare şi toate aceste valori finale, de ex., aproximativ 1 mg/kg până la aproximativ 3 mg/kg, aproximativ 1 mg/kg până la aproximativ 5 mg/kg, aproximativ 1 mg/kg până la aproximativ 8 mg/kb, aproximativ 3 mg/kg până la aproximativ 8 mg.kg, aproximativ 1 mg/kg până la aproximativ 10 mg/kg, aproximativ 1 mg/kg până la aproximativ 20 mg/kg, aproximativ 1 mg/kg până la aproximativ 40 mg/kg, aproximativ 5 mg/kg până la aproximativ 30 mg/kg, sau aproximativ 5 mg/kg până la aproximativ 20 mg/kg.

[0094] Monitorizarea terapiei

[0095] Creşterile mediate de anticorpi ale conţinutului mineral osos, sau ale densităţii osoase pot fi măsurate utilizând absorptometria cu raze X cu energie simplă şi duală, ultrasunetele, tomografia computerizată, radiografia şi imagistica prin rezonanţă magnetică. Cantitatea de masă osoasă poate fi calculată şi din greutăţile corporale, sau utilizând alte metode (a se vedea Guinness-Hey, Metab. Bone Dis. Relat. Res., 5:177-181 (1984)). Modelele animale sunt utilizate în domeniu pentru testarea efectului compoziţiilor şi metodelor farmaceutice asupra, de exemplu, parametrilor pierderii osoase, resorbţiei osoase, formării osoase, rezistenţei osoase, sau mineralizării osoase care imită condiţiile bolilor umane, cum ar fi, osteoporoza şi osteopenia. Exemplele de astfel de modele includ modelul de şobolan ovariectomizat (Kalu, Bone and Mineral, 15:175-192 (1991); Frost and Jee, Bone and Mineral, 18:227-236 (1992); şi Jee şi Yao, J. Musculoskel. Neuron. Interact., 1:193-207 (2001)). Metodele de măsurare a activităţii anticorpilor descrise aici pot fi utilizate şi pentru a determina eficacitatea altor inhibitori de sclerostină.

[0096] La om, densitatea minerală osoasă poate fi determinată clinic utilizând absorptiometria duală cu raze X (DXA), de exemplu, a şoldului şi coloanei vertebrale. Alte tehnici includ tomografia computerizată cantitativă (QCT), ultrasonografia, absorptiometria cu raze X cu energie unică (SXA) şi absorptiometria radiografică. Locurile scheletice centrale comune pentru măsurare includ coloana vertebrală şi şoldul; locurile periferice includ antebraţul, degetul, încheietura mâinii şi călcâiul. Cu excepţia ultrasonografiei, Asociaţia Medicală Americană notează că tehnicile de BMD (densitate minerală osoasă) implică de obicei utilizarea razelor X şi se bazează pe principiul că atenuarea radiaţiei depinde de grosimea şi compoziţia ţesuturilor din calea radiaţiei. Toate tehnicile implică compararea rezultatelor cu o bază de date normativă.

[0097] Alternativ, un răspuns fiziologic la unul, sau mai mulţi anticorpi anti-sclerostină poate fi măsurat prin monitorizarea nivelurilor markerilor osoşi. Markerii osoşi sunt produse create în timpul procesului de remodelare osoasă şi sunt eliberaţi de os, osteoblaste şi/sau osteoclaste. Fluctuaţiile nivelurilor de "markeri" ai resorbţiei osoase şi/sau ale formării osoase implică modificări ale remodelării/modelării osoase. Fundaţia Internaţională pentru Osteoporoză (IOF) recomandă utilizarea markerilor osoşi pentru monitorizarea terapiilor de densitate osoasă (a se vedea, de ex., Delmas ş.a., Osteoporos Int., Suppl. 6:S2-17 (2000)). Markerii care indică resorbţia osoasă (sau activitatea osteoclastelor) includ, de exemplu, C-telopeptida (de ex., telopeptida C-terminală a colagenului de tip 1 (CTX), sau C-telopeptida reticulată serică), N-telopeptida (telopeptida N-terminală a colagenului de tip 1 (NTX)), dezoxipiridinolina (DPD), piridinolina, hidroxiprolina urinară, galactozilhidroxilizina şi fosfataza acidă rezistentă la tartrat (de ex., izoforma 5b a fosfatazei acide rezistente la tartrat serică). Markerii de formare/mineralizare osoasă includ, dar nu se limitează la, fosfataza alcalină specifică osului (BSAP), peptidele eliberate din extensia N- şi C-terminală a procolagenului de tip I (P1NP, PICP) şi osteocalcina (OstCa). Mai multe kituri sunt disponibile comercial pentru detectarea şi cuantificarea markerilor în probele clinice, cum ar fi, urina şi sângele.

