LT6426B - Antisense oligonukleotide for prevention of bacterial biofilm and antibiotic resistance - Google Patents
Antisense oligonukleotide for prevention of bacterial biofilm and antibiotic resistance Download PDFInfo
- Publication number
- LT6426B LT6426B LT2015092A LT2015092A LT6426B LT 6426 B LT6426 B LT 6426B LT 2015092 A LT2015092 A LT 2015092A LT 2015092 A LT2015092 A LT 2015092A LT 6426 B LT6426 B LT 6426B
- Authority
- LT
- Lithuania
- Prior art keywords
- mutans
- sobrinus
- seq
- sequence
- bacteria
- Prior art date
Links
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 title claims abstract description 31
- 230000002265 prevention Effects 0.000 title claims abstract description 15
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 title claims abstract description 13
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 title description 19
- 241000194019 Streptococcus mutans Species 0.000 claims abstract description 73
- 241000193987 Streptococcus sobrinus Species 0.000 claims abstract description 53
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 22
- 239000000074 antisense oligonucleotide Substances 0.000 claims abstract description 12
- 238000012230 antisense oligonucleotides Methods 0.000 claims abstract description 12
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 26
- 229920001503 Glucan Polymers 0.000 claims description 21
- 229960000074 biopharmaceutical Drugs 0.000 claims description 19
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 18
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 18
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 claims description 17
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 17
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 14
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 14
- 101150116229 gtfB gene Proteins 0.000 claims description 14
- 239000000969 carrier Substances 0.000 claims description 8
- 229920006317 cationic polymer Polymers 0.000 claims description 8
- 101150035967 gtf3 gene Proteins 0.000 claims description 7
- 101150055890 gtfC gene Proteins 0.000 claims description 7
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 claims description 6
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 5
- 229920002444 Exopolysaccharide Polymers 0.000 claims description 4
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 claims description 3
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 claims description 3
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 claims description 2
- 230000000149 penetrating effect Effects 0.000 claims description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 abstract description 23
- 108020000948 Antisense Oligonucleotides Proteins 0.000 abstract description 7
- 230000001603 reducing effect Effects 0.000 abstract description 5
- 239000007787 solid Substances 0.000 abstract description 5
- 208000035143 Bacterial infection Diseases 0.000 abstract description 3
- 208000022362 bacterial infectious disease Diseases 0.000 abstract description 3
- 239000011521 glass Substances 0.000 abstract description 3
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 abstract description 3
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 35
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 34
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 34
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 20
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 17
- 108010055629 Glucosyltransferases Proteins 0.000 description 16
- 102000000340 Glucosyltransferases Human genes 0.000 description 16
- 230000032770 biofilm formation Effects 0.000 description 16
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 14
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 13
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 13
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 12
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 12
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 12
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 11
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 11
- 238000002367 polarised neutron reflectometry Methods 0.000 description 11
- 229920000636 poly(norbornene) polymer Polymers 0.000 description 11
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 11
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 10
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 8
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 7
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 7
- 229920002477 rna polymer Polymers 0.000 description 7
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 6
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 6
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 6
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 6
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 6
- 230000003746 surface roughness Effects 0.000 description 6
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 5
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 5
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 5
- 238000010149 post-hoc-test Methods 0.000 description 5
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 5
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 5
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 5
- 239000012096 transfection reagent Substances 0.000 description 5
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 4
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 4
- 108091093037 Peptide nucleic acid Proteins 0.000 description 4
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 4
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 4
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 4
- 238000011161 development Methods 0.000 description 4
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 4
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 4
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 4
- 238000001543 one-way ANOVA Methods 0.000 description 4
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 4
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 3
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 3
- 108091028664 Ribonucleotide Proteins 0.000 description 3
- 230000009471 action Effects 0.000 description 3
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 230000002921 anti-spasmodic effect Effects 0.000 description 3
- 230000010065 bacterial adhesion Effects 0.000 description 3
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 3
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 3
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 3
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 3
- 239000005547 deoxyribonucleotide Substances 0.000 description 3
- 125000002637 deoxyribonucleotide group Chemical group 0.000 description 3
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 3
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 3
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 3
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 3
- 239000002336 ribonucleotide Substances 0.000 description 3
- 125000002652 ribonucleotide group Chemical group 0.000 description 3
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 3
- 241000894007 species Species 0.000 description 3
- KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 7H-purine Chemical compound N1=CNC2=NC=NC2=C1 KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108020005544 Antisense RNA Proteins 0.000 description 2
- 208000024172 Cardiovascular disease Diseases 0.000 description 2
- 108700011259 MicroRNAs Proteins 0.000 description 2
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 2
- 108020004459 Small interfering RNA Proteins 0.000 description 2
- 206010061372 Streptococcal infection Diseases 0.000 description 2
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 2
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 2
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 2
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 2
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N cholesterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N 0.000 description 2
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 2
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 2
- 239000000412 dendrimer Substances 0.000 description 2
- 229920000736 dendritic polymer Polymers 0.000 description 2
- 208000002925 dental caries Diseases 0.000 description 2
- 230000009881 electrostatic interaction Effects 0.000 description 2
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 2
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 2
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 2
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 2
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 2
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 2
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 description 2
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 2
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 2
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 2
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 2
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 2
- 108010017836 1,3-alpha-D-glucan synthase Proteins 0.000 description 1
- KSXTUUUQYQYKCR-LQDDAWAPSA-M 2,3-bis[[(z)-octadec-9-enoyl]oxy]propyl-trimethylazanium;chloride Chemical compound [Cl-].CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(=O)OCC(C[N+](C)(C)C)OC(=O)CCCCCCC\C=C/CCCCCCCC KSXTUUUQYQYKCR-LQDDAWAPSA-M 0.000 description 1
- PIINGYXNCHTJTF-UHFFFAOYSA-N 2-(2-azaniumylethylamino)acetate Chemical group NCCNCC(O)=O PIINGYXNCHTJTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100038740 Activator of RNA decay Human genes 0.000 description 1
- 208000031729 Bacteremia Diseases 0.000 description 1
- 108700003860 Bacterial Genes Proteins 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 102000020313 Cell-Penetrating Peptides Human genes 0.000 description 1
- 108010051109 Cell-Penetrating Peptides Proteins 0.000 description 1
- 229920001661 Chitosan Polymers 0.000 description 1
- 229920000858 Cyclodextrin Polymers 0.000 description 1
- HMFHBZSHGGEWLO-SOOFDHNKSA-N D-ribofuranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H]1O HMFHBZSHGGEWLO-SOOFDHNKSA-N 0.000 description 1
- 229920002491 Diethylaminoethyl-dextran Polymers 0.000 description 1
- 101100114828 Drosophila melanogaster Orai gene Proteins 0.000 description 1
- 102100031780 Endonuclease Human genes 0.000 description 1
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 102000010834 Extracellular Matrix Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010037362 Extracellular Matrix Proteins Proteins 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 108091027305 Heteroduplex Proteins 0.000 description 1
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 1
- 101710203526 Integrase Proteins 0.000 description 1
- 108010044467 Isoenzymes Proteins 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 239000004952 Polyamide Substances 0.000 description 1
- 229920002873 Polyethylenimine Polymers 0.000 description 1
- CZPWVGJYEJSRLH-UHFFFAOYSA-N Pyrimidine Chemical compound C1=CN=CN=C1 CZPWVGJYEJSRLH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020004518 RNA Probes Proteins 0.000 description 1
- 239000003391 RNA probe Substances 0.000 description 1
- 108010057163 Ribonuclease III Proteins 0.000 description 1
- 102000003661 Ribonuclease III Human genes 0.000 description 1
- PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N Ribose Natural products OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N 0.000 description 1
- 241000194017 Streptococcus Species 0.000 description 1
- 241001521783 Streptococcus mutans UA159 Species 0.000 description 1
- 241000773031 Streptococcus sobrinus TCI-194 Species 0.000 description 1
- RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-N Thiophosphoric acid Chemical class OP(O)(S)=O RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- HMFHBZSHGGEWLO-UHFFFAOYSA-N alpha-D-Furanose-Ribose Natural products OCC1OC(O)C(O)C1O HMFHBZSHGGEWLO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000003277 amino acid sequence analysis Methods 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 description 1
- 230000003385 bacteriostatic effect Effects 0.000 description 1
- 238000003766 bioinformatics method Methods 0.000 description 1
- 229920001222 biopolymer Polymers 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 159000000007 calcium salts Chemical class 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000000748 cardiovascular system Anatomy 0.000 description 1
- 230000001013 cariogenic effect Effects 0.000 description 1
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 description 1
- 230000021164 cell adhesion Effects 0.000 description 1
- 238000007385 chemical modification Methods 0.000 description 1
- 235000012000 cholesterol Nutrition 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 239000003184 complementary RNA Substances 0.000 description 1
- 238000004590 computer program Methods 0.000 description 1
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 1
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000002939 deleterious effect Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 230000003831 deregulation Effects 0.000 description 1
- 230000000368 destabilizing effect Effects 0.000 description 1
- RTINQKRHLKCKBZ-UHFFFAOYSA-N diaminophosphinic acid;morpholine Chemical compound NP(N)(O)=O.C1COCCN1 RTINQKRHLKCKBZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MWRBNPKJOOWZPW-CLFAGFIQSA-N dioleoyl phosphatidylethanolamine Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(=O)OCC(COP(O)(=O)OCCN)OC(=O)CCCCCCC\C=C/CCCCCCCC MWRBNPKJOOWZPW-CLFAGFIQSA-N 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 1
- 230000002526 effect on cardiovascular system Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 210000002744 extracellular matrix Anatomy 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 238000001476 gene delivery Methods 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 108010076450 glucosyltransferase C Proteins 0.000 description 1
- 244000005702 human microbiome Species 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000000126 in silico method Methods 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 238000011005 laboratory method Methods 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000013011 mating Effects 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 244000005706 microflora Species 0.000 description 1
- 108010050062 mutacin GS-5 Proteins 0.000 description 1
- 239000002539 nanocarrier Substances 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 229940124276 oligodeoxyribonucleotide Drugs 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 1
- 230000000704 physical effect Effects 0.000 description 1
- 229920000962 poly(amidoamine) Polymers 0.000 description 1
- 229920000333 poly(propyleneimine) Polymers 0.000 description 1
- 229920002647 polyamide Polymers 0.000 description 1
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- MWWATHDPGQKSAR-UHFFFAOYSA-N propyne Chemical compound CC#C MWWATHDPGQKSAR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 108090000589 ribonuclease E Proteins 0.000 description 1
- HFHDHCJBZVLPGP-UHFFFAOYSA-N schardinger α-dextrin Chemical compound O1C(C(C2O)O)C(CO)OC2OC(C(C2O)O)C(CO)OC2OC(C(C2O)O)C(CO)OC2OC(C(O)C2O)C(CO)OC2OC(C(C2O)O)C(CO)OC2OC2C(O)C(O)C1OC2CO HFHDHCJBZVLPGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- -1 see D. Liu et al. Chemical class 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 208000010110 spontaneous platelet aggregation Diseases 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 230000001360 synchronised effect Effects 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 1
- 230000000451 tissue damage Effects 0.000 description 1
- 231100000827 tissue damage Toxicity 0.000 description 1
- 239000007078 todd-hewitt medium Substances 0.000 description 1
- 230000000699 topical effect Effects 0.000 description 1
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 1
- 230000009752 translational inhibition Effects 0.000 description 1
Landscapes
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Abstract
Description
Šis išradimas yra mikrobiologijos srities ir yra susijęs su bakterinių bioplėvėlių atsiradimu ir augimu ant žmogaus audinių. Šis išradimas konkrečiai susijęs su streptokokų sukeltų bakterinių infekcijų, pasižyminčių bakterinių bioplėvėlių formavimusi ant žmogaus audinių, prevencija ir gydymu, taip pat streptokokų atsparumo antibiotikams prevencija, panaudojant priešprasminį oligonukleotidą ir farmacines kompozicijas jo pagrindu.The present invention is in the field of microbiology and relates to the appearance and growth of bacterial biofilms on human tissues. The present invention relates in particular to the prevention and treatment of bacterial infections caused by streptococci, characterized by the formation of bacterial biofilms on human tissues, as well as the prevention of streptococcal antibiotic resistance by use of antisense oligonucleotide and pharmaceutical compositions based thereon.
