KR920002311B1

KR920002311B1 - 융모성질병(Trophoblastic Diseases)의 감별 진단용 시약의 제조 및 측정방법

Info

Publication number: KR920002311B1
Application number: KR1019890006870A
Authority: KR
Inventors: 정태화; 최명자; 최인성; 강혜경; 이종순
Original assignee: 한국과학기술원; 이상수
Priority date: 1989-05-23
Filing date: 1989-05-23
Publication date: 1992-03-21
Also published as: KR900018673A

Abstract

내용 없음.

Description

융모성질병(Trophoblastic Diseases)의 감별 진단용 시약의 제조 및 측정방법

제1도는 단일클론 항체, KW가 결합된 고상형 항체를 공동으로 사용하여 단일클론 항체, C10C에 효소 알카라인 포스파타제(alkaline phosphatase)를 결합시켜 hCG홀몬 총분자만을 특정적으로 측정할 수 있음을 나타내는 살험방법 및 결과로서, 유리알파형 소분자나 유리베타형 소분자와는 반응성이 없음을 나타내는 그래프.

제2도는 단일클론 항체, KW가 결합된 고상형 항체를 공동으로 사용하여 단일클론 항체, C10C에 효소 알카라인 포스파타제(alkaline phosphatase)를 결합시켜 hCG 홀몬총분자만을 특정적으로 측정할 수 있음을 나타내는 실험방법 및 결과로서, 유사당단백홀몬인 갑상선 자극 호르몬(Tyroid Stimulating Hormone ; TSH) 난포자극호르몬(Follicle Stimulating Hormone ; FSH) 황체화 호르몬(Leutenizing Hormone ; LH)과 거의 교차반응이 없음을 나타내는 그래프.

제3도는 단일클론 항체, KW가 결합된 고상형 항체를 공동으로 사용하여 단일클론 항체, C6C에 효소 알카라인 포스포타제(alkaline phosphatase)를 결합시켜 유리형 베타소분자 hCG만을 특정적으로 측정할 수 있음을 나타내는 실험방법 및 결과로서 유리알파형 소분자는 반응성이 없음을 나타내는 그래프.

제4도는 단일클론 항체, KW가 결합된 고상형 항체를 공동으로 사용하여 단일클론 항체, C6C에 효소 알카라인 포스포타제(alkaline phosphatase)를 결합시켜 유리형베타 소분자 hCG만을 특정적으로 측정할 수 있음을 나타내는 실험방법 및 결과로서 hCG홀몬 총분자나 유사 당단백홀몬인 TSH, FSH, LH와는 교차 반응이 없음을 나타내는 그래프.

제5도는 단일클론 항체, KW가 결합된 고상형 항체를 공동으로 사용하고, 제1효소 접합항체 (C10C-HRP)와 제2효소 접합항체(C6C-AP)혼합체인 복합 효소항체를 사용하여 검체중의 hCG홀몬 총분자와 유리베타형 소분자를 동시에 분별 측정하는 방법을 나타내는 도면.

제6도는 제5도의 측정법에 따라 홀몬 총분자와 유리베타형 소분자의 분별측정 실험을 했을때 hCG홀몬 총분자와 유리베타형 소분자의 농도에 따른 흡광도 반응성을 나타내는 그래프.

제7도는 제5도의 실험방법에 따라 분별측정 했을때 고농도 검체의 희석배수에 따른 결과를 나타내는 그래프.

제8도는 제5도의 실험방법에 따라 분별측정 했을때 고상형 항체와, 시료 단일 복합효소 접합항체를 동시에 넣고 반응시키는 일단계 반응법이나 고상형 항체와 시료를 먼저 반응시킨 후 미반응 시료를 제거하고 다시 단일 복합효소 접합항체를 가해 반응시키는 이 단계 반응법의 비교를 나타낸 도면으로서 두 방법 모두 이용 가능함을 나타내는 도면.

