KR940002794B1 - 은행엽에서 플라본 글리코람노사이드 쿠마릭에스터 화합물을 분리 정제하는 방법 - Google Patents

은행엽에서 플라본 글리코람노사이드 쿠마릭에스터 화합물을 분리 정제하는 방법 Download PDF

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Abstract

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Description

은행엽에서 플라본 글리코람노사이드 쿠마릭에스터 화합물을 분리 정제하는 방법
본 발명은 은행엽으로부터 플라본 글리코람노사이드 쿠마릭에스터 화합물을 분리 정제하는 방법에 관한 것이다.
더욱 상세하게는 은행엽에서 주된 유효성분인 캄프페롤-3-O-α(6'''-파라-쿠마로일글루코실-β-1,4-람노사이드)로 명명되는 캄프페롤 글리코람노사이드 쿠마릭에스터 화합물과 퀘세틴-3-O-α-(6'''-파라-쿠마로일글루코실-β-1,4-람노사이드)로 명명되는 퀘세틴 글리코람노사이드 쿠마릭에스터 화합물을 분리정제하는 방법이다.
은행엽에서 추출된 엑기스는 노인성치매, 뇌혈관 및 말초혈관 혈류장애치료약으로 사용되고 있으며, 그 주요 활성성분은 플라보노이드로 알려져 있다.
일반적으로 은행엽엑기스의 함유성분은 플라보노이드류, 터페노이드류, 기타 유기산류로 나눌 수 있는데, 그중 플라보노이드류가 전체 함유성분에서 약 50퍼센트를 차지하고 있다.
특히, 플라노보이드류중에서 상기 질환치료에 가장 중요한 활성물질은 플라본 글리코사이드류이며, 이중 주요 유효성분은 캄프페롤 글리코람노사이드 쿠마릭에스터화합물 및 퀘세틴 글리코람노사이드 쿠마릭에스터화합물등으로 이루어진 플라본 글리코람노사이드 쿠마릭 에스터 화합물이다.
본 발명은 은행엽으로부터 주요 유효활성물질인 플라본 글리코람노사이드 쿠마릭에스터 화합물을 추출 분리하고 이로부터 캄프페롤 글리코람노사이드 쿠마릭에스터 화합물과 퀘세닌 글리코람노사이드 쿠마릭에스터화합물을 동시에 고농도로 각각 분리 및 정제함으로써 은행엽엑기스의 표준물질 및 새로운 의약품으로 개발 가능한 생리활성물질을 대량생산이 가능한 방법을 제공하는데 그 목적이 있다.
이하, 본 발명을 상세히 설명하면 다음과 같다.
은행엽을 30℃ 내지 80℃에서 저급알콜, 저급아세테이트, 저급케톤 또는 이들의 혼합용매로 추출하고 농축한 잔사를 증류수나 저급알콜수용액, 저급케톤수용액에 용해시킨후, 생성된 침전물을 여과한 여액을 클로로포름, 사염화탄소, 벤젠, 톨루엔, 에테르등의 비극성 용매로 분리하고 이를 가성소다, 가성카리, 수산화암모늄, 탄산소다 등의 알카리화합물로 pH가 7 내지 10의 범위가 되도록 조절한 후, 이를 저급아세테이트, 저급케톤, 저급알콜 또는 그 혼합용매등으로 추출, 분리, 농축, 건조하여 플라본 글리코람노사이드 쿠마릭에스터 혼합분말을 얻는다.
다음, 이 혼합분말을 메칠알콜-클로로포름, 에칠아세테이트 및 에칠아세테이트를 함유한 혼합용매를 사용하여 실리카겔 칼럼크로마토그라피로 캄프페롤 글리코람노 사이드 쿠마릭에스터 화합물과 퀘세틴 글리코람노사이드 쿠마릭에스터 화합물을 각각 분리, 정제한후, 각각의 플라본 글리콜람노사이드 쿠마릭에스터 화합물을 최소량의 2차 증류수로 가온하여 녹인후 영하 0℃-20℃에서 방치하면 순수한 무정형의 결정을 얻는다.
이와같은 본 발명을 더욱 상세히 설명하면 다음과 같다.
건조된 은행엽을 저급알콜, 저급아세테이트, 저급케톤 또는 그 혼합용매로 30℃-80℃에서 환류 추출한후 여과하고 농축한다. 잔사를 다시 증류수 또는 증류수와 저급알콜 및 저급케톤 혼합용액에 녹인후 셀라이트, 활성탄을 넣고 교반 여과하여 여액을 클롤로포름, 사염화탄소, 벤젠, 톨루엔, 에테르 등의 비극성용매로 분리한다.
