KR960004024B1

KR960004024B1 - 인삼 진세노사이드 Rb₁을 함유하는 항 대사성 당뇨제

Info

Publication number: KR960004024B1
Application number: KR1019920017677A
Authority: KR
Inventors: 박기현; 박화진; 이만휘; 박경미
Original assignee: 재단법인 한국인삼연초연구원; 박명규; 한국담배인삼공사; 김영태
Priority date: 1992-09-28
Filing date: 1992-09-28
Publication date: 1996-03-25
Also published as: KR940006599A

Abstract

내용 없음.

Description

인삼 진세노사이드 Rb1을 함유하는 항 대사성 당뇨제

제 1 도는 진세노사이드 Rb₁이 단백질의 인산화와 탈인산화에 미치는 영향을 보여주는 전기 영동의 전개도이다.

본 발명은 대사성 당뇨에 효과적인 인삼 사포닌, 특히 진세노사이드 Rb₁를 함유하는 항 대사성 당뇨제에 관한 것이다.

인류의 건강을 위협하는 질병 중의 하나의 당뇨병은 동매경화증과 같은 순환기 질환을 비롯해 신장병, 뇌관련질환, 망막증 등 다양한 합병증을 유발시키는 성인병으로 알려져 있다. 당뇨병은 크게 두가지가 있다.

첫째, 혈당을 저하시키는 인슈린이 부족하여 혈중에 당이 증가하는 유형으로써, 어린아이나 10대 청소년등에서 나타나는 인슈린 의존성 당뇨병이다.

둘째, 인슈린이 부족하지는 않지만 당의 대사가 비정상적이어서 혈중에 당이 축적되는, 중년 이상의 성인에게 발견되는 인슈린 비의존성 당뇨, 또는 대사성 당뇨라고 한다. 이 대사성 당뇨는 당뇨병 환자의 80-90%를 차지하고 있다.

인슈린 비의 비의존성, 대사성 당뇨병은 임상학적으로 볼 때, 식사후 일정시간이 경과된 뒤에도 혈증 포도당 양과 혈중의 트리글리세라이드(triglyceride) 양은 비정상적으로 증가하며, 혈당 상승에 의해 초래되는 간내 글리코겐(glycogen)양이 감소된다.

인슈린 비의존성, 대사성 당뇨병은 쥐에 사염화탄소를 투입하고 간에서의 당대사를 관찰할 수 있으며, 이 때 관찰되는 단백질들의 변화는 다음과 같다.

간내 글리코겐은 분자량 43,000인 글리코겐 생성효소에 의하여 합성되며, 저장상태의 글리코겐은 분해효소에 의해 분해된다. 글리코겐 생성효소 단백질의 카르복실기 말단에 가깝게 위치한 세린 또는 트레오닌 잔기에 인이 결합하는 글리코겐 생성효소의 인산화에 의해 효소 활성은 저하되고, 글리코겐의 합성이 중단된다. 인산화된 글리코겐 생성효소의 탈인산화는 단백질 인산분해효소 (protein phosphatase)에 의해 이루어지며, 탈인산화된 글리코겐 생성효소는 활성을 회복하게 된다(Y, Nishizuka, Mol. Biol. Biochem. Biophys., 32, 113-135, 1980 ; E. G. Krebs et. al., Ann. Rev. Biochem., 48, 923-959, 1979 ; J.Perry et. al., FASEB j., 2, 2957-2969, 1988 ; P. Cohen, Ann. Rev. Biochem., 58, 453-508, 1989). 대사성 당뇨에서는 단백질 인산분해효소가 불활성화되어 글리코겐 생성효소의 탈인산화 반응이 이루어지지 않은 채 글리코겐 생성효소의 인산화 양은 계속 증가하게 된다. 따라서 글리코겐의 합성은 실제로 감소한다.

간의 원형질막에 존재하는 칼슘 펌프 (Ca²⁺-pump)는 분자량 118,000의 단백질로써, 간세포 밖에서 간세포내로 유입되는 칼슘을 간세포 밖으로 유출시켜 주면서 간세포 내의 칼슘의 양을 조절하는데, 이 단백질의 카르복실기 말단 부근에 위치한 세린 또는 트레오닌의 잔기가 인산화되면 간세포 밖으로부터만 간세포 내로 칼슘이 유입되기 때문에 간세포 외부에 칼슘의 부족현상이 일어남과 동시에 간세포 내부에는 칼슘이 축적하게 되며, 이 칼슘으로 칼슘펌프의 인산화는 더욱 강하게 일어난다(S. Loterszajin 등, Hormonal inhibition of the liver plasma membrane (Ca²⁺-Mg²⁺) ATPase is mediated by a Gs-like protein, in cell calcium metablism, 3-11, Ed. Gary Fiskum, Plenum press, 1989년 ; Sue-Hwa Lin, 동일본, 13-19면 ; J.L. Farber 등, Science, 206, 700-702, 1979 ; L. Moore, Biochemical pharmacology, 29, 2505-2511, 1980).. 이러한 칼슘 부족현상으로 혈당 저하작용이 있는 인슈린이 췌장의 β-세포로부터 분비되지 않아 당뇨병이 유발된다. 이러한 이유로 당뇨병 및 그 합병증을 치료하기 위해 일본에서는 당뇨병환자에게 칼슘 섭취를 권장하고 있다(후지다 다구오, 칼슘의 Rb₁경이, 152-159, 1989년, 강담사).