[0098] Terapie combinată

[0099] Tratamentul unei patologii prin combinarea a doi, sau mai mulţi agenţi care vizează acelaşi agent patogen, aceeaşi cale biochimică, sau acelaşi proces biologic are uneori ca rezultat o eficacitate mai mare şi efecte secundare diminuate în raport cu utilizarea unei doze relevante din punct de vedere terapeutic din fiecare agent în parte. În unele cazuri, eficacitatea combinaţiei de medicamente este aditivă (eficacitatea combinaţiei este aproximativ egală cu suma efectelor fiecărui medicament administrat în parte), dar în alte cazuri efectul este sinergic (eficacitatea combinaţiei este mai mare decât suma efectelor fiecărui medicament administrat în parte). Aşa cum este utilizat aici, termenul "terapie combinată" înseamnă că doi, sau mai mulţi agenţi sunt administraţi simultan, de ex., concomitent, sau în care unul dintre agenţi este administrat primul, urmat de al doilea agent, de ex., secvenţial.

[0100] Anticorpul poate fi administrat împreună cu un tratament standard pentru tratamentul densităţii minerale osoase scăzute (adică, anticorpul şi tratamentul standard fac parte din acelaşi plan de tratament). Aşa cum este utilizat aici, termenul "tratament standard" se referă la un tratament care este în general acceptat de medici pentru un anumit tip de pacient diagnosticat cu un anumit tip de boală. Anticorpul poate fi administrat împreună cu un al doilea agent de întărire a oaselor util pentru tratamentul densităţii minerale osoase scăzute, sau al defectului osos. Agentul de întărire a oaselor poate fi selectat din grupul care constă dintr-un agent antiresorbtiv, un agent de formare a oaselor (adică anabolic), un modulator al receptorilor de estrogen (inclusiv, dar fără a se limita la, raloxifen, bazedoxifen şi lasofoxifen) şi un medicament care are un efect inhibitor asupra osteoclastelor. Al doilea agent de întărire a oaselor poate fi selectat din grupul care constă dintr-un bifosfonat (inclusiv, dar fără a se limita la, alendronat de sodiu (FOSAMAX®), risedronat, ibandronat de sodiu (BONIVA®) şi acid zoledronic (RECLAST®)); un estrogen, sau un analog de estrogen; un inhibitor al ligandului anti-RANK (RANKL), cum ar fi, un anticorp anti-RANKL (de ex., denosumab, PROLIA®); vitamina D, sau un derivat, sau un mimetic al acesteia; o sursă de calciu, un inhibitor al catepsinei-K (cat-K) (de ex., odanacatib), tibolonă, calcitonină, sau un calcitriol; şi terapie de substituţie hormonală. Al doilea agent de creştere a oaselor poate include, dar fără a se limita la, hormon paratiroidian (PTH), sau un fragment peptidic al acestuia, proteină legată de PTH (PTHrp), proteină morfogenetică osoasă, osteogenină, NaF, un agonist PGE2, o statină, ranelat de stronţiu şi un inhibitor de sclerostină (de ex., un anticorp anti-sclerostină descris, de ex., în brevetele U.S. nr. 7.592.429, sau 7.872.106). Al doilea agent pentru întărirea oaselor ar putea fi Forteo® (Teriparatidă), Preotact®, sau Protelos®. Al doilea agent de întărire a ţesutului osos poate cuprinde o proteină morfogenetică osoasă (de ex., BMP-1, BMP-2, BMP-3, BMP-4, BMP-5, BMP-6, BMP-7, BMP-8, BMP-9, BMP-10, BMP-11, BMP-12, BMP-13, BMP-14 şi/sau BMP-15).

