KR910004101B1 - 바이러스-특이성 유전적 조절하에서 지시인자 유전자 산물을 발현하는 안정한 포유동물 세포주 - Google Patents

바이러스-특이성 유전적 조절하에서 지시인자 유전자 산물을 발현하는 안정한 포유동물 세포주 Download PDF

Info

Publication number
KR910004101B1
KR910004101B1 KR1019880005719A KR880005719A KR910004101B1 KR 910004101 B1 KR910004101 B1 KR 910004101B1 KR 1019880005719 A KR1019880005719 A KR 1019880005719A KR 880005719 A KR880005719 A KR 880005719A KR 910004101 B1 KR910004101 B1 KR 910004101B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
cell line
protein
tat
galactosidase
hiv
Prior art date
Application number
KR1019880005719A
Other languages
English (en)
Other versions
KR880014097A (ko
Inventor
퀸 퍼구슨 블레어
테리 배첼러 리
로버트 페터웨이 스테펜
하워드 뉴바우어 러쎌
Original Assignee
이.아이.듀퐁 드 네모아 앤드 캄파니
도날드 에이.호스
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 이.아이.듀퐁 드 네모아 앤드 캄파니, 도날드 에이.호스 filed Critical 이.아이.듀퐁 드 네모아 앤드 캄파니
Publication of KR880014097A publication Critical patent/KR880014097A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR910004101B1 publication Critical patent/KR910004101B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/54—Interleukins [IL]
    • C07K14/55—IL-2
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
    • C12N2740/16311—Human Immunodeficiency Virus, HIV concerning HIV regulatory proteins
    • C12N2740/16322—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Abstract

내용 없음.

Description

바이러스-특이성 유전적 조절하에서 지시인자 유전자 산물을 발현하는 안정한 포유동물 세포주
제 1 도는 HIV tat 유전자 산물에 의한 HIV LTR의 전사-활성화를 설명하기 위해 사용된 시스템의 개략도이다.
제 2 도는 일시적 발현 분석을 통하여, 얻은 결과로서, HIV LTR에 연결된 표시인자 유전자의 발현이 HIV tat-의존적으로 유도됨을 밝혀주는 도표이다.
제 3 도는 상이한 여러 종의 세포 종류를 대상으로한 일시적 발현 분석을 통하여 얻은 결과로서, pLTR-cat로부터 CAT의 발현이 HIV tat-의존적으로 유도됨을 밝혀주는 도표이다.
제 4 도는 HIV LTR 및 HIV tat 유전자 산물의 조절하에서 작동성으로 분비되는 IL 2를 발현하는 안정된 사람 세포주가 유도되었음을 밝혀주는 도표이다.
제 5 도는 HIV LTR 및 HIV tat 유전자 산물의 조절하에서 작동성 β-갈락토시다제를 발현하는 안정된 Hela세포주가 유도되었음을 밝혀주는 도표이다.
제 6 도는 12-8세포의 성장 및 β-갈락토시다제 발현에 미치는 마이토마이신-C의 효과를 나타낸 그래프이다.
본 발명은 바이러스-특이적(HIV-특이적)조절 DNA서열(예 : HIV LTR) 및 조절 단백질(예 : HIV tat 유전자 산물)의 유전적 조절하에서 용이하게 분석할 수 있는 지시 인자 단백질(예 : 이.콜라이 β-갈락토시다제)을 특이적으로 발현하는 안정된 포유동물 세포주를 유전공학적으로 유도하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 특정 부류의 항-바이러스(항-HIV)성 치료 화합물을 효율적으로 선별하는 시스템을 제공한다.
사람의 면역결핍 바이러스-1(HIV-I, 또한 LVA, HTLV-III 또는 ARV)은 후천성 면역 결핍증(AIDS)의 주요 병원체이다[참조 ; Barre-Sinoussi et al., Science 220 ; 868-871(1983) ; Gallo et al., Science 224 : 500-503(1984) ; Levy et al., Science 225 : 840-842(1984)].
HIV의 게놈은 바이러스 주(major)구조 단백질을 암호화 하는 gag.pol 및 env 유전자외에도, 추가의 바이러스 단백질을 암호화하는 sor, tat, art/trs 및 3'-orf로 지정된 몇몇의 또다른 개방 판독 프레임을 함유한다. 이들 단백질은 HIV 감염 주기동안 중요한 조절기능의 역할을 하는 것으로 알려져 있다.
본 명세서에서 사용되는 "유전자"라는 용어는 특정 단백질 생성물의 발현을 특정화하는 DNA 서열 정보를 내포한다.
처음으로 하젤틴, 봉-스탈(Haseltine and Wong-Staal) 및 그의 동료들은 중요한 조절 단백질의 하나인 tat 유전자의 단백질이 HIV LTR프로모터 영역에 연결된 유전자 서열의 발현의 활성을 촉진하는 것으로 보고하였다[참조 ; Sodroski et al., Science 227 ; 227-173(1985) ; Arya et al., Science 229 : 69-73(1985) : Sodroski et al., Science 229 : 74-77(1985)]. tat 단백질에 의한 유전자 발현의 양성적 조절은 전사-활성화(Trans-activation)로 알려진 현상의 한 예이다. 전사-활성화란 특정 조절 단백질에 의해 특정 표적 유전자의 발현이 양성적으로 조절되는 것이다.
