MD3227325T2 - Compoziții de inhibitor selectiv trans-semnalizare de IL-6 - Google Patents

Abstract

Un inhibitor selectiv de semnalizare IL-6-trans poate fi utilizat pentru a trata o varietate de afecţiuni mediate de IL-6, inclusiv boli inflamatorii şi cancer. Inhibitorul poate fi administrat în siguranţă la oameni într-o varietate de doze.

Description

CONTEXTUL INVENŢIEI

IL-6 este o citokină pleiotropă produsă de celulele hematopoietice şi non-hematopoietice, de exemplu ca răspuns la infecţie şi leziuni tisulare. IL-6 îşi exercită activităţile biologice multiple prin două căi principale de semnalizare, o aşa-numită cale clasică ligand-receptor prin IL-6R legat de membrană, prezentă în principal pe hepatocite şi anumite leucocite, şi o cale de trans-semnalizare prin sIL-6R circulant care provine din clivajul proteolitic al IL-6R legat de membrană sau din tăiere şi îmbinare alternativă.

În calea clasică, IL-6 se leagă direct de IL-6R legat de membrană pe suprafaţa unei game limitate de tipuri de celule. Complexul IL-6/IL-6R se asociază cu un dimer preformat al proteinei receptorului gp130 transducător de semnal, provocând modificări sterice în homodimerul gp130 şi iniţiind astfel o cascadă de semnalizare intracelulară. Semnalizarea clasică este responsabilă pentru mecanismele acute de apărare inflamatorie şi pentru funcţiile fiziologice cruciale ale IL-6, cum ar fi semnale de creştere şi regenerare pentru celule epiteliale intestinale.

Domeniile extracelulare ale IL-6R şi gp130 pot fi generate fără domeniile de ancorare a membranei prin translaţia ARNm-urilor tăiate şi îmbinate alternativ, rezultând variante de sIL-6R şi sgp130. În plus, domeniul extracelular al IL-6R poate fi eliminat de proteazele legate de membrană din familia A dezintegrină şi metaloproteaze (ADAM) (la om, ADAM17) pentru a genera sIL-6R. În procesul de trans-semnalizare, sIL-6R se leagă de IL-6, formând un complex agonist care se leagă de dimerii transmembranari gp130 prezenţi pe o multitudine de tipuri de celule care nu exprimă IL-6R legat de membrană; semnalizarea IL-6 de către traductoarele de semnal şi activatorii transcripţiei (STAT) este atunci indusă în celulele care nu răspund în mod normal la IL-6. Activitatea complexului IL-6/sIL-6R este în mod normal controlată de niveluri ridicate de sgp130 prezent în circulaţie, care concurează efectiv cu gp130 legat de membrană. Trans-semnalizarea este implicată în principal în inflamaţia cronică şi s-a demonstrat că împiedică populaţiile de celule T de mucoasă, care promovează boala, să intre în apoptoză. EP1630232 descrie transfecţia celulelor HEK293 cu gp130-Fc, incubarea celulelor transfectate timp de 24 de ore şi apoi recoltarea gp130-Fc din colecţia de celule cultivate.

Ar fi de dorit să existe o moleculă care mimează inhibitorul natural de trans-semnalizare sgp130, dar cu o afinitate de legare mai mare şi, în consecinţă, o activitate inhibitoare mai puternică. Mai mult, ar fi de dorit să existe o moleculă care să poată fi administrată la om cu toxicitate minimă şi potenţial imunogen.

SUMARUL INVENŢIEI

S-a descoperit acum că un inhibitor selectiv II,-6-trans-semnalizare poate fi administrat la oameni fără efecte nocive semnificative într-un interval mare de dozare. Acest inhibitor este în mod substanţial lipsit de modele de agregare şi glicozilare care sunt asociate cu potenţial imunogen. În plus, inhibitorul asigură un timp de înjumătăţire favorabil la om.

Invenţia furnizează un dimer polipeptidic cuprinzând doi monomeri de SECV ID NR: 1. De preferinţă, monomerii sunt legaţi prin una sau mai multe punţi disulfură. De preferinţă, dimerul este legat prin punţi disulfură la poziţiile Cys623 şi Cys626 de SECV ID NO: 1. Invenţia furnizează de asemenea un dimer polipeptidic cuprinzând doi monomeri ai SECV ID NR: 2. De preferinţă, monomerii sunt legaţi prin una sau mai multe punţi disulfură. De preferinţă, dimerul este legat prin punţi disulfură la poziţiile Cys623 şi Cys626 de SECV ID NO: 2.

Dimerul polipeptidic cuprinde nu mai mult de 6 % galactoză-alfa-1,3-galactoză per mol de polipeptidă. De preferinţă, dimerul polipeptidic include cel puţin 52% glicani având unul sau mai multe resturi de acid sialic.

Invenţia furnizează, de asemenea, o compoziţie cuprinzând dimerii polipeptidici dezvăluiţi aici. De preferinţă, nu mai mult de 5% din dimerul polipeptidic din compoziţie este prezent ca un agregat oligomeric şi/sau compoziţia nu cuprinde mai mult de 10,0%, 8,0%, 6,0 sau 4,0% în greutate de polipeptide care sunt o variaţie trunchiată a polipeptidei (de exemplu, o versiune trunchiată a SECV ID NR: 1 în raport cu polipeptidele din SECV ID NR: 1 sau o versiune trunchiată din SECV ID NR: 2 în raport cu polipeptidele din SECV ID NR: 2). Mai mult, dimerii din astfel de compoziţii pot include caracteristicile descrise în paragraful de mai sus şi descrise mai detaliat mai jos.

Invenţia mai include utilizarea dimerilor polipeptidici şi a compoziţiilor descrise aici pentru fabricarea unui medicament pentru tratarea unei afecţiuni descrise aici.

În plus, invenţia include metode de preparare a dimerilor polipeptidici, ceea ce acoperă secvenţe de nucleotide asociate, vectori de expresie, celule care exprimă polipeptida, şi purificarea polipeptidei. În particular, invenţia include secvenţe de nucleotide codificând o polipeptidă de SECV ID NR: 1 sau SECV ID NR:2 sau o polipeptidă având o secvenţă de aminoacizi identică în cel puţin 90% cu SECV ID NR: 1 sau SECV ID NR:2. De preferinţă, secvenţa de nucleotide este identică în cel puţin 90% cu secvenţa de nucleotide din FIG. 3 sau FIG. 7 şi mai preferabil codifică o polipeptidă cu SECV ID NR: 1 sau SECV ID NR: 2. De preferinţă, secvenţa de nucleotide este secvenţa de nucleotide din Figura 7.

DESCRIEREA PE SCURT A FIGURILOR

FIG. 1 arată calea de trans-semnalizare a IL-6. sIL-6R generat din ARNm tăiat şi îmbinat alternativ sau clivaj proteolitic este capabil să se lege la IL-6 pentru a forma un complex IL-6/sIL-6 care se leagă la gp130 prezent pe marea majoritate a tipurilor de celule ale corpului şi induce o cascadă de semnalizare intracelulară.

FIG. 2 arată că un dimer polipeptidic cuprinzând doi monomeri din SECV ID NR: 1 nu interferează cu legarea IL-6 la IL-6R legat de membrană (semnalizare clasică), dar se leagă selectiv la complexul IL-6/sIL-6R şi previne trans-semnalizarea.

FIG. 3 arată secvenţa de nucleotide şi aminoacizi a subunităţii unice gp130-Fc.

FIG. 4 prezintă o hartă a vectorului de expresie pANTVhG1. Sunt prezentate elemente pentru IgG umană sau expresia proteinei de fuziune şi pentru selecţia în celulele eucariote, precum şi siturile relevante de digestie cu enzime de restricţie (nu la scară). Elementele includ: CMV P, un promotor de expresie a citomegalovirusului; secvenţe IgG1 umană: VH, CH1, Hinge, CH2 şi CH3; hIgGI poli A, secvenţă de poliadenilare IgG umană; pAT153; o secvenţă de vector de expresie derivată din pBR322 care conţine o origine de replicare şi o genă Amp pentru rezistenţa bacteriană împotriva ampicilinei; secvenţă de promotor SV40; DHFR, secvenţă de codificare a dihidrofolat reductazei; secvenţe de digestie cu enzime de restricţie Mlul, HindIII, Eagl şi SspI; şi o secvenţă murină de semnal consens. Detalii ale elementelor pentru propagarea şi selecţia de procariote nu sunt arătate.

