KR970006162B1 - 2-케토-엘(L)-굴론산 생성능을 갖는 코리네박테리움(Corynebacterium) 속 미생물 및 이를 이용한 2-케토-엘(L)-굴론산의 제조방법 - Google Patents

Abstract

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Description

2-케토-엘(L)-굴론산 생성능을 갖는 코리네박테리움(Corynebacterium)속 미생물 및 이를 이용한 2-케토-엘(L)-굴론산의 제조방법

본 발명은 칼슘 2,5-디케토-글로콘산(Calcium 2,5-diketo-gluconicacid: 이하 DKG라 한다)으로부터 2-케토-L-굴론산(Calcium 2-Keto-L-Gulonic acid: 이하 2-KLG라 한다)를 고농도로 생산할 수 있는 새로운 변이주 및 그를 이용하여 2-케토-L-굴론산을 재조하는 방법에 관한 것이다.

2-KLG는 비타민 C 합성의 핵심 중간물질이며, 그의 제조방법에는 솔비톨, 솔보오스, 디아세톤솔보오스를 거쳐 포도당으로부터 합성하는 화학적 레이스테인법(Reichstein method. J. Agric, Chem. Soc., 28,pp 890, 1954)과 포도당으로 부터 DKG를 걸쳐 생산하는 발효법이 있는데, 후자는 한 종류의 재조합 균주에 의한 생산법(USP 3,998,697)과 서로 다른 두가지 균주의 조합에 의한 생산법으로 구분된다(Appl, Environ. Microbiol.,43, pp.1064, 1982; EP 공개 제0088408호).

두가지 균주를 사용하는 EP 공개 제0088409호에 의한 발효법은 다음의 두전환 단계로 구성된다. 즉, 제1단계에서는 아세토박터, 글로코노박터, 어위니아 등의 균주를 이용하여 포도당을 2,5-디케토-글로콘산으로 전환시키고, 제2단계에서 DKG를 2-KLG로 바꾸는데 이 단계는 코리네박테리움, 브레비박테리움, 아쓰로박터, 슈도모나스 등의 균주를 사용한다. 상기 제 1단계와 제2단계는 혼합배양 방식으로 수행된다. 이때, 포도당에서 2-KLG에로의 생산수율 및 비타민 C의 산업적 생산가능성은 제2단계 균주의 역가에 의해 크게 결정된다.

현재 제2단계 반응에 사용되고 있는 균주인 Corynebacterium ATCC31090은 배지조건에 따라 7-15%의 생산수율을 나타내고 있으나 산업화에 필요한 70% 수준에는 크게 미흡하다. 그 이유는 DKG가균주의 에너지원으로 소모되는 측면과 2-케토-D-글로콘산(이하 2-KDG라 한다), L-이돈산(이하 L-IA라 한다), 5-케토-D-글루콘산(이하 5-KDG락 한다), D-글루콘산(이하 DGA라 한다)등의 여러 부산물이 형성되는 대사과정에 원인이 있는 것으로 알려지고 있다. 따라서 이와같은 대사경로중 일부를 차단하므로써 ATCC 31090이 가지고 있는 DKG에서 2-KLS로의 전환능력을 최대로 발휘하는 산업적 생산성이 있는 우량 균주를 얻고자 하는 것이 일반적인 연구의 흐름이었다.

지금까지 밝혀진 제2단계에 관련된 생화학적 경로는 아래 그림과 같다.

종래 상기 대사과정중 일부를 차단하여 2-KLG의 생산성이 향상된 균주를 선발하고자 하는 노력의결과로 보고된 바에 따르면, 상기 과정중 ①과 ②의 단계가 차단된 변이주가 가장 우수한 생산성을 갖는 것으로 보고되어 있다.(Argic. Biol. Chem.,51(11),3039-47, 1987)

본 발명자들은 친주인 코리네박테리움을 변이시켜 더욱 2-KLG의 생산성이 향상된 변이주를 얻고자 노력한 결과. 종래의 어느 변이주보다도 2-KLG의 생산성이 향상되어 있으며 또한 종래 변이주들과는 상이한 영양 특성을 갖는 신규한 변이주를 얻고 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

즉, 본 발명의 목적은 2-케토-L-굴론산 생성능이 있으며, 효모 엑기스 요구성을 갖는 신규한 코리네박테리움속(Corynebacterium sp.)M1-43 균주를 제공하는 것이다.

