KR920006108B1 - 바실러스 라이케니포미스(Bacillus licheniformis)의 셀룰레이스(cellulase) 유전자 - Google Patents

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Description

바실러스 라이케니포미스(Bacillus licheniformis)의 셀룰레이스(cellulase) 유전자

제1도는 콩고레드(congored) 염색방법으로 셀룰레이스(cellulase)가 클로닝된 재조합 플라스미드를 갖고 있는 형질전환주를 선별한 사진이다.

제2도는 에스케리치아 콜라이(E. coli)에 클로닝된 셀룰레이스 유전자 인서트 크기를 최종적으로 1.4kb로 줄인 pLC110의 제한효소지도를 나타내는 그림이다. 실선으로 표시된 Hind III/EcoRI 단편이 삽입된 셀룰레이스 유전자를 나타낸다.

제3도는 클로닝된 셀룰레이스 유전자의 DNA 염기서열을 밝히기 위해 사용한 DNA의 방향을 나타낸다.

제4도는 결정된 DNA 염기배열과 이로부터 추정된 아미노산 배열 순서를 나타낸다.

제5도는 에스케리치아 콜라이 표준균주와 셀룰레이스 유전자가 클로닝된 균주의 조 추출액을 폴리아크릴아마이드겔 전기영동한 사진도해이다.

본 발명은 단백분해효소(protease)와 세제에 내성을 갖는, 바실러스 라이케니포미스(Bacillus licheniformis) KCTC 1026 유래의 셀룰레이스 유전자에 관한 것이다. 셀룰레이스는 1,4-β-글루칸 글루카노 하이드로레이스(E. C. 3. 2. 1. 4)로 불리는데 많은 미생물에 의해 생산된다. 대부분의 셀룰레이스는 다성분(multi component) 효소계로 되어 있어 다양한 pH 영역에서 활성을 나타낸다. 세균기원의 셀룰레이스 유전자로는, 클로스트리디움 써모셀륨(clostridium thermocellum) 및 셀룰로모나스 피미(cellulomonas fimi)의 셀룰레이스 구조 유전자가 대장균에 클로닝된 것이 보고되어 있다.(Cornet et al., FEMS Microbiology Letters 16 : 137-141(1983) ; Gilkes et al., Journal of Biological Chemistry 259 : 10455-10459(1984). 이밖에도 바실러스를 포함해서 셀로비브리오(cellovibrio), 아세토비브리오(Acetovibrio), 슈도모나스(Pseudomonas), 써모액티노마이세테스(Thermoactinomycetes), 스트렙토마이세스(Streptomyces)등의 균주가 생산하는 셀룰레이스가 알려져 있다. 셀룰레이스 생산량이 많은 곰팡이로는 아스퍼질러스(Aspergillus), 페니실리움(Penicillium), 퓨자리움(Fusarium) 등이 알려져 있다. 바실러스 라이케니포미스에 대한 연구는 단백질 분해효소(protease)나 아밀라아제(amylase)등에 대해서는 많이 진행되었으나 셀룰레이스에 대한 보고는 거의 없다.

본 발명은 바실러스 라이케니포미스 유래의 셀룰레이스 유전자와 이를 포함하는 재조합 플라스미드의 제조에 대한 것이다. 사용균주는 바실러스 라이케니포미스 KCTC 1026으로 과학기술원 유전공학센터 유전자 은행으로부터 분양받은 것이다. 바실러스 라이케니포미스가 생산하는 셀룰레이스는 단백분해효소와 세제에 내성을 갖는 효소로 분자량이 약 31,000달톤 정도이다. 셀룰레이스를 코딩하여 단백분해효소 및 세제에 대해 내성을 갖는 본 발명에 따른 유전자는 셀룰레이스 유전자 공여체인 B. 라이케니포미스 균주의 염색체 DNA와E. coli 플라스미드 pUC19로부터 제조할 수 있다. 즉, 셀룰레이스 유전자 공여체인 B, 라이케니포미스 KCTC 1026 균주를 PB 배지에서 배양하여 균체를 모은 후, 페놀 추출법(Saito et al., BBA 72 : 619-629(l963))에 의해 셀룰레이스를 코딩하는 염색체 DNA를 추출 정제하고, 이 DNA를 제한 효소 Sau3A로 부분 절단한 후 10-40% 슈크로스 밀도구배 원심분리에 의해 DNA 크기에 따라 분획을 수집한다. 한편, 벡타로 사용되는 E, coli pUC19를 가알카리분해방법(Bolivar et al., Gene 2 : 95-113(1977))에 따라 대량 분리하고, 제한 효소 BamHI로 완전 전달한 후 상기에서 수득한 Sau3A-절단 염색체 DNA크기별 분획과 연결시킨다. 이렇게 하여 수득한 연결된 DNA는 콤피턴트(competent) 세포인 E. coli JM l09(KCTC 2427)등에 형질전환시킬 수 있다. 또는 이 연결된 DNA, 즉 셀룰레이스 유전자 인서트(insert)가 들어 있는 플라스미드가 인서트 크기가 10kb이상임으로 하여 매우 불안정하므로 여러 제한 효소를 이용하여 그 크기를 줄일 수 있다. 본 발명에서는 인서트의 크기를 최종적으로 1.4kb로 감소시킨 플라스미드를 제조하였다.

