KR910004120B1 - 고중합 항체-효소결합체의 제조방법 - Google Patents
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Abstract
내용 없음.
Description
제 1 도는 본 발명의 실시예 1의 결합체와 종래방법에 의한 결합체와의 분자량을 비교한 것이다.
제 2 도는 본 발명의 실시예 1의 결합체와 종래방법에 의한 결합체의 효소면역 측정치의 증폭효과를 비교한 것이다.
제 3 도는 본 발명의 실시예 2의 결합체가 분자량이 큰것임을 보여주는 FPLC Superose 6HR 16/50겔 여과용출 패턴이다.
제 4 도는 본 발명 실시예 2의 결합체가 종래방법에 의한 결합체보다 측정치 증폭효과가 큰것임을 보여주는 것이다.
제 5 도는 본 발명 실시예 3의 결합체가 분자량이 큰것임을 보여주는 FPLC Superose 6HR 16/50겔 여과용출 패턴이다.
제 6 도는 본 발명 실시예 3의 결합체가 종래방법에 의한 결합체보다 측정치 증폭효과가 큰것임을 보여주는 것이다.
제 7 도는 본 발명 결합체가 측정치의 증폭효과에서 큰차이를 보이게 되는 이유를 설명하는 것이다.
본 발명은 효소면역 측정법에서 사용하는 정량하고자 하는 특정 물질과 특이적으로 결합하는 항체에 효소를, S-아세틸티오 아세트산(SATA)을 이용하여 화학적으로 결합시킨 결합체의 제조방법에 관한 것으로, 좀더 구체적으로는 알칼라인 포스파타제(Alkaline Phosphatase, Scripps cat # A0424, A0625)를 효소로 사용하고 결합에 사용되는 화합물로는 SATA를 사용하여 평균분자량이 큰 결합체를 제조하는 방법에 관한 것이다.
이와같은 SATA를 이용하여 결합체를 제조하는 종래방법으로는 퍼옥시다제를 효소로 사용하여 기존의 반응조건에서 평균분자량이 작은 결합체를 얻는 알·줄리앙, 에스·던컨, 피터디·웨스톤 및 로저 팅글워스 등에 의한 Anal. Biochem.(1983) 132, 68-73에 기재된 방법이 있다.
그러나 퍼옥시다제는 본 발명에서 사용한 알칼라인 포스파타제에 비해 유리아민기가 적어 S-아세틸티오아세트산(이하 SATA라 약칭한다)으로 활성화 시킬경우, 활성화되는 정도가 알칼라인 포스파타제보다 떨어지는 단점을 발견하고 이를 본 발명자등이 연구, 검토하므로써 본 발명을 완성하게 되었다.
일반적으로 SATA는 효소나 항체등과 같은 모든 단백질의 유리 아민기와 반응하는 것으로 그 반응을 보면 아래와 같다.
이 SATA는 효소에 존재하는 모든 유리아민기와 반응을 할 수 있으므로 1개의 효소당 SATA가 1개이상 반응을 하는 것이 일반적이나 본 발명에서는 효소 1개당 4개이상의 SATA가 반응한다.
[HS-기의 정량은 Ellman's reagent를 사용함(Ellman, G. L.(1959) Arch. Biochem. Biophys. 82, 70-77)].
한편, 항체는 석시니미딜 4-(P-말레이미도페닐)부티레이트(이하 SMPB라 약칭한다.)와 아래와 같은 반응을 한다.
상술한 SMPB는 항체에 존재하는 모든 유기아민기와 반응할 수 있으므로 항체 1개당 1개이상의 SMPB가 반응하는 것이 일반적이나 본 발명에서는 항체 1개당 4개이상의 SMPB가 반응한다.
따라서 SMPB로 처리한 항체를 SATA로 처리한 효소와 혼합을 하면 다음과 같은 항체-효소 결합체가 형성된다.