[0101] Terapia combinată care utilizează un anticorp descris aici poate preceda, sau urma administrării unui/unor agenţi terapeutici suplimentari (de ex., un al doilea agent de întărire a oaselor) la intervale cuprinse între minute, săptămâni, sau luni. De exemplu, se administrează modalităţi separate la un interval de aproximativ 24 ore una de cealaltă, de ex., la un interval de aproximativ 6-12 ore una de cealaltă, sau la un interval de aproximativ 1-2 ore una de cealaltă, sau la un interval de aproximativ 10-30 de minute una de cealaltă. În unele situaţii, poate fi de dorit să se extindă semnificativ perioada de tratament, trecând de la mai multe zile (2, 3, 4, 5, 6, sau 7 zile) până la câteva săptămâni (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, sau 8 săptămâni) între administrările diferitelor modalităţi. Se au în vedere în mod specific tratamentele repetate cu unul, sau ambii agenţi/terapii ai terapiei combinate.

[0102] Regimul terapeutic de întreţinere

[0103] De asemenea, este avută în vedere utilizarea unui al doilea agent de creştere a densităţii osoase şi/sau anticorp descris aici într-un regim de întreţinere pentru, de ex., a preveni, sau încetini pierderea densităţii minerale osoase. În acest sens, o metodă, sau utilizare descrisă aici cuprinde, opţional, administrarea uneia, sau mai multor cantităţi dintr-un al doilea agent de creştere a densităţii osoase eficient în menţinerea densităţii minerale osoase pentru o perioadă de întreţinere de aproximativ 1 săptămână până la aproximativ 5 ani după încheierea perioadei de tratament cu anticorpul. De exemplu, o metodă, sau utilizare descrisă aici cuprinde administrarea unui al doilea agent de întărire a oaselor subiectului pentru o perioadă de menţinere de aproximativ cel puţin aproximativ 1 săptămână, aproximativ 2 săptămâni, aproximativ 3 săptămâni, aproximativ 4 săptămâni, aproximativ 5 săptămâni, aproximativ 6 săptămâni, aproximativ 7 săptămâni, aproximativ 8 săptămâni, aproximativ 9 săptămâni, aproximativ 10 săptămâni, aproximativ 11 săptămâni, aproximativ 12 săptămâni, aproximativ 3 luni, aproximativ 13 săptămâni, aproximativ 14 săptămâni, aproximativ 15 săptămâni, aproximativ 16 săptămâni, aproximativ 4 luni, aproximativ 17 săptămâni, aproximativ 18 săptămâni, aproximativ 19 săptămâni, aproximativ 20 de săptămâni, aproximativ 5 luni, aproximativ 21 de săptămâni, aproximativ 22 de săptămâni, aproximativ 23 de săptămâni, aproximativ 24 de săptămâni, aproximativ 6 luni, aproximativ 25 de săptămâni, aproximativ 26 de săptămâni, aproximativ 27 de săptămâni, aproximativ 28 de săptămâni, aproximativ 7 luni, aproximativ 29 de săptămâni, aproximativ 30 de săptămâni, aproximativ 31 de săptămâni, sau mai mult (de ex., aproximativ 8 luni, aproximativ 9 luni, aproximativ 10 luni, aproximativ 11 luni, aproximativ 1 an, aproximativ 15 luni, aproximativ 18 luni, aproximativ 2 ani, aproximativ 3 ani, aproximativ 4 ani, aproximativ 5 ani, sau mai mult (de ex., pe durata vieţii subiectului). Perioada de menţinere poate fi de aproximativ 6-12 săptămâni. Perioada de menţinere poate fi de aproximativ 4-12 săptămâni, sau de aproximativ 1-3 luni. Perioada de menţinere poate fi de aproximativ 12-20 de săptămâni, sau de aproximativ 3-5 luni. Perioada de menţinere poate fi de aproximativ 20-32 de săptămâni, sau de aproximativ 5-8 luni. Perioada de menţinere poate fi de aproximativ 24-36 de săptămâni, sau de aproximativ 6-9 luni. Perioada de menţinere poate fi de aproximativ 1 an, aproximativ 2 ani, aproximativ 3 ani, aproximativ 4 ani, aproximativ 5 ani, sau mai mult. "Menţinerea" densităţii minerale osoase include menţinerea unor niveluri similare ale parametrilor densităţii minerale osoase cu cele observate la subiectul care a primit tratamentul cu anticorpi.