FIG. 5 arată o hartă a vectorului de expresie pFER02. Sunt arătate elementele pentru exprimarea peptidei 1 şi pentru selecţia în celulele eucariote, precum şi siturile relevante de digestie cu enzime de restricţie (nu la scară). Elementele includ: CMV P, un promotor de expresie a citomegalovirusului; SECV ID NR: 2, secvenţa de codificare; hIgG1 poli A, secvenţă de poliadenilare IgG umană; pAT153; o secvenţă de vector de expresie derivată din pBR322 care conţine o origine de replicare şi genă Amp pentru rezistenţa bacteriană împotriva ampicilinei; secvenţă de promotor SV40; DHFR, secvenţă de codificare a dihidrofolat reductazei; secvenţele de digestie cu enzime de restricţie MluI, EagI şi SspI; şi o secvenţă murină de semnal consens.

FIG. 6 prezintă elemente de secvenţă de nucleotide ale plasmidei de expresie pFER02.

FIG. 7 arată secvenţa de aminoacizi a subunităţii unice gp130-Fc şi secvenţa de nucleotide optimizată pentru utilizarea optimă a codonului în celule CHO.

DESCRIERE DETALIATĂ A INVENŢIEI

Un aspect al invenţiei furnizează un dimer de doi monomeri de fuziune gp130-Fc (de exemplu, doi monomeri din SECV ID NR: 1). În forma sa activă, polipeptida cu SECV ID NR: 1 există ca un dimer legat prin două legături disulfură la Cys623 şi Cys626 (FIG. 2). SECV ID NR: 2 corespunde secvenţei de aminoacizi a unui monomer de fuziune gp130-Fc având peptida semnal endogenă. Peptida semnal este îndepărtată în timpul sintezei proteinelor, rezultând producerea polipeptidei din SECV ID NR: 1.

Dimerii polipeptidici descrişi aici inhibă selectiv trans-semnalarea excesivă (FIG. 1) şi induc apoptoza celulelor T dăunătoare implicate în multiple boli inflamatorii. Dimerul polipeptidic vizează şi neutralizează complecşii IL-6/sIL-6R şi, prin urmare, este de aşteptat să inhibe doar IL-6 trans-semnalizarea în concentraţiile terapeutice dorite, lăsând intacte semnalizarea clasică şi numeroasele sale funcţii fiziologice, precum şi mecanismele sale acute de apărare inflamatorie (FIG. 2). Se crede că dimerul polipeptidic nu poate interfera cu semnalizarea IL-6 clasică din cauza obstacolelor sterice; porţiunea Fc nu poate fi introdusă într-o membrană celulară, ceea ce face ca porţiunea gp130 să nu fie disponibilă pentru legarea la complexul IL-6/sIL-6R legat de membrană. Astfel, este de aşteptat ca polipeptida să aibă o eficacitate similară cu blocarea globală a IL-6 (de exemplu, tocilizumab, sirukumab), dar cu mai puţine efecte secundare.

Dimerii polipeptidici descrişi aici cuprind de preferinţă monomeri gp130-Fc având secvenţa corespunzând cu SECV ID NR:1. În anumite variante de realizare, monomerii au secvenţa corespunzând cu SECV ID NR:2. Dimerii polipeptidici descrişi aici cuprind polipeptide având cel puţin în 90% identitate de secvenţă cu SECV ID NR: 1 sau SECV ID NR:2 . Polipeptida cuprinde domeniul gp130 D6 (în particular aminoacizii TFTTPKFAQGE: poziţiile de aminoacizi 585-595 din SECV ID NR: 1), AEGA în regiunea balama a domeniului Fc (poziţiile de aminoacizi 609-612 din SECV ID NR:1) şi nu cuprinde un element de legătură între porţiunea gp130 şi domeniul Fc. Dezvăluirea furnizează un dimer polipeptidic cuprinzând doi monomeri având o secvenţă de aminoacizi în cel puţin 90% identificată cu secvenţa de la SECV ID NR: 1, în care secvenţa de aminoacizi cuprinde domeniul gp130 D6, AEGA în regiunea balama a domeniului Fc şi nu există element de legătură prezent între porţiunea gp130 şi domeniul Fc. Într-o variantă preferată de realizare, dezvăluirea furnizează un dimer polipeptidic cuprinzând doi monomeri având o secvenţă de aminoacizi de cel puţin 90% secvenţa identificată la SECV ID NR: 2, în care secvenţa de aminoacizi cuprinde domeniul gp130 D6, AEGA în regiunea balama a domeniului Fc şi nu există nici un element de legătură prezent între porţiunea gp130 şi domeniul Fc, de preferinţă în care monomerii sunt legaţi prin una sau mai multe punţi disulfură, în care dimerul polipeptidic cuprinde nu mai mult de 6% galactoză-alfa-1,3-galactoză per mol de polipeptidă, de preferinţă nu mai mult de 3 %mol, mai preferabil nu mai mult de 1 %mol, chiar mai preferabil nu mai mult de 0,5 %mol de galactoză-alfa-1,3 -galactoză.

Este de dorit ca polipeptidele să fie substanţial lipsite de fragmente de galactoză-alfa-1,3-galactoză, deoarece acestea sunt asociate cu un răspuns imunogen. S-a descoperit în mod surprinzător că dimerii conform invenţiei au niveluri scăzute de astfel de fragmente. Polipeptida (de exemplu, un monomer polipeptidic şi/sau dimer descris aici) nu conţine mai mult de 6 % galactoză-alfa-1,3-galactoză per mol de polipeptidă. De preferinţă, polipeptida conţine nu mai mult de 4 % molar, 3 % molar, 2 % molar, 1 % molar, 0,5 % molar, 0,2 % molar, 0,1 % molar sau chiar un nivel nedetectabil de galactoză-alfa-1,3-galactoză (de exemplu, măsurat prin WAX-HPLC, NP-HPLC sau WAX, de preferinţă aşa cum este determinat prin WAX-HPLC). În alte variante de realizare, polipeptidele conţin mai puţin de 6%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0,5%, 0,2% sau chiar 0,1% galactoză-alfa-1,3-galactoză, raportat la cantitatea totală de glicani, fie în masă, fie pe bază molară.

În unele variante de realizare, este de asemenea de dorit ca o polipeptidă conform invenţiei să fie sialilată, de exemplu, pentru a creşte timpul de înjumătăţire al polipeptidelor conform invenţiei. Fiecare lanţ al polipeptidei conţine 10 situsuri presupuse de N-glicozilare; nouă situsuri de N-glicozilare sunt localizate în porţiunea gp130 şi un situs de N-glicozilare este localizat în porţiunea Fc. Prin urmare, polipeptida conţine un total de 20 de situsuri de glicozilare. În anumite variante de realizare, o medie de cel puţin 52% sau cel puţin 54% din glicani de pe polipeptidă include un rest de acid sialic, cum ar fi o medie de la 52-65% (de exemplu, măsurată prin WAX-HPLC, NP-HPLC sau WAX, de preferinţă aşa cum este determinat prin WAX-HPLC). De preferinţă, polipeptida conform invenţiei are o greutate moleculară aproximativă de 220 kDa; fiecare 93 kDA având o greutate moleculară suplimentară de ~20 kDa derivată din 10 lanţuri de N-glicozilare.

În unele variante de realizare, dezvăluirea furnizează compoziţii cuprinzând o multitudine de polipeptide descrise aici (de exemplu, o multitudine de monomeri polipeptidici şi/sau dimeri polipeptidici descrişi aici). În unele variante de realizare, o compoziţie cuprinde o medie de cel puţin 25% (de exemplu, cel puţin 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, sau 40%) polipeptide mono-sialilate; o medie de cel puţin 10% (de exemplu, cel puţin 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, sau 25%) polipeptide di-sialilate; o medie de cel puţin 1% (de exemplu, cel puţin 1%, 1,5%, 2%, 2,5%, 3%, 3,5%, 4%, 4,5%, 5%, 5,5%, sau 6%) polipeptide tri-sialilate; şi/sau o medie de cel puţin 0,1% (de exemplu, cel puţin 0,2%, 0,3%, 0,4%, 0,5%, 0,6%, 0,7%, 0,8%, 0,9%, sau 1%) glicani tetra-sialilaţi; raportat la grupările de glicani din compoziţie.

În plus, este de dorit să se minimizeze măsura în care polipeptidele se agregă, lucru care este denumit aici oligomerizare, care are ca rezultat agregate oligomerice. "Agregate oligomerice" aşa cum sunt utilizate aici, nu se referă la peptida dimerizată activă. În schimb, termenul se referă la un agregat de cel puţin trei monomeri (de exemplu, cu SECV ID NR: 1) sau, mai tipic, la cel puţin un dimer de dimeri activi. S-a descoperit în mod surprinzător că dimerii peptidici conform invenţiei prezintă niveluri scăzute de agregare. În anumite variante de realizare, mai puţin de 5%, mai puţin de 4%, mai puţin de 3%, mai puţin de 2%, mai puţin de 1,5%, sau chiar mai puţin de 1,0% din polipeptidă este prezent ca oligomer. Conţinutul de oligomeri poate fi măsurat, de exemplu, prin cromatografie cu excludere dimensională-difuzare a luminii cu mai multe unghiuri (SEC-MALS) sau SEC-UV.