본 발명이 종래의 방법보다 고중합의 결합체를 얻을 수 있는것은 본 발명에서 효소로 사용한 알칼라인 포스파타제가 종래방법에서 효소로 사용한 퍼옥시다제보다 유리아민기가 많아 상술한 SATA와의 반응시 알칼라인 포스파타제가 퍼옥시다제보다 반응성이 높기 때문이고, SATA는 두 종류의 단백질(즉 효소와 항체)를 결합시키는데 필요한 중간연결체로 작용하므로 SATA와 단백질과의 반응비를 높임으로써 이 SATA가 많이 반응하여 단백질이 많이 결합되어 있을수록 항체와 반응시켰을때 고중합의 결합체를 얻을 수 있기 때문이다.
즉, 퍼옥시다제는 SATA가 적게 반응하므로 최종적으로 항체와 반응시켰을때 저중합의 결합체가 얻어지기 쉬우며, 알칼라인 포스파타제는 SATA가 많이 반응하므로 최종적인 항체와의 반응시 고중합의 결합체가 쉽게 얻어질 수 있는 것이다.
한편, SATA가 반응하는 정도에 영향을 미치는 요소로 효소의 차이 이외에 효소의 농도, 효소와 SATA와의 몰반응비, 반응온도, 반응시간등이 있는데 효소의 농도, 반응온도, 반응시간등은 결합체를 제조함에 있어서 효소농축의 한계, 효소활성도를 유지하는 온도의 한계, 적절한 제조시간등의 제한조건에 의하여 극단적으로 변화시킬 수 없는 요소이다.
그러므로 SATA가 반응하는 정도는 효소와 SATA와의 몰반응비로 효과적으로 조절할 수 있다. 종래의 방법의 몰반응비로는(1몰 IgG에 4몰 SMPB반응, 1몰 APase에 1몰 SATA반응) 알칼라인 포스파타제와 항체의 저중합 중합체가 얻어지며 본 발명에서 상술한 몰반응비로 반응시키면 고중합의 항체-효소 결합체가 얻어진다.
이러한 저중합의 항체-효소 결합체와 고중합의 항체-효소 결합체는 효소 면역측정법을 행할경우, 측정치의 증폭효과에서 큰 차이를 보이게 된다.
효소면의 측정법에서는 특정항원의 양을 측정하기 위해 2가지의 항체(1차 항체와 2차항체라 부름)가 필요한데 1차 항체로는 그 특정항원을 항원-항체반응으로 고정화를 행한다음(제 7 도의 a), 2차 항체로는 2차 항체와 효소를 결합시킨 결합체를 사용한다(제 7 도의 b):
이 항체-효소 결합체는 전술한 바와같이 저중합과 고중합의 결합체가 있을수 있는데(제 7 도의 c) 각각은 제 7 도의 d에 도시된 바와같이 고중합 결합체가 저중합 결합체보다 측정치의 증폭효과가 더욱 크게 나타난다.
상술한 바와같이 퍼옥시다제로는 고중합 결합체를 용이하게 얻을 수 없으나 본 발명에서는 알칼라인 포스파타제를 사용하고 SATA와의 반응비를 높임으로써 고중합 결합체를 얻을 수 있으므로 이와같이 고중합 결합체를 효소면역측정시 사용할 경우에는 저중합 결합체보다 효소반응에 의한 측정치의 증폭효과가 크게 나타나 측정에 보다 유리한 점을 제공할 수 있는 것이다.
본 발명의 항체-효소 결합체는 인산나트륨 완충용액하에서 정제된 항체와 SMPB를 몰농도비 약 1 : 10-1 : 30으로 반응시켜 활성화된 항체를 얻은다음, 인산나트륨 완충용액하에서 정재된 효소와 SATA를 몰농도비 약 1 : 10-1 : 100으로 반응시켜 얻은 활성화된 효소를 몰농도비 약 1 : 2의 비율로 상온에서 2시간 반응시켜 제조한 것으로 다음의 실시예는 본 발명을 좀더 구체적으로 설명하는 것이다.
[실시예 1]
임신진단 및 특별부류의 암을 진단하는데는 사람 코리오닉 고나 도트로핀 호르몬(human Chorionic Gonadotropin, 이하 hCG라 한다)양의 측정 및 모니터가 필요하므로 이 hCG에 대한 항체(이하 K16이라 한다)를 아미콘 농축기(Amicon ultrafil-teration)로 약 7mg/ml의 농도로 만든 후 약 2ml을 투석막에 넣고 인산나트륨 완충용액(0.1M. PH7.0)으로 밤새 투석하였다.