Išradimo pagrindasBackground of the Invention
Vienas iš žmogaus infekcijų šaltinių yra normaliąją žmogaus mikroflorą sudarantys streptokokai. Tarp jų išskirtinos rūšys yra S. mutans ir S. sobrinus, įprastai randami žmogaus burnoje. Šių rūšių streptokokai be kita ko geba suformuoti vandenyje netirpią bakterinę bioplėvelę ant burnos audinių paviršiaus. Šių bakterijų formuojamos biologinės plėvelės struktūrinį karkasą sudaro netirpus polimeras - gliukanas, kurį iš sacharozės sintezuoja kelių tipų gliukoziltransferazės (Gtf) izofermentai, t. y. S. mutans GtfB ir GtfC bei S. sobrinus Gtfl (Bowen ir Koo. Biology of Streptococcus mutansderived glucosyltransferases: role in extracellular matrix formation of cariogenic biofilms. Caries Res. 45 (2011), p. 69-86). Gliukoziltransferazės lokalizuojasi ne tik ant bakterijų sienelės, bet ir yra išskiriamos į aplinką laisvoje formoje. Dėl šių fermentų veiklos S. mutans, S. sobrinus ir kitos burnos bakterijos gali tvirtintis praktiškai prie bet kokių paviršių, tarp jų žmogaus audinių, nes susidarantis gliukanas savo fizinėmis savybėmis yra labai lipni medžiaga. Todėl Gtf fermentai tapę svarbiu taikiniu kuriant įvairias farmakologiškai aktyvias medžiagas, slopinančias S. mutans bei S. sobrinus bakterijų adheziją.One of the sources of human infections is the streptococci that make up the normal human microflora. Among these, distinguished species are S. mutans and S. sobrinus, commonly found in the human mouth. These types of streptococci are able, among other things, to form a water-insoluble bacterial biofilm on the surface of oral tissues. The structural backbone of the biofilm formed by these bacteria consists of insoluble polymer glucan, which is synthesized from sucrose by several types of glucosyltransferase (Gtf) isoenzymes, i. y. S. mutans GtfB and GtfC and S. sobrinus Gtfl (Bowen and Koo. Biology of Streptococcus Mutansderived Glucosyltransferases: Role in Extracellular Matrix Formation of Cariogenic Biofilms. Caries Res. 45 (2011), pp. 69-86). Glucosyltransferases are not only localized on the bacterial wall but are also released into the environment in free form. Due to the action of these enzymes, S. mutans, S. sobrinus, and other oral bacteria can attach to virtually any surface, including human tissues, because the glucan formed is a highly tacky substance by its physical properties. Therefore, Gtf enzymes have become an important target for the development of various pharmacologically active substances that inhibit the adhesion of S. mutans and S. sobrinus bacteria.
Dėl kasdienių burnos audinių pažeidimų, kitų patologinių būsenų, taip pat atliekant medicinines intervencijas burnoje, sukeliančias reikšmingą bakteriemiją, S. mutans bei S. sobrinus patenka į žmogaus kraują ir kardiovaskulinę sistemą (Nakano ir kt. Streptococcus mutans and cardiovascular diseases. J. Dent. Sci. Rev. 44 (2008), p. 29-37).As a result of daily oral tissue damage, other pathological conditions, as well as oral medical interventions leading to significant bacteremia, S. mutans and S. sobrinus enter the human blood and cardiovascular system (Nakano et al., Streptococcus mutans and cardiovascular diseases. J. Dent. Sci. Rev. 44 (2008), pp. 29-37).
Burnos streptokokai yra susiję su burnos, nosiaryklės, odos, kardiovaskulinės sistemos ir kitomis žmogaus bakterinėmis infekcijomis.Oral streptococci are associated with oral, nasopharyngeal, skin, cardiovascular and other human bacterial infections.
S. mutans ir S. sobrinus infektiškumas susijęs su šių bakterijų išskiriamų gliukoziltransferazių veikla - gliukano sinteze. Tyrimais nustatyta, kad S. mutans padermės, turinčios defektus gtfB ir gtfC genuose, pasižymi ryškiai mažesnėmis savybėmis sukelti trombocitų agregaciją kraujyje palyginus su normaliomis („laukinėmis“) S. mutans bakterijomis (Taniguchi ir kt. Defect of glucosyltransferases reduces platelet aggregation activity of Streptococcus mutans: Analysis of clinical strains isolated from orai cavities. Arch. Orai Biol. 55 (2010), p. 410-416). Taigi streptokokų gliukoziltransferazių raiškos slopinimas praktiškai infekcijų prevencijai, tarp jų dantų ėduonies, širdies bei kraujagyslių ligų prevencijai.Infectivity of S. mutans and S. sobrinus is related to the activity of glucosyltransferases secreted by these bacteria - glucan synthesis. Studies have shown that S. mutans strains that have defects in the gtfB and gtfC genes exhibit markedly lower levels of platelet aggregation than normal ("wild") S. mutans bacteria (Taniguchi et al., Defect of glucosyltransferases). mutans: Analysis of clinical strains isolated from orai cavities (Arch. Oral Biol. 55 (2010), pp. 410-416). Thus, the inhibition of streptococcal glucosyltransferase expression is practically prevented in the prevention of infections, including tooth decay, cardiovascular disease.
Be to, bakterinės bioplėvelės yra susijusios su atsparumu įprastiems antibiotikams. Didesnis bakterinės bioplėvelės kiekis koreliuoja su atsparumo antibiotikams didėjimu, todėl bakterinių bioplėvelių sintezės inhibicija didina bakterijų jautrumą antibiotikams.In addition, bacterial biofilms are associated with resistance to conventional antibiotics. Higher levels of bacterial biofilms correlate with an increase in antibiotic resistance, so inhibition of bacterial biofilm synthesis increases bacterial susceptibility to antibiotics.
Čia aprašytas patentuojamas išradimas pateikia būdą kaip užslopinti ir/arba sumažinti S. mutans ir S. sodrinus bakterinės plėvelės formavimąsi. Šis metodas remiasi priešprasminių oligonukleotidų (PO), selektyviai slopinančių S. mutans gftB ir gtfC bei S. sodrinus gtfl genų raišką, panaudojimu. Taip slopinant gliukoziltransferazių ir tolimesnėje pasėkoje gliukano sintezę. Gliukano sintezės inhibicija užkerta kelią bakterinės bioplėvelės susidarymui, kurie savo ruožtu sąlygoja S. mutans ir S. sodrinus sukeltų infekcijų, profilaktiką bei prevenciją, taip pat didina šių bakterijų jautrumą antibiotikams.The patentable invention described herein provides a method of inhibiting and / or reducing bacterial film formation in S. mutans and S. enrichment. The method relies on the use of antisense oligonucleotides (POs), which selectively inhibit the expression of S. mutans gftB and gtfC and S. saturrinus gtfl genes. This inhibits the synthesis of glucosyltransferases and, consequently, glucan. Inhibition of glucan synthesis prevents the formation of bacterial biofilms, which in turn lead to the prevention and prevention of infections caused by S. mutans and S. saturrinus and increase their susceptibility to antibiotics.
Apibendrinant išdėstytą, patentuojamas PO ir būdas kompleksiškai sprendžia streptokokų infekcijų profilaktikos, prevencijos ir atsparumo antibiotikams problemas.To sum up, the patented PO and method address complexly the prevention, prevention, and antibiotic resistance of streptococcal infections.
Išradimo esmėThe essence of the invention
Kaip aptarta aukščiau, yra aktualus poreikis spręsti streptokokų infekcijų profilaktikos, prevencijos ir gydymo problemas, kurias sukelia bakterijos patekusios j kraujotakos sistemą ir kitus objektus, kurie kontaktuoja su gyvais audiniais. Šis išradimas apima medžiagas ir būdą, kurie sprendžia šias problemas.As discussed above, there is an urgent need to address the prevention, prevention, and treatment of streptococcal infections caused by bacteria entering the circulatory system and other objects that come into contact with living tissues. The present invention encompasses materials and methods that solve these problems.
Pagrindinis patentuojamas išradimo objektas yra medžiaga - izoliuotas priešprasminis oligonukleotidas (PO), atitinkantis šiuos požymius:The main subject-matter of the invention is a material, an isolated antisense oligonucleotide (PO), which has the following features:
a) PO sudarytas iš nukleotidų sekų pagal SEQ ID nr. 1;a) The PO consists of the nucleotide sequences of SEQ ID NO. 1;
b) PO sudaryti iš nukleotidų sekų, kurie yra SEQ ID nr. 1 fragmentas.b) the PO consists of the nucleotide sequences set forth in SEQ ID NO. Fragment 1.
Taip pat išradimo objektas yra PO, bet kuria iš aukščiau nurodytų formų, panaudojami atsparumo antibiotikams prevencijai.The invention also relates to POs, in any of the above forms, for use in the prevention of antibiotic resistance.
Taip pat išradimo objektas yra PO, kurių nukleotidų sekos skiriasi nuo SEQ ID nurodytos SEQ ID nr. 1 vienu, dviem, trimis arba keturiais nukleotidais.The invention also relates to POs having nucleotide sequences different from SEQ ID NO. 1 by one, two, three or four nucleotides.
PO, bet kuria iš aukščiau nurodytų formų, gali būti konjuguoti su peptidu palengvinančiu prasiskverbimą per bakterijos ląstelės sienelę.The PO, in any of the above forms, may be conjugated to a peptide to facilitate penetration through the bacterial cell wall.
Taip pat išradimo objektas yra biofarmacinė kompozicija, kurią sudaro PO, bet kuria iš aukščiau nurodytų formų, ir kitos dalys, skirta biofarmaciniam ir medicininiam panaudojimui.The invention also relates to a biopharmaceutical composition comprising a PO in any of the above forms and other parts for biopharmaceutical and medical use.
Taip pat išradimo objektas yra biofarmacinė kompozicija, kurią sudaro PO, bet kuria iš aukščiau nurodytų formų, ir kitos dalys, tarp jų biofarmacijoje naudojami adjuvantai ir/ar nešėjai.The present invention also relates to a biopharmaceutical composition comprising a PO in any of the above forms and other components including adjuvants and / or carriers used in biopharmaceuticals.
Taip pat išradimo objektas yra biofarmacinė kompozicija, kurią sudaro PO, bet kuria iš aukščiau nurodytų formų, ir kitos dalys, kurioje naudojamas nešėjas yra katijoninis polimeras.The present invention also relates to a biopharmaceutical composition comprising a PO in any of the above forms and other parts wherein the carrier is a cationic polymer.
Taip pat išradimo objektas yra biofarmacinė kompozicija, kurią sudaro PO, bet kuria iš aukščiau nurodytų formų, ir kitos dalys, skirta aplinkos ir įvairių butinių paviršių apdorojimui, siekiant antibakterinio poveikio nukreipto į S. mutans ir S. sobrinus ant tokių paviršių.The present invention also relates to a biopharmaceutical composition comprising PO in any of the above forms and other parts for treating the environment and various flat surfaces for antibacterial activity against S. mutans and S. sobrinus on such surfaces.
Taip pat išradimo objektas yra biofarmacinė kompozicija, kurią sudaro PO, bet kuria iš aukščiau nurodytų formų, ir kitos dalys, skirta aplinkos ir įvairių butinių paviršių apdorojimui, siekiant sumažinti bakterinių bioplėvelų atsiradimą ir augimą.The present invention also relates to a biopharmaceutical composition comprising a PO in any of the above forms and other parts for treating the environment and various flat surfaces to reduce the occurrence and growth of bacterial biofilms.
Taip pat išradimo objektas yra biofarmacinė kompozicija, kurią sudaro PO, bet kuria iš aukščiau nurodytų formų, ir kitos dalys, skirta aplinkos ir įvairių butinių paviršių apdorojimui, siekiant padidinti S. mutans ir S. sobrinus bakterijų jautrumą antibiotikams.The present invention also relates to a biopharmaceutical composition comprising PO in any of the above forms and other parts for treating the environment and various flat surfaces to increase the sensitivity of S. mutans and S. sobrinus to antibiotics.