수용액층을 알카리화합물(가성소다, 가성카리, 수산화암모늄, 탄산소다 등)로 알카리화하여 pH 7-10으로 조정하고 저급아세테이트, 저급케톤, 저급알콜 또는 그 혼합용매로 교반 분리한후, 유기용매층을 증류수로 2-4회 씻고 탈수처리후 농축, 건조하면 황색분말상의 플라본 글리코람노사이드 쿠마릭에스터 혼합분말을 얻는다.
이 혼합분말은 주로 캄프페롤 글리코람노사이드 쿠마릭에스터 화합물과 퀘세틴 글리코람노사이드 쿠마릭에스터 화합물로 이루어져 있고 기타 다른 물질이 소량 함유된 분말이다.
다음, 이 분말은 분리 정제하여 캄프페롤 글리코람노사이드 쿠마릭에스터 화합물과 퀘세틴 글리코람노사이드 쿠마릭에스터 화합물을 얻기 위해서 실리카겔칼럼크로마토그라피를 이용한다.
이때 칼럼에 사용하는 용매는 클롤로포름과 메칠알콜 혼합용매 및 에칠아세테이트등을 사용하면 좋다.
또한 이를 더욱 순수하게 정제하기 위하여는 상기한 각각의 플라본 글리코사이드 화합물을 최소량의 2차 증류수로 가온용해한후 영하 0℃-20℃에서 방치하면 무정형의 결정을 얻는다.
이와같은 본 발명에 따르면, 은행엽으로부터 주요활성 물질인 캄프페롤 글리코람노사이드 쿠마릭에스터 화합물과 퀘세틴 글리코람노사이드 쿠마릭에스터 화합물만을 분리할 수 있어 상기 질환의 치료효과를 높힐 수 있는 새로운 의약품을 개발가능하고, 또한 그 공정이 간단하여 대량생산이 가능하며 경제적인 방법으로 생산할 수 있다.
이와같은 본 발명을 실시에에 의거 더욱 상세히 설명하겠는바, 본 발명이 다음의 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
[실시예 1]
은행엽 건조분말 3kg을 에칠알콜 15ℓ을 넣고 40℃에서 교반, 환류하여 5시간씩 2회 추출한후 여과한다.
여액을 농축하고 잔사를 물-알콜 혼합용액(2:1) 3ℓ을 가하여 녹인후 셀라이트 300g을 넣고 교반하여 여과한다.
여액을 클롤로포름으로 3ℓ씩 3회 분리한후 수용액층을 1노르말 가성소다액으로 pH 7.5-8.5로 조정한다. 이 알칼리용액을 동량의 에칠아세테이트로 4회 추출 분리하여 모으고 증류수로 2회 씻은후 무수망초로 탈수하고 농축 건조하면 황색분말상의 플라본 글리코람노사이드 쿠마릭에스터 혼합분말 26g을 얻는다.
[실시예 2]
은행엽 건조분말 3kg을 에칠아세테이트 15ℓ에 넣고 50℃에서 환류, 교반하여 7시간씩 3회 추출하고 여과한다.
여액을 농축하고 잔사를 증류수 2ℓ에 녹인후, 탄산소다를 사용하여 pH 7-8로 만들고 셀라이트 200g을 넣고 교반하여 여과한다.
여액을 사염화탄소로 반복 분리하여 수용액층을 탄산소다로 pH 8-9로 조정하고 부칠알콜-에칠아세테이트(1:2) 혼합용매를 사용하여 동량으로 3회 교반 분리하고 유기용매층을 모아 증류수로 3회 씻은후 무수망초로 탈수하고 농축 건조하면 황색분말상의 플라본 글리코람노사이드 쿠마릭에스터 혼합분말 32g을 얻는다.
[실시예 3]
은행엽 건조분말 3kg을 아세톤 15ℓ로 교반 환류시켜 40℃에서 5시간씩 2회 추출한후 여과한다.
여액을 약 1ℓ로 농축후 증류수를 1ℓ가하고 활성탄 500g을 넣은후 교반하고 여과한다. 여액을 동량의 벤젠으로 4회 반복 추출 분리하고 수용액층을 1노르말 수산화암모늄액으로 pH 11.5-12로 조정한후 부칠알콜로 2회 분획한다.
수층을 다시 pH 7.5-8.5로 조정한후 동량의 에칠아세테이트 4회 추출 분리하여 모으고 증류수로 2회 씻은후 무수망초로 탈수하고 농축건조하면 황색분말상의 플라본 글리코람노사이드 쿠마릭에스터 혼합분말 25g을 얻는다.
[실시예 4]
잘게 분쇄한 건조 은행엽 3kg을 메칠알콜 15ℓ에 넣고 50℃에서 교반 환류시켜 7시간씩 2회 추출한후 여과한다.
여액을 농축한 잔사에 아세톤과 증류수 혼합용매(1:3) 2ℓ를 가하여 약 45℃로 가온 교반한다. 냉각후 셀라이트 250g을 가하여 교반 여과하고 여액을 활성탄 500g을 넣고 교반 여과한다.