De preferinţă, polipeptida este prezentă în forma sa de lungime completă (de exemplu, include doi monomeri de lungime completă, de exemplu, din SECV ID NR: 1). Totuşi, cultura celulară poate produce o variantă trunchiată la care se face referire aici ca formă unică gp130 (SGF). SGF este o moleculă cu două lanţuri legate covalent, un lanţ cuprinzând un monomer gp130-Fc cu lungime completă (de exemplu, din SECV ID NR:1) şi un al doilea lanţ cuprinzând un monomer gp130-Fc trunchiat (de exemplu, o trunchiere din SECV ID NR: 1), care al doilea lanţ include domeniul Fc şi îi lipseşte majoritatea sau tot domeniul gp130 (de exemplu, terminat înaintea secvenţei de legătură la regiunea Fc). Studiile până în prezent demonstrează că SGF nu are un amino-terminal heterogen. SGF poate fi format la niveluri consistente într-un bioreactor şi, odată format, nivelurile de SGF nu sunt uşor modificate în timpul purificării, procesării sau condiţiilor de depozitare accelerată. Nivelurile de SGF sunt dificil de îndepărtat în timpul purificării datorită proprietăţilor fizico-chimice similare cu forma de lungime completă a dimerului polipeptidic; astfel, eforturile de a elimina SGF pot duce la o reducere semnificativă a randamentului. S-a descoperit în mod surprinzător că dimerii conform invenţiei sunt aproape întotdeauna de lungime completă. În anumite variante de realizare, compoziţia invenţiei cuprinde nu mai mult de 4,0% în greutate, 3,0% în greutate, 2,0% în greutate sau chiar 1,5% în greutate polipeptide care sunt o variaţie trunchiată a polipeptidei din SECV ID NR: 1 în raport cu polipeptidele din SECV ID NR: 1. În anumite variante de realizare, compoziţia invenţiei cuprinde nu mai mult de 4,0% în greutate, 3,0% în greutate, 2,0% în greutate sau chiar 1,5% în greutate polipeptide care sunt o variaţie trunchiată a polipeptidei din SECV ID NR: 2 în raport cu polipeptidele din SECV ID NR: 2.

Polipeptida conform invenţiei este în mod tipic administrată parenteral, cum ar fi intravenos sau subcutanat.

Formulările adecvate le includ pe cele care cuprind un surfactant, în particular un surfactant neionic, cum ar fi un surfactant polisorbat (de exemplu, polisorbat 20). Formulările pot include, de asemenea, agenţi de tamponare şi zaharuri. Un agent de tamponare exemplificativ este histidina. Un zahar exemplificativ este zaharoza. Astfel, o formulare adecvată ar putea include polisorbat 20 (de exemplu, 0,01-1 mg/mL, 0,02-0,5 mg/mL, 0,05-0,2 mg/mL), histidină (de exemplu, 0,5 mM-250 mM, 1-100 mM, 5-50 mM, 10-20 mM) şi zaharoză (de exemplu, 10-1000 mM, 20-500 mM, 100-300 mM, 150-250 mM).

Indicaţii

În inflamaţia acută, s-a demonstrat că IL-6 induce răspunsul de fază acută în ficat conducând la eliberarea cascadei de proteine de fază acută, în particular CRP. Prin formarea unui complex cu sIL-6R vărsat de neutrofilele apoptotice la locul inflamaţiei şi legarea complexului de trans-semnalizare IL-6/sIL-6R rezultat la traductorul de semnal gp130 pe celulele endoteliale, IL-6 induce expresia chemokinelor, cum ar fi proteină chemotactică monocitară (MCP)-1 şi atrage celulele mononucleare. Aceasta duce la rezolvarea inflamaţiei acute şi la iniţierea unui răspuns imun adaptativ. Astfel, în inflamaţia acută, IL-6 cu complexul sIL-6R susţine tranziţia între stadiul neutrofil predominant precoce al inflamaţiei şi influxul mai susţinut de celule mononucleare, conducând în cele din urmă şi la rezolvarea inflamaţiei.

Inflamaţia cronică, cum ar fi boala Crohn (CD), colita ulceroasă (CU), artrita reumatoidă (RA) sau psoriazisul, este asociată histologic cu prezenţa celulelor mononucleare, cum ar fi macrofagele şi limfocitele, care persistă în ţesut după ce au fost dobândite pentru rezolvarea fazei inflamatorii acute. În modelele de boli inflamatorii cronice, IL-6 pare să aibă un rol dăunător favorizând acumularea de celule mononucleare la locul leziunii, prin inducerea secreţiei continue de MCP-1, a angio-proliferării şi a funcţiilor anti-apoptotice asupra celulelor T.

Boala inflamatorie intestinală (IBD), şi anume CD sau UC, este o inflamaţie cronică care apare în intestinul persoanelor susceptibile, despre care se crede că este independentă de un anumit agent patogen. Modificările barierei mucoase epiteliale cu permeabilitate intestinală crescută duc la o expunere sporită a sistemului imunitar al mucoasei la antigenele luminale, ceea ce determină o activare necorespunzătoare a sistemului imunitar intestinal la pacienţi. Activarea necontrolată a limfocitelor T CD4+ ale mucoasei cu eliberarea excesivă consecutivă de citokine proinflamatorii induce inflamaţie gastrointestinală patogenă şi leziuni tisulare. Există un consens că principalele celule imunitare activate implicate în patogeneza IBD sunt celulele T intestinale şi macrofagele.

IL-6 se dovedeşte a fi o citokină centrală în IBD la om. S-a constatat că pacienţii cu CD şi CU produc niveluri crescute de IL-6 în comparaţie cu martorii, nivelurile IL-6 fiind corelate cu activitatea clinică. De asemenea, s-a descoperit că pacienţii cu CD au niveluri crescute de sIL-6R şi, în consecinţă, complex IL-6/sIL-6R în ser. Celulele mononucleare de lamina propria obţinute din probele de colon chirurgicale de la pacienţii cu CD şi UC au arătat că atât celulele T CD4+, cât şi macrofagele au produs cantităţi crescute de IL-6 în comparaţie cu martorii. S-a descoperit că sIL-6R este eliberat prin eliminarea de la suprafaţa macrofagelor şi a celulelor mononucleare cu producţie crescută asociată cu niveluri ridicate de IL-6. La pacienţii cu CD, celulele T ale mucoasei au prezentat dovezi puternice pentru IL-6 trans-semnalizare cu activarea STAT3, bcl-2 şi bcl-xl. Blocarea IL-6 trans-semnalizării a cauzat apoptoza celulelor T, indicând faptul că sistemul IL-6/sIL-6R mediază rezistenţa celulelor T la apoptoză în CD.

Astfel, la pacienţii cu IBD, acumularea dobândită de celule T CD4+ care promovează boala, în lamina propria, conducând la perpetuarea inflamaţiei este dependentă în mod critic de trans-semnalizare anti-apoptotică de IL-6/sIL-6R. Se crede că prin acţiunea asupra complexului IL-6/sIL-6R, polipeptida dezvăluită aici este utilă în tratarea bolilor CD şi a altor boli inflamatorii.

Astfel, polipeptida conform invenţiei poate trata afecţiunile mediate de IL-6. Condiţiile mediate de IL-6 includ boala inflamatorie sau un cancer. În această privinţă, polipeptidele şi compoziţiile descrise aici pot fi administrate unui subiect care are o boală inflamatorie, cum ar fi artrita idiopatică juvenilă, boala Crohn, colita (de exemplu, colita care nu este asociată cu IBD, incluzând colita prin radiaţii, colita diverticulară, colita ischemică, colita infecţioasă, boala celiacă, colita autoimună sau colita rezultată din alergii care afecteaza colonul), dermatita, psoriazis, uveita, diverticulita, hepatita, sindromul colonului iritabil (IBS), lupus eritematos, nefrita, boala Parkinson, colita ulcerativă (colita multiplă, SM), boala Alzheimer, artrita, artrita reumatoidă, astmul şi diverse boli cardiovasculare, cum ar fi ateroscleroza şi vasculita. În anumite variante de realizare, boala inflamatorie este selectată din grupul constând din diabet, gută, sindrom periodic asociat criopirinei şi tulburare pulmonară obstructivă cronică.

De preferinţă, boala inflamatorie sau afecţiunea mediată de IL-6 este boală inflamatorie intestinală, de preferinţă în care tratamentul induce remisia bolii inflamatorii intestinale. De preferinţă, boala inflamatorie intestinală este boala Crohn sau colita ulceroasă, de preferinţă în care tratamentul menţine remisia bolii inflamatorii intestinale. De preferinţă, boala inflamatorie sau afecţiunea mediată de IL-6 este artrita reumatoidă, psoriazisul, uveita sau ateroscleroza. De preferinţă, boala inflamatorie sau afecţiunea mediată de IL-6 este colita care nu este asociată cu boala inflamatorie intestinală, de preferinţă în care colita este colita prin radiaţii, colita diverticulară, colita ischemică, colita infecţioasă, boala celiacă, colita autoimună, sau colita rezultată din alergii afectând colonul. De preferinţă, boala inflamatorie sau afecţiunea mediată de IL-6 este selectată dintre boala Crohn, colita ulceroasă, artrita reumatoidă şi psoriazis, mai preferabil din boala Crohn şi colita ulceroasă.

