KR910004372B1 - L-페닐알라닌의 정제 및 회수방법 - Google Patents

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내용 없음.

Description

L-페닐알라닌의 정제 및 회수방법

본 발명은 기타 여러 불순물들을 포함하고 있는 L-페닐알라닌 발효액으로 부터 L-페닐알라닌을 정제 및 회수하는 방법중의 하나이다. 발효법에 의해 생산되는 아미노산들은 미생물의 영양원으로 사용되는 배지성분 즉, 무기영양분, 아미노산 및 펩타이드와 다른 여러 유기화합물에서 유래하는 불순물과 미생물의 대사에 의해 생산되는 유기물과 균체의 성분등 다수의 불순물이 함유되어 있는 것이 통례이다. L-페닐알라닌의 발효 생산시에도 이러한 불순물이 다량 함유되어 있으므로 L-페닐알라닌을 발효액으로부터 회수 정제하는데는 곤란한 점이 많이 대두되고 있다. 아미노산 회수에는 여러 방법들이 있으며, 그 중의 대표적인 방법으로 이온교환 수지법등이 있다. 이 방법은 컬럼에 양, 음이온, 교환 수지를 넣어 적당한 pH조건에서 통액하여 아미노산을 흡착시키고, 산 또는 염기를 사용, 용리하여 특정 아미노산 성분을 분리 정제하는 방법이다.

상기 방법에 대한 선행기술로서는 예를들어, 미국 특허 제 4,584,399 및 기타 여러 문헌 [Cogan et al., J.Sci. Food ＆ Agri. 1981, 32/459-66 ; Abe et al,. Bull. chem.Soc.Jpn. 1982, (JAPAN) 55/687-89/0 ; Lutz, Br.Jirgensons : Ber., 64, 1221(1931); D.T.Englis and H.A.Fiess, Ind, Eng.Chem., 36, 604(1944) ; C.S.Cleaver, R.A., Hardy, Jr. and H.G.Cassidy, J.Am.Chem.Soc., 67, 1343(1945)]등이 있다. 이 밖에 L-페닐알라닌을 황산과 반응시켜 황산염을 만든 다음, 재분리하여 회수하는 아미노산 회수 방법등이 있다.(U.S.pat.No.4,339,304/1983-Ajinomoto Co.) 또한 칼슘이온과 아미노산을 결합시켜 아미노산의 금속염을 형성, 재분리 회수하는 L-페닐알라닌의 회수방법도 특허(U.S.pat.No.4,621,153-BTI inc. -1986)로 발표된 바 있다. 위에서 언급한 이온교환 수지법은 재생 및 용리제로 과량의 산, 알칼리가 사용되며, 수지탑 설비에 있어 기본 설비투자 비가 과다하게 소요되며, L-페닐알라닌의 Ca++염 회수방법은 결정 순도가 낮고, 결정 수율이 80%미만으로 낮은 단점이 있다.

본 발명의 특징은 L-페닐알라닌 발효액으로 부터 L-페닐알라닌을 회수 정제하기 위해서 적당한 pH 범위에서 Zn 염을 만들고, 산을 첨가하여 L-페닐알라닌을 회수, 정제하는 방법이다. L-페닐알라닌의 불용성 Zn 염을 만드는 방법을 구체적으로 설명하면 우선 L-페닐알라닌 발효액에서 균체를 분리하고, 여기에 L-페닐알라닌과의 반응 당량 비율 만큼의 Zn 염을 첨가한 후 암모니아수로 pH를 알칼리성으로 하여 Zn과 L-페닐알라닌을 결합시켜 L-페닐알라닌 Zn염으로서 석출시킨다. 상기 용액을 여과하여 L-페닐알라닌 Zn 염의 결정을 분리하고 여과액 속에 남아있는 일부의 잔류 L-페닐알라닌은 pH 를 조절하여 다시 발효상등액으로 재순화시킨다. 석출된 아미노산 Zn염은 결정이 크고(판상형) 결정 수득량이 95%이상이다. 다른 금속염과는 달리 초원심분리기(Ultra Filter)및 R.O. 계(R.O. System)을 사용치 않고, 고분자 물질 및 기타 불순물을 제거하지 않아도 아미노산 Zn 염 형태로 용이하게 결정으로 석출되는 장점이 있다. Phe-Zn 염 화합물에서 L-페닐알라닌을 해리하기 위해서는 상기 Phe-Zn 염을 물에 현탁시켜 35% 염산을 첨가하여 산성으로 하면 Zn 이온과 L-페닐알라닌 이온으로 된다. 이 용액을 농축하면 두성분의 용해도 차이에 의하여 L-페닐알라닌은 결정으로 석출되고 Zn 염은 용액속에 용해 잔류하게 된다. 석출된 L-페닐알라닌의 결정은 여과 분리하고 모액은 pH를 조절하여 발효 상등액 탱크로 재순환 시킨다.

