LU85804A1 - Procede et dispositif de separation de bacteries a partir d'une phase liquide en vue notamment d'un controle bacteriologique - Google Patents

Description

-ï « 1.

La présente invention concerne un procédé et un dispositif de séparation de bactéries à partir d'une phase liquide en vue notamment d'un contrôle bactériologique .

5 Le contrôle bactériologique des eaux est une nécessité pour la protection sanitaire des populations, notamment en ce qui concerne : - les eaux destinées à la consommation humaine (eaux potables) et animale, 10 - les eaux destinées à des usages alimentaires directs ou indirects (utilisées dans les industries alimentaires), - les eaux des milieux aquatiques utilisées pour la conchyliculture (élevage des coquillages) ou l'aqua- 15 culture, - les eaux de piscines, - les eaux du milieu aquatique naturel consacrées aux loisirs, baignade, ...

- les rejets d'eaux usées plus ou moins épurées, 20 notamment dans les zones sensibles à la pollution.

Le contrôle est d'autant plus nécessaire que les eaux superficielles (rivières, lacs, étangs) sont de plus en plus utilisées pour la préparation d'eau potable, et que ces eaux superficielles sont très vulnérables aux 25 rejets contaminés bactériologiquement (rejets domestiques et urbains, rejets d'abattoirs, ...).

Devant la difficulté d'isoler et de dénombrer les bactéries pathogènes, susceptibles de provoquer des maladies humaines ou animales, on recherche classiquement 30 des bactéries dites "germes-tests de contamination fécale" dont la présence permet de suspecter celle de germes pathogènes qui sont de même origine (matières fécales) et les accompagnent généralement. Ces germes-tests 4 2.

ont été choisis également en fonction de leur facilité 1 de détermination par les méthodes de la bactériologie classique.

Les bactéries coliformes répondent au critère de 5 définition des germes-tests et sont utilisées classiquement en tant que tels. Par ailleurs, certaines bactéries de ce type, de l'espèce Escherichia coli sont potentiellement pathogènes et leur identification apporte une présomption supplémentaire de non-potabilité. D'autres . 10 bactéries sont également utilisables comme germes-tests de contamination fécale (Streptocoques fécaux, ...).

Le problème posé par l'application des méthodes classiques de la bactériologie à l'évaluation du degré de contamination bactérien des eaux est la longueur des 15 déterminations en laboratoire. Cette durée est en effet incompressible du fait que ces méthodes comportent des ; cultures bactériennes, sur milieux nutritifs appropriés, nécessitant des incubations de longue durée avant lecture du résultat.

20 A titre indicatif, les méthodes classiques de dé nombrement des bactéries coliformes ou Escherichia coli, nécessitent au moins 24 heures (méthode avec concentration sur membrane) dans le cas de l'analyse des eaux peu contaminées (type eaux potables ou eaux traitées) 25 tandis que la méthode utilisée sur les eaux contaminées (type eaux de rivière) nécessite deux incubations successives de 48 heures pour déterminer les bactéries coliformes et Escherichia coli. (Méthode en milieu liquide, dite du "nombre le plus probable").

30 Ce temps de réponse élevé constitue un handicap certain lorsque le contrôle de qualité de l'eau est effectué en vue d'une action préventive ou curative (interdiction de l'usage de l'eau contaminée, modification des conditions de fonctionnement d'une installation de 35 traitement). En effet, une atteinte irréparable à la santé publique peut être causée entre le début de la pollution bactérienne de l'eau et la connaissance du résultat de l'analyse de contrôle.

<v 3.

Un autre inconvénient de ces méthodes est d'être purement manuelles et de ne pas pouvoir se prêter à une automatisation complète (réalisation d'analyses en continu ou de façon séquentille à fréquence rapide sans au-5 cune intervention humaine).

Le but recherché lors de la conception de l'invention était : - de permettre une réduction très importante du temps de réponse des analyses de contrôle bactériologique 10 des eaux par identification et comptage des bactéries, notamment conformes et/ou Escherichia coli et, si possible, de réduire ce temps de plusieurs jours à une durée de quelques heures, - de permettre une automatisation complète ren-15 dant possible un contrôle pratiquement continu.

Au niveau du laboratoire, la seule manière actuel-1 lement connue de raccourcir le temps de réponse des mé thodes de la bactériologie classique consiste à réaliser une filtration de l'échantillon liquide sur une membrane 20 dont la taille des pores est inférieure à celle des bactéries (en général des pores de diamètre 0,4 microns), à concentrer ainsi la totalité des bactéries présentes sur la surface de la membrane et à réaliser sur celle-ci, par apport de milieu nitritif adéquat, une culture qui, 25 après incubation rapide, permettra d'identifier la présence et de dénombrer les bactéries spécifiquement recherchées .