본 발명은 본 발명자들이 발명 제조한 인체 태반성 홀몬(human Chorionic Gonadotropin)(특허출원 1939. 2. 28. 2513호)의 각 소단위(subunit)분자에 대한 단일클론 항체(monoclonal antibody)들의 특성을 이용하거나 유통되는 기존상품의 유사한 특성을 가진 단일클론 항체를 이용하여 면역화학적 측정법에 의해 홀몬의 총분자(whole hCG)와 유리베타형 소단위 분자(β-subunit)를 단 일회의 측정단계 방법에 의해 동시에 감별하여 측정할 수 있는 새로운 인체 융모성질병(trophoblastic diseases)의 진단용 시약 제조방법 및 측정법에 관한 발명이다.

인체 태반의 영양배엽 세포에서 분비되는 당 단백질 홀몬인 인체 태반성 성선 자극홀몬(human chorionic gonadotropin)의 부인의 임신 초기에 임신 여부를 진단하는 중요한 진단 표지물질로 사용되고 있다. 한편 이 홀몬은 임신이 아닌 각종 융모성종양 환자의 뇨와 혈청중에서도 다량으로 존재하여 융모암(trophoblastic diseases)의 조기진단과 그 치료과정의 추적에서도 중요한 진단 지표물질로 이용되고 있다. 융모성 종양 환자 중에서는 홀몬 총분자(whole hCG)와 소단위분자(α,β-subunit)들의 함량과 상대적 조성비등이 정상 임신의 경우와는 다르게 나타날 뿐만 아니라 융모성 종양 환자들 사이에서도 그 형에 따라서 이 값들이 다른 것으로 알려지고 있다. 뿐만아니라 자연 유산이나 자궁외 임신들과 같은 비정상적 임신의 경우에도 홀몬 총분자와 그 소단위 분자들의 함량비가 다르게 나타난다.

본 발명의 특징은 홀몬 총분자와 유리베타형 소단위 분자에만 특이적으로 반응하는 단일클론 항체들을 이용하여 효소 면역 측정법에 의한 홀몬 분자들의 미량측정을 한번 조작하여 동시에 각각 분별하여 측정함으로써 질병을 감별진단 할 수 있는 새로운 진단약의 제조방법을 제공함에 있다. 홀몬 분자를 진단 표지 물질로 사용하여 여러 종류의 홀몬(hCG)측정용 진단약이 시판되어 실용화되고 있으나 주로 홀몬 총분자에 특이성을 가진 소단위 분자인 베타형 분자에 반응하는 단일클론 항체를 이용하여 총 홀몬분자(whole hCG)만을 측정하는 방법이다. 이 경우 측정되는 물질은 총분자와 유리베타형 소단위 분자 모두 동시에 검출되거나 또는 총분자 만이 검출되고 유리베타형은 특이적으로 검출이 불가능 하였다. 따라서 융모성질병(trophoblastic diseases)과 임신 진단을 동시에 구별 진단하거나 융모성질병의 종류를 정확히 감별하여 진단하는 방법은 불가능하였다. 그러나 본 발명은 좀더 구체적으로 설명하면 홀몬 총분자와 유리베타형 소단위 분자를 분리 정량하는 방법으로서 총분자와 베타형 소단위 분자 2종류에 모두 반응성을 가진 특정 단일클론 항체를 폴리스치렌(polystyrene)이나 기타 플라스틱 폴리머(plastic polymer)로 만든 시험관이나, 볼(ball) 또는 플레이트 웰(plate well)과 같은 고상형 담체에 결합시켜 검체와 반응시킬때 검체중에서 총분자와 베타형 소단위 분자를 동시에 검출하고, 그후 결합부위가 다르게 친화 항수(affinity constant)가 다른 단일클론 항체에 효소를 결합시켜 만든 복합체를 반응시켜 고상형 결합체에 함께 결합된 총분자와 베타형 소단위 분자를 분별반응시켜 각각의 분자를 분별 측정할 수 있도록한 것이다. 본 발명을 실시예에 따라 상세히 기술하면 다음과 같으며 이 실시예로서 한정되는 것은 아니다.