양성적으로 작용하는 조절 단백질 및 이에 해당하는 반응성 표적 유전자는 수많은 바이러스 뿐만 아니라 원핵 및 진핵 세포 시스템 모두에 공지되어 있다. 예를 들어, HIV경우에서와 같이, 많은 또다른 동물 바이러스는 전사-활성인자 단백질을 암호화하며, 이것은 바이러스 유전자의 발현을 양성적으로 조절하는 것으로 알려져 있다. 상기 바이러스에는 헤르페스 바이러스(예 ; 헤르페스 심플렉스 바이러스, 사이토메갈로 바이러스), 아데노 바이러스, 파포바 바이러스(예 ; SV40, 폴리오마 바이러스, JC 바이러스), 백혈병 레트로 바이러스(예 ; 소의 백혈병 바이러스, HTLV-1, HTLV-II) 및 이외의 렌티 바이러스(예 ; 비스나 바이러스, 말 전염성 빈혈 바이러스, 원숭이의 면역결핍 바이러스)가 포함된다. 양성-작용성 조절 단백질 이외에도, 세포내인성 및 바이러스 음성-작용성 조절 단백질은 특정 표적 유전자의 발현을 음성적으로 조절, 즉 억제할 수 있는 것으로 밝혀졌다.
tat에 의한 전사-활성화에 대해 반응성을 지닌 HIV LTR내의 서열정보는 뉴클레오타이드-17과 +58(이 번호는 전사 출발점을 기준으로 한다)사이에 위치한다[참조 ; Rosen et al., Cell 41 ; 813-823(1985) ; Muesing et al., Cell 48 : 691-701(1987)]. 이러한 전사-활성화 표적 서열은 tat 단백질에 의해 직접적으로 인식될 수 있다.
tat에 대한 LTR-연결된 서열의 발현 활성화에는 mRNA축적의 증가[참조 ; Cullen, Cell' 46 : 973-982(1986) ; Gendelman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 83: 9759-9763(1986) ; Wright et al., Science 234 : 988-934(1986) ; Peterlin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 83 : 9734-9738(1986) ; Muesing et al., Cell 48 : 691-701(1987)] 및 가능하게는 전사-후 조절[참조 ; Rosen et al., Nature 319 : 555-559(1986) ; Cullen, Cell 46 : 973-982(1986) : Feinberg et al., Cell 46 : 807-817(1986)]이 포함된다.
기능적인 HIV tat를 발현시키는 통합된 이종(Heterologous) 유전자[참조 ; Rosen et al., J. Virol. 57 : 379-384(1986) ; Cullen, Cell 46 : 973-982(1986)] 또는 HIV LTR에 연결된 클로람페니콜 아세틸 트랜스퍼라제(CAT)를 함유하는 유전자[참조 ; Wright et al., Science 234 : 988-992(1986)]를 함유하는 안정한 사람 세포주의 유도방법은 이미 보고된 바 있다. 라이트(Wright et al.)등은 또한 통합된 LTR-cat 유전자가 일시적으로 삽입된 tat-발현 유전자에 의해 유도될 수 있음을 밝혀냈다. 그러나, tat-발현 유전자 및 LTR-연결된 지시인자 유전자 모두를 함유하는 안정한 사람 세포주의 유도를 기술한 보고는 아직 없었다.
tat 유전자 산물은 HIV 복제에 필수적인 것으로 알려져 있다[참조 ; Dayton et al., Cell 44 : 941-947(1986) ; Fisher et al., Nature 320 : 367-371(1986)]. tat 유전자 산물이 유전자 발현을 유도하는 분자적 기작을 분석하는 것은 상당히 흥미로운 일이다. tat는 HIV생활주기에 대해 필수적이고 바이러스-특이적인 성분이므로 tat 기능에 대한 특이적 억제제는 황-HIV 바이러스 치료제로 사용될 수 있다. 본 발명은 HIV tat 기능을 특이적으로 억제하는 화합물을 신속하게 선별하고 동정할 수 있는 시스템을 제공한다. 바이러스만을 선택적으로 공격하면서 이의 포유동물 숙주에는 해를 끼치지 않는 화합물을 동정하는 능력은 효과적인 비독성 항-바이러스성 약제에 대한 가능성을 제시한다.
HIV 억제제의 동정을 위한 본 발명의 시스템은 중요하게도 감염성 HIV를 사용하지 않는 간단한 반-자동 비방사성 분석을 제공한다. 무엇보다도, 여기에서 설명된 HIV에 대한 실험적 잇점 및 선별방법은 유전자 발현에 대한 또다른 특이적 양성-작용성 또는 음성-작용성 조절인자의 억제제를 동정하기 위한 다른 바이러스 및 포유동물 세포시스템에 적용될 수 있다. 그러므로 여기에서 기술된 시스템은 항-바이러스 치료제에 한정되는 것이 아니며, 다른 질환에 대한 치료제의 동정에도 사용할 수 있다.
본 발명은 두가지 종류의 재조합 이종 유전자가 도입된 숙주게놈을 함유하는 유전공학적으로 조작된 안정한 포유동물 세포주의 유도에 관한 것이다. 제 1 유전자는 제 2 유전자의 발현을 조절할 수 있는 단백질을 발현한다. 제 2 유전자는 제 1 유전자에 의해 발현된 조절 단백질과 반응성이 있거나 이에 의해 인식된 표적 DNA 조절 서열을 함유한다. 제 2 유전자는 특정 목적하는 모든 유전자 산물을 암호화하고 발현한다. 조절단백질이 반응성 DNA 서열로부터의 유전자 발현에 영향을 미치는 분자기작에 대한 상세한 이해는 필요하지 않다.
