LT4008B - Novel polypeptides - Google Patents

Novel polypeptides Download PDF

Info

Publication number
LT4008B
LT4008B LTIP1886A LTIP1886A LT4008B LT 4008 B LT4008 B LT 4008B LT IP1886 A LTIP1886 A LT IP1886A LT IP1886 A LTIP1886 A LT IP1886A LT 4008 B LT4008 B LT 4008B
Authority
LT
Lithuania
Prior art keywords
bssl
pro
polypeptide
ala
gly
Prior art date
Application number
LTIP1886A
Other languages
English (en)
Inventor
Lars Blaeckberg
Michael Edlund
Lennart Hansson
Olle Hernell
Lennart Lundberg
Mats Stroemqvist
Jan Toernell
Original Assignee
Astra Ab
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Astra Ab filed Critical Astra Ab
Publication of LTIP1886A publication Critical patent/LTIP1886A/xx
Publication of LT4008B publication Critical patent/LT4008B/lt

Links

Landscapes

  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Description

Šis išradimas skirtas naujiems polipeptidams, kurie yra tulžies druskos stimuliuojamos lipazės (BSSL; EC 3.1.1.1) variantai. Jis taip pat susijęs su DNR molekulėmis, koduojančiomis minėtuosius polipeptidus, ir su subproduktais, turinčiais minėtąsias DNR molekules. Šis išradimas dar skirtas minėtųjų BSSL variantų ir transgeninių nežmogiškos kilmės žinduolių, galinčių ekspresuoti šiuos BSSL variantus, sukūrimo būdams. Be to, išradimas susijęs su tokiais transgeniniais gyvūnais, o taip pat su kūdikiams skirtais preparatais, turinčiais tokių transgeninių gyvūnų pieno. Šis išradimas taip pat susijęs su farmacinėmis kompozicijomis, turinčiomis minėtųjų polipeptidų, ir su šių polipeptidų ir DNR molekulių panaudojimu vaistų gamyboje.
Dietiniai lipidai tai svarbus energijos šaltinis. Daugiau kaip 95% šių lipidų sudaro turtingi energija triacilgliceroliai. Kai kurie iš lipidų, pvz., kai kurios riebiosios rūgštys ir riebaluose tirpstantys vitaminai, yra pagrindinės dietos sudedamosios dalys. Prieš triacilglicerolių ir mažesniąją dalį sudarančių komponentų, t.y. esterizuotų riebaluose tirpstančių vitaminų ir cholesterolio bei diacilfosfatidilglicerolių, įsiurbimą skrandyje ir žarnyne būtina hidrolizuoti esterinį ryšį, kad gautųsi mažiau hidrofobinis, absorbuojamas produktas. Šias reakcijas katalizuoja specifinė fermentų, vadinamų lipazėmis, grupė. Žmogaus atveju, manoma, kad pagrindinės lipazės yra skrandžio lipazė, kasos lipazė, priklausanti nuo kolipazės (tri- ir diacilglicerolių hidrolizė), kasos fosfolipazė A2 (diacilfosfatidilglicerolių hidrolizė) ir karboksilinių esterių hidrolazė (CEH) (cholesterolio ir riebaluose tirpstančių vitaminų esterių, bet taip pat tri-, di- ir monoacilglicerolių hidrolizė). Kai naujagimiai maitinami krūtimi, tulžies druskos stimuliuojamai lipazei (BSSL) tenka pagrindinis vaidmuo hidrolizuojant keletą iš aukščiau minėtų lipidų. Produktai, gauti lipidų virškinimo metu, kartu su tulžies druskomis sudaro miceles arba vienasluoksnes vezikules (Hernell, O., Staggers, J.E. and Carey, M.C. (1990): Biochemistry 29, 2041-2056), iš kurių vykdomas įsiurbimas.
Kai kurių rūšių, pvz., žmonių, gorilų, kačių ir šunų, pienas turi tulžies druskos stimuliuojamą lipazę (BSSL) (Hernell, O., Blackberg, L., and Lindberg, T. in: Textbook of gastroenterology and nutrition in infancy (Lebenthal, E. ed) pp. 209-217 (Raven Press, New York 1989; Hamosh, M., Freed, L.M., York, C.M., Sturman, J.A., and Hamosh, P. (1986): Fed. Proc. 45, 1452). Kai BSSL plonosios žarnos viršutinėje dalyje sumaišoma su tulžimi, ji specifiškai aktyvuojama pirminėmis tulžies druskomis (Hernell, O. (1975): Eur.
J. Clin. Invest. 5, 267-272). BSSL, sudaranti apie 1% visų pieno baltymų (Blackberg, L. & Hernell, O. (1981): Eur. J. Biochem 116, 221-225), nedegraduoja keliaudama su pienu per skrandį ir dvylikapirštės žarnos turinyje tulžies druskos neleidžia ją inaktyvuoti kasos proteazėms, tokioms kaip tripsinas ir chimotripsinas.
Žmogaus pieno terminis apdorojimas (pasterizacija prie 62,5°C, 30 min), visiškai inaktyvuojantis BSSL (Bjorksten, B., Burman, L.G., deChateau, P., Fredrikzon, B., Gothefors, L. & Hernell, O. (1980): Br. Med. J. 201, 276-272), sumažina neišnešiotų kūdikių riebalų įsiurbimo koeficientą apytiksliai 1/3 (Williamson, S., Finucane, E., Lilis, H., and Gamsu, H.R. (1978): Arch. Dis. Childhood 53, 555-563; Atkinson, S.A., Bryan, M.H., and Andersson, G.H. (1981): J. Pediatr. 99, 617-624). Taigi, dėl BSSL, geriau vartoti šviežio žmogaus pieno triacilglicerolią, negu kūdikiams skirtus mišinius, turinčius panašią riebalų sudėtį (Hernelį O. and Blackberg, L. in: Encyclopedia of human biology (Dulbecco, R.ed.) Vol. 3, pp. 47-56 (Academic Press, San Diego 1991); Chappell, J.E., Clandinin, M.T., Kearney-Volpe, C., Reichman, B., and Swyer, P.W. (1986): J. Pediatr. 108, 439-447).
BSSL tai nespecifinė lipazė (EC 3.1.1.1), kadangi ji hidrolizuoja ne tik triacilglicerolį, bet ir monoacilglicerolį, cholesterolio esterius ir riebaluose tirpstančių vitaminų esterius (Blackberg, L. and Hernell, O. (1983): FEBS Lett. 157, 337-341). Todėl aktyvuota BSSL potencialiai pati gali hidrolizuoti daugumą žmogaus pieno lipidų, nors veiksmingausiai žmogaus pieno triacilglicerolis panaudojamas sinergetiškai veikiant skrandžio lipazei (EC 3.1.1.3), nuo kolipazės priklausomai kasos lipazei (EC 3.1.1.3) ir BSSL (Bernback, S., Bla ckberg, L., and Hernell, O. (1980): J. Clin. Invest. 85,1221-1226).
Paskutiniai tyrimai padėjo suvokti, kad pieno fermentai ypatingai svarbūs naujagimiams panaudojant polinesočias riebiąsias rūgštis, turinčias ilgas grandines (Hernell ir kt., 1993). Šios riebiosios rūgštys yra reikšmingi eikosanoidų pirmtakai ir yra svarbios nervų sistemos vystymuisi. Naujagimiai, ypač neišnešioti, turi ribotas galimybes sintetinti šias riebiąsias rūgštis iš jų pirmtakų. Taigi jos yra itin svarbios tam tikru, dar tiksliai neapibrėžtu laikotarpiu po gimimo.
Neseniai kelių laboratorijų darbuose buvo apibūdintos tiek pieno lipazės tiek ir kasos karboksilinio esterio hidrolazės (CEH) (EC 3.1.1.1) cDNR struktūros (Baba, T., Downs,
D., Jackson, K.W., Tang, J. and Wang, C.S. (1991): Biochemistry 30, 500-510; Hui, D. and Kissel, J.A. (1990): Febs Lett. 276, 131-134; Nilsson, J., Blackberg, L., Carlsson, P., Enerback, S., Hernell, O. and Bjursell, G. (1990): Eur J. Biochem. 192, 543-550; Reue, K., Zambaux, J., Wong, H., Lee, G., Leete, T.H., Ronk, M., Shively, J.E., Sternby, B., Borgstrom, B., Ameis, D. and Schotz, M.C. (1991): J. Lipid. Res. 32, 267-276), bei padaryta išvada, jog šie pieno ir kasos fermentai yra to pačio geno produktai. cDNR seka ir išvesta BSSL/CEH geno aminorūgščių seka (SEQ ID NO: 1) taip pat pateiktos dokumentuose WO 91/15234 (Oklahomos medicininių tyrimų fondas) ir WO 91/18923 (Aktiebolaget Astra).
BSSL tai viengrandinis glikoproteinas. Išvestas baltymas susideda (SEQ ID NO:3) iš 722 aminorūgščių liekanų ir yra gausiai glikozilintas (Abouakil, N., Rogalska, E., and Lombardo, D. (1989): Biochim. Biophys. Actą 1002, 225-230). Baltymo N-galo dalis yra itin homologiška acetilėholinesterazei ir kai kurioms kitoms esterazėms (Nilsson ir kt., 1990).
Bandomoji aktyviojo centro serino liekana sutampa su serinu-194; seka aplink šį seriną atitinka serino hidrolazių suderinamąją aktyviojo centro seką.Vienintelė bandomoji N-glikozilinimo vieta yra už septynių liekanų į N-galo pusę nuo aktyviojo centro serino (Nilsson ir kt., 1990). BSSL sekos C-galo dalyje 16 kartų pasikartoja 11-os aminorūgščių liekanų ilgio fragmentai, turintys daug prolino. Pasikartojimų skaičiaus kitimas, atrodo, gali didžiąja dalimi paaiškinti molekulių dydžio ir aminorūgščių sudėties skirtumus tarp fermentų, išskirtų iš skirtingų rūšių (Han, J.H., Stratowa, C., and Rutter, W.J. (1987): Biochemistry 26, 1617-1625; Fontaine, R., Carter, C., and Hui, D. (1991): Biochemistry 30, 7008-1014; Kyger, E.M., Wiegand, R.C., and Lange, L.G. (1989): Biochem. Biophys. Res. Commun. 164, 1302-1309). Šie pasikartojimai neša didžiąją dalį iš 15-20% baltymo angliavandenių (Baba ir kt., 1991, Abouakil ir kt., 1989).
Vienintelis struktūrinis skirtumas tarp BSSL ir tipiškos esterazės slypi polipeptido Cgalo dalyje, t.y. šešiolikoje pasikartojančių sekų, turinčių po 11-a aminorūgščių liekanų ir daug prolino. Atitinkamas kasos fermentas iš karvės ir žiurkės turi tik 3 ir 4 pasikartojimus, atitinkamai (Han ir kt., 1987; Kyger ir kt., 1989). Tai greičiausiai patvirtina hipotezę, kad C-galo dalis ar bent jos dalis nedaro įtakos lipazės veiklumui, t.y. jos poveikiui į ilgos grandinės triacilglicerolį, esantį emulsinėje būsenoje.
Paprastai lipidų įsiurbimo ir drauge mitybos sutrikimus sukelia kasos nuo kolipazės priklausomos lipazės ir/arba tulžies druskų kiekio sumažėjimas virškinimo trakte. Tipiškais tokio lipazės nepakankamumo pavyzdžiais yra ligoniai, sergantys pūslės fibroze, įprastiniu genetiniu sutrikimu, sukeliančiu nepakankamumą visam gyvenimui 80% pacientų, ir lėtinis pankreatitas, dažnai sukeliamas lėtinio alkoholizmo.
Šiuo metu gydant ligonius, sergančius kasos lipazės nepakankamumu, skiriamos vartoti orališkai labai didelės dozės neapdoroto kiaulės kasos fermentų preparato. Tačiau nuo kolipazės priklausanti kasos lipazė inaktyvuojasi dėl vyraujančio skrandyje žemo pH. Šio reiškinio negalima pilnai pašalinti naudojant didžiules fermentų dozes. Todėl skiriamos labai didelės dozės netinka daugumai ligonių, ir, be to, preparatai yra negryni ir nemalonaus skonio. Buvo paruoštos tam tikros tabletės, praeinančios skrandžio rūgštines sritis ir išskiriančios fermentą tik santykinai šarminėje plonosios žarnos aplinkoje. Tačiau daugelio ligonių, turinčių kasos sutrikimų, plonosios žarnos nenormaliai rūgštinės, ir tokiais atvejais tabletės gali neišleisti fermento.
Be to, kadangi šiuo metu rinkoje parduodami preparatai gauti ne iš žmogaus, kyla tam tikras pavojus sukelti imunines reakcijas, iššaukiančias ligoniams žalingas pasekmes arba sumažinančias gydymo veiksmingumą. Kitas šiuo metu esančių preparatų trūkumas yra tai, kad nepranešama ar jie turi kitą lipolitinį aktyvumą, nesusijusį su nuo kolipazės priklausančia lipaze. Iš tikrųjų daugumas jų pasižymi labai žemo lygio BSSL/CEH aktyvumu. Tai gali būti viena iš priežasčių, dėl kurių daugumas ligonių, sergančių pūslės fibroze, nepaisant papildomo gydymo kenčia riebaluose tirpstančių vitaminų ir svarbių riebiųjų rūgščių nepakankamumą.
Todėl labai svarbu gauti produktus, pasižyminčius žmogaus lipazės savybėmis ir struktūra, bei plačiu substratinų specifiškumu, kuriuos galima būtų skirti orališkai vartoti ligoniams, sergantiems vienos ar kelių kasos lipolitinių fermentų trūkumu. Produktai, kuriuos galima gauti panaudojant šj išradimą, patenkina šį poreikį patys arba drauge su preparatais, turinčiais kitas lipazės.
Rekombinantiniai BSSL variantai, pagal išradimą, išlaiko katalitinį aktyvumą, bet turi mažiau glikozilinimo vietų negu pilno ilgio BSSL, ir todėl pagaminami su potencialiai mažesniu angliavandenių nevienalytiškumu. Šis sudėtingumo sumažinimas palengvina rekombinantinių baltymų išgryninimą ir apibūdinimą, todėl turėtų sumažėti polipeptidų, turinčių BSSL aktyvumą, gamybos kaina.
Kita vertus, dėl sumažinto glikozilinimo lygio keliami mažesni reikalavimai recipientui ir, panaudojant kelias ląsteles-šeimininkes, gaunama didesnė išeiga. Be to, sumažintas glikozilinimo vietų skaičius leidžia BSSL variantų gamybą panaudojant žemesnius eukariotus ir apriboja galimą nenormalaus glikozilinimo, galinčio sukelti imuninę reakciją, riziką. Sumažinto lygio ir paprastesnis glikozilinimas taip pat reiškia, kad šiuo atveju recipientų ratas yra platesnis negu baltymų, turinčių labai sudėtingas ir sunkias angliavandenių dalis, atveju.
Akivaizdu, kad panaudojant mažesnio dydžio, bet vienodo aktyvumo BSSL variantus terapiniams tikslams, sumažėja priedų medžiagos kiekis. Kitas galimas BSSL varianto, neturinčio daugumos ar visų O-glikozilintų pasikartojimų, pranašumas susijęs su šeimininkų imuninio atsako rizikos sumažėjimu. Tai įvyksta dėl to, kad O-prijungtieji cukrus gali būti labai nevienalyčiai priklausomai nuo ląstelės, kurioje jie gaminami.
Mokslinėje literatūroje yra pranešimų, jog natyvią BSSL suriša ir įsiurbia žarnyno gleivinė. Atrinkti BSSL variantai su mažesniu įsiurbimu ilgiau bus veiklus dietinių lipidų atžvilgiu, tuo pagerindami virškinimą žarnyne. Molekulės su sumažintu glikozilinimo lygiu yra vienas iš tokių variantų pavyzdžių.
Kaip paminėta aukščiau, buvo iškelta prielaida, kad BSSL ypač svarbus įsisavinant ilgų grandinių polinesočias riebiąsias rūgštis (Hernell, O., Blackberg, L., Chen, Q., Sternby,
B. and Nilson, A. (1993): J. Pediatr. Gastroenterol. Nutr. (in press), kurios labai svarbios naujagimių nervų sistemos vystymuisi ir vitaminui A. Gautasis pagal šį išradimą BSSL variantas, kuris yra labiau efektyvus šiais požiūriais, gali būti pasirinktas žinomais metodais. Nutrauktas ar sutrumpintas fermentas tur būt skirsis konformacijos požiūriu, dėl to gali pasikeisti jo specifiškumas skirtingiems lipidiniams substratams.
Išradimas iš vienos pusės susijęs su nukleino rūgšties molekule, koduojančia polipeptidą, kuris yra BSSL variantas, trumpesnis negu 722 aminorūgštys, ir minėtasis BSSL variantas turi aminorugščių sekos dalį, parodytą sekoje SEQ ID NO: 3 kaip liekanos 536-722.
Čia vartojamas terminas „aminorugščių sekos dalis“ reiškia vieną atskirą aminorūgštį, o taip pat seką iš kelių aminorugščių ar derinį iš kelių tokių sekų.
Terminas „BSSL variantas“, reiškia polipeptidą, pasižymintį BSSL aktyvumu ir turintį žmogaus BSSL aminorugščių sekos, pažymėtos Sekų Apraše kaip seka SEQ ID NO: 3, dalį.
Terminas „polipeptidas, pasižymintis BSSL aktyvumu“, reiškia polipeptidą, turintį bent dalį šių savybių:
(a) tinkamas oraliniui vartojimui;
(b) aktyvuojamas specifinėmis tulžies druskomis;
(c) plonųjų žarnų turinyje veikiantis kaip nespecifinė lipazė, t.y. galintis hidrolizuoti lipidus santykinai nepriklausomai nuo jų cheminės sandaros ir fizinės būklės (emulsinės, dalelių pavidalo, ištirpusios);
ir nebūtinai turintis vieną ar daugiau iš šių savybių:
(d) galintis hidrolizuoti triacilglicerolius, turinčius įvairaus grandinių ilgio ir skirtingo nesotumo laipsnio riebiąsias rūgštis;
(e) galintis taip pat hidrolizuoti diacilglicerolį, monoacilglicerolį, cholesterolio esterius, lizofosfatidilacilglicerolį ir retinilą bei kitus riebaluose tirpstančių vitaminų esterius;
(f) galintis hidrolizuoti triacilgliceroliuose ne tik sn-l(3) esterinius ryšius, bet ir sn-2 esterinį ryšį;
(g) galintis sąveikauti ne tik su pirminėmis, bet ir su antrinėmis tulžies druskomis;
(h) optimalus aktyvumas priklauso nuo tulžies druskų;
(i) stabilus ta prasme, kad skrandžio turinys nepaveiks jo katalitinio aktyvumo kokiu nors žymiu laipsniu;
0) atsparus kasos proteazėms, pvz., tripsinui, jei yra tulžies druskų;
(k) galintis surišti hepariną ir heparino darinius, pvz., heparino sulfatą;
(l) galintis prisirišti prie lipidų ir vandens fazių skiriamosios ribos;
(m) pakankamai stabilus, kad būtų galima liofilizuoti;
(n) stabilus, kai sumaišomas su maisto sudedamosiomis dalimis, tokiomis kaip žmogaus pienas arba pieno mišiniai.
Kitais požiūriais išradimas susijęs su nukleino rūgšties molekule, atitinkančia aukščiau pateiktą aprašymą, kai minėtasis BSSL variantas turi fenilalanino liekaną C-galo pozicijoje arba turi savo C-galo dalyje seką Gln-Met-Pro, arba savo C-galo dalyje turi aminorugščių seką, parodytą sekoje SEQ ID NO: 3 kaip 712-722 liekanos.
Šiame kontekste, terminas „C-galo pozicija“ pažymi paskutinės C-galo liekanos poziciją, o terminas „C-galo dalis“ pažymi apytiksliai 50 aminorugščių liekanų, sudarančių BSSL varianto C-galo pabaigą.
Toliau išradimas susijęs su nukleino rūgšties molekule, atitinkančia aukščiau pateiktą aprašymą, kai minėtasis BSSL variantas turi mažiau nei 16 pasikartojimo vienetų. Šiame kontekste terminas „pasikartojimo vienetas“ pažymi vieną iš 33 nukleotidų ilgio pasikartojimo vienetų, pateiktų Sekų Apraše esančioje sekoje SEQ ID NO: 1.
Kitais požiūriais išradimas susijęs su nukleino rūgšties molekule, atitinkančia aukščiau pateiktą aprašymą, koduojančia polipeptidą, kurio aminorūgščių seka turi bent 90% homologiją su aminorūgščių seka, parodyta Sekų Apraše kaip sekos SEQ ID NO: 5, 6 arba 9, o taip pat su nukleino rūgšties molekule, koduojančia polipeptidą, kurio aminorūgščių seka turi bent 90% homologiją su aminorūgščių seka, parodyta Sekų Apraše kaip seka SEQ ID NO: 7, išskyrus tas nukleino rūgščių molekules, kurios koduoja polipeptidus, turinčius asparagino liekaną 187 pozicijoje.
Išradimas taip pat skirtas polipeptidams, parodytiems Sekų Apraše kaip sekos SEQ ID NO: 5, 6, 7 arba 9, o taip pat polipeptidams, kuriuos koduoja nukleino rūgšties seka, atitinkanti aukščiau pateiktą aprašymą.
Be to, išradimas yra apie hibridinį geną, turintį nukleino rūgšties molekulę, atitinkančią aukščiau pateiktą aprašymą, apie galintį replikuotis ekspresijos vektorių, turintį tokį hibridinį geną, ir ląstelę, priimančią tokį hibridinį geną. Tokia ląstele gali būti prokariotinė ląstelė, vienaląstis eukariotinis organizmas arba ląstelė, kilusi iš daugialąsčio organizmo, pvz., žinduolio.
Siame kontekste terminas „hibridinis genas“ reiškia nukleino rūgšties seką, turinčią iš vienos pusės nukleino rūgšties seką, koduojančią BSSL variantą, kaip apibrėžta aukščiau, ir iš kitos pusės geno, sąlygojančio hibridinio geno produkto ekspresiją, nukleino rūgšties seką. Terminas „genas“ reiškia visą geną, o taip pat jo sekos dalį, sąlygojančią ir nukreipiančią hibridinio geno ekspresiją norimame audinyje. Paprastai minėta sekos dalis apima bent jau vieną ar kelias promotorines sritis, transkripcijos startinį saitą, 3' ir 5' nekoduojančias sritis ir struktūrines sekas.
Geriau kai hibridinis genas konstruojamas in vitro įterpiant BSSL variantą koduojančią nukleino rūgšties seką į geną, galintį sąlygoti ekspresiją, panaudojant žinomas šios srities metodikas. Iš kitos pusės BSSL variantą koduojanti nukleino rūgšties seka gali būti įterpiama in vitro pasinaudojant homologinę rekombinacija.
Šiame kontekste terminas „galintis replikuotis“ reiškia, kad vektorius gali replikuotis duotojo tipo ląstelėje-šeimininkėje, į kurią jis buvo įvestas. Tiesiogiai prieš nukleino rūgšties seką, koduojančią BSSL variantą, galima įstatyti seką, koduojančią signalinį peptidą, kurio buvimas užtikrina BSSL varianto, ekspresuoto ląstelėje-šeimininkėje, priėmusioje vektorių, sekreciją. Signalinė seka gali būti natūraliai susieta su nukleino rūgšties seka arba gali būti kitos kilmės.
Kaip vektorių galima panaudoti bet kurį nešiklį, su kuriuo patogu atlikti DNR rekombinacijos procedūras, ir jo pasirinkimą dažnai nulemia ląstelė-šeimininkė, į kurią vektorius turi būti įvedamas. Todėl vektorius gali būti autonomiškai besireplikuojantis, t.y. galintis egzistuoti kaip nechromosominis objektas, kurio replikacija nepriklauso nuo chromosomos replikacijos; tokių vektorių pavyzdžiais gali būti plazmidė, fagas, kosmidė, mini-chromosoma arba virusai. Iš kitos pusės gali būti vektorius, kuris, po to kai įvedamas į ląstelę-šeimininkę, integruojasi į ląstelės-šeimininkės genomą ir replikuojasi kartu su