[실시예 1]

본 발명자들이 사용한 단일클론 항체, KW(KCTC 8432P), C10C(KCTC 8433P), C6C(KCTC 8430P)의 특성 및 친화 항수는 표 1과 같다.

[표 1]

제5도의 측정방법에 따라 분별측정할때 사용되는 단일클론 항체들의 특성 및 친화 항수

위의 단일클론 항체중 KW와 C10C의 조합을 이용하면 hCG홀몬 총 분자만을 측정할 수 있으며 베타형 소분자나 알파형 소분자, 또는 유사한 당단백질 홀몬과는 교차반응을 하지 않으며, 그 실험 및 결과는 제1도, 제2도와 같다.

[실시예 2]

위의 단일클론 항체중 KW와 C6C의 조합을 이용하면 hCG의 베타형 소분자만을 측정할 수 있으며, hCG홀몬 총분자와 알파형 소분자 또는 유사한 당단백질과는 교차반응을 하지 않으며 그 실험 및 결과는 제3도, 제4도와 같다.

실시예 1과 실시예 2에서 사용한 3종류의 단일클론 항체는 위의 실시예에 한정되지 않고, 유사한 특성을 가진 기존 상품의 단일클론 항체를 이용하여도 된다.

[실시예 3]

위의 단일클론 항체중 KW를 탄산완충액, PH 9.6용액에 10㎍/ml의 농도로 녹이고 폴리스치렌 마이크로 타이터 플레이트(polystyrene microtiter plate)의 웰(well)에 200㎕씩 가해 4℃에서 18시간정도 반응시킨후 생리 식염수가 함유된 인산염 완충액으로 3회 세척하여, 항체 KW(KCTE 8432P)로 고상형 항체를 제조한다. 항체 C10C(KCTC 8433P)를 효소, 홀스레디시 퍼옥시다제(horseradish peroxidase, HRP) 결합시켜 제1효소 접합항체를 만들고(1), 항체 C6C에 효소 알카라인 포스파타제 (alkaline phosphatase, AP)를 결합시켜 제2효소 접합항체를 만든후(2), 이 두 종류의 효소 접합항체를 혼합하여 단일 복합효소 접합항체로 만들어, 고상형 항체와 검체, 복합효소 접합항체를 함께 반응시키면, 검체중 hCG홀몬 총분자와 유리베타 소분자의 양에 따라 분별 반응이 일어나며, 제1효소 접합항체의 기질인 오르소-페닐렌 다이아민(O-phenylene diamine)을 사용하며, 450nm에서 흡광도를 측정하면 hCG총분자만을 측정할 수 있으며 제2효소 접합항체의 기질인 파라나이트로 페닐 포스페이트(P-nitrophenyl phosphate)를 사용하여 405nm에서 흡광도를 측정하면 유리베타 소분자만을 측정할 수 있다. 이때 두 종류의 효소 접합항체에 따른 흡광도 측정파장을 405nm로 동일하게 사용하여도 홀몬 총 분자와 유리베타형 소분자를 분별측정할 수 있으며 그 실험방법은 제5도와 같으며, 그 결과는 제6도와 같다. 이때 효소 접합항체에 사용하는 효소는 위의 실시예에 한정되지는 않으며, 또한 상호 교환하여 사용하여도 된다.

제5도의 방법으로 홀몬 총분자와 유리베타형 소분자를 분별 측정함에 있어서 필요한 킬트의 구성요소는 표 2와 같으며 다른 유사 홀몬과의 교차 반응은 표 3과 같다.

[표 2]

제5도의 측정법에 따라 분별측정할때 필요한 킬트의 구성성분

[표 3]

교차 반응성

또한 이 방법으로 측정함에 있어서 동일 검체에 대한 측정치의 재현성은 표 4와 같으며 홀몬 총분자와 유리베타형의 경우 변이계수(coefficient of variation)가 각각 8%와 6%미만이었다.