[0104] Kituri

[0105] O compoziţie farmaceutică care cuprinde unul, sau mai mulţi anticorpi descrişi aici poate fi plasată în recipiente (de ex., flacoane, sau seringi), împreună cu material de ambalare care oferă instrucţiuni privind utilizarea unor astfel de compoziţii farmaceutice. În general, astfel de instrucţiuni vor include o exprimare tangibilă care descrie concentraţia de anticorpi, precum şi, în anumite exemple de realizare, cantităţi relative de ingrediente, excipienţi, sau diluanţi (de ex., apă, soluţie salină, sau PBS) care pot fi necesare pentru reconstituirea compoziţiei farmaceutice.

[0106] EXEMPLE

[0107] Exemplul 1 - Analiza variantei C-terminală PARG a Romosozumabului

[0108] Romosozumab de tip sălbatic şi o variantă C-terminală PARG a romosozumabului au fost digerate prin Lys-C şi analizate prin cartografiere peptidică LC/MS. Profilurile UV ale acestor două construcţii au fost comparate una lângă alta (Figura 3). S-a stabilit că romosozumabul de tip sălbatic şi varianta C-terminală PARG a romosozumabului au un pic similar care eluează la 37,7 minute, dar s-a determinat că romosozumabul de tip sălbatic are o masă de 659,3 Da şi varianta C-terminală PARG a romosozumabului are o masă de 886,7 Da. Se crede că majoritatea variantelor de lizină (K) ale romosozumabului (PGK) au fost eliminate din proces. Prezenţa unei cantităţi semnificative din forma amidată a variantei C-terminală PARG a romosozumabului (pic 828,6 Da) confirmă faptul că eficienţa amidării este dependentă de secvenţă în comparaţie cu secvenţa PG a romosozumabului de tip sălbatic.

[0109] În continuare, varianta C-terminală PARG a fost tratată cu carboxipeptidază (CP-B), analizată prin metoda CEX-HPLC şi comparată cu varianta de control C-terminală PARG, care nu a fost tratată cu CP-B. Există o deplasare semnificativă după tratament pentru picurile care eluează la 17,5 minute şi 21 minute, dar nu şi pentru picul de la 24 minute (Figura 4). Se are în vedere că picul de la 24 minute este forma dublu amidată, care este protejată de degradarea proteolitică.

[0110] Exemplul 2 - Îmbogăţirea variantelor C-terminale

[0111] Purificarea, sau îmbogăţirea pentru diferite specii de romosozumab dintr-o compoziţie care cuprinde romosozumab de tip sălbatic şi varianta C-terminală PARG a romosozumabului se realizează prin fracţionare prin cromatografie cu schimb cationic (CEX). CEX separă proteinele pe baza diferenţelor dintre sarcinile lor de suprafaţă. La un pH stabilit, variantele încărcate pozitiv ale romosozumabului de tip sălbatic sunt separate pe o coloană de schimb cationic (de ex., coloana analitică Dionex Pro Pac WCX-10, 2,0 mm x 250 mm) şi eluate folosind un gradient de sare (de ex., Faza Mobilă A: 10:90 (v/v) ACN, 19 mM MES pH 6,2; Faza Mobilă B: 10:90 (v/v) ACN, 19 mM MES, 250 mM NaCl, pH 6,2). Diferitele variante C-terminale ale romosozumabului sunt încărcate diferit şi varianta încărcată mai pozitiv eluează ulterior în CEX. Astfel, ordinea de eluţie este: PG (tip sălbatic), P-amidă (prolină amidată de tip sălbatic), variantă PARG şi PAR-amidă. Colectorul de fracţii poate fi programat să colecteze eluenţi CEX care conţin diferite variante la timpi de eluţie diferiţi.

[0112] Exemplul 3 - Analiza agregării variantelor C-terminale PARG ale Romosozumabului

[0113] Fără a fi legaţi de vreo teorie anume, se are în vedere că, deoarece varianta C-terminală PARG este puternic încărcată, astfel de forme ar respinge formele neamidate din compoziţii, reducând astfel agregarea în compoziţie.