Ί chromosoma (chromosomomis), į kurią jis buvo integruotas. Tinkamų vektorių pavyzdžiais gali būti bakterijų ekspresijos vektorius ir mielių ekspresijos vektorius. Šio išradimo vektorius gali pernešti bet kurias iš aukščiau apibrėžtų išradimo nukleino rūgščių sekų.
Iš kitos pusės išradimas susijęs su rekombinantinių polipeptidų gamybos procesu, kuris susideda iš: (i) nukleino rūgšties molekulės, atitinkančios aukščiau pateiktą aprašymą, įterpimo į hibridinį geną, galintį replikuotis tam tikrose recipientinėse ląstelėse ar organizmuose; (ii) gauto rekombinantinio hibridinio geno įvedimo į recipientinę ląstelę ar organizmą; (iii) gautos ląstelės auginimo kultivavimo terpėje ar ant jos arba organizmo, kuriame ekspresuojamas polipeptidas, identifikavimo ir padauginimo ir (iv) polipeptido išgavimo.
Ląstelių auginimui galima panaudoti bet kurią įprastą terpę, tinkančią šiam reikalui. Tinkamu vektoriumi gali būti bet kuris iš aukščiau aprašytų vektorių, o atitinkama ląstelešeimininke gali būti bet kuri ląstelė iš aukščiau aprašytų tipų. Konstruojant vektorių ir efektyviai jį įvedant į ląstelę-šeimininkę galima panaudoti bet kurį žinomą DNR rekombinacijos srityje šiems tikslams skirtą būdą. Priklausomai nuo ląstelės tipo ir vektoriaus sudėties, ekspresuotas ląstelėje rekombinantinis žmogaus BSSL variantas gali būti sekretuojamas, t.y. pernešamas pro ląstelės membraną.
Jei BSSL variantas lieka rekombinantinių recipientinių ląstelių viduje, tai yra ląstelė jo nesekretuoja, tai jis gali būti išgaunamas standartinėmis procedūromis, tame tarpe ląstelė gali būti suardoma mechaniškai, pvz., ultragarsu ar homogenizatoriuje, arba fermentais ar chemikalais, po to gryninama.
Kad būtų sekretuojama, prieš DNR seką, koduojančią BSSL variantą, reikia įstatyti seką, koduojančią signalinį peptidą, kuris užtikrina BSSL varianto išskyrimą iš ląstelės taip, kad bent jau didžioji pagaminto BSSL varianto dalis yra išskiriama į auginimo terpę ir išgaunama.
Išradimas taip pat yra apie ekspresijos sistemą, turinčią hibridinį geną, kuris gali ekspresuotis ląstelėje- ar organizme-šeimininke, priimančiame minėtąjį hibridinį geną, todėl rekombinantinis polipeptidas gaminamas, kai ekspresuojasi hibridinis genas, kuris sukonstruotas įterpiant nukleino rūgšties seką, atitinkančią aukščiau pateiktą aprašymą, į geną, sugebantį tarpininkauti ekspresuojant minėtąjį hibridinį geną.
Vienas iš galimų šio išradimo rekombinantinio BSSL varianto gamybos būdų tai panaudojimas transgeninių nežmogiškos kilmės žinduolių, galinčių išskirti BSSL variantą į savo pieną. Transgeninių nežmogiškos kilmės žinduolių panaudojimas pranašus tuo, kad didelis rekombinantinio BSSL varianto kiekis gaunamas už priimtiną kainą ir tuo, kad, ypač kai nežmogiškos kilmės žinduoliu yra karvė, rekombinantinis BSSL variantas gaunamas piene, kuris yra normali sudedamoji dalis, pvz., kūdikių mitybos mišinių, todėl nereikia ekstensyvaus gryninimo, kai rekombinantinis BSSL variantas yra naudojamas kaip maistingas priedas produktuose, pagamintuose pieno pagrindu.
Be to, kai gaminama aukštesniuose organizmuose, tokiuose kaip nežmogiškos kilmės žinduoliai, tai atliekamas taisyklingas žinduolių baltymo molekulės apdorojimas, pvz., procesingas po transliacijos ir teisingas suklostymas. Taip pat galima gauti didelius kiekius beveik gryno BSSL varianto.
Tuo būdu ekspresijos sistema, besiremianti aukščiau pateiktu aprašymu, gali būti žinduolių ekspresijos sistema, turinti DNR seką, kuri koduoja BSSL variantą, įterptą į geną, koduojantį nežmogiškos kilmės žinduolio pieno baltymą, tam, kad būtų suformuotas hibridinis genas, kuris gali ėkspresuotis priėmusios minėtąjį hibridinį geną žinduolių suaugusios patelės pieno liaukoje.
Manoma, kad pieno liauka, kaip ekspresijos audinys, ir genai, koduojantys pieno baltymus, ypač tinkami gaminti heterologiniams baltymams transgeniniuose nežmogiškos kilmės žinduoliuose, kadangi pieno baltymai žinduolių pieno liaukose natūraliai gaminami padidintais kiekiais. Taip pat pieną lengva surinkti ir galima gauti didelius jo kiekius. Ryšium su tuo, pieno baltymų genų panaudojimas rekombinantinio BSSL varianto gamyboje pranašus dar tuo, kad pastarasis gaminamas sąlygose, artimose natūralioms gamybos sąlygoms, ekspresijos reguliavimo ir gamybos vietos (pieno liaukose) požiūriu.
Naudojant transgeninius žinduolius, geriau kai aukščiau minėtas hibridinis genas turi seką, koduojančią signalinį peptidą, tam, kad hibridinio geno produktas būtų teisingai išskiriamas per pieno liauką. Paprastai signaliniu peptidu galėtų būti aptariamo pieno baltymo geno signalinis peptidą arba signalinis peptidas susijęs su DNR seka, koduojančia BSSL variantą. Tačiau ir kitos signalinės sekos, sąlygojančios hibridinio geno produkto sekreciją per pieno liauką, taip pat tinka. Žinoma, atskiri hibridinio geno elementai turi būti taip sujungti, kad įvyktų teisinga geno produkto ekspresija ir procesingas. Todėl normaliai DNR seka, koduojanti pasirinktą signalinį peptidą, turi būti tiksliai prijungta prie DNR sekos, koduojančios BSSL variantą, N-galo dalies. DNR seka, koduojanti BSSL variantą, paprastai turi savąjį terminacijos kodoną, bet ne savo pranešimo nutraukimą ir poliadenilinimo saitą. Po DNR sekos, koduojančios BSSL variantą, paprastai paliekamos iRNR procesingo sekos, priklausančios pieno baltymo genui.
Nustatyta, kad už tam tikro hibridinio geno tikrąjį ekspresijos lygį atsako keletas faktorių. Labai svarbūs ekspresijos lygiui gali būti promotoriaus bei kitų reguliuojančių sekų ypatumai, kaip minėta aukščiau, žinduolio genomo vieta, į kurią integruojama ekspresijos sistema, pieno baltymą koduojančio geno vieta, į kurią įstatoma DNR seka, koduojanti BSSL variantą, elementai, sąlygojantys post-transkripcinę reguliaciją, ir kiti panašūs faktoriai. Pasiremdamas žiniomis apie įvairių faktorių įtaką hibridinio geno ekspresijos lygiui, žmogus, patyręs šioje srityje, turėtų žinoti kaip sukonstruoti ekspresijos sistemą, naudingą iškeltam tikslui.
Vartoti skirtas pieno baltymo genas gali būti išgautas iš tos pačios rūšies, į kurią bus įterpta ekspresijos sistema, arba jis gali būti kilęs iš kitos rūšies. Ryšium su paskutiniu atveju, buvo parodyta, kad valdymo elementai, nukreipiantys geno ekspresiją į pieno liauką, neturi rūšinių apribojimų, kas gali būti įmanoma dėl bendrų protėvių (Hennighausen, L., Riuz, L. & Wall, R. (1990): Current Opinion in Biotechnology 1, 7478).
Tarp paprastai įvairių žinduolių pieno išrūgose randamų baltymų yra tokių, kurie pateikia pavyzdžius tinkamų genų, koduojančių pieno baltymą ar jo veikliąją subseką ir kuriuos galima panaudoti konstruojant ekspresijos sistemą, pagal išradimą, pvz., išrūgų rūgščiojo baltymo (WAP) genas, geriau kai jis išgautas iš pelių, ir β-laktoglobulino genas, geriau kai jis išgautas iš avies. Kazeino genai, gauti iš įvairių šaltinių, taip pat gali būti panaudoti gaminant BSSL variantus transgeniniu būdu, pvz., avies aSl-kazeinas ir triušio β -kazeinas. Šiuo metu tinkamiausias yra pelių WAP genas, kadangi nustatyta, kad jis įvairių transgeniniu gyvūnų piene gali suteikti aukštą ekspresijos lygį keletui svetimų žmogaus baltymų (Hennighausen ir kt., 1990).
Kita seka, susieta su išradimo ekspresijos sistema, yra taip vadinama ekspresiją stabilizuojanti seka, kurios pagalba gaunamas aukštas ekspresijos lygis. Yra rimtų nuorodų, kad tokia stabilizuojanti seka yra netoli pieno baltymo genų pradžios.
Į išradimą taip pat įtrauktas nežmogiškos kilmės transgeniniu žinduolių, galinčių ekspresuoti BSSL variantą, gavimo būdas, susidedantis iš (a) aukščiau aprašytos ekspresijos sistemos įterpimo į nežmogiškos kilmės žinduolio apvaisintą kiaušinėlį ar embriono ląstelę ir (b) gauto apvaisinto kiaušinėlio ar embriono, introdukuoto į suaugusią nežmogiškos kilmės žinduolio patelę, išauginimo.
Ekspresijos sistemą galima įterpti į žinduolių gemalinę liniją panaudojant bet kurią tinkančią metodiką, pvz., kaip aprašyta „Manipulating the Mouse Embryo“ (Manipuliavimas su pelės embrionu); Laboratorinis vadovas, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1986. Pavyzdžiui, keletą šimtų ekspresijos sistemos molekulių galima tiesiogiai įšvirkšti į apvaisintą kiaušinėlį, pvz., į apvaisintą vienos ląstelės kiaušinėlį arba jo pro-branduolį, arba pasirinkto žinduolio gemalą ir vėliau po mikroįšvirkštimo kiaušinėliai perkeliami į pseudopastojusių įmočių kiaušintakius bei leidžiama jiems vystytis.
Nežmogiškos kilmės transgeniniu žinduolių, galinčių ekspresuoti BSSL variantą, gavimo būdas gali aip pat pasinaudoti atveju, kuomet minėtasis žinduolis iš esmės nesugeba ekspresuoti savo paties BSSL. Toks būdas susideda iš (a) žinduolio sugebėjimų ekspresuoti BSSL panaikinimo taip, kad žinduolio BSSL iš esmės neekspresuojama, ir aukščiau minėtos ekspresijos sistemos įstatymo į žinduolio gemalinę liniją taip, kad BSSL variantas yra ekspresu oj amas tame žinduolyje; ir/arba (b) žinduolio BSSL geno ar jo dalies pakeitimo aukščiau aprašytąją ekspresijos sistema.
Žinduolio BSSL ekspresijos sugebėjimus patogu panaikinti sukeliant mutacijas DNR sekoje, atsakingoje už BSSL ekspresiją. Tai gali būti mutacijos, pasenkančios DNR sekos nuskaitymo rėmelį, terminacijos kodono įvedimas arba vieno ar daugiau nukleotidų išmetimas iš DNR sekos.
Žinduolių BSSL genas ar jo dalis gali būti pakeista aukščiau apibrėžta ekspresijos sistema arba DNR seka, koduojančia BSSL variantą, panaudojant gerai žinomus homologinės rekombinacijos principus.
Kitas svarbus aspektas, susijęs su išradimu, tai aukščiau aprašytos DNR sekos įterpimas į transgeninių nežmogiškos kilmės žinduolių genomą. Geriau kai minėtoji DNR seka jau yra žinduolio gemalinėje linijoje ir žinduolio pieno baltymo gene. Geriau, kai nežmogiškos kilmės transgeninį žinduolį galima išrinkti iš grupės, kurią sudaro pelės, žiurkės, triušiai, avys, kiaulės ir raguočiai.
Į išradimą taip pat įtraukti aukščiau apibrėžtų transgeninių nežmogiškos kilmės žinduolių palikuonys bei pienas, gautas iš tokių transgeninių nežmogiškos kilmės žinduolių.
Toliau išradimas susijęs su mišiniais kūdikių mitybai, turinčiais aukščiau apibrėžto pieno, ir kūdikių mitybos mišiniais, turinčiais aukščiau apibrėžtą BSSL variantą. Kūdikių mišiniai gali būti ruošiami panaudojant tradicinius būdus ir turėti bet kokius būtinus priedus, tokius kaip mineralus, vitaminus ir kt.
Kitu aspektu išradimas susijęs su vaistinėmis sudėtimis, turinčiomis aukščiau apibrėžtą BSSL variantą, bei su tokio BSSL varianto panaudojimu gydymui.
Dar kitu aspektu išradimas susijęs su aukščiau apibrėžtu BSSL variantu, kai jis panaudojamas gaminti vaistus, skirtus gydyti patologines būsenas susijusias su egzokrininiu kasos nepakankamumu; pūslės fibrozė; lėtiniu pankreatitu; riebalų įsiurbimo sutrikimais; riebaluose tirpstančių vitaminų įsiurbimo sutrikimais; riebalų įsiurbimo sutrikimais dėl fiziologinių priežasčių. Išradimas taip pat siejasi su BSSL varianto panaudojimu gaminti vaistus, pagerinančius dietinių riebalų įsisavinimą, ypač neišnešiotiems kūdikiams.
PAVYZDŽIAI
1. REKOMBINANTINIO BSSL EKSPRESIJA EUKARIOTU IR PROKARIOTŲ
LĄSTELĖSE
1.1. EKSPERIMENTINĖ DALIS
1.1.1. Rekombinantinės plazmidės pS146 plazmidė, turinti 2,3 kb žmogaus BSSL cDNR (Nilsson ir kt., 1990), kuri buvo klonuota su pUC19, skaidoma Hind III ir Sal I. BSSL cDNR įterpta į jaučio papilomos viruso (BPV) ekspresijos vektorių pS147 (Fig. 1). Šis vektorius turi žmogaus BSSL cDNR, kurią kontroliuoja pelių metalotioneino 1 (mMT-1) enhanceris ir promotoriaus elementas (Pavlakis, G.N., and Hamer, D.H. (1983): Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, 397-401). iRNR procesingo signalai paimti iš triušio β-globino geno fragmento, apimančio dalį egzono II, introną II, egzoną III ir toliau einančius elementus. Šis transkripcinis vienetas klonuotas su vektoriumi, turinčiu visą BPV genomą. BPV ir BSSL transkripcinis vienetas transkribuojami ta pačia kryptimi. Kad vektorius galėtų daugintis E. coli viduje, jis taip pat turi pML2d, pBR322 darinį (Sarver, N., Byrne, J.C., and Howell, P.M. (1982): Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79, 7147-7151).
Ekspresijos vektorius pS147 transfekuotas kartu su vektoriumi, koduojančiu atsparumo neomicinui geną, kurį reguliuoja Harvey sarkomos viruso 5'-galo ilgojo pasikartojimo ir beždžionių viruso su 40 poliadenilinimo singalai (Lusky, M., and Botchan, M.R. (1984): Cell 36, 391-401).
Tam, kad E. coli ekspresuotų BSSL, BSSL cDNR subklonuotas kaip Ndel-BamHI fragmentas iš pT7-7 plazmidės (Ausubel, F.M., Brent R., Kingston, R.E., Moore, D.D., Seidman, J.G., Smith, J.A., Struhl, K. (eds) in: Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons, New York; edition of 1992) į pGEMEX-l plazmidę (promega, Madison, WI, JAV) (Studier, F.W. and Moffat, B.A.(1986): J.Mol. Biol. 189, 113-130). Šioje klonavimo procedūroje T7 geno 10 koduojanti seka pakeičiama BSSL genu, koduojančiu subrendusį baltymą, ir startiniu kodonu. Galutinis ekspresijos vektorius, pGEMEX/BSSL, patikrintas nustatant DNR seką, panaudojant specifinius BSSL vidinius pradmenis.
1.1.2. Mutagenezė
Numeris 1 suteiktas nukleotidui A iš iniciacijos kodono ATG. Numeruojant aminorūgštis, pirmajam signalinio peptido metioninui suteiktas -23 numeris, o pirmajai subrendusio baltymo aminorūgšties liekanai, alaninui, suteiktas numeris 1.
Kuriant variantą A su delecija (SEQ ID NO: 4), susintezuoti du PCR pradmenys, PCR-1 ir PCR-2 (1 lentelė). J/mdlII, Sali ir BčzraHI saitai sukurti tam, kad būtų galima klonuoti su skirtingomis plazmidėmis. Bell saitas BSSL sekoje sukurtas be aminorūgščių pakeitimų. Tai buvo padaryta tam, kad palengvėtų sintezuotų DNR prijungimas, norint gauti kitus variantus. Pradmuo PCR-2 turi du sintetinius terminacijos kodonus. Gauti PCR fragmentai buvo suskaidyti BamHI ir HindlII bei klonuoti pUC18, kad būtų galima nustatyti seką. Ši plazmidė pažymėta pS157. Tikslus PCR fragmentas įterptas į BPV ekspresijos vektorių, prijungiant prie BSSL sekos vieninteliame Asp700 saite (1405 vieta BSSL cDNR) ir Salį saite prieš β-globino geno fragmentą, taip gaunant pS257.
B varianto (SEQ ID NO: 5) konstravimas atliktas panaudojant oligonukleotidus, pažymėtus numeriais 3, 4, 7 ir 8 (1 lentelė). Renatūruoti oligonukleotidai koduoja kraštinę C-galo aminorūgščių seką, atitinkančią fragmentą nuo lizino 712 iki fenilalanino 722 pilno ilgio baltyme. Šis fragmentas prijungtas prie gliutamino 535. Transliacijos terminacijos seka įterpta po paskutinio fenilalanino. Šis fragmentas turi Bell saitą 5'-gale ir Salį saitą 3'-gale, todėl jį galima įterpti į pS157. Gautoji plazmidė suskaldyta Asp700 ir Salį ir gauta 313 bp fragmentas įterptas į ekspresijos vektorių, kaip aprašyta aukščiau. Gauta plazmidė buvo pažymėta pS258.
LENTELĖ.
Sintetiniai oligonukleotidai, panaudoti konstruojant BSSL variantus. Restrikcijos saitų nukleotidai pabraukti. Transliacijos terminacijos signalai pažymėti storesniu šriftu.
Varianto N pakeistas kodonas pažymėtas PCR-3 storesniu šriftu ir žvaigždute.
Oligonukle otidas Seka (5' - 3')
PCR-1 CGGGATCCGAAGCCCTTCGCCACCCCCACG
PCR-2 CGAAGCTTGTCGACTTACTACTGATCAGTCACTGTGGGCAGCGC CAG
PCR-3 GGGAATTCTGGCCATTGCTTGGGTGAAGAGGAATATCGCGGCC TTCGGGGGGGACCCCAACCAGATCACGCTCTTCGGGGAGTCT *
PCR-4 CGGGATCCCACATAGTGCAGCATGGGGTACTCCAGGCC
1 GATCAGGGGGCCCCCCCCGTGCCGCCCACGGGTGACTCCGGG
2 GCCCCCCCCGTGCCGCCCACGGGTGACTCCAAGGAAGCTCAGA
3 TGCCTGCAGTCATTAGGTTTTAGTAAGTCGACA
4 AGCTTGTCGACTTACTAAAACCTAATGACTG
5 CAGGCATCTGAGCTTCCTTGGAGTCACCCGTGGGCGGCACGGG GGGGGCCCCGGA
6 GTCACCCGTGGGCGGCACGGGGGGGGCCCCCT
7 GATCAGAAGGAAGCTCAGA
8 CAGGCATCTGAGCTTCCTTCT
Konstruojant geną, koduojantį C variantą (SEQ ID NO; 6), panaudoti oligonukleotidai, pažymėti numeriu nuo 1 iki 6 (1 lentelė). Renatūruotas DNR fragmentas turi du pasikartojimus, koduojančius vienuolika aminorūgščių, sutampančius su derintoju (Nilsson ir kt., 1990), įterptu tarp gliutamino 535 ir lizino 712 iki fenilalanino 722 sekos. Šis fragmentas taip pat turi Bell saitą 5'-gale ir Sali saitą 3'-gale, todėl galima laikytis tos pačios klonavimo strategijos.
Konstruojant variantą N (variantą be N-glikozilinimo, SEQ ID NO: 7), sintezuoti du PCR pradmenys (PCR-3 ir PCR-4 1 lentelėje). Kad būtų galima nustatyti seką, sukurti EcoRI ir BamHI saitai klonuojant 360 bp PCR produktą su pUC19. Potencialus Npririštasis glikozilinimo saitas, asparaginas 187 pakeistas gliutaminu. Modifikuota seka atskirta kaip Ball-HindlII fragmentas ir klonuota su SacI ir HindlII pagalba suskaidyta pUC19 kartu su SacI ir Bali fragmentu, turinčiu mMT-1 promotorių ir BSSL cDNR 5'galą. Apie 1,2 kb ilgio SacI-DralII fragmentas išskirtas iš šios plazmidės ir įterptas į ekspresijos vektoriaus mMT-1 elementą bei BSSL cDNR seką atitinkamai. Gauta plazmidė pažymėta pS299.
1.1.3. Žinduoliu ląstelių kultūra ir transfekcijos
Vektoriai buvo drauge transfekuoti į pelių ląstelių liniją C127 (ATCC CRL 1616), pagal kalcio fosfato precipitacijos būdą (Graham, F.L. and Van der Eb, A.J. (1973): Virology 52, 456-467).
C127 ląstelės augintos Ham'o F12-Dulbecco modifikuotoje Eagle'o terpėje (DMEM), (1:1) papildytoje 10% embrioninio veršiuko serumu. Neomicinui atsparių ląstelių klonai atrinkti panaudojant 1,5 mg x ml'l G418 ir po 10-15 dienų išaugę atsparių ląstelių klonai išskirti iš pagrindinių lėkštelių ir padauginti tyrimams.
1.1.4. Bakterijų kamienai ir auginimo sąlygos
Atliekant ekspresijos bandymus, vektorius pGEMEX/BSSL transformacijos būdu perneštas j E. coli JM109(DE3) ir BL21(DE3)pLysS kamienus. Ekspresijos bandymai atlikti pagal Studier ir kt. (1986) aprašymą. Surinkus bakterijų derlių, ląstelės nusodintos centrifūguojant (5000 x g, 10 min prie 4°C). Ruošiant periplazmos ir citoplazmos frakcijas, centrifugavimo nuosėdos pakartotinai suspenduotas panaudojant 4 ml 20 mM Tris-Cl/20% sacharozės, pH 8,0, 200 μΐ 0,1 M EDTA ir 40 μΐ lizocimo (15 mg/ml vandenyje) kiekvienam centrifugavimo nuosėdų gramui. Suspensija laikyta 40 minučių ant ledo. Pridėta po 160 μΐ 0,5 M MgCl2 kiekvienam centrifugavimo nuosėdų gramui, po to suspensija centrifūguota 20 minučių prie 12000 x g. Gautas supernatante buvo periplazmos proteinai, o centrifugavimo nuosėdose - citoplazmos frakcija. Ruošiant tirpiuosius baltymus, ląstelės suspenduotos 40 mM Tris-Cl, 0,1 mM EDTA, 0,5 mM fenilmetilsulfonilfloride, pH 8,2, ir lizuojant keletą kartų šaldomos ir atšildomos bei paveikiamos ultragarsu. Ląstelių lizatas centrifūguotas (30000 x g, 30 min prie 25 °C).
1.1.5. Nukleino rūgšties analizė
RNR ir DNR išskiriamos iš žinduolių ląstelių atskirtų linijų arba E.coli ląstelių (Ausubel ir kt., 1992). RNR ir DNR frakcionuojamos agarozės gelyje ir atliekamas blotingas su GeneScreen Plūs (New England Nuclear) bei hibridinama pagal tiekėjo instrukcijas.
1.1.6. Natyviu fermentu paruošimas