Cette technique présente trois graves inconvé- ' nients : 30 - le diamètre des pores de la membrane nécessaire à la rétention des bactéries est si petit que ces pores peuvent se trouver très rapidement colmatés par des particules solides de petite taille, de nature non bactérienne (particules colloïdales d'argile, limons, matières 35 humiques, débris végétaux ou animaux, etc.) ce colmatage empêchant la filtration de se poursuivre et rendant donc la méthode inopérable,

V

4.

- le nombre de bactéries séparées par filtration et retenues par unité de surface de la membrane peut être trop élevé, rendant impossible l'identification séparée des colonies bactériennes se développant lors 5 de l'incubation et par conséquent la numération des bactéries.

- la préconcentration des bactéries sur membrane étant irréversible, celle-ci ne peut retrouver son état initial et être réutilisée. On pourrait concevoir des . io systèmes à renouvellement automatisé de la membrane {déroulement d'une bande de matériau), mais au prix d'une grande complexité sur le plan mécanique et avec un risque important de contamination de la membrane neuve par celle qui a déjà été utilisée.

15 La méthode décrite ci-dessus manifeste donc des résultats insuffisants vis-à-vis des objectifs fixés.

Dans le but de résoudre le problème, des méthodes nouvelles reposant sur des principes tout à fait différents ont été mises au point. Il s'agit essentiellement 20 de méthodes instrumentales et notamment la méthode électrochimique de détection des bactéries coliformes et E. coli mise au point par Wilkins et coll.("Microbial détection method based on sensing molecular hydrogen". Applied Microbiology, vol. 27, n° 5, Mai 1974, p.649-25 652. - J.R. Wilkins, E.H. Boykin "Analytical notes.

Method for early détection and monitoring of coliforms".

J.A.W.W.A. Mai 1976, p.257-262. - J.R. Wilkins et coll. "Multichannel electrochemical microbial détection unit". Applied and Environmental Microbiology, vol. 35, n° 1, 30 p.214-215, Janv. 1978), qui numère ces bactéries en mesurant le temps de latence au bout duquel une culture réalisée par mélange de l'échantillon étudié avec un milieu nitritif convenable produit de l'hydrogène moléculaire détectable à l'aide d'une électrode de platine 35 dont le potentiel est comparé en permanence à celui d'une électrode de référence (par exemple électrode au calomel ou au chlorure d'argent).

-\f 5.

D'autres méthodes ont été également décrites par la littérature : méthode utilisant des radio-éléments, méthodes sérologiques, méthodes électrochimiques diverses, méthodes enzymatiques, méthodes Chromatographiques, mé-5 thodes par chimiluminescence (voir A.M.Cunâell "Rapid coun-ting methods for coliform bacteria". Advances in applied microbiology, vol. 27, p.169-181/ 1981).

Bon nombre des méthodes instrumentales mentionnées ci-dessus présentent la particularité d'avoir un 10 temps de réponse d'autant plus court que l'échantillon étudié est fortement contaminé en bactéries conformes ou E. coli. Le temps de réponse peut être court de l'ordre de quelques heures sur des échantillons très fortement contaminés. Il est par contre plus long lorsque 15 l'échantillon est peu contaminé et peut atteindre ou dépasser une douzaine d'heures lorsque l'échantillon k contient une seule bactérie du type recherché. Ceci de meure un inconvénient dans le cas de la surveillance des eaux potables où une contamination faible peut déjà 20 conduire à des risques sanitaires importants.

Il est à signaler par ailleurs que toutes les méthodes connues, dont toutes celles qui ont été mentionnées précédemment, utilisent des volumes d'échantillon (eau) faible (en général de 100 ml), alors que des 25 volumes beaucoup plus importants (quelques litres ou dizaines de litres) seraient nécessaires pour identifier des bactéries en cas de contamination très faible, mais néanmoins existante.

Enfin, certaines méthodes utilisent des réactifs 30 coûteux (par exemple molécules biochimiques complexes) ou dont l'usage pose des problèmes spécifiques (ex: radio-éléments).

La présente invention n'est pas en soi une méthode de détermination à réponse rapide des bactéries, 35 mais un procédé de séparation et donc de "concentration" rapide de celles-ci, permettant de diminuer le temps de réponse des méthodes de détermination utilisées ensuite.

* 6.

