KR930008973B1 - 광합성 세균 배양용 무살균 배지 및 이를 이용한 광합성 세균의 배양방법 - Google Patents

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Description

광합성 세균 배양용 무살균 배지 및 이를 이용한 광합성 세균의 배양방법

본 발명은 광합성 세균 배양용 무살균 배지 및 이를 이용하여 개방계에서 광합성 세균을 배양하는 방법에 관한 것으로, 좀 더 구체적으로는 초산, 프로피온산과 같은 휘발성 저급 지방산의 탄소원, 염화암모늄과 황산암모늄 혹은 인산암모늄의 질소원, 비오틴, 니아신과 같은 비타민과 코발트, 철, 망간, 몰리브덴과 같은 미네랄의 미량성분, 효모추출물과 글루탐산소다의 증식촉진제, KH₂PO₄, 황산마그네슘과 염화칼슘으로 구성되는 무살균 배지와 이를 이용하여 개방계 옥외에서 정치 배양함을 특징으로 하는 광합성 세균의 배양 방법에 관한 것이다.

현재 광합성 세균(주로 홍색비유황세균)은 양식, 축산 사료의 첨가제, 유기질 비료의 기능 개선제, 단세포 단백질, 유용 물질 생산 및 폐수처리등에 광범위하게 이용되고 있는 균주로서 로도박터 스페로이드에스(Rhodobactor sphaeroides)와 로도박터 캡슈라타(Rhodobacter capsulata)가 주로 사용되고 있으며, 일반적인 광합성 세균증은 에너지원 및 탄소원으로 단당류, 휘발성 저급 지방산, 유기산, 아미노산 등을 이용하고, 무기물과 생육인자로 비오틴, 니아신, 티아민, 비타민 B₁₂, 파아아미노 벤조산등의 비타민들을 요구한다.

또한, 광합성 세균은 호기암 및 혐기명의 어느 한 조건 혹은 병합된 조건에서도 증식이 모두 가능하며, 질소 고정능도 가지고 있다.

한편, 연구실 혹은 현장에서 홍색비유황세균 균체로부터 유용물질을 생산한다든지 또는 홍색비유황세균 균체의 생산에 있어서 배양에 사용하는 배지에는 배지 성분으로 효모추출물, 글루탐산소다, 비타민, 질소원 등이 과량으로 함유되어 있어 홍색 비유황세균외에 일반미생물이 증식하기가 용이하므로 적당한 방법에 의해 살균 혹은 제균하고, 적정시설을 이용하여 외부로부터의 잡균에 의한 2차 오염을 방지하면서 배양을 실시하고 있다. 또한, 대규모 혹은 소규모 홍색비유황세균의 생산에 있어서도 배양기와 배지의 살균시설 및 배양기의 무균운전을 위한 일정한 시설을 필요로 하기 때문에 배양이 용이하지 못하고 비경제적일 뿐만 아니라 유용물질 및 균체의 생산량이 저조한 문제점이 있었다.

그러므로, 광합성 세균의 배양용 배지로서 무살균 배지를 이용하면 유용할 것이라는 근거 아래 많은 연구가 진행되어 왔지만, 아직까지 효과적인 무살균 배지에 대한 연구 보고가 없는 실정이다.

따라서, 본 발명의 목적은 광합성 세균 배양용 무살균 배지를 제공함으로서 광합성 세균을 용이하게 배양할 수 있게 하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적을 상기 무살균 배지를 이용하여 광합성 세균을 배양하는 방법을 제공하는데 있다.

상기 목적들 뿐만 아니라 용이하게 표출될 수 있는 또다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명에서는 초산, 프로피온산과 같은 휘발성 저급 지방산의 탄소원, 염화암모늄, 황산암모늄, 인산암모늄의 질소원, 비오틴, 티아민, 니아신과 같은 비타민과 코발트, 철, 망간, 몰리브덴과 같은 미네랄의 미량성분, 효모추출몰과 글루탐산소다와 같은 증식촉진제, 황산마그네슘과 염화 칼슘, 및 KH₂PO₄으로 구성되는 무살균배지에 홍색비유황세균을 접종하고 반연속식(Semi-cotinuous)배양을 행함으로서 홍색비유황세균 균체를 저렴한 가격으로 생산할 수 있었다.

본 발명을 좀 더 상세히 설명하면 다음과 같다.