[0114] Lotul de proteine A al variantei C-terminale PARG a romosozumabului a fost analizat alături de setul de proteine A al romosozumabului de tip sălbatic utilizând SEC-HPLC, o metodă HPLC de excludere dimensională care separă proteinele pe baza diferenţelor de volum hidrodinamic (Tabelul 1).

[0115] Tabelul 1

Moleculă

%HMW

Lot AMG785 ARG ProA

3,4%

Lot AMG785 WT ProA

7,2%

[0117] Datele au demonstrat că varianta C-terminală PARG a romosozumabului are mai puţine specii cu greutate moleculară mare în comparaţie cu romosozumabul de tip sălbatic.

[0118] Exemplul 4 - Analiza viscozităţii variantei C-terminale PARG a Romosozumabului

[0119] Soluţiile de anticorpi care conţin varianta C-terminală PARG a romosozumabului, sau romosozumabul de tip sălbatic sunt măsurate folosind un con şi o placă. Soluţiile sunt concentrate până la 120 mg/ml în funcţie de epuizarea volumică aproximativă şi sunt determinate concentraţiile finale (± 10%) folosind absorbanţa proteinelor la 280 nm (după diluare pentru a ajunge în limitele a 0,1-1 unităţi de absorbanţă (AU)) şi un coeficient de extincţie specific proteinei. Analiza viscozităţii este efectuată pe un instrument Brookfield LV-DVIII cu con şi placă (Brookfield Engineering, Middleboro, MA, SUA) folosind un ax şi o cupă de probă CP-40, sau un reometru ARES-G2 (TA Instruments, New Castle, DE, SUA) folosind un ax TA Smart Swap cu con/placă de 2 grade. Toate măsurătorile sunt efectuate la 25 °C şi controlate de o baie de apă ataşată la cupa de probă. Au fost colectate manual mai multe măsurători de viscozitate, într-un interval de cuplu definit (10-90%), prin creşterea turaţiei axului. Măsurătorile sunt mediate pentru a raporta o valoare a viscozităţii pe probă, pentru a simplifica graficul comparativ rezultat.

[0120] Exemplul 5 - Analiza solubilităţii variantei C-terminale PARG a Romosozumbului

[0121] Pentru a determina impactul variaţiei de aminoacizi ale variantei PARG a romosozumabului, comparativ cu romosozumabul de tip sălbatic, asupra solubilităţii după injectarea subcutanată (SC), a fost efectuat un test de solubilitate în dializă atât pe varianta romosozumab de tip sălbatic, cât şi pe varianta PARG-C terminală. Acest screening implică dializarea unei probe din varianta C-terminală PARG a romosozumabului şi a unei probe din romosozumab de tip sălbatic într-o soluţie care simulează pH-ul şi tăria ionică a spaţiului SC şi monitorizarea solubilităţii şi stabilităţii fizice a anticorpului în aceste condiţii pe o perioadă scurtă de timp. Probele au fost formulate la ~63 mg/ml în tampon de formulare (pH 5,2). Apoi, fiecare probă a fost injectată într-o casetă de dializă şi dializată într-un tampon PBS pentru a imita spaţiul SC. Observaţiile vizuale au fost efectuate la 24 ore după dializa iniţială. Romosozumabul de tip sălbatic prezintă de obicei precipitare după 24 ore.

[0122] Rezultatele arată că ambele molecule precipită în această analiză, dar varianta C-terminală PARG precipită mai puţin şi într-un ritm mai lent. Acest lucru sugerează că această variantă este mai rezistentă la precipitare decât tipul sălbatic, deşi varianta nu elimină complet precipitarea.

