KR960005086B1 - 빙핵활성을 갖는 미생물의 배양방법 - Google Patents

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내용 없음.

Description

빙핵활성을 갖는 미생물의 배양방법

제1도는 본 발명에 있어서, 초기배지에 함유되어 있는 젖산이 포도당 존재하에서도 슈도모나스 시링게 KCTC 1832에 의해 소모되는 것을 나타낸 그래프이고,

제2도는 본 발명에 있어서, 탄소원 제한연속 배양에서 희석율(성장속도와 같음)을 0.04hr^-1로 하고 온도를 28℃에서 22℃로 내렸을 때 각 클래스별 빙핵활성의 변화를 나타낸 그래프이다.

본 발명은 빙핵활성을 갖는 미생물인 슈도모나스 시링게(Pseudomonas syringae)의 고생산성 발효에 의해 배양하는 방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 빙핵활성 단백질 함유미생물인 슈도모나스 시링게를 발효조에서 고농도로 생산하는 유가배양을 포함한 회분배양과 연속배양 방법으로 배양하는 개선된 배양방법에 관한 것이다.

여기서 생산성이라함은 빙핵활성을 갖는 미생물균체의 발효조내농도(g./L), 단위시간당 또는 단위발효조 용적당 생산할 수 있는 균체량(g/Lhr), 그리고 단위균체당 생산되는 빙핵활성의 핵수(active nuclei numbers/g cell)를 말한다.

빙핵활성을 갖는 미생물에 관해서는 슈도모나스(Pseudomonas), 어위니아(Erwinia) 및 잔토모나스(Xanthomonas)를 중심으로 1970년대 초부터 알려지기 시작했다. 빙핵활성은 미생물이 생산하는 빙핵활성 단백질(INP, Ice-nucleation protein)에 기인하는 것이다. 빙핵활성 단백질의 특이한 구조에서 그 활성이 생긴다고 알려져 있는데, 그 작용기작 규명을 통하여 제빙, 제설 및 냉동공조산업, 식품공업 등에 응용하거나 냉해방지를 위한 균주개발, 또는 효과적인 진단시약의 개발 등에 응용하고자 하는 연구가 진행되고 있다[Wolber and Warren, "Bacterial ice-nucleation protein"(Trends in Biochemical Science 14 : 179~182, 1989)].

이와같은 응용범위를 갖는 빙핵활성 미생물을 어떤 목적이든 산업적으로 이용하기 위해서는 대량으로 생산할 수 있는 기술이 필요하다. 대량생산 발효기술은 두가지 관점으로 나누어 살펴볼 수 있는데, 첫번째는 빙핵활성을 갖는 미생물 균체를 대량생산하는 발효기술이고, 두번째는 균체당 빙핵활성이 최대가 될 수 있도록 발효환경을 조절하는 것이다.

이와관련되는 기술로는 어위니아 우레도바(Erwinia uredova)와 슈도모나스 비리 디프라바(Pseudomonas viridiflava)의 배양에 관한 것(일본특허 공개소 63-230473호), 수도모나스 시링게(Pseudomonas syringae) ACTC 53543의 배지조건에 관한 것(미국특허 제944120호), pH 조절에 관한 것(미국특허 제910600호) 그리고 2단 온도조절 방법(미국 특허 제21949호) 등이 알려져 있다.

그러나 이러한 기술들은 발효조의 생산성 및 균체농도가 낮다는 문제점이 있다.

따라서, 본 발명에서는 위와같은 종래의 기술들의 문제점을 극복하고 대량생산할 수 있고 균체당 빙핵활성이 최대가 될 수 있도록 하기 위하여 고농도 배양과 연속배양을 통한 최적화 기술을 도입하였다.

즉, 유가배양(fed-batch culture) 및 반복식 유가배양(repeated fed-batch culture)에서 최종균체 농도를 증가시켜 발효조 사용효율을 향상시킬 뿐만 아니라 연속원심분리기나 막분리기의 사용이 필요한 농축단계 없이도 동결건조할 수 있도록 한다.