본 발명의 광합성 세균 배양용 무살균 배지는 최종농도로 1당 초산, 프로피온산과 같은 휘발성 저급 지방산으로부터 선택된 1종 이상의 탄소원 3~5g, 염화암모늄, 황산암모늄과 인산암모늄으로부터 선택된 1종 이상의 질소원 0.4~1g, KH₂PO₄0.25~0.8g, 글루탐산소다 0.05~0.2g, 효모추출물 0.01~0.2g, 황산마그네슘 0.01~0.2g, 염화칼슘 0.005~0.053g, 비오틴 1×10^-5~1×10^-4g, 니아신 1×10^-4~1×10^-3g, 타아민원으로서 염소티아민 1×10^-4~1×10^-3g, 망간원으로서 황산망간(MnSO₄·5H₂O) 1×10^-4~2×10^-3g, 철원으로서 구연산철 1×10^-4~2.5×10^-3g, 코발트원으로서 염화코발트(CoCl₂·6H₂O) 1×10^-4~2.5×10^-3g, 몰리브덴원으로서 Na₂MoO₄·2H₂O 1×10^-5~5×10^-5g 으로 구성된다.

즉, 종래 배지에서 홍색비유황세균이 아닌 일반미생물이 이용하여 증식하기에 유리한 배지 성분인 효모추출물, 글루탐산소다, 비타민, 질소원등을 홍색비유황세균이 증식하는데 필요한 양만큼으로 한정하여 줌으로서 일반 미생물의 생육을 저지하였다. 홍색 비유황세균은 혐기명 혹은 호기암 또는 병화된 조건 및 질소원이 결핍된 조건하에서는 질소 고정에 의해서도 생육이 가능하므로 일정한 조건에서만 생육할 수 있는 일반 미생물 보다 증식력이 강한 특징을 갖는다. 그러나, 배지 성분 중 일반 미생물이 생육하는데 유리한 성분이 효모추출물, 글루탐산소다, 비타민, 질소원등이 과량으로 존재하게 되면 홍색비유황세균이 이용하고도 많은 양의 배지성분이 남게 되고, 잔존하는 배지 성분을 이용하여 일반 미생물이 생육하게 되어 홍색비유황세균 배양시 오염이 되는 것이다.

본 발명에서 사용되는 휘발성 저급 지방산으로부터 선택된 탄소원, 염화암모늄, 황산암모늄과 인산암모늄으로부터 선택된 질소원, KH₂PO₄, 글루탐산소다, 효모추출물, 황산마그네슘, 염화칼슘, 비오틴, 니아신, 염화티아민, 황산망간, 구연산철, 염화코발트등의 성분이 홍색비유화세균의 배양에 필요한 필수 성분 및 보조 영양원이란 것은 "J, Ferment. Technol., Vol. 56, No3, p200~208, 1978"등과 같은 종래의 문헌등에 상세히 기술되어 있다.

본 발명의 무살균 배지에 있어서 각각의 성분비가 설정치 이하일 경우에는 홍색비유황세균의 생육이 저조하며, 설정치 이상일 경우에는 일반 미생물의 생육이 발달하여 오염이 되는 문제점이 발생한다. 본 발명자는 상기 문제점을 해결하기 위하여, 본 발명과 같은 범위로 성분의 양을 한정해 줌으로서 잡균의 오염없이 홍색비유황세균을 배양할 수 있었다.

본 발명의 무살균 배지는 배지 성분의 양이 한정되어 있으므로 배지 성분이 빨리 고갈되므로 반연속식으로 배양하는 방법을 이용함으로서 홍색비유황세균을 용이하게 대량으로 배양할 수 있었다. 즉, 배지의 교환은 4일 간격으로 전체 배양액의 60~80%를 제거하고 새로 제조한 배지를 동량 첨가하는 방법으로 홍색비유황세균을 배양하였다.

무살균 배지를 이용한 홍색비유황세균의 배양방법을 좀 더 상세히 설명하면 다음과 같다.

먼저, 배지 1 리터당 KH₂PO 및 K₂HPO 각 0.5g, MgSO₄·7H₂O 0.2g, CaCl₂·2H₂O 0.053g, 효모추출물 2.0g, 트립톤 1.0g, 초산소다 1g, MnSO₄·5H₂O 1.2×10^-3g, 구연산철 2.5×10^-3g, CoCl₂·6H₂O 1×10^-3g, 니코틴산 1×10^-3g, 염산티아민 1×10^-3g과 비오틴 4×10^-5g이 포함된 스크린(screen)용 배지 20ml를 200ml용 플라스크에 주입하고 토양 혹은 연못에서 채취한 시료를 약간 첨가하고, 플라스크의 기체층을 질소 가스로 치환 충진시킨 후 온도 30℃, 평면조도 약 2만룩스의 조건에서 수일간 정치 배양한 다음, 배양액을 페트리디쉬(petridesh)의 평판 배지에 도말하고 배양하여 형성된 단일콜로니(Single colony)를 분리함으로써 광합성 세균 즉, 홍색비유황세균을 얻었다.