L-페닐알라닌 발효액을 균체 분리하여 상등액에 수용성 염을 L-페닐알라닌 과의 반응 당량 비율만큼 첨가하여 교반시킨다. 이 용액에 알칼리를 투입하여 pH 8.5 이상 상승시키면 L-페닐알라닌 Zn 염의 불용성 아미노산 금속염으로 형성되어 침전된다. Zn염으로서는 ZnCl₂, ZnSO₄, ZnOAC 등의 수용성 염 모두를 사용할 수 있으며, 알칼리로는 NaOH, KOH, NH₄OH 등의 알칼리를 사용할 수 있다. 이때의 L-페닐알라닌 Zn 염의 형성에는 pH 8.5-9.0이 적합하다. L-페닐알라닌 Zn 염을 물에 5% 현탁시켜 35% 염산을 서서히 투입하여 pH 4.0까지 조절하면 ZnCl₂와 L-페닐알라닌으로 용해한다. 이 용액을 증류 농축하면 두 성분의 용해도 차이에 의해서 L-페닐알라닌이 결정으로 석출된다. L-페닐알라닌의 결정은 여과하여 회수하고 분리된 모액은 pH를 조절하여 발효액으로 재순환시킨다. 상기의 구체적인 사항들을 요약하면 L-페닐알라닌 Zn 염 제조공정과 L-페닐알라닌 제조공정으로 구별된다. 본 실험에서 반응조건을 확립하기 위하여 Zn 염의 종류에 따른 L-페닐알라닌 Zn 염 생성효과와 pH 별 조건 및 L-페닐알라닌 생성효과를 산의 종류에 따라 실험한 결과는 다음과 같다.

[표 1]

L-페닐알라닌(LPA)발효액에 Zn 염 종류별 L-페닐알라닌 Zn 염 생성 효과

* L-페닐알라닌 발효액(2% w/v)에 Zn 염 종류별로 반응 당량 만큼 첨가하여 암모니아수로 pH 9.0조절(100ml씩)

[표 2] pH별 L-페닐알라닌 Zn 염 생성효과

* L-페닐알라닌 발효액(2% w/v)에 ZnCl₂반응 당량 만큼 첨가하여 다시 NH₄로 pH 별 조절(100ml씩)

* L-페닐알라닌 Zn 염(2% w/v)에 물에 현탁시켜 Acid 별로 pH 4.0조절(100ml씩)

L-페닐알라닌 Zn염에서 생성된 L-페닐알라닌은 워터스 HPLC를 사용하여 분석하였고 칼럼은 역상(Econosphere C₁₈) 5μ에서 유속은 1.0ml/min이고, 확인은, 254 U.V에서 완충용액은 0.13 KH₂PO₄+PicA25ml+아세토니트릴 50ml→PH 2.5 용액을 사용하였으며, 희석은 정제수(HPLC 용)으로 하였다. Zn 분석은 퍼킨 엘머 분광분석기(Perkin Elmer ∑-2 Atomic Absorption Spectrophotometer)로 분석하였다. 파장은 λ: 213.9nm에서 램프는 아연 홀로우 캐소드 램프 (Zinc.Hollow Cathod Lamp)를 사용하였고, 희석은 증류수로 하였다.