Tulžies druskos stimuliuojama lipazė išskirta iš moters pieno, kaip aprašyta anksčiau (Blackberg & Hernell, 1981). Kaip parodė SDS-PAGE analizė, išvalytas preparatas buvo homogeninis ir pasižymėjo 100 pmol riebiųjų rūgščių išskyrimo x min'l ir mg'l lyginamuoju aktyvumu, tiriant su ilgų grandinių triacilglicerolio substratu.
1.1.7. Fermentu bandinys
Fermentų bandinys atliktas pagal aprašymą (Blackberg & Hernell, 1981), naudojant kaip substratą trioleiną emulsijoje su gumiarabiku. Inkubuota su 10 mM natrio cholatu kaip aktyvuojančia tulžies druska. Tiriant priklausomybę nuo tulžies druskų (natrio cholato ir natrio dezoksicholato, Sigma Chem. Co.), pridedamų druskų koncentracijos atitiko nurodytas Fig 3.
1.1.8. Vestern blotingas
Blotingo bandymuose norint sustiprinti reakciją, kondicionuota terpė koncentruota chromatografiškai ant mėlynosios sefarozės (Pharmacia LKB Biotechnology). Atitinkama terpė sumaišyta su mėlynąja sefaroze (Apie 10 ml terpės kiekvienam gelio ml). Gelis perplautas (10 ml kiekvienam gelio ml) su 0,5 M Tris-Cl buferiu, turinčiu 0,1 M KCI, pH
7,4. Fermentų aktyvumas išplautas 1,5 M KCI tame pačiame buferyje. Naudojant šį būdą gautos 25-30 kartų didesnės koncentracijos, o taip pat 3-5 kartus didesnis grynumas. SDSPAGE atlikta 10% poliakrilamido gelyje, iš esmės pagal Laemmli (U.K. (1970): Nature (London) 227, 680-685). Po perkėlimo ant nitroceliuliozės membranų ir inkubacijos su polikloniniu triušių BSSL- antiserumu, panaudotas ožkos anti-triušinis IgG, konjuguotas su šarmine fosfataze, ir kiti reagentai iš Bio-Rad.
1.1.9. Poveikis N-glikozidaze F
Prie 10 μΐ varianto B, turinčio 2,5 μηαοί riebiųjų rūgščių išskyrimo x min'l BSSL aktyvumą, pridėta 1 μΐ 1M β-merkaptoetanolio ir 0,5 μΐ 10% (svoris/tūris) SDS. Pavirinus 5 minutes, pridėta 10 μΐ 0,1 M natrio fosfato buferio, pH 8,0, 6 μΐ 0,1 M EDTA, 4 μΐ 7,5% (svoris/tūris) Nonidet P40 ir 5 μΐ (1U) N-glikozidazės F (Boehringer Mannheim). Kontrolei, tas pats varianto B kiekis paveiktas tuo pačiu būdu tik be glikozidazės. Po inkubacijos per naktį prie 37 °C, atlikta pavyzdžių SDS-PAGE analizė ir blotingas, panaudojant polikloninį triušio BSSL- antiserumą.
1.2. REZULTATAI
1.2.1. BSSL variantu konstravimas (kūrimas)
BSSL variantų modifikacijos palyginti su pilno ilgio BSSL susumuotos 2 lentelėje ir Fig 1. Būdai, panaudoti kuriant šiuos variantus, aprašyti 1.1. skyriuje. Variante A (SEQ ID NO: 4) terminacijos kodonas įvestas po gliutamino, esančio 535 pozicijoje, tuo būdu iš pilno ilgio baltymo pašalintos paskutinės 187 aminorūgštys. Variante B (SEQ ID NO: 5) dalis, koduojanti 11 paskutiniųjų C-galo aminorūgščių, ir originali transliacijos pabaiga prijungti prie gliutamino 535. Taigi šis variantas neturi visų pasikartojimų. Variante C (SEQ ID NO: 6) fragmentas, kuriame yra du pasikartojimai, turintys seką, sutampančią su derintoju (Nilsson ir kt., 1990), įterptas tarp gliutamino 535 ir sekos nuo lizino 712 iki fenilalanino 722.
Norint nustatyti bandomosios N-prijungtosios angliavandeninės struktūros, esančios arti aktyviojo centro serino 194, svarbą, sukonstruotas kitas variantas. Variantas N (SEQ ID NO: 7) gautas pakeičiant potencialų N-glikozilinimo saitą, asparaginą 187, gliutaminu.
LENTELĖ
BSSL variantų aminorūgščių sekos palyginti su žmogaus BSSL.
Variantai Pašalintos liekanos Pakeistos liekanos
A (SEQ ID NO: 4) 536-722
B (SEQ ID NO: 5) 536-711
C (SEQ ID NO: 6) 536-568, 591-711
N (SEQ ID NO: 7) Asn 187 —> Gln
1.2.2. Rekombinantinės DNR apibudinimas žinduoliu ląstelių linijose
DNR pavyzdžiai paruošti iš ląstelių linijų, transfekuotų ekspresijos vektoriais, koduojančiais skirtingus BSSL variantus. Paruošta DNR skaidyta BnmHI, frakcionuota agarozės geliuose ir perkelta ant membranų hibridizacijai. Kaip zondas naudota 32p_ žymėta BSSL cDNR. Hibrizidacijos rezultatai patvirtino, kad rekombinantiniai genai egzistuoja ir taip pat, kad vektoriaus kopijų skaičius buvo apytiksliai lygus skirtingose ląstelių linijose (Fig. 2). Hibridizuotų fragmentų išsidėstymas atspindėjo skirtingus įvairių BSSL sekų ilgius ir sutapo su lauktais ilgiais. Išsidėstymas, kuris taip pat buvo panašus į DNR, išskirtos iš naudotų transekcijos bandymų bakterijų, rodė kad ląstelių linijose neįvyko didelių vektoriaus DNR persitvarkymų (Fig. 2 ). Viršutiniai hibridizacijos signalai DNR pavyzdyje, atstovaujančiame variantą A, geičiausiai gauti dėl dalinio suskaidymo.
1.2.3. Pilno ilgio ir mutantinio BSSL iRNR ekspresija žinduoliu ląstelėse
Rekombinantiniu BSSL genų ekspresijos tyrimui RNR išskirta iš atskirų ląstelių linijų. Northern blotingo eksperimentai ir hibridizacija su 32p_žymėtąja BSSL cDNR parodė, kad rekombinantinė iRNR aptinkama visose ląstelių linijose, priėmusiose BSSL vektorių (Fig. 3). Kontroliniuose pavyzdžiuose, paimtuose iš ląstelių linijų, turinčių tą patį vektorių, bet be BSSL cDNR, hibridizacija nebuvo aptikta (Fig. 3).
Skirtingi hibridizuotų iRNR ilgiai derinosi su cDNR modifikacijomis. Skirtingų pavyzdžių rekombinantiniu BSSL iRNR variantų kiekių lygiai buvo praktiškai tie patys, išskyrus variantą A (Fig. 3). Priežastis, dėl kurios varianto A iRNR blogiau kaupiama, nežinoma, bet tai buvo aptikta dvejose ląstelių linijų populiacijose, o taip pat išskirtuose klonuose. Hibridizacija su pelių β-aktino zondu patvirtino, kad skirtinguose pavyzdžiuose buvo vienodas RNR kiekis (Fig. 3, apatinė panelė).
1.2.4. Pilno ilgio BSSL ir BSSL variantu produkavimas žinduoliu ląstelėse
Surinkta terpė iš C127-ląstelių, transfekuotų pilno ilgio BSSL ir įvairiomis mutantinėmis formomis, atskirų klonų ir tirtas BSSL aktyvumas (Fig. 4). Klonuose su didžiausia ekspresija pilno ilgio molekulės ir variantų N, B ir C aktyvumai svyravo nuo 0,7 iki 2,3 ųmol riebiųjų rūgščių išlaisvinimo x min'f x terpės ml'l. Tai atitiko 7-23 ųg x terpės ml'l ekspresijos lygiams ir buvo artimas natyvaus pieno BSSL lyginamajam aktyvumui. Visi analizuoti klonai su variantu A pasižymėjo aktyvumu mažesniu už 0,05 ųmol riebiųjų rūgščių išlaisvinimo x min'1 x terpės mlf.Koncentravimas su mėlynąja sefaroze ir liofilizacija parodė, kad klonuose, pasižyminčiuose didžiausiu aktyvumu, aktyvus fermentas iš tikrųjų buvo ekspresuotas, nors labai žemu lygiu. Negalima atmesti galimybės, kad varianto A žemas aktyvumas iš dalies gali būti paaiškintas žymiai mažesniu specifiniu aktyvumu.
Klonų iš įvairių transfekcijos eksperimentų Western blotingo tyrimo duomenys parodyti . Fig. 5A. BSSL variantų Mr gauti kaip tikėtasi. Tačiau reikėtų pažymėti, kad pilno ilgio BSSL variantai, bei variantai B ir C davė dvigubas juostas. Kadangi visi trys turėjo intaktinį vienintelį N-glikozilinimo saitą tuo tarpu, kai variantas N, neparodęs dvigubos juostos, neturėjo šio saito, tai galimas paaiškinimas, jog tos dvigubos juostos kilusios dėl N-glikozilinimo skirtumų. Todėl variantas B buvo paveiktas N-glikozidaze F. Kaip parodyta Fig. 5B, iš viršutinės juostos liko tik pėdsakai, tuo tarpu apatinė juosta sustiprėjo, rodydama, kad tik dalis ekspresuoto varianto buvo N-glikozilinta.
Vienas būdingų BSSL bruožų yra specifinis aktyvavimasis esant pirminėms tulžies druskoms, pvz., cholatui (Hernell, 1975). Aktyvuojant cholatu, visos skirtingos rekombinantinės formos pasižymėjo ta pačia priklausomybe nuo koncentracijos (Fig. 6). Didžiausias aktyvumas naudotoje bandymų sistemoje buvo gautas prie apytiksliai 10 mM. Kai cholatas buvo pakeistas dezoksicholatu (antrine tulžies druska) stimuliacija nebuvo stebėta. Taigi pilno ilgio rekombinantas bei skirtingi variantai parodė tą patį specifiškumą aktyvavimo tulžies druskomis atžvilgiu.
1.2.5. Pilno ilgio BSSL ekspresija ir biocheminis apibūdinimas E.coli ląstelėse
Du E.coli kamienai, JM109(DE3) ir BL21(DE3)pLysS (Studier ir kt., 1986), transformuoti ekspresijos vektoriumi pGEMEX/BSSL, turinčiu žmogaus BSSL cDNR, kontroliuojamą T7 promotoriaus. Transformantai iš abiejų kamienų identifikuoti, auginti ir indukuoti paveikus IPTG apie 90 min (Studier ir kt., 1986). Visos iRNR Northern blotingo analizė, naudojant BSSL cDNR kaip 32P-žymėtąjį zondą, parodė, kad ekspresija buvo produktyviai indukuotą abiejuose kamienuose ir kad transkripcija buvo griežtai valdoma (Fig. 7A). Matomas rekombinantinės BSSL dydis, apytiksliai 2,4 kb, derinasi su lauktu ilgiu. Baltymo pavyzdžių atskyrimas su SDS-PAGE ir imunodetekcija su anti-BSSL antikūnais parodė, kad E.coli efektyviai gamina pilno ilgio BSSL (Fig. 7B). BL21(DE3)pLysS kamienas išskyrė į periplazmą daugiau proteino negu JM109(DE3) (Fig.7B).
Indukuotos su IPTG E.coli kultūros turėjo aktyvią tirpią BSSL, atitinkančią 0,5 - 4 ųg BSSL proteino/kultūros ml. Western blotingas parodė, kad 20-60% reaguojančios medžiagos buvo netirpiose centrifugavimo nuosėdose. Neindukuotos bakterijos nerodė jokio žymaus BSSL aktyvumo.
Lipazės aktyvumas iš išaugintų bakterijų turėjo tą pačią priklausomybę nuo tulžies druskų kaip ir natyvi pieno BSSL.
2. REKOMBINANTINĖS PILNO ILGIO IR JOS MUTANTINIŲ FORMŲ TULŽIES
DRUSKOS STIMULIUOJAMOS LIPAZĖS GRYNINIMAS IR APIBŪDINIMAS
2.1 EKSPERIMENTINĖ DALIS
2.1.1. Fermentai ir fermentu variantai
Rekombinantinė pilno ilgio BSSL ir BSSL variantai B, C ir N sukonstruoti ir ekspresuoti kaip aprašyta ankščiau. Lyginant su natyviu fermentu variantas B (SEQ ID NO: 5) neturėjo visų 16 unikalių, O-glikozilintų, turtingų prolinu C-galo pasikartojimų (536-711 aminorūgštys), o kraštinis C-galo fragmentas (712-722 aminorūgštys) buvo prijungtas prie gliutamino 535. Variantas C (SEQ ID NO: 6) turėjo tą patį C-galo fragmentą ir du pasikartojimus, 11 liekanų ilgio, tarp gliutamino 535 ir lizino 712. Variante N (variantas be N-glikozilinimo, SEQ ID NO: 7) asparaginas 187, atsakingas už vienintelį N-prijungtąjį cukrų, buvo pakeistas gliutamino liekana.
Natyvi BSSL išskirta iš moters pieno, kaip aprašyta (Blackberg & Hernell, 1981).
2.1.2. Fermentu išbandymas
Lipazės aktyvumas išbandytas, kaip aprašyta (Blackberg & Hernell, 1981), panaudojant kaip substratą trioleiną emulsijoje su gumiarabiku. Aktyvuojančia tulžies druska panaudotas natrio cholatas (10 mM). Skirtingos bandymų modifikacijos pateiktos brėžinių aprašymuose.
2.1.3. Imunosorbento paruošimas
Išgryninta pieno BSSL (3 mg) sujungta su sefaroze, panaudojant CNBr pagal gamintojų aprašą. 40 ml polikloninio antiserumo, gauto triušiuose prieš išgrynintą pieno BSSL, praleista pro kolonėlę. Specifiniai antikūnai išplauti 0,1 M glicinu-HCl, pH 2,5. pH privesta apytiksliai iki 8 naudojant kietą Tris. Po druskų pašalinimo ir liofilizacijos 6 mg afiniškai išvalytų antikūnų sujungta su sefaroze, kaip aprašyta aukščiau.
2.1.4. Gryninimo būdas
Kondicionuota auginimo terpė, turinti 5-25 pig rekombinantinės ekspresuotos BSSL ar BSSL varianto, sumaišyta su mėlynąja sefaroze (Pharmacia, Švedija), 10 ml terpės vienam gelio ml. Maišant 30 min gelis perplautas 0,05 M Tris-Cl, pH 7,0, 0,05 M KCI ir lipazės aktyvumas išplautas 0,05 M Tris-Cl, pH 7,0, 1,5 M KCI. Surinktas aktyvumo pikas ir dializuotas 5 mM natrio veronaliu, pH 7,4, 0,05 M NaCl. Dializatas praleistas pro heparino-Sefarozės kolonėlę. Kolonėlė išplauta NaCl gradientu nuo 0,05 iki 1,0 M, 5 mM natrio veronalio buferyje, pH 7,4. Frakcijos, pasižyminčios lipazės aktyvumu, surinktos ir panaudotos imunosorbentinėje kolonėlėje. Po plovimo su 0,05 M Tris-Cl, pH 7,0, 0,15 M NaCl lipazė išplauta 0,1 M glicino-HCl, pH 2,5. Frakcijų pH tuoj pat privestas apytiksliai iki 8 su kietu Tris.
2.1.5. Elektroforezė
Natrio dodecilsulfato poliakrilamido gelio elektroforezė (SDS-PAGE) atlikta pagal Laemmli (1970). Baltymai dažyti Commassie Brilliant Blue.
2.1.6. N-galo sekos analizė
Aminorugščių sekos nustatymas atliktas panaudojant Applied Biosystems Ine. 477A impulsinį skystos fazės sekvenserių ir on-line feniltiohidantoino analizatorių 120A su reguliarių ciklų programomis bei reagentais, gautais iš gamintojų. Pradinis ir pakartotinis apskaičiavimai pagal žinomos sekos standartinį baltymą (β-lactoglobuliną), buvo 47% ir 97%, atitinkamai.
2.2. REZULTATAI
2.2.1. Rekombinantinin BSSL ir BSSL variantu gryninimas
Kondicionuotos terpės chromatografija ant mėlynosios sefarozės pirmiausia panaudota koncentravimui. Tolesnės chromatografijos ant heparino-sefarozės pagalba pradinis gryninimas pasiektas pašalinus daugumą albuminų, esančių auginimo terpėje. Tai parodė, kad rekombinantinės BSSL molekulės visos išlaiko susirišimą su heparinu. Po apdorojimo imunosorbentu, kaip parodė SDS-PAGE (Fig. 8 ), visi BSSL variantai pasižymėjo grynumu didesniu už 90%. Pilno ilgio fermentas bei variantai B ir C migravo kaip dupletai. Skirtingų variantų Mr parodyti 3 lentelėje. N-galo sekos nustatymas išaiškino vienintelę seką visiems variantams iš 8 ciklų: Ala-Lys-Leu-Gly-Ala-Val-Tyr-Thr-.
2.2.2. Lipazės aktyvumas
Skirtingų preparatų molekulinė masė pateikta 3 lentelėje. Preparatų specifinis aktyvumas svyravo nuo 75 iki 120 ųmol laisvų riebiųjų rūgščių atskėlimo per vieną minutę vienam mg baltymo. Taigi neaptikta žymaus skirtumo tarp pilno ilgio BSSL ir BSSL variantų aktyvumo.
Kad preparatai veiktų ilgų grandinių triacilglicerolius emulsinėje būsenoje, visiems jiems būtinai reikėjo pirminės tulžies druskos (natrio cholato) (Fig. 9A). Natrio dezoksicholatas nestimuliavo nei vieno varianto (duomenys neparodyti). Tačiau kartu su kitomis tulžies druskomis dezoksicholatas parodė du efektus (Fig. 9B ir C ). Pirma, jis sumažindavo cholato koncentraciją, kurios reikėjo stimuliacijai, ir, antra, jis slopindavo fermento aktyvumą esant didesnėms tulžies druskos koncentracijoms.
LENTELĖ
Rekombinantinių pilno ilgio BSSL ir BSSL variantų Mr
Fermentas Mr (kDa) nustatytas pagal SDS-PAGE
Pilno ilgio 105,107
Variantas B 63,65
Variantas C 60,62
Variantas N 95
2.2.3. Rekombinantiniu BSSL ir BSSL variantu stabilumas
Rekombinantinės BSSL bei BSSL variantai pasižymėjo tuo pačiu pH stabilumu kaip ir natyvus pieno BSSL (Fig. 10). Visais atvejais inaktyvacija pasiekta prie pH apie 2,5-3. Virš pH 3 visi variantai buvo stabilūs jei baltymo koncentracijos buvo pakankamai aukštos. Tai padaryta pridėjus jaučio serumo albumino arba ovalbumino (duomenys neparodyti). Atskiesti pavyzdžiai buvo mažiau stabilūs prie visų išbandytų pH, bet slenkstis išliko tas pats (duomenys neparodyti). Pav. 11 parodytas rekombinantinio fermento termostabilumas, palyginus su natyviu pieno fermentu. Prie 37-40°C temperatūros aktyvumas pradeda mažėti. Variantai (B, C, N) buvo mažiau stabilūs, negu pilno ilgio rekombinantinis fermentas ir pieno fermentas. Tačiau, jei baltymo koncentracija padidinama pridedant jaučio serumo albumino, tai visi variantai būna atsparūs prie 40°C (Fig- H).
Natyvi pieno BSSL ir visi rekombinantiniai variantai jautrūs tripsinui. Rasta inaktyvacijos priklausomybė nuo laiko (Fig. 12). Tačiau, jei j buferį pridedama tulžies druskos, t.y. cholato, lipazės variantai apsaugomi ir aktyvumas išlaikomas (Fig. 12).
Taigi, daugelio in vitro požymių, t.y. tulžies druskų stimuliacijos, heparino surišimo, pH ir temperatūrinio stabilumo bei tulžies druskų apsaugos nuo proteazinės inaktyvacijos, atžvilgiu nebuvo aptikta žymių skirtumų tarp įvairių BSSL variantų ir natyvios pieno BSSL.
3. EKSPRESIJA TRANSGENINIUOSE GYVŪNUOSE
3.1. EKSPRESIJOS VEKTORIŲ KONSTRAVIMAS
Konstruojant ekspresijos vektorių, skirtą produkuoti rekombinantinį žmogaus BSSL variantą transgeninių žinduolių piene, buvo laikomasi šios strategijos (Fig. 13).
Trys plazmidės, turinčios skirtingas žmogaus BSSL geno dalis (pS309, pS310 ir pS311) buvo gautos pagal Lidberg, U., Nilsson, J., Stromberg, K., Stenman, G., Sahlin, P., Enerback, S.G. and Bjursell, G. (1992: Genomics 13, 630-640) aprašytą būdą. Plazmidė pS309 turi Sphl fragmentą, apimantį BSSL geną nuo 5' netranskribuojamos srities iki ketvirtojo introno dalies. Plazmidė pS31O turi SacI fragmentą, apimantį BSSL varianto geną nuo dalies pirmojo introno iki šeštojo introno dalies. Galiausiai, plazmidė pS311 turi
BamHI fragmentą, apimantį BSSL geną nuo didžiosios dalies penktojo introno ir visą likusią intronų/egzonų struktūrą su delecijomis egzone 11. Pašalintos sekos yra 231 bp, todėl gaunama seka, koduojanti BSSL variantą, kuris turi tiksliai 77 aminorūgštis arba septyniomis mažiau už pilno ilgio BSSL. Gauto BSSL varianto („variantas T“) nukleotidų seka pateikta Sekų Apraše kaip SEQ ID NO: 8. Varianto T aminorūgščių seka pateikta Sekų Apraše kaip SEQ ID NO: 9.
Dėl labai didelio pasikartojamumo žmogaus BSSL geno egzono 11 sekoje, reiktų tikėtis santykinai didelio persitvarkymų dažnio, kai ši seka klonuojama plazmidėje ir dauginama bakterijoje. Remiantis šiomis prielaidomis vienas norimas BSSL variantas, turintis sutrumpintą egzoną 11, buvo identifikuotas, išskirtas ir nustatyta jo seka.
Kita plazmidė, pS283, turinti dalį žmogaus BSSL cDNR, klonuotos plazmidėje pUC19 prie HindlII ir Sacl saitų, panaudota apjungti genomines sekas. Plazmidė pS283 taip pat panaudota gauti tinkamą restrikcijos fermentų saitą, KpnI, esantį BSSL 5' netransliuojamoje lyderinėje sekoje.
Plazmidė pS283 suskaidyta Ncol ir Sacl ir elektroforetiškai išskirtas apie 2,7 kb ilgio fragmentas. Plazmidė pS309 suskaidyta Ncol ir BspEI ir išskirtas apie 2,3 kb ilgio fragmentas, turintis BSSL geno 5' dalį. Plazmidė pS310 suskaidyta su BspEI ir Sacl ir išskirtas apie 2,7 kb ilgio fragmentas, turintis BSSL geno vidurinę dalį. Šie trys fragmentai sujungti ir transformuoti į kompetentinį E. coli kamieną TG2, o transformantai išskirti atrenkant ampicilinu.
Plazmidės paruoštos iš kelių transformantų ir viena plazmidė, pavadinta pS312 (Fig. 14), turinti norimą konstrukciją, panaudota tolimesniuose eksperimentuose.
Norint gauti modifikuotą pS311, kurioje BamHI saitas, esantis už terminacijos kodono, pakeistas Salį saitu tolimesnio klonavimo palengvinimui, panaudotas toks būdas. Plazmidė pS311 linearizuota dalinai suskaidant BamHI. Linearizuotas fragmentas atskirtas ir įterptas sintetinis DNR linkeris, pakeičiantis BamHI į Salį saitą (5'-GATCGTCGAC-3'), tuo būdu suardant BamHI saitą. Kadangi buvo dvi potencialios vietos integruotis sintetiniams linkeriams, gautos plazmidės išanalizuotos skaidant restrikciniais fermentais. Plazmidė, su įterptu linkeriu norimoje vietoje už egzono 11, buvo išskirta ir pažymėta pS313.
Gaunant galutinę ekspresijos vektoriaus konstrukciją, turinčią žmogaus BSSL variantų sekas, panaudotas egzistuojantis ekspresijos vektorius, pS314, sukonstruotas taip, kad sąlygotų specifinę stadijoms ir audiniui ekspresiją pieno liaukos ląstelėse laktacijos metu. Plazmidė pS314 turi genominį fragmentą iš pelių išrūgų rūgštinio baltymo (WAP) geno (Campbell, S.M., Rosen, J.M., Hennighausen, L.G., Strech-Jurk, U. and Sippel, A.E. (1984): Nucleic Acid Res. 12, 8685-8697), klonuotą kaip NotI fragmentas. Genominis fragmentas turi apie 4,5 kb priekyje esančių valdymo sekų (URS), visus keturis pelių WAP egzonus ir visas intronų sekas bei apie 3 kb seką, esančią po paskutinio egzono. Vienintelis
KpnI saitas yra pirmame egzone 24 kb ankščiau už natūralų WAP transliacijos iniciacijos kodoną. Kitas vienintelis restrikcinio fermento saitas yra Salį saitas, esantis egzone 3.