Galiausiai išradimas apima S. mutans ir S. sobrinus bakterijų kolonijų kontrolės būdą, kuris apima šių bakterijų gebėjimo sintetinti bioplėvelių karkasą sudarančių egzopolisacharidų slopinimą, panaudojant PO, specifiškai ir vienu metu slopinančio gtfB ir gtfC iRNR raišką S. mutans bakterijoje ir gtfl iRNR raišką S. sobrinus bakterijoje, administravimą, taip vienu metu slopinant šių bakterijų gebėjimą sintezuoti vandenyje netirpių gliukanų ir dalinai vandenyje tirpių gliukanų polimerus.Finally, the invention encompasses a method of controlling bacterial colonies in S. mutans and S. sobrinus, which comprises inhibiting the ability of these bacteria to synthesize exopolysaccharides forming biofilm backbone by using PO specifically and simultaneously inhibiting gtfB and gtfC iRNA expression in S. mutans and gtfl iRNA expression in S. administration of the bacterium, thereby inhibiting simultaneously the ability of these bacteria to synthesize polymers of water-insoluble glucans and partially water-soluble glucans.
Iliustracijų aprašymaiIllustrations of illustrations
Priedas 1. PO sekų sąrašas ir aprašymas.Appendix 1. List and description of PO sequences.
Fig. 1. Maišytos S. mutans ir S. sobrinus kultūrų bioplėvelės profilometrijos kiekybiniai duomenys po 24 vai. inkubacijos periodo Todd Hevvitt mitybinėje terpėje su tiriamos sekos PO ir kontrole.FIG. 1. Quantitative data of biofilm profiling of mixed S. mutans and S. sobrinus cultures after 24 h. of the incubation period in Todd Hevvitt's medium with test sequence PO and control.
Fig. 1A- streptokokų bioplėvelės paviršiaus šiurkštumas (Rq).FIG. 1A- surface roughness (Rq) of streptococcal biofilm.
Fig. 1B - streptokokų bioplėvelės storis. *p < 0,05 palyginus su nepaveiktomis bakterijomis; “p < 0,05 palyginus su kontrole (išmaišytos sekos PO).FIG. 1B - Streptococcal biofilm thickness. * p <0.05 compared to unaffected bacteria; P <0.05 versus control (PO of mixed sequences).
Duomenys (n = 5-6) yra vidurkiai ± vidurkio standartinė paklaida.Data (n = 5–6) are means ± standard error of the mean.
SPSS programos (versija 20.0) One-Way Anova, LSD Post-Hoc testas.SPSS Programs (Version 20.0) One-Way Anova, LSD Post-Hoc Test.
Fig. 2. Maišytos S. mutans ir S. sobrinus kultūrų bioplėvelės profilometrijos kiekybiniai duomenys po 24 vai. inkubacijos periodo Todd Hevvitt mitybinėje terpėje, turinčioje seilių (1:10), su tiriamu PO.FIG. 2. Quantitative data of biofilm profiling of mixed S. mutans and S. sobrinus cultures after 24 h. incubation period in Todd Hevvitt's saliva (1:10) medium with test PO.
Fig. 2A - streptokokų bioplėvelės paviršiaus šiurkštumas (Rq).FIG. 2A - surface roughness (Rq) of streptococcal biofilm.
Fig. 2B - streptokokų bioplėvelės storis. *p < 0,05 palyginus su nepaveiktomis bakterijomis; “p < 0,05 palyginus su kontrole (išmaišytos sekos PO).FIG. 2B - Streptococcal biofilm thickness. * p <0.05 compared to unaffected bacteria; P <0.05 versus control (PO of mixed sequences).
Duomenys (n = 5-6) yra vidurkiai ± vidurkio standartinė paklaida.Data (n = 5–6) are means ± standard error of the mean.
SPSS programos (versija 20.0) One-VVay Anova, LSD Post-Hoc testas.SPSS Programs (Version 20.0) One-VVay Anova, LSD Post-Hoc Test.
Fig. 3. Maišytos S. mutans ir S. sobrinus kultūrų bioplėvelės profilometrijos kiekybiniai duomenys po 24 vai. inkubacijos periodo Todd Hevvitt mitybinėje terpėje, turinčioje 10% kraujo serumo, su tiriamos sekos PO.FIG. 3. Quantitative data of biofilm profiling of mixed S. mutans and S. sobrinus cultures after 24 h. incubation period in Todd Hevvitt's medium containing 10% serum with the PO of the test sequence.
Fig. 3A - streptokokų bioplėvelės paviršiaus šiurkštumas (Rq).FIG. 3A - surface roughness (Rq) of streptococcal biofilm.
Fig. 3B - streptokokų bioplėvelės storis. *p < 0,05 palyginus su nepaveiktomis bakterijomis; “p < 0,05 palyginus su kontrole (išmaišytos sekos PO).FIG. 3B - Streptococcal biofilm thickness. * p <0.05 compared to unaffected bacteria; P <0.05 versus control (PO of mixed sequences).
Duomenys (n = 5-6) yra vidurkiai ± vidurkio standartinė paklaida.Data (n = 5–6) are means ± standard error of the mean.
SPSS programos (versija 20.0) One-Way Anova, LSD Post-Hoc testas.SPSS Programs (Version 20.0) One-Way Anova, LSD Post-Hoc Test.
Sąvokų apibrėžimaiDefinitions
Šiame dokumente naudojama sąvoka “priešprasminis poveikis” reiškia oligonukleotido poveikį, kuris susidaro po to, kai sudaromas junginys su papildoma seka, esančia iRNR, lemiantis specifinį geno raiškos ir baltymo transliacijos slopinimą.As used herein, the term "antisense effect" refers to the effect of an oligonucleotide that results from the formation of a compound with an additional sequence contained in an iRNA that results in specific inhibition of gene expression and protein translation.
Šiame dokumente naudojama sąvoka priešprasminiai oligonukleotidai (PO) reiškia preparatus, kurie yra chemiškai modifikuotos arba nemodifikuotos viengubos nukleorūgšties molekulės (paprastai 15-30 nt ilgio), galinčios selektyviai jungtis su savo taikiniu iRNR sekoje pagal Watson-Crick susiporavimo principą. PO-iRNR heterodupleksų formavimasis sąlygoja šiuos efektus:The term antisense oligonucleotides (PO), as used herein, refers to preparations that are chemically modified or unmodified single nucleic acid molecules (typically 15-30 nt in length) that can selectively bind to their target in the iRNA sequence according to the Watson-Crick mating principle. The formation of PO-iRNA heteroduplexes results in the following effects:
1) aktyvuojama RNazė H endonukleazė arba bakterijų endoribonukleazės RNazė III ir RNazė E - lemiančios iRNR degradaciją, tačiau paliekant PO nepažeistą;1) activation of RNase H endonuclease or bacterial endoribonuclease RNase III and RNase E - leading to degradation of the iRNA but leaving the PO intact;
2) sąlygojama transliacijos inhibiciją per ribosomų veiklos sferinį blokavimą;2) caused by translational inhibition through spherical blocking of ribosome activity;
3) slopinamas iRNR susijungimas;3) inhibiting iRNA binding;
4) destabilizuojamas iRNR pirmtakas.4) destabilizing the iRNA precursor.
Kuris efektas pasireikš, priklauso nuo PO cheminės struktūros ir hibridizacijos vietos, tačiau vėlesni rezultatai yra konkretaus geno-taikinio raiškos ir baltymų transliacijos derereguliacija.Which effect will occur depends on the chemical structure of the PO and the site of hybridization, but subsequent results are deregulation of specific gene-target expression and protein translation.
“Nukleotidų seka”, “nukleorūgštis“, „nukleorūgšties grandinė“ ir „nukleorūgšties seka“ reiškia, kad bet kas, kas jungiasi arba hibridizuojasi per bazių susijungimą įskaitant oligomerus arba polimerus, turinčius pagrindą, suformuotą iš natūraliai atsirandančių nukleotidų, tokių kaip DNR (dezoksiribonukleino rūgštis) arba RNR (ribonukleorūgštis) ir/arba nukleorūgšties analogai, susidedantys iš nestandartinių nukleobazių ir/arba nestandartinių karkasų, pavyzdžiui, peptidinė nukleorūgštis (PNR) arba užrakinta nukleorūgštis (UNR), arba be kokia išvestinė arba modifikuota nukleorūgšties forma, tame tarpe ir pakeitimai siekiant padidinti stabilumą ir atsparumą nukleazėms."Nucleotide sequence", "nucleic acid", "nucleic acid chain", and "nucleic acid sequence" means any one which binds or hybridizes through base fusion including oligomers or polymers based on naturally occurring nucleotides, such as DNA (deoxyribonucleotides). acid) or RNA (ribonucleic acid) and / or nucleic acid analogues consisting of non-standard nucleobases and / or non-standard backbones, such as peptide nucleic acid (PNR) or locked nucleic acid (UNR), or any derivative or modified nucleic acid, to increase the stability and resistance to nucleases.
Šiame dokumente naudojama sąvoka “peptidinė nukleorūgštis“ arba „PNR“ reiškia sintetinį oligomerą arba polimerą, turintį poliamido pagrindą su prisijungusiomis nukleobazėmis (atsirandančiomis natūraliai arba modifikuojamomis), įskaitant, bet neapsiribojant, bet kokie oligomerų ar polimerų segmentai nurodyti ar įvardinti kaip peptidinės nukleorūgštys JAV Pat. Nr. 5539082, 5527675, 5623049, 5714331, 5718262, 5736336, 5773571, 5766855, 5786461, 5837459, 5891625, 5972610, 5986053, 6107470 6201103, 6228982 ir 6357163, VV096/04000, kurie visi yra įtraukti kaip nuorodos arba yra naudojami kaip nuorodos kituose cituotuose dokumentuose. Prisijungusi nukleobazė, pavyzdžiui, purino ar pirimidino bazė PNR gali būti prijungta prie karkaso naudojantis viena iš jungčių apibūdintų PCT/US02/30573 ar bet kurioje kitoje nuorodoje, esančioje šiame dokumente. Jame PNR turi N-(2-aminoetilo)-glicino) pagrindą. PNR gali būti susintetinta (ir vizualiai paženklinta) kaip minima PCT/US02/30573 arba jame cituotose nuorodose. PNR stipriai jungiasi ir tai atlieka specifinio eiliškumo tvarka, su DNR ir RNR, nes PNR karkasas neturi krūvio. Taigi, trumpi PNR zondai gali demonstruoti panašią specifiką su ilgesniais DNR ir RNR zondais. PNR zondai taip pat gali rodyti didesnį detalumą prisijungiant prie papildomos DNR ar RNR.As used herein, the term "peptide nucleic acid" or "PNR" means a synthetic oligomer or polymer based on a polyamide with attached nucleobases (whether naturally occurring or modified), including, but not limited to, any segments of oligomers or polymers designated or designated as U.S. Patient Nucleic Acids . No. 5539082, 5527675, 5623049, 5714331, 5718262, 5736336, 5773571, 5766855, 5786461, 5837459, 5891625, 5972610, 5986053, 6107470, 6201103, 6228982 and 6357163, all of which are incorporated by reference or incorporated by reference in WO096 / 04000 in the documents. A bound nucleobase, such as a PNR base of purine or pyrimidine, can be linked to the backbone by using one of the linkages described in PCT / US02 / 30573 or any other reference herein. It contains an N- (2-aminoethyl) -glycine) backbone. The PNR can be synthesized (and visually labeled) as mentioned in PCT / US02 / 30573 or references cited therein. PNR binds strongly and does so in a specific order, with DNA and RNA, since the PNA backbone is not charged. Thus, short PNR probes may exhibit similar specificities with longer DNA and RNA probes. PNR probes can also show greater detail in binding to additional DNA or RNA.
Šiame dokumente naudojama sąvoka „užrakinta nukleorūgštis“ arba „UNR“ reiškia oligomerą arba polimerą, sudarytą bent iš vieno ar kelių UNR subvienetų.As used herein, the term "locked nucleic acid" or "UNR" refers to an oligomer or polymer composed of at least one or more UNR subunits.
Šiame dokumente naudojama sąvoka „UNR subvienetas“ reiškia ribonukleotidą, kuriame yra metileno tiltas, jungiantis 2’-deguonies ribozę su 4’-anglimi (žr. Kurreck Antisense technologies. Improvement through novel Chemical modifications. (Eur J Biochem 270 (2003). 1628-1644 p.)).As used herein, the term "UNR subunit" refers to a ribonucleotide containing a methylene bridge linking a 2'-oxygen ribose to a 4'-carbon (see Kurreck Antisense Technologies. Improvement through Novel Chemical Modifications. Eur J Biochem 270 (2003) 1628 Pp. -1644)).