여액을 1노르말 가성카리액으로 pH 8.5-9.5로 조정한후 동량의 메칠에칠케톤용매로 4회 추출 분리하여 유기용매층을 모은다. 유기용매층을 증류수 2회 씻은후 무수망초로 탈수한 다음 농축 건조하면 황갈색분말상의 플라본 글리코람노사이드 쿠마릭에스터 혼합분말 30g을 얻는다.
[실시예 5]
실시예 1-4에서 얻은 분말 25g을 50㎖의 메칠알콜에 녹인다. 이 용액을 500㎖의 클로로포름-에테르(1:1) 혼합용매에다 교반하면서 적하하면 미황색의 침전물이 생성되고 생성된 침전물을 하루밤 방치한후 여과하여 건조하면 약 17g의 순수한 미황색 분말을 얻는다.
이 과정으로 지방물질(불포화탄화수소, 스테로이드등) 및 기타 비플라본화합물 등을 제거함으로써 고농도로 정제된 플라본 글리코람노사이드 쿠마릭에스터 혼합물질을 얻게 된다.
계속하여 각각의 화합물로 분리 정제하기 위해서 이 분말의 25배에 해당하는 실리카겔을 사용하고, 메칠알콜-클로로포름(1:4)을 용매로 하여 1차 칼럼크로마토그라피를 실시한다.
상기 방법으로 각 분획을 분리하면서 하기의 박층크로마토그라피법으로 표준품과 비교확인한 다음, 주요물질인 플라본 글리코람노사이드 쿠마릭에스터 분획만을 모아 농축건조하고, 이를 다시 에칠아세테이트-메칠에칠케톤-개미산-물(20 : 3 : 1 : 1)의 혼합용매로 2차 칼럼크로마토그라피로 분리하면 하기의 박층크로마토그라피법으로 확인된 캄프페롤 글리코람노사이드 쿠마릭에스터 화합물과 퀘세틴 글리코람노사이드 쿠마릭에스터 화합물을 순수정제된 상태로 각각 3.2g, 2.7g을 얻는다.
박층크로마토그라피법(TLC) : TLC판-실리카켈 60F 254(Merck사 제품)
전개용매-에칠아세테이트 : 메칠에칠케톤 : 개미산 : 물(=3 : 5 : 1 : 1)
확인방법-① UV 254㎜로 황갈색 반점
② 바닐린ㆍ황산 발색시약으로 황색 또는 황갈색 반점
Rf값-캄프페롤 글리코람노사이드 쿠마릭에스터 화합물 : Rf≒0.68
퀘세틴 글리코람노사이드 쿠마릭에스터 화합물 : Rf≒0.72
[실시예 6]
실시예 1-4에서 얻은 분말 25g을 실시예 5와 같이 용매침전법으로 정제한후 시료량의 25배로 실리카겔 칼럼을 만들고 메칠알콜-클로로포름(1 : 4) 용매를 사용하여 흘려보내고 1차로 플라본 글리코람노사이드 쿠마릭에스터 분획만을 모은다.
이를 농축 건조하고 다시 에칠아세테이트로 2차 칼럼크로마토그라피하면 캄프페롤 글리코람노사이드 쿠마릭에스터 화합물과 퀘세틴 글리코람노사이드 쿠마릭에스터 화합물을 각각 4.2g, 3.2g을 순수하게 얻는다.
[실시예 7]
실시예 5-6에서 얻은 각각의 캄프페롤 글리코람노사이드 쿠마릭에스터 화합물과 퀘세틴 글리코람노사이드 쿠마릭에스터 화합물을 더욱 순수한 결정을 얻고자 각각의 화합물을 최소량의 2차 증류수로 가온하여 녹인후 서서히 식히고 영하 0℃-20℃에서 방치하면서 재결정함으로써 무정형의 결정을 얻는다.

Claims (1)

  1. 은행엽엑기스 수용액을 유기용매로 추출하여 플라본 글리코람노사이드 쿠마릭에스터를 분리 정제함에 있어서, 유기용매로 추출하기 전에 가성소다, 가성카리, 수산화암모늄 또는 탄산소다로 pH를 7 내지 9의 범위가 되도록 조절하고, 유기용매추출하여 플라본 글리코람노사이드 쿠마릭에스터 혼합분말을 얻은 다음, 이를 저급알콜에 녹인후 클로로포름-에테르 혼합용매에다 적가하고 여과하여 정제된 혼합분말을 얻고, 이를 메틸알콜-클로로포름을 사용하여 실리카겔 칼럼으로 분리 정제하고, 이를 다시 메칠아세테이트-메틸에틸케톤-개미산-물의 혼합용매로 분리하여 캄프페롤 글리코람노사이드 쿠마릭에스터 화합물과 퀘세틴 글리코람노사이드 쿠마릭에스터 화합물을 각각 분리 정제한 다음, 이들 각각을 2차 증류수로 가온하여 녹인후 0-20℃에서 방치하여 재결정하는 것을 특징으로 하는 플라본 글리코람노사이드 쿠마릭에스터 화합물을 분리 정제하는 방법.
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