또한 고농도 연속배양을 이용하여 빙핵활성 미생물을 생산함으로써 생산성 향상 뿐만 아니라 균질의 빙핵활성을 갖을 수 있도록 하였으며, 연속배양 및 유가식 배양에서 용존산소가 부족하게 될 경우에는 산소부화막[(주) 흥양, 서울]을 사용하여 산소분압이 높아진 공기의 공급으로 문제를 해결하였다. 또한 단위 균체당 빙핵활성을 최대로 하기 위해서는 연속배양에서 비정상 상태에 있는 미생물 생리 연구를 통하여 최적발효 환경을 확립하였다.

따라서, 본 발명은 빙핵활성을 갖는 미생물 슈도모나스 시링게를 유가배양을 포함한 회분배양과 연속배양 방법을 통하여 미생물 균체를 대량 생산하고, 균체당 빙핵활성이 최대가 될 수 있도록 발효환경을 조절하는 빙핵활성미생물의 배양방법을 제공하는데 그 목적이 있다.

이하 본 발명을 상세히 설명하면 다음과 같다.

본 발명은 빙핵활성미생물을 배양하는 방법에 있어서, 빙핵활성 미생물 슈도모나스 시링게 KCTC 1832를 사용하여 빙핵활성 단백질 함유 미생물을 발효조에서 35~100g/l(건조균체농도기준)의 고농도로 생산하는 유가배양을 포함한 회분배양 또는 연속배양에 의해 배양함을 그 특징으로 한다. 하지만 사용미생물이 슈도모나스 시링게 KCTC 1832로 제한되기 보다는 슈도모나스 시링게의 일반적인 고농도 배양방법으로 보아야 할 것이다.

본 발명은 빙핵활성을 갖는 미생물인 수도모나스 시링게(Pseudomonas syringae)KCTC 1832를 배양함에 있어서, 상기 미생물을 옥수수 침지액, 효모엑기스 및 소이펩톤이 포함된 산업용 미생물 함유 발효조에서 배양시키되 (a) 배양과정 동안에 산소부화막을 이용하여 용존산소가 10~50%가 유지되도록 용존산소를 제한하는 공정

(b) 발효조에 포도당 농도가 1% 이하가 되지 않도록 배양액을 공급하는 공정 및

(c) 용존산소가 1ppm 이하로 제한된 상태에서 배양온도를 20~24℃로 낮추어 주는 공정 중에서 선택되는 하나 이상의 공정으로 배양시키는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 있어서, 유가배양 및 연속배양에서 미생물 균체를 고농도로 생산하기 위해서는 (1) 균형있는 영양원의 공급, (2) 용존산소부족문제의 해결, (3) 미생물이 성장하면서 생산하는 대사열로 인한 온도상승의 방지, (4) 미생물의 성장을 저해할 가능성이 있는 부대사산물(발효 배지에서 유입된 것 및 성장 중 생산하는 것)의 축적방지 등의 네가지가 주요한 문제가 된다.

위에 열거한 네가지 문제점을 해결하는 방법을 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하면 다음과 같다.

첫째, 균형있는 영양원의 공급을 위한 배지 디자인은 발효 최적화의 가장 중요한 것으로 본 발명에서의 기본 디자인은 퍼트(S. J. Pirt)의 책["Principles of Microbes and Cell Cultivation" 1975, Blackwel Ltd., 134]을 주로 참고하였는데, 이는 미생물 균체구성 성분의 화학적 분석에 기초한 방법으로서 균체구성 성분에 알맞도록 배지를 고안한다는 것이다. 따라서, 자연계에서 새로 분리되는 균주에서는 성장조건이나 배지성분에 관한 정보가 없으므로 이러한 배지디자인 유용하게 사용될 수 있다.