특히, 2가지 종류의 재조합 이종 유전자, 즉 HIV tat 유전자 산물을 발현하는 제 1 유전자 및 암호화 서열(예 ; HIV LTR서열에 연결된 지시인자 단백질 암호화 서열)의 통합된 복제물(copies)을 함유하는 안정된 사람 세포주가 유도되어 왔다. HIV tat 단백질을 발현시키기 위해, HIV tat 암호화 서열을 시미안(simian)바이러스 40(SV 40)초기 영역에서 유래된 전사신호의 조절하에 있도록 하여 플라즈미드 pSV-tat를 수득한다. LTR-연결된 지시인자 유전자는 세균성 클로람페니콜 아세틸 트랜스퍼라제(cat), 이 콜라이 β-갈락토시다제, 및 사람의 IL-2(인터루킨 2)로부터 유래된 암호화 서열을 이용하여 각기 플라즈미드 pLTR-cat, pLTR-βgal, 및 pLTR-IL2를 제작한다. HIV LTR은 tat 단백질에 대한 반응성을 지니고, LTR에 연결된 서열의 발현에 대한 tat-의존성 활성화를 조절하는 서열 정보를 함유하는 것으로 알려져 있다. 그러므로 LTR-연결된 지시인자 유전자 산물의 발현은 HIV tat 유전자 산물에 의존하거나 이에 의해 강력하게 조절된다. HIV LTR 및 tat유전자 산물의 조절하에서, CAT, β-갈락토시다제 또는 IL 2를 비교적 높은 수준으로 발현하는 안정된 사람의 HeLa-유도된 세포주를 분리한다. 작동성 tat의 부재하에서, HIV LTR에 의해 직접적으로 발현된 β-갈락토시다제 또는 IL 2는 본 분석의 탐지 한계에 못미치는 양이다. CAT은 작동성 tat 없이는 HIV LTR로부터 매우 낮은 농도로 발현된다. 그러므로 이러한 안정된 세포주의 지시인자 유전자를 높은 농도로 발현시키는 것은 작동성 tat 단백질의 존재에 좌우된다. 일정한 유전자 산물을 본질적으로 발현하는 안정된 세포주를 수득하는 요건으로서, 유전자 산물이 발현될 농도에서 숙주세포에게 치명적이지 않아야 한다. CAT, IL 2, β-갈락토시다제는 비교적 높은 수준으로 발현되어도 HeLa 세포에게 치명적이지 않음이 밝혀졌다.
[포유동물 세포의 형질감염, 성장 및 선별]
포유동물 세포주를 고농도의 글루코즈가 함유되고 10% 송아지 혈청(Hazleton Research Products, Denver, PA)으로 보충된 들베코(Dulbecco's)변형 최소 이글(Eagle's)배지(DMEM)중에서 단층 배양물 상태로 유지시킨다, 세포를 60mm조직 배양 접시당 5×105개의 세포 농도로 접종하고, 그 다음날 인산칼슘염 동시-침전법을 사용하여 형질감염시킨다[참조 ; Graham and Van der Eb, Virology 52 : 456-467(1973) : Wigler et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 76 : 1373-1376(1979)]. 일시적 분석에서, 형질감염시킨지 48시간 경과 후 세포를 수거한다.
형질감염인 플라즈미드 DNA의 통합된 복제물을 함유하는 안정된 포유동물 세포는 pSV 2-neo우성 선별 마커를 사용하여 항생제 G418(Gibco Laboratories, Grand Island, NY) 내성에 대하여 선별한다[참조 ; Southern and Berg, J. Mol. Appl., Genet, 1 : 327-341(1982) : Colbere-Garpin et al., J. Mol. Biol. 150 : 1-4(1981)]. 플라즈미드 pSV2-neo는 미합중국 보존 균주협회(American Type Culture Collection, Rockrille, MD)에서 수득한다. 형질감염시킨지 24시간 경과후, 60mm 배양접시중의 세포를 100mm배양접시 3개에 분리시킨다. 형질감염시킨지 48시간 경과후, 세포를 G418(600㎍/ml)을 함유하는 완전배지에 접종한다. 10 내지 14일 동안 선별 배지에서 성장시킨 후, 세포의 G418-선별된 집락을 클론화 실린더를 사용하여 모으거나 분리한다. 세포를 계속 성장시키는 동안 G418-함유 배지에 유지시킨다.
[폴라즈미드 제조]
문헌[참조 ; Maniatis et al., Molecular Cloning : A Laboratory Plasmid, Cold Spring Harbor Laboratory, New York(1982)]에 기술된 표준방법을 사용하여 플라즈미드를 제조하며, 상기 문헌은 여기에서 문헌으로서 인용된다. 플라즈미드 제조에 사용되는 효소 및 다른 시약은 구입할 수 있다(Bethesda Research Laboratories Gaithersburg, MD 또는 New England Biolabs, Beverly, MA). 본 발명에 사용되는 여러가지 뉴클레오타이드 서열의 절단, 동정, 회수 및 정제방법은 본 분야의 기술자에게 공지되어 있으며, 이와 마찬가지로 서열을 벡터에 연결하고, 숙주 미생물 균주를 형질전환시키며, 클론화하고 합성된 생성물을 회수하는 방법 또한 공지되어 있다. 그러므로, 본 발명의 특정 양태에 관련된 방법만을 여기에서 기술할 것이다.
플라즈미드 pSV-cat은 SV40초기 프로모터의 전사 조절을 받는 세균성 클로람페니콜 아세틸 트랜스퍼라제(cat)암호화 서열 및 폴리아데닐화 신호를 함유한다[참조 ; Gorman et al., Mol. Cell. Biol, 2 : 1044-1051(1982)]. 플라즈미드 pCH 110에서, 이.콜라이-유도된 β-갈락토시다제 암호화 서열도 마찬가지로 SV40 초기 전사 조절을 받는다[참조 ; Hall et al., J. Mol. Appl. Genet. 2 : 101-109(1983)]. pSV2-cat 및 pCH 110은 미합중국 보존 균주협회 및 Pharmacia(Piscataway, NJ)에서 각기 구입할 수 있다. pSV2-cat 및 pCH 110은 각기 pSV-cat 및 pSV-βgal로 취급될 수 있다.