인슈린 의존형 당뇨병은 자가면역질환으로, 자가항체는 분자량이 64,000의 단백질이다(S. Baekkeskovet. al., Nature, 298, 167-169, 1982). 이러한 분자량의 자가항체가 사염화탄소를 투여한 쥐의 간세포에서도 인산화되어 나타났다.

당뇨병에 대한 인삼의 치유효과에 대한 연구는 많으며, 이 결과들을 검토하면 다음과 같은 문제점을 발견 할 수 있다. 인슈린 의존성 당뇨병을 연구함에 있어 췌장에서 인슈린이 분비되지 않게 스트렙토조신(streptozosin) 등으로 췌장의β-세포를 파괴한 후 어떤 약물의 항당뇨 효과를 관찰하는 것은 타당할 수 있으나, 이것을 대사성 당뇨를 유발하는 것은 아니다. 둘째 대사성 당뇨는 간 및 혈액에서 포도당과 글리코겐의 대사가 원활히 일어나지 않기 때문에 유발되며, 이것은 간의 기능성 단백질들의 인사화에 의해 조절된다. 그러므로 혈당과 간의 글리코겐과의 정량적 변화에 연관된 관련 단백질의 인산화 정도를 정량적으로 증명해야 할 필요가 있다.

셋째 당뇨병의 예방이나 치유효과를 혈당강하 작용이나 이에 동반되는 고지혈중 등의 개선에 목표를 두고 연구해왔기 때문에, 혈당강하와 간 글리코겐의 상승효과 만을 연관시킨 항당뇨효과의 기술은 매우 단순하였다. 이와 같은 당 대사에 관련된 세포레벨에서의 반응현상을 심도있게 관찰해 볼 필요가 있다.

따라서 본 발명에서는 사염화탄소를 처리한 쥐에 대하여 인삼의 진세노사이드 Rb₁를 투여하였을 때, 글리코겐 생성효소, 칼슘 펌프 및 자가항체 등의 단백질의 인산화를 억제함과, 동시에 혈당과 혈액내 트리글리세라이드의 양을 낮추어줌을 관찰하였고, 이에 따라 대사성 당뇨의 예방에 응용할 수 있게 되었다.

본 발명의 인삼의 진세노사이드 Rb₁은 항당뇨 작용을 나타내는데 유효한 양으로 투여될 수 있다. 그 양은 비제한적이며 0.1∼100mg/kg의 범위이다.

본 발명의 인삼의 진세노사이드 Rb을 함유하는 항대사성 당뇨제는 통상의 방법으로 투여될 수 있으며, 예를 들면 경구투여 또는 비경구 투여에 의할 수 있다.

본 발명의 진세노사이드 Rb₁을 함유하는 항 대사상 당뇨제는 투여 목적, 투여 경로 등에 따라 적합한 제형으로 제제화할 수 있으며, 예를 들면 정제, 펠릿, 캡슐, 엑기스, 드링크제 등의 경구용 약제의 제형으로 만들 수 있다. 제제화에 있어서는 인삼의 진세노사이드 Rb₁의 항당뇨 효과에 역효과를 미치지 아니하는 제약학적으로 허용되는 부형약을 사용할 수 있다.

본래 인삼의 분말 또는 각종 추출물은 인체에 대해 단기간 복용할 때 뿐만이 아니라 장기간 복용하여도 전혀 부작용을 일으키지 않고 오히려 비정상의 체질을 정상적인 적으로 변화시키는 것으로 보고되어 있어 인체에 대해 매우 안전하게 사용될 수 있을 뿐만 아니라(E. Traubucci, Pharmaton Geriatirc for oxicological Examination Mimeograph, Milano, 1(1969) ; 홍 형근 등, 고려인삼의 식품안전성 연구, 제 4 회 국제인삼심포지움, 199(1984) ; F. Soldati, Toxicological S tudies on Ginseng, Proc. Int. Ginesng Symp., 119(1984) ; A.H.Bott ; es et al., The Effect of Gineseng on Lifespen and Stress Responses in Mice, Gerontology, 25, 125(1979)), 더욱이 본 발명에 따른 인삼의 진세노사이드 Rb₁은 그의 생쥐에게 복강내(i.p.) 투여했을 때의 LD₅₀이 약 1,100mg/kg 체중의 범위인 것으로 보고되어 있어서(Korean Ginseng, Korea Ginseng ＆ Tabacco Res. Inst., Samhwa Pub. Co., Ltd. 149(1980)) 인체에 매우 안전하게 투여될 수 있다.

