MD1148Z

MD1148Z - Device for skin step-by-step fixation in the decellularization process

Info

Publication number: MD1148Z
Application number: MDS20160141A
Authority: MD
Inventors: Ольга МАКАГОНОВА; Виорел НАКУ; Георге МУШЕТ; Адриан КОЧУГ; Марианна ЖИАН; Виолета САРЕВ; Виталие КОБЗАК
Original assignee: Государственный Медицинский И Фармацевтический Университет "Nicolae Testemitanu" Республики Молдова
Priority date: 2016-11-29
Filing date: 2016-11-29
Publication date: 2017-12-31
Also published as: MD1148Y

Abstract

The invention relates to the field of regenerative medicine, in particular to devices for skin fixation in the decellularization process.The device for skin step-by-step fixation in the decellularization process comprises a carcass, made up of three tubular sections (1) with the diameter of the tube of 2 cm, made in the form of a circle of a diameter of 10 cm, coaxially placed and fixed to each other by means of four tubes (2) of a length of 10 cm and a diameter of 1 cm, placed on circumference, at the same distance from each other, at the same time on the upper part of the sections (1), diametrically opposite, are made four holes of a diameter of 2 mm. The device further comprises rods (3) of a length of 2 cm and a diameter of 1 mm, one end of which is made sharp, and on the other end is made a handle in the form of a cylinder. At the same time, on the upper part of the lower section of the carcass, diametrically opposite, are fixed with one end four rods, fixed with the other end to a round plate (4) for the placement of a magnet. All elements of the device are made of stainless steel.

Description

Invenţia se referă la medicina regenerativă, şi anume la dispozitive pentru fixarea pielii în procesul de decelularizare. The invention relates to regenerative medicine, namely to devices for fixing the skin in the decellularization process.

Cea mai apropiată soluţie este dispozitivul, care include un recipient cu diametrul de 3 cm şi înălţimea de 3 cm, care conţine patru elemente de fixare executate în formă de cilindru, pe centrul circumferinţei cărora sunt executate orificii cu diametrul de 1 mm, precum şi patru tije cu lungimea de 5 cm şi diametrul de 0,9 mm, un capăt al cărora este executat ascuţit, iar pe celălalt capăt este executat un mâner în formă de cilindru [1]. The closest solution is the device, which includes a container with a diameter of 3 cm and a height of 3 cm, which contains four fixing elements made in the shape of a cylinder, on the center of the circumference of which holes with a diameter of 1 mm are made, as well as four rods with a length of 5 cm and a diameter of 0.9 mm, one end of which is made sharp, and on the other end a handle in the shape of a cylinder is made [1].

Dezavantajul acestei soluţii constă în faptul că are o eficacitate scăzută, deoarece necesită un timp mai îndelungat şi efort în procesul de decelularizare a pielii. The disadvantage of this solution is that it has low effectiveness, as it requires more time and effort in the skin decellularization process.

Problema pe care o rezolvă invenţia constă în crearea unui dispozitiv, care ar permite o decelularizare etajată, adică mai uşoară şi eficace a pielii, favorizând un acces mai bun pentru schimbarea repetată şi succesivă a reactivilor în procesul de decelularizare şi asigurând o mişcare rotativă dispozitivului. The problem solved by the invention consists in creating a device that would allow for a staged, i.e. easier and more effective, decellularization of the skin, favoring better access for repeated and successive change of reagents in the decellularization process and ensuring a rotary movement of the device.

Dispozitivul pentru fixarea etajată a pielii în procesul de decelularizare, conform invenţiei, înlătură dezavantajul menţionat mai sus prin aceea că include o carcasă compusă din trei compartimente tubulare cu diametrul tubului de 1 cm, executate în formă de cerc cu diametrul de 10 cm, amplasate coaxial şi fixate unul de altul prin intermediul a patru tuburi cu lungimea de 10 cm şi diametrul de 1 cm, amplasate pe circumferinţă, la aceeaşi distanţă unul faţă de altul, totodată pe partea de sus a compartimentelor, diametral opus, sunt executate câte patru orificii cu diametrul de 2 mm, nişte tije cu lungimea de 2 cm şi diametrul de 1 mm, un capăt al cărora este executat ascuţit, iar pe celălalt capăt este executat un mâner în formă de cilindru, totodată pe partea de sus a compartimentului de jos al carcasei, diametral opus, sunt fixate cu un capăt patru tije, iar cu celălalt capăt de o placă rotundă pentru amplasarea unui magnet, totodată toate elementele sunt executate din inox. The device for the staged fixation of the skin in the decellularization process, according to the invention, eliminates the aforementioned disadvantage by including a housing composed of three tubular compartments with a tube diameter of 1 cm, made in the shape of a circle with a diameter of 10 cm, placed coaxially and fixed to each other by means of four tubes with a length of 10 cm and a diameter of 1 cm, placed on the circumference, at the same distance from each other, at the same time on the top of the compartments, diametrically opposite, four holes with a diameter of 2 mm are made, some rods with a length of 2 cm and a diameter of 1 mm, one end of which is made sharp, and on the other end a cylinder-shaped handle is made, at the same time on the top of the lower compartment of the housing, diametrically opposite, four rods are fixed with one end, and with the other end to a round plate for placing a magnet, at the same time all the elements are made of stainless steel.