Pentru boala inflamatorie, cum ar fi boala inflamatorie intestinală, tratamentul poate include remisiunea afecţiunii, menţinerea remisiunii afecţiunii, sau ambele.

Alte variante de realizare oferă o metodă de tratare, reducere a severităţii sau prevenire a unui cancer, incluzând, dar fără a se limita la mielom multiplu, leucemie cu celule plasmatice, carcinom cu celule renale, sarcom Kaposi, cancer colorectal, cancer gastric, melanom, leucemie, limfom, gliom, glioblastom multiform, cancer pulmonar (incluzând, dar fără a se limita la cancer pulmonar cu celule non-mici (NSCLC; atât adenocarcinom, cât şi carcinom cu celule scuamoase)), limfom non-Hodgkin, boala Hodgkin, plasmocitom, sarcom, timom, cancer de sân, cancer de prostată, carcinom hepatocelular, cancer de vezică urinară, cancer uterin, cancer pancreatic, cancer esofagian, cancer cerebral, cancer la cap şi gât, cancer ovarian, cancer de col uterin, cancer testicular, cancer de stomac, cancer esofagian, hepatom, leucemie limfoblastică acută (ALL), T-ALL, leucemie mielogenă acută (AML), leucemie mielogenă cronică (CML) şi leucemie limfocitară cronică (CLL), carcinoame salivare, sau alte tipuri de cancer.

Alte variante de realizare a prezentei dezvăluiri furnizează o metodă de tratare, reducere a severităţii sau prevenire a unei boli selectate din grupul constând din sepsis, resorbţie osoasă (osteoporoză), caşexie, oboseală legată de cancer, psoriazis, artrită idiopatică juvenilă cu debut sistemic, lupus eritematos sistemic (SLE), glomerulonefrită proliferativă mezangială, hiper gammaglobulinemie, boala Castleman, gammapatie IgM, mixom cardiac şi diabet insulino-dependent autoimun.

Aşa cum sunt utilizaţi aici, termenii "tratament", "tratare" şi "tratând" se referă la inversarea, atenuarea, întârzierea debutului sau inhibarea progresului unei boli sau tulburări, sau la unul sau mai multe simptome ale acesteia, aşa cum este descris aici. În unele variante de realizare, tratamentul poate fi administrat după ce unul sau mai multe simptome s-au dezvoltat. În alte variante de realizare, tratamentul poate fi administrat în absenţa simptomelor. De exemplu, tratamentul poate fi administrat unei persoane susceptibile înainte de apariţia simptomelor (de exemplu, în lumina unui istoric de simptome şi/sau în lumina factorilor genetici sau alţi factori de susceptibilitate). Tratamentul poate fi continuat şi după ce simptomele au dispărut, de exemplu pentru a preveni sau a întârzia reapariţia acestora.

Polipeptida conform invenţiei poate fi administrată împreună cu un al doilea agent activ. Al doilea agent activ poate fi unul sau mai multe dintre acidul 5-aminosalicilic, azatioprină, 5-mercaptopurină şi un corticosteroid. Regimurile de dozare pentru administrarea de acid 5-aminosalicilic, azatioprină, 5-mercaptopurină şi corticosteroizi sunt binecunoscute unei persoane de specialitate în domeniu.

Metode de producţie

Un alt aspect al dezvăluirii furnizează un vector, care cuprinde o moleculă de acid nucleic codificând SECV ID NR: 1 sau SECV ID NR: 2 precum şi celule cuprinzând vectorul menţionat. ADN-ul codificând secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 1 sau SECV ID NR: 2 poate fi clonat în vector astfel încât peptida semnal este legată în cadru la capătul amino-terminal al secvenţei de aminoacizi a lanţului de anticorp. Peptida semnal poate fi o peptidă semnal imunoglobulină sau o peptidă semnal heterologă (adică, o peptidă semnal dintr-o proteină non-imunoglobulină).

Designul vectorului de expresie, inclusiv selecţia secvenţelor de reglare, poate depinde de factori precum alegerea celulei gazdă care trebuie transformată, nivelul dorit de exprimare a proteinei şi aşa mai departe. Secvenţele de reglare pentru expresia celulelor gazdă de mamifere includ elemente virale care direcţionează niveluri ridicate de exprimare a proteinei în celulele de mamifere, cum ar fi promotori şi/sau amplificatori derivaţi din LTR retrovirale, citomegalovirus (CMV) (cum ar fi promotorul/amplificatorul CMV), virusul simian 40 (SV40) (cum ar fi promotorul/amplificatorul SV40), adenovirusul (de exemplu, promotorul major tardiv al adenovirusului (AdMLP)), poliomul şi promotorii puternici de mamifere, cum ar fi promotorii nativi de imunoglobulină şi actină. Celula gazdă poate fi o celulă de mamifer, insectă, plantă, bacteriană, sau drojdie, de preferinţă celula este o celulă de mamifer, cum ar fi o celulă de ovar de hamster chinezesc (CHO). Exemple de celule CHO sunt celulele (CHO)/dhfr obţinute din Colecţia Europeană de Culturi de Celule (ECACC, Nr. 9406067).

De preferinţă, celula gazdă este o celulă CHO şi acidul nucleic codificând polipeptida este codon optimizat pentru utilizare în celulele CHO. De preferinţă, acidul nucleic codificând polipeptida este secvenţa descrisă în FIG. 3 sau FIG. 7.

Dezvăluirea furnizează în plus metode pentru producerea polipeptidelor conform invenţiei. Într-o variantă de realizare, este furnizată o metodă pentru producerea unui dimer cuprinzând doi monomeri ai SECV ID NR: 1 legaţi printr-o punte disulfură, metoda menţionată cuprinzând exprimarea SECV ID NR: 1 în celule şi purificarea polipeptidei menţionate. De preferinţă, sunt furnizate metode pentru producerea unui dimer cuprinzând doi monomeri ai SECV ID NR: 2 legaţi printr-o punte disulfură, metoda menţionată cuprinzând exprimarea SECV ID NR: 2 în celule şi purificarea polipeptidei menţionate. Metodele pentru introducerea vectorilor de acid nucleic sunt cunoscute unei persoane de specialitate în domeniu şi includ, de exemplu, electroporarea, transfecţia şi altele asemenea. Celulele transfectate sunt cultivate pentru a permite celulelor să exprime proteina dorită. Celulele şi mediile de cultură sunt apoi colectate şi dimerii polipeptidici sunt purificaţi, de exemplu, prin etape pe coloană de cromatografie (de exemplu, MAbSelect Sure, SP Sepharose, Capto Q). Dimerul poate fi, de asemenea, concentrat şi/sau tratat cu etape de reducere/inactivare virală.

Un alt aspect al invenţiei acoperă dimerii polipeptidici produşi prin metodele dezvăluite aici. De preferinţă, dimerii au caracteristicile descrise aici (de exemplu, % de galactoză-alfa-1,3-galactoză per mol de polipeptidă, sialilare). Dimerii produşi prin aceste metode pot fi utilizaţi pentru a prepara compoziţii adecvate. Compoziţiile menţionate au de preferinţă caracteristicile descrise aici (de exemplu, agregare scăzută, trunchieri).

EXEMPLIFICARE

Exemplul 1

Prepararea şi caracterizarea peptidei 1 (polipeptida din SECV ID NR: 1 în forma sa activă dimerizată)

Clonarea şi exprimarea peptidei 1 în celule CHO / dhfr

Celulele CHO /dhfr au fost obţinute din colecţia europeană de culturi celulare (ECACC, nr. 9406067). Celulele CHO /dhfr aderente au deficit de dihidrofolat reductază (DHFR), o enzimă care catalizează reducerea folatului la dihidrofolat şi apoi la tetrahidrofolat. Celulele CHO / dhfr manifestă astfel sensibilitate la medicamentul antifolat, metotrexat (MTX).

Linia celulară CHO/dhfr este bine caracterizată şi testată. Securitatea liniei celulare parentale CHO /dhfr ca substrat celular pentru producţia de produse biofarmaceutice pentru uz uman a fost confirmată de ECACC (Porton Down, Marea Britanie) pentru sterilitate microbiană, micoplasmă şi viruşi advenţiali conform 21 CFR.