본 발명에서 사용한 균주가 여기에 해당하는데, 본 발명의 사용균주는 국내토양에서 분리된 슈도모나스 시링게 AL(P. syringae AL ; 김정한 등, 1989, 한국생화학회지 22 : 73~77)로서 기탁번호 KCTC 1832로 1987년 6월 한국과학기술연구원 유전공학연구소 유전자은행에 기탁되어 있는 것을 사용하였다.

이러한 본 발명의 미생물에 대해서는 화학적 성분에 기초한 기본배지 디자인에 유기복합 성분으로 효모 엑기스, 펩톤, 소이톤, 단백질 가수분해 물, 그리고 옥수수 침지액(corn-steep liquor) 등을 첨가하였다.

각 성분의 조성예는 실시예에 명시하였다.

둘째, 용존산소 부족문제의 해결은 미생물의 고농도 배양을 위해 해결해야 할 가장 기초적인 문제중 하나이다. 미생물의 대사에 필요한 산소의 부족은 대사과정의 부분적인 저해와 부대사산물의 생산 등의 문제를 유발한다.

발효조의 산소 전달 능력을 향상시키기 위하여 통기속도 및 교반속도를 최대로 하고도 용존산소가 1ppm 이하로 부족해질 때는 공기중의 산소 분압을 증가시킬 수 있는 산소부화막 장치를 사용하여 대기중 21%인 산소 분압을 45-50%로 높게 하여 통기에 이용하였다.

산소부화막 장치는 막분리기술에 의해 공기중 산소분압을 높이는데 사용되는 것이다.

또한 공기나 산소부화막으로 산소분압이 높아진 공기로 사용하다가 더이상 용존산소를 유지할 수 없을 때는 배지공급속도를 낮추어 미생물의 산소요구도를 낮추도록 하는 방법도 사용하였다. 그 어떤 방법으로도 용존산소를 1ppm 이상으로 유지할 수 없는 경우에는 산소제한 상태의 성장이 계속되도록 배지공급 속도를 조절하였다. 이때는 통기에서 공급되는 모든 산소를 미생물이 대사에 사용하여 용존산소농도가 0이 되며 공급되는 산소만큼만 미생물의 성장이 계속된다.

셋째, 미생물의 성장하면서 내는 대사열(metabolic heat)은 보통 발효조의 경우처럼 낮은 농도의 경우는 큰 문제가 되지 않는다. 본 발명에서처럼 고농도로 배양해야 할 경우는 특별히 냉각된 물을 사용하거나 냉각순환 시스템을 갖는 온도조절기를 사용해야 하는데 본 발명에서는 후자를 사용하였다.

넷째, 미생물의 성장을 저해할 가능성이 있는 부산물의 축적은 계속 유입되는 배지성분중 미생물에 의해 사용되지 않는 성분의 축적과 미생물이 성장하는 과정에서 생기는 부대사산물의 축적으로 나눌 수 있다. 본 발명에서 사용한 옥수수 침지액에 함유된 젖산이 전자의 경우에 해당한다. 본 발명에서 사용한 슈도모나스 시링게 KCTC 1832를 포도당과 옥수수 침지액 등이 함유된 배지(실시예 1, 2참조)에서 배양했을 때 젖산은 포도당 존재하에서도 본 균주에 의해 사용되었다(제1도). 그것은 이 균주가 젖산을 생산할 수 있는 조건이 되더라도 환경조절에 따라 다시 사용될 수 있다는 것을 뜻한다.

본 발명을 위해 많은 발효실험을 수행하였지만 포도당/젖산 분석기로 측정한 결과 젖산이 축적되지는 않는다는 것이 확인되었다. 또한 많은 수도모나스 균주들이 고분자 다당류를 형성하는 것이 알려진 것처럼 본 발명의 경우에도 산소제한 조건의 생리상태가 계속되면 고분자 다당류가 생성되는 것이 관찰되었다. 그러나 고분자 다당류가 너무 많이 생성되면 배지성분중 희귀원소를 응집하므로 미생물의 성장에 영향을 미칠 가능성이 있는데, 본 발명에서 확립한 최적조건하에서는 그런 고분자물질이 생성되지 않는다.