Avantajele acestui dispozitiv constau în faptul că asigură scufundarea totală a pielii şi permite o decelularizare etajată, adică mai eficace a ei. The advantages of this device are that it ensures total immersion of the skin and allows for a more effective, tiered decellularization of the skin.

Rezultatul tehnic al invenţiei constă în crearea unui dispozitiv pentru fixarea etajată a pielii în procesul decelularizării, care asigură operativ, sigur, calitativ, uşor, atraumatic, precum şi econom fixarea pielii de prelucrat şi obţinerea unei mişcări rotative a dispozitivului în procesul de decelularizare. The technical result of the invention consists in creating a device for layered fixation of the skin in the decellularization process, which ensures operative, safe, qualitative, easy, atraumatic, as well as economical fixation of the skin to be processed and obtaining a rotary movement of the device in the decellularization process.

Invenţia se explică prin desenele din fig. 1-3, care reprezintă: The invention is explained by the drawings in Fig. 1-3, which represent:

- fig. 1, vederea de ansamblu a dispozitivului pentru fixarea etajată a pielii în procesul decelularizării; - Fig. 1, overall view of the device for layered skin fixation during the decellularization process;

- fig. 2, vederea de jos a dispozitivului. - Fig. 2, bottom view of the device.

Dispozitivul pentru fixarea etajată a pielii în procesul de decelularizare include o carcasă formată din trei compartimente tubulare 1 cu diametrul tubului de 1 cm, executate în formă de cerc cu diametrul de 10 cm, amplasate coaxial şi fixate unul de altul prin intermediul a patru tuburi 2 cu lungimea de 10 cm şi diametrul de 1 cm, amplasate pe circumferinţă, la aceeaşi distanţă unul faţă de altul, totodată pe partea de sus a compartimentelor 1, diametral opus, sunt executate câte patru orificii cu diametrul de 2 mm. Dispozitivul mai conţine nişte tije 3 cu lungimea de 2 cm şi diametrul de 1 mm, un capăt al cărora este executat ascuţit, iar pe celălalt capăt este executat un mâner în formă de cilindru. Totodată pe partea de sus a compartimentului de jos al carcasei, diametral opus, sunt fixate cu un capăt patru tije, iar cu celălalt capăt de o placă rotundă 4 pentru amplasarea unui magnet. Toate elementele dispozitivului sunt executate din inox. The device for the staged fixation of the skin in the decellularization process includes a housing formed by three tubular compartments 1 with a tube diameter of 1 cm, made in the shape of a circle with a diameter of 10 cm, placed coaxially and fixed to each other by means of four tubes 2 with a length of 10 cm and a diameter of 1 cm, placed on the circumference, at the same distance from each other, at the same time on the upper part of the compartments 1, diametrically opposite, four holes with a diameter of 2 mm are made. The device also contains rods 3 with a length of 2 cm and a diameter of 1 mm, one end of which is made sharp, and on the other end a cylinder-shaped handle is made. At the same time, on the upper part of the lower compartment of the housing, diametrically opposite, four rods are fixed with one end, and with the other end to a round plate 4 for placing a magnet. All elements of the device are made of stainless steel.

Dispozitivul pentru fixarea etajată a pielii în procesul de decelularizare se utilizează în modul următor. The device for layered skin fixation in the decellularization process is used in the following way.

