KR910004366B1 - 젖산균 락토바실러스속 tsc-67 및 그의 제조방법 - Google Patents

젖산균 락토바실러스속 tsc-67 및 그의 제조방법 Download PDF

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Abstract

내용 없음.

Description

젖산균 락토바실러스속 TSC-67 및 그의 제조방법
본 발명은 산, 담즙, 위액, 항생제 등에 대해 우수한 내성을 나타내는 새로운 젖산균 및 그의 제조방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 돈분으로부터 분리 채취한 락토바실러스속(Lactobacillus spp.) TSC-67 및 그의 제조방법에 관한 것이다.
최근 내산성, 내담즙산성을 갖고, 미생물이 처할 수 있는 상황인 위액 및 여러종류의 항생제에 대한 내성을 지니며, 유해균을 억제하여 항생제, 항균제의 사용을 감소시킬 수 있는 젖산균의 개발이 산업계로부터 강력히 요구되고 있다.
종래에 이러한 목적으로 사용되어온 젖산균으로 스트렙토코커속(Streptococus spp.), 락토바실러스속(Lactobacillus spp.) 및 비피도박테리움속(Bifidobacterium spp.) 등이 알려져 있다.
그러나 본 발명자들은 이들 미생물에 대한 연구를 계속 해온결과, 전술한 바와 같이 산, 담즙, 항생제 및 위액에 대한 내성이 부족하여 실제 산업적으로 사용하기에는 부족한 점이 많다는 결론을 얻고, 여러가지 형태의 탐색을 실시한 바. 돈분으로부터 채취, 분리한 젖산균이 기존의 젖산균이 갖고 있지 않은 새로운 특성을 가지고 있다는 점을 발견하고 본 발명을 하기에 이르렀다.
본 발명은 산, 담즙, 위액, 항생제 등에 대하여 우수한 내성을 가지고 있으면서 인체에 유해한 미생물의 생육을 효과적으로 억제할 수 있는 새로운 젖산균 및 그 제조방법을 제공하는데 그 목적이 있다.
이하, 본 발명을 상세히 설명하면 다음과 같다.
본 발명은 내산성, 내담즙산성을 가지면서 위액 및 항생제에 대한 내성을 갖추고 있는 것을 특징으로 하는 락토바실러스속 TSC-67(수탁번호 : KCTC 8458 P)인 것이다.
본 발명에서 새로운 젖산균인 락토바실러스속 TSC-67은 돈분으로부터 분리 배양한 것이다.
이하, 본 발명을 더욱 상세히 설명하면 다음과 같다.
본 발명에 다른 신규 미생물인 락토바실러스속 TSC-67을 돈분으로부터 분리 배양한 젖산균의 일종으로서 1989년 4월 17일자로 한국과학기술원에 기탁(수탁번호 : KCTC 8458 P)한 것이다.
본 발명의 신균주인 락토바실러스속 TSC-67을 분리해내기 위해서 우선, 돈분 1g을 취하여 pH 2의 완충용액 9ml에 현탁하고, 100분간 진탕한후, 담즙 3%을 함유한 로고사(Rogosa) 한천 평판배지에 도말한다.
계속해서 이 배지를 37℃에서 2일간 배양하고, 그때 나타난 균총중, 각종의 항생제가 함유된 배지에서 내성을 보이며, 돼지의 위액중에서 100분간 처리하여 생존한 균주를 분리한다.
이와 같이 하여 분리 배양된 락토바실러스속 TSC-67의 미생물학적 특성을 기술하면 다음과 같다.
1) 균의 형태
로고사 한천 평판배지에서 37℃, 2일간 배양했을때 균의 형태
(1) 세포의 크기 : 0.8-1.0㎛
(2) 세포의 형상 : 막대형
(3) 운동성 : 없음
(4) 포자형성능 : 없음
(5) 그람염색 : 양성
2) 각 배지에서의 생육상태
(1) 로고사 한천배지에서 37℃, 2일간 배양했을때 균총의 형태
①형상 : 원형
②크기 : 0.3-0.8㎜(직경)
③융기 : 돌충
④색조 : 백색, 불투명
⑤표면 : 원활
⑥주변 : 원할
(2) 엠아르에스(MRS) 한천배지에서 37℃, 2일간 배양했을때 균총의 형태
①형상 : 원형
②크기 : 0.8-1.5㎜(직경)
③융기 : 돌출
④색조 : 엷은 황백색, 불투명
⑤표면 : 원활
⑥주변 : 원활
(3) 생리적 성질
①생육온도 : 생육범위 : 7-45℃
최적온도 : 30-37℃
②생육 pH : 생육범위 : pH 1.0-8.0
최적 pH : pH 4.5-7.0
③산소의 영향 : 통성혐기성, 호기조건에서도 생육하지만, 질소 및 이산화탄소 조건에서도 생육양호
3) 베타-칼라토시드분해효소 : +
4) 알기닌 탈이미노화효소 : -
5) 라이신 탈키르복실화효소 : -
6) 오르니틴 탈카르복실화효소 : -