La présente invention a ainsi pour objet un pro-1 cédé de séparation de bactéries d'une phase liquide, ca ractérisé en ce que l'on met en contact la phase liquide avec au moins une électrode maintenue à un potentiel 5 ayant une polarité opposée à la charge des bactéries à séparer de façon à obtenir une fixation des bactéries sur l'électrode.

Sans que cela constitue une limitation quelconque, on estime que le mécanisme de fixation est le suivant: 10 comme toutes les particules en suspension dans l'eau, les bactéries portent une charge électrique superficielle qui peut résulter simultanément de phénomènes : - de nature électrochimique (formation d'une double couche ionique à l'interface solide-liquide, em- 15 magasinant une certaine quantité d'électricité) , - de nature biochimique : propriétés de dissociation ionique des molécules constituant la paroi cellulaire ou secrétées et adhérant à celle-ci, - de nature biologique, liés au métabolisme des 20 bactéries : transport actif d'ions à travers les parois cellulaires.

Lorsqu'on met en contact la phase liquide avec l'électrode dont le potentiel est maintenu à une polarité opposée à la charge des bactéries, les bactéries 25 sont attirées par cette électrode et viennent y adhérer. Généralement, la charge des bactéries est négative et l'électrode est maintenue à un potentiel positif.

Le mécanisme de cette adhésion importe peu, qu'il soit purement physico-chimique ou biochimique.

30 Pour favoriser le processus de migration des bac téries vers l'électrode et la rétention des bactéries ' sur cette électrode afin d'obtenir un rendement de sépa ration élevé, on utilise avantageusement une électrode perforée telle qu'une grille et on fait passer la phase 35 liquide à travers ladite électrode perforée.

Selon les cas, on pourra ensuite appliquer une méthode d'identification et de dénombrement des bactéries: 7.

- soit directement à la surface de l'électrode, - soit dans un petit volume de liquide (concentrât) dans lequel on fera relarguer les bactéries précédemment fixées à la surface de l'électrode à l'aide de 5 moyens adaptés (par exemple modification de la polarité électrique de l'électrode).

La présente invention facilite l'utilisation de méthodes déjà connues d'identification et de dénombrement des bactéries et permet de réduire leur temps de 10 réponse chaque fois qu'il s'agit de méthodes dont le temps de réponse est d'autant plus court que l'échantillon étudié est contaminé bactériologiquement.

L'invention est exposée ci-après plus en détail à l'aide d'un dessin représentant seulement un mode 15 d'exécution.

Sur ce dessin : la figure unique est un schéma d'un dispositif pour la mise en oeuvre du procédé selon la présente invention.

20 Comme représenté sur la figure unique, l'échantil lon d'eau duquel on veut séparer les bactéries est introduit dans une cellule 1 de forme cylindrique comportant à sa base un dispositif de réglage de débit 2 permettant de régler à volonté la vitesse de passage de l’eau 25 à travers la cellule. La cellule est garnie de deux électrodes métalliques 3 et 4 qui sont superposées horizontalement et remplissent la section entière de la cellule. Ces électrodes sont constituées par une grille métallique de faible ouverture de maille. Le liquide qui s'écoule 30 verticalement à travers la cellule est ainsi obligé de passer à travers les grilles métalliques. L'ensemble du dispositif est stérilisé (rinçage prolongé à l'alcool éthylique) avant réalisation de chaque analyse. L'électrode métallique inférieure 3 est placée à un potentiel 35 électrique positif par rapport à la deuxième électrode 4 par un générateur 5 dont la nature importe peu (pile, accumulateur, alimentation stabilisée en courant ou en 8.

tension). Cette différence de potentiel peut être contrôlée par un voltmètre 6 et ajustée à l'aide d'un dispositif adéquat tel qu'un rhéostat 7. La vitesse d'écoulement du liquide est réglée à une valeur telle que toute 5 particule bactérienne puisse séjourner un temps suffisant à proximité immédiate de l'électrode 3 chargée positivement pour que, soumise à l'attraction de l'électrode, . elle ait le temps de se déplacer à travers le liquide pour atteindre cette électrode et se trouver retenue à sa sur-10 face. Cette durée est fonction de la géométrie du dispositif, du potentiel électrique appliqué à l'électrode et de la charge électrique propre de la bactérie.

Après passage de tout le volume d'échantillon, les bactéries qu'il contenait se trouveront en très grande 15 partie, sinon totalement, fixées à l'électrode 3. Une méthode d'identification et de numération de bactéries spécifiques ayant un temps de réponse d'autant plus court que le nombre de bactéries est élevé peut alors être directement appliquée sur l'électrode métallique.