이하 본 발명을 실시예로서 설명한다. 그러나 본 발명은 실시예에만 국한하는 것은 아니다.

[실시예 1]

인삼의 진세노사이드 Rb₁의 분리 및 정제

인삼 500g의 분쇄한 분말을 70℃에서 3시간 동안 메탄올 1리터에 침적시킨 후 원심하여 상등액을 취하고, 감압 농축시켰다. 증류수 50ml에 녹이고, 디에틸에테르 5ml으로 2회 반복 추출 제거하고, 물층을 불포화 부탄을 용액 50ml로 4회 추출하고 불포화 부탄올 층을 합하여 증류수 30ml석으로 2회 세척하였다. 마지막으로 불포화 부탄올 층을 농축하고 난 후에 메탄올로 용해시켰다. 이것을 고속액체 크로마토그라피[조건 ; lichrosorb-NH₂(4.6mm I.D × 250mm, 50㎛)]에서 굴절율 검출기 이동상으로 아세토니트릴-물-부탄올(80 : 20 : 10, v/v)을 사용하고 고소액체크로마토 그램상에서 21분에 나타나는 분획을 모아 정제하여 무게를 달아 본 결과, 그 수율은 약 0.2%이 이었다.

[실시예 2]

1군상 5마리씩으로 이루어진 스프레이그 덜리 쥐(Sprague Dawley rat, 숫놈, 무게 약 200g)를 대상으로, 4군에 대하여 시행하였다. 사염화탄소군은 사염화탄소를 0.35ml/kg 되도록 옥수수기름(시그마사 제품, C-8267) 13ml에 녹여서 복강내로 투입한 경우이며 ; 진세노사이드 Rb₁군은 진세노사이드 Rb₁을 1회 10mg/kg되도록 생리식염수에 녹여 복강내로 1일 1회, 3일간 투입한 경우이며 ; 진세노사이드 Rb₁+ 사염화탄소군은 진세노사이드 Rb₁을 1회 10mg/kg 되도록 생리식염수에 녹여 복강내로 1일 1회로, 3일간 투입한 뒤 사염화탄소를 0.35ml/kg 되도록 복강내로 투여한 군이다. 대조군으로 옥수수기름을 0.35ml/kg 되도록 복강내로 투입하였다. 24시간 후에 쥐를 희생시키고, 혈청 및 간을 회수하였다.

[실시예 1-1]

[혈중의 글루코스의 양 측정]

혈액으로부터 제조한 혈청 20㎕에 글루코스옥시다제 3250ku/l, 퍼옥시다제 3.56ku/l, 뮤타로타제 22.5ku/l, 글리신 2.25g/1이 함유된 효소 시약(glucose-enzyme용액, 아산제약 주식회사) 30ml을 첨가하여 37℃에서 5분간 방치한 후 40분 이내에 시약 블랭크를 대조로 하여 분광광도계의 500nm에서 나타나는 흡광도를 측정하였다. 포도당에 대한 표준용액은 포도당 200mg/100ml를 사용하였다.

[실시예 1-2]

[혈중의 트리글리세라이드의 양 측정]

혈액으로부터 제조한 혈청 20㎕에 트리글리세라이드 G Ⅱ 시험액(Wako사 제품) 3.0ml을 첨가하여 37℃에서 15분동안 반응시키고, 분광광도계 505nm에서 흡광도를 측정하였고, 표준용액으로써 0.0312%의 글리세린 흡광도를 적용하였다.

[표 1] 실시예 1-1 및 1-2의 결과

참고 : 1) 대조는 옥수수기름을 복강내로 투여한 것을 나타냄. CCL₄은 옥수수 기름에 녹여 복강내로 투여하고, 진세노사이드-Rb₁은 인삼의 진세노사이드 Rb₁을 나타내는 것으로 생리식염수에 녹여 복강내로 투여했다.

2) n은 실험횟수를 나타내며,

3) 글루코스는 평균±표준편차로, 트리글리세라이드는 평균값으로 표시했다.