본 발명의 또다른 목적은 2-케토-L-굴론산 생성능이 있으며, 효과- 엑기스 요구성을 갖는 신규한코리네박테리움속(Corynebacterium sp.)M1-43 균주틀 영양배지에서 호기적으로 배양하여 고농도의 2-케토-L-굴론산을 축적한 후 배양액으로부터 2-케토-L-굴론산을 회수함을 특징으로 하는 발효법에 의한 2-케토-L-굴론산의 제조방법을 제공하는 것이다.

이하 본 발명을 보다 상세히 설명한다.

본 발명자들에 의해 개발된 변이주는 지금까지 보고된 코리네박테리움 ATCC 31090의 변이균주들과는 다른 특성을 가지고 있다. 즉. 위에서 도식으로 나타낸 ATCC 31090 균주의 부산물 생성대사과정중 어느 하나도 완벽히 차단되지 않았음에도 불구하고 M1-43은 2-KLG를 제외한 모든 유기산부산물들의 30-70% 낮아진 생성량을 나타낸다. 특히 효모 엑기스에 대한 생육 의존성은 펩톤이나 옥수수침지액, 쇠고기 엑기스 등으로도 대체될 수 없으며, 효모 엑기스를 공급하여 정상적인 생육을 유지시켜야만 고수율의 2-KLG 생산력을 보이는 점에서 지금가지 얻을 수 있었던 변이주들과 현격한 차이를 나타낸다.

친주로부터 본 발명의 변이주를 얻는 것은 통상의 변이방법에 의하여, 즉 자외선이나 화학적 돌연변이원을 이용하여 변이를 유발한 후 변이주를 선별하는 방법에 의해 실시할 수 있다.

변이주를 배양함에 있어서는 통상의 배양방법을 이용하여 영양배지에서 호기성 조건하에 변이주를 배양하면 무방하지만, 상기한 대로 본 발명의 변이주는 절대적인 효모 엑기스 요구성을 나타내므로 배지에 적당량, 예를 들면 0.1-0.5%(W/v)의 효모 엑기스를 첨가해 주어야 한다. 또한 전환반응에 있어서서 질소원의 농도가 매우 중요하다. 바람직하게는 유안을 0.01∼0.025%(w/v)의 양으로 첨가한다. 2-케토-L-굴론산의 출발물질로 사용되는 2,5-디케토-글루콘산 칼슘염도 배지에 첨가하여 주어야한다. 2,5-디케토-글루콘산 칼슘염의 첨가량은 0.1-1.0%(w/v)가 바람직하다. 첨가량이 1.0%를 넘으면 생산되는 2-케토-L-굴론산의 생산은 더이상 증가하지 않고 오히려 부산물로서 L-이돈산의 생산량이 증가된다.

바람직한 코리네박테리움 속 Ml-43의 배양방법은 다음과 같다. 박토펩톤, 효모 엑기스, 글리세롤 각자 0.5%로 구성된 슬랜트베지에서 성장 보관된 M1-43 균주를 글리세롤 대신 당이 포함된 생산배지로 한 루프만큼 옮겨져 30℃이하의 조건에서 20시간 배양한다. OD가 6.5를 넘고 배지의 PH가 7.5를 지나면 0.5% 당이 첨가된 5%DKG용액을 0.5내지 1.0%가 되도록 투입하여 15-36시간동안 추가 배양한다. 최종배양액은 균체를 제거하여 화학성분으로 고 포함한 유기산들을 분석하거나 5내지 10배 희석하여 프로마토그래피를 분석할 수 있다.

이하 실시예를 들어 본 발명을 보다 상세히 설명한다.