본 발명에 있어서, 생산된 미생물 균체당 생성되는 빙핵활성을 최대화시키는 문제는 미생물 균체를 생산하는 것 자체와는 또 다른 문제로서, 단위균체당 빙핵활성을 최대화하기 위하여 사용한 방법은 연속배양에서의 비정상 상태를 통한 미생물생리 최적화실험이었다. 이 방법은 제한기질 및 성장속도에 정확히 알려진(보통 회분식 배양의 경우는 일정한 환경을 유지하기 힘듬) 상태에서 발효환경 변수의 효과에 대해 정확한 결과를 얻을 수 있기 때문에 사용하였다.

제2도는 탄소원 제한 연속배양조에서 희석율을 0.04hr^-1로 일정하게 유지하고 온도를 28℃에서 22℃로 변화시켰을 때 단위균체당 생기는 각 클래스별 빙핵수(ice-nuclei number)의 변화를 온도별로 측정한 것이다. 제2도에서 볼 수 있는 것처럼 그 효과는 몇시간 내에 측정할 수 있었으며, 제2도에서 보인 온도변화 효과외에도 제한기질, 용존산소 농도, 온도 배지종류 등에 대하여 유사한 실험결과를 최적화하여 실시예의 각 발효의 경우에 적용하였다.

온도는 빙핵활성을 최대화하는데 가장 중요한 요인중의 하나로 25℃ 이하에서 빙핵활성이 향상되며 20℃ 보다 더 낮아져도 빙핵활성은 크게 나아지지 않는다.

또한, 제2도에서 특기할 만한 것은 빙핵의 활성온도에 따라 구분된 클래스 A, B, C (각각 4.4℃ 이상, -4.8~ -5.7, -7.6이나 그 이상에서 활성을 나타냄)별로 구분되는 활성의 변화도 각각 측정할 수 있다는 사실이다. 빙핵수는 흡광도 1.0으로 맞춘액을 10배씩 계속 희석하여 측정하는 발리(Vali)의 방법을 사용하였다(J. Atmos. Sci., 28권 402-409, "Quantitative evaluation of experimental results on the heterogeneous freezing of supercooled liquids").

단위균체당 빙핵활성수를 증가시키기 위하여는 미생물이 낮은 속도로(최대성장속도의 1/3 이하) 자라는 것이 유리하다는 것을 밝혔는데, 본 발명에서는 주로 미생물이 필요로 하는 영양원의 제한공급으로 성장속도를 낮추었다.

여기서, 제한공급이라함은 미생물의 최대기질 소모속도보다 기질고급속도를 낮추는 것으로 그 비율은 배양액을 공급하는 펌프의 속도를 조절함으로써 원하는 속도로 조절할 수 있다.

본 발명에서는 최대 빙핵수가 얻어지는 경우를 중심으로 실험하였는바, 최대 빙핵수는 흡광도 1.0일 때의 액속에 들어있는 미생물 수에 비교하여(4.5×10cells/mL, ±20%) 비슷한 빙핵수를 갖는 때를 최대 빙핵수에 이르렀다고 볼 수 있다. 왜냐하면 미생물 한 마리당 한개 이상의 빙핵이 존재한다고 하더라도 실험기술상 한마리의 미생물을 단순한 희석만으로 둘로 나눌 수 없기 때문에 각 미생물 개체에 전부 빙핵이 존재하는 것, 즉 어떤 액안에 미생물 수만큼 빙핵수가 존재한다면 최대 빙핵수가 된다는 것이다.

따라서 본 발명의 방법을 사용하여 빙핵활성을 갖는 미생물 슈도모나스 시링게를 발효조에서 고농도로 생산하여 냉해방지를 위한 균주개발 또는 효과적인 진단시약의 개발 등에 응용할 수 있고, 인공제빙과제설, 냉동산업 및 삭품산업 등의 다양한 분야에 널리 사용할 수 있다.