플라즈미드 p5' LTR-cat은 이의 SV40 기원(origin)영역을 함유하는 259개 염기쌍의 Pvu II 내지 Hind III 단편을 생물학적 활성을 지닌 프로 바이러스 클론 pH×B2gpt(A. Fisher, NIH, Bethesda, MD에서 구입)로부터 수득된 650개 염기쌍의 Hpa I 내지 Hind III 5' LTR-함유 DNA 단편으로 치환시킴으로써 pSV-cat으로부터 수득할 수 있다[참조 ; Fisher et al., Nature 320 : 367-371(1986)]. 플라즈미드 p3' LTR-cat은 상기와 유사하게 pH×B2gpt로부터 수득된 720개 염기쌍의 Xho I 내지 Hind III 3'LTR-함유 DNA 단편을 사용하여 작제된다. Xho I 부위는 연결과정 전에 클데나우 반응을 통하여 평활말단으로 전환시킨다.
플라즈미드 pLTR-βgal은 p5'LTR-cat의 cat 암호화 서열을 함유하는 Hind III 내지 BanH I 단편을 pSV-βgal로부터 수득된 Hind III 내지 BamH I βgal-함유 단편으로 치환시킴으로써 제조할 수 있다.
플라즈미드 pSV-tat는 Hind III 내지 Hpa I cat-함유 단편을 pH×B2gpt에서 수득된 HIV tat 암호화 서열을 함유하는 2628개 염기쌍의 Sal I 내지 BamH I 단편으로 치환시킴으로써 유도된다. 연결시키기전에, Hind III 내지 Sal I 올리고뉴클레오타이드 링커를 이용하여 Sal I 부위를 Hind III 부위로 전환시키고, BamH I 부위는 클레나우 반응을 통하여 평활말단으로 전환시킨다.
플라즈미드 pLTR-IL2는 Hind III 내지 Hpa I cat-함유 단편을 플라즈미드 pY3으로부터 수득한 사람의 IL2암호화 서열을 함유하는 400개 염기쌍의 psa I 내지 Stu I 단편으로 치환시킴으로써, p3'LTR-cat으로부터 유도된다, 플라즈미드 ay3는 사람의 IL2 cDNA를 함유하며, 케이.리백(K.Livak : Du pont Experimental Station, Wilmington, DE)으로부터 입수할 수 있다. pY3의 IL2 암호화 서열은 문헌[참조 ; Taniguchi et al., Nature 302 : 305-310(1983)]에서 보고된 것과 동일하다.
[클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제 및 β-갈락토시다제 분석]
PBS중의 1mM EDTA를 사용하여 60mm 배양판에서 세포를 부유시키고 펠렛화한 후, -70℃에서 저장하거나 즉시 분석한다. 250mM당, 10mM 트리스-HCl(pH 7.4), 10mM EDTA를 함유하는 용액 50㎍중에 세포 펠렛을 현탁시키고, 동결 및 해동 주기를 3회 반복한 후, 원심 분리하여 세포조각을 제거하여 세포 분해물을 제조한다. 세포 분해물은 문헌[참조 ; Gorman et al., Mol. Cell Biol. 2 : 1044-1051(1982)]에 따라 클로람페니콜 아세틸 트랜스퍼라제(CAT)활성분석에 이용된다, 클로람페니콜이 아세틸화된 형태로 전환된 것은 실리카겔 박층 크로마토그라피한 후 판에서 사라진 반점을 액체 방사성 동위원소 측정기(liquid scintillation counter)로 측정하여 정량할 수 있다.
β-갈락토시다제 분석은 문헌[참조 ; Pharmacia Analects Newsletter, Vol. 14, No. 2)에 기술된 바와 같이 수행한다. CAT 또는 β-갈락토시다제의 상대적 활성을 측정하기 위해, 초기 반응 속도를 측정하고(즉, 생성물의 형성량은 분석한 세포 추출물의 용적 및 분석 반응시간에 비례한다)각각의 분석을 사용된 세포 추출물의 용적 및 분석 반응시간에 대하여 평준화한다.
[IL2 분석]
세포 배양물중의 분비된 IL2를 직접적으로 분석하고, 문헌[참조 ; Robb. Meth, Enzymol. 116 : 493-525(1985)]에 기술된 바와같이 IL2-의존성 뮤린(murine)세포주 CTLL을 사용하여 수행한다. 정제된 사람 저켓(Jurkat)세포-유도된 IL-2는 여기에서 수행된 분석결과 ㎍당 약 300단위의 특이적 활성을 지니는 것으로 나타났다(참조 ; L. Breth, Du Pont Glasgow Site, Glasgow, DE).
제 1 도는 HIV tat 유전자 산물에 의한 HIV LTR의 전사-활성화를 설명하기 위해 사용된 시스템의 개략도이다. 2가지 종류의 이종 유전자가 사람 세포에 전이되는데, 하나의 유존자(SV-tat)는 HIV tat 유전자산물(TAT)를 발현시키고, 또 하나의 유전자는 HIV LRT에 연결된 지시인자 단백질 암호화 서열(LTR-cat, LTR-βgal, 또는 LTR-IL2)을 함유한다. 유전자를 전이시킨후, 지시인자 유전자 산물(CAT, βgal 또는 IL2)의 발현량을 정량한다.
제 2 도는 일시적 발현 분석을 통하여 얻은 결과로서, HIV LTR에 연결된 지시인자 유전자 발현이 HIV tat-의존적으로 유도됨을 밝혀주는 도표이다. HeLa세포를 상기 플라즈미드로 형질감염시키고, 이어서 유전자를 절단시킨지 48시간 경과후에 세포 분해물을 제조한다. 운반체로서 초음파 처리된 연어(salmon)정자 DNA가 사용된 형질감염물은 60mm배양판당 총 10 내지 15㎍의 DNA를 함유한다. 각각의 형질전환에 사용된 플라즈미드 DNA의 양은 하기와 같다 : A) pSV-cat 또는 pLTR-cat 3㎍, pSV-tat 5㎍, 및 총 DNA 10㎍ ; B) pLTR-IL2 5㎍, pSV-tat10㎎ 및 총 DNA 15㎍ ; C) pLTR-βgal 5㎍, pSV-tat 10㎍, 및 총 DNA 15㎍.