Selecţia şi construcţia secvenţei ADNc

Secvenţa ADNc a peptidei 1 (secvenţa polipeptidică din SECV ID NR: 1) a fost sintetizată ca un singur fragment de ADN de către GeneArt AG (Regensburg, Germania) folosind secvenţa pentru domeniul extracelular al gp130 (IL6ST, NCBI Gene ID 3572, transcriere varianta 1 (NP_002175), aminoacizii 23-617) şi domeniul Fc al IgG1 umană (IGHG1, NCBI Gene ID 3500, aminoacizii 221-447 conform numerotării Kabat EU). Secvenţa a fost optimizată pentru utilizare optimă a codonilor în celule CHO. Trei mutaţii punctuale bine caracterizate au fost introduse în regiunea balama inferioară a părţii Fc.

Secvenţa ADNc a fost modificată în continuare prin înlocuirea peptidei semnal gp130 originală cu o peptidă semnal a lanţului greu IgG de şoarece cu eficacitate cunoscută în sistemele de expresie a celulelor CHO. Peptida semnal este scindată în timpul sintezei proteinelor. Prezenţa secvenţei IgG1 Cys-Pro-Pro-Cys în regiunea Fc are ca rezultat dimerizarea a două subunităţi gp130-Fc identice prin intermediul resturilor sulfhidril din regiunea Fc, care formează împreună Peptida 1.

FIG. 3 prezintă secvenţa de nucleotide şi aminoacizi a subunităţii gp130-Fc utilizată pentru formarea Peptidei 1.

Construcţia plasmidei de expresie pentru selecţia băncii de celule master (MCB)

ADNc-ul peptidei 1 a fost clonat într-un vector de expresie pANTVhG1 (Antitop) conţinând gena dhfr pentru selecţia de transfectant cu MTX (FIG. 4) după cum urmează: În primul rând, vectorul de expresie a fost digerat cu enzime de restricţie Mlul şi Eagl pentru a permite inserarea ADNc-ului peptidei 1. În al doilea rând, regiunea de codificare a peptidei 1 a fost amplificată prin PCR utilizând primerii OL1425 şi OL1426 (Tabelul 1) şi digerată cu enzimele de restricţie MluI şi EagI. În al treilea rând, fragmentele digerate au fost purificate pe gel şi legate împreună pentru a genera vectorul de expresie pFER02 (FIG. 5). ADNc-ul peptidei 1 a fost inserat sub controlul promotorului citomegalovirusului (CMV).

Table 2 prezintă funcţia elementelor de expresie pFER02. FIG. 6 prezintă secvenţele de nucleotide ale elementelor de expresie pFER02.

Tabelul 1 Secvenţe de oligonucleotide utilizate pentru a amplifica regiunea de codificare a peptidei 1 pentru clonarea în pANTVhG1

Primer Secvenţa (5'-3')* OL1425 ctgttgctacgcgtgtccactccGAGCTGCTGGATCCTTGCGGC OL1426 gcgggggcttgccggccgtggcactcaCTTGCCAGGAGACAGAGACAG *Secvenţele specifice peptidei 1 sunt afişate cu majuscule, secvenţele specifice vectorului sunt afişate cu litere mici şi siturile de restricţie sunt subliniate

Tabelul 2 Elemente de expresie pFER02

Caracteristică Funcţie promotor CMV promotor/amplificator imediat-precoce. permite exprimarea eficientă, la nivel înalt, a proteinei recombinante hIgG1 poliA secvenţa de poliadenilare a IgG umană gena de rezistenţă la ampicilină (β-lactamaza) selecţia de vector în E. coli promotor precoce SV40 şi origine permite exprimarea eficientă, la nivel înalt, a genei de rezistenţă la neomicină şi replicarea epizomală în celulele care exprimă antigenul T mare SV40 DHFR selecţia de transfectanţi stabili în celulele dhfr CHO semnal de poliadenilare SV40 terminare eficientă a transcripţiei şi poliadenilare a ARNm

Procesul de selecţie a liniei celulare care conduce la clona finală care produce peptida 1

Vectorul pFER02 a fost linearizat cu enzima de restricţie SspI cu capăt bont, care are un singur situs de recunoaştere situat în gena beta-lactamazei. Plasmida linearizată a fost transfectată în 5 × 106 celule CHO/dhfr- folosind transfecţia mediată de lipide. La douăzeci şi patru de ore după transfecţie, celulele transfectate au fost selectate în mediu suplimentat cu ser fetal de viţel dializat 5% (FCS) şi 100 nM metotrexat (MTX). Celulele transfectate au fost diluate în acest mediu la diferite densităţi şi distribuite în plăci de cultură de ţesut cu 96 de godeuri, cu fund plat. Celulele au fost apoi incubate într-o atmosferă umidificată la 5% CO2 şi 37°C. Mediul de selecţie MTX proaspăt a fost adăugat la intervale regulate în timpul perioadei de incubare pentru a se asigura că nivelurile de MTX şi nivelurile de nutrienţi rămân constante.

Selectarea iniţială a liniei celulare cu selectarea MTX

Timp de câteva săptămâni după transfecţie, plăcile de cultură de ţesut au fost examinate folosind un aparat Genetix CloneSelect®, şi s-a observat că > 2000 de godeuri au colonii în creştere activă. Supernatanţii din aceste godeuri au fost prelevaţi şi testaţi pentru titrul peptidei 1 prin ELISA. Pe baza rezultatelor acestui test, un total de 105 dintre cele mai bune godeuri de exprimare au fost extinse în plăci cu 48 de godeuri. Un total de 83 de linii celulare au fost selectate pentru expansiune în plăci cu 6 godeuri sau baloane T-25; supernatantul din fiecare dintre liniile celulare a fost eşantionat şi testat pentru titrul peptidei 1 (ELISA). Pe baza acestor rezultate, 54 dintre cele mai bune linii celulare de exprimare cu caracteristici optime de creştere au fost selectate pentru expansiune în baloane T-75 sau T-175; supernatanţii din baloanele confluente au fost prelevaţi şi titrurile de peptidă 1 au fost cuantificate (ELISA). Compararea nivelurilor de expresie între liniile celulare a permis identificarea celor mai bune 38 de linii celulare care au fost selectate pentru analiza productivităţii. Productivitatea a fost evaluată după cum urmează:

unde:

Th este titrul de recoltare [µg/mL]

Ti este titrul iniţial [µg/mL]

Vh este numărul de celule viabile la recoltare [× 106 celule/mL]

Vi este numărul iniţial de celule viabile [× 106 celule/mL]

Timpul este timpul scurs (zile) între Ti şi Th

Pe baza rezultatelor de productivitate (pg/celulă/zi), au fost selectate 13 linii celulare pentru amplificarea genei. Amplificarea genei prin MTX pentru selectarea liniei celulare a peptidei 1

Cele 13 linii celulare selectate au fost alese pentru prima rundă de amplificare a genei prin presiune selectivă sub concentraţii crescânde de MTX (0,1-50 M). După 7-10 zile, supernatantul din fiecare godeu din fiecare dintre cele 13 linii celulare a fost prelevat şi testat pentru titrul peptidei 1 (ELISA). Godeurile din fiecare linie celulară cu niveluri ridicate de expresie a peptidei 1 au fost evaluate pentru productivitate (pg/celulă/zi). O a doua rundă de amplificare a genei a fost iniţiată cu un total de 16 godeuri din linii celulare care au arătat creşteri semnificative ale productivităţii.

A doua rundă de amplificare a genei a fost efectuată în prezenţa concentraţiilor crescute de MTX; supernatanţii din fiecare cultură au fost testaţi pentru titrul Peptidei 1 (ELISA). Godeurile selectate din fiecare linie celulară au fost extinse şi productivitatea a fost evaluată (pg/celulă/zi); au fost identificate cinci linii celulare cu productivitate crescută ca răspuns la presiunea de selecţie MTX crescută. Aceste cinci linii celulare au fost avansate la o a treia rundă de amplificare a genei utilizând presiunea de selecţie sub concentraţie crescută de MTX; supernatanţii din fiecare godeu au fost testaţi pentru titrul de peptidă 1 (ELISA). Godeurile selectate pentru fiecare linie celulară au fost extinse şi productivitatea (pg/celulă/zi) a fost evaluată; au fost selectate cinci linii celulare care demonstrează o expresie ridicată a peptidei 1.

Limitarea diluţiei clonelor

Clonarea cu diluţie limitativă a fost efectuată pe cele cinci linii celulare care demonstrează expresia peptidei 1. După o săptămână de incubare, plăcile au fost examinate utilizând un aparat Genetix CloneSelect® şi au fost identificate colonii individuale. Ratele de creştere a două linii celulare în timpul clonării cu diluţie au fost observate ca fiind deosebit de lente şi astfel aceste linii celulare au fost întrerupte. În total, din cele trei linii celulare rămase, 58 de colonii clonale au fost selectate pentru expansiune, mai întâi în plăci cu 48 de godeuri şi apoi extinse succesiv prin plăci cu 12 godeuri, baloane T-25 şi baloane T-75 în absenţa MTX. Fiecare dintre cele 58 de clone selectate a fost apoi evaluată pentru productivitate (pg/celulă/zi); au fost selectate 16 clone pentru adaptarea suspensiei şi adaptarea la creştere într-un mediu definit chimic.