상기 셀룰레이스 유전자 인서트를 함유하는 플라스미드를 E. coli에 형질전환시킨 경우, 그 형질발현 산물이 세포 밖으로 분비되지 않기 때문에, 바실러스-에스케리치아 셔틀 벡터를 이용하여 바실러스 속에서 발현될 수 있는 재조합 플라스미드를 제조할 수 있다.

본 발명에 다른 셀룰레이스 유전자로 형질전환시킨 균주를 배양하여 수득한 셀룰레이스는 전기영동 등의 방법에 의해 분자량을 확인한 결과 31kb이었으며, 계면활성제와 단백분해효소에 대해서도 내성을 나타내었다.

이하. 하기의 비제한적인 실시예에 의해 본 발명을 보다 상세히 설명한다.

[실시예 1]

(1) 염색체 DNA의 제조 및 벡타에의 삽입

바실러스 라이케니포미스 KCTC 1026를 PB 배지 100ml에 하룻밤 배양한 후 원심분리에 의해 균체를 회수했다. 균체를 페놀법에 의해 DNA를 추출정제한 결과 1.5mg의 염색체 DNA를 얻었다. 이 염색체 DNA중에서 100μg을 취해 제한효소 Sau3A를 첨가해 37℃에서 2시간 반응시켜 부분절단하였다. 10-40% 슈크로스그 밀도구배를 5mg 만들어서 하루 방치한후 그위에 상기의 부분절단된 염색체 DNA 0.lml을 얹은 후 28,000rpm에서 3시간 동안 초고속원심분리한 후 튜브에 구멍을 내어 0.2ml씩 분획을 받아서 아가로스겔 전기영동에 의해 분획의 DNA 크기를 확인해 5-20kb의 분획만 회수하였다. 한편 pUC19 플라스미드 DNA l0μg에 BamHI을 첨가해 1시간 반응시켜 완전절단하고 5분간 열처리하였다. 절단된 프라스미드 DNA 1μg에 상기에서 수득한 Sau3A-부분절단 염색체 DNA 분획 5μg을 섞고 DNA 리가아제를 첨가하고 15℃에서 16시간 반응시켜서 연결된 DNA를 얻었다.

(2) 플라스미드에 의한 형질전환

동결보조된 콤피턴트세포(E. coli KCTC 2427) 200μl를 하나한의 방법(Douglas Hanahan : DNA cloning vol I. 109-128)에 따라 상온에서 녹인후 여기에 연결된 DNA 0.lμg을 첨가해 30분간 얼음위에서 반응시켰다. 42℃에서 2분동안 열충격을 가한후 곧바로 얼음에 냉각시킨후 배지 0.8ml을 여기에 첨가해 37℃에서 1시간동안 반응시켰다. 반응후 맥콩키앰피씰린(MacConkey Ampicillin) 평판배지에 도말하여 흰색 콜로니를 형성한 형질전환주를 선별했다. 형질전환주는 1μg는 DNA에 약 40,000개를 얻었다. 1차로 선별된 형질전환주들을 엠피씰린을 ml당 50μg 첨가한 LB 평판배지에 리플리카해서 37℃에서 24시간 배양한다. 배양후 평판배지위에 씨엠시 오버레이 아가(CMC overlay agar)를 도말하고 60℃에서 2시간동안 반응시켰다. 반응후 1% 콩고레드(congo red) 용액으로 15분간 염색하고 1M Nacl로 씻어내어 셀룰레이스 활성을 갖는 노란색 환(yellow inhibitor zone)을 형성하는 콜로니를 최종적으로 선별하였다. 이들 셀룰레이스 활성을 나타내는 균주의 사진을 제1도에 나타내었다. 8,000주의 형질전환주 중에서 1주가 셀룰레이스 활성을 나타내었다.

셀룰레이스 유전자 인서트(insert)가 들어 있는 균주의 플라스미드는 인서트 크기가 10kb이상으로 매우 불안정하기 때문에 EcoRI, PsTl, HindIII, HincII등의 통상의 제한효소로 절단하여 분석한 후 최종적으로 인서트크기 1.4kb를 갖는 플라스미드를 얻고 이를 pLC110으로 명명하였다. pLC110의 제한효소지도는 제2도에 나타내었다.