Žmogaus BSSL varianto genominė seka įstatyta tarp KpnI ir Salį saitų, naudojant šią strategiją. Pirma, pS314 suskaidyta panaudojant KpnI ir Salį ir fragmentas, turintis perskeltą plazmidę, išskirtas elektroforetiškai. Antra, pS312 suskaidyta panaudojant KpnI ir BamHI, ir išskirtas apie 4,7 kb fragmentas, turintis žmogaus BSSL geno 5' dalį. Trečia, pS313 suskaidyta panaudojant BamHI ir Salį, ir išskirta žmogaus BSSL geno 3' dalis.Gauti trys fragmentai sujungti, transformuoti į kompetentines E.coli bakterijas ir transformantai išskirti po selekcijos ampicilinu.
Plazmidės paruoštos iš kelių transformantų ir atliktas restrikcinis kartografavimas bei sekos analizė. Viena plazmidė, turinti norimą ekspresijos vektorių, identifikuota ir pažymėta kaip pS317 (Fig. 15).
Šalinant prokariotinės plazmidės sekas, pS317 suskaidyta Notl. Po to rekombinantinio vektoriaus elementas, sudarytas iš pelių WAP sekos, esantis šalia žmogaus BSSL varianto genominio fragmento, atskirtas naudojant elektroforezę agarozei. Prieš įvedant į pelės embrioną atskirtas fragmentas išgrynintas naudojant elektroeliuciją.
Rekombinantinis genas, skirtas žmogaus BSSL varianto ekspresijai transgeninių pelių piene pavaizduotas Fig. 16.
3.2. Transgeninių gyvūnu sukūrimas
Notl fragmentas išskirtas iš plazmidės pS317 pagal būdą, aprašytą 3.1. skyriuje. Šis DNR fragmentas, turi pelių WAP promotorių, prijungtą prie genominės sekos, koduojančios žmogaus BSSL variantą. Išskirtas fragmentas, 3 ng/μΐ koncentracijoje, įšvirkštas į 350 C57Bl/6JxCBA/2J-f2 embrionų pronukleusus, gautus iš pelių donorių, kurioms sukelta superovuliacija įvedant 5 IU nėščios kumelės serumo gonadotropino. C57Bl/6JxCBA/2J-fi gyvūnai gauti iš Bomholtgard Veisimo ir tyrimų centro LTD, Ry, Danija. Surinkus embrionus iš kiaušintakių, jie atskirti nuo iškylos (cumulus oophorus) ląstelių paveikiant hialuronidaze terpėje M2 (Hogan, B., Constantini, F. and Lacy, E. (1986): Manipulating the mouse embryo. A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press). Perplauti embrionai perkelti į terpę M16 (Hogan ir kt., 1986) ir laikyti inkubatoriuje su 5% CO2 atmosfera. Įšvirkščiama buvo M2 terpės mikrolašeliuose, su lengvo parafino aliejumi, naudojant Narishigi hidraulinius mikromanipuliatorius ir Nikon inversinį mikroskopą su Nomarski optika. Įšvirkštus 267 sveikai atrodantys embrionai implantuoti į 12 pseudonėščių C57Bl/6JxCBA/2J-fi recipienčių, kurioms į pilvo ertmę įvesta 0,35 ml 2,5% avertino. Atliekant PCR analizę su DNR, gauta iš uodegos biopsijos pavyzdžių, paimtų iš gyvūnų praėjus trims savaitėms po gimimo, nustatytos, pelės, kurios integravo transgeną. Teigiami rezultatai patvirtinti Southern blotingo analize.
Surenkant pieną patelėms, esančioms laktacijos periode, leista į pilvo ertmę po 2 IU oksitocino, ir po 10 minučių anestezuota suleidžiant į pilvo ertmę 0,40 ml 2,5% avertino. Pieno surinkimo įrenginys prijungtas prie spenelių silikonizuotais vamzdeliais ir pienas rinktas j 1,5 ml Eppendorfo mėgintuvėlius švelniai masažuojant pieno liaukas. Pieno kiekis svyravo priklausomai nuo laktacijos dienos nuo 0,1 iki 0,5 ml vienai pelei per melžimą.
3.3. BSSL VARIANTU EKSPRESIJA TRANSGENINĖSE PELĖSE
Transgeninės pelės identifikuotos analizuojant DNR, gautą iš uodegos biopsijos pavyzdžių. Šie audinio pavyzdžiai inkubuoti su proteinazę K ir ekstrahuoti fenolu/chloroformu. Išskirta DNR naudota polimerazės grandininėse reakcijose su pradmenimis, kurie amplifikuoja specifinius fragmentus, jei yra heterologinė įterpta DNR, turinti ekspresijos vektoriaus fragmentą. Gyvūnai taip pat buvo tirti DNR hibridizacijos būdu tam, kad pasitvirtintų PCR duomenys ir sužinota informacija apie integruotų vektoriaus elementų kopijų skaičių.
Vienoje bandymų grupėje dviem būdais ištirta 31 pelė ir rezultatai parodė, kad 1 pelė turi heterologinį DNR vektoriaus elementą, gautą iš pS317. PCR analizės ir hibridizacijos bandymų rezultatai sutapo (Fig. 17). 10 iš 65 tirtų gyvūnų buvo transgeniniai pS317 atžvilgiu.
Pelės, identifikuotos kaip vektoriaus DNR elemento nešėjos (gyvūnai-įkūrėjai), po to suporuotos ir tais pačiais būdais identifikuoti Fl, palikuonys turintys transgeną.
RNR, išskirta iš pS317 transgeninių patelių įvairių audinių per laktacijos periodą, išskirta panaudojant agarozės formaldehido gelio elektroforezę, atliktas jos blotingas prie membranų ir hibridizuota su 32p_žymėtąja BSSL cDNR, naudojama kaip zondas. Gauti rezultatai parodė, jog ekspresija buvo tik pieno liaukose laktacijos periodu (Fig. 18).
Pieno pavyzdžiai surinkti iš anestezuotų gyvūnų-įkūrėjų, paveiktų oksitocinu, laktacijos indukcijai , ir tirti ar yra rekombinantinis žmogaus BSSL variantas. Tirta SDSPAGE būdu, po to perkeliant ant nitroceliuliozės membranų ir inkubuojant su polikloniniais antikūnais, pagamintais prieš natyvią žmogaus BSSL. Gauti rezultatai parodė rekombinantinio žmogaus BSSL varianto ekspresiją transgeninių pelių piene. Fig. 19 rodo rekombinantinio žmogaus BSSL varianto buvimą transgeninių pelių piene. Pieno pavyzdžių, gautų iš įvairių pS317 transgeninių pelių, išskyrimas SDS-PAGE būdu ir imunoblotingas parodė, kad rekombinantinis BSSL variantas, turintis mažesnę molekulinę masę, gaminamas efektyviau palyginus su pilno ilgio rekombinantiniu BSSL variantu, gautu iš pS314 transgeninių pelių pieno. Plazmidė pS314 panaši į pS317, bet turi pilno ilgio žmogaus BSSL cDNR, vietoj genominio varianto. Dviguba juosta, matoma visuose pelių pieno pavyzdžiuose, yra pelių BSSL, ir tuo rodo serumo kryžminį reaktyvumą. Ši išvada patvirtinta aptikus, kad ši dviguba juosta matoma 9 takelyje Fig. 19, kuriame yra išgrynintą pelių BSSL.
Sukurtos stabilios transgeninių gyvūnų linijos.
Panašiai gali būti sukurti kiti transgeniniai gyvūnai, tokie kaip triušiai, karvės ar avys, galintys ekspresuoti žmogaus BSSL variantą.
DEPOZITAI
Šios plazmidės buvo deponuotos pagal Budapešto sutartį muziejuje DSM (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen):
Plazmide Depozito No. Deponavimo data
pS309 DSM 7101
pS310 DSM 7102
pS311 DSM 7103 1992 birželio 12
pS317 DSM 7104
pS147 DSM 7495
pS257 DSM 7496 1993 vasario 26
pS299 DSM 7497
pS258 DSM 7501
pS259 DSM 7502 1993 kovo 3
TRUMPAS ILIUSTRACIJŲ APRAŠYMAS
Figūra 1
A. BPV pagrindu sukurto vektoriaus, naudoto įvairių BSSL variantų, ekspresijai planas.
B. Ištirtų įvairių BSSL variantų schema. FL žymi pilno ilgio BSSL. Aktyvusis centras pažymėtas rutuliuku, saitas potencialiam N-prijungtam angliavandeniui pažymėtas trikampiu. Sritis, turinti pasikartojimus, išskirta užbrūkšniuota zona, o konservatyvus Cgalas pažymėtas ištisai užpildyta zona.
Figūra 2
DNR, išskirtos iš ląstelių linijų, ekspresuojančių BSSL variantus, Southern blotingo analizė. Tirta DNR, išskirta iš ląstelių linijų, ekspresuoj ančių pilno ilgio BSSL (FL), variantą A (A), variantą B (B), variantą C (C), variantą N (N). 5 ųg atitinkamai paruoštos DNR, išskirtos iš ląstelės (kairėje), ir 1 ng išgrynintos vektoriaus DNR, išskirtos iš bakterijų (dešinėje) suskaidytos BamHI. DNR pavyzdžiai išskirti agarozės gelyje, perkelti ant GeneScreen Plūs membranos ir hibridizuoti su 32p.žymėtąja žmogaus BSSL cDNR.
Figūra 3
RNR, išskirtos iš ląstelių linijų, ekspresuojančių rekombinantinius BSSL variantus, Northern blotingo analizė. Tirta 10 ųg RNR, išskirtos iš ląstelių linijų, gaminančių pilno ilgio BSSL (FL), variantą A (A), variantą B (B), variantą C (C), variantą N (N). RNR iš 027 ląstelių linijos, turinčios BPV vektorių, identišką vektoriui iš Pav. 1, išskyrus tai, kad jis koduoja baltymą negiminingą BSSL, naudotas kaip neigiama kontrolė (-) (viršutinė dalis). Filtrai hibridizuoti su 32p_žymėtąja BSSL cDNR. Po to filtrai pakartotinai hibridizuoti su pelių β-aktino cDNR zondu, β-aktino iRNR signalai (apatinė dalis) naudoti kaip vidinė kontrolė RNR kiekiui, užneštam į kiekvieną takelį.
Figūra 4
BSSL aktyvumo ekspresija 027 ląstelėse, transfekuotose pilno ilgio ir mutantinėmis žmogaus BSSL formomis. 027 ląstelės buvo transfekuotos skirtingomis BSSL kostrukcijomis: pilno ilgio BSSL (FL), variantu N (N), variantu C (C), variantu B (B), variantu A (A). Po pradinio auginimo periodo, atrinkti atskiri klonai ir leista jiems augti iki susiliejimo. Atrinktų klonų skaičius (n) pažymėtas paveikslėlyje. Lipazės aktyvumas nustatytas kondicionuotoje terpėje. Reikšmės išreikštos išskirtų laisvų riebiųjų rūgščių μ mol x min'l x kondicionuotos terpės ml'l.
Figūra 5
A. Pilno ilgio ir mutantinės rekombinantinės BSSL Western blotingas. Lipazės aktyvumas, išreikštas išskirtų riebiųjų rūgščių pmol x minl, gelyje užnešta: pilno ilgio 0,2 (1 takelis), variantas N 0,16 (2 takelis), variantas C 0,6 (3 takelis), variantas B 0,8 (4 takelis), natyvus BSSL 0,1 (5 takelis). Naudotas antiserumas buvo gautas triušiuose prieš BSSL, išskirtą iš moters pieno. Molekulinės masės markerių (iš anksto padažytas SDSPAGE standartas, Low Range, BioRad) padėtys parodytos kairėje.
B. Varianto B, paveikto N-glikozidaze, Western blotingas. Variantas B suskaidytos N-glikozidaze F, kaip aprašyta eksperimentinėje dalyje. 1 takelyje nepaveiktas, o 2 takelyje paveiktas variantas B.
Figūra 6
Pilno ilgo ir mutantinio BSSL priklausomybė nuo tulžies druskų. Nustatytas lipazės aktyvumas keičiant natrio cholato (ištisinė linija) arba natrio dezoksicholato (punktyrinė linija) koncentracijas kondicionuotoje terpėje, naudojant pilno ilgio rekombinantinį BSSL (*), variantą A (□), variantą B (Δ), variantą C (), variantą N (O) ir išgrynintą žmogaus pieno BSSL (O). Varianto A atveju kondicionuota terpė sukoncentruota ant mėlynosios sefarozės, kaip aprašyta eksperimentinėje dalyje. Atitinkamo fermento kiekis parinktas toks, kad gautųsi tas pats didžiausio aktyvumo lygis, išskyrus variantą A, kurio didžiausias aktyvumas sudarė tik vieną dešimtąją kitų. Kontroliniai bandymai parodė, kad auginimo terpė neturi įtakos aktyvumo lygiui arba natyvios BSSL priklausomybei nuo tulžies druskų (duomenys neparodyti).
Figūra 7
A. Įvairių E.coli kamienų, pagamintų BSSL, Northern blotingas. Bakterijos indukuotos IPTG, kaip aprašyta eksperimentinėje dalyje. Bandymo sąlygos buvo tokios pat, kaip Pav. 2 apraše. 1 takelis, neindukuotas BL21(DE3)pLysS kamienas; 2 takelis, indukuotas BL21(DE3)pLysS kamienas; 3 takelis, neindukuotas JM109(DE3) kamienas; 4 takelis, indukuotas JM109(DE3) kamienas;
B. 8-18% SDS-PAGE Western blotingas, naudojant antikūnus prieš išgrynintą pieno BSSL, rodantis rekombinantinės BSSL ekspresiją skirtinguose E.coli kamienuose, naudojant pGEMEX. Bakterijos indukuotos IPTG ir citoplazminiai bei periplazminiai baltymai išskirti iš lizatų, kaip aprašyta eksperimentinėje dalyje. Bakterinių baltymų kiekiai, užnešti į 2-5 takelius (periplazminiai preparatai) ir į 7-10 takelius (citoplazminiai preparatai), atitinka tą patį kultūros tūrį, todėl dažų dėmės proporcingos produkcijos lygiui. 1 takelis, Pharmacia molekulinės masės markeris; 2 ir 8 takeliai, indukuotas JM109(DE3) kamienas; 3 ir 7 takeliai, neindukuotas JM109(DE3) kamienas; 4 ir 10 takeliai, indukuotas BL21(DE3)pLysS kamienas; 5 ir 9 takeliai, neindukuotas BL21(DE3)pLysS kamienas; 6 takelis, 25 ng išgryninto natyvaus pieno BSSL.
Figūra 8
Išgrynintos rekombinantinės BSSL ir BSSL variantų SDS-PAGE. Pilno ilgio BSSL (FL) ir BSSL variantai N, B ir C išgryninti kaip aprašyta. Kiekvieno panaudota 3 pg, išskyrus variantą B, kurio buvo panaudoti 1,5 pg. Išgrynintos natyvios pieno BSSL (NAT) panaudota 5 pg. Molekulinės masės markerių pozicijos pažymėtos kairėje.
Figūra 9
Natrio dezoksicholato įtaka rekombinantinės BSSL ir BSSL variantų aktyvacijai natrio cholatu. Ištirtas lipazinis aktyvumas rekombinantinės pilno ilgio BSSL (O), rekombinantiniu BSSL variantų B (O), C () ir N (Δ) išgrynintų preparatų ir išgrynintos natyvios pieno BSSL (□) prie skirtingų natrio cholato koncentracijų, be (kairioji panelė) ir su 5 mM (centrinė panelė) arba 10 mM (dešinioji panelė) dezoksicholato.
Figūra 10
Rekombinantinės BSSL ir BSSL variantų stabilumas prie skirtingų pH. Natyvi BSSL, rekombinantinė pilno ilgio BSSL ir BSSL variantai inkubuoti prie 37 °C skirtinguose buferiuose su pH 2-8. Visi buferiai turėjo 1 mg/ml jaučio serumo albumino. Po 30 min paimti vienodo dydžio mėginiai ir tirtas jų lipazinis aktyvumas. Simbolių paaiškinimo žiūrėk Fig 9 apraše.
Figūra 11
Rekombinantinės BSSL ir BSSL variantų atsparumas kaitinimui. Išgryninta rekombinantinė pilno ilgio BSSL, BSSL variantai ir natyvi pieno BSSL inkubuoti prie nurodytų temperatūrų 50 mM Tris-Cl buferyje, pH 7,5. Viena pavyzdžių grupė turėjo 1 mg/ml jaučio serumo albumino. Po 30 min paimti mėginiai ir tirtas jų lipazinis aktyvumas. Aktyvumai išreikšti kaip procentai nuo kiekvieno pavyzdžio aktyvumo prie 0 min. Simbolių paaiškinimo žiūrėk Fig 9 apraše.
Figūra 12
Tulžies druskų įtaka rekombinantinės BSSL ir BSSL variantų inaktyvavimui tripsinu. Išgryninta rekombinantinė pilno ilgio BSSL, BSSL variantai ir natyvi pieno BSSL (15 pi, turintys 1-4 pg) pridėti į 60 pi 1,0 M Tris-Cl, pH 7,4, su 10 pg tripsino (TPCK-tripsin, Boehringer-Mannheim) prie 25 °C, be (punktyrinė linija) ir su (ištisinė linija) 10 mM natrio cholatu. Po nurodyto laiko buvo paimti vienodo dydžio mėginiai ir ištirtas jų lipazinis aktyvumas. Reikšmės išreikštos kaip procentai nuo reikšmių, gautų kontrolinėse inkubacijose be tripsino. Simbolių paaiškinimo žiūrėk Fig 9 apraše.
Figūra 13
Plazmidės pS317 gamybos būdas. Smulkiau žiūrėk 3.1 skyriuje.
Figūra 14
Plazmidės pS312 sandaros schema.
Figūra 15
Plazmidės pS317 sandaros schema.
Figūra 16
Schema, vaizduojanti žmogaus BSSL varianto genominės sandaros fizinę padėtį WAP geno pimajame egzone, kaip aprašyta 3.1 skyriuje.
Figūra 17
A. PCR pradmenų, vartotų identifikuojant transgeninius gyvūnus, išsidėtymo schema. 5'-pradmuo išsidėsto prie WAP sekos, pradedant nuo 148 bp pozicijos prieš WAP ir BSSL varianto sujungimo tašką. 3'-pradmuo išsidėsto prie pirmo BSSL varianto introno, kuris baigiasi 400 bp žemiau sujungimo taško.
B. Vartotų PCR pradmenų sekos.
C. Potencialių gyvūnų-įkūrėjų tipiška PCR analizė agarozės gelyje. M: molekulinės masės markeriai. 1 takelis: kontrolinis PCR produktas, gautas iš plazmidės pS317. 2-13 takelis: PCR reakcijos, atliktos su DNR preparatais iš potencialių gyvūnų-įkūrėjų.
Figūra 18
RNR, išskirtos iš pS317 transgeninės pelės patelės įvairių audinių, Northern blotingas. Audiniai išskirti ketvirtą laktacijos dieną. 10 ųg visos RNR iš kiekvieno audinio tirta išskyrus agaru-formaldehidu ir perkėlus ant membranų bei hibridinant su 32p. žymėtąja žmogaus BSSL cDNR. Takeliuose yra Mg:pieno liaukos; Li: kepenų; Ki: inkstų; Sp: blužnies; He: širdies; Lu: plaučių; Sg: seilių liaukos; Br: smegenų. RNR dydis, išreikštas nukleotidais, pažymėtas kairėje.
Figūra 19
Pieno, gauto iš pS317 transgeninių pelių, ir pilno ilgio cDNR vektoriaus pS314 transgeninių pelių bei kontrolinių gyvūnų, Western blotingas. Bandiniai išskirti SDSPAGE būdu ir perkelti į Immobilon filtrus bei atliktas imuninis blotingas, naudojant atiserumą, gautą prieš natyvią žmogaus BSSL. 1 takelis: molekulinės masės markeriai; 2,3 ir 4 takeliai: 2 μΐ pieno iš pS317 įkūrėjo #91 trijų Fl dukterų (Fl 30, 31, ir 33); 5 takelis: 2 μΐ pieno iš pS314 įkūrėjo #90; 6,7 ir 8 takeliai: 2 μΐ pieno iš trijų neturinčių BSSL transgeninių gyvūnų; 9 takelis: išgryninta pelių BSSL; 10 takelis: išgryninta žmogaus natyvi BSSL.
SEKŲ APRAŠAS (1) BENDRA INFORMACIJA (1) PAREIŠKĖJAI:
(A) VARDAS: AB ASTRA (B) GATVĖ: Kvarnbergagatan 16 (C) MIESTAS: Sodertalje (E) ŠALIS: Švedija (F) PAŠTO KODAS (ZIP): S-151 85 (G) TELEFONAS: +46-8-55 32 60 00 (H) TELEFAKSAS: +46-8-55 32 88 20 (I) TELEKSAS: 19237 astras (ii) IŠRADIMO PAVADINIMAS: Nauji polipeptidai (iii) SEKŲ SKAIČIUS: 9 (iv) KOMPIUTERIU NUSKAITOMA FORMA:
(A) NEŠIKLIO TIPAS: Minkštasis diskas (B) KOMPIUTERIS: Suderinamas su IBM PC (C) OPERACINĖ SISTEMA: PC-DOS/MS-DOS (D) PROGRAMA: Patentln Release #1.0, Versija #1.25 (EPO) (2) SEQ ID no: 1 inforMACIJA:
(i) SEKOS CHARAKTERISTIKOS:
(A) ILGIS: 2428 bazių poros (B) TIPAS: nukleino rūgštis (C) SUSIVIJIMAS: dvigubas (D) TOPOLOGIJA: linijinė (ii) MOLEKULĖS TIPAS: cDNR, gauta iš iRNR (iii) HIPOTETINĖ: ne (iii) ANTIPRASMINĖ: ne (vi) ORIGINALO ŠALTINIS:
(A) ORGANIZMAS: Homo sapiens (F) AUDINIO TIPAS: pieno liauka (ix) YPATYBĖ:
(A) VARDAS/RAKTAS: CDS (B) PADĖTIS: 82.. 2319 (D) KITA INFORMACIJA: /produktas = „tulžies druskomis stimuliuojama lipazė“ (ix) YPATYBĖ:
(A) VARDAS/RAKTAS: egzonas (B) PADĖTIS: 985 .. 1173 (ix) YPATYBĖ:
(A) VARDAS/RAKTAS: egzonas (B) PADĖTIS: 1174 .. 1377 (ix) YPATYBĖ:
(A) VARDAS/RAKTAS: egzonas (B) PADĖTIS: 1378 . . 1575 (ix) YPATYBĖ:
(A) VARDAS/RAKTAS: egzonas (B) PADĖTIS: 1576 .. 2415 (ix) YPATYBĖ:
(A) VARDAS/RAKTAS: subrendęs peptidas (B) PADĖTIS: 151.. 2316 (ix) YPATYBĖ:
(A) VARDAS/RAKTAS: polyA signalas (B) PADĖTIS: 2397 .. 2402 (ix) YPATYBĖ:
(A) VARDAS/RAKTAS: pasikartojimų sritis (B) PADĖTIS: 1756 .. 2283 (ix) YPATYBĖ:
(A) VARDAS/RAKTAS: 5'UTR (B) PADĖTIS: 1.. 81 (ix) YPATYBĖ:
(A) VARDAS/RAKTAS: pasikartojimo vienetas (B) PADĖTIS: 1756 .. 1788 (ix) YPATYBĖ:
(A) VARDAS/RAKTAS: pasikartojimo vienetas (B) PADĖTIS: 1789 .. 1821 (ix) YPATYBĖ:
(A) VARDAS/RAKTAS: pasikartojimo vienetas (B) PADĖTIS: 1822 .. 1854 (ix) YPATYBĖ:
(A) VARDAS/RAKTAS: pasikartojimo vienetas (B) PADĖTIS: 1855 .. 1887 (ix) YPATYBĖ:
(A) VARDAS/RAKTAS: pasikartojimo vienetas (B) PADĖTIS: 1888 .. 1920 (ix) YPATYBĖ:
(A) VARDAS/RAKTAS: pasikartojimo vienetas (B) PADĖTIS: 1921.. 1953 (ix) YPATYBĖ:
(A) VARDAS/RAKTAS: pasikartojimo vienetas (B) PADĖTIS: 1954 .. 1986 (ix) YPATYBĖ:
(A524) VARDAS/RAKTAS: pasikartojimo vienetas (B) PADĖTIS: 1987 .. 2019 (ix) YPATYBĖ:
(A) VARDAS/RAKTAS: pasikartojimo vienetas (B) PADĖTIS: 2020 .. 2052 (ix) YPATYBĖ:
(A) VARDAS/RAKTAS: pasikartojimo vienetas (B) PADĖTIS: 2053 .. 2085 (ix) YPATYBĖ:
(A) VARDAS/RAKTAS: pasikartojimo vienetas (B) PADĖTIS: 2086.. 2118 (ix) YPATYBĖ:
(A) VARDAS/RAKTAS: pasikartojimo vienetas (B) PADĖTIS: 2119.. 2151 (ix) YPATYBĖ:
(A) VARDAS/RAKTAS: pasikartojimo vienetas (B) PADĖTIS: 2152 .. 2184 (ix) YPATYBĖ:
(A) VARDAS/RAKTAS: pasikartojimo vienetas (B) PADĖTIS: 2185 .. 2217 (ix) YPATYBĖ:
(A) VARDAS/RAKTAS: pasikartojimo vienetas (B) PADĖTIS: 2218 . . 2250 (ix) YPATYBĖ:
(A) VARDAS/RAKTAS: pasikartojimo vienetas (B) PADĖTIS: 2251.. 2283 (xi) SEKOS ATVAIZDAVIMAS: SEQ ID NO: 1:
ACCTTCTGTA TCAGTTAAGT GTCAAGATGG AAGGAACAGC AGTCTCAAGA TAATGCAAAG 60
agtttattca tccagaggct g ATG Met -23 CTC Leu ACC Thr ATG GGG CGC Arg CTG Leu CAA Gln CTG Leu -15 GTT Vai 111
Met -20 Gly
GTG TTG GGC CTC ACC TGC TGC TGG GCA GTG GCG AGT GCC GCG AAG CTG 159
Vai Leu Gly Leu Thr Cys Cys Trp Ala Vai Ala Ser Ala Ala Lys Leu
-10 -5 1
GGC GCC GTG TAC ACA GAA GGT GGG TTC GTG GAA GGC GTC AAT AAG AAG 207
Gly Ala Vai Tyr Thr Glu Gly Gly Phe Vai Glu Gly Vai Asn Lys Lys
5 10 15
CTC GGC CTC CTG GGT GAC TCT GTG GAC ATC TTC AAG GGC ATC CCC TTC 255
Leu Gly Leu Leu Gly Asp Ser Vai Asp Ile Phe Lys Gly Ile Pro Phe
20 25 30 35
GCA GCT CCC ACC AAG GCC CTG GAA AAT CCT CAG CCA CAT CCT GGC TGG 303
Ala Ala Pro Thr Lys Ala Leu Glu Asn Pro Gln Pro His Pro Gly Trp
40 45 50
CAA GGG ACC CTG AAG GCC AAG AAC TTC AAG AAG AGA TGC CTG CAG GCC 351