이하 본 발명을 실시예에 의거 상세히 설명하겠는바, 본 발명이 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

[참고예]

엘비(LB) 배지에서 4℃ 냉장고에 보관하고 있던 플레이트로부터 50ml의 엘비 또는 티피비(TPB) 배지가 들어 있는 500ml 크기의 배플달린 삼각 프라스크에 접종하여 12-15시간 30℃의 쉐이커에서 150rpm으로 배양한 것을 발효조에 접종균으로 사용하였다. 접종은 3-10%로 하였고 발효조는 5L 크기에 실제 운전볼륨을 2.5-3.0L가 되도록 조정하였다.

발효를 시작한 후 포도당 및 젖산은 포도당-젖산 분석기(YSI 2300, U. S. A)를 사용하여 측정하였고 균체농도는 흡광도로 단시간에 측정하는 방법 이외에 105℃ 건조 또는 동결건조 후에 측정하였다. 배양중 pH는 30% 암모니아수를 사용하여 6.0-6.5로 조절하였다. 용존산소의 변화에 따라 통기율을 0.5v/v/m에서 2.0v/v/m으로 조정하였고 교반속도는 500-1500rpm으로 조정하여 특별한 경우를 제외하면 15% 이상의 용존산소를 유지하도록 하였다.

산소요구도가 높아서 최고 통기율과 교반속도로도 용존산소를 그 이상 유지할 수 없는 경우(균체농도 25-35g/L 이상)에는 제한 배지의 공급속도를 조절하여 산소요구도를 낮추거나 산소제한 상태로 발효를 계속하였고 경우에 따라서는 산소 부화막을 사용하여 45% 산소를 함유하도록 농축된 공기를 공급하였다. 균체가 50g/L 이상 고농도로 생산되었을 때 농축단계 없이 바로 동결건조하거나 침착물 제거를 위하여 연속 원심 분리기나 마이크로 필트레이션에 의해 세척한 후 동결 건조하였다.

[실시예 1]

본 배양조의 초기배지를 옥수수 침지액 4%, 효모엑기스 1%, 소이펩톤 0.5%, 제일인산칼리움 1%, 함수결정 포도당 5%로 하고 초기 pH를 2N NaOH를 사용하여 6.7로 맞춘 후 121℃에서 30분 멸균하여(포도당 별도멸균) 위의 조건대로 접종하여 발효를 시작하였다. 온도는 25℃로 유지하여 배양하였으며 20시간 경과 후 포도당 40% 옥수수 침지액 10%, 소이펩톤 1%, 효모엑기스 1%로 조성된 액을 발효조에 포도당 농도가 1% 이하가 되지 않도록 공급하여 유가식 배양을 40시간까지 계속했을 때 건조 균체 농도 62g/L를 얻을 수 있었다.

[실시예 2]

본 배양조의 초기배지를 옥수수 침지액 5%, 효모엑기스 1%, 소이펩톤 0.5%, 제일인산칼리움 1%, 함수결정포도당 3%로 하고 배양을 시작한 후 10시간 후부터 포도당 40%, 옥수수 침지액 10%로 조성된 액을 계속적으로 공급하였을 때 50시간에 81g/L의 건조균체농도를 얻을 수 있었다.

여기서 균체농도 21g/L(배양시간 15경과)에서부터는 용존산소 농도가 5% 이하로 떨어져 산소제한상태의 성장으로 끝날 때까지 계속된다. 용존산소에 의한 제한 성장이 되기 전까지는 26℃로 배양온도를 유지하다가 제한 성장 단계로 가게되면 배양 온도를 21℃로 낮추어 완전한 제한성장으로 배양을 계속하였다.

[실시예 3]

본 배양조의 초기배지를 옥수수 침지액 4%, 효모엑기스 1%, 소이펩톤 0.5%, 제일인산칼리움 1%, 하이드롤 5.5%로 하고 온도를 22℃로 배양을 시작하였다.