7) 시몬스 사이트레이트이용성 : -
8) 황화수소(H2S)생성 : -
9) 우레아가수분해효소 : -
10) 트립토판 탈아미노화효소 : -
11) 인돌 생성 : -
12) 아세토인 생성 : +
13) 젤라틴 가수분해 : -
14) 포도당 : +
15) 만니톨 : +
16) 이노시톨 : -
17) 솔비톨 : -
18) 람노오스 : -
19) 슈크로오스 : +
20) 멜리비오스 : -
21) 아미그달린 : -
22) 아라비노오스 : +
23) 시토크롬 산화효소 : +
24) 이산화질소(NO2) 생성 : -
25) 질소 환원 : +
26) 카탈라아제 : -
27) 당으로부터 생성되는 젖산의 산광성 : L(+)형
28) 내산성 : pH 1.0에서 생육
29) 내담즙산성 : 4.5%에서 생육
30) 위액에 대한 내성 : pH 2.0의 위액에서도 생육
31) 항생제 내성
⑴ 린코마이신 : 내성
⑵ 타이로신 : 내성
⑶ 테라마이신 : 내성
⑷ 클로람페니콜 : 내성
⑸ 세팔로스포린 C : 내성
⑹ 에리트로마이신 : 내성
⑺ 바시트라신 : 내성
⑻ 네오마이신 : 내성
⑼ 가나마이신 : 내성
⑽ 켄타마이신 : 내성
⑾ 스펙티노마이신 : 내성
⑿ 설파메타진 :내성
⒀ 티오펩틴 : 내성
이상과 같은 락토바실러스속 TSC-67은 그람양성, 통성혐기성, 카탈라아제 음성의 간균이며, 또한 포도당으로부터 L(+)형의 젖산을 생성하고 기체를 생성하지 않으나, 글루콘산으로부터 기체를 생성하는 동종발효성 (homofermentative) 락토바실러스속의 젖산균인 것이다.
또한 본 발명의 신균주는 15℃에서도 생육할 수 있으므로 락토바실러스속중 스트렙토박테리움 아속으로 분류된다(Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, vol. 2., 1986).
스트렙토박테리움에 속하는 균종은 모두 13종이 있으며, 이중 L(+)형의 젖산을 생성하는 동종 발효형의 락토바실러스로는 5종이 있고, 본 발명의 신균주인 락토바실러스속 TSC-67과의 미생물학적 성지를 비교해보면 다음 표 1과 같다.(Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 8th ed. 1974).
[표 1]
Figure kpo00001
상기 표 1에서와 같이 본 발명에 따른 신균주 락토바실러스속 TSC-67은 미생물학적인 제반특성이 락토바실러스속의 스트렙토박테이움 아속중 5종의 균과는 다른점을 보여준다.
즉, 본 발명의 신균주가 나타내고 있는 성질중 셀로비오스와 만니톨로부터 산을 생성하는 점은 락토바실러스속중 크실로서스, 카세이알락토서스(casei ss alactosus), 카세이카세이(casei ss casei), 카세이 람노서스(casei ss rhamnosus) 등의 4종과 같으나, 아미그달린(Amygdalin), 아라비노오스(Arabinose), 락토오스 이용성에서 상기 4종과는 다른점을 보여준다.
또한, 당이용성에서 가장 근사한 현상을 보이는 락토바실러스 카세이 알락토서스와 비교할때 락토바실러스속 TSC-67은 형태적으로 만곡형의 긴 막대균으로, 휘어짐이 거의 없고 짧은 막대균의 형태를 갖는 락토바실러스 카세이 람노서스 KCTC 1046 보다는 긴 막대균 형태의 락토바실러스 카세이 알락토서스 KCTC 3165에 더 비슷한 형태를 갖는다. 그러나 락토바실러스속 TSC-67은 45℃이상에서 생육이 가능하고, 락토바실러스 카세이 알락토서스 KCTC 3165보다 세포의 길이가 약간 짧다.
이상의 이유에서 본 발명의 신균주는 기존의 균주와는 다른 새로운 형태의 젖산균임을 알 수 있다.
본 발명에 의한 락토바실러스속 TSC-67은 엠아르에스 및 로고사 배지에서 양호하게 생육하며, 액체배지에서 7℃, 6일만에 생육 정지기에 도달한다.
또한 본균은 pH 1.0의 산성 및 담즙산 4.5%를 함유한 배지에서도 생육이 가능하다. 더우기 pH 2.0의 위액에서도 생육이 가능하며, 린코마이신, 타일로신등 여러가지 항생제에 대해 내성을 가진다.
이와 같이 본 발명에 따른 젖산균인 락토바실러스속 TSC-67의 균체나 그 농축물, 또는 건조물은 약물학적제제나 식품첨가제제 또는 동물사료첨가제로서 제품에 사용할 수가 있다.
본 발명 젖산균에 대해 실시예를 통해 상세히 설명하면 다음과 같다.
[실시예 1]
-배양예