투석후 280nm에서 흡광도를 측정하여 K16의 농도를 5mg/ml로 하고(1mg/ml K16농도일때 A280nm=1, 4) 상기 K16용액 2ml을 반응용기(pierce사 reaction vial)안에 넣었다. SMPB를 아세톤에 녹여 K16용액에 최종 631pM의 농도가 되도록 저어주면서 투입하면 SMPB에 의한 K16의 활성화가 이루어진다. 온도는 상온이다. 30분간이 끝난후 세파덱스 G-25컬럼(1×20cm)에 넣고 반응하지 않은 SMPB를 활성화된 K16으로부터 제거한다.
이렇게 얻어진 K16은 4℃에 일단 보관한다(K16*로 표시) 알칼라인 스파타제(Scripps사, 이하 Apase라 한다)를 약 10mg/ml 농도로 약 1ml를 취하여 투석막에 넣고 인산나트륨 완충용액(0.1m, pH7.0)으로 밤새 투석한후 280nm에서 흡광도를 측정하여 APase의 농도를 5mg/ml로 만든다(1mg/ml APase 농도일때 A280nm=0.99).
상기 Apase 용액 2ml을 반응용기(Pierce사 reactionvial)안에 넣고, 한편으로는 SATA 1.47mg을 아세톤 20ml에 용해하여 SATA 용액을 만든후, 이것을 헤밀톤 주사기로 반응용기내의 APase 용액에 저어주면서 투입하여 APase와 반응토록 한다. 30분후 세파덱스 G-25컬럼(1×20cm)를 사용하여 미반응 SATA를 활성화된 APase로부터 분리 제거한다. 이렇게 얻어진 활성화된 APase는 따로 약 50ml의 유리용기에 담아 4℃에서 일단 보관한다(APase*로 표시).
수산화아민 용액(0.5M)을 상기 APase 용액 1/10의 비율로 넣은 후 잘 섞어주면서 상온에서 1시간 반응시킨다. 이 반응에서, 활성화된 APase로부터 수소황기(sulfhyldryl)가 노출된다(APase* *로 표시)
반응후 앞서 준비 보관한 K16*와 APase**를 섞어주면 K16*의 말레이미드기가 APase**의 수소황기(sulfhydryl)와 반응하여 결합이 이루어져 K16*-APase**의 결합체가 만들어진다. 결합반응은 상온에서 2시간 이루어지도록 한 다음 4℃로 옮겨 밤새 보관한다.
결합반응을 중지시키기 위해 요오드아세트아마이드(0.1M) 용액을 준비하여 결합체용액에 최종 1mM 농도가 되도록 넣어준 후 상온에서 30분간 반응시켜 K16*-APase**결합체를 제조하였다.
제 1 도는 종래의 방법(Anal. Biochem(1983) 132, 68-73, 점선)으로 제조한 결합체의 분자량과 본 실시예(실선)에 의해 제조된 결합체의 분자량을 FPLC Superose 6HR 16/50겔 여과 칼럼에 의해 비교해본 것으로 본 실시예에 의해 제조된 결합체가 종래방법의 결합체보다 먼저 용출됨을 보아 평균자량이 더 큰것임을 알 수 있었다.
제 2 도는 종래의 방법에 의한 결합체와 본 실시예에 의한 결합체의 측정치 증폭 효과를 비교한 것이다. 측정방법은 비드 타입의 효소면의 측정법(bead-type Enzyme Immuno Assay)를 사용하여 hCG 농도 0,25,200mIU/ml의 3가지 농도에서 중복 실험하였다.
실험을 한 결과, 종래방법에 의한 결합체나 본 실시예에 의한 결합체 모두가 측정하고자하는 hCG 농도에 비례하여 측정치가 증대됨을 알수 있었다. 양자간의 차이점은 본 실시예에 의한 결합체의 hCG농도 비례하여 증가하는 측정치가, 종래방법에 의한 결합체의 측정치보다 약 2배높다는 것이다. 따라서 본 실시예에 이한 결합체를 사용함으로써 hCG에 대한 검출한계(detectability)와 민감도(sensitivity)를 약 2배 정도 향상시킬 수 있었다.