제 3 도는 상이한 여러 종의 세포 종류를 대상으로 한 일시적 분석을 통하여 pLTR-cat로부터 CAT의 발현이 HIV tat-의존적으로 유도됨을 밝혀주는 도표이다. 포유동물 세포를 상기 플라즈미드로 형질감염시키고, 이어서 유전자를 절단시킨지 48시간 경과시에 세포 용해물을 제조한다. 운반체로서 초음파처리된 연어정자 DNA가 사용된 형질감염물은 60mm배양판당 총 DNA 7㎍을 함유한다. 각각의 형질감염에 사용되는 플라즈미드 DNA의 양은 하기와 같다 ; pSV-cat 2㎍, pLTR-cat 2㎍, 및 pSV-tat 5㎍. 형질감염된 세포 용해물의 CAT활성을 정량하고, pLTR-cat 또는 pSV-cat로 형질감염된 동일한 종류의 세포에서 발현된 CAT 수준, 또는 pSV-cat로 형질감염된 HeLa세포에서 발현된 CAT수준으로 평준화된다.
사용된 세포주의 출처는 하기와 같다 ; NIH3T3, CHO, 및 HeLa(American Type Culture Collection) ; PK(M. Whealy, Du Pont Experimental Station, Wilmington, DE) : L(M. Linn, Du Pont Experimental Station, Wilmington, DE).
제 4 도는 HIV LTR 및 HIV tat 유전자 산물의 조절하에서 작동성으로 분비되는 IL2를 발현하는 안정된 사람 세포주가 유도되었음을 밝혀주는 도표이다. HeLa세포를 표지된 플라즈미드(pSV-neo 0.5㎍, pLTR-IL2.5㎍, pSV-tat 10㎍, 60mm 배양판당 총 DNA 16㎍)로 형질감염시키고, G418에서의 성장을 기준으로 선별한다. G418-선별된 세포의 집락을 모으거나 개별적으로 클론화하고, 이어서 분비된 IL2를 분석한다.
제 5 도는 HIV LTR 및 HIV tat 유전자 산물의 조절하에서 작동성 β-갈락토시다제를 발현하는 안정된 HeLa 세포주가 유도되었음을 밝혀주는 도표이다. HeLa 세포를 상기 플라즈미드(pSV-neo 0.5㎍, pLTR-βgal 5㎍, pSV tat 15㎍, 60mm 세포배양판당 총 DNA 16㎍)로 형질 감염시키고 G418의 존재하에서 성장한 균주를 선별한다.
G418-선별된 세포집락을 모으고 개별적으로 클론화한후 이어서 β-갈락토시다제에 대하여 분석(2차 컬럼)한다. tat-발현 pSV-tat 플라즈미드를 일시적으로 도입함으로써 모아지거나 클론화된 G418-선별된 세포중 일부를 tat-유도성 β-갈락토시다제, 즉 tat-유도성 LTR-βgal 유전자를 분석한다. pSV-tat의 유전자 전달이 시작된지 48시간 경과 후, 세포를 β-갈락토시다제 활성에 대하여 분석(3차 컬럼)한다. pLTR-cat지시인자 유전자를 일시적으로 유도함으로써 수집하거나 클론화된 G418-선별된 세포 몇몇을 기능적 tat 유전자 산물의 발현에 대하여 분석한다. pLTR-cat의 유전자 전달이 시작된지 48시간 경과 후 세포의 CAT활성을 분석(4차 컬럼)한다. tat 활성은 pLTR-cat로부터의 CAT 발현수준에 상응하는 임의의 단위로 표현된다.
제 6 도는 12-8세포의 성장 및 β-갈락토시다제 발현에 미치는 마이토마이신-c의 효과를 나타낸 그래프이다. Hela-유도된 클론 12-8세포(참조 : 제 5 도)를 96-웰(well)미세역가측정판중에 웰당 5×103세포로 접종한다. 접종한지 1일 경과후, 배지를 다양한 농도의 마이토마이신-c를 함유하는 배지로 대치시킨다. 접종한지 4일 경과후, 세포성장 및 β-갈락토시다제를 분석한다.
[실시예 1]
일시적 분석을 통한 LTR-연결된 유전자 발현의 tat-매개된 전사-활성화에 대한 연구
pSV-tat로부터 발현되며 LTR-연결된 cat, β-갈락토시다제, 및 IL2의 발현을 전사-활성화하는 tat유전자 산물의 기능은 일시적 형질감염 및 발현분석으로 분석된다. 이러한 분석에는 플라즈미드의 상이한 배합물을 HeLa세포로 유전자 전달 또는 형질감염시키고 유전자 전달이 48시간 경과되었을 때, 발현된 표시인자 유전자 산물의 농도를 정량하는 단계가 포함된다. 사용된 조건하에서는 약 5%의 표적 세포가 수득되고, 이들은 형질 감염된 플라즈미드 DNA에 존재하는 유전자를 작동성으로 발현한다. 그러나, 형질감염되고 발현된 DNA라도 숙주게놈내로 모두 필수적으로 안정하게 도입되는 것은 아니다.
사실상, 형질감염된 DNA의 안정된 도입 및 발현율은 표적 HeLa세포의 약 0.1% 정도로 현저히 낮다. 그러므로, 유전자 전달이 48시간 경과되었을 때의 유전자 발현분석은 일시적 발현분석이라 할 수 있다.