Nukleino rūgščių ir nukleino rūgščių analogų pavyzdžiai, naudojam kaip izoliuotas PO, taip pat apima oligomerų ir nukleotidų monomerų polimerus, tarp jų dvigubi irviengubi deoksiribonukleotidai (DNR), ribonukleotidai (RNR) tarp jų natūraliai susiformuojančios priešprasminės RNR molekulės, tokios kaip mikroRNR (miRNR) ir mažos trukdančios (interferuojančios) RNR (siRNR), randamos eukariotinėse ląstelėse, taip pat mažos priešprasminės RNR, randamos prokariotinėse ląstelėse (bakterijose), anomerinės jų formos, natūralūs ir sintetiniai analogai ir kita. Nukleorūgšties grandinė gali būti sudaryta vien tik iš deoksiribonukleotidų, ribonukleotidų, peptidinių nukleorūgščių (PNR), užrakintų nukleorūgščių (UNR), natūralių ar sintetinių analogų, tokių kaip fosforodiamidato morfolino ir tiofosforoamidato oligonukleotidai, ar jų mišiniai. DNR, RNR ir kitos natūralios ar šiame dokumente apibūdintos sintetinės nukleo rūgštys gali būti naudojamos metoduose ir išradimo kompozicijose.Examples of nucleic acids and nucleic acid analogues used as isolated PO also include oligomer and nucleotide monomer polymers, including double and single deoxyribonucleotides (DNA), ribonucleotides (RNA) between naturally occurring antisense RNA molecules (such as microRNAs) and microRNAs. small interfering RNAs (siRNAs) found in eukaryotic cells, as well as small antisense RNAs found in prokaryotic cells (bacteria), anomeric forms thereof, natural and synthetic analogues, and others. The nucleic acid chain may consist solely of, or mixed with, deoxyribonucleotides, ribonucleotides, peptide nucleic acids (PNRs), locked nucleic acids (UNRs), natural or synthetic analogs such as phosphorodiamidate morpholine and thiophosphoroamidate oligonucleotides. DNA, RNA and other natural or synthetic nucleic acids described herein may be used in the methods and compositions of the invention.
Naudojant terminą „farmaciškai tinkamas“, pavyzdžiui, percituojant „farmaciškai tinkamas nešėjas“ arba „farmaciškai tinkamas priedas“šiame dokumente norima pasakyti, kad medžiaga, kuri nėra biologiškai ar kaip nors kitaip nepageidaujama, t.y. medžiaga gali būti inkorporuota į farmacines kompozicijas, skiriamas pacientui, nesukeliant nepageidaujamų biologinių poveikių ar reaguojant į kitus komponentus, esančius kartu sudėtyje nesielgia žalingai. Be to, priedai ir nešėjai, esantys minimose sudėtyse, yra tinkami taikyti žmogaus audinių aplinkoje ir/ar kraujo terpėje nesukeliant jokio nepageidaujamo biologinio poveikio bei niekaip žalingai nereaguojant. Šiame dokumente yra pateikti tinkamų nešėjų ir priedų pavyzdžiai, kurių tarpe yra vanduo be nukleazių ar bet koks kitas reagentas, kurio pagalba yra suformuojamas kompaktiškas, stabilus, teigiamai įkrautas kompleksas su oligonukleotidu, skirtas saugoti nuo degradacijos ir padėti oligonukleotidui lengviau įsiskverbti į bakterijų ląsteles, pavyzdžiui, komerciškai prieinamas TurboFect™ transfekcijos reagentas ir katijoninis polimeras (Thermo Fisher Scientific, Fermentas).As used herein, the term "pharmaceutically acceptable", for example, "pharmaceutically acceptable carrier" or "pharmaceutically acceptable additive" is intended to mean that a substance that is not biologically or otherwise undesirable, e.g. the substance may be incorporated into pharmaceutical compositions for administration to the patient without causing adverse biological effects or in response to other components present in the composition without deleterious effects. In addition, the additives and carriers contained in said compositions are suitable for application to the human tissue environment and / or blood medium without causing undesirable biological effects and without causing any harmful reaction. This document provides examples of suitable carriers and additives, including nuclease-free water or any other reagent that forms a compact, stable, positively charged complex with an oligonucleotide to prevent degradation and facilitate the penetration of the oligonucleotide into bacterial cells, e.g. , a commercially available TurboFect ™ transfection reagent and a cationic polymer (Thermo Fisher Scientific, Enzyme).
Šiame dokumente vartojama sąvoka „nukleazių neturintis vanduo“ reiškia sterilų dejonizuotą vandenį, kuriame nėra jokio tipo nukleazių, galinčių skaidyti oligonukleotidus.As used herein, the term "nuclease-free water" refers to sterile deionized water that does not contain any type of nuclease capable of cleaving oligonucleotides.
Šiame dokumente vartojamas terminas „bioplėvelė“ reiškia bioplėvelę, sudarytą iš polisacharidų matricos, kurią sudaro daugiausia vandenyje netirpūs ir dalinai tirpūs gliukanai ir bakterijos, galinčios iš gliukozės monomerų sintezuoti polisacharidinius polimerus, sudarančius egzopolisacharidinę matricą.As used herein, the term "biofilm" refers to a biofilm consisting of a polysaccharide matrix composed primarily of water-insoluble and partially soluble glucans and bacteria capable of synthesizing polysaccharide polymers forming an exopolysaccharide matrix from glucose monomers.
Išsamus išradimo aprašymasDetailed Description of the Invention
Išradimas parodo naują būdą, skirtą bioplėvelių, tokių kaip bioplėvelė, besiformuojanti iš burnos streptokokų, ypač S. mutans ir S. sobrinus, ir bioplėvelių junginių ant kietų paviršių, pavyzdžiui stiklo ir žmogaus audinių, formavimosi mažinimui, slopinimui ar kelio tam užkirtimui.The present invention provides a novel method for reducing, inhibiting or inhibiting the formation of biofilms, such as biofilm, formed from oral streptococci, particularly S. mutans and S. sobrinus, and biofilm compounds on hard surfaces, such as glass and human tissue.
Šiam naujam būdui taikomas efektyvus priešprasminių oligonukleotidu (PO) poveikis, siekiant vienu metu nusitaikyti ir slopinti gliukozilransferazės iRNR išraišką kelių rūšių streptokokuose, ypač S. mutans ir S. sobrinus, tokių kaip gtfB ir gtfC glukoziltransferazės iRNR, esančias S. mutans ir gtfl iRNR S. sobrinus, lemiančių vandenyje netirpių ir iš dalies vandenyje tirpių gliukano polimerų gamybos ir bakterijų ląstelių sukibimo slopinimą S. mutans ir S. sodrinus kultūrose taip lemiant bioplėvelių mažinimą, slopinimą arba kelio užkirtimą jų formavimuisi. Minėtos kultūros gali būti in vitro kultūros arba in vivo kultūros, pvz., ant kitų kietų paviršių kontaktuojančių su žmogaus audiniais ir krauju.This novel method exerts an effective effect of antisense oligonucleotide (PO) to simultaneously target and inhibit glucosyl transferase iRNA expression in several species of streptococci, particularly S. mutans and S. sobrinus such as gtfB and gtfC glucosyltransferase iRNAs in S. mutans and gtfl. sobrinus, leading to inhibition of the production of water - insoluble and partially water - soluble glucan polymers and of bacterial cell adhesion in cultures of S. mutans and S. saturrinus, thus leading to reduction, inhibition or inhibition of biofilms. Said cultures may be in vitro cultures or in vivo cultures, for example, on other solid surfaces in contact with human tissues and blood.
Išradime patentuojamų naujų PO sekų sąrašas ir aprašymas pateiktas 1 priede.A list and description of the novel PO sequences patented by the invention is provided in Annex 1.
Minėti PO gali būti chemiškai sintetinami PNR formos nukleotidai, savo sekomis atitinkantys nukleotidų SEQ ID nr. 1 seką, priešprasminio efekto eksponavimui, kaip parodyta pavyzdyje, arba išradimo specifikacijoje nurodytas sąlygas atitinkantys PO fragmentai ar modifikacijos.Said POs may be chemically synthesized PNR-form nucleotides corresponding to SEQ ID NO. SEQ ID NO: 1 for displaying the antisense effect as exemplified or PO fragments or modifications meeting the conditions specified in the specification.
Gliukanų, sudarančių bioplėvelės egzopolisacharidinę matricą, matavimas gali būti atliktas kaip aprašyta pavyzdžiuose, kur rezultatai aiškiai parodo, kad bakterijų adhezija prie stiklo paviršiaus yra stipriai sumažinama su PO molekulėmis, kurių nukleotidų seka atitinka SEQ ID nr. 1.The measurement of glucans forming the biopolymer exopolysaccharide matrix can be carried out as described in the examples, where the results clearly show that bacterial adhesion to the glass surface is strongly reduced with PO molecules having the nucleotide sequence of SEQ ID NO. 1.
Bioplėvelės formavimosi mažėjimas rodo gliukano polimerų sintezės mažėjimą, nes gliukanai yra būtini bioplėvelių formavimuisi, o gliukanų nebuvimas lemia bioplėvelės nesiformavimą.The decrease in biofilm formation indicates a decrease in glucan polymer synthesis, since glucans are essential for biofilm formation and the absence of glucans leads to biofilm formation.
Taikiniai minėtuose S. mutans ir S. sobrinus genuose bei atitinkamai iRNR yra konservatyvūs - koduojančios nukleotidų sekos šių bakterijų genuose yra nekintančios. Todėl PO panaudojimas sumažina bakterijų gebėjimą kitais būdais sintetinti vandenyje netirpius ir dalinai tirpius gliukanus, kad būtų galima sukurti bioplėvelės polimerinę matricą.Targets in the aforementioned S. mutans and S. sobrinus genes and, respectively, the iRNAs are conservative - the coding nucleotide sequences in these bacterial genes are constant. Therefore, the use of PO reduces the ability of bacteria to otherwise synthesize water-insoluble and partially soluble glucans to form a biofilm polymeric matrix.
Pagal šį išradimą nauji PO, kurie pasiekia priešprasminj efektą, gali bet kokia kita šiame dokumente apibūdinta PO forma, ar jų fragmentai ar modifikacijos.According to the present invention, new POs which achieve the antispasmodic effect may be any other form of the PO described herein, or fragments or modifications thereof.
Trumpesnės sekos turi gali būti savarankiškai naudojamos nustatytiems bakterijų genomo taikiniams tarp gtfB ir gtfC S. mutans, taip pat S. sobrinus gtfl genų ir iRNR. Dėl termodinaminių savybių (tokių pačių kaip ir su PO SEQ ID nr. 1), šie trumpesni fragmentai atitinkamoje bakterijų genomo srityje gali formuoti heterodupleksus.Shorter sequences may be used independently for established bacterial genomic targets between gtfB and gtfC in S. mutans, as well as S. sobrinus gtfl genes and iRNAs. Due to their thermodynamic properties (similar to those of PO SEQ ID NO: 1), these shorter fragments can form heteroduplexes in the relevant region of the bacterial genome.
Gausus literatūroje pristatytų tyrimų, atliktų in vitro ir in vivo sąlygomis, skaičius demonstruoja, kad nuo 8 nt iki 30 nt ilgio nukleotidų sekų PO būdingas priešprasminis poveikis. Net ir PO su vienu nesutampančiu nukleotidu taip pat būdingas stiprus priešprasminis poveikis (žr. Hamel ir kt. „Inhibition of gene expression by anti-sense C-5 propyne oligonucleotides detected by a reporter enzyme“ (Biochem J 339 (1999), 547-553 p.); VVagner ir kt. „Potent and selective inhibition of gene expression by an antisense heptanucleotide“ (Nat Biotechnol 14 (1996), 840-844 p.); Fakler ir kt. „Short antisense oligonucleotide-mediated inhibition is stronglydependenton oligo length and concentration būt almost independent oflocation ofthe target sequence“ (J Biol Chem 269 (1994), 16187-16194 p.); Woolf ir kt. „Specificity of antisense oligonucleotides in v/Vo“(Proc Natl Acad Sci USA 89 (1992), 7305-7309 p.)).The large number of literature studies in vitro and in vivo demonstrate that POs from 8 nt to 30 nt in length have antisense effects. Even PO with a single mismatched nucleotide also exhibits potent antisense activity (see Hamel et al., "Inhibition of gene expression by anti-sense C-5 propyne oligonucleotides detected by a reporter enzyme" (Biochem J 339 (1999), 547- Wagner et al., "Potent and selective inhibition of gene expression by an antisense heptanucleotide" (Nat Biotechnol 14 (1996), pp. 840-844); Fakler et al., "Short antisense oligonucleotide-mediated inhibition is strongly dependent oligo length and concentration to be almost independent of the location of the target sequence "(J Biol Chem 269 (1994), 16187-16194); Woolf et al.," Specificity of antisense oligonucleotides in v / Vo "(Proc Natl Acad Sci USA 89 ( 1992), pp. 7305-7309).