Gln Gly Thr Leu Lys Ala Lys Asn Phe Lys Lys Arg Cys Leu Gln Ala
55 60 65
ACC ATC ACC CAG GAC AGC ACC TAC GGG GAT GAA GAC TGC CTG TAC CTC 399
Thr Ile Thr Gln Asp Ser Thr Tyr Gly Asp Glu Asp Cys Leu Tyr Leu
70 75 80
AAC ATT TGG GTG CCC CAG GGC AGG AAG CAA GTC TCC CGG GAC CTG CCC 447
Asn Ile Trp Vai Pro Gln Gly Arg Lys Gln Vai Ser Arg Asp Leu Pro
85 90 95
GTT ATG ATC TGG ATC TAT GGA GGC GCC TTC CTC ATG GGG TCC GGC CAT 495
Vai Met Ile Trp Ile Tyr Gly Gly Ala Phe Leu Met Gly Ser Gly His
100 .· 105 110 115
GGG GCC AAC TTC CTC AAC AAC TAC CTG TAT GAC GGC GAG GAG ATC GCC 543
Gly Ala Asn Phe Leu Asn Asn Tyr Leu Tyr Asp Gly Glu Glu Ile Ala
120 125 130
ACA CGC GGA AAC GTC ATC GTG GTC ACC TTC AAC TAC CGT GTC GGC CCC 591
Thr Arg Gly Asn Vai Ile Vai Vai Thr Phe. Asn Tyr Arg Vai Gly Pro
135 140 145
CTT GGG TTC CTC AGC ACT GGG GAC GCC AAT CTG CCA GGT AAC TAT GGC 639
Leu Gly Phe Leu Ser Thr Gly Asp Ala Asn Leu Pro Gly Asn Tyr Gly
150 155 160
CTT CGG GAT CAG CAC ATG GCC ATT GCT TGG GTG AAG AGG AAT ATC GCG 687
Leu Arg Asp Gln His Met Ala Ile Ala Trp Vai Lys Arg Asn Ile Ala
165 170 175
GCC Ala 180 TTC Phe GGG GGG GAC CCC AAC AAC ATC ACG CTC TTC GGG GAG TCT GCT 735
Gly Gly Asp Pro 185 Asn Asn Ile Thr Leu 190 Phe Gly Glu Ser Ala 195
GGA GGT GCC AGC GTC TCT CTG CAG ACC CTC TCC CCC TAC AAC AAG GGC 783
Gly Gly Ala Ser Vai Ser Leu Gln Thr Leu Ser Pro Tyr Asn Lys Gly
200 205 210
CTC ATC CGG CGA GCC ATC AGC CAG AGC GGC GTG GCC CTG AGT CCC TGG 831
Leu Ile Arg Arg Ala Ile Ser Gln Ser Gly Vai Ala Leu Ser Pro Trp
215 220 225
GTC ATC CAG AAA AAC CCA CTC TTC TGG GCC AAA AAG GTG GCT GAG AAG 879
Vai Ile Gln Lys Asn Pro Leu Phe Trp Ala Lys Lys Vai Ala Glu Lys
230 235 240
GTG GGT TGC CCT GTG GGT GAT GCC GCC AGG ATG GCC CAG TGT CTG AAG 927
Vai Gly Cys Pro Vai Gly Asp Ala Ala Arg Met Ala Gln Cys Leu Lys
245 250 255
GTT ACT GAT CCC CGA GCC CTG ACG CTG GCC TAT AAG GTG CCG CTG GCA 975
Vai Thr Asp Pro Arg Ala Leu Thr Leu Ala Tyr Lys Vai Pro Leu Ala
260 265 270 275
GGC CTG GAG TAC CCC ATG CTG CAC TAT GTG GGC TTC GTC CCT GTC ATT 1023
Gly Leu Glu Tyr Pro Met Leu His Tyr Vai Gly Phe Vai Pro Vai Ile
280 285 290
GAT GGA GAC TTC ATC CCC GCT GAC CCG ATC AAC CTG TAC GCC AAC GCC 1071
Asp Gly Asp Phe Ile Pro Ala Asp Pro Ile Asn Leu Tyr Ala Asn Ala
295 300 305
GCC GAC ATC GAC TAT ATA GCA GGC ACC AAC AAC ATG GAC GGC CAC ATC 1119
Ala Asp Ile Asp Tyr Ile Ala Gly Thr Asn Asn Met Asp Gly His Ile
310 315 320
TTC GCC AGC ATC GAC ATG CCT GCC ATC AAC AAG GGC AAC AAG AAA GTC 1167
Phe Ala Ser Ile Asp Met Pro Ala Ile Asn Lys Gly Asn Lys Lys Vai
325 330 335
ACG GAG GAG GAC TTC TAC AAG CTG GTC AGT GAG TTC ACA ATC ACC AAG 1215
Thr Glu Glu Asp Phe Tyr Lys Leu Vai Ser Glu Phe Thr Ile Thr Lys
340 345 350 355
GGG CTC AGA GGC GCC AAG ACG ACC TTT GAT GTC TAC ACC GAG TCC TGG 1263
Gly Leu Arg Gly Ala Lys Thr Thr Phe Asp Vai Tyr Thr Glu Ser Trp
360 365 370
GCC CAG GAC CCA TCC CAG GAG AAT AAG AAG AAG ACT GTG GTG GAC TTT 1311
Ala Gln Asp Pro Ser Gln Glu Asn Lys Lys Lys Thr Vai Vai Asp Phe
375 380 385
GAG ACC GAT GTC CTC TTC CTG GTG CCC ACC GAG ATT GCC CTA GCC CAG 1359
Glu Thr Asp Vai Leu Phe Leu Vai Pro Thr Glu Ile Ala Leu Ala Gln
390 395 400
CAC AGA GCC AAT GCC AAG AGT GCC AAG ACC TAC GCC TAC CTG TTT TCC 1407
His Arg Ala Asn Ala Lys Ser Ala Lys Thr Tyr Ala Tyr Leu Phe Ser
405 410 415
CAT CCC TCT CGG ATG ccc GTC TAC CCC AAA TGG GTG GGG GCC GAC CAT 1455
His Pro Ser Arg Met Pro Vai Tyr Pro Lys Trp Vai Gly Ala Asp His
420 425 430 435
GCA GAT GAC ATT CAG TAC GTT TTC GGG AAG CCC TTC GCC ACC CCC ACG 1503
Ala Asp Asp Ile Gln Tyr Vai Phe Gly Lys Pro Phe Ala Thr Pro Thr
440 445 450
GGC TAC CGG CCC CAA GAC AGG ACA GTC TCT AAG GCC ATG ATC GCC TAC 1551
Gly Tyr Arg Pro 455 Gln Asp Arg Thr Vai 460 Ser Lys Ala Met Ile 465 Ala Tyr
TGG ACC AAC TTT GCC AAA ACA GGG GAC CCC AAC ATG GGC GAC TCG GCT 1599
Trp Thr Asn 470 Phe Ala Lys Thr Gly 475 Asp Pro Asn Met Gly 480 Asp Ser Ala
GTG CCC ACA CAC TGG GAA CCC TAC ACT ACG GAA AAC AGC GGC TAC CTG 1647
Vai Pro 485 Thr His Trp Glu Pro 490 Tyr Thr Thr Glu Asn 495 Ser Gly Tyr Leu
GAG ATC ACC AAG AAG ATG GGC AGC AGC TCC ATG AAG CGG AGC CTG AGA 1695
Glu 500 Ile Thr Lys Lys Met 505 Gly Ser Ser Ser Met 510 Lys Arg Ser Leu Arg 515
ACC AAC TTC CTG CGC TAC TGG ACC CTC ACC TAT CTG GCG CTG CCC ACA 1743
Thr Asn Phe Leu Arg 520 Tyr Trp Thr Leu Thr 525 Tyr Leu Ala Leu Pro 530 Thr
GTG ACC GAC CAG GAG GCC ACC CCT GTG CCC CCC ACA GGG GAC TCC GAG 1791
Vai Thr Asp Gln 535 Glu Ala Thr Pro Vai 540 Pro Pro Thr Gly Asp 545 Ser Glu
GCC ACT CCC GTG CCC CCC ACG GGT GAC TCC GAG ACC GCC CCC GTG CCG 1839
Ala Thr Pro 550 Vai Pro Pro Thr Gly 555 Asp Ser Glu Thr Ala 560 Pro Vai Pro
CCC ACG GGT GAC TCC GGG GCC CCC CCC GTG CCG CCC ACG GGT GAC TCC 1887
Pro Thr 565 Gly Asp Ser Gly Ala 570 Pro Pro Vai Pro Pro 575 Thr Gly Asp Ser
GGG GCC CCC CCC GTG CCG CCC ACG GGT GAC TCC GGG GCC CCC CCC GTG 1935
Gly 580 Ala Pro Pro Vai Pro 585 Pro Thr Gly Asp Ser 590 Gly Ala Pro Pro Vai 595
CCG CCC ACG GGT GAC TCC GGG GCC CCC CCC GTG CCG CCC ACG GGT GAC 1983
Pro Pro Thr Gly Asp 600 Ser Gly Ala Pro Pro 605 Vai Pro Pro Thr Gly 610 Asp
TCC GGG GCC CCC CCC GTG CCG CCC ACG GGT GAC TCC GGG GCC CCC CCC 2031
Ser Gly Ala Pro 615 Pro Vai Pro Pro Thr 620 Gly Asp Ser Gly Ala 625 Pro Pro
GTG CCG CCC ACG GGT GAC TCC GGC GCC CCC CCC GTG CCG CCC ACG GGT 2079
Vai Pro Pro 630 Thr Gly Asp Ser Gly 635 Ala Pro Pro Vai Pro 640 Pro Thr Gly
GAC GCC GGG CCC CCC CCC GTG CCG CCC ACG GGT GAC TCC GGC GCC CCC 2127
Asp Ala 645 Gly Pro Pro Pro Vai 650 Pro Pro Thr Gly Asp 655 Ser Gly Ala Pro
CCC GTG CCG CCC ACG GGT GAC TCC GGG GCC CCC CCC GTG ACC CCC ACG 2175
Pro 660 Vai Pro Pro Thr Gly 665 Asp Ser Gly Ala Pro 670 Pro Vai Thr Pro Thr 675
GGT GAC TCC GAG ACC GCC CCC GTG CCG CCC ACG GGT GAC TCC GGG GCC 2223
Gly Asp Ser Glu Thr 680 Ala Pro Vai Pro Pro 685 Thr Gly Asp Ser Gly 690 Ala
CCC CCT GTG CCC CCC ACG GGT GAC TCT GAG GCT GCC CCT GTG CCC CCC 2271
Pro Pro Vai Pro 695 Pro Thr Gly Asp Ser 700 Glu Ala Ala Pro Vai 705 Pro Pro
ACA GAT GAC TCC AAG GAA GCT CAG ATG CCT GCA GTC ATT AGG TTT TAGCGTCCCA
2326
Thr Asp Asp Ser Lys Glu Ala Gln Met Pro Ala Vai Ile Arg Phe
710 715 720
TGAGCCTTGG TATCAAGAGG CCACAAGAGT GGGACCCCAG GGGCTCCCCT CCCATCTTGA
GCTCTTCCTG AATAAAGCCT CATACCCCTA AAAAAAAAAA AA
2386
2428 (2) SWQ ID NO: 2 INFORMACIJA:
(i) SEKOS CHARAKTERISTIKOS:
(A) ILGIS: 745 aminorūgštys (B) TIPAS: aminorūgštis (D) TOPOLOGIJA: linijinė (ii) MOLEKULĖS TIPAS: baltymas (») SEKOS ATVAIZDAVIMAS: SEQ ID NO: 2:
Met -23 Leu Thr Met -20 Gly Arg Leu Gln Leu -15 Vai Vai Leu Gly Leu -10 Thr Cys
Cys Trp Ala -5 Vai Ala Ser Ala Ala 1 Lys Leu Gly Ala 5 Vai Tyr Thr Glu
Gly 10 Gly Phe Vai Glu Gly 15 Vai Asn Lys Lys Leu 20 Gly Leu Leu Gly Asp 25
Ser Vai Asp Ile Phe 30 Lys Gly Ile Pro Phe 35 Ala Ala Pro Thr Lys 40 Ala
Leu Glu Asn Pro 45 Gln Pro His Pro Gly 50 Trp Gln Gly Thr Leu 55 Lys Ala
Lys Asn Phe 60 Lys Lys Arg Cys Leu 65 Gln Ala Thr Ile Thr 70 Gln Asp Ser
Thr Tyr 75 Gly Asp Glu Asp Cys 80 Leu Tyr Leu Asn Ile 85 Trp Vai Pro Gln
Gly 90 Arg Lys Gln Vai Ser 95 Arg Asp Leu Pro Vai 100 Met Ile Trp Ile Tyr 105
Gly Gly Ala Phe Leu 110 Met Gly Ser Gly His 115 Gly Ala Asn Phe Leu 120 Asn
Asn Tyr Leu Tyr 125 Asp Gly Glu Glu Ile 130 Ala Thr Arg Gly Asn 135 Vai Ile
Vai Vai Thr 140 Phe Asn Tyr Arg Vai 145 Gly Pro Leu Gly Phe 150 Leu Ser Thr
Gly •Asp 155 Ala Asn Leu Pro Gly 160 Asn Tyr Gly Leu Arg 165 Asp Gln His Met
Ala 170 Ile Ala Trp Vai Lys 175 Arg Asn Ile Ala Ala 180 Phe Gly Gly Asp Pro 185
Asn Asn Ile Thr Leu 190 Phe Gly Glu Ser Ala 195 Gly Gly Ala Ser Vai 200 Ser
Lęu Gln Thr Leu 205 Ser Pro Tyr Asn Lys 210 Gly Leu Ile Arg Arg 215 Ala Ile
Ser Gln Ser 220 Gly Vai Ala Leu Ser 225 Pro Trp Vai Ile Gln 230 Lys Asn Pro
Leu Phe 235 Trp Ala Lys Lys Vai 240 Ala Glu Lys Vai 32 Gly 245 Cys Pro Vai Gly
Asp Ala Ala Arg Met Ala Gln Cys Leu Lys Vai Thr Asp Pro Arg Ala
250
255
260
265
Leu Thr Leu Ala. Tyr 270 Lys Vai Pro Leu Ala 275 Gly Leu Glu Tyr Pro 280 Met
Leu His Tyr Vai 285 Gly Phe Vai Pro Vai 290 lle Asp Gly Asp Phe 295 lle Pro
Ala Asp Pro 300 lle Asn Leu Tyr Ala 305 Asn Ala Ala Asp lle 310 Asp Tyr lle
Ala Gly 315 Thr Asn Asn Met Asp 320 Gly His lle Phe Ala 325 Ser He Asp Met
Pro 330 Ala lle Asn Lys Gly 335 Asn Lys Lys Vai Thr 340 Glu Glu Asp Phe Tyr 345
Lys Leu Vai Ser Glu 350 Phe Thr lle Thr Lys 355 Gly Leu Arg Gly Ala 360 Lys
Thr Thr Phe Asp 365 Vai Tyr Thr Glu Ser 370 Trp Ala Gln Asp Pro 375 Ser Gln
Glu Asn Lys 380 Lys Lys Thr Vai Vai 385 Asp Phe Glu Thr Asp 390 Vai Leu Phe
Leu Vai 395 Pro Thr Glu lle Ala 400 Leu Ala Gln His Arg 405 Ala Asn Ala Lys
Ser 410 Ala Lys Thr Tyr Ala 415 Tyr Leu Phe Ser His 420 Pro Ser Arg Met Pro 425
Vai Tyr Pro Lys Trp 430 Vai Gly Ala Asp His 435 Ala Asp Asp lle Gln 440 Tyr
Vai Phe Gly Lys 445 Pro Phe Ala Thr Pro 450 Thr Gly Tyr Arg Pro 455 Gln Asp
Arg Thr Vai 460 Ser Lys Ala Met lle 465 Ala Tyr Trp Thr Asn 470 Phe Ala Lys
Thr Gly 475 Asp Pro Asn Met Gly 480 Asp Ser Ala Vai Pro 485 Thr His Trp Glu
Pro 490 Tyr Thr Thr Glu Asn 495 Ser Gly Tyr Leu Glu 500 lle Thr Lys Lys Met 505
Gly Ser Ser Ser Met 510 Lys Arg Ser Leu Arg 515 Thr Asn Phe Leu Arg 520 Tyr
Trp Thr Leu Thr 525 Tyr Leu Ala Leu Pro 530 Thr Vai Thr Asp Gln 535 Glu Ala
Thr Pro Vai 540 Pro Pro Thr Gly Asp 545 Ser Glu Ala Thr Pro 550 Vai Pro Pro
Thr Gly 555 Asp Ser Glu Thr Ala 560 Pro Vai Pro Pro Thr 565 Gly Asp Ser Gly
Ala 570 Pro Pro Vai Pro Pro 575 Thr Gly Asp Ser Gly 580 Ala Pro Pro Vai Pro 585
Pro Thr Gly Asp Ser 590 Gly Ala Pro Pro Vai 595 Pro Pro Thr Gly Asp 600 Ser
Gly Ala Pro Pro 605 Vai Pro Pro Thr Gly 610 Asp Ser 33 Gly Ala Pro 615 Pro Vai
Pro Pro Thr 620 Gly Asp Ser Gly Ala 625 Pro Pro Vai Pro Pro 630 Thr Gly Asp
Ser Gly 635 Ala Pro Pro Vai Pro 640 Pro Thr Gly Asp Ala 645 Gly Pro Pro Pro
Vai 650 Pro Pro Thr Gly Asp 655 Ser Gly Ala Pro Pro 660 Vai Pro Pro Thr Gly 665
Asp Ser Gly Ala Pro 670 Pro Vai Thr Pro Thr 675 Gly Asp Ser Glu Thr 680 Ala
Pro Vai Pro Pro 685 Thr Gly Asp Ser Gly 690 Ala Pro Pro Vai Pro 695 Pro Thr
Gly Asp Ser 700 Glu Ala Ala Pro Vai 705 Pro Pro Thr Asp Asp 710 Ser Lys Glu
Ala Gln 715 Met Pro Ala Vai Ile 720 Arg Phe
(2) SEQ ID NO: 3 INFORMACIJA:
(i) SEKOS CHARAKTERISTIKOS:
(A) ILGIS: 722 aminorūgštys (B) TIPAS: aminorūgštis (D) TOPOLOGIJA: linijinė (ii) MOLEKULĖS TIPAS: baltymas (iii) HIPOTETINĖ: ne (vi) ORIGINALO ŠALTINIS:
(A) ORGANIZMAS: Homo sapiens (F) AUDINIO TIPAS: pieno liauka (xi) SEKOS ATVAIZDAVIMAS: SEQ ID NO: 3:
Ala 1 Lys Le'u Gly Ala 5 Vai Tyr Thr Glu Gly 10 Gly Phe Vai Glu Gly 15 Vai
Asn Lys Lys Leu 20 Gly Leu Leu Gly Asp 25 Ser Vai Asp Ile Phe 30 Lys Gly
Ile Pro Phe 35 Ala Ala Pro Thr Lys 40 Ala Leu Glu Asn Pro 45 Gln Pro His
Pro Gly 50 Trp Gln Gly Thr Leu 55 Lys Ala Lys Asn Phe 60 Lys Lys Arg Cys
Leu 65 Gln Ala Thr Ile Thr 70 Gln .Asp Ser Thr Tyr 75 Gly Asp Glu Asp Cys 80
Lfeu Tyr Leu Asn Ile. 85 .Trp Vai Pro Gln Gly 90 Arg Lys Gln Vai Ser 95 Arg
Asp Leu Pro Vai 100 Met Ile Trp Ile Tyr 105 Gly Gly Ala Phe Leu 110 Met Gly
Ser Gly His 115 Gly Ala Asn Phe Leu 120 Asn Asn Tyr Leu Tyr 125 Asp Gly Glu
Glu Ile 130 Ala Thr Arg Gly Asn 135 Vai Ile 34 Vai Vai Thr 140 Phe Asn Tyr Arg
Vai 145 Gly Pro Leu Gly Phe 150 Leu Ser Thr Gly Asp 155 Ala Asn Leu Pro Gly 160
Asn Tyr Gly Leu Arg 165 Asp Gln His Met Ala 170 Ile Ala Trp Vai Lys 175 Arg
Asn Ile Ala Ala 180 Phe Gly Gly Asp Pro 185 Asn Asn Ile Thr Leu 190 Phe Gly
Glu Ser Ala 195 Gly Gly Ala Ser Vai 200 Ser Leu Gln Thr Leu 205 Ser Pro Tyr
Asn Lys 210 Gly Leu Ile Arg Arg 215 Ala Ile Ser Gln Ser 220 Gly Vai Ala Leu
Ser 225 Pro Trp Vai Ile Gln 230 Lys Asn Pro Leu Phe 235 Trp Ala Lys Lys Vai 240
Ala Glu Lys Vai Gly 245 Cys Pro Vai Gly Asp 250 Ala Ala Arg Met Ala 255 Gln
Cys Leu Lys Vai 260 Thr Asp Pro Arg Ala 265 Leu Thr Leu Ala Tyr 270 Lys Vai
Pro Leu Ala 275 Gly Leu Glu Tyr Pro 280 Met Leu His Tyr Vai 285 Gly Phe Vai
Pro Vai 290 Ile Asp Gly Asp Phe 295 Ile Pro Ala Asp Pro 300 Ile Asn Leu Tyr
Ala 305 Asn Ala Ala Asp Ile 310 Asp Tyr Ile Ala Gly 315 Thr Asn Asn Met Asp 320
Gly His Ile Phe Ala 325 Ser Ile Asp Met Pro 330 Ala Ile Asn Lys Gly 335 Asn
Lys Lys Vai Thr 340 Glu Glu Asp Phe Tyr 345 Lys Leu Vai Ser Glu 350 Phe Thr
Ile Thr Lys 355 Gly Leu Arg Gly Ala 360 Lys Thr Thr Phe Asp 365 Vai Tyr Thr
Glu Ser 370 Trp Ala Gln Asp Pro 375 Ser Gln Glu Asn Lys 380 Lys Lys Thr Vai
Vai 385 Asp Phe Glu Thr Asp 390 Vai Leu Phe Leu Vai 395 Pro Thr Glu Ile Ala 400
Leu Ala Gln His Arg 405 Ala Asn Ala Lys Ser 410 Ala Lys Thr Tyr Ala 415 Tyr
Leu Phe Ser His 420 Pro Ser Arg Met Pro 425 Vai Tyr Pro Lys Trp 430 Vai Gly
Ala Asp His 435 Ala Asp Asp Ile Gln 440 Tyr Vai Phe Gly Lys 445 Pro Phe Ala
Thr Pro 450 Thr Gly Tyr Arg Pro 455 Gln Asp Arg Thr Vai 460 Ser Lys Ala Met
Ile 465 Ala Tyr Trp Thr Asn 470 Phe Ala Lys Thr Gly 475 Asp Pro Asn Met Gly 480
Asp Ser Ala Vai Pro 485 Thr His Trp Glu' Pro 490 Tyr Thr Thr Glu Asn 495 Ser
Gly Tyr Leu Glu 500 Ile Thr Lys Lys Met5 Gly 505 Ser Ser Ser Met 510 Lys Arg
Ser Leu Arg 515 Thr Asn Phe Leu Arg 520 Tyr Trp Thr Leu Thr 525 Tyr Leu Ala
Leu Pro 530 Thr Vai Thr Asp Gln 535 Glu Ala Thr Pro Vai 540 Pro Pro Thr Gly
Asp 545 Ser Glu Ala Thr Pro 550 Vai Pro Pro Thr Gly 555 Asp Ser Glu Thr Ala 560
Pro Vai Pro Pro Thr 565 Gly Asp Ser Gly Ala 570 Pro Pro Vai Pro Pro 575 Thr
Gly Asp Ser Gly 580 Ala Pro Pro Vai Pro 585 Pro Thr Gly Asp Ser 590 Gly Ala
Pro Pro Vai 595 Pro Pro Thr Gly Asp 600 Ser Gly Ala Pro Pro 605 Vai Pro Pro
Thr Gly 610 Asp Ser Gly Ala Pro 615 Pro Vai Pro Pro Thr 620 Gly Asp Ser Gly
Ala 625 Pro Pro Vai Pro Pro 630 Thr Gly Asp Ser Gly 635 Ala Pro Pro Vai Pro 640
Pro Thr Gly Asp Ala 645 Gly Pro Pro Pro Vai 650 Pro Pro Thr Gly Asp 655 Ser
Gly Ala Pro Pro 660 Vai Pro Pro Thr Gly 665 Asp Ser Gly Ala Pro 670 Pro Vai
Thr Pro Thr 675 Gly Asp Ser Glu Thr 680 Ala Pro Vai Pro Pro 685 Thr Gly Asp
Ser Gly 690 Ala Pro Pro Vai Pro 695 Pro Thr Gly Asp Ser 700 Glu Ala Ala Pro
Vai 705 Pro Pro Thr Asp Asp 710 Ser Lys Glu Ala Gln 715 Met Pro Ala Vai lle 720
Arg Phe (2) SEQ ID NO: 4 INFORMACIJA:
(i) SEKOS CHARAKTERISTIKOS:
(A) ILGIS: 535 aminorūgštys (B) TIPAS: aminorūgštis (D) TOPOLOGIJA: linijinė (ii) . MOLEKULĖS TIPAS: baltymas (iii) HIPOTETINĖ: ne (vi) ORIGINALO ŠALTINIS:
(A) ORGANIZMAS: Homo sapiens (F) AUDINIO TIPAS: pieno liauka (ix) YPATYBĖ:
(A) VARDAS/RAKTAS: Peptidas (B) PADĖHS: 1.. 535 (D) KITA INFORMACIJA: / žymė= Variantas_A (xi) SEKOS ATVAIZDAVIMAS: SEQ ID NO: 4:
Ala Lys Leu Gly Ala Vai Tyr Thr Glu Gly Gly Phe Vai Glu Gly Vai 1 5 36 io 15
Asn Lys Lys Leu 20 Gly Leu Leu Gly Asp 25 Ser Vai Asp Ile Phe 30 Lys Gly
Ile Pro Phe 35 Ala Ala Pro Thr Lys 40 Ala Leu Glu Asn Pro 45 Gln Pro His
Pro Gly 50 Trp Gln Gly Thr Leu 55 Lys Ala Lys Asn Phe 60 Lys Lys Arg Cys
Leu 65 Gln Ala Thr Ile Thr 70 Gln Asp Ser Thr Tyr 75 Gly Asp Glu Asp Cys 80
Leu Tyr Leu Asn Ile 85 Trp Vai Pro Gln Gly 90 Arg Lys Gln Vai Ser 95 Arg
Asp Leu Pro Vai 100 Met Ile Trp Ile Tyr 105 Gly Gly Ala Phe Leu 110 Met Gly
Ser Gly His 115 Gly Ala Asn Phe Leu 120 Asn Asn Tyr Leu Tyr 125 Asp Gly Glu
Glu Ile 130 Ala Thr Arg Gly Asn 135 Vai Ile Vai Vai Thr 140 Phe Asn Tyr Arg
Vai 145 Gly Pro Leu Gly Phe 150 Leu Ser Thr Gly Asp 155 Ala Asn Leu Pro Gly 160
Asn Tyr Gly Leu Arg 165 Asp Gln His Met Ala 170 Ile Ala Trp Vai Lys 175 Arg
Asn Ile Ala Ala 180 Phe Gly Gly Asp Pro 185 Asn Asn Ile Thr Leu 190 Phe Gly
Glu Ser Ala 195 Gly Gly Ala Ser Vai 200 Ser Leu Gln Thr Leu 205 Ser Pro Tyr
Asn Lys 210 Gly Leu Ile Arg Arg 215 Ala Ile Ser Gln Ser 220 Gly Vai Ala Leu
Ser 225 Pro Trp Vai Ile Gln 230 Lys Asn Pro Leu Phe 235 Trp Ala Lys Lys Vai 240
Ala Glu Lys Vai Gly 245 Cys Pro Vai Gly Asp 250 Ala Ala Arg Met Ala 255 Gln
Cys Leu Lys Vai 260 Thr Asp Pro Arg Ala 265 Leu Thr Leu Ala Tyr 270 Lys Vai
Pro Leu Ala 275 Gly Leu Glu Tyr Pro 280 Met Leu His Tyr Vai 285 Gly Phe Vai
Pro Vai 290 Ile- Asp Gly Asp Phe 295 Ile Pro Ala Asp Pro 300 Ile Asn Leu Tyr
Ala 305 Asn.. Ala’ Ala Asp Ile 310 Asp Tyr Ile Ala Gly 315 Thr Asn Asn Met Asp 320
Gly His Ile Phe Ala 325 Ser Ile Asp Met Pro 330 Ala Ile Asn Lys Gly 335 Asn
Lys Lys Vai Thr 340 Glu Glu Asp Phe Tyr 345 Lys Leu Vai Ser Glu 350 Phe Thr
Ile Thr Lys 355 Gly Leu Arg Gly Ala 360 Lys Thr Thr Phe Asp 365 Vai Tyr Thr
Glu Ser 370 Trp Ala Gln Asp Pro 375 Ser Gln JJlu Asn Lys 380 Lys Lys Thr Vai
Vai 385 Asp Phe Glu Thr Asp 390 Vai Leu Phe Leu Vai 395 Pro Thr Glu Ile Ala 400
Leu Ala Gln His Arg Ala Asn Ala Lys Ser Ala Lys Thr Tyr Ala Tyr
405 410 415
Leu Phe Ser His Pro Ser Arg Met Pro Vai Tyr Pro Lys Trp Vai Gly
420 425 430
Ala Asp His Ala Asp Asp Ile Gln Tyr Vai Phe Gly Lys Pro Phe Ala
435 440 445
Thr Pro Thr Gly Tyr Arg Pro Gln Asp Arg Thr Vai Ser Lys Ala Met
450 455 460
Ile Ala Tyr Trp Thr Asn Phe Ala Lys Thr Gly Asp Pro Asn Met Gly
465 470 475 480
Asp Ser Ala Vai Pro Thr His Trp Glu Pro Tyr Thr Thr Glu Asn Ser
485 490 495
Gly Tyr Leu Glu Ile Thr Lys Lys Met Gly Ser Ser Ser Met Lys Arg
500 505 510
Ser Leu Arg Thr Asn Phe Leu Arg Tyr Trp Thr Leu Thr Tyr Leu Ala
515 520 525
Leu Pro Thr Vai Thr Asp Gln
530 535 (2) SEQ ID NO: 5 INFORMACIJA:
(i) SEKOS CHARAKTERISTIKOS:
(A) ILGIS: 546 aminorūgštys (B) TIPAS: aminorūgštis (D) TOPOLOGIJA: linijinė (ii) MOLEKULĖS TIPAS: baltymas (iii) HIPOTETINĖ: ne (vi) ORIGINALO ŠALTINIS:
(A) ORGANIZMAS: Homo sapiens (F) AUDINIO TIPAS: Pieno liauka (ix) YPATYBĖ:
(A) VARDAS/RAKTAS: Peptidas (B) PADĖTIS: 1..546 (D) KITA INFORMACIJA: / žymė= Variantas_B (xi) SEKOS ATVAIZDAVIMAS: SEQ ID NO: 5
Ala 1 Lys Leu Gly Ala 5 Vai Tyr -Thr Glu Gly 10 Gly Phe Vai Glu Gly 15 Vai
Asn Lys Lys Leu 20 Gly Leu Leu Gly Asp 25 Ser Vai Asp Ile Phe 30 Lys Gly
Ile Pro Phe 35 Ala Ala Pro Thr Lys 40 Ala Leu Glu Asn Pro 45 Gln Pro His
Pro Gly 50 Trp Gln Gly Thr Leu 55 Lys Ala . Lys Asn Phe 60 Lys Lys Arg Cys
Leu 65 Gln Ala Thr Ile Thr 70 Gln Asp Ser 38 Thr Tyr 75 Gly Asp Glu Asp Cys 80
Leu Tyr Leu Asn Ile 85 Trp Vai Pro Gln Gly 90 Arg Lys Gln Vai Ser 95 Arg
Asp Leu Pro Vai 100 Met Ile Trp Ile Tyr 105 Gly Gly Ala Phe Leu 110 Met Gly
Ser Gly His 115 Gly Ala Asn Phe Leu 120 Asn Asn Tyr Leu Tyr 125 Asp Gly Glu
Glu Ile 130 Ala Thr Arg Gly Asn 135 Vai Ile Vai Vai Thr 140 Phe Asn Tyr Arg
Vai 145 Gly Pro Leu Gly Phe 150 Leu Ser Thr Gly Asp 155 Ala Asn Leu Pro Gly 160
Asn Tyr Gly Leu Arg 165 Asp Gln His Met Ala 170 Ile Ala Trp Vai Lys 175 Arg
Asn Ile Ala Ala 180 Phe Gly Gly Asp Pro 185 Asn Asn Ile Thr Leu 190 Phe Gly
Glu Ser Ala 195 Gly Gly Ala Ser Vai 200 Ser Leu Gln Thr Leu 205 Ser Pro Tyr
Asn Lys 210 Gly Leu Ile Arg Arg 215 Ala Ile Ser Gln Ser 220 Gly Vai Ala Leu
Ser 225 Pro Trp Vai Ile Gln 230 Lys Asn Pro Leu Phe 235 Trp Ala Lys Lys Vai 240
Ala Glu Lys Vai Gly 245 Cys Pro Vai Gly Asp 250 Ala Ala Arg Met Ala 255 Gln
Cys Leu Lys Vai 260 Thr Asp Pro Arg Ala 265 Leu Thr Leu Ala Tyr 270 Lys Vai
Pro Leu Ala 275 Gly Leu Glu Tyr Pro 280 Met Leu His Tyr Vai 285 Gly Phe Vai
Pro Vai 290 Ile Asp Gly Asp Phe 295 Ile Pro Ala Asp Pro 300 Ile Asn Leu Tyr
Ala 305 Asn Ala Ala Asp Ile 310 Asp Tyr Ile Ala Gly 315 Thr Asn Asn Met Asp 320
Gly His Ile Phe Ala 325 Ser Ile Asp Met Pro 330 Ala Ile Asn Lys Gly 335 Asn
Lys Lys Vai Thr 340 Glu Glu Asp Phe Tyr 345 Lys Leu Vai Ser Glu 350 Phe Thr
Ile Thr Lys 355 Gly Leu Arg Gly Ala 360 Lys Thr Thr Phe Asp 365 Vai Tyr Thr