Acest dispozitiv se utilizează în mediu steril sub o hotă cu flux laminar de aer. Prealabil, dispozitivul se sterilizează în autoclavă şi se pregătesc soluţiile pentru decelularizare. Apoi se dezgheaţă o bucată de piele congelată şi cu ajutorul unui bisturiu se secţionează un fragment de piele cu dimensiunile de 10 x10 cm. După înlăturarea ţesutului adipos de pe partea epidermo-dermală, fragmentul de piele se fixează de colţuri prin intermediul tijelor 3 şi orificiilor executate pe partea de sus a compartimentelor 1. Ulterior carcasa se scufundă într-un vas de sticlă cu soluţie de 0,25% Tripsin-EDTA la temperatura camerei, timp de 6 ore. După aceasta vasul de sticlă este amplasat pe un agitator magnetic, care datorită magnetului plasat pe placa rotundă 4, imprimă o mişcare orbitală necesară procesului de decelularizare. Apoi fragmentul de piele se spală de 3 ori în apă distilată timp de 15 min de fiecare dată, după care se incubează în soluţie de 70% etanol timp de 12 ore. Ulterior fragmentul de piele se incubează în sol. Peroxid hidrogen 3% timp de 15 min. Fragmentul de piele iarăşi se spală de 3 ori în apă distilată timp de 15 min de fiecare dată, apoi se incubează în 1% Triton X-100 şi 0,26%Tris şi 0,69%EDTA timp de 6 ore, după care în final se spală de 6 ori în apă distilată timp de 15 min de fiecare dată. Toate aceste etape sunt efectuate la temperatura camerei cu ajutorul unui agitator orbital. Apoi fragmentul de piele se spală în soluţie de serum-free Dulbeco modificat Eagle mediu (DMEM) cu 1% penicilină/streptomicină cu ajutorul unui agitator magnetic la temperatura de 37°C timp de 24 ore. Ulterior pielea este liofilizată şi stocată într-un disicator pâna la utilizare. Fiecare fragment de piele este fixat şi preparat pentru investigaţie histologică, fiind colorat cu hematoxilin şi eosin. Pentru a măcina pielea decelularizată ea se taie în benzi de 1 cm lăţime şi se plasează într-un măcinător. După o spălare minuţioasă, pielea se scufundă în soluţie de DMEM fără ser cu amestecul antibiotic şi antimicotic de 1%, continuând procesul pe agitatorul magnetic la temperatura de 37°C timp de 24 ore. This device is used in a sterile environment under a laminar air flow hood. First, the device is sterilized in an autoclave and the solutions for decellularization are prepared. Then a piece of frozen skin is thawed and a 10 x 10 cm skin fragment is sectioned with a scalpel. After removing the adipose tissue from the epidermal side, the skin fragment is fixed to the corners by means of rods 3 and holes made on the top of the compartments 1. Subsequently, the carcass is immersed in a glass vessel with a 0.25% Trypsin-EDTA solution at room temperature for 6 hours. After this, the glass vessel is placed on a magnetic stirrer, which, thanks to the magnet placed on the round plate 4, creates an orbital movement necessary for the decellularization process. Then the skin fragment is washed 3 times in distilled water for 15 min each time, after which it is incubated in 70% ethanol solution for 12 hours. Subsequently the skin fragment is incubated in sol. 3% hydrogen peroxide for 15 min. The skin fragment is again washed 3 times in distilled water for 15 min each time, then it is incubated in 1% Triton X-100 and 0.26% Tris and 0.69% EDTA for 6 hours, after which it is finally washed 6 times in distilled water for 15 min each time. All these steps are performed at room temperature using an orbital shaker. Then the skin fragment is washed in serum-free Dulbeco's modified Eagle medium (DMEM) solution with 1% penicillin/streptomycin using a magnetic stirrer at 37°C for 24 hours. The skin is then freeze-dried and stored in a desiccator until use. Each skin fragment is fixed and prepared for histological investigation, being stained with hematoxylin and eosin. To grind the decellularized skin, it is cut into 1 cm wide strips and placed in a grinder. After thorough washing, the skin is immersed in serum-free DMEM solution with 1% antibiotic and antifungal mixture, continuing the process on a magnetic stirrer at 37°C for 24 hours.

Curăţarea dispozitivului se efectuează prin dezinfectarea cu detergenţi şi soluţii degresante şi sterilizarea ulterioară în autoclavă. The device is cleaned by disinfection with detergents and degreasing solutions and subsequent sterilization in an autoclave.