(3) 바실러스 벡타에 서브클로닝

셀룰레이스 유전자를 함유한 재조합 플라스미드 pLC110이 들어 있는 에스케리치아 콜라이(E. coli)의 셀룰레이스 유전자산물은 세포바깥으로 분비되지 않아, 유전자산물을 세포바깥으로 분비시킬 수 있는 바실러스에 다음과 같이 서브클로닝(subcloning)하였다. pLC110을 제한효소 EcoRI과 SphI으로 이중분해하여, 바실러스-에스케리치아 셔틀벡타(Bacillus-E. coli shuttle vector)인 pUBll0에 멀티클로닝사이트(multi cloning site)를 넣어 제조한 pUBl19를 동일한 제한효소들로 이중분해하여 이중분해한 PULll0과 연결(ligation)시킨 후 바실러스 서브틸리스 BR151(KFCC 35422)을 형질전환시켜서 셀룰레이스 유전자를 갖는 재조합플라스미드 PULll0을 얻었다. 이 플라스미드 PULll0을 함유하는 바실루스 서브틸리스 BR151은 1990년 6월 29일자로 사단법인 한국종균협회(KFCC)에 KFCC-l0703의 기탁번호로 기탁되었다.

(4) DNA 염기서열결정

pLC110에서 셀룰레이스 유전자를 함유하고 있는 1.4kb DNA의 염기서열결정은 pUC19 플라스미드를 이용하고 디데옥시쇄 말단법(dideoxy chain termination method ; Sanger et al., Procedings of the National Academy of Science 74 : 5463-5467(1977)에 따랐다. DNA 염기서열 결정시의 전략은 제3도에 나타내었으며 결정된 DNA 염기서열 및 추정되는 아미노산배열은 제4도에 나타내었다.

[실시예 2]

(1) 셀룰레이스의 특성

클로닝된 셀룰레이스의 분자량을 확인하기 위해 E. coli JMl09(pUC l9)균주를 콘트롤로 해서 E. coli JM l09(pLC110) 균주의 조 추출액을 제조해서 8% 폴리아크릴 아마이드겔 전기영동한 결과 셀룰레이스 분자량은 31kb이었으며 제5도에 전기영동한 겔 사진을 나타내었다. 클로닝된 셀룰레이스의 활성과 안정성에 미치는 pH 및 온도의 영향을 살펴보았다.

바실러스 라이케니포미스 KCTC1026 균주와 클로닝된 pULll0(B.subtilis BRl51) 균주를 하룻밤 배양한 것을 효소용액으로 하여 씨엠씨로부터 유리되는 환원당을 다이니트로 살리실릭산(dinitrosalisylic acid, DNS) 방법(J.R.Sumner et al., J. Biol. Chem., 108, 51(1935))으로 측정한 결과 중성 pH에서 높은 활성을 나타냈으며 반응최적온도는 50℃정도였다.

(2) 클로닝된 셀룰레이스에 대한 계면활성제의 영향

클로닝된 셀룰레이스에 대한 여러가지 계면활성제(예, AS, AOS, LAS, ES)의 영향을 살펴보았다. 0.05% 계면활성제 용액에 셀룰레이스를 100단위를 첨가하고 30℃에서 15분간 반응시킨후 잔류활성을 측정한 결과 아래표 1과 같이 계면활성제에 대해 안정하다는 것을 확인했으며 0.15% SDS와 반응시에도 활성은 영향을 받지 않았다.

[표 1]

*AS : 소듐 알킬설페이트

AOS : 소듐 알파올레핀 설포네이트

LAS : 소듐 직쇄 알킬벤젠 설포네이트

ES : 소듐 폴리옥시에틸렌 알킬설포네이트

SDS :소듐 도데실 설페이트

(3) 클로닝된 셀룰레이스에 대한 단백분해효소의 영향

클로닝된 셀룰레이스에 대한 세제용 단백분해효소의 영향을 살펴보았다. Novo사의 세제용 단백분해효소인 알칼라아제(Alkalase)와 에스페라제(Esperase) 0.01-1%에 클로닝된 셀룰레이스를 섞고 20℃에서 15시간동안 반응시킨 후 잔류활성을 측정한 결과 아래표 2와 같이 세제용 단백분해효소에 내성을 나타내었다.

[표 2]

Claims (2)

1. 바실러스 라이케니포미스 KCTC 1026의 셀룰레이스를 코딩(coding)하며 계면활성제 및 단백분해효소에 대해 내성을 갖는 셀룰레이스 유전자.
2. 제1항에 있어서, 다음과 같은 아미노산 배열을 갖는 셀룰레이스를 유전자.

   

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