PO sintezėPO Synthesis
Šiame išradime nurodytos naujos PO sekos gali būti sintetinamos ir modifikuojamos įvairiais būdais aprašytais literatūroje.The novel PO sequences of the present invention may be synthesized and modified in various ways described in the literature.
PO nešėjaiPO carriers
Šiame dokumente minimi PO gali būti efektyviau transportuojami į S. mutans ir S. sobrinus bakterijas (t.y., įsiskverbti per bakterijų ląstelės sienelę) naudojant nešėjus. Nešėjas gali būti transfekcijos reagentai ir katijoniniai polimerai, kurie yra žinomi. Visų PO formų su nešėju ar transfekcijos reagentu, sudarytu iš katijoninio polimero, pavyzdžiui, TurboFect™ (Thermo Fisher Scientific) gali būti naudojama tam, kad padidinti bakterijų PO įsisavinimą ir efektyviai padidinti bioplėvelės formavimosi S. mutans ir S. sobrinus inhibiciją.The POs mentioned in this document can be more efficiently transported to S. mutans and S. sobrinus bacteria (i.e., penetrate the bacterial cell wall) using carriers. The carrier may be the transfection reagents and cationic polymers known in the art. All forms of PO with carrier or transfection reagent consisting of a cationic polymer such as TurboFect ™ (Thermo Fisher Scientific) can be used to increase bacterial PO uptake and to effectively increase inhibition of S. mutans and S. sobrinus biofilm formation.
PNR formos PO SEQ ID nr. 1, naudojami bioplėvelės formavimosi slopinimui pademonstruoti ant kieto paviršiaus, parodant jų dėka pasiekiamą priešprasminį efektą.PNR Form PO SEQ ID NO. 1, used to demonstrate the inhibition of biofilm formation on a solid surface, demonstrating the antisense effect they provide.
Kiti nešėjai, naudojami įvairioms PO formoms, skirti PO įterpimui į eukariotines ir prokariotines ląsteles, gali būti įvairios cheminės medžiagos, galinčios sudaryti kompleksus su izoliuotais oligonukleotidais tam, kad apsaugoti juos nuo degradacijos ir pagerinti jų skvarbą į ląsteles. Šios medžiagos apima, bet neapsiriboja, kalcio druskos (pvz., kalcio fosfatas, kalcio chloridas), katijoniniai lipidai (ρνζ.,Ν(2,3dioleoiloksipropyl) N, N, N-trimetilamoniochloridas;Other carriers used for various forms of PO for insertion of PO into eukaryotic and prokaryotic cells may be various chemicals that can complex with isolated oligonucleotides to protect them from degradation and improve their cellular penetration. These materials include, but are not limited to, calcium salts (e.g., calcium phosphate, calcium chloride), cationic lipids (ρνζ., Ν (2,3dioleoyloxypropyl) N, N, N-trimethylammonium chloride;
dioleoilfosfatidiletanolaminas; cholesterolis), katijoniniai polimerai (pvz.,dietilaminoetilo dekstranas, polietileniminas, chitozanas, ciklodekstrinas, poliamidoamino dendrimerai, polipropilenimino dendrimerai), į ląsteles prasiskverbiantys peptidai (peptidai, paprastai turintys mažiau nei 30 amino rūgščių (pvz., penetratinas) ir skirtingų tipų nanodalelės (žr. D. Liu ir kt. „Chemical Methods for DNA Delivery“, Ed., E. C. Heiser, Volume 1 of Gene Delivery to Mammalian Cells (Methods Mol Biol 245 (2004), 3-23 p., Mumana Press Ine., Totowa, NJ); Zhu ir Mahato „Lipid andpolymeric carrier-mediated nucleic acid delivery“ (Expert Opin Drug Deliv 7 (2010), 1209-1226 p.); Bai ir kt. „Antisense antibioties: a brief review of novel target discovery and delivery“ (Curr Drug Discov Technol 7 (2010), 7685 p.); Yu ir kt. „Targeted delivery systems for oligonueleotide therapeuties” (AAPS J 11 (2009), 195-203 p.); Aalinkeel ir kt. „Quantum rods as nanocarriers ofgene therapy“ (Drug Deliv 19 (2012), 220-231 p.). Visi šie transfekcijos reagentai, išskyrus kalcio fosfatą, kuris formuoja kalcio-fosfato-DNR nuosėdas, veikia panašiai - jie sudaro junginius su oligonukleotidais per elektrostatinę sąveiką tarp neigiamo krūvio oligonukleotidų molekulių ir teigiamo krūvio reagento molekulių. Kadangi tokie kompleksai išlaiko teigiamą krūvį, jie gali susijungti su neigiamo krūvio eukariotinių ląstelių plazmine membrana ar bakterijos ląstelės sienele ir gali būti įsisavinti ląstelių.dioleoyl phosphatidylethanolamine; cholesterol), cationic polymers (e.g. diethylaminoethyl dextran, polyethyleneimine, chitosan, cyclodextrin, polyamidoamine dendrimers, polypropyleneimine dendrimers), intracellular peptides (peptides typically containing less than 30 amino acids (e.g. see D. Liu et al., Chemical Methods for DNA Delivery, Ed., EC Heiser, Volume 1 of Gene Delivery to Mammalian Cells (Methods Mol Biol 245 (2004), pp. 3-23, Mumana Press Ine. Totowa, NJ; Zhu and Mahato, "Lipid and Polymeric Carrier-Mediated Nucleic Acid Delivery" (Expert Opin Drug Deliv 7 (2010), pp. 1209-1226); Bai et al., "Antisense Antibiotics: A Brief Review of Novel Target Discovery" and delivery "(Curr Drug Discov Technol 7 (2010), p. 7685); Yu et al.," Targeted delivery systems for oligonucleotide therapies "(AAPS J 11 (2009), 195-203); Aalinkeel et al." Quantum rods as nanocarriers ofgene therapy ”(Drug Deliv 19 (2012), 22 0-231) All of these transfection reagents, except for calcium phosphate, which forms a calcium-phosphate-DNA precipitate, act in a similar way - they form compounds with oligonucleotides through electrostatic interactions between the negative charge oligonucleotide molecules and the positive charge reagent molecules. Because such complexes retain a positive charge, they may bind to the plasma membrane or bacterial cell wall of a negatively charged eukaryotic cell and may be absorbed by cells.
Plačiausiai naudojama transfekcijos reagentai PO pristatymui į bakterines ląsteles yra katijoniniai polimerai ir į ląsteles įsiskverbiantys peptidai, kurie yra naudojami visiems šiame dokumente minimiems PO, skirtingoms šiame dokumente minimoms PO formoms ir modifikacijoms. Svarbu akcentuoti, kad į ląsteles prasiskverbiantys peptidai yra pajėgūs įsiskverbti į ląsteles ne tik elektrostatinės sąveikos dėka, bet ir formuojant trumpalaikes poras ląstelių plazminėje membranoje (žr. Guo ir kt. „Treatment of Streptococcus mutans with antisense oligodeoxyribonucleotides to gtfB mRNA inhibits GtfB expression and funetion“ (FEMS Microbial Lett 264 (2006), 8-14 p.) efektyviam fosforotioatų formos PO pristatymas iki S. mutans bakterijų naudojant katijonų polimerą - So-Fast™ (Taiyangma).The most widely used transfection reagents for delivery of PO to bacterial cells are cationic polymers and intracellular peptides, which are used for all the POs mentioned in this document, different forms and modifications of the PO mentioned herein. It is important to emphasize that cell penetrating peptides are capable of penetrating cells not only through electrostatic interaction but also through the formation of transient pores in the cellular plasma membrane (see Guo et al. (FEMS Microbial Lett 264 (2006), pp. 8-14) Effective delivery of phosphorothioate-form PO to S. mutans bacteria using the cationic polymer So-Fast ™ (Taiyangma).
PanaudojimasApplication
Šis išradimas visomis savo išraiškomis suteikia priemones ir būdus bioplėvelės formavimosi ant audinių slopinimui be žymios įtakos S. mutans ir S. sobrinus bakterijų gyvybingumui. Išradime nurodytas būdas ir PO suteikia galimybę administruoti PO, atitinkančius SEQ nr. 1, j bakterinę kultūrą naudojant efektyvią koncentraciją tam, kad sumažinti S. mutans ir S. sobrinus adheziją, tarpusavio sukibimą ir bioplėvelės formavimąsi, bet be baktericidinio (bakterijas naikinančio) poveikio, kaip tai aiškiai pademonstruota su maišytomis S. mutans ir S. sobrinus kultūrų, Fig. 1 Airi B.The present invention, in all its forms, provides means and methods for inhibiting biofilm formation on tissues without significantly affecting the viability of S. mutans and S. sobrinus bacteria. The method and PO of the invention provide the ability to administer POs corresponding to SEQ ID NOs. 1, using bacterial culture at an effective concentration to reduce adhesion, adhesion and biofilm formation of S. mutans and S. sobrinus, but without bactericidal (bactericidal) effect, as clearly demonstrated with mixed S. mutans and S. sobrinus cultures. , FIG. 1 Airi B.
Išradimas leidžia naudoti PO, kurių seka yra SEQ ID nr. 1, arba šiame dokumente apibūdinto PO fragmentus, arba PO modifikacijas, pasiekiant priešprasminį efektą, bioplėvelių bei atsparumo antibiotikams prevencijai ir kontrolei, be reikšmingo poveikio žmogaus mikrobiomui.The invention allows the use of POs having the sequence of SEQ ID NO. 1, or fragments of the PO described herein, or modifications of the PO to achieve antispasmodic effect, for the prevention and control of biofilms and antibiotic resistance without significant effects on the human microbiome.
Kaip matoma, (Fig. 1A ir 1B), efektyvi PO koncentracija sumažina S. mutans ir S. sobrinus adheziją, bakterijų sukibimą ir bioplėvelės formavimąsi be išreikšto bakteriostatinio ir baktericidinio poveikio. Fig.3A ir 3B specifiškai parodyta efektyvios PO koncentracijos poveikį terpėje su kraujo serumu, tokiu būdu parodant poveikį gyviems žmogaus audiniams artimoje sistemoje.As can be seen (Figs. 1A and 1B), effective PO concentration reduces adhesion, bacterial adhesion and biofilm formation of S. mutans and S. sobrinus without any pronounced bacteriostatic and bactericidal activity. Figures 3A and 3B specifically show the effect of effective PO concentration in serum medium, thus demonstrating the effect on living human tissues in the immediate system.
Visų šiame dokumente nurodytų poveikių atžvilgiu šis išradimas atskleidžia naują būdą kontroliuoti ir užkirsti kelią bioplėvelių židiniams, naudojant PO, kurių sekos yra SEQ ID nr. 1, arba jo fragmentus ar modifikacijas, ir taip pasiekiant priešprasminį poveikį S. mutans ir S. sobrinus gliukoziltransferazių atžvilgiu. Šis naujas būdas suteikia įrankį bioplėvelės formavimosi slopinimui ant įvairių kietų paviršių. Kadangi bioplevėlės yra kliūtis antibiotikams paveikti bioplėvelę sintetinančias bakterijas, atitinkamai šis išradimas užkerta kelią ir atsparumui antibiotikams, kadangi dėl mažesnės bioplėvelės didėja antibiotikų poveikis bakterijoms.With respect to all of the effects disclosed herein, the present invention provides a novel way of controlling and preventing biofilm foci using POs having the sequence of SEQ ID NO. 1, or fragments or modifications thereof, thereby achieving an antisense effect on glucosyltransferases of S. mutans and S. sobrinus. This new method provides a tool for inhibiting biofilm formation on various hard surfaces. Because biofilms are an obstacle to antibiotic action on bacteria that synthesize biofilm, the present invention also prevents antibiotic resistance, since a smaller biofilm increases the effect of antibiotics on bacteria.