[0123] Exemplul 6 - Analiza de difuzie a variantei C-terminale PARG a Romosozumabului

[0124] Pentru a determina impactul variaţiei aminoacizilor din varianta C-terminală PARG a romosozumabului, în comparaţie cu romosozumabul de tip sălbatic, asupra difuziei din spaţiul subcutanat (SC), a fost efectuat un test utilizând Scissor (Pion Inc., Billerica, MA). Acest test implică injectarea probelor (varianta C-terminală PARG a romosozumabului, sau romosozumab de tip sălbatic) la o concentraţie de ~70 mg/ml într-un spaţiu SC simulat, compus dintr-o matrice de colagen şi acid hialuronic. Anticorpul este capabil să difuzeze din această matrice printr-o membrană de dializă într-un rezervor de tampon carbonat la pH 7,4. Momentele de timp au fost colectate timp de până la 3 zile şi fiecare moment de timp a fost testat pentru concentraţia de proteine prin RP-HPLC. Curbele concentraţiei de proteine în funcţie de timp generate simulează ratele de difuzie din spaţiul SC. În plus, precipitarea în matricea SC este monitorizată prin inspecţie vizuală.

[0125] Atât romosozumabul de tip sălbatic, cât şi varianta C-terminală PARG au fost testate în Scissor, aşa cum s-a descris mai sus. Rezultatele prezentate în Figura 5 indică faptul că, romosozumabul de tip sălbatic difuzează din spaţiul SC simulat la o viteză mult mai mică şi că o cantitate mai mare de romosozumab de tip sălbatic este reţinută la locul de injectare simulat decât varianta C-terminală PARG a romosozumabului.

[0126] Exemplul 7 - Legarea FcRn

[0127] FcRn, receptorul Fc neonatal, este un heterodimer de tip MHC clasa I, compus dintr-un lanţ α transmembranar (omolog cu moleculele de tip MHC clasa I) şi un lanţ uşor β2 microglobulinic. FcRn se leagă de interfaţa dintre domeniile CH2 şi CH3 ale lanţurilor grele de IgG din regiunea Fc a moleculei de IgG în condiţii uşor acide (~pH 6) şi se eliberează la pH neutru (~7,4). Prin această interacţiune dependentă de pH, FcRn mediază homeostazia IgG la adulţii umani prin menţinerea nivelurilor serice de IgG.

[0128] Un test de legare competitivă, Testul de legare AlphaScreen® (PerkinElmer, San Jose, CA) a fost utilizat pentru a evalua legarea domeniului Fc al romosozumabului de tip sălbatic şi al variantei C-terminale PARG a romosozumabului la FcRn. Testul este un test omogen de proximitate luminescentă amplificată ("Alpha") bazat pe sfere, care detectează interacţiunile bimoleculare. Testul conţine două tipuri de sfere, o sferă acceptoare şi o sferă donatoare. Sferele acceptoare sunt acoperite cu un hidrogel care conţine derivaţi de tioxenă, precum şi chelat de nichel care se leagă de domeniul histidină al FcRn marcat cu histidină (FcRn-His). Sferele donatoare sunt acoperite cu un hidrogel care conţine ftalocianină, un fotosensibilizator şi streptavidină, care se leagă de Fc uman derivat din CHO biotinilat. Când FcRn-His şi Fc uman biotinilat se leagă împreună, acestea aduc sferele acceptoare şi donatoare în imediata apropiere. Când lumina laser este aplicată acestui complex, oxigenul ambiental este convertit în oxigen singlet de către microsferă donatoare. Dacă microsferele se află în imediata apropiere, are loc un transfer de energie către microsfera acceptoare, rezultând producţia de lumină (luminescenţă), care este măsurată într-un cititor de plăci echipat pentru detectarea semnalului AlphaScreen®.

[0129] Când un anticorp este prezent în concentraţii suficiente pentru a inhiba legarea FcRn-His la domeniul Fc uman biotinilat, se observă o scădere dependentă de doză a emisiei la 570 nm. Legarea probei de testat faţă de standardul de referinţă al anticorpului este determinată şi raportată ca % de legare relativă şi poate fi utilizată pentru a demonstra integritatea domeniului Fc al anticorpului. Se are în vedere că, în cazul compoziţiilor care au varianta C-terminală PARG, curba doză-răspuns va fi similară, sau mai bună decât anticorpul de tip sălbatic.

[0130] Rezultatele sunt prezentate în Figura 6. S-a observat că atât romosozumab de tip sălbatic, cât şi varianta C-terminală PARG a romosozumabului s-au legat similar de FcRn şi legarea FcRn nu a fost afectată de mutaţia PARG.