20 A titre d'exemple, on peut appliquer la méthode électrochimique de Wilkins en introduisant dans la cellule le milieu de culture des bactéries coliformes ou E.coli et en thérmostatant cette cellule à une température respectivement de 37 ou 44°C.

25 Dans ce cas, le matériau de l'électrode 3 peut être avantageusement choisi en platine et il suffira alors pour appliquer le procédé de Wilkins de suivre le potentiel pris spontanément par cette électrode par rapport à une électrode de référence 8 placée dans le milieu de culture, 30 le dispositif imposant le potentiel entre les électrodes 3 et 4 étant alors mis hors circuit.

Un essai a été effectué dans les conditions suivantes sur une eau très faiblement contaminée (2 Escherichia coli/100 ml) : 35 - diamètre de la cellule : 2,3 cm, - nature des électrodes 3 et 4 : grille de platine à ouverture de maille: de 250 microns, en double épaisseur , t 9.

- distance entre ces électrodes : 1 cm, - différence de potentiel appliquée entre les électrodes 3 et 4 : 2 volts, - vitesse de passage : 240 cm3/cm2 de surface 5 d'électrode/heure, - température de thermostatisation pendant la phase de culture de la méthode de Wilkins : 44°C,

La durée de l'analyse effectuée en utilisant le procédé selon l'invention, puis en appliquant la méthode 10 de Wilkins est de 11 heures.

A titre de comparaison, la durée d'une analyse effectuée par la méthode du nombre le plus probable (méthode de la bactériologie classique) est de 96 heures et la durée de l'analyse effectuée par la méthode de Wilkins 15 appliquée directement à l'échantillon est de 15 heures 40 minutes.

On donnera ci-après des variantes possibles de réalisation et de fonctionnement.

a) Nature du matériau métallique constituant les 20 électrodes :

On peut utiliser tous les métaux ou alliages non corrodables dans les conditions de fonctionnement,du graphite ou du carbone conducteur de l'électricité, ainsi que tous les autres matériaux susceptibles de conduire 25 le courant électrique ou d'acquérir le potentiel électrique désiré : matériaux minéraux ou organiques échangeurs d'ions, b) Forme du matériau constituant les électrodes : A la place des grilles, on peut utiliser une 30 feuille métallique perforée ou un empilement de grains (par exemple des sphères).

c) Sens de circulation du fluide dans la cellule par rapport au système d'électrodes et au champ de la pesanteur : 35 L'écoulement peut être ascendant, descendant, latéral, ou être une combinaison de ces types d'écoulement.

♦ 10.

d) Nature du dispositif créant le champ électrique entre électrodes ou imposant le potentiel électrique de l'électrode opérant la séparation et la rétention des bactéries : 5 En plus des générateurs électriques extérieurs, on peut utiliser deux électrodes constituées de métaux différents entre lesquelles s'établira spontanément une différence de potentiel électrique.

e) Forme du signal électrique entre les électro- 10 des :

Le courant peut avoir un potentiel ou une intensité constante au cours du temps. Mais, il peut également avoir un caractère discontinu se définissant par sa fréquence, la forme du signal (triangulaire, carré, 15 sinusoïdal, etc.) et son amplitude.

f) Mode de réglage du potentiel entre électrodes: On peut utiliser un dispositif d'impédance électrique réglable intercalé entre le générateur de courant et les électrodes.

20 On peut également utiliser comme générateur de courant une alimentation électrique stabilisée en tension (réglable) ou en courant (réglable), ou un dispositif potentiostatique ou potentio-cinétique réglant la tension de l'électrode en fonction 25 de la tension d'une électrode de référence en agissant sur 1'intensité du courant placé entre les deux électrodes.

g) Possibilité d'utilisation des électrodes de la cellule pour réaliser ou faciliter les opérations de 30 nettoyage et stérilisation de la cellule - par application entre les électrodes d'un 4 potentiel électrique continu suffisant pour provoquer 1'électrolyse de l'eau et nettoyer les électrodes par les effets mécaniques (génération de bulles gazeuses) 35 et chimiques (production d'oxygène naissant à caractère oxydant et biocide), - ou encore par génération électrolytique in ♦ * 11 .

situ de réactifs stérilisants par passage d'une solution r adéquate (par exemple génération de chlore par électro- lyse d'une solution de chlorure de sodium).