Išrastas naujas PO, kurio sekos SEQ ID nr. 1, arba visų šiame dokumente nurodytų PO fragmentai ar PO modifikacijos, gali būti naudojami kaip biofarmacinių kompozicijų (tirpalų, suspensijų ir pan.) dalys, gali būti įtraukti į biofarmacinių kompozicijų formules, suteikiant tiek vietinį, tiek sisteminį aktualų poveikį gyvam organizmui - žmogui, arba negyviems paviršiams kontaktuojantiems su gyvo organizmo audiniais ir krauju.A new PO having the sequence SEQ ID NO. 1, or any of the PO fragments or PO modifications referred to herein, may be used as parts of biopharmaceutical compositions (solutions, suspensions, etc.), may be incorporated into biopharmaceutical formulations, providing topical, systemic, human, human, or on inanimate surfaces in contact with living tissue and blood.
Šiame išradime atskleistas naujas PO, kurio SEQ ID nr. 1, arba jo fragmentai ar PO modifikacijos, geba susijungti su atitinkamomis Streptococcus mutans genomo dalimis koduojančiomis gliukoziltransferazę B ir gliukoziltransferazę C, ir šių gliukoziltransferazių iRNR vienu metu, taip pat su gliukoziltransferazę l iRNR S. sobrinus ir tokiu būdu slopinti gliukanų gamybą, sumažinant bioplėvelės formavimąsi, taip užkertant kelią bioplėvelės formavimuisi. Tikslas pasiekiamas veikiant šiame išradime apibrėžų PO molekulėms, kurios slopina gliukanų gamybą S. mutans ir S.The present invention provides a new PO having SEQ ID NO. 1, or fragments or PO modifications thereof, capable of binding to the respective portions of the Streptococcus mutans genome encoding glucosyltransferase B and glucosyltransferase C, and the simultaneous inhibition of these glucosyltransferases by iRNA, and the inhibition of lysine by S.R. , thus preventing biofilm formation. The object is achieved by the action of PO molecules as defined in the present invention which inhibit glucan production in S. mutans and S.
sobrinus, vienu metu taikantis į abiejų rūšių bakterijų gliukanų sintezės mechanizmus, su vieno tipo PO molekule.sobrinus, which targets both types of bacterial glucan synthesis simultaneously with a single type of PO molecule.
Be to, šiame išradime atskleisti nauji PO, kurių sekos SEQ ID nr. 1, arba visi šiame dokumente nurodytų PO fragmentai ar PO modifikacijos, užkerta kelią bakterijų adhezijai ir prikibimui prie kietų paviršių, tuo pačiu metu nesumažinant bakterijų gyvybingumo. Šis aspektas suteikia galimybę naudoti pateiktus PO kaip medžiagą kovai su infekcijomis, kuri reikšmingai nepaveikia žmogaus organizme esančios bakterijų ekosistemos - mikrobiomo.The present invention further provides novel POs having the sequence SEQ ID NO. 1, or any of the PO fragments or modifications of the PO herein, prevents bacterial adhesion and adherence to solid surfaces without at the same time reducing bacterial viability. This aspect allows the use of the POs provided as a substance to fight infections that do not significantly affect the microbiome of the bacterial ecosystem in the human body.
Šio išradimo rezultate sukurto naujo PO, kurių sekos SEQ ID nr. 1, bei jo fragmentų ar modifikacijų, efektas in vitro atitiko in silico sumodeliuotą poveikį į S.mutans ir S.sobrinus. Minėtas PO slopina S.mutans ir S.sobrinus gebėjimą sintezuoti bioplėvelės formavimuisi reikalingus gliukanus. Ne bioplėvelėje esančios bakterijos yra lengviau atpažįstamos ir eliminuojamos natūraliu keliu žmogaus imuninės sistemos, taip pat yra labiau paveikios įprastoms antibiotikų koncentracijoms.As a result of the present invention, a new PO having the sequence SEQ ID NO. 1, and fragments or modifications thereof, in vitro corresponded to the in silico modeled effect on S.mutans and S.sobrinus. Said PO inhibits the ability of S.mutans and S.sobrinus to synthesize the glucans required for biofilm formation. Non-biofilm bacteria are more easily recognized and eliminated naturally by the human immune system, and are more effective at normal antibiotic concentrations.
Atitinkamai, šis išradimas suteikia būdą ir priemones bioplėvelės slopinimui, mažinimui, taip pat užkerta kelią bioplėvelės židinių ant kietų paviršių in vitro ir in vivo atsiradimui bei atsparumo antibiotikams vystymuisi.Accordingly, the present invention provides a method and means for inhibiting and reducing biofilm, as well as preventing the development of biofilm foci on solid surfaces in vitro and in vivo and the development of antibiotic resistance.
TechnologijaTechnology
Priešprasminė technologija suteikia keletą privalumų, lyginant su kitomis antibakterinėmis technologijomis, tarp jų pagrindiniai privalumai yra:The antisense technology offers several advantages over other antibacterial technologies, among which the main advantages are:
1) specifinis ir sinchroninis gtf iRNR S. mutans ir S. sobrinus slopinimas;1) specific and synchronous inhibition of gtf iRNA in S. mutans and S. sobrinus;
2) šiame išradime atskleistos PO sekos naudojimas analogiškiems taikiniams dviejų rūšių streptokokuose (S. mutans ir S. sobrinus);2) use of the PO sequence disclosed in the present invention for analogous targets in two species of streptococci (S. mutans and S. sobrinus);
3) išorinis panaudojimas siekiant S. mutans ir S. sobrinus bioplėvelių inhibicijai ant negyvų paviršių, tokių kaip aplinkos ir buitiniai paviršiai, siekiant sumažinti patogeninių bakterijų paplitimą aplinkoje.3) external application to inhibit S. mutans and S. sobrinus biofilms on inanimate surfaces such as environmental and household surfaces to reduce the spread of pathogenic bacteria in the environment.
Šiame išradime atskleistas PO panaudojimo būdas ir PO, kurio seka yra SEQ ID nr. 1, arba visi šiame dokumente nurodyto PO fragmentai ar PO modifikacijos slopina bioplėvelės formavimąsi ir tuo pačiu ligų ir patologijų, sukeltų bioplėvelės formavimosi, atsiradimą.The present invention discloses a method of using a PO and a PO having the sequence of SEQ ID NO. 1, or all fragments or modifications of the PO referred to herein inhibit biofilm formation and thereby the development of diseases and pathologies caused by biofilm formation.
Šio išradimo PO vienu metu ir lygiagrečiai slopina gliukoziltransferazės iRNR ir gtf genų raišką S. mutans ir S. sobrinus.The PO of the present invention simultaneously and in parallel suppresses the expression of glucosyltransferase iRNA and gtf genes in S. mutans and S. sobrinus.
Gliukoziltransferazės iRNR ir gtf genų raiškos inhibicijos efektas, taip pat vandenyje netirpių ir dalinai tirpių gliukanų sintezės slopinimo efektas ir atitinkamai bioplėvelės formavimosi slopinimo efektas pasiekiamas, panaudojant tokios sekos PO:The effect of inhibiting the expression of glucosyltransferase iRNA and gtf genes, as well as the effect of inhibiting the synthesis of water-insoluble and partially soluble glucans and, respectively, of biofilm formation, is achieved by using the following sequence PO:
SEQ ID nr. 1 (5'-TTGGCAGACCATTGCTTAA -3'), kurios veikimo išdava yra vandenyje netirpių gliukanų gamybos ir rezultate bioplėvelės formavimosi slopinimas.SEQ ID NO: 1 (5'-TTGGCAGACCATTGCTTAA -3 '), the action of which is to inhibit the production of water-insoluble glucans and result in the formation of biofilm.
Taip pat analogiškas efektas kaip nurodyti aukščiau pasiekiamas veikiant PO sekos fragmentams ir modifikuotoms sekoms aprašytoms šiame patente.Likewise, an analogous effect as above is achieved by acting on the PO sequence fragments and modified sequences described in this patent.
PO, kurio seka yra SEQ ID nr. 1, yra optimizuota 20 nukleotidų molekulė, atsižvelgiant į termodinamines savybes reikalingas S. mutans gtfB irgtfC, S. sobrinus gtfl iRNR slopinimui. Bet koks PO fragmentas, net ir trumpesnis nei 20 nt seka atitinkantis SEQ ID nr. 1, apimantis ar atitinkantis šiame dokumente apibrėžtus gliukoziltransferazių kodavimo regionus, turi priešprasminj poveikį ir patenka į šiuo išradimu apibrėžiamas (ir pareiškiamas patentavimui) PO formas, būdą ir priemones.The PO having the sequence SEQ ID NO. 1, is an optimized 20 nucleotide molecule with respect to the thermodynamic properties required for the inhibition of S. mutans gtfB irgtfC, S. sobrinus gtfl iRNA. Any fragment of PO, even less than 20 nt in the sequence of SEQ ID NO. 1, comprising or corresponding to the coding regions for glucosyltransferases as defined herein, has an antispasmodic effect and is within the scope, form and means of the POs defined and claimed in the present invention.
Šiame išradime nurodyti izoliuoti PO gali būti izoliuoti iš natūralaus ar gamtinio šaltinio per išsgrynintą restrikcijos reakciją, taip pat gaminami sintetiniais būdais, t.y., sintetinami chemiškai arba gaminamas rekombinantiniu būdu ar naudojant genų inžineriją, ar polimerizacijos ir amplifikacijos metodus, pvz., polimerazės grandininę reakciją (PGR) ir PGR amplifikaciją ar kurį nors kitą metodą. PO taip pat gali būti paruoštas atliekant žinomus veiksmus ar kitus metodus, aprašytus šiame dokumente atsižvelgiant į šį išradimą.The isolated POs of the present invention may be isolated from a natural or natural source by a purified restriction reaction, or may be synthesized by synthetic means, i.e., chemically synthesized or recombinantly produced, or by genetic engineering, or polymerization and amplification methods, e.g. PCR) and PCR amplification or any other method. The PO may also be prepared by known procedures or other methods described herein in accordance with the present invention.
Šiame išradime nurodytais PO gali būti bet kokios molekulės, pagrįstos atitinkamomis nukleotidų sekomis, kurios jungiasi ar jungiasi naudojant bazinį nukleotidų suporavimą, įskaitant oligomerus arba polimerus, turinčius pagrindą, suformuotą iš natūraliai paplitusių nukleotidų ir/arba nukleino rūgščių analogų, sudarančių nestandartines nukleobazes ir/arba nestandartinius pagrindus, pvz., peptidinė nukleorūgštis (PNR) arba užrakinta nukleorūgštis (UNR), arba bet kokios išvestinės nukleorūgščių formos, kaip parodyta šiame dokumente. PO gali turėti dalinį, pvz., 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 ar netgi 90% natūraliai paplitusių nukleotidų, o likusieji, t.y. 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20 ar netgi 10% yra nukleorūgšties analogai, sudaryti iš nestandartinių nukleobazių ir/arba nestandartinių pagrindų, kaip nurodyta šiame dokumente naudojant PNR, UNR ar bet kokią kitą išvestinę nukleorūgšties formą. PO gali būti toliau chemiškai modifikuojamas. Tokios modifikacijos gali būti fosforotioatų formos oligodeoksiribonukleotidai, kaip parodyta šiame dokumente. Visos šiame dokumente pateiktos PO sekos gali būti chemiškai susintetintos kaip PNR.The POs of the present invention may be any molecule based on the corresponding nucleotide sequences which bind or bind using basic nucleotide pairing, including oligomers or polymers based on naturally occurring nucleotides and / or nucleic acid analogs forming non-standard nucleobases and / or non-standard bases, such as peptide nucleic acid (PNR) or locked nucleic acid (UNR), or any derived form of nucleic acid as shown herein. The PO may have a partial, e.g., 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, or even 90% naturally occurring nucleotides, and the rest, i.e. 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20 or even 10% are nucleic acid analogs consisting of non-standard nucleobases and / or non-standard bases as defined herein using PNR, UNR or any other derivative of the nucleic acid. The PO can be further chemically modified. Such modifications may be oligodeoxyribonucleotides in the form of phosphorothioates as shown herein. All PO sequences in this document can be chemically synthesized as PNR.