Adaptarea liniilor celulare la cultura în suspensie în mediu definit chimic

Cele 16 linii celulare au fost adaptate la cultura în suspensie într-un mediu definit chimic, după cum urmează: liniile celulare selectate în cultura aderentă au fost adaptate mai întâi la suspensie atât în mediu de creştere în suspensie CHO (glucoză ridicată DMEM, inclusiv L-glutamina şi piruvat de sodiu, FCS dializat 5%, 20 mg/L L-prolină, 1 × penicilină/streptomicină, F68 pluronic 1%) şi apoi în mediu de creştere în suspensie definit chimic (CD Opti-CHO® de la Life Technologies Ltd. (Paisley, Marea Britanie), FCS dializat 2,5%, 0,1 × penicilină/streptomicină, 8 mM Glutamax®).

Odată adaptate la cultura în suspensie, liniile celulare au fost înţărcate, în etape, într-un mediu de creştere în suspensie definit chimic fără ser (CD Opti-CHO®, 0,1 × penicilină/streptomicină, 8 mM Glutamax®). MTX a fost omis din toate culturile în suspensie. Liniile adaptate au fost extinse şi au fost pregătite bănci de celule de sămânţă. Pe scurt, celulele au fost extinse la 300 ml volum total şi recoltate atunci când densitatea celulară a depăşit 0,85 × 106 celule/mL şi viabilitatea a fost >90%. Încă 3 × 107 celule au fost însămânţate într-un balon proaspăt care conţine 70 mL mediu de creştere în suspensie pentru analiza de creştere şi productivitate. Celulele rămase au fost recoltate prin centrifugare şi resuspendate într-un volum adecvat de mediu de congelare pentru a produce o suspensie de celule la 1 × 107 celule/mL. Flacoanele au fost congelate până la -80°C. Banca de celule a fost apoi transferată în azot lichid pentru depozitare pe termen lung.

Cele 16 linii celulare au fost rafinate în continuare până la 5 clone după adaptarea fără ser. Cele 5 clone au fost evaluate pentru creştere (densitatea celulară şi timpul de dublare celulară) şi productivitate (pg/celulă/zi), după care au fost selectate 3 clone. O clonă a fost selectată pentru a face o bancă de celule master.

A fost efectuată pregătirea băncii de celule master (MCB) şi a băncii de celule de lucru (WCB). Un flacon din stocul de pre-însămânţare a fost utilizat pentru prepararea unei MCB de 200 de flacoane şi un flacon de MCB a fost folosit pentru a prepara o WCB de 200 de flacoane. În fiecare caz, un flacon a fost dezgheţat şi mediul de crioconservare a fost îndepărtat prin centrifugare. Celulele au fost resuspendate şi propagate în volum în mediu de creştere (CD OptiCHO® / 4 mM L-glutamină). Patru pasaje au fost efectuate în timpul creării MCB şi şase pasaje au fost efectuate în timpul creării WCB.

Când s-au obţinut suficiente celule, celulele au fost alicotate în mediu de crioconservare (92,5% CD OptiCHO® / 7,5% DMSO) în flacoane de polipropilenă (fiecare conţinând aproximativ 1,5 × 107 celule viabile) şi crioconservate prin reducerea temperaturii la -100° C pe o perioadă de cel puţin 60 de minute într-un proces de congelare treptată. Flacoanele sunt depozitate într-un recipient de umplere automată cu azot lichid în fază de vapori într-o zonă controlată GMP.

Descrierea procesului de fabricaţie a substanţei medicamentoase (DS)

O scurtă descriere a procesului de fabricaţie a Peptide 1 DS este următoarea. Celulele dintr-o fiolă WCB sunt reînviate şi extinse progresiv folosind mediu fără proteine înainte de inoculare într-un bioreactor de producţie. După finalizarea culturii celulare, celulele şi resturile celulare sunt îndepărtate prin filtrarea culturii.

Purificarea constă din trei etape pe coloană de cromatografie (MAbSelect Sure, SP Sepharose, Capto Q), o etapă de concentrare şi diafiltrare şi include două etape specifice de reducere/ inactivare virală; tratament Triton X-100 (inactivarea virusurilor încapsulate) şi o etapă de nanofiltrare (îndepărtarea virusurilor încapsulate şi neîncapsulate).

După concentrare şi diafiltrare, se adaugă excipienţi pentru formularea de DS. Peptida 1 formulată este filtrată la 0,22 µm în recipiente.

Coloana Sartobind Phenyl, utilizată în lotul de 10000 L în locul coloanei Capto Q, este eficientă în reducerea prezenţei oligomerilor. Această coloană a fost capabilă să reducă nivelul formelor oligomerice de la o medie de 2,7% la 1%.

Metode analitice

Analiza structurii glicanilor a fost efectuată la Procognia Limited (Ashdod, Israel). N-glicanii au fost eliberaţi din probă folosind PNGaza F şi apoi marcaţi cu 2-aminobenzamidă. Glicanii eliberaţi au fost trataţi cu sau fără o serie de exoglicozidaze, pentru a genera diferite forme de glican. Glicanii au fost separaţi prin analiză HPLC bi-dimensională (NP-HPLC şi WAX) şi identificaţi prin comparaţie cu o bază de date a timpului de retenţie care a fost construită folosind standarde pregătite intern, separate şi analizate prin aceeaşi analiză HPLC bi-dimensională.

Conţinut de acid sialic

Cromatografia lichidă la presiune ultraînaltă (UPLC) a fost utilizată pentru a determina conţinutul de acid sialic şi pentru a confirma identitatea peptidei. Metoda a fost condusă utilizând o coloană Acquity UPLC BEH C18 1,7 µm 2,1x50 şi următoarea fază mobilă: 9:7:84/acetonitril: metanol: apă, cu un debit de 0,3 mL/min. Acizii sialici au fost eliberaţi din proba de testat prin scindare enzimatică cu sialidază şi apoi au fost derivatizaţi cu o etichetă fluorescentă (diclorhidrat de 1,2 diamino 4,5 metilendioxibenzen (DMB)). Proba de testat marcată a fost separată prin UPLC cu eluare izocratică şi detectare a fluorescenţei cu o lungime de undă de excitare de 373 nm şi o lungime de undă de emisie de 448 nm. Conţinutul de acid sialic din probele de testat a fost cuantificat în raport cu standardele de acid N-glicolilneuraminic (NGNA) şi acid N-acetilneuraminic (NANA), rulate ca o curbă standard. Conţinutul de acid sialic NGNA şi NANA este raportat ca acid sialic pmol / proteină pmol.

Model de sialilare

Schimb anionic slab (WAX) - HPLC a fost utilizat pentru determinarea procentului % de glicani neutri, mono-, di-, tri- şi tetra-sialilaţi. Metoda presupune eliberarea enzimatică a N-glicanilor din substanţa medicamentoasă cu PNGase, marcare fluorescentă cu 2-aminobenzamidă (2-AB), desalinizare cu cartuşe Ludger D1. Separarea glicanilor sialilaţi a fost efectuată prin WAX-HPLC, utilizând o coloană Glyco Sep C cu un gradient de format acetonitril/0,5M amoniu 20% la 40°C. Detectarea fluorescenţei a fost setată la 330 nm de excitare şi 420 nm de emisie. Testarea unui standard de referinţă a fost efectuată în paralel. Procentul % de glicani neutri, mono-, di-, tri- şi tetra-sialilaţi a fost determinat din cromatograma WAX-HPLC şi raportat.

Puritate, SEC

HPLC cu excludere dimensională (SEC) a fost utilizată pentru a determina puritatea substanţei medicamentoase prin separarea dimerilor activi intacţi de formele SGF şi oligomerice (cuprinse în principal de dimeri din dimerii activi). Molecula de dimer activ intactă constă din cele două subunităţi identice de proteine glicozilate (domeniul extracelular gp130 fuzionat cu partea Fc a lanţului greu din IgG1 umană). Probele au fost separate pe baza greutăţii moleculare folosind o coloană de permeaţie cu gel (TSK G3000SWXL) cu un debit de 1 mL/min şi o fază mobilă de fosfat de sodiu 0,2 M pH 7,0. Eluatul de coloană a fost monitorizat la 280 nm. Specia intactă se identifică prin timpul ei caracteristic de retenţie; procentul % de puritate a dimerului activ este exprimat ca procent din suprafaţa totală a vârfului integrat.

Forme oligomerice

Procentul de forme oligomerice este determinat folosind metoda SEC prezentată mai sus. Procentul formelor oligomerice este exprimat ca procent din suprafaţa totală a vârfului integrat.