Glu Ser 370 Trp Ala Gln Asp Pro 375 Ser Gln Glu Asn Lys 380 Lys Lys Thr Vai
Vai 385 Asp Phe Glu Thr Asp 390 Vai Leu Phe Leu Vai 395 Pro Thr Glu Ile Ala 400
Leu Ala Gln His Arg 405 Ala Asn Ala Lys Ser 410 Ala Lys Thr Tyr Ala 415 Tyr
Leu Phe Ser His 420 Pro Ser Arg Met Pro 425 Vai Tyr Pro Lys Trp 430 Vai Gly
Ala Asp His 435 Ala Asp Asp Ile Gln 440 t$S· Vai Phe Gly Lys 445 Pro Phe Ala
Thr Pro 450 Thr Gly Tyr Arg Pro 455 Gln Asp Arg Thr Vai 460 Ser Lys Ala Met
Ile 465 Ala Tyr Trp Thr Asn 470 Phe Ala Lys Thr Gly 475 Asp Pro Asn Met Gly 480
Asp Ser Ala Vai Pro 485 Thr His Trp Glu Pro 490 Tyr Thr Thr Glu Asn 495 Ser
Gly Tyr Leu Glu 500 Ile Thr Lys Lys Met 505 Gly Ser Ser Ser Met 510 Lys Arg
Ser Leu Arg 515 Thr Asn Phe Leu Arg 520 Tyr Trp Thr Leu Thr 525 Tyr Leu Ala
Leu Pro 530 Thr Vai Thr Asp Gln 535 Lys Glu Ala Gln Met 540 Pro Ala Vai Ile
Arg Phe 545 (2) SEQ ID NO: 6 INFORMACIJA:
(i) SEKOS CHARAKTERISTIKOS:
(A) ILGIS: 568 aminorūgštys (B) TIPAS: aminorūgštis (D) TOPOLOGIJA: linijinė (ii) MOLEKULĖS TIPAS: baltymas (iii) HIPOTETINĖ·, ne (vi) ORIGINALO ŠALTINIS:
(A) ORGANIZMAS: Homo sapiens (F) AUDINIO TIPAS: Pieno liauka (ix) YPATYBĖ:
(A) VARDAS/RAKTAS: Peptidas (B) PADĖTIS: 1.. 568 (D) KITA INFORMACIJA: / žymė= Variantas_C (xi) SEKOS ATVAIZDAVIMAS: SEQ ID NO: 6
Ala 1 Lys Leu Gly Ala 5 Vai Tyr Thr Glu Gly 10 Gly Phe Vai Glu Gly 15 Vai
Asn Lys Lys Leu 20 Gly Leu Leu Gly Asp 25 Ser Vai Asp Ile Phe 30 Lys Gly
Ile Pro Phe 35 Ala Ala Pro Thr Lys 40 Ala Leu Glu Asn Pro 45 Gln Pro His
Pro Gly 50 Trp Gln Gly Thr Leu .Lys 55 Ala Lys Asn Phe 60 Lys Lys Arg Cys
Leu 65 Gln Ala Thr Ile .Thr 70 Gln Asp Ser Thr Tyr 75 Gly Asp Glu Asp Cys 80
Leu Tyr Leu Asn Ile 85 Trp Vai Pro Gln Gly 90 Arg Lys Gln Vai Ser 95 Arg
Asp Leu Pro Vai 100 Met Ile Trp Ile Tyr 105' Gly Gly Ala Phe Leu 110 Met Gly
Ser Gly His 115 Gly Ala Asn Phe Leu 120 As3o Asn Tyr Leu Tyr 125 Asp Gly Glu
Glu lle 130 Ala Thr Arg Gly Asn 135 Vai lle Vai Vai Thr 140 Phe Asn Tyr Arg
Vai 145 Gly Pro Leu Gly Phe 150 Leu Ser Thr Gly Asp 155 Ala Asn Leu Pro Gly 160
Asn Tyr Gly Leu Arg 165 Asp Gln His Met Ala 170 lle Ala Trp Vai Lys 175 Arg
Asn lle Ala Ala 180 Phe Gly Gly Asp Pro 185 Asn Asn lle Thr Leu 190 Phe Gly
Glu Ser Ala 195 Gly Gly Ala Ser Vai 200 Ser Leu Gln Thr Leu 205 Ser Pro Tyr
Asn Lys 210 Gly Leu lle Arg Arg 215 Ala lle Ser Gln Ser 220 Gly Vai Ala Leu
Ser 225 Pro Trp Vai lle Gln 230 Lys Asn Pro Leu Phe 235 Trp Ala Lys Lys Vai 240
Ala Glu Lys Vai Gly 245 Cys Pro Vai Gly Asp 250 Ala Ala Arg Met Ala 255 Gln
Cys Leu Lys Vai 260 Thr Asp Pro Arg Ala 265 Leu Thr Leu Ala Tyr 270 Lys Vai
Pro Leu Ala 275 Gly Leu Glu Tyr Pro 280 Met Leu His Tyr Vai 285 Gly Phe Vai
Pro Vai 290 lle Asp Gly Asp Phe 295 lle Pro Ala Asp Pro 300 lle Asn Leu Tyr
Ala 305 Asn Ala Ala Asp lle 310 Asp Tyr lle Ala Gly 315 Thr Asn Asn Met Asp 320
Gly His lle Phe Ala 325 Ser lle Asp Met Pro 330 Ala lle Asn Lys Gly 335 Asn
Lys Lys Vai Thr 340 Glu Glu Asp Phe Tyr 345 Lys Leu Vai Ser Glu 350 Phe Thr
lle Thr Lys 355 Gly Leu Arg Gly Ala 360 Lys Thr Thr Phe Asp 365 Vai Tyr Thr
Glu Ser 370 Trp Ala Gln Asp Pro 375 Ser Gln Glu Asn Lys 380 Lys Lys Thr Vai
Vai 385 Asp Phe Glu Thr Asp 390 Vai Leu Phe Leu Vai 395 Pro Thr Glu lle Ala 400
Leu Ala Gln His Arg 405 Ala Asn Ala Lys Ser 410 Ala Lys Thr Tyr Ala 415 Tyr
Leu Phe Ser His 420 Pro Ser Arg Met Pro 425 Vai Tyr Pro Lys Trp 430 Vai Gly
Ala Asp His 435 Ala Asp Asp lle Gln 440 Tyr Vai Phe Gly Lys 445 Pro Phe Ala
Thr Pro 450 Thr Gly Tyr Arg Pro 455 Gln Asp Arg Thr Vai 460 Ser Lys Ala Met
lle 465 Ala Tyr Trp Thr Asn 470 Phe Ala Lys' Thr Gly 475 Asp Pro Asn Met Gly 480
Asp Ser Ala Vai Pro Thr His Trp GiU Pro Tyr Thr Thr Glu Asn Ser
485 490 495
Gly Tyr Leu Glu 500 Ile Thr Lys Lys Met 505 Gly Ser Ser Ser Met 510 Lys Arg
Ser Leu Arg 515 Thr Asn Phe Leu Arg 520 Tyr Trp Thr Leu Thr 525 Tyr Leu Ala
Leu Pro 530 Thr Vai Thr Asp Gln 535 Gly Ala Pro Pro Vai 540 Pro Pro Thr Gly
Asp 545 Ser Gly Ala Pro Pro 550 Vai Pro Pro Thr Gly 555 Asp Ser Lys Glu Ala 560
Gln Met Pro Ala Vai 565 Ile Arg Phe
(2) SEQ ID NO: 7 INFORMACIJA:
(i) SEKOS CHARAKTERISTIKOS:
(A) ILGIS: 722 aminorūgštys (B) TIPAS: aminorūgštis (D) TOPOLOGIJA: linijinė (ii) MOLEKULĖS TIPAS: baltymas (iii) HIPOTETINĖ: ne (vi) ORIGINALO ŠALTINIS:
(A) ORGANIZMAS: Homo sapiens (F) AUDINIO TIPAS: Pieno liauka (ix) YPATYBĖ:
(A) VARDAS/RAKTAS: Peptidas (B) PADĖTIS: 1.. 722 (D) KITA INFORMACIJA: / žymė= Variantas_N (xi) SEKOS ATVAIZDAVIMAS: SEQID NO: 7
Ala 1 Lys Leu Gly Ala 5 Vai Tyr Thr Glu Gly 10 Gly Phe Vai Glu Gly 15 Vai
Asn Lys Lys Leu 20 Gly Leu Leu Gly Asp 25 Ser Vai Asp Ile Phe 30 Lys Gly
Ile Pro Phe 35 Ala Ala Pro Thr Lys 40 Ala Leu Glu Asn Pro 45 Gln Pro His
Pro Gly 50 Trp Gln Gly Thr Leu 55 Lys Ala Lys Asn Phe 60 Lys Lys Arg cys
Leu 65 Gln Ala Thr Ile Thr 70 Gln Asp Ser Thr Tyr 75 Gly Asp Glu Asp Cys 80
Leu Tyr Leu Asn Ile 85 Trp Vai Pro Gln Gly 90 Arg Lys Gln Vai Ser 95 Arg
Asp Leu Pro Vai 100 Met •Ile Trp Ile Tyr 105 Gly Gly Ala Phe Leu 110 Met Gly
Ser Gly His 115 Gly Ala Asn Phe Leu 120 Asn Asn Tyr Leu Tyr 125 Asp Gly Glu
Glu Ile 130 Ala Thr Arg Gly Asn 135 Vai Ile Vai Vai Thr 140 Phe Asn Tyr Arg
Vai 145 Gly Pro Leu Gly Phe 150 Leu Ser Thr Gly 42 Asp 155 Ala Asn Leu Pro Gly 160
Asn Tyr Gly Leu Arg 165 Asp Gln His Met Ala 170 Ile Ala Trp Vai Lys 175 Arg
Asn Ile Ala Ala 180 Phe Gly Gly Asp Pro 185 Asn Gln Ile Thr Leu 190 Phe Gly
Glu Ser Ala 195 Gly Gly Ala Ser Vai 200 Ser Leu Gln Thr Leu 205 Ser Pro Tyr
Asn Lys 210 Gly Leu Ile Arg Arg 215 Ala Ile Ser Gln Ser 220 Gly Vai Ala Leu
Ser 225 Pro Trp Vai Ile Gln 230 Lys Asn Pro Leu Phe 235 Trp Ala Lys Lys Vai 240
Ala Glu Lys Vai Gly 245 Cys Pro Vai Gly Asp 250 Ala Ala Arg Met Ala 255 Gln
Cys Leu Lys Vai 260 Thr Asp Pro Arg Ala 265 Leu Thr Leu Ala Tyr 270 Lys Vai
Pro Leu Ala 275 Gly Leu Glu Tyr Pro 280 Met Leu His Tyr Vai 285 Gly Phe Vai
Pro Vai 290 Ile Asp Gly Asp Phe 295 Ile Pro Ala Asp Pro 300 Ile Asn Leu Tyr
Ala 305 Asn Ala Ala Asp Ile 310 Asp Tyr Ile Ala Gly 315 Thr Asn Asn Met Asp 320
Gly His Ile Phe Ala 325 Ser Ile Asp Met Pro 330 Ala Ile Asn Lys Gly 335 Asn
Lys Lys Vai Thr 340 Glu Glu Asp Phe Tyr 345 Lys Leu Vai Ser Glu 350 Phe Thr
Ile Thr Lys 355 Gly Leu Arg Gly Ala 360 Lys Thr Thr Phe Asp 365 Vai Tyr Thr
Glu Ser 370 Trp Ala Gln Asp Pro 375 Ser Gln Glu Asn Lys 380 Lys Lys Thr Vai
Vai 385 Asp Phe Glu Thr Asp 390 Vai Leu Phe Leu Vai 395 Pro Thr Glu Ile Ala 400
Leu Ala Gln His Arg 405 Ala Asn Ala Lys Ser 410 Ala Lys Thr Tyr Ala 415 Tyr
Leu Phe Ser His 420 Pro Ser Arg Met Pro 425 Vai Tyr Pro Lys Trp 430 Vai Gly
Ala Asp His 435 Ala Asp Asp Ile Gln 440 Tyr Vai Phe Gly Lys 445 Pro Phe Ala
Thr Pro 450 Thr Gly Tyr Arg Pro 455 Gln Asp Arg Thr Vai 460 Ser Lys Ala Met
Ile 465 Ala Tyr Trp Thr Asn 470 Phe Ala Lys Thr Gly 475 Asp Pro Asn Met Gly 480
Asp Ser Ala Vai Pro 485 Thr His Trp Glu Pro 490 Tyr Thr Thr Glu Asn 495 Ser
Gly Tyr Leu Glu' 500 Ile Thr Lys Lys Met’Gly 505 Ser Ser Ser Met 510 Lys Arg
Ser Leu Arg 515 Thr Asn Phe Leu Arg 520 Tyf^Trp Thr Leu Thr 525 Tyr Leu Ala
Leu Pro 530 Thr Vai Thr Asp Gln 535 Glu Ala Thr Pro Vai 540 Pro Pro Thr Gly
Asp 545 Ser Glu Ala Thr Pro 550 Vai Pro Pro Thr Gly 555 Asp Ser Glu Thr Ala 560
Pro Vai Pro Pro Thr 565 Gly Asp Ser Gly Ala 570 Pro Pro Vai Pro Pro 575 Thr
Gly Asp Ser Gly 580 Ala Pro Pro Vai Pro 585 Pro Thr Gly Asp Ser 590 Gly Ala
Pro Pro Vai 595 Pro Pro Thr Gly Asp 600 Ser Gly Ala Pro Pro 605 Vai Pro Pro
Thr Gly 610 Asp Ser Gly Ala Pro 615 Pro Vai Pro Pro Thr 620 Gly Asp Ser Gly
Ala 625 Pro Pro Vai Pro Pro 630 Thr Gly Asp Ser Gly 635 Ala Pro Pro Vai Pro 640
Pro Thr Gly Asp Ala 645 Gly Pro Pro Pro Vai 650 Pro Pro Thr Gly Asp 655 Ser
Gly Ala Pro Pro 660 Vai Pro Pro Thr Gly 665 Asp Ser Gly Ala Pro 670 Pro Vai
Thr Pro Thr 675 Gly Asp Ser Glu Thr 680 Ala Pro Vai Pro Pro 685 Thr Gly Asp
Ser Gly 690 Ala Pro Pro Vai Pro 695 Pro Thr Gly Asp Ser 700 Glu Ala Ala Pro
Vai 705 Pro Pro Thr Asp Asp 710 Ser Lys Glu Ala Gln 715 Met Pro Ala Vai Ile 720
Arg Phe (2) SEQ ID NO: 8 INFORMACIJA:
(i) SEKOS CHARAKTERISTIKOS:
(A) ILGIS: 2184 bazių poros (B) TIPAS: nukleino rūgštis (C) SUSIVIJIMAS: dvigubas (D) TOPOLOGIJA: linijinė (ii) MOLEKULĖS TIPAS: DNR (genominė) (iii) HIPOTETINĖ: ne (iii) ANTIPRASMINĖ: ne (vi) ORIGINALO ŠALTINIS:
(A) ORGANIZMAS: Homo sapiens (F) AUDINIO TIPAS: pieno liauka (ix) YPATYBĖ:
(A) VARDAS/RAKTAS: CDS (B) PADĖTIS: 82.. 2088 (D) KITA INFORMACIJA: /žymė= Vaiiantas_T (ix) YPATYBĖ:
(A) VARDAS/RAKTAS: subrendęs peptidas (B) PADĖTIS: 151.. 2085 (ix) YPATYBĖ: 44 (A) VARDAS/RAKTAS: pasikartojimų sritis (B) PADĖTIS: 1756 .. 2052 (ix) YPATYBĖ:
(A) VARDAS/RAKTAS: pasikartojimo vienetas (B) PADĖTIS: 1756 .. 1788 (ix) YPATYBĖ:
(A) VARDAS/RAKTAS: pasikartojimo vienetas (B) PADĖTIS: 1789 .. 1821 (ix) YPATYBĖ:
(A) VARDAS/RAKTAS: pasikartojimo vienetas (B) PADĖTIS: 1822.. 1854 (ix) YPATYBĖ:
(A) VARDAS/RAKTAS: pasikartojimo vienetas (B) PADĖTIS: 1855 .. 1887 (ix) YPATYBĖ:
(A) VARDAS/RAKTAS: pasikartojimo vienetas (B) PADĖTIS: 1888 .. 1920 (ix) YPATYBĖ:
(A) VARDAS/RAKTAS: pasikartojimo vienetas (B) PADĖTIS: 1921.. 1953 (ix) YPATYBĖ:
(A) VARDAS/RAKTAS: pasikartojimo vienetas (B) PADĖTIS: 1954 .. 1986 (ix) YPATYBĖ:
(A) VARDAS/RAKTAS: pasikartojimo vienetas (B) PADĖTIS: 1987 .. 2019 (ix) YPATYBĖ:
(A) VARDAS/RAKTAS: pasikartojimo vienetas (B) PADĖTIS: 2020 .. 2052 (xi) SEKOS ATVAIZDAVIMAS: SEQ ID NO: 8
ACCTTCTGTA TCAGTTAAGT GTCAAGATGG AAGGAACAGC AGTCTCAAGA TAATGCAAAG 60
AGTTTATTCA TCCAGAGGCT G ATG Met CTC ACC ATG GGG CGC CTG CAA CTG Leu Gln Leu -15 GTT Vai 111
Leu Thr Met -20 Gly Arg
-23
GTG TTG GGC CTC ACC TGC TGC TGG GCA GTG GCG AGT GCC GCG AAG CTG 159
Vai Leu Gly Leu Thr Cys Cys Trp Ala Vai Ala Ser Ala Ala Lys Leu
-10 -5 1
GGC GCC GTG TAC ACA GAA GGT GGG TTC GTG GAA GGC GTC AAT AAG AAG 207
Gly Ala Vai Tyr Thr Glu Gly Gly Ehe Vai Glu Gly Vai Asn Lys Lys
5 10 15
CTC GGC CTC CTG GGT GAC TCT GTG GAC ATC TTC AAG GGC ATC CCC TTC 255
Leu Gly Leu Leu Gly Asp Ser Vai Asp Ile Phe Lys Gly Ile Pro Phe
20 25 30 35
GCA GCT CCC ACC AAG GCC CTG GAA AAT CCT CAG CCA CAT CCT GGC TGG 303
Ala Ala Pro Thr Lys Ala Leu Glu Asn Pro Gln Pro His Pro Gly Trp
40 45 50
CAA GGG ACC CTG AAG GCC AAG AAC TTC AAG AAG AGA TGC CTG CAG GCC 351
Gln Gly Thr Leu Lys Ala Lys Asn Phe Lys Lys Arg Cys Leu Gln Ala
55 60 45 65
ACC Thr ATC Ile ACC Thr 70 CAG GAC AGC ACC TAC Tyr 75 GGG GAT GAA GAC TGC CTG TAC CTC Leu 399
Gln Asp Ser Thr Gly Asp Glu Asp Cys 80 Leu Tyr
AAC ATT TGG GTG CCC CAG GGC AGG AAG CAA GTC TCC CGG GAC CTG CCC 447
Asn Ile Trp Vai Pro Gln Gly Arg Lys Gln Vai Ser Arg Asp Leu Pro
85 90 95
GTT ATG ATC TGG ATC TAT GGA GGC GCC TTC CTC ATG GGG TCC GGC CAT 495
Vai Met Ile Trp Ile Tyr Gly Gly Ala Phe Leu Met Gly Ser Gly His
100 105 110 115
GGG GCC AAC TTC CTC AAC AAC TAC CTG TAT GAC GGC GAG GAG ATC GCC 543
Gly Ala Asn Phe Leu Asn Asn Tyr Leu Tyr Asp Gly Glu Glu Ile Ala
120 125 130
ACA CGC GGA AAC GTC ATC GTG GTC ACC TTC AAC TAC CGT GTC GGC CCC 591
Thr Arg Gly Asn Vai Ile Vai Vai Thr Phe Asn Tyr Arg Vai Gly Pro
135 140 145
CTT GGG TTC CTC AGC ACT GGG GAC GCC AAT CTG CCA GGT AAC TAT GGC 639
Leu Gly Phe Leu Ser Thr Gly Asp Ala Asn Leu Pro Gly Asn Tyr Gly
150 155 160
CTT CGG GAT CAG CAC ATG GCC ATT GCT TGG GTG AAG AGG AAT ATC GCG 687
Leu Arg Asp Gln His Met Ala Ile Ala Trp Vai Lys Arg Asn Ile Ala
165 170 175
GCC TTC GGG GGG GAC CCC AAC AAC ATC ACG CTC TTC GGG GAG TCT GCT 735
\.la Phe Gly Gly Asp Pro Asn Asn Ile Thr Leu Phe Gly Glu Ser Ala
.80 185 190 195
5GA GGT GCC AGC GTC TCT CTG CAG ACC CTC TCC CCC TAC AAC AAG GGC 783
5ly Gly Ala Ser Vai Ser Leu Gln Thr Leu Ser Pro Tyr Asn Lys Gly
200 205 210
:tc ATC CGG CGA GCC ATC AGC CAG AGC GGC GTG GCC CTG AGT CCC TGG 831
jeu Ile Arg Arg Ala Ile Ser Gln Ser Gly Vai Ala Leu Ser Pro Trp
215 220 225
;tc ATC CAG AAA AAC CCA CTC TTC TGG GCC AAA AAG GTG GCT GAG AAG 879
Tai Ile Gln Lys Asn Pro Leu Phe Trp Ala Lys Lys Vai Ala Glu Lys
230 235 240
;tg GGT TGC CCT GTG GGT GAT GCC GCC AGG ATG GCC CAG TGT CTG AAG 927
'ai Gly Cys Pro Vai Gly Asp Ala Ala Arg Met Ala Gln Cys Leu Lys
245 250 255
:tt ACT GAT CCC CGA GCC CTG ACG CTG GCC TAT AAG GTG CCG CTG GCA 975
ral Thr Asp Pro Arg Ala Leu Thr Leu Ala Tyr Lys Vai Pro Leu Ala
:60 265 27 0 275
1GC CTG GAG TAC CCC ATG CTG CAC TAT GTG GGC TTC GTC CCT GTC ATT 1023
ily Leu Glu Tyr Pro Met Leu His Tyr Vai Gly Phe Vai Pro Vai Ile
280 285 290
:AT GGA GAC TTC ATC CCC GCT GAC CCG ATC AAC CTG TAC GCC AAC GCC 1071
.sp Gly Asp Phe Ile Pro Ala Asp Pro Ile Asn Leu Tyr Ala Asn Ala
295 300 305
!CC GAC ATC GAC TAT ATA GCA GGC ACC AAC AAC ATG GAC GGC CAC ATC 1119
.la Asp Ile Asp Tyr Ile Ala Gly Thr Asn Asn Met Asp Gly His Ile
310 315 320
TC GCC AGC ATC GAC ATG CCT GCC ATC AAC AAG GGC AAC AAG AAA GTC 1167
'he Ala Ser Ile Asp Met Pro Ala Ile Asn Lys Gly Asn Lys Lys Vai
325 330 46 335
ACG GAG GAG Glu GAC TTC TAC Tyr 345 AAG Lys CTG Leu GTC Vai AGT GAG TTC ACA ATC ACC AAG 1215
Thr 340 Glu Asp Phe Ser Glu 350 Phe Thr Ile Thr Lys 355
GGG CTC AGA GGC GCC AAG ACG ACC TTT GAT GTC TAC ACC GAG TCC TGG 1263
Gly Leu Arg Gly Ala 360 Lys Thr Thr Phe Asp Vai 365 Tyr Thr Glu Ser 370 Trp
GCC CAG GAC CCA TCC CAG GAG AAT AAG AAG AAG ACT GTG GTG GAC TTT 1311
Ala Gln Asp Pro 375 Ser Gln Glu Asn Lys 380 Lys Lys Thr Vai Vai 385 Asp Phe
GAG ACC GAT GTC CTC TTC CTG GTG CCC ACC GAG ATT GCC CTA GCC CAG 1359
Glu Thr Asp 390 Vai Leu Phe Leu Vai 395 Pro Thr Glu Ile Ala 400 Leu Ala Gln
CAC AGA GCC AAT GCC AAG AGT GCC AAG ACC TAC GCC TAC CTG TTT TCC 1407
His Arg 405 Ala Asn Ala Lys Ser 410 Ala Lys Thr Tyr Ala 415 Tyr Leu Phe Ser
CAT CCC TCT CGG ATG CCC GTC TAC CCC AAA TGG GTG GGG GCC GAC CAT 1455
His 420 Pro Ser Arg Met Pro 425 Vai Tyr Pro Lys Trp 430 Vai Gly Ala Asp His 435
GCA GAT GAC ATT CAG TAC GTT TTC GGG AAG CCC TTC GCC ACC CCC ACG 1503
Ala Asp Asp Ile Gln 440 Tyr Vai Phe Gly Lys Pro 445 Phe Ala Thr Pro 450 Thr
GGC TAC CGG CCC CAA GAC AGG ACA GTC TCT AAG GCC ATG ATC GCC TAC 1551
Gly Tyr Arg Pro 455 Gln Asp Arg Thr Vai 460 Ser Lys Ala Met Ile 465 Ala Tyr
TGG ACC AAC TTT GCC AAA ACA GGG GAC CCC AAC ATG GGC GAC TCG GCT 1599
Trp Thr Asn 47 0 Phe· Ala Lys Thr Gly 475 Asp Pro Asn Met Gly 480 Asp Ser Ala
GTG CCC ACA CAC TGG GAA CCC TAC ACT ACG GAA AAC AGC GGC TAC CTG 1647
Vai Pro 485 Thr His Trp Glu Pro 490 Tyr Thr Thr Glu Asn 495 Ser Gly Tyr Leu
GAG ATC ACC AAG AAG ATG GGC AGC AGC TCC ATG AAG CGG AGC CTG AGA 1695
Glu 500 Ile Thr Lys Lys Met 505 Gly Ser Ser Ser Met 510 Lys Arg Ser Leu Arg 515
ACC AAC TTC CTG CGC TAC TGG ACC CTC ACC TAT CTG GCG CTG CCC ACA 1743
Thr Asn Phe Leu Arg 520 Tyr Trp Thr Leu Thr Tyr 525 Leu Ala Leu Pro 530 Thr
GTG ACC GAC CAG GAG GCC ACC CCT GTG CCC CCC ACA GGG GAC TCC GAG 1791
Vai Thr Asp Gln 535 Glu Ala Thr Pro Vai 540 Pro Pro Thr Gly Asp 545 Ser Glu
GCC ACT CCC GTG CCC CCC ACG GGT GAC TCC GAG ACC GCC CCC GTG CCG 1839
Ala Thr Pro 550 Vai Pro Pro Thr Gly 555 Asp Ser Glu Thr Ala 560 Pro Vai Pro
CCC ACG GGT GAC TCC GGG GCC CCC CCC GTG CCG CCC ACG GGT GAC TCC 1887
Pro Thr 565 Gly Asp Ser Gly Ala 570 Pro Pro Vai Pro Pro 575 Thr Gly Asp Ser
GGG GCC CCC CCC GTG CCG CCC ACG GGT GAC TCC GGG GCC CCC CCC GTG 1935
Gly 580 Ala Pro Pro Vai Pro 585 Pro Thr Gly Asp Ser 590 Gly Ala Pro Pro Vai 595
CCG CCC ACG GGT GAC TCC GGG GCC CCC CCC GTG CCG CCC ACG GGT GAC 1983
Pro Pro Thr Gly Asp 600 Ser Gly Ala Pro Pro Vai 60547 Pro Pro Thr Gly 610 Asp
TCC GGG GCC CCC CCC GTG CCG CCC ACG GGT GAC TCC GGG GCC CCC CCT
Ser Gly Ala Pro 615 Pro Vai Pro Pro Thr 620 Gly Asp Ser Gly Ala 625 Pro Pro
GTG CCC CCC ACA GAT GAC TCC AAG GAA GCT CAG ATG CCT GCA GTC ATT
Vai Pro Pro 630 Thr Asp Asp Ser Lys 635 Glu Ala Gln Met Pro 640 Ala Vai Ile
AGG TTT TAGCGTCCCA TGAGCCTTGG TATCAAGAGG CCACAAGAGT GGGACCCCAG Arg Phe
645
GGGCTCCCCT CCCATCTTGA GCTCTTCCTG AATAAAGCCT CATACCCCT (2) SEQ ID NO: 9 INFORMACIJA:
(i) SEKOS CHARAKTERISTIKOS:
(A) ILGIS: 668 aminorūgštys (B) TIPAS: aminorūgštis (D) TOPOLOGIJA: linijinė (ii) MOLEKULĖS TIPAS: baltymas (xi) SEKOS ATVAIZDAVIMAS: SEQ ID NO: 9:
2031
2079
2135
2184
Met -23 Leu Thr Met -20 Gly Arg Leu Gln Leu -15 Vai Vai Leu Gly Leu -10 Thr Cys
Cys Trp Ala -5 Vai Ala Ser Ala Ala 1 Lys Leu Gly Ala 5 Vai Tyr Thr Glu
Gly 10 Gly Phe Vai Glu Gly 15 Vai Asn Lys Lys Leu 20 Gly Leu Leu Gly Asp 25
Ser Vai Asp Ile Phe 30 Lys Gly Ile Pro Phe 35 Ala Ala Pro Thr Lys 40 Ala
Leu Glu Asn Pro 45 Gln Pro His Pro Gly 50 Trp Gln Gly Thr Leu 55 Lys Ala
Lys Asn Phe 60 Lys Lys Arg Cys Leu 65 Gln Ala Thr Ile Thr 70 Gln Asp Ser
Thr Tyr 75 Gly Asp Glu Asp Cys 80 Leu Tyr Leu Asn Ile 85 Trp Vai Pro Gln
Gly 90 Arg Lys Gln Vai Ser 95 Arg Asp Leu Pro Vai 100 Met Ile Trp Ile Tyr 105
Gly Gly Ala Phe Leu 110 Met Gly Ser Gly His 115 Gly Ala Asn Phe Leu 120 Asn
Asn Tyr Leu Tyr 125 Asp Gly Glu Glu I-le 130 Ala Thr Arg Gly Asn 135 Vai Ile
Vai Vai Thr 140 Phe Asn Tyr Arg Vai 145 Gly Pro Leu Gly Phe 150 Leu Ser Thr
Gly Asp 155 Ala Asn Leu Pro Gly 160 Asn Tyr Gly Leu Arg 165 Asp Gln His Met
Ala 170 Ile Ala Trp Vai Lys 175 Arg Asn Ile Ala Ala Ϊ80 Phe Gly Gly Asp Pro 185
Asn Asn Ile Thr Leu 190 Phe Gly Glu Ser Ala 195' 4?ly Gly Ala Ser Vai 200 Ser
Leu Gln Thr Leu 205 Ser Pro iyr Asn Lys 210 Gly Leu Ile Arg Arg 215 Ala Ile
Ser Gln Ser 220 Gly Vai Ala Leu Ser 225 Pro Trp Vai Ile Gln 230 Lys Asn Pro
Leu Phe 235 Trp Ala Lys Lys Vai 240 Ala Glu Lys Vai Gly 245 Cys Pro Vai Gly
Asp 250 Ala Ala Arg Met Ala 255 Gln Cys Leu Lys Vai 260 Thr Asp Pro Arg Ala 265
Leu Thr Leu Ala Tyr 270 Lys Vai Pro Leu Ala 275 Gly Leu Glu Tyr Pro 280 Met
Leu His Tyr Vai 285 Gly Phe Vai Pro Vai 290 Ile Asp Gly Asp Phe 295 Ile Pro
Ala Asp Pro 300 Ile Asn Leu Tyr Ala 305 Asn Ala Ala Asp Ile 310 Asp Tyr Ile
Ala Gly 315 Thr Asn Asn Met Asp 320 Gly His Ile Phe Ala 325 Ser Ile Asp Met
Pro 330 Ala Ile Asn Lys Gly 335 Asn Lys Lys Vai Thr 340 Glu Glu Asp Phe Tyr 345
Lys Leu Vai Ser Glu 350 Phe Thr Ile Thr Lys 355 Gly Leu Arg Gly Ala 360 Lys
Thr Thr Phe Asp 365 Vai Tyr Thr Glu Ser 370 Trp Ala Gln Asp Pro 375 Ser Gln
Glu Asn Lys 380 Lys Lys Thr Vai Vai 385 Asp Phe Glu Thr Asp 390 Vai Leu Phe
Leu Vai 395 Pro Thr Glu Ile Ala 400 Leu Ala Gln His Arg 405 Ala Asn Ala Lys
Ser 410 Ala Lys Thr Tyr Ala 415 Tyr Leu Phe Ser His 420 Pro Ser Arg Met Pro 425
Vai Tyr Pro Lys Trp 430 Vai Gly Ala Asp His 435 Ala Asp Asp Ile Gln 440 Tyr
Vai Phe Gly Lys 445 Pro Phe Ala Thr Pro 450 Thr Gly Tyr Arg Pro 455 Gln Asp
Arg Thr Vai 460 Ser Lys Ala Met Ile 465 Ala Tyr Trp Thr Asn 470 Phe Ala Lys
Thr Gly 475 Asp Pr'o Asn Met Gly 480 Asp Ser Ala Vai Pro 485 Thr His Trp Glu
Pro 490 Tyr Thr Thr Glu Asn 495 Ser Gly Tyr Leu Glu 500 Ile Thr Lys Lys Met 505
Gly Ser Ser Ser Met 510 Lys Arg Ser Leu Arg 515 Thr Asn Phe Leu Arg 520 Tyr
Trp Thr Leu Thr 525 Tyr Leu Ala Leu Pro 530 Thr Vai Thr Asp Gln 535 Glu Ala
Thr Pro Vai 540 Pro Pro Thr Gly Asp 545 Ser Glu Ala Thr Pro 550 Vai Pro Pro
Thr Gly Asp Ser Glu Thr Ala Pro Vai Pro^%ro Thr Gly Asp Ser Gly
555 560 565
Ala 570 Pro Pro Vai Pro Pro 575 Thr Gly Asp Ser Gly 580 Ala Pro Pro Vai Pro 585
Pro Thr Gly Asp Ser 590 Gly Ala Pro Pro Vai 595 Pro Pro Thr Gly Asp 600 Ser
Gly Ala Pro Pro 605 Vai Pro Pro Thr Gly 610 Asp Ser Gly Ala Pro 615 Pro Vai
Pro Pro Thr 620 Gly Asp Ser Gly Ala 625 Pro Pro Vai Pro Pro 630 Thr Asp Asp
Ser Lys Glu Ala Gln Met Pro Ala Vai lle Arg Phe 635 640 645