[0131] Exemplul 8 - Legarea FcyRIIa

[0132] FcyRIIa este un receptor Fc activator exprimat pe monocite, anumite celule dendritice, neutrofile, celule B, trombocite şi celule NK. FcyRIIa (CD32a) este cel mai răspândit FcyR, cu două domenii extracelulare de tip Ig şi afinitate scăzută de legare pentru IgG monomerică. Există două variante alelice comune la om despre care se ştie că există pentru FcγRIIa, care exprimă fie histidină, fie arginină la poziţia 131 (131H şi, respectiv, 131R).

[0133] A fost dezvoltat un test de legare competitivă pentru a evalua legarea romosozumabului de tip sălbatic şi a variantei C-terminale PARG a romosozumabului la FcyRIIa (131H). Testul de legare a FcyRIIa (131H) este un test omogen de proximitate luminescentă amplificat, bazat pe sfere (test de legare AlphaScreen® (PerkinElmer, San Jose, CA) care detectează interacţiunile bimoleculare. Testul conţine 2 tipuri de sfere, o sferă acceptoare şi o sferă donatoare. Sferele acceptoare conţin chelatul de europiu, un fluorofor şi sunt acoperite cu un hidrogel care conţine glutationă, care se leagă de FcγRIIa (131H)-glutation-S-transferază umană recombinantă (FcγRIIa (131H) - GST). Sferele donatoare sunt acoperite cu un hidrogel care conţine ftalocianină, un fotosensibilizator şi streptavidină, care se leagă de IgG1 umană biotinilată. Când FcyRIIa (131H) - GST şi IgG1 umană biotinilată se leagă, acestea aduc sferele acceptoare şi donatoare în apropiere. Când un laser este aplicat acestui complex, oxigenul ambiental este convertit în oxigen singlet de către sfera donatoare. Când sferele acceptoare şi donatoare sunt aproape, oxigenul singlet difuzează în interiorul sferelor acceptoare, rezultând producerea de lumină (luminescenţă), care este măsurată într-un cititor de plăci echipat pentru detectarea semnalului de luminescenţă.

[0134] Când anticorpii sunt prezenţi în concentraţii suficiente pentru a inhiba legarea FcyRIIa (131H) - GST la IgG1 umană biotinilată, se măsoară o scădere dependentă de doză a emisiei la 570 nm. Legarea probei de testat faţă de standardul de referinţă al anticorpilor este determinată şi raportată ca % de legare relativă şi poate fi utilizată pentru a demonstra integritatea domeniului Fc al anticorpului. Rezultatele sunt prezentate în Figura 7. S-a observat că legarea relativă a variantei C-terminale PARG a romosozumabului la FcyRIIa (131H) a fost mult mai mare decât la romosozumab de tip sălbatic.

[0135] Exemplul 9 - Studiu farmacocinetic pe şoareci

[0136] Pentru a evalua in vivo expunerea şi biodisponibilitatea la medicament, se efectuează un studiu farmacocinetic cu doză unică la şoareci. Varianta C-terminală PARG a romosozumabului este injectată fie intravenos (prin vena cozii), fie subcutanat, la o doză de 1 mg/kg. Folosind nouă animale pe grup, eşantionarea eşalonată permite colectarea datelor la un număr mare de momente în timp, fără a depăşi volumul maxim de sânge care poate fi prelevat de la un animal individual. La fiecare moment în timp, se prelevează 0,05 ml de sânge. Animalele 1 până la 3 sunt prelevate la 0,083, 24, 96 şi 192 ore după administrare. Animalele 4-6 sunt prelevate la 1, 48, 168 şi 240 ore. Animalele 7-9 sunt prelevate la 6, 72 şi 192 ore. Serul este colectat din proba de sânge integral şi concentraţia substanţei testate este determinată printr-un test imunologic de legare, cum ar fi, ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbant Assay). Modificările concentraţiei substanţei testate în timp pot fi utilizate pentru a calcula parametrii farmacocinetici prin analiza în două compartimente. Parametrii de interes includ, dar fără a se limita la, aria de sub curba concentraţiei plasmatice în funcţie de timp (AUC), timpul de înjumătăţire (t1/2) şi clearance-ul (CL) pentru fiecare grupă de dozare. Biodisponibilitatea poate fi determinată ca raportul dintre AUC pentru doza administrată subcutanat şi AUC pentru doza administrată intravenos.