이러한 일시적 형질감염 및 발현분석의 결과는 표 2에 나타나 있다. pLTR-cat에 있어서, cat발현의 tat-의존성 유도율은 약 5600배이다. CAT분석은 비유도성 LTR-cat유전자로부터의 CAT를 감별할 수 있을 정도로 충분히 예민한 것이다. pLTR-IL2 및 pLTR-βgal의 경우에 있어서, IL2 또는 β-갈락토시다제 발현의 비-유도성 농도는 식별한계보다 낮은 것이다. tat의 존재하에서, IL2 및 β-갈락토시다제의 현저히 증가된 농도는 각기 pLTR-IL2 및 pLTR-βgal에서 발현된 것이다. HeLa 세포내에서 LTR-IL2 및 LTR-βgal의 tat-의존성 유도량은 각기 500배 또는 1770배 이상인 것으로 측정되었다.
[실시예 2]
HIV tat의 종 특이성 및 LTR-매개된 전사-활성화
HIV LTR-연결된 유전자의 tat-매개된 발현에 대한 본 연구의 목적중 하나는 활성인자(activator) 및 프로모터 배합체를 포유동물 세포내에서 이종 단백질의 높은 발현수준을 획득하기 위한 일반적인 도구로서 평가하는 것이므로, 상이한 종의 다양한 섬유아세포-유아세포에서 tat 유전자 산물에 의한 전자-활성화의 절대 발현수준 및 정도를 모두 측정한다. 이러한 분석을 목적으로 일시적 형질감염 및 발현분석을 수행한다. 그 결과는 표 3에 나타나 있다. 놀랍게도, HIV LTR의 tat-매개된 전사-활성화는 시험된 사람의 세포주가 아닌 것들과 비교하여 시험된 사람 세포주(HeLa)에서 상당히 더욱 효과적임이 밝혀졌다. 즉, 실험에서, HeLa 세포에서 cat 발현에 대한 tat-의존성 유도 증가정도는 4200-배인데 반하여, 사람 세포가 아닌 경우는 단지 3.6 내지 23-배로 나타났다. HIV tat 유전자 산물에 의해 발휘된 전사-활성화의 주성분은 종 특이성 성분이다.
HIV tat-활성화된 LTR에 의해 유도된 HeLa 세포에서의 유전자 발현 정도는 SV40초기 프로모터에서 관찰된 것보다 약 55배 이상 크다. 그러므로, HIV tat LTR-매개된 발현 시스템은 삽입된 유전자 서열을 비교적 높은 수준으로 발현시키기에 유용한 도구가 된다. 이러한 시스템은 유용한 폴리펩타이드(예 : IL2)를 제조하기 위한 수단으로서 중요한 가치를 지닌다. 그러나 HIV tat 및 LTR-매개된 발현 시스템의 주된 용도는 사람 세포 숙주에 한정되어 있다. 그러나 유사한 전사-활성인자-함유 발현 시스템은 다른 포유동물 세포주에도 안정하게 도입될 수 있다. tat기능을 하는 주요성분은 사람에 특이적이므로, 사람 세포숙주(즉 ; HeLa세포)를 이용하여 tat 기능을 발휘하는 안정된 세포주를 유도한다.
[실시예 3]
HIV tat기능을 지닌 안정된 사람 세포주의 유도
tat 활성화의 분자기작을 연구하고 사람 세포내의 이종 단백질의 안정된 발현을 위한 tat-매개된 발현의 용도를 평가하기 위하여, 작동성 tat 유전자 단독, tat 단백질에 의해 활성화될 수 있는 형태의 LTR-지시인자 유전자, 또는 tat- 및 LTR-함유 유전자 모두를 함유하는 안정된 형질감염된 세포주를 유도한다. 특히, tat 및 LTR 조절하에서 용이하게 분석할 수 있는 표시인자 유전자 산물을 발현하는 안정된 세포주는 tat 기능에 대한 억제제를 선별하기 위한 표적 세포로서 유용하다.
안정된 세포주를 유도하기 위해 pSv2-neo 우성 선별 마커를 사용한다. neo 유전자의 발현은 약제 G418에 대한 내성을 부여한다. 실제로 pSv2-neo DNA를 안정하게 발현하는 형질감염된 세포는 pSV2-neo 플라즈미드로 동시-형질감염된 유전자도 발현할 가능성이 높다. 그러므로, 본 발명자들은 pSV-neo와 함께 tat-함유 및 LTR-함유 플라즈미드 작제물의 다양한 배합물로 HeLa 세포를 형질감염시키고, G418에 대한 내성을 지닌 세포를 선별한다. G418-선별된 세포의 집략을 차례로 모으거나 클론화하고, 작동성 tat의 발현 및/또는 LTR-연결된 표시인자 유전자의 tat-의존성 발현을 분석한다.
이러한 원리를 이용하여, 작동성 tat 유전자산물을 발현하는 (LTR-연결된 표시인자 유존자의 부재하에서)HeLa-유도된 세포주를 분리한다. 예를들어 제 5 도의 Hela-유도된 클론 12-11을 참조하라. tat-유도된 상태에서 pLTR-cat 또는 pLTR-βgal 모두를 함유하는 안정된 세포주 또한 분리하다. 예를들어 제 5 도의 HeLa-유도된 클론 11-3, 11-4 및 11-5를 참조하라. 또한 HIV LTR 및 tat 유전자 산물의 조절을 받는 CAT, IL2, 또는 β-갈락토시다제를 비교적 높은 수준으로 발현하는 안정된 HeLa-유도된 세포주가 분리되었다. 예를들어, HeLa-유도된 클론 14-8(제 4 도) 및 12-8(제 5 도)은 IL2 및 β-갈락토시다제를 각각 비교적 높은 수준으로 발현한다. 클론 12-8의 서브클론(subclone)이 분리되었으며 이들 B-9이라 한다.