Exemplu Example

După o sterilizare prealabilă a dispozitivului şi înlăturarea ţesutului adipos de pe partea epidermo-dermală, fragmentul de piele cu dimensiunile de 10 x10 cm a fost fixat de colţuri prin intermediul tijelor 3 şi orificiilor executate pe partea de sus a compartimentelor 1, fiind scufundată într-un vas de sticlă cu soluţie de 0,25% Tripsin-EDTA timp de 6 ore la temperatura camerei. Apoi fragmentul de piele a fost spălat de 3 ori în apă distilată timp de 15 min de fiecare dată, după care incubat în soluţie de 70% etanol timp de 12 ore. Ulterior fragmentul de piele a fost incubat în soluţie de Peroxid hidrogen 3% timp de 15 min, apoi spălat de 3 ori în apă distilată timp de 15 min de fiecare dată. După aceasta fragmentul de piele a fost incubat în soluţie de 1% Triton X-100 şi 0,26%Tris şi 0,69%EDTA timp de 6 ore, în final a fost spălat de 6 ori în apă distilată timp de 15 min de fiecare dată. Toate aceste etape au fost efectuate la temperatura camerei cu ajutorul unui agitator orbital. Apoi fragmentul de piele a fost spălat în soluţie de serum-free Dulbeco modificat Eagle mediu (DMEM) cu 1% penicilină/streptomicină cu ajutorul unui agitator magnetic la temperatura de 37°C timp de 24 ore. Ulterior pielea a fost liofilizata şi stocată într-un disicator până la utilizare. Fiecare fragment de piele a fost fixat şi preparat pentru investigaţie histologică fiind colorat cu hematoxilin şi eosin. Pentru a măcina pielea decelularizată ea a fost tăită în benzi de 1 cm lăţime şi plasată într-un măcinător. După o spălare minuţioasă, pielea a fost scufundată în soluţie de DMEM fără ser cu amestecul antibiotic - antimicotic de 1%, continuând procesul pe agitatorul magnetic la temperatura de 37°C timp de 24 ore. After prior sterilization of the device and removal of adipose tissue from the epidermal-dermal side, the skin fragment measuring 10 x 10 cm was fixed to the corners by means of rods 3 and holes made on the top of compartments 1, being immersed in a glass vessel with 0.25% Trypsin-EDTA solution for 6 hours at room temperature. Then the skin fragment was washed 3 times in distilled water for 15 min each time, then incubated in 70% ethanol solution for 12 hours. Subsequently, the skin fragment was incubated in 3% hydrogen peroxide solution for 15 min, then washed 3 times in distilled water for 15 min each time. After this, the skin fragment was incubated in a solution of 1% Triton X-100 and 0.26% Tris and 0.69% EDTA for 6 hours, finally it was washed 6 times in distilled water for 15 min each time. All these steps were performed at room temperature using an orbital shaker. Then the skin fragment was washed in serum-free Dulbeco's modified Eagle medium (DMEM) solution with 1% penicillin/streptomycin using a magnetic shaker at 37°C for 24 hours. Subsequently, the skin was lyophilized and stored in a desiccator until use. Each skin fragment was fixed and prepared for histological investigation by staining with hematoxylin and eosin. To grind the decellularized skin, it was cut into 1 cm wide strips and placed in a grinder. After thorough washing, the skin was immersed in serum-free DMEM solution with 1% antibiotic-antimycotic mixture, continuing the process on the magnetic stirrer at 37°C for 24 hours.

Toate fragmentele de piele au fost liofilizate şi stocate în desicator până la utilizare. Cu scopul detectării rezidiului celular, a resturilor nucleare, precum şi pentru vizualizarea arhitecturii matricii extracelulare, mostrele de piele au fost fixate şi preparate pentru examen histologic, fiind colorate cu hematoxilin şi eosin. S-a efectuat cuantificarea spectrofotometrică a cantităţii de AND, s-au obţinut următoarele rezultate: All skin fragments were lyophilized and stored in a desiccator until use. In order to detect cellular debris, nuclear debris, and to visualize the extracellular matrix architecture, the skin samples were fixed and prepared for histological examination, being stained with hematoxylin and eosin. Spectrophotometric quantification of the amount of DNA was performed, the following results were obtained:

Rezulatatele cuantificării cantităţii de ADN (ng/µl) Decelularizarea cu tripsină şi triton Control (pielea nedecelularizată) 12,5 Repetiţia 1 4,8 Repetiţia 2 4,8 Repetiţia 3 4,8DNA quantification results (ng/µl) Decellularization with trypsin and triton Control (non-cellularized skin) 12.5 Repetition 1 4.8 Repetition 2 4.8 Repetition 3 4.8

Dispozitivul corespunde cerinţelor şi normelor sanitare, toate piesele dispozitivului fiind executate din material inoxidabil, şi asigură o uşoară decelularizare a pielii. The device complies with sanitary requirements and standards, all parts of the device being made of stainless steel, and ensures gentle decellularization of the skin.

Acest dispozitiv se utilizează pentru fixarea pielii în procesul decelularizării în Laboratorul inginerie tisulară şi culturi celulare şi la catedrele universităţii. This device is used to fix the skin during the decellularization process in the Tissue Engineering and Cell Culture Laboratory and at university departments.

1. MD s 2016 0131 2017.03.31 1. MD s 2016 0131 2017.03.31

Claims

Device for tiered fixation of the skin in the decellularization process, which includes a housing formed by three tubular compartments (1) with a tube diameter of 1 cm, made in the shape of a circle with a diameter of 10 cm, placed coaxially and fixed to each other by means of four tubes (2) with a length of 10 cm and a diameter of 1 cm, placed on the circumference, at the same distance from each other, at the same time on the top of the compartments (1), diametrically opposite, four holes with a diameter of 2 mm are made, some rods (3) with a length of 2 cm and a diameter of 1 mm, one end of which is made sharp, and on the other end a cylinder-shaped handle is made, at the same time on the top of the lower compartment of the housing, diametrically opposite, four rods are fixed with one end, fixed with the other end to a round plate (4) for placing a magnet, at the same time all the elements are made of stainless steel.