Claims (15)

1. Anticorp care se leagă specific la sclerostina din SECV ID NR: 1, în care anticorpul cuprinde un lanţ greu care cuprinde secvenţa de aminoacizi Pro-Ala-Arg-Gly (SECV ID NR: 8) la capătul C-terminal al lanţului greu, în care anticorpul cuprinde o secvenţă de aminoacizi a lanţului uşor prezentată în SECV ID NR: 12 şi o secvenţă de aminoacizi a lanţului greu prezentată în SECV ID NR: 13, sau SECV ID NR: 14.

2. Anticorp conform revendicării 1, în care capătul C-terminal al lanţului greu este amidat.

3. Anticorp conform revendicării 1, sau revendicării 2, în care capătul C-terminal al ambelor lanţuri grele cuprinde secvenţa de aminoacizi Pro-Ala-Arg-Gly (SECV ID NR: 8), opţional în care capătul C-terminal al ambelor lanţuri grele este amidat.

4. Anticorp conform revendicării 1, în care anticorpul cuprinde o secvenţă de aminoacizi care cuprinde Pro-Ala-Arg-Gly-Lys (SECV ID NR: 11) la capătul C-terminal al unui lanţ greu.

5. Compoziţie farmaceutică care cuprinde o populaţie de anticorpi conform oricăreia dintre revendicările 1-4 şi un purtător acceptabil farmaceutic.

6. Compoziţie farmaceutică care cuprinde un amestec de anticorpi care se leagă specific la sclerostina cu SECV ID NR: 1 şi un purtător acceptabil farmaceutic;

în care 3-5% dintre anticorpii din compoziţie sunt o populaţie de anticorpi conform oricăreia dintre revendicările 1-4.

7. Compoziţie farmaceutică conform revendicării 6, în care toată, sau o parte din populaţia de anticorpi cuprinde un lanţ greu care cuprinde o secvenţă C-terminală Pro-Ala-Arg-Gly (SECV ID NR: 8), opţional în care Pro-Ala-Arg-Gly C-terminală (SECV ID NR: 8) este mono-amidată

8. Compoziţie farmaceutică conform revendicării 6, sau revendicării 7, în care toată, sau o parte din populaţia de anticorpi cuprinde o secvenţă C-terminală Pro-Ala-Arg-Gly (SECV ID NR: 8) în ambele lanţuri grele, opţional în care secvenţa C-terminală Pro-Ala-Arg-Gly (SECV ID NR: 8) este amidată pe ambele lanţuri grele.

9. Compoziţie farmaceutică conform revendicării 8, în care mai puţin de 35% din populaţia de anticorpi este amidată pe ambele lanţuri grele.

10. Compoziţie farmaceutică conform oricăreia dintre revendicările 6-8, în care mai puţin de 35% din populaţia de anticorpi cuprinde lanţuri grele care nu sunt amidate.

11. Compoziţie farmaceutică conform oricăreia dintre revendicările 6-8, în care 33% din populaţia de anticorpi nu este amidată, 33% din populaţia de anticorpi cuprinde un lanţ greu amidat şi 33% din populaţia de anticorpi cuprinde două lanţuri grele amidate.

12. Compoziţie farmaceutică conform oricăreia dintre revendicările 6-11, care cuprinde, în plus, o sare de calciu, un tampon acetat, un poliol şi un surfactant.

13. Compoziţie farmaceutică conform revendicării 12, în care sarea de calciu cuprinde acetat de calciu, tamponul acetat cuprinde acetat de sodiu, poliolul cuprinde zaharoză şi surfactantul cuprinde polisorbat 20.

14. Compoziţie farmaceutică conform oricăreia dintre revendicările 6-13, care cuprinde, în plus, 55 mM acetat, 13 mm calciu, 6,0% (g/v) zaharoză, 0,006% (g/v) polisorbat 20, pH 5,2.

15. Compoziţie farmaceutică conform oricăreia dintre revendicările 5-14, pentru utilizare în tratamentul unei afecţiuni osoase la un subiect, în care respectiva afecţiune osoasă este asociată cu o activitate anormală a osteoblastelor, sau osteoclastelor.