이와 유사한 방법으로, pSV-βgal을 함유하며, 본질적으로 탐지가능한 수준의 β-갈락토시다제를 발현하는 HeLa유도된 세포 클론을 분리한다. 이러한 HeLa-유도된 클론 하나를 8-10이라 명명하였다. 클론 8-10중의 β-갈락토시다제의 발현은 HIV tat와는 무관하므로, 이들 세포는 HIV tat에 대한 어떠한 장정적인 억제제의 특이성을 시험하는데 있어서, tat-억제제 선별시에 표적세포로서 유용하다. 클론 8-10의 tat-독립성 β-갈락토시다제 발현에 영향을 미치지 않으면서 HeLa-유도된 클론 12-9 또는 B-9의 tat-의존성 β-갈락토시다제 발현을 억제하는 화합물은 tat작용에 대해 강력하게 특이적인 억제제이다.
실시예 3에 기술된 바와 같이 HeLa 유도된 클론 B-9 및 8-10은 미합중국 보존균주 협회(Rockville, MD소재)에 기탁번호 CRL9432 및 CRL9433으로 각기 기탁되어 있다. 이들 기탁물은 특허청의 승인하에서 일반인이 입수할 수 있다. 그러나, 기탁물의 이용가능성이 행정부에 의해 허여된 특허권의 실효시에 본특허를 실행할 수 있는 것으로 이해되어서는 안된다.
HIV tat 유전자의 조절을 받는 용이하게 분석할 수 있는 표시인자 유전자 산물을 높은 수준으로 발현시키는 안정된 세포주의 유도는 tat 유전자 산물의 작용기작에 대한 더 깊은 연구, 및 tat-매개된 Ltr-유도된 유전자 발현을 억제하는 화합물을 동정하는 약제 개발연구에 상당히 유용한 것이다. HIV tat 유전자에 있어서의 돌연변이는 활성적인 LTR-cat 또는 LTR-βgal을 함유하는 세포주에 형질감염시킴으로써 생물학적 활성에 대하여 용이하게 선별할 수 있다. 이러한 분석은 감염성 바이러스 부재하에서도 수행할 수 있으며, 특히 CAT이 표시인자 유전자로서 사용된 경우 매우 예민하며, 신속하고, 저렴하며, β-갈락토시다제를 표시인자 유전자로서 선택한 경우 방사성 동위원소를 사용하지 않고도 수행할 수 있다.
이러한 tat-활성적으로 통합된 LTR 유전자 작제물을 이용한 실험은 HIV감염 생활주기 동안 tat에 의한 전사-활성화의 표적인 통합된 HIV프로바이러스 LTR와 거의 흡사한 작용을 함을 보여준다. HIV 생활 주기동안, 통합된 프로바이러스 LTR의 전사-활성화는 감염성 바이러스의 바이러스 유전자 및 동시 생성물의 발현을 증가시킨다.
[실시예 4]
96-웰 미세역가측정판에서의 세포성장 및 β-갈락토시다제 측정
HIV tat 유전자 산물의 엄격한 조절을 받으며 이의 활성에 의존적인 용이하게 판별할 수 있는 표시인자 유전자 산물을 높은 수준으로 발현하는 HeLa-유도된 클론 12-8 또는 12-10(제 5 도 참조)과 같은 세포주는 tat 활성화를 억제하는 화합물을 동정하는데에 매우 유용하다. 다수의 화합물의 선별을 용이하게 하기 위하여, β-갈락토시다제 발현을 정량하기 위한 반-자동화된 미세분석법을 개발하였다. 96-웰 미세역가 측정판에서 배양된 세포의 β-갈락토시다제 발현을 측정하기 위해, 간접적인 면역학적 효소-결합된 면역흡착 분석법(ELISA)을 사용한다.
그러나 이 방법은 미세역가측정판 웰에서 배양된 클론 12-8(B-9)세포의 β-갈락토시다제를 측정하기에 충분히 예민하지 못하다. 예상외로 직접적인 β-갈락토시다제 효소 분석이 마이크로 웰에서 배양된 클론 12-8(B-9)세포의 β-갈락토시다제 발현을 정량하는데 있어서 더욱 예민한 방법으로 밝혀졌다(하기 참조).
β-갈락토시다제 분석과 병행하여, 미세역가 측정판 포맷(format)을 이용하여 세포 생존도를 측정할 수 있다. tat에 대한 억제제의 특이성 정도를 1차 확인하기 위해, 시험될 화합물과 반응하는 β-갈락토시다제 발현 및 세포성장을 함께 측정하는 것이 바람직하다. 실시예 3에서 기술한 바와 같이, tat에 대한 억제제의 특이성을 2차 확인하기 위해, β-갈락토시다제의 발현이 tat기능과 무관한 세포주(예 8-10)의 β-갈락토시다제 발현에 대한 억제제의 효과를 시험한다. tat 기능의 억제제에 대한 표준 선별방법에는 HeLa-유도된 클론 B-9(tat-의존성 β-갈락토시다제 발현) 및 8-10(tat-독립성 β-갈락토시다제 발현)을 모두 이용하여 세포성장 및 β-갈락토시다제에 대한 화합물의 용량-의존성 효과를 정량하는 단계가 포함된다.
세포성장 및 β-갈락토시다제 발현의 정량에 이용되는 방법은 하기에 기술되어 있다. 마이크로 웰당 0.1ml의 배지가 함유된 96-웰 미세역가측정판상에 세포를 접종한다. 세포를 접종한지 1일 경과후, 시험할 화합물을 배지에 가한다. 4일간 성장시킨 후, 복제판내의 세포수 또는 β-갈락토시다제 활성을 분석한다.