Pavyzdžiai pavyzdys - Priešprasminių oligonukleotidų sekos parinkimas gliukoziltransferazės raiškos slopinimuiExamples Example - Sequence Selection of Antisense Oligonucleotides for Inhibition of Glucosyltransferase Expression
Bioinformaciniai metodai ir rezultataiBioinformatics methods and results
Parenkant šiame išradime atskleistas naujas PO sekas, pirmiausiai buvo identifikuotos konservatyvios homologinės sritys burnos streptokokų gtf genuose. Šiam tikslui atlikta palyginamoji aminorūgščių sekų analizė tarp S. mutans GtfB baltymo ir kitų Gtf baltymų, esančių burnos streptokokuose.In selecting the novel PO sequences disclosed herein, conservative homologous regions in the gtf genes of oral streptococci were first identified. For this purpose, a comparative amino acid sequence analysis was performed between S. mutans GtfB protein and other Gtf proteins present in oral streptococci.
S. mutans ir S. sobrinus štamai atrinkti tolesnei analizei BLAST algoritmu (blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi):S. mutans and S. sobrinus strains selected for further analysis by BLAST algorithm (blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi):
S.mutans - UA159, LJ23, GS—5, NN2025, Asega, Leo, UA140, UA174, CH638, CH639, BV24, JP9-4, UA96, UA545, UA113, AF199, UA318, UA114, BZ15. S.sobrinus - TCI-194, ATCC33478, ATCC27607, OMZ176, NIDR6715 bei gtf-l gene for glucosyltransferase, complete cds.S. mutans - UA159, LJ23, GS-5, NN2025, Asega, Leo, UA140, UA174, CH638, CH639, BV24, JP9-4, UA96, UA545, UA113, AF199, UA318, UA114, BZ15. S.sobrinus - TCI-194, ATCC33478, ATCC27607, OMZ176, NIDR6715 and gtf-1 gene for glucosyltransferase, complete cds.
Analizė atlikta 2014 m. gruodžio mėn.Analysis conducted in 2014. December.
GtfB, GtfC, Gtfl baltymus sudarančios aminorūgščių sekos buvo atrinktos ir daugybinė sekų palyginamoji analizė buvo atlikta naudojant MAFFT programos internetinį serverį, esantj Max-Planck Institute for Development Biology (http://toolkit.tuebingen.mpq.de/mafft. atlikta 2015 m. sausio mėn.).The amino acid sequences constituting the GtfB, GtfC, Gtfl proteins were selected and multiple sequence comparisons were performed using the MAFFT web server at the Max-Planck Institute for Developmental Biology (http://toolkit.tuebingen.mpq.de/mafft. 2015). . month of January.).
Taikant tokį metodą, buvo nustatyta konservatyvi 26nt sritis GtfB, GtfC, Gtfl baltymų aminorūgščių DNRseka: 5’-CCTTACCTTCATGATGATGGCGACAA-3’ (SEQ ID nr. 5), kuri yra homologiška S. mutans ir S.sobrinus baltymuose.Using this method, a conserved 26nt region of the amino acid DNA sequence of the GtfB, GtfC, Gtfl proteins was identified: 5'-CCTTACCTTCATGATGATGGCGACAA-3 '(SEQ ID NO: 5), which is homologous to S. mutans and S.sobrinus proteins.
Šios sekos iRNR pagal Rfold programos rezultatus (Consensus sritis pažymėta pilkai): 5’ACAACGACACUCCUBBMMMMBMIMMMiįMBCAAUAUGAUUAAUAUGGA3’ (SEQ ID nr. 3).The following sequence of iRNAs according to the results of the Rfold program (Consensus region is highlighted in gray): 5'ACAACGACACUCCUBBMMMMBMIMMMiMBCAAUAUGAUUAAUAUGGA3 '(SEQ ID NO: 3).
Atitinkamas koduojantis iRNR segmentas šiai sričiai turi šią 20 nukleotidu (nt) seką:The corresponding coding iRNA segment for this region has the following 20 nucleotide (nt) sequence:
5’-UACCUUCAUGAUGAUGGCGA-3’ (SEQ ID nr. 2).5'-UACCUUCAUGAUGAUGGCGA-3 '(SEQ ID NO: 2).
Programų JalVievv; Sma; Soligo pagalba išanalizavus PO kandidatų termodinamiką ir kitus ypatumus heteroduplekso formavimosi metu, atlikta 2015 m. vasario mėn.) rezultatais, buvo parinkta 20 nt seka, komplementari aukščiau tekste nurodytai koduojančiai sričiai:Program JalVievv; Sma; Solig's help in analyzing thermodynamics and other features of PO candidates during heteroduplex formation was performed in 2015. 20), a 20 nt sequence complementary to the coding region above was selected:
5'-UACCUUCAUGAUGAUGGCGA-3' koduojančios srities seka [SEQ ID nr.2]5'-UACCUUCAUGAUGAUGGCGA-3 'coding region sequence [SEQ ID NO: 2]
11111111111111111111111111111111111111
3'-TCGCCATCATCATGAAGGTA-5' komplementari seka[SEQ ID nr. 1]Complementary sequence of 3'-TCGCCATCATCATGAAGGTA-5 '[SEQ ID NO. 1]
Eksperimentiniame darbe, atliktame remiantis šiais bioinformaciniais rezultatais, buvo panaudotas žemiau nurodytos sekos oligonukleotidas:An oligonucleotide of the following sequence was used in the experimental work based on the following bioinformative results:
5’- TCGCCATCATCATGAAGGTA-3’ (SEQ ID nr. 1) pavyzdys - Priešprasminių oligonukleotidų poveikis į bioplėvelės formavimąsi S. mutans kultūroseExample 5'-TCGCCATCATCATGAAGGTA-3 '(SEQ ID NO: 1) - Effect of antisense oligonucleotides on biofilm formation in S. mutans cultures
Laboratoriniai metodai ir rezultataiLaboratory methods and results
Tiriamas PO (5’- TCGCCATCATCATGAAGGTA-3' SEQ ID nr 1) sumažina streptokokų maišytos kultūros (S. mutans ir S. sobrinus) adheziją in vitro prie stikliukų paviršiaus jų maišytoje kultūroje, augančioje Todd Hewitt mitybinėje terpėje su 1% sacharoze.The assayed PO (5'-TCGCCATCATCATGAAGGTA-3 'SEQ ID NO: 1) reduces the in vitro adhesion of a streptococcal mixed culture (S. mutans and S. sobrinus) to the surface of slides in their mixed culture grown in Todd Hewitt's medium with 1% sucrose.
Remiantis optinio profilometro Sensofar PLu 2300 ir kompiuterinės programos Gvvyddion (versija 2.27) apskaičiuotais duomenimis nustatyta, kad tiriamos sekos nukleorūgštis 39 % sumažina maišytos S. mutans ir S. sobrinus bioplėvelės paviršiaus šiurkštumą (parametras - Rq) palyginus su nepaveiktomis bakterijomis (p < 0,05) bei 27 % palyginus su išmaišytos sekos nukleorūgštimi (neigiama kontrolė: 5'AACTCGTATGCTACAGCTAG-3') (p < 0,05) (fig.1A). Taip pat nustatyta, kad tiriamos sekos nukleorūgštis 38 % sumažina maišytos S. mutans ir S. sobrinus bioplėvelės storį palyginus su nepaveiktomis bakterijomis (p > 0,05) bei 23 % palyginus su išmaišytos sekos nukleorūgštimi (p > 0,05) (fig. 1B).Calculated by Sensofar PLu 2300 optical profilometer and computer program Gvvyddion (version 2.27), the nucleic acid of the analyzed sequence reduced surface roughness (parameter Rq) of mixed S. mutans and S. sobrinus biofilm compared to untreated bacteria (p <0, 05) and 27% relative to the mixed sequence nucleic acid (negative control: 5'AACTCGTATGCTACAGCTAG-3 ') (p <0.05) (FIG. 1A). It was also found that the nucleic acid of the tested sequence reduced the thickness of the mixed S. mutans and S. sobrinus biofilm by 38% compared to unaffected bacteria (p> 0.05) and by 23% compared to the mixed sequence nucleic acid (p> 0.05) (fig. 1B).
Nustatyta, kad tiriamos priešprasminės sekos nukleorūgštis Todd Hevvitt mitybinėje terpėje, turinčioje 1 % sacharozės ir seilių (1:10), 51 % sumažina maišytosNucleic acid of the antisense sequence tested in Todd Hevvitt's medium containing 1% sucrose and saliva (1:10) has been found to reduce by 51%
S. mutans ir S. sobrinus bioplėvelės paviršiaus šiurkštumą (Rq) palyginus su nepaveiktomis bakterijomis (p < 0,05), bei 39 % palyginus su išmaišytos sekos nukleorūgštimi (p < 0,05) (fig. 2A). Taip pat nustatyta, kad tiriamos sekos nukleorūgštis 27 % sumažina maišytos S. mutans ir S. sobrinus bioplėvelės storį palyginus su nepaveiktomis bakterijomis (p < 0,05) bei 34 % palyginus su išmaišytos sekos nukleorūgštimi (p < 0,05) (fig. 2B).S. mutans and S. sobrinus biofilm surface roughness (Rq) compared to unaffected bacteria (p <0.05) and 39% compared to shuffled nucleic acid (p <0.05) (Fig. 2A). It was also found that the nucleic acid of the tested sequence reduced the thickness of the mixed S. mutans and S. sobrinus biofilm by 27% compared to unaffected bacteria (p <0.05) and 34% compared to the mixed sequence nucleic acid (p <0.05) (fig. 2B).
Nustatyta, kad tiriamos priešprasminės sekos nukleorūgštis Todd Hevvitt mitybinėje terpėje, turinčioje 1 % sacharozės ir 10 % kraujo serumo, 10 % sumažina maišytos S. mutans ir S. sobrinus bioplėvelės paviršiaus šiurkštumą (Rq) palyginus su nepaveiktomis bakterijomis (p > 0,05), bei 25 % palyginus su išmaišytos sekos nukleorūgštimi (p < 0,05) (fig. 3A). Taip pat nustatyta, kad tiriamos sekos nukleorūgštis 44 % sumažina maišytos S. mutans ir S. sobrinus bioplėvelės storį palyginus su nepaveiktomis bakterijomis (p < 0,05) bei 41 % palyginus su išmaišytos sekos nukleorūgštimi (p < 0,05) (fig. 3B).The nucleic acid of the tested antisense sequence in Todd Hevvitt's medium containing 1% sucrose and 10% serum showed a 10% reduction in the surface roughness (Rq) of the mixed S. mutans and S. sobrinus biofilm compared to untreated bacteria (p> 0.05). , and 25% relative to the mixed sequence nucleic acid (p <0.05) (Fig. 3A). It was also found that the nucleic acid of the test sequence reduced the thickness of the mixed S. mutans and S. sobrinus biofilm by 44% compared to the unaffected bacteria (p <0.05) and 41% compared to the mixed sequence nucleic acid (p <0.05) (fig. 3B).
Tyrimo metu gauti duomenys rodo, kad tiriamos priešprasminės sekos nukleorūgštis PO ženkliai sumažina streptokokų (S. mutans, S. sobrinus) adheziją prie stikliukų paviršiaus in vitro sistemoje, ir todėl - statistiškai reikšmingai sumažina streptokokų (S. mutans, S. sobrinus) bioplėvelės formavimąsi ir jos kiekius.The results of the study indicate that the nucleic acid PO of the antisense sequence under investigation significantly reduces the adhesion of streptococci (S. mutans, S. sobrinus) to the surface of the vitreous in the in vitro system and therefore statistically significantly reduces the biofilm formation of streptococci (S. mutans, S. sobrinus). and its quantities.
Nustatyta, kad tiriamas PO (5'- TCGCCATCATCATGAAGGTA-3' SEC ID Nr 1) 27 % sumažina streptokokų (S.mutans ir S.sobrinus) agregaciją palyginus su nepaveiktomis bakterijomis bei 16 % palyginus su išmaišytos sekos nukleorūgštimi (neigiama kontrolė: 5-AACTCGTATGCTACAGCTAG-3') Todd Hevvitt mitybinėje terpėje su 1 % sacharoze.The assayed PO (5′-TCGCCATCATCATGAAGGTA-3 ′ SEC ID No 1) was found to reduce the aggregation of streptococci (S. mutans and S.sobrinus) by 27% compared to unaffected bacteria and by 16% compared to the mixed sequence nucleic acid (negative control: 5- AACTCGTATGCTACAGCTAG-3 ') Todd Hevvitt in nutrient medium with 1% sucrose.