[실시예 2]
소화기암을 진단하거나 모니터하는데는 카시노엠브리오닉 항원(Carcinoembryonic antigen)의 양을 측정하여야하므로 이 카시노 엠브리오닉 항원에 대한 항체(α31)와 APase를 K16-APase 경우와 동일한 방법으로 반응시켜 고중합의 결합체를 얻었다.
제 3 도는 본 실시예에 의해 제조된 α31-APase 결합체가 고중합의 결합체임을 보여주는 FPLC Superose 6HR 16/50겔 여과 칼럼용출 패턴이다.
제 4 도는 본 실시예에 의해 얻어진 고중합의 결합체가 종래 방법에 의한 결합체보다 측정치 증폭 효과가 큼을 보여주는 결과이다.
측정방법으로는 비드타입의 효소면의 측정법(bead-type Enzyme-Immuno Assay)를 사용하였다. CEA농도는 0, 4, 10, 30, 60ng/ml의 5가지 농도에서 중복 실험하였다.
[실시예 3]
간의 이상을 진단하는데는 α-페토프로테인에 측정 및 모니터가 필요하므로, α-페토프로테인에 대한 항체(F-14)와 APase 결합체를 실시예 1에 설명한 동일 방법으로 제조하였다.
제 5 도는 본 실시예에 의해 제조된 F14-APase 결합체가, 고중합의 결합체임을 보여주는 FPLC Superose 6HR 16/50겔 여과 칼럼용출 패턴이다.
제 6 도는 본 실시예에 의해 얻어진 고중합의 F14-APase 결합체가 종래 방법에 의한 결합체보다 측정치 증폭 효과가 큰것을 보여주는 결과이다. 측정방법으로는 비드 타입의 효소 면역 측정법(bead-type Enzyme-Immuno Assay)을 사용하였다. AFP의 농도는 0, 25, 100, 250, 500ng/ml의 5가지 농도에서 중복실험하였다.
Claims (3)
- 석시니미딜-4-(p-말레이미도페닐)부티레이트로 활성화시킨 사람코리오닉 고나도트로핀호르몬, 카시노엠브리오닉항원 및 α-페토프로테인의 항체를 S-아세틸티오아세트산으로 활성화시킨 알칼라인 포스파타제와 반응시킴을 특징으로 하는 고중합 항체-효소 결합체의 제조방법.
- 제 1 항에 있어서, 활성화된 항체와 활성화된 효소의 반응비율은 몰농도로 1 : 2로 함을 특징으로 하는 방법.
- 제 1 항에 있어서, 항체와 석시니미딜-4-(p-말레이미도페닐)부티레이트의 반응비율은 몰농도로 1 : 10-1 : 30이고 효소와 S-아세틸티오아세트산의 반응비율은 몰농도로 1 : 10-1 : 100임을 특징으로 하는 방법.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1019880018205A KR910004120B1 (ko) | 1988-12-31 | 1988-12-31 | 고중합 항체-효소결합체의 제조방법 |
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|---|---|---|---|
| KR1019880018205A KR910004120B1 (ko) | 1988-12-31 | 1988-12-31 | 고중합 항체-효소결합체의 제조방법 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR900009094A KR900009094A (ko) | 1990-07-02 |
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|---|---|---|---|
| KR1019880018205A KR910004120B1 (ko) | 1988-12-31 | 1988-12-31 | 고중합 항체-효소결합체의 제조방법 |
Country Status (1)
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|---|---|
| KR (1) | KR910004120B1 (ko) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2695405A1 (fr) * | 1992-09-04 | 1994-03-11 | Becton Dickinson Co | Procédé de préparation de conjugués facteur intrinsèque-peroxydase de raifort. |
-
1988
- 1988-12-31 KR KR1019880018205A patent/KR910004120B1/ko not_active IP Right Cessation
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2695405A1 (fr) * | 1992-09-04 | 1994-03-11 | Becton Dickinson Co | Procédé de préparation de conjugués facteur intrinsèque-peroxydase de raifort. |
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| Publication number | Publication date |
|---|---|
| KR900009094A (ko) | 1990-07-02 |
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