추가 공급 배지는 포도당 50%, 옥수수 침지액 10-%, 소이펩톤 1%, 효모엑기스 1%, 황산암모니움 5%로 조성된 액을 사용하였을 때 46시간 배양후 96g/l의 건조균체 농도를 얻을 수 있었다. 이 경우에는 배양 18시간후부터 산소 부화막(흥양)을 통하여 45% 산소함유공기로 통기를 계속하였다.

[실시예 4]

본 배양조의 초기배지를 실시예 1~3에서처럼 완전한 복합배지를 사용치 않고 반합성배지로 하여 25℃에서 배양하였다. 초기 배지는 함수 결정포도당 77(g/L), MgSO₄·7H₂O 2.3, NH₄Cl 10, NaNO₃3, KH₂PO₄11.3, CaCl₂2H₂O0.1, FeSO₄·7H₂O 0.07, MnSO₄·5H₂O 0.02, ZnSO₄·7H₂O 0.02, 효모엑기스 5.0, 소이톤 2.5, Tri-Na citrate 2로 배지를 조성하여 배양을 시작하였다. 배양 36시간째 부터는 포도당 50%, MgSO₄·7H₂O 2.3%, NH₄Cl1%, KH₂PO₄1.13%, 효모엑기스 3%로 조제된 액으로 공급하면서 유가배양을 계속했을 때 60시간에 이르러 건조 균체농도 88g/L을 얻을 수 있었다. 배지의 추가공급과 함께 배양온도를 22℃로 낮추어 배양을 계속하였다.

지금까지의 실시예는 유가회본 배양을 통한 생산성 향상을 예시하는 것이고 다음의 실시예는 고농도 연속 배양에 관한 것이다. 연속배양에 의한 생산의 장점은 유가식 배양보다 일정한 활성을 갖는 미생물을 생산할 수 있다는 것 외에도 단위 발효조에서 생산할 수 있는 균체량, 즉 생산성이 증가된다는 것이다.

[실시예 5~12]

연속배양은 초기배지를 함수결정 포도당 77(g/L), MgSO₄·7H₂O 2.3, NH₄Cl 10, KH₂PO₄11, CACl₂·2H₂O 0.1, FeSO₄·7H₂O 0.07, MnSO₄·5H₂O 0.02, ZnSO₄·7H₂O 0.02, CuSO₄·5H₂O 0.005, 효모엑기스 5.0-20.0, 소이톤 2.5, Tri-Na citrate 2로 하여 배양을 시작하였다. 연속배양요으로 사용한 배지는 함수결정 포도당 220(g/L), MgSO₄·7H₂O 2.3, NH₄Cl 20, NaNO 3 5, KH₂PO₄11, CaCl₂·2H₂O 0.1, FeSO₄·7H₂O 0.07, MnSO₄·5H₂O 0.02, ZnSO₄·7H₂O 0.02, CuSO₄·5H₂O 0.005, 효모엑기스 5.0, 소이톤 2.5, Tri-Na citrate 2로 조정하였다. 각 희석율 및 온도별 건조균체 생산의 결과를 다음표에 나타내었다.

Claims (1)

1. 빙핵활성을 갖는 미생물인 슈도모나스 시링게(Pseudomonas syringae) KCTC 1832를 배양함에 있어서, 상기 미생물을 옥수수 침지액, 효모엑기스 및 소이펩톤이 포함된 산업용 미생물 함유 발효조에서 배양시키되 (a) 배양과정 동안에 산소부화막을 이용하여 용존산소가 10~50%가 유지되도록 용존산소를 제한하는 공정 (b) 발효조에 포도당 농도가 1% 이하가 되지 않도록 배양액을 공급하는 공정 및 (c) 용존산소가 1ppm 이하로 제한된 상태에서 배양온도를 20~24℃로 낮추어 주는 공정 중에서 선택되는 하나 이상의 공정으로 배양시키는 것을 특징으로 하는 빙핵활성을 갖는 미생물의 고농도 배양방법.