실시예 1

친주인 코리네박테리움 ATCC 31090을 밥토펩톤, 효모엑기스, 포도당이 각각 0.5%씩 첨가된 배지에 접종한다. 0D=0.2에서 배지 중에 나이트로소구아니딘을 최종농도가 0.02%가 되도록 첨가하여 30분 내지 1시간 동안 배양을 계속했다. 원심분리하여 회수된 균체를 2회 식염수로 세척한 뒤, 1분간 자외선을 조사하고 암실에서 미네랄 배지에 넣어 3시간 방채했다가 D-글루콘산을 탄소원으로 첨가하여 6시간동안 추가 배양했다. 미네랄 배지의 성분은 다음과 같다. 증류수 1리터 당 붕산 88㎍, 몰리브덴염 37㎍,철염 970㎍, 아연염 88㎍, 망간염 27㎍, 타이민 -HCl 1㎍, 판토텐산 10㎍, 나이아신 10㎍, 비오틴0.1㎍, CaCO₃3㎍을 넣고 이를 20배 희석하여 사용했다. 상기 배양에 의해 얻은 배양액을 글루콘산이 0.2% 첨가된 최소 한천배지에 도말하고 섭씨 30℃에서 4일간 증식시켰다. 자란 군락들은 투쓰피킹하여 0.3% 글루콘산과 0.2% 2-KLG가 들어있는 최소한천배지로 옮겨 5일간 배양하여, 구루콘산-함유 배지에서는 성장이 좋고 2-KLG-함유 배지에서는 성장이 나쁜 균주를 선발했다. 모아진 균주들은 플라스크 생산배지에 접종하고, 최종 배양액을 액체 크로마토그라피로 분석하여 얻어지는 크로마토그램을 통해 특히 우수한 2-KLG 생산성을 나타내며 동시에 부산물을 적게 생산하는 균주를 선발하고 M1-43으로 명명하였다. 본 발명에서 제공되는 코리네박테리움 속 M1-43은 1993년 12월 20일자로 한국종균협회에 기탁되어 KFCC-10806의 수탁번호를 부여받았다.

본 발명의 변이주 M1-43과 친주인 ATCC 31090간의 형태적 및 생리적 특성의 비교결과는 다음의 표 1, 표 2, 표 3과 같다.

상기 표 1은, 변이주 M1-43과 친주 ATCC 31090간에는 균주 개체간의 형태학적 측면보다 군락모양과 생리적인 측면에서 눈에 띄는 차이를 보인다는 것과 다른 부산물들의 질적인 변화 없이 2-KLG 생산력이 현격히 높아졌다는 특징을 보이고 있다.

상기 표 2는, 변이주 M1-43은 친주인 ATCC 31090에 비해 20KLG나 2-KDG의 탄소원으로서의 이용능을 거의 소실하였음을 보이고 있다. 그러나 각각의 생산력은 표1에서처럼 2-KDG 경우는 감소되었고 2-KLG는 크게 증가되어 있었다.

상기 표 3은, 변이주 M1-43이 친주인 ATCC 31090과는 달리 2-KLG 생산과 생육에 있어서 효모엑기스 의존성을 나타내는 것을 보여주고 있다. 생육에 있어서는 효모 엑기스가 없더라도 M1-43균주는 배지에 따라 일정량의 생육을 보이지만 그런 경우에도 효모 엑기스 없이는 DKG의 2-KLG에로의 전환률은 매우 낮았다. 즉, M1043 균주에 있어서 효모 엑기스는 정상적인 생육에 필요하며 특히 ATCC 31090에 비해 300% 이상의 증가를 보이는 2-KLG 생산에는 절대적으로 필요하였다.

실시예 2

박토펩톤, 효모엑기스, 포도당 각각 0.5%F를 함유하는 배지 0.1L가 든 2L플라스크 두개를 준비하여, 각각에 코리네박테리움 ATCC 31090과 그 변이주 M1-43(KFCC-10806)의 한 루프씩을 접종했다. 30℃에서 20시간 배양한 후, 0.5% 당이 첨가된 5% DKG용액 20ml을 첨가하여 30시간 추가 배양했다. 최종배양액을 원심 분리하여 5배 희석한 뒤 액체 크로마노그래피로 그 유기산들을 분석했다. 결과는 표4와 같다. M1-43 균주는 ATCC 31090균주와 유사한 생육과 pH양상을 보이는 반면, 2-KLG의 생산에 있어서는 현격한 증가를 그리고 부산물인 2-KDG와 L-IA의 생산에 있어서는 30% 이상의 감소를 보였다.

실시예 3

10ml 플라스크 24개를 준비하여 실시예 1과 동일한 배지를 각각 10ml씩 넣었다. 처음 12개에는 ATCC 31090균주를 접종했으며, 나머지엔 M1-43 균주를 접종하여 20시간 경과 뒤 DKG를 투여하였다. 이며, DKG는 플라스크 4개마다 최종농도가 0.2%, 0.4%, 0.6%, 0.8%, 1.0%, 1.2%가 되도륵 투입하였다.