분리된 홍색비유황세균을 배지 1당 초산, 프로피온산과 같은 휘발성 저급 지방산으로부터 선택된 1종 이산의 탄소원 3~5g, 염화암모늄, 황산암모늄과 인산암모늄으로부터 선택된 1종 이상의 질소원 0.4~1g, KH₂PO₄0.25~0.8g, 글루탐산소다 0.05~0.2g, 효모추출물 0.01~0.1g, 황산마그네슘 0.01~0.2g, 염화칼슘 0.005~0.053g, 비오틴 1×10^-5~1×10^-4g, 니아신 1×10^-4~1×10^-3g, 티아민원으로서 염산티아민 1×10^-4~10^-3g, 망간원으로서 황산망간(MnSO₄·5H₂O) 1×10^-4~2×10^-3g, 철원으로서 구연산철 1×10^-4~2.5×10^-3g, 코발트원으로서 염화코발트(CoCl₂·6H₂O) 1×10^-3~5×10^-3g, 몰리브덴원으로서 Na₂MoO₄·2H₂O 1×10^-5~5×10^-5g의 농도로 구성된 본 배양 배지 2를 함유하는 5용 일반플라스틱 용기에 접종하되 본 배양 배지와 동일한 배지에서 무균적으로 배양한 배양액 500ml를 접종하고 개방계옥외에서 정치 배양을 실시하였다. 배양온도는 실외온도(6월, 평균 20~30℃)에 의하였고 조도는 태양광을 차광막에 의해 반차광하여 정오에 배양기의 표면 조도를 약 1,000룩스로 하였다.

배양하면서 4일 간격으로 전체 배양액의 60~80%를 제거하고 새로 제조한 본 배양 배지를 동량 첨가하였다.

다음의 실시예 및 비교예는 본 발명의 광합성 세균 배양용 무살균 배지 및 이를 이용한 광합성 세균의 배양 방법을 좀 더 구체적으로 설명하는 것이지만, 본 발명의 범주를 한정하는 것은 아니다.

[실시예 1]

먼저, 배지 1리터당 KH₂PO 및 K₂HPO 각 0.5g, MgSO₄·7H₂O 0.2g, CaCl₂·2H₂O 0.053g, 효모추출물 2.0g, 트립톤 1.0g, 초산소다 1g MnSO₄·5H₂O 1.2×10^-3g, 구연산철 2.5×10^-3g, CoCl₂·6H₂O 1×10^-3g, 니코틴산 1×10^-3g, 염산티아민 1×10^-3g과 비오틴 4×10^-5g이 포함된 스크린(screen)용 배지 10ml를 100ml용 플라스크에 주입하고 조치원 지역에서 채취한 토양시료 0.5g을 첨가한 다음, 플라스크의 기체층을 질소가스로 치환 충진시킨후 온도 30℃, 표면조도 약 2만룩스의 조건에서 5일간 배양하고 배양액을 스크린용 배지에 한천(agar)을 첨가하여 경화시킨 고체배지를 함유하는 페트리 디쉬에 도말한 후, 30℃의 온도로 배양하여 단일클로니를 형성시킨 다음, 형성된 단일클로니중 광합성 세균으로 동정되는 콜로니를 선별하고 분리된 홍색비유황세균을 스크린용 배지에 (NH₄)₂HPO₄0.8g과 글루탐산소다 3.4g을 첨가한 기초배지에 접종하고 호기암의 조건, 좀더 구체적으로는 25~30℃의 온도, 6.5~7.5의 pH, 300~1,500rpm의 교반속도, 0.2~5.0vvm의 공기공급량, 용존산소농도 0.4~5.0ppm을 유지하면서 pH조절기가 부착된 배양기를 운전하였으며, 알루미늄 호일로 외부로부터의 빛을 완전히 차단시키면서 종배양하였다.

종배양한 홍색비유황세균 배양액 100ml를 1유리용기에 초산 3g/, KH₂PO 0.5g/, 염화암모늄 0.65g/, 글루탐산소다 0.187g/, 효모추출물 0.02g/, MgSO₄·7H₂O 0.5g/, CaCl₂·2H₂O 0.0133g/, MnSO₄·5H₂O 1.2×10^-3g/, 구연산철 2.5×10^-3g/, CoCl₂·6H₂O 1×10^-5g/, 니아신 5×10^-4g/, 염산티아민 5×10^-4g/, 비오틴 2×10^-5g/및 몰리부덴 2×10^-5g/의 최종 농도로 구성되는 본 발명의 배지 400ml를 접종하여 옥외 배양계에서 7일간 정치 배양하였다.

배양시 배지의 pH는 6.8~7.0으로 조정하였고, 온도는 대기 온도에 의하였고, 광도는 강한 태양광을 차광막에 의해 차광하여 정오의 조도를 10000룩스로 조정하여 배양하였다.