프로테오스펩톤 10g, 우육추출물 10g, 효모추출물 5g, 포도당 20g, 올레인산 솔비탄 1g, 구연산암모늄 2g, 초산소다 5g, 황산마그네슘 및 황산망간 미량, 인산 2소다 2g 및 증류수 1ℓ정도되는 배지(pH 6.5)를 121℃, 15분간 멸균하였다.
이 배지를 30℃로 냉각 후 동일조성의 배지에서 미리 30℃, 24시간 배양해둔 락토바실러스속 TSC-67의 종배양액 50ml를 전술한 배지 11에 접종하여 30℃, 100rpm, 1.0vvm으로 48시간 배양하였다. 배양종료시 생균수는 2.0×1010/ml이었다.
배양종료후 배양액을 한외여과하여 집균하고, 멸균 생리식염수에 현탁하여 다시 한외여과하여 집균하였다. 구해진 균체 농축물을 탈지분유 15%(w/v), 글루탐산 소다 1% 용액(미리 121℃, 10분간 멸균)에 재현탁하여 진공 동결건조하였다. 진공건조 분말중 본균은 5.0×1012/g이 함유되어 있었다.
[실시예 2]
-내산성 실험
pH과 각 3.0, 2.5, 1.5, 1.0인 완충용액에 실시예 1에서 얻어진 균주를 접종한후, 37℃에서 진탕배양하면서 경시적으로 배양액을 일정량 취하여, 121℃, 15분간 멸균한 0.1%(w/v)펩톤수에 일정비율로 희석하였다.
트립토스 10g, 효모추출물 5g, 포도당 10g, 아라비노오스 5g, 슈크로오스 5g, 초산소다 15g, 구연산암모늄 2g, 인산 1칼륨 6g, 황산마그네슘, 황산망간 및 황산철미량, 올레인산 솔비탄 1g, 한천 5g 및 2차 증류수 11을 100℃에서 2-3분간 가열하여 조제한 배지에 상기의 희석액을 일정량 도말한후 37℃에서 2일간 배양후 나타나는 균총을 세었다. 그 결과는 다음과 같다.
Figure kpo00002
[실시예 3]
-내담즙산성
트립토스 10g, 효모추출물 5g, 포도당 10g, 아라비노오스 5g, 사카로오스 5g, 초산소다 15g, 구연산암모늄 2g, 인산 1카륨 6g, 올레인산 솔비탄 1g과 황산마그네슘, 황산망간, 황산철 미량, 한천 15g 및 2차 증류수 11을 함유한 배지에 옥스갈(Bacto Oxgall, Difco Co.소담즙산의 10배 농축분말)을 각각 0.4, 0.45, 0.5%(w/v)되게 첨가하고 100℃, 2-3분간 가열하여 조제한 배지에 백금이를 사용하여 본균을 접종한후, 37℃에서 2일간 배양하며 생육상태를 관찰한 결과 0.45% 옥스갈 함유배지에서도 생육을 볼 수 있었으며, 이 결과는 담즙산 4.5%에 해당하는 것이다.
[실시예 4]
- 유해균 억제력
실시예 2와 동일한 배지를 만들고, 멸균후 45℃로 냉각하여 본균주를 1.5%(v/v) 접종하였다. 분주후 냉각한 배지에 활력이 왕성한 대장균, 살모넬라 및 포도상구균을 접종하여 37℃에서 24시간 배양하면서 대장균, 살모넬라, 포도상구균의 상태를 관찰한 결과, 모두 생육이 억제되고 있음을 볼 수 있었다.
[실시예 5]
-위액에 대한 내성
사료 급여 3-4시간후 도살한 돼지에서 즉시 채취한 위내용물을 여과하여 고형분을 제거하고, 1N 염산으로 pH 2.0으로 조절하였다. 제균막을 통하여 멸균한후 상기으 돼지위액 27ml를 무균적으로 넣고 유리섬유 여과기를 통하여 질소를 불어넣어 완전 혐기상태를 만들어 준후, 회전식교반기를 적당한 속도로 회전시켰다.
한편 항온 온수순환기를 이용하여 37℃의 온수를 순환시켜 위액의 온도가 항상 37℃로 유지되도록 하였다.
그 후 총균수 2.0×1010이 되는 락토바실러스속(Lactobacillus spp.) TSC-67의 배양액 3ml을 미리 화염살균한 시료채취기를 통하여 접종하여, 본균이 2.0 S109/ml가 되도록 하여주고, 다시 시료채취기를 통하여 경시적으로 시료를 채취하여 생균수를 측정하였다.
그 결과는 다음과 같다.
Figure kpo00003
[실시예 6]
-항생제 내성
별도로 멸균한 타일로신 주석산염(Tylosin tartarate Sigma Co.)을 각각 100, 50, 25, 12.5, 6.25, 3.125, 1.56, 0.78㎍/ml가 되도록 첨가한 로고사 한천 평판배지에 본균을 백금이를 사용하여 접종한후, 37℃에서 2일간 배양하여 생육상태를 관찰한 결과, 본균은 타일로신 주석산염이 100㎍/ml로 함유된 배지에서도 생육함을 볼 수 있었다.
[실시예 7]
-항생제 내성
상기 실시예 6과 동일한 방법으로 여러가지 항생제에 대한 실험을 하였으며, 그 결과는 다음과 같다.
Figure kpo00004