Forma gp130 unic (SGF)

Procentul de SGF a fost determinat folosind metoda SEC prezentată mai sus. Procentul de SGF este exprimat ca procent din suprafaţa totală a vârfului integrat.

Rezultatele analizelor sunt prezentate în Tabelul 3.

Tabelul 3 Rezultatele testului de caracterizare

Analiză Valoare teoretică Lotul 1 (400 L) Lotul 2 (800 L) Lotul 3 (800 L) Lotul 4 (800 L) Lotul 5 (800 L) Lotul 6 (10.000 L) Analiza monozaharidelor (pmol/pmol peptidă 1) fucoză 7,4 7,9 7,2 6,5 6,3 6,5 glucozamină 41,6 45,2 42,5 38,6 39,2 42,9 manoză 44,6 44,2 43,3 39,8 38,9 39,8 galactoză 21,9 23,1 20,8 19,8 20,8 19,3 model de sialilare prin WAX-HPLC neutru 40,9 43,2 49,7 50,9 40,8 45,2 mono- sialilat 34,2 33,3 32,6 32,9 33,9 33,4 di-sialilat 20,1 19,1 16,0 14,7 20,4 17,7 tri-sialilat 4,3 4,1 1,7 1,4 4,9 3,5 tetra-sialilat 0,4 0,4 ND ND ND 0,3 miez total fucoză 64,1 65,8 61,4 63,3 62,4 65,6 sialilare totală 52,2 49,6 43,0 39,8 54,1 48,0 gal-alfa-1,3-gal nedetectabil nedetectabil nedetectabil nedetectabil nedetectabil nedetectabil forme oxidate prin RP-HPLC (% suprafaţă a peptidei oxidate faţă de peptida neoxidată în proba testată) raportare rezultat Ox 1 netestat ND ND 0,035 0,013 0,009 Ox 2 0,198 0,175 0,172 0,177 0,158 Ox 3 0,127 0,123 0,119 0,119 0,123 Ox 4 ND ND ND ND ND Ox 5 ND ND ND ND ND MW şi prezenţa formelor SGF şi oligomerice prin SEC-MALS dimer % 91,2 ± 0,2 92,3 ± 0,2 93,9 ± 0,1 95,2± 0,1 94,2± 0,0 95,9± 0,0 forme oligomerice % 4,7 ± 0,1 4,3 ± 0,1 2,4 ± 0,1 1,8± 0,1 1,9± 0,0 1,0± 0,0 % SGF 4,1 ± 0,1 3,4 ± 0,1 3,7 ± 0,1 2,97± 0,1 3,9±0,1 3,1±0,0

Descrierea şi compoziţia produsului medicamentos (DP)

DP este o soluţie sterilă care trebuie administrată prin i.v. infuzie. DP constă din peptida 1 la o concentraţie de 15 mg/mL într-o soluţie izotonă conţinând 25 mM L-histidină, 200 mM zaharoză şi 0,1 mg polisorbat 20/mL la pH 7,6. Flacoanele sunt acoperite cu azot pentru protecţie împotriva oxidării. Produsul este destinat pentru o singură utilizare şi depozitare la -20°C până la decongelare pentru administrare clinică.

Compoziţie şi formulă de lot

Formula de lot pentru produsul medicamentos este prezentată în Tabelul 4.

Tabelul 4

Compoziţie de lot DP Componentă Cantitate Standard de calitate Peptida 1 720 g Specificaţie Ferring L-histidină 186,18 g Ph.Eur./USP* sucroză 3286,08 g Ph.Eur./USP* Polisorbat 20 4,8 g Ph.Eur./USP* WFI ad 49536 g Ph.Eur./USP* hidroxid de sodiu quantum satis Ph.Eur./USP* azot quantum satis Ph.Eur./USP* * curr. Ed.

Exemplul 2

Studiu clinic 000067 (doză unică)

Proiectare

Acesta a fost un studiu cu doză unică, controlat cu placebo, orb unic, randomizat în cadrul dozei, cu grup paralel de creştere a dozei. Studiul a fost realizat în două părţi, în care partea 1 a inclus subiecţi sănătoşi şi partea 2 a inclus pacienţi cu CD în remisie clinică. Obiectivul a fost de a examina siguranţa şi tolerabilitatea şi, dacă este posibil, de a obţine semne ale efectelor farmacologice, după doze unice de peptida 1.

În partea 1, au fost incluşi 64 de subiecţi, dintre care 48 (44 bărbaţi, 4 femei) au primit tratament activ şi 16 (toţi bărbaţi) au primit placebo. Au fost investigate şapte doze şi administrate sub formă de i.v. perfuzie timp de 30 de minute (0,75 mg, 7,5 mg, 75 mg) sau 1 oră (150 mg, 300 mg, 600 mg şi 750 mg). În plus, 6 subiecţi au primit o s.c. doză de 60 mg peptida 1 şi 2 subiecţi au primit o s.c. doză de placebo. Peptida 1 a fost administrată la 15 mg/mL în 25 mM histidină, 200 mM zaharoză şi 0,1 mg/mL polisorbat 20.

În partea 2, au fost incluşi 24 de pacienţi, dintre care 18 (11 bărbaţi, 7 femei) au primit tratament activ (75 mg, 300 mg şi 750 mg) şi 6 (4 bărbaţi, 2 femei) au primit placebo, toate administrate i.v.

Rezultate

Evaluarea PK după administrările i.v. de peptida 1 au arătat proporţionalitate cu doza atât pentru AUC, cât şi pentru Cmax în intervalul 0,75 mg până la 750 mg, concentraţiile Cmax în plasmă variind de la 0,2 până la 170 µg/mL (FIG. 3). Clearance-ul a fost de aproximativ 0,13 L/h, timpul mediu de înjumătăţire terminal aproximativ 4,5 zile, iar volumul de distribuţie aproximativ 20 L, acesta din urmă indicând o oarecare distribuţie extravasculară. Administrarea s.c. de 60 mg peptida 1 a arătat o Cmax de 1,1 µg/ml la 2,3 zile şi un timp de înjumătăţire de 5,0 zile. Biodisponibilitatea după administrarea s.c. de peptida 1 a fost calculată a fi de aproximativ 50%.

Administrarea i.v. de 75, 300 şi 750 mg la pacienţii cu CD în remisie a arătat rezultate foarte similare ca la subiecţii sănătoşi (FIG. 4). AUC şi Cmax au fost proporţionale în doză cu concentraţiile Cmax de 16, 76 şi 186 µg/mL (16, 77, şi 161 µg/mL pentru subiecţii sănătoşi). Clearance-ul a fost de aproximativ 0,13 L/h, timpul mediu de înjumătăţire terminal aproximativ 4,6 zile, iar volumul de distribuţie aproximativ 22 L.

Profilul de siguranţă al peptidei 1 a fost favorabil, cu puţine evenimente adverse care au apărut în toate grupurile de tratament, inclusiv în grupul placebo, toate fiind uşoare sau moderate. Nu au fost observate tendinţe aparente legate de doză în ceea ce priveşte incidenţa sau frecvenţa evenimentelor adverse. Perfuziile au fost întrerupte la doi subiecţi, unul din cauza reacţiilor la perfuzie uşoare (Partea 1, grupul 300 mg) şi unul din cauza reacţiilor la perfuzie moderate (Partea 2, grupul 75 mg).

Nu au existat tendinţe aparente legate de doză sau modificări legate de tratament în semnele vitale, ECG, sau parametrii de chimie clinică.

Un subiect sănătos din grupul de 300 mg a prezentat anticorpi anti-peptida 1 care nu au fost neutralizaţi în urma tratamentului la vizita de urmărire la 5-6 săptămâni după administrare.

În general, peptida a fost sigură şi bine tolerată atunci când a fost administrată intravenos până la 750 mg ca doză unică i.v., iar la 60 mg ca doză unică s.c.

Exemplul 3

Studiu clinic 000115 (doză ascendentă multiplă)

Proiectare

Acesta a fost un studiu controlat cu placebo, dublu-orb, în cadrul grupului de doză, randomizat, în grup paralel, cu obiectivul de a investiga siguranţa, tolerabilitatea şi farmacocinetica dozelor multiple crescătoare de peptida 1. Dozele investigate au fost 75, 300 şi 600 mg de peptida 1 administrat o dată pe săptămână, timp de 4 săptămâni, prin perfuzie i.v. timp de 30 de minute (75 mg) sau 1 oră (300 mg şi 600 mg).

Au fost incluşi douăzeci şi patru (24) de subiecţi sănătoşi, dintre care 18 (11 bărbaţi şi 7 femei) au primit tratament activ şi 6 (2 bărbaţi şi 4 femei) au primit placebo.