Taip pat, įgyvendindama šio laikotarpio darbų planą UAB Bioseka nustatė, kad tiriamas PO (5'- TCGCCATCATCATGAAGGTA-3' SEC ID Nr 1) 58 % sumažina streptokokų (S. mutans ir S. sobrinus) polisacharidinių polimerų susidarymą palyginus su nepaveiktomis bakterijomis Todd Hewitt mitybinėje terpėje su 1 % sacharoze, o atlikus statistinius skaičiavimus su SPSS programos 20 versija nustatyta, kad šis sumažėjimas yra statistiškai reikšmingas (p < 0,05; One-Way Anova, LSD Post-Hoc testas). Be to, tiriamos optimizuotos priešprasminės sekos nukleorūgštis 53 % sumažina S. mutans ir S. sodrinus polisacharidinių polimerų susidarymą lyginant su išmaišytos sekos nukleorūgštimi (neigiama kontrolė: 5'AACTCGTATGCTACAGCTAG-3') Todd Hewitt mitybinėje terpėje su 1 % sacharoze, o atlikus statistinius skaičiavimus su SPSS programos 20 versija nustatyta, kad šis sumažėjimas yra statistiškai reikšmingas (p < 0,05; One-Way Anova, LSD Post-Hoc testas).Also, in the implementation of its work plan for this period, UAB Bioseka found that tested PO (5'-TCGCCATCATCATGAAGGTA-3 'SEC ID No 1) reduces the formation of polysaccharide polymers of streptococci (S. mutans and S. sobrinus) by 58% compared to unaffected bacteria Todd Hewitt medium with 1% sucrose and statistically significant reduction in SPSS version 20 (p <0.05; One-Way Anova, LSD Post-Hoc test). In addition, the optimized antisense sequence nucleic acid under investigation reduces the formation of polysaccharide polymers of S. mutans and S. saturrinus by 53% compared to the mixed sequence nucleic acid (negative control: 5'AACTCGTATGCTACAGCTAG-3 ') in Todd Hewitt's medium with 1%, with SPSS version 20, this decrease was found to be statistically significant (p <0.05; One-Way Anova, LSD Post-Hoc test).
Tyrimu metu gauti rezultatai rodo, kad tirtas PO (5TCGCCATCATCATGAAGGTA-3' SEQ ID nr. 1) ženkliai sumažina streptokokų (S. mutans ir S. sobrinus) agregaciją, o taip pat statistiškai reikšmingai sumažina streptokokų (S. mutans ir S. sobrinus) gaminamų polisacharidinių polimerų koncentraciją in vitro bakterinėje sistemoje.The results obtained in the study show that the tested PO (5TCGCCATCATCATGAAGGTA-3 'SEQ ID NO: 1) significantly reduces the aggregation of streptococci (S. mutans and S. sobrinus) as well as statistically significant reduction of streptococci (S. mutans and S. sobrinus). concentration of polysaccharide polymers produced in vitro in the bacterial system.
PO sekų sąrašas ir aprašymasList and description of PO sequences
Seka Nr. 1 (SEQ ID nr.1): 5'- TCGCCATCATCATGAAGGTA -3'Track # 1 (SEQ ID NO: 1): 5'- TCGCCATCATCATGAAGGTA -3 '
Ilgis: 20 nukleotidų (nt)Length: 20 nucleotides (nt)
Cheminė struktūra: deoksiribonukleorūgštis (DNR)Chemical structure: deoxyribonucleic acid (DNA)
Kilmė: dirbtinai susintetinta izoliuota priešprasminė nukleotidų sekaOrigin: an artificially synthesized isolated antisense nucleotide sequence
Funkcija: ši seka pagal komplementarumo principą jungiasi su atitinkama sritimi S. mutans gtfB ir gtfC iRNR bei S. sobrinus gtfl iRNR, sukeldama priešprasminį efektą. Esamuose eksperimentuose tai yra testuojama seka.Function: This sequence binds to the corresponding region of S. mutans gtfB and gtfC iRNA and S. sobrinus gtfl iRNA according to the complementarity principle, resulting in an antisense effect. In existing experiments, this is a test sequence.
Seka Nr. 2 (SEQ ID nr.2):Track # 2 (SEQ ID NO: 2):
5'185'18
ACAACGACACUCCUUACCUUCAUGAUGAUGGCGACAAUAUGAUUAAUAUGGA 3'ACAACGACACUCCUUACCUUCAUGAUGAUGGCGACAAUAUGAUUAAUAUGGA 3 '
Ilgis: 52 ntLength: 52 nt
Cheminė struktūra: RNRChemical structure: RNA
Kilmė: natūrali seka, esanti S. mutans gtfB ir S. mutans gtfB iRNROrigin: Natural sequence present in S. mutans gtfB and S. mutans gtfB iRNA
Funkcija: koduoja S. mutans gtfB ir S. mutans gtfB. Prie šios sekos atitinkamos srities gali jungtis priešprasminiai oligonukleotidai, turintys seką Nr. 1, sukeldami priešprasminį efektą.Function: Encodes S. mutans gtfB and S. mutans gtfB. Primeric oligonucleotides having the sequence no. 1, causing a counter-sensory effect.
Seka Nr. 3 (SEQ ID nr. 3): 5'-UACCUUCAUGAUGAUGGCGA-3’Track # 3 (SEQ ID NO: 3): 5'-UACCUUCAUGAUGAUGGCGA-3 '
Ilgis: 20 ntLength: 20 nt
Cheminė struktūra: iRNRChemical structure: iRNA
Kilmė: natūrali seka, esanti esanti S. mutans gtfB ir S. sobrinus gtfl iRNROrigin: Natural sequence present in S. mutans gtfB and S. sobrinus gtfl iRNA
Funkcija: pasirinkta DNR taikinio seka. Prie šios sekos atitinkamos srities gali jungtis priešprasminiai oligonukleotidai, turintys seką Nr. 1, sukeldami priešprasminį efektą.Function: Selected DNA target sequence. The corresponding region of this sequence can be joined by antisense oligonucleotides having the sequence no. 1, causing a counter-sensory effect.
Seka Nr. 4 (SEQ ID nr. 4): 5'- AACTCGTATGCTACAGCTAG -3'Track # 4 (SEQ ID NO: 4): 5'- AACTCGTATGCTACAGCTAG -3 '
Ilgis: 20 ntLength: 20 nt
Cheminė struktūra: DNRChemical structure: DNA
Kilmė: dirbtinai susintetinta izoliuota priešprasminė nukleotidų sekaOrigin: an artificially synthesized isolated antisense nucleotide sequence
Funkcija:Function:
naudota kaip kontrolinė seka laboratoriniuose tyrimuose.used as a control sequence in laboratory studies.
Seka N r. 5 (SEQ ID nr. 5): 5'- CCTTACCTTCATGATGATGGCGACAA -3'Follows N r. 5 (SEQ ID NO: 5): 5'- CCTTACCTTCATGATGATGGCGACAA -3 '
Ilgis: 26 ntLength: 26 nt
Cheminė struktūra: DNRChemical structure: DNA
Kilmė: natūrali seka, esanti S. mutans gtfB ir S. sobrinus gtflOrigin: Natural sequence present in S. mutans gtfB and S. sobrinus gtfl
DNRDNA
Funkcija:Function:
koduoja S. mutans gtfB ir S. sobrinus gtfl.encodes S. mutans gtfB and S. sobrinus gtfl.
Claims (10)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| LT2015092A LT6426B (en) | 2015-10-30 | 2015-10-30 | Antisense oligonukleotide for prevention of bacterial biofilm and antibiotic resistance |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| LT2015092A LT6426B (en) | 2015-10-30 | 2015-10-30 | Antisense oligonukleotide for prevention of bacterial biofilm and antibiotic resistance |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| LT2015092A LT2015092A (en) | 2017-05-25 |
| LT6426B true LT6426B (en) | 2017-07-10 |
Family
ID=58719330
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| LT2015092A LT6426B (en) | 2015-10-30 | 2015-10-30 | Antisense oligonukleotide for prevention of bacterial biofilm and antibiotic resistance |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| LT (1) | LT6426B (en) |
-
2015
- 2015-10-30 LT LT2015092A patent/LT6426B/en not_active IP Right Cessation
Non-Patent Citations (5)
| Title |
|---|
| BOWEN IR KOO: "Biology of Streptococcus mutans-derived glucosyltransferases: role in extracellular matrix formation of cariogenic biofilms", CARIES RES., 2011, pages 69 - 86 |
| HAMEL ET AL.: "Inhibition of gene expression by anti-sense C-5 propyne oligonucleotides detected by a reporter enzyme", BIOCHEM J., 1999, pages 547 - 553 |
| KURRECK ET AL.: "Antisense technologies. Improvement through novel chemical modifications", EUR J BIOCHEM, 2003, pages 1628 - 1644, XP009045309, DOI: doi:10.1046/j.1432-1033.2003.03555.x |
| NAKANO ET AL.: "Streptococcus mutans and cardiovascular diseases", J. DENT. SCI. REV., 2008, pages 29 - 37, XP025406280, DOI: doi:10.1016/j.jdsr.2007.09.001 |
| TANIGUCHI ET AL.: "Defect of glucosyltransferases reduces platelet aggregation activity of Streptococcus mutans: Analysis of clinical strains isolated from oral cavities", ARCH. ORAL BIOL., 2010, pages 410 - 416, XP027051298 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| LT2015092A (en) | 2017-05-25 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Zhang et al. | Multi-targeted antisense oligonucleotide delivery by a framework nucleic acid for inhibiting biofilm formation and virulence | |
| JP6902869B2 (en) | Composition for regulating the expression of ataxin 2 | |
| US20210317479A1 (en) | Nucleic acid assemblies for use in targeted delivery | |
| KR20210055733A (en) | Compositions and methods for delivering nucleobase editing systems | |
| EP3272868A1 (en) | Organic compositions to treat kras-related diseases | |
| TW201143780A (en) | Treatment of Colony-stimulating factor 3 (CSF3) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to CSF3 | |
| TW201219569A (en) | Treatment of Sialidase 4 (NEU4) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to NEU4 | |
| CN114375194A (en) | Treatment of angiopoietin-like 7(ANGPTL7) -related diseases | |
| AU2020221355A1 (en) | Compositions and methods for treating glycogen storage disease type 1a | |
| TW201202418A (en) | Treatment of Methionine Sulfoxide Reductase A (MSRA) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to MSRA | |
| EP3814504A1 (en) | Aptamers for personal care applications | |
| JPH11507818A (en) | Essential oligonucleotides for vertebrate telomerase | |
| US20190352640A1 (en) | Ribosomal rna origami and methods preparing thereof | |
| TWI606058B (en) | Nucleic acid complex and nucleic acid polysaccharide complex | |
| WO2016123628A1 (en) | Sequence specific and organism specific antimicrobials and related materials and methods | |
| Bai et al. | Antisense antibacterials: from proof-of-concept to therapeutic perspectives | |
| US20180362976A1 (en) | Antisense molecules for treatment of staphylococcus aureus infection | |
| US20240376466A1 (en) | Genome editing compositions and methods for treatment of fanconi anemia | |
| LT6426B (en) | Antisense oligonukleotide for prevention of bacterial biofilm and antibiotic resistance | |
| JP6600621B2 (en) | Antisense molecules for the treatment of Staphylococcus aureus infections | |
| EP3047023A2 (en) | Compositions and methods for inhibiting jc virus (jcv) | |
| KR20120006975A (en) | Pharmaceutical composition containing L-ribozyme for treating rejection by administering enantiomeric aptamers | |
| LT6214B (en) | Antisense oligonucleotide for prevention of atherosclerosis and cardivascular infections | |
| CN121358862A (en) | Compositions and methods for treating kidney disease | |
| TW202430635A (en) | Rnai agents for inhibiting expression of complement component c3 (c3), pharmaceutical compositions thereof, and methods of use |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| BB1A | Patent application published |
Effective date: 20170525 |
|
| FG9A | Patent granted |
Effective date: 20170710 |
|
| MM9A | Lapsed patents |
Effective date: 20171030 |