[실시예 1]

균체를 제거한 L-페닐알라닌 발효액(27g/ℓ, 0.16M) 1ℓ에 ZnCl₂(22.4g, 0.17M)을 넣고 교반하여 완전히 용해한 다음 암모니아수를 천천히 투입하여 pH 8.5로 조절하면 L-페닐알라닌 Zn 염이 결정으로 석출된다(결정wt, 35.4gr, 순도 99.4%). 상기 결정 슬러리를 여과, 건조 후 20g을 평량하여 물 400ml에 현탁시키고 35% 염산을 천천히 첨가하여 pH 4.0조절하면 슬러리는 완전히 용해된다. 이 용액을 증류, 농축하면 L-페닐알라닌의 결정으로 석출된다. 이 결정을 여과 수세후 건조하여 L-페닐알라닌(23.3g)을 얻었다.

[실시예 2]

균체를 제거한 L-페닐알라닌 발효액(27g/ℓ, 0.16M) 1ℓ에 ZnSO₄(26.5g, 0.17M)을 넣고 교반하여 완전히 용해한다. 그리고 암모니아수를 천천히 투입하여 pH 7.5까지 올리면 L-페닐알라닌 Zn 염이 석출된다(결정wt 32.4gr, 순도 99.2%). 상기 슬러리를 여과, 건조 후 10g을 평량하여 물 400ml에 현탁시키고 염산(35%)을 천천히 첨가하여 pH 5.0으로 조절하면 슬러리는 완전히 용해한다. 이 용액을 진공, 농축하면 L-페닐알라닌은 결정으로 석출된다. 실시예 1과 같은 방법으로 이 결정( L-페닐알라닌) 21.6g을 얻었다.

[실시예 3]

균체를 제거한 L-페닐알라닌 발효액(25g/ℓ, 0.15M) 1ℓ에 ZnOAC (28.5g, 0.16M)을 넣고 교반하여 완전히 용해한 다음 암모니아수를 천천히 투입하여 pH 8.0로 조절하면 L-페닐알라닌 Zn 염이 석출된다(결정wt 31.4gr , 순도 98.4%). 상기 결정 슬러리를 여과, 건조 후 10gr을 평량하여 물 200ml에 현탁시키고 35% 염산을 천천히 첨가하여 pH 4.0으로 조절하면 슬러리는 완전히 용해된다. 이 용액을 증류, 농축하면 L-페닐알라닌의 결정으로 석출된다. 이 결정은 여과 수세 후 건조하여(20.5g)을 얻었다.

[실시예 4]

균체를 제거한 L-페닐알라닌 발효액(23g/ℓ, 0.14M) 1ℓ에 ZnCl₂(19gr, 0.15M)을 투입하여 완전히 용해한다. 그리고 암모니아수를 천천히 투입하여 pH 9.0로 조절하면 L-페닐알라닌 Zn 염이 석출된다(결정wt 30.5gr, 순도 99.4%). 상기 결정 슬러리를 여과, 건조 후 20gr을 평량하여 물 1ℓ에 현탁시키고 인산(85%)를 천천히 첨가하여 pH 5.0으로 조절하면 슬러리는 완전히 용해된다. 이 용액을 진공, 농축하면 L-페닐알라닌의 결정으로 석출된다. 이 결정을 여과 수세 후 건조하여 L-페닐알라닌 결정(wt 20.4gr)을 얻었다.

Claims (6)

1. L-페닐알라닌 발효액에 Zn 염을 첨가하여 알카리를 투입하고 pH 7.0-9.0으로 조절하여 L-페닐알라닌 Zn 염을 석출시키는 방법.
2. L-페닐알라닌 Zn 염의 슬러리에 첨가하여 pH 4.0-7.0으로 조절하여 L-페닐알라닌을 회수하는 방법.
3. 상기 제 1 항에 있어 알카리로서 NH₄OH를 사용하는 방법.
4. 상기 제 1 항에 있어 Zn 염은 ZnCl₂, ZnSO₄, ZnOAC를 사용하는 방법.
5. 상기 제 1 항에 있어 L-페닐알라닌의 당량 만큼 Zn 염을 사용하는 방법.
6. 상기 제 2 항에 있어 산으로 HCl, H₂SO₄, H₃PO₄를 사용하는 방법.