Claims (42)

  1. APIBRĖŽTIS
    1. Nukleino rūgšties molekulė, koduojanti polipeptidą, kuris yra tulžies druskos stimuliuojamos lipazės (BSSL) variantas, trumpesnis negu 722 aminorūgštys, ir minėtasis BSSL variantas yra SEQ ID NO 3 aminorūgščių sekos dalis, pažymėta 536-722 liekanomis.
  2. 2. Nukleino rūgšties molekulė pagal 1 punktą besiskirianti tuo, kad jos koduojamas minėtasis BSSL variantas turi C-gale fenilalanino liekaną.
  3. 3. Nukleino rūgšties molekulė pagal 1 arba 2 punktus besiskirianti tuo, kad jos koduojamas minėtasis BSSL variantas C-gale turi Gln-Met-Pro seką.
  4. 4. Nukleino rūgšties molekulė pagal bet kurį iš 1-3 punktų, besiskirianti tuo, kad jos koduojamas minėtasis BSSL variantas C-gale turi aminorūgščių seką, kuri sekoje SEQ ID NO 3 pažymėta 712-722 liekanomis.
  5. 5. Nukleino rūgšties molekulė pagal bet kurį iš 1-4 punktų, besiskirianti tuo, kad jos koduojamas minėtasis BSSL variantas turi mažiau negu 16 pasikartojimų vienetų.
  6. 6. Nukleino rūgšties molekulė pagal 1 punktą, besiskirianti tuo, kad ji koduoja polipeptidą, kurio aminorūgščių seka turi bent 90% homologiją su aminorūgščių seka, sekų apraše parodyta kaip sekos SEQ ID NO 5,6 arba 9.
  7. 7. Nukleino rūgšties molekulė pagal 6 punktą, besiskirianti tuo, kad ji koduoja polipeptidą, kuris turi aminorūgščių seką, sekų apraše parodytą kaip sekos SEQ ID NO 5,6 arba 9.
  8. 8. Nukleino rūgšties molekulė, koduojanti polipeptidą, kurio aminorūgščių seka turi bent 90% homologiją su aminorūgščių seka, kuri sekų apraše parodyta kaip seka SEQ ID NO 7, išskyrus tas nukleino rūgšties molekules, kurios koduoja polipeptidus, turinčius asparagino liekaną 187 pozicijoje.
  9. 9. Nukleino rūgšties molekulė pagal 8 punktą, besiskirianti tuo, kad ji koduoja polipeptidą, kuris turi aminorūgščių seką, sekų apraše parodytą kaip seka SEQ ID NO 7.
  10. 10. Polipeptidas, sekų apraše parodytas kaip sekos SEQ ID NO 5, 6, 7, arba 9.
  11. 11. Polipeptidas, koduojamas nukleino rūgščių sekos, pagal bet kurį iš 1-9 puktų.
  12. 12. Polipeptidas pagal 10 arba 11 punktą, besiskiriantis tuo, kad yra grynu pavidalu.
  13. 13. Hibridinis genas, turintis nukleino rūgšties molekulę, pagal bet kurį iš 1-9 puktų.
  14. 14. Galintis replikuotis ekspresijos vektorius, turintis savo sudėtyje hibridinį geną pagal 13 punktą.
  15. 15. Vektorius pagal 14 punktą, besiskiriantis tuo, kad jis sukurtas jaučio papilomos viruso vektorių pS258, pS259 arba pS299 pagrindu.
  16. 16. Ląstelė, turinti hibridinį geną pagal 13 punktą.
  17. 17. Ląstelė pagal 16 punktą, besiskirianti tuo, kad kilusi iš pelių ląstelių linijos 027 arba E.coli.
  18. 18. Rekombinantinio polipeptido gavimo būdas, besiskiriantis tuo, kad (i) nukleino rūgšties molekulę, pagal bet kurį iš 1-9 punktų, įterpia į hibridinį geną, galintį replikuotis specifinėje ląstelėje-šeimininkėje arba organizme-šeimininke; (ii) gautą rekombinantinį hibridinį geną įveda į ląstelę-šeimininkę arba organizmą-šeimininką; (iii) gautąją ląstelę identifikuoja ir augina auginimo terpėje arba ant jos; arba gautą organizmą identifikuoja ir padaugina polipeptido ekspresijai gauti (iv) ir šį polipeptidą išskiria.
  19. 19. Būdas pagal 18 punktą, besiskiriantis tuo, kad hibridinis genas yra jaučio papilomos viruso vektorių pS258, pS259 arba pS299 sudėtyje.
  20. 20. Ekspresijos sistema, besiskirianti tuo, kad ji turi hibridinį geną, kuris gali ekspresuoti ląstelėje-šeimininkėje arba organizme-šeimininke, priėmusiame minėtąjį hibridinį geną, todėl gaminamas rekombinantinis polipeptidas, kai ekspresuoja hibridinis genas, o minėtasis hibridinis genas gautas įterpiant nukleino rūgšties seką, pagal bet kurį iš
    1-9 punktų, į geną, galintį tarpininkauti minėtojo hibridinio geno ekspresijai.
  21. 21. Transgeninių nežmogiškos kilmės žinduolių, galinčių ekspresuoti BSSL variantą, sukūrimo būdas, besiskiriantis tuo, kad (a) ekspresijos sistemą pagal 20 punktą, įveda į apvaisintą kiaušinėlį arba nežmogiškos kilmės žinduolio embriono ląstelę tam, kad įjungtų ekspresijos vektorių į žinduolio gemalinę liniją, ir (b) iš gautojo introdukuoto apvaisinto kiaušinėlio arba embriono išaugina subrendusią nežmogiškos kilmės žinduolio patelę.
  22. 22. Transgeninių nežmogiškos kilmės žinduolių, galinčių ekspresuoti BSSL variantą ir negalinčių ekspresuoti savo paties BSSL, sukūrimo būdas, besiskiriantis tuo, kad (a) sunaikina žinduolio sugebėjimus ekspresuoti savąją BSSL taip, kad žinduolio BSSL nepasireiškia, ir įveda ekspresijos sistema pagal 20 punktą į žinduolio gemalinę liniją taip, kad BSSL variantas ekspresuoja žinduolyje; ir/arba (b) žinduolio BSSL geną arba jo dalį pakeičia ekspresijos sistema pagal 20 punktą.
  23. 23. Transgeninis nežmogiškos kilmės žinduolis, besiskiriantis tuo, kad jis priima į savo genomą DNR seką pagal bet kurį iš 1-9 punktų.
  24. 24. Transgeninis nežmogiškos kilmės žinduolis pagal 23 punktą, besiskiriantis tuo, kad jame DNR seka yra žinduolio gemalinėje linijoje.
  25. 25. Transgeninis nežmogiškos kilmės žinduolis pagal 23 arba 24 punktus, besiskiriant i s tuo, kad jame DNR seka yra žinduolio pieno baltymo gene.
  26. 26. Transgeninis nežmogiškos kilmės žinduolis pagal bet kurį iš 23-25 punktų, besiskiriantis tuo, kad jis priklauso grupei, sudarytai iš pelių, žiurkių, triušių, avių, kiaulių ir galvijų.
  27. 27. Palikuonys, besiskiriantys tuo, kad jie yra transgeninių nežmogiškos kilmės žinduolių pagal bet kurį iš 23-26 punktų.
  28. 28 Pienas, besiskiriantis tuo, kad gautas iš transgeninių nežmogiškos kilmės žinduolių pagal bet kurį iš 23-27 punktų.
  29. 29. Mišinys kūdikiui, besiskiriantis tuo, kad jo sudėtyje yra pieno pagal 28 punktą.
  30. 30. Mišinys kūdikiui, besiskiriantis tuo, kad jis turi polipeptidą pagal bet kurį iš ΙΟΙ 2 punktų.
  31. 31. Mišinio kūdikiui gavimo būdas, besiskiriantis tuo, kad į mišinį kūdikio mitybai papildomai deda polipeptidą pagal bet kurį iš 10-12 punktų.
  32. 32. Polipeptidas pagal bet kurį iš 10-12 punktų, skirtas panaudoti kaip priedas sudarant kūdikio mitybos mišinį.
  33. 33. Farmacinė kompozicija, besiskirianti tuo, kad turi polipeptidą pagal bet kurį iš 10-12 punktų.
  34. 34. Polipeptidas pagal bet kurį iš 10-12 punktų, skirtas panaudoti gydymui.
  35. 35. Polipeptido pagal bet kurį iš 10-12 punktų panaudojimas vaistų, gydančių patologijas, susijusias su egzokrininiu kasos nepakankamumu, gamyboje.
  36. 36. Panaudojimas pagal 35 punktą, besiskiriantis tuo, kad polipeptidą pagal 10-12 punktus naudoja vaistų, gydančių pūslės fibrozę, gamyboje.
  37. 37. Panaudojimas pagal 35 punktą ,besiskiriantis tuo, kad polipeptidą pagal 10-12 punktus naudoja vaistų, gydančių chronišką pankreatitą, gamyboje.
  38. 38. Panaudojimas pagal 35 punktą, besiskiriantis tuo, kad polipeptidą pagal 10-12 punktus naudoja vaistų, gydančių riebalų įsiurbimo sutrikimą, gamyboje.
  39. 39. Panaudojimas pagal 35 punktą, besiskiriantis tuo, kad polipeptidą pagal 10-12 punktus naudoja vaistų, gydančių riebaluose tirpstančių vitaminų įsiurbimo sutrikimą, gamyboje.
  40. 40. Panaudojimas pagal 35 punktą, besiskiriantis tuo, kad polipeptidą pagal 10-12 punktus naudoja vaistų, gydančių riebaluose tirpstančių vitaminų įsiurbimo sutrikimą dėl fiziologinių priežasčių, gamyboje.
  41. 41. Panaudojimas pagal 35 punktą, besiskiriantis tuo, kad polipeptidą pagal 10-12 punktus naudoja vaistų, pagerinančių dietinių lipidų įsisavinimą, gamyboje.
  42. 42. Panaudojimas pagal 35 punktą, besiskiriantis tuo, kad polipeptidą pagal 10-12 punktus naudoja vaistų, skirtų neišnešiotiems naujagimiams ir pagerinančių dietinių lipidų įsisavinimą, gamyboje.
LTIP1886A 1993-03-01 1994-02-28 Novel polypeptides LT4008B (en)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
SE9300686A SE9300686D0 (sv) 1993-03-01 1993-03-01 Novel polypeptides