Le procédé selon l'invention présente les avan-5 tages suivants : - Ce procédé permet de "concentrer" des bactéries à partir d'un volume d'eau pouvant être important (plusieurs litres ou dizaines de litres) comparativement aux échantillons habituellement traités, conduisant : 10 .à une réduction notable du temps de réponse de la méthode d'identification et de dénombrement des bactéries, . à une augmentation de la sensibilité de la méthode, une seule bactérie contenue dans plusieurs 15 litres de liquide pouvant être détectée.

- Ce procédé peut être utilisé sur des eaux contenant des particules en suspension et colloïdes sans risque de colmatage (contrairement aux membranes utilisées classiquement pour concentrer les bactéries par 20 filtration ou couplées à des méthodes instrumentales plus performantes,par exemple la méthode de Wilkins.

- Le nettoyage du dispositif est facile et celui-ci peut être réutilisé rapidement.

- En conséquence des trois points précédents, le 25 dispositif est facilement automatisable pour travailler de façon séquentielle sans intervention humaine.

- Le dispositif ainsi automatisé peut être lui-même couplé à un dispositif automatique d'identification et de numération des bactéries.

30 - Le dispositif n'est pas sélectif vis-à-vis des types de microorganismes ou germes pathogènes, la sélectivité étant assurée par la méthode d'identification et de numération, le dispositif est donc d'application générale.

35 - Bien que, par nature, le dispositif puisse être couplé à toute méthode d'identification et de numération des bactéries, sa conception le rend avantageusement couplable aux méthodes électrochimiques (telle * 12.

9 que par exemple celle de Wilkins) car l'électrode de Æ fixation et rétention des bactéries peut alors devenir électrode active dans le processus d'identification et numération.

5 Le procédé selon l'invention trouve des applica tions diverses : a) Applications analytiques

Ce procédé trouve une application en laboratoire pour la concentration des microorganismes (bacté- 10 ries, mais aussi levures, champignons, algues microscopiques, éventuellement virus) préalablement à leur identification et leur numération par des méthodes diverses en vue de diminuer les temps de réponse, notamment dans les laboratoires d'analyse des eaux potables; 15 pour le contrôle microbiologique de toutes les eaux naturelles (superficielles et souterraines, continentales et marines); pour le contrôle de denrées alimentaires liquides aqueuses (exemple: le lait); 20 pour les analyses biologiques et médicales sur des fluides biologiques (sang, urine,...).

Il trouve également une application dans des systèmes automatisés de contrôle de la contamination biologique des eaux en vue d'une détection précoce des 25 contaminations et de la prévention des risques sanitaires, notamment : - le contrôle des systèmes de captage, traitement, stockage, distribution des eaux potables, ainsi que des chaînes de production et conditionnement de liquides 30 alimentaires; - le contrôle sanitaire des eaux à usage théra- = peutique; - le contrôle des piscines et installations de loisirs utilisant l'eau; 35 - le contrôle de la qualité sanitaire des eaux de baignade (eaux douces et marines); - le contrôle et la protection des zones de pisciculture, conchyliculture, aquaculture et toutes zones ψ 13.

9 sensibles à la contamination microbiologique; - le contrôle continu d'eaux industrielles.

Selon les cas, ces systèmes peuvent fonctionner en continu ou de façon séquentielle à fréquence rapide.

5 b) Autres applications L'invention peut également être utilisée, à une échelle beaucoup plus grande pour la purification microbiologique de liquides, principalement de nature aqueuse en adaptant la configuration du système à des débits im-10 portants (substitution d'une rétention dans la masse à une rétention en surface).

Cette application est notamment intéressante lorsque l'usage ultérieur du liquide ne permet pas l'addition de réactifs chimiques stérilisants ou l'usage de 15 moyens thermiques (pasteurisation).

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Claims (6)

1. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'on utilise une électrode perforée et on fait passer la phase liquide à travers ladite électrode per- 10 forée.
2. 3. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que l'électrode est constituée par une grille.
3. 4. Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que l'on fait passer la phase liquide verticale- 15 ment à travers une cellule comportant deux électrodes superposées constituées par des grilles.
4. 5. Dispositif de séparation des bactéries pour la mise en oeuvre d'un procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce qu'il comprend 20 une enceinte, une électrode perforée remplissant la section entière de cette enceinte et des moyens pour faire passer de manière contrôlée une phase liquide contenant des bactéries à travers ladite électrode.
5. 6. Dispositif selon la revendication 5, caracté- 25 risé en ce qu'il comprend deux électrodes perforées su- „ perposées horizontalement et des moyens pour faire pas ser verticalement ladite phase liquide à travers les deux électrodes.
6. 7. Dispositif selon la revendication 5 ou 6,. ca- 30 ractérisé en ce que la ou les électrodes sont constituées 1 par des grilles.