Rezultate

Evaluarea PK a arătat caracteristici foarte apropiate în prima şi ultima zi de tratament şi similare cu rezultatele din studiul cu doză unică. AUC şi Cmax au fost proporţionale cu doza după prima şi a patra doză, cu concentraţii Cmax de 19, 78 şi 148 µg/mL după prima doză şi 19, 79 şi 142 µg/mL după a patra doză (16, 77 şi 161 pg/mL pentru doză unică la subiecţi sănătoşi; FIG. 5). Valorile minime corespunzătoare au fost 0,66, 2,68, 4,56 µg/mL şi 0,98, 3,95 şi 7,67 µg/mL pentru cele trei niveluri de doză. Timpul mediu de înjumătăţire terminal calculat după ultima doză a fost de aproximativ 5,5 zile.

Profilul de siguranţă al peptidei 1 a fost favorabil, cu puţine evenimente adverse care au apărut în toate grupurile de tratament, inclusiv în grupul placebo, toate fiind uşoare sau moderate. Nu au fost observate tendinţe aparente legate de doză în ceea ce priveşte incidenţa sau frecvenţa evenimentelor adverse. Un subiect (grup de 600 mg) a fost retras din cauza reacţiilor uşoare la perfuzie.

Nu au existat tendinţe aparente legate de doză sau modificări legate de tratament în semnele vitale, ECG, sau parametrii de chimie clinică.

Nu au fost detectaţi anticorpi anti-peptidă 1 la niciunul dintre subiecţi.

În general, peptida 1 a fost sigură şi bine tolerată atunci când a fost administrată i.v. până la 600 mg o dată pe săptămână timp de 4 săptămâni.

Claims (16)

1. Dimer polipeptidic cuprinzând doi monomeri gpl30-Fc având identitate de secvenţă de cel puţin 90% cu SECV ID NR: 1, în care monomerii cuprind aminoacizii la poziţiile 585-595 din SECV ID NR:1, o regiune balama a domeniului Fc cuprinzând aminoacizii la poziţiile 609-612 din SECV ID NR:1, iar monomerii nu cuprind un element de legătură între porţiunea gp130 şi domeniul Fc, de preferinţă în care monomerii sunt legaţi prin una sau mai multe punţi disulfură, în care dimerul polipeptidic cuprinde nu mai mult de 6 % galactoză-alfa-1,3-galactoză per mol de polipeptidă, de preferinţă nu mai mult de 3 %mol, mai preferabil nu mai mult de 1 %mol, chiar mai preferabil nu mai mult de 0,5 %mol de galactoză-alfa-1,3-galactoză,

în care dimerul polipeptidic poate fi obţinut prin exprimarea unei polipeptide având identitate de secvenţă de cel puţin 90% cu SECV ID NR: 1 în celule de ovar de hamster chinezesc (CHO), selectarea unei linii celulare care produce dimerul polipeptidic, cultivarea liniei celulare în medii de cultură, şi colectarea dimerilor polipeptidici menţionaţi din celulele menţionate şi/sau mediile de cultură celulară, de preferinţă în care dimerii menţionaţi sunt purificaţi şi/sau concentraţi.

2. Dimer polipeptidic conform revendicării 1, în care dimerul polipeptidic cuprinde glicani, în care o medie de cel puţin 52%, preferabil cel puţin 54% din glicani include unul sau mai multe resturi de acid sialic, mai preferabil 52-65%.

3. Dimer polipeptidic conform revendicării 1 sau 2, în care monomerii au SECV ID NR: 1 sau SECV ID NR: 2.

4. Compoziţie cuprinzând dimerul polipeptidic conform oricăreia dintre revendicările precedente, în care:

a. nu mai mult de 5% din dimerul polipeptidic este prezent ca un agregat oligomeric,

b. compoziţia cuprinde nu mai mult de 4,0% în greutate de polipeptide care sunt o variaţie trunchiată a polipeptidei din SECV ID NR: 1 în raport cu polipeptidele din SECV ID NR: 1, de preferinţă în care nu mai mult de 3%, mai preferabil în care nu mai mult de 1,5%, cel mai preferabil în care nu mai mult de 1,0% din polipeptidă este prezentă ca oligomer sau

c. ambele.

5. Compoziţie cuprinzând dimerul polipeptidic conform oricăreia dintre revendicările 1-3 sau compoziţia conform revendicării 4, în care compoziţia mai cuprinde un agent activ de suprafaţă.

6. Compoziţie conform revendicării 5, în care agentul activ de suprafaţă este un agent activ de suprafaţă neionic, de preferinţă în care agentul activ de suprafaţă este un agent activ de suprafaţă polisorbat, mai preferabil în care agentul activ de suprafaţă este polisorbat 20.

7. Compoziţie care cuprinde dimerul polipeptidic conform oricăreia dintre revendicările 1-3 sau compoziţia conform oricăreia dintre revendicările 4-6, în care compoziţia mai cuprinde un agent de tamponare şi un zahăr, de preferinţă în care agentul de tamponare este histidină, de preferinţă în care zahărul este zaharoză.

8. Dimer polipeptidic conform oricăreia dintre revendicările 1-3 sau compoziţia conform oricăreia dintre revendicările 4-7 pentru utilizare în tratamentul unei boli inflamatorii sau a unei afecţiuni mediate de IL-6 la om.

9. Dimer polipeptidic sau compoziţie pentru utilizare conform revendicării 8, în care boala inflamatorie sau afecţiunea mediată de IL-6 este boala inflamatorie intestinală, de preferinţă în care tratamentul induce remisia bolii inflamatorii intestinale.

10. Dimer polipeptidic sau compoziţie pentru utilizare conform revendicării 8, în care boala inflamatorie intestinală este boala Crohn sau colita ulceroasă, de preferinţă în care tratamentul menţine remisia bolii inflamatorii intestinale.

11. Dimer polipeptidic sau compoziţie pentru utilizare conform revendicării 8, în care boala inflamatorie sau afecţiunea mediată de IL-6 este artrita reumatoidă, psoriazisul, uveita sau ateroscleroza; sau în care boala inflamatorie sau afecţiunea mediată de IL-6 este colita care nu este asociată cu boala inflamatorie intestinală, de preferinţă în care colita este colita prin radiaţii, colita diverticulară, colita ischemică, colita infecţioasă, boala celiacă, colita autoimună sau colita rezultată din alergii afectând colonul.

12. Dimer polipeptidic sau compoziţie pentru utilizare conform oricăreia dintre revendicările 8-11, în care dimerul polipeptidic sau compoziţia este administrată parenteral, de preferinţă intravenos sau subcutanat.

13. Metodă pentru producerea unui dimer polipeptidic cuprinzând doi monomeri gp130-Fc având identitate de secvenţă cel puţin 90% cu SECV ID NR: 1, în care monomerii cuprind aminoacizii la poziţiile 585-595 din SECV ID NR:1, o regiune balama a domeniului Fc cuprinzând aminoacizii la poziţiile 609-612 din SECV ID NR:1, iar monomerii nu cuprind un element de legătură între porţiunea gp130 şi domeniul Fc, de preferinţă în care monomerii sunt legaţi prin una sau mai multe punţi disulfură, metoda menţionată cuprinzând:

- exprimarea unei secvenţe de aminoacizi având identitate de secvenţă de cel puţin 90% cu SECV ID NR: 1 în celulele ovariene de hamster chinezesc (CHO),

- selectarea unei linii celulare producând dimerul polipeptidic menţionat, în care dimerul polipeptidic cuprinde nu mai mult de 6% galactoză-alfa-1,3-galactoză per mol de polipeptidă, de preferinţă nu mai mult de 3 %mol, mai preferabil nu mai mult de 1 %mol, chiar mai preferabil nu mai mult de 0,5 %mol de galactoză-alfa-1,3-galactoză,

- cultivarea celulelor din linia celulară în medii de cultură, şi

- colectarea dimerilor polipeptidici menţionaţi din celulele menţionate şi/sau mediile de cultură celulară, de preferinţă în care dimerii menţionaţi sunt purificaţi şi/sau concentraţi.

14. Metodă conform revendicării 13, în care dimerul polipeptidic cuprinde glicani, în care o medie de cel puţin 52%, de preferinţă cel puţin 54% din glicani include unul sau mai multe resturi de acid sialic, mai preferabil 52-65%.

15. Metodă conform revendicării 13 sau 14, în care monomerii au SECV ID NR: 1.

16. Metodă conform oricăreia dintre revendicările 13-15, în care:

a. nu mai mult de 5% din dimerii polipeptidici sunt prezenţi ca un agregat oligomeric,

b. nu mai mult de 4,0% în greutate din polipeptide sunt prezente ca o variaţie trunchiată a polipeptidei din SECV ID NR: 1 în raport cu polipeptidele din SECV ID NR: 1, de preferinţă în care nu mai mult de 3%, mai preferabil în care nu mai mult de 1,5%, cel mai preferabil în care nu mai mult de 1,0% din polipeptidă este prezentă ca oligomer sau

c. ambele.