Publications (2)

Publication Number Publication Date
LTIP1886A LTIP1886A (en) 1994-09-25
LT4008B true LT4008B (en) 1996-07-25

Family

ID=20389078

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
LTIP1886A LT4008B (en) 1993-03-01 1994-02-28 Novel polypeptides

Country Status (3)

Country Link
LT (1) LT4008B (lt)
SE (1) SE9300686D0 (lt)
ZA (1) ZA941064B (lt)

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1991015234A1 (en) 1990-04-04 1991-10-17 Oklahoma Medical Research Foundation Recombinant bile salt activated lipases
WO1991018923A1 (en) 1990-06-01 1991-12-12 Aktiebolaget Astra Derivatives of human bile-salt stimulated lipase, and pharmaceutical compositions containing them

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1991015234A1 (en) 1990-04-04 1991-10-17 Oklahoma Medical Research Foundation Recombinant bile salt activated lipases
WO1991018923A1 (en) 1990-06-01 1991-12-12 Aktiebolaget Astra Derivatives of human bile-salt stimulated lipase, and pharmaceutical compositions containing them

Non-Patent Citations (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ABOUAKIL N, ROGALSKA E, LOMBARDO D.: "Human milk bile-salt stimulated lipase: further investigations on the amino-acids residues involved in the catalytic site", BIOCHIM BIOPHYS ACTA, 1989, pages 225 - 230, XP023578023, DOI: doi:10.1016/0005-2760(89)90291-9
ATKINSON SA, BRYAN MH, ANDERSON GH.: "Human milk feeding in premature infants: protein, fat, and carbohydrate balances in the first two weeks of life", J PEDIATR., 1981, pages 617 - 624
BLÄCKBERG L, HERNELL O.: "Further characterization of the bile salt-stimulated lipase in human milk", FEBS LETT., 1983, pages 337 - 341, XP025594547, DOI: doi:10.1016/0014-5793(83)80571-7
BLÄCKBERG L, HERNELL O.: "The bile-salt-stimulated lipase in human milk. Purification and characterization", EUR J BIOCHEM., 1981, pages 221 - 225, XP009028305, DOI: doi:10.1111/j.1432-1033.1981.tb05322.x
CHAPPELL JE ET AL.: "Fatty acid balance studies in premature infants fed human milk or formula: effect of calcium supplementation", J PEDIATR., 1986, pages 439 - 447
HAN, J.H., STRATOWA, C., RUTTER, W.J.: "Isolation of full-length putative rat lysophospholipase cDNA using improved methods for mRNA isolation and cDNA cloning", BIOCHEMISTRY, 1987, pages 1617 - 1625, XP001314847
HERNELL O.: "Human milk lipases. III. Physiological implications of the bile salt-stimulated lipase", EUR J CLIN INVEST, 1975, pages 267 - 272
J. NILSSON, L. BLÄCKBERG ET AL.: "cDNA cloning of human-milk bile-salt-stimulated lipase and evidence for its identity to pancreatic carboxylic ester hydrolase", EUR. J. BIOCHEM, 1990, pages 543 - 550
K. REUE, J. ZAMBAUX ET AL.: "cDNA cloning of carboxyl ester lipase from human pancreas reveals a unique proline-rich repeat unit", J. LIPID RES., 1991, pages 267 - 276, XP002302171
KYGER EM, WIEGAND RC, LANGE LG.: "Cloning of the bovine pancreatic cholesterol esterase/lysophospholipase", BIOCHEM BIOPHYS RES COMMUN., 1989, pages 1302 - 1309, XP024836440, DOI: doi:10.1016/0006-291X(89)91811-1
LOTHAR HENNIGHAUSEN, LEONARD RUIZ, ROBERT WAL: "Transgenic animals â€" Production of foreign proteins in milk", CURRENT OPINION IN BIOTECHNOLOGY, 1990, pages 74 - 78, XP023601177, DOI: doi:10.1016/0958-1669(90)90013-B
O. HERNELL ET AL.: "Encyclopedia of human biology (Vol. 3)", pages: 47 - 56
O. HERNELL ET AL.: "Textbook of gastroenterology and nutrition in infancy", pages: 209 - 217
O. HERNELL, M. C. CAREY, J. E. STAGGERS: "Physical-chemical behavior of dietary and biliary lipids during intestinal digestion and absorption. 2. Phase analysis and aggregation states of luminal lipids during duodenal fat digestion in healthy adult human beings", BIOCHEMISTRY, 1990, pages 2041 - 2056
S BERNBÄCK, L BLÄCKBERG, O HERNELL: "The complete digestion of human milk triacylglycerol in vitro requires gastric lipase, pancreatic colipase-dependent lipase, and bile salt-stimulated lipase", J. CLIN. INVEST., 1990, pages 1221 - 1226
S WILLIAMSON, E FINUCANE, H ELLIS, H R GAMSU: "Effect of heat treatment of human milk on absorption of nitrogen, fat, sodium, calcium, and phosphorus by preterm infants", ARCH DIS CHILD., 1978, pages 555 - 563
TADASHI BABA, DEBORAH DOWNS ET AL.: "Structure of human milk bile salt activated lipase", BIOCHEMISTRY, 1991, pages 500 - 510

Also Published As

Publication number Publication date
LTIP1886A (en) 1994-09-25
ZA941064B (en) 1994-09-01
SE9300686D0 (sv) 1993-03-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP0651793B1 (en) Dna sequences used in the production of recombinant human bssl/cel in transgenic non-human mammals, and the produced bssl/cel used in infant formulas
EP0845939B1 (en) Lysosomal proteins produced in the milk of nonhuman transgenic animals
US5827683A (en) Nucleic acids encoding BSSL variants
LT4008B (en) Novel polypeptides
EP1262191A1 (en) Pharmaceutical compositions comprising recombinant human acid alpha-glucosidase containing mannose 6-phosphate
PL175404B1 (pl) Wyizolowana cząsteczka DNA i sposób wytwarzania ludzkiego białka BSSL/CEL

Legal Events

Date Code Title Description
MM9A Lapsed patents

Effective date: 20050228