[표 4]

재현성

동시 실험에서의 재현성(Within-Run Precision)

반복 실험에서의 재현성

ㆍN=실험숫자/횟수 ㆍSD=표준편차

ㆍX=평균치 ㆍCV=변이계수

검체 희석에 따른 측정치의 정확성은 홀몬 총 분자와 유리베타형 소분자 측정의 경우 제7도와 같으며 고농도 검체의 희석배수에 따른 상관관계 계수도 0.995이상으로 희석배수에 따른 정확성이 우수하였다.

[실시예 4]

위의 실시예 1, 2, 3에서 홀몬 총 분자와 유리베타형 소분자를 측정함에 있어서 고상형 항체에 시료와 효소 접합항체를 동시에 반응시키는 경우와 시료를 먼저 고상형 항체와 반응시키고 미반응 물질을 세척한 후 다시 효소 접합항체를 반응시키는 경우를 비교했을때 비슷한 반응을 보였으며 그 결과는 제8도와 같다.

참고 문헌

1. Nakane, P.K. and Kawaoi, A.(1974) : Histochem. Cytochem. 22, 1084

2. Avrmeas, S.(1969) : Immunochem. 6. 43

Claims

두종류 이상의 단일클론 항체들의 각각 다른 특이 반응을 상호 보완적으로 이용하여 에피토프가 일부 동일한 두 종류 이상의 물질을 동시에 분별 측정하는 면역측정 방법.
제1항에 있어서, 에피토프가 일부 동일한 두 종류 이상의 물질과 동시에 특이 반응성을 갖는 고상형 단일클론 항체를 제조한후, 이를 사용하여 두 종류 이상의 물질을 동시에 반응시켜 동시에 측정하는 면역측정 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 두 종류 이상의 물질의 각각 다른 에피토프에 대한 두 종류 이상의 단일클론 항체에 종류가 다른 표지물질에 사용하여 각각 표지물질을 접합 만들고, 이 에피토프가 다른 두 종류 이상의 표지물질 접합항체를 혼합하여 단일 복합표지물질 접합체를 제조하여 두 종류 이상의 물질을 동시에 분별 측정하는 면역측정방법.
제3항에 있어서 표지물질이 효소인 면역측정방법.
제2항에 있어서 고상형 단일클론 항체 제조방법에 있어서, hCG홀몬 총분자와, 베타 소단위 분자에만 특이적으로 반응하는 단일클론 항체를 제조한 후 이를 사용하여 검체중 hCG홀몬 총분자와 베타형 소단위 분자만을 동시에 분별측정하는 면역측정 방법.
제3항에 있어서 종류가 다른 2종류의 표지물질중 홀스 레디시 퍼옥시다제는 hCG총분자에 특이 반응성을 가지는 단일클론 항체에 결합시켜 표지물질 접합항체를 만들고, 알카라인 포스포타제를 베타 소단위 분자에 특이 반응성을 갖는 단일클론 항체에 결합시켜 표지물질 접합 항체를 만들어 이 두종류의 표지물질 접합체를 혼합하여 복합표지물질 접합체를 단일용액으로 제조하여 분별측정하는 면역측정방법.
제5항의 고상형 단일클론 항체와 제6항의 복합표지물질 접합체가 포함된 융모성 질병의 감별 진단용 시약조성물.
제7항에 있어서, hCG홀몬 총분자와 베타형 소단위 분자를 각각 분별측정함에 있어서 한개의 킷트안에 다음과 같은 구성성분으로 이루어진 시약조성물.

① 고상형 단일클론항체 ② 단일 복합효소 접합항체

③ 효소기질 1 ④ 효소기질 2

⑤ 효소기질 3
제3항에 있어서 검체와 고상형 단일클론 항체를 먼저 반응시키고 세척후, 검체, 효소 복합항체를 모두 함께 반응시켜 측정하는 일단계 반응법을 이용한 면역 측정방법.