Claims (5)

  1. 내산성, 내담즙산성을 가지면서 위액 및 항생제에 대한 내성을 지니고 있는 것을 특징으로 하는 락토바실러스(Lactobacillus spp.) TSC-67(수탁번호 : KCTC 8458 P)
  2. 제 1 항에 있어서, 락토바실러스속 TSC-67은 돈분으로부터 분리된 것임을 특징으로 하는 것.
  3. 제 1 항에 있어서, 락토바실러스속 TSC-67은 다음 (1) 내지 (15)의 특성을 갖는 것. (1) 그람(Gram)양성, (2) 무포자형성, (3) 간균, (4) 운동성없음, (5) 통성혐기성, (6) 카탈라아제(catalase) : 음성, (7) 포도당으로부터 기체생성 : 양성, (8) 글루콘산으로부터 기체생성 : 음성, (9) 생육온도범위 : 7-45℃, (10) 당으로부터 생성되는 젖산의 선광성 : L(+)형, (11) 당으로부터 산생성 : 포도당, 만니톨, 슈크로오스, 아라비노오스, 셀로비오스, 갈락토오스, 락토오스, 말토오스, 리보오스, 에스큘린애 양성, (12) 내산성 : pH1.0에서 생육, (13) 내담즙산성 : 5%에서 생육, (14) 위액에 대한 내성 :pH 2로 조절한 돼지위액에서 100분 이상 생육, (15) 항생제 내성 : 린코마이신, 타일로신, 테라마인신, 에리트로마이신, 클로람페니콜, 페니실린, 세팔로스포린, 바시트라신, 네오마이신, 가나마이신, 겐타마이신, 스펙티노마이신, 설파메타진, 티오펩틴, 하이그로마이신에 내성.
  4. 젖산균 락토바실러스속 TSC-67(수탁번호 : KCTC 8458 P)의 균제나 그 농축물 또는 건조물을 함유하고 있는 것을 특징으로 하는 약물학적제제나 식품 첨가제 또는 동물사료첨가제.
  5. 프로테오스펩톤, 우육추출물, 효모추출물, 포도당, 올레인산 솔비탄, 구연산 암모늄, 추산소사 황산마그네슘, 황산망간, 인산 2소다와 2차증류수로 이루어진 30℃의 배지에다 미리 돈분으로부터 분리하여 30℃, 24시간 배양한 락토바실러스속 TSC-67(수탁번호 : KCTC 8458 P)의 종배양액을 접종하고, 이를 30℃, 100rpm, 1.0vvm으로 48시간 배양한 다음, 배양액을 한외여과하여 집균한 균체농축물을 탈지분유와 글루탐산소다용액에 재현탁하여 진공동결건조하는 것을 특징으로 하는 락토바실러스속 TSC-67의 제조방법.
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