최종 36시간 발효하여 얻어진 전환율은 표 5와 같다. DKG의 첨가량(%)을 줄일수록 전환률은 상대적으로 높아져 M1-43 균주는 0.2% 수준에서 60%를 상회하는 높은 결과를 보였다. DKG가 1% 이상 첨가되면 전환욜은 25-30% 수준을 유지하였는데 L-이돈산의 생산량이 증가되어 있었다. 일부 플라스크속의 DKG는 전환되지 않고 대부분 남아있는 경우가 있었고 그럴경우 대부분 pH는 7.0을 넘지 못하고 낮게 유지되고 있었다.

실시예 4

10ml 플라스크 24개를 준비하여 실시예 1과 동일한 배지를 각각 10ml씩 넣었다. 유안을 추가로 첨가하여 플라스크 4개마다 다음과 같은 농도를 갖도륵 하였다. 0%, 0.01%, 0.025%, 0.05%, 0.075%, 0.0%. 플라스크 12개씩에 ATCC 31090 균주와 M1-43 균주틀 각각 접종하였으며, 각 2개마다 위에서 특정한 농도의 유안으로 처리하였다. 16시간 배양한 뒤, 5% DKG용액 1ml씩을 넣었고 추가로 20시간 배양을 계속하였다. 생산된 2-KLC의 양(mg/ml)은 표 6과 같다. 배지 중의 질소원의 농도는 DKG의 전환률에 큰 영향을 주는 것으로 나타난다. 0.025% 이상 유안의 증가는 전환에 해로웠지만, 0.01-0.025%의 첨가는 전혀 첨가하지 않은 경우에 비해 10% 이상의 증가를 보였다.

실시예 5

옥수수침지액 0.3%, MgSO₄,7H₂O 0.02%, KH₂PO₄0.1% 및 글리세톨 0.5%를 함유하는 배지(pH 7.3)50ml가 든 0.5L 플라스크 10개를 준비했다. 5개 플라스크에 ATCC 31090 균을 접종시키고 나머지에는 M1-43균을 접종시켰다. (YE 무첨가군)

한편 상기와 동일하게 준비하되 배지에 효모 엑기스 0.3%를 첨가한 효모 엑기스 첨가군(YE 첨가군)을 준비하여 동이하게 균주들을 접종시켰다.

실시예 4에 준하여 배양을 함에 따라, YE 무첨가군에 있어서 ATCC 31090 균주는 통상의 생육을 보이는 반면 M1-43 균주는 비교군의 1/10수준의 저조한 생육을 보였고 0.5% DKG 첨가시에도 거의 전환을 확인할 수 없었는데, 그 결과는 표 7에 나타내었다.

반면, YE 첨가군에서는 M1-43 균주는 ATCC 31090 균주에 비해 2배 높은 생육도를 보였으며 현격한 2-KLG 생산력 증가를 나타냈다. 결과는 표 7과 같다.

Claims (5)

1. 2-케토-L-굴론산 생성능이 있으며, 효모 엑기스 요구성을 갖는 코리네박테리움 속(Corynebacterium sp.) M1-43(KFCC-10806)균주.
2. 2-케토-L-굴론산 생성능이 있으며, 효모 엑기스 요구성을 갖는 코리네박테리움 속(Corynebacterium sp.) M1-43(KFCC-10806)균주를 2,5-디케토-글루콘산을 함유하는 영양배지에서 호기적으로 배양하여 고농도의 2-케토-L-굴론산을 축적한 후, 배양액으로 부터 2-케토-L-굴론산을 회수함을 특징으로 하는 발효법에 의한 2-케토-L-굴론산의 제조방법.
3. 제2항에 있어서, 배지중에 질소원으로서 유안을 0.01-0.025(w/v)의 농도로 첨가함을 특징으로하는 방법.
4. 제2항에 있어서, 배지중에 효모 엑기스를 0.1-0.5%(w/v)의 농도로 첨가함을 특징으로 하는 방법.
5. 제2항에 있어서, 배지중에 함유되는 2,5-디케토-글루콘산의 양은 0.1-1.0%(w/v)임을 특징으로하는 방법.