표 1에서 보는 바와 같이 대조군에 비해, 사염화탄소 투여군의 혈청에서는 포도당의 양이 약 86%, 트리글리세라이드는 3% 증가하였다. 진세사이드-Rb₁을 3일간 투여한 후 사염화탄소를 투여한 군의 혈청에서는 단독으로 사염화탄소만을 투여군에 대해 포도당은 28%, 트리글리세라이드는 26% 정도 감소하고 있다.

[실시예 1-3]

[간조직 내의 글리코겐의 양 측정]

균질화한 간조직 0.4g에 1.5ml의 1N NaOH를 첨가하여 항온수조에서 60분 동안 끊여 분해시킨 뒤, 3ml의 1N 과염소산을 첨가하여 혼합한 다음 실온에서 15분 동안 방치하였다. 여과한 여과액에 안트론(anthrone) 시약 2ml를 첨가하고, 냉각시킨 다음 항온수조에서 10분 동안 끊인 시료를 분광광도계의 620nm에서 흡광도를 측정하였다.

[표 2] 간 조직내의 글리코겐 양

사염화탄소 투여군의 쥐 간조직 내의 글리코겐 함량은 대조군의 간조직 내의 그것보다 약 12.8% 감소했지만, 진세노사이드 Rb₁+사염화탄소 군의 간조직 내의 글리코겐 함량은 사염화탄소 투여군에 대해 약 31% 증가하고 있다.

이것은 인삼의 진세노사이드-Rb₁은 간조직 내의 글리코겐 양의 저하를 억제시켜 주는 작용을 하고 있음을 시사해 주는 결과이며, 또한 이 결과는 혈당 함량이 사염화탄소 투여군에서 증가하지만 진세노사이드-Rb₁+사염화탄소 투여군에서 감소하는 현상과도 직접적인 관계가 있음을 시사하였다.

[실시예 2]

[단백질 인산화 및 탈인산화 반응에 미치는 진세노사이드-Rb₁의 효과]

4군에서 적출한 각각의 간조직 균질액 100㎍에[³²P]γ-ATP 2μCi를 첨가하여 37℃에서 5분 동안 인산화시킨 다음, 반응정지액 (0.125M 트리스, 4% 소튬 도레실 설페이트, 5% 2-머갑토에탄올, 0.01% 브로모페놀 블루, pH 6.8)으로 반응을 정지시킨 다음 SDS-전기영동을 행하여 건조시키고, -70℃에서 7일 동안 X-선 필름에 노출시켜 방사활성을 가진 인산화된 단백질을 검출했다. 동시에 단백질의 탈인산화 반응에 관여하는 단백질 인산분해효소의 저해제인 NaF를 50mM되도록 간조직 균일액에 첨가했다.

결과를 제 2 도에 종합하였다. 레인 1은 옥수수오일을 투여한 대조군이며, 레인 2는 대조군에 NaF를 처리한 경우, 레인 3은 진세노사이드-Rb 투여군, 레인 4는 진세노사이드-Rb 투여군에 NaF를 처리할 경우, 레인 5는 사염화탄소 투여군, 레인 6은 사염화탄소 투여군에 NaF를 처리한 경우, 레인 7은 진세노사이드-Rb + 사염화탄소 투여군, 및 레인 8은 진세노사이드-Rb + 사염화탄소 투여군에 NaF를 처리한 경우의 단백질 패턴을 보여주고 있다.

사염화탄소를 투여하였을 때(레인 5) 가정한 대로 글리코겐 생성효과(34 KD), 자가항원(64 KD), 칼슘펌프(118 KD)등 단백질들은 레인 1의 대조군에 비해 현저하게 인산화되었다. 그리고 레인 7의 진세노사이드-Rb₁투여에 의하여 인산화 단백질의 양은 감소되어, 진세노사이드-Rb₁에 의한 투여효과를 예측할 수 있었다.

NaF를 처리하였을 때의 레인 2, 레인 4, 레인 8의 34KD ; 레인 2, 레인 4, 레인 6, 레인 8의 38.5 KD ; 레인 2, 레인 4의 118KD에서 관찰되어 NaF가 탈인산화를 억제함을 알 수 있었다.

진세노사이드-Rb 를 투여하면 사염화탄소에 의해 유발되는 혈당과 혈중 트리글리세라이드의 증가를 감소시키며, 간내 글리코겐의 감소를 억제시켰다. 이를 세포내 당대사 관련 단백질들의 인산화 패텐면에서 살펴보았을 때, 진세노사이드-Rb 는 탈인산화를 촉진시키는 것으로 관찰되어, 이상에서 진세노사이드-Rb 는 대사성 당뇨에 효과적임을 알 수 있다.

Claims

인삼의 진세노사이드 Rb₁ 을 유효성분으로 함유함을 특징으로 하는 항대사성 당뇨병제.