7일간 배양후 영양한천 배지를 사용한 콜로니계수법에 의해 잡균의 오염정도 및 홍색비유황세균의 증식정도를 측정한 다음, 그 결과를 하기 표 1에 기재하였다.

[비교예 1]

KH₂PO₄, 0.5g/, K₃HPO₄0.5g/, (NH₄)₂HPO₄0,8g/, MgSO₄·7H₂O 0.2g/, CaCl·2H₂O 5×10^-2g/, 니코틴산 1×10^-3g/, 염산티아민 1×10^-3g/, 비오틴 1×10^-3g/, 프로피온산소다 2g/, CH₃COONa, 3H₂O 2g/, 효모추출물 2g/, CoCl₂40μM, NaHCO₃1g/, EDTA(에틸렌디아민테드라 아세테이트)50mg/와 CNB₁₂20μM/로 구성되는 배지를 사용한 것을 제외하고는 실시예 1 과 동일한 방법으로 홍색비유황세균을 배양하고 잡균의 오염정도를 측정하여 그 결과를 표 1에 기재하였다.

[실시예 2]

최종 농도로 초산 3g/대신에 초산소다 2g/와 프로피온산소다 2g/를 사용한 것을 제외하고는 실시예 1에 기재된 배지 2를 5의 플라스틱 용기에 넣고 실시예 1과 동일한 방법으로 분리하고 종배양한 배양액 500ml를 접종하고 옥외 개방계에서 배양하였다. 배양 온도는 실외 온도(6월, 평균 20~30℃)에 의하였고 조도는 태양광을 차광막에 의해 반차광하여 정오에 배양기의 표면 조도를 10000룩스로 하였다.

배양을 행하면 4일 간격으로 배양액의 80%를 상기 조성의 배지로 교체하면서 28일간 반연속 정치 배양하였다. 4일 간격으로 영항한천배지를 사용한 콜리니계수법에 의해 잡균의 오염정도 및 홍색비유황세균의 증식 정도를 측정한 다음, 그 결과를 하기 표 1에 기재하였다.

[비교예 2]

비교예 1에서 사용한 배지를 이용하여 배양한 것을 제외하고는 실시예 2와 동일한 방법으로 홍색비유황세균을 배양하고 잡균을 오염 정도를 4일 간격으로 측정하여 그 결과를 표 1에 기재하였다.

[표 1]

상술한 바와 같이 홍색비유황세균의 배양에 있어서 배지 성분중 일반 미생물이 증식하는데 유리한 효모추출물, 글루탐산소다, 비타민, 질소원등을 홍색비유황세균이 증식하는데 필요한 양만큼으로 한정하여 주고 배지를 4일 간격으로 반연속적으로 교환하여 줌으로서 잡균의 오염없이 광합성 세균 즉, 홍색비유황세균을 대량으로 증식시킬 수 있었다.

Claims (5)

1. 배지 1당 휘발성 저급 지방산으로부터 선택된 1종 이상의 탄수원 3~5g, 염화암모늄, 황산암모늄과 인산암모늄으로부터 선택된 1종 이상의 질소원 0.4~1g, KH₂PO₄0.25~0.8g, 글루탐산소다 0.05~0.2g, 효모추출물 0.01~0.1g, 황산마그네슘 0.01~0.2g, 염화칼슘 0.005~0.053g, 비오틴 10×10^-5~1×10^-4g, 니아신 1×10^-4~1×10^-3g, 티아민원으로서 염산티아민 1×10^-4~1×10^-3g, 망간으로서 황산망간(MnSO₄·5H₂O) 1×10^-4~2×10^-3g, 철원으로서 구연산철 1×10^-4~2.5×10^-3g, 코발트원으로서 염화코발트(CoCl₂·6H₂O) 1×10^-3~5×10^-3g, 및 몰리브덴원으로 Na₂MoO₄·2H₂O 1×10^-5~5×10^-5으로 구성되는 것을 특징으로 하는 광합성 세균 배양용 무살균 배지.
2. 제 1 항에 있어서, 탄소원은 초산 또는 프로피온산임을 특징으로 하는 광합성 세균 배양용 무살균 배지.
3. 상기 제 1 항의 배지에 광합성 세균을 접종하여 배양하면서 일정간격으로 일정량의 배지를 교환함을 특징으로 하는 광합성 세균의 배양 방법.
4. 제 3 항에 있어서, 배지 교환은 4일 간격으로 배양액의 60~80%를 교환함을 특징으로 하는 광합성 세균의 배양 방법.
5. 제 3 항에 있어서, 상기 광합성 세균의 배양은 개방계 옥외에서 정치, 배양하는 것을 특징으로 하는 광합성 세균의 배양 방법.