마이크로 웰내의 생존 세포수를 색도계로 측정하고 황색의 테트라졸륨염 MTT(디메틸티아졸 테트라졸륨 브로마이드)를 첨가한다. MTT를 세포 배양물(마이크로 웰당 배양물 0.1ml당 H2O중의 1mg/ml MTT 50㎕)에 가한다. 세포를 37℃에서 4시간 동안 배양시킨 후, 이소프로판올 중의 0.04N HCl 0.1ml을 각 마이크로 웰중에 가하고 함유물을 피펫팅하여 혼합한다. 570nm에서 혼합물의 흡광도는 미세역가측정판 판독기(Biotech)를 사용하여, 산 이소프로판올을 가한지 15분 내지 1시간 내에 측정한다. 생존 세포에서만 기능적인 디하이드로계나제는 황색의 MTT를 자주색의 포르마잔으로 전환시키며, 포르마잔은 용해되어 분광측광법으로 흡광도를 측정할 수 있게 된다. 그러므로 생존 세포수는 MTT 반응 생성물인 포르마잔의 농도(흡광도)에 비례한다.
β-갈락토시다제 활성은 하기 방법에 따라 96-웰 미세역가측정판 포맷에서 정량한다. HeLa-유도된 세포 단층에서 배지를 제거하고, 각 웰에 20mM의 자당, 10mM의 트리스)Hcl(pH 7.4) 및 10mM의 EDTA를 함유하는 용액 50㎕를 가한다. 동결 및 해동 주기를 3회 반복하여 세포를 분해한다. 각각의 마이크로 웰에 완충액 Z(60mM Na2PO4, 40mM NaH2PO4, 10mM KCl, 1mM MgSO4, 50mM β-머캅토에탄올, pH 7.0)150㎕를 가한다. 완충액 Z중의 4mg/ml의 ONPG(o-니트로페닐-β-D-갈락토피라노사이드)를 함유하는 용액 40㎕를 가하여 β-갈락토시다제 반응을 시작하고 37℃에서 10분 내지 4시간 동안 반응시킨다. 생성물의 형성은 미세역가측정판 판독기를 사용하여 415nm에서 흡광도를 측정함으로써 판정한다. β-갈락토시다제에 더욱 민감한 이외의 기질을 사용할 수도 있다. 세포수 분석 및 β-갈락토시다제 분석 모두에 있어서, 데이타 조작 및 분석은 여기에 맞는 소프트웨어를 이용하는 컴퓨터와 인터페이스(interface)로 연결시킨다.
96-웰 미세역가측정판상의 마이크로 웰중의 HeLa-유도된 클론 12-8의 성장 및 β-갈락토시다제 발현에 대한 접종밀도의 효과를 시험한다. 클론 12-8에 대한 최적 접종밀도는 마이크로 웰당 5×103세포이다. 포유동물 세포의 DNA 복제 및 성장을 억제하는 것으로 알려진 약제에 대한 시스템의 반응의 예비시험으로서 12-8 세포의 성장 및 β-갈락토시다제 발현에 대한 대한 항생제 마이토마이신-c의 효과를 측정한다. 나타낸 바와 같이(제 6 도), 12-8세포성장 및 β-갈락토시다제 발현에 대한 마이토마이신-c의 뚜렷한 용량-반응효과가 관찰되었다.
세포수 및 β-갈락토시다제 발현을 신속하게 정량하기 위해 기술된 반-자동화된 방법의 개발은 tat기능의 억제제를 선별하는데 있어서, 상기 시험 시스템을 다수의 화합물에 적용시킬 수 있도록 도와준다. 기술된 세포주는 또다른 필수적 HIV 기능과는 달리, 특히 HIV tat기능을 억제할 수 있는 화합물을 동정하는데에 있어서의 표적을 제공한다. 그러므로, 감염성 HIV의 복제물을 억제하는 것으로 나타난 화합물을 HIV tat 및 LTR-표시인자 유전자-함유 세포주내에서 시험하여, 이들 화합물의 작용양태에 tat 기능의 억제가 포함되는지를 확인한다. 상기의 분석과정은 신속하고, 정량적이며, 저렴하고, 감염성 HIV 그자체를 다룰때 생기는 불편함이 없다.

Claims (30)

  1. a) 전사-활성 조절 단백질을 발현하는 제 1 DNA서열, 및 b) 전사-활성 조절 단백질에 대해 반응성인 표적 DNA 조절서열에 연결되어 있고 목적 단백질을 발현하는 제 2 DNA서열인 2가지의 이종 DNA서열이 계놈내에 삽입되어 있음을 특징으로 하는, 유전공학적으로 조작된 안정한 포유동물 세포주.
  2. 제 1 항에 있어서, 제 1 DNA서열이 바이러스성 전사-활성 조절 단백질을 발현하고, 목적 단백질을 발현하는 제 2 DNA서열이 전사-활성 단백질에 대해 반응성인 바이러스성 조절서열에 연결된 안정한 포유동물 세포주.
  3. 제 2 항에 있어서, 사람 세포주로부터 유도되고, 제 1 DNA서열이 사람의 면역결핍 바이러스(HIV)tat 단백질을 발현하고, 제 2 DNA서열이 HIV LTR조절서열에 연결된 세포주.
  4. 제 3 항에 있어서, 사람의 HeLa세포주로부터 유도된 세포주.
  5. 제 3 항에 있어서, 제 2 DNA서열이 세균성 β-갈락토시다제, 세균성 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제, 및 사람의 IL2로 이루어진 그룹중에서 선택된 지시인자 단백질을 발현하는 세포주.
  6. 제 4 항에 있어서, 제 2 DNA서열이 세균성 β-갈락토시다제, 세균성 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제, 및 사람의 IL2로 이루어진 그룹중에서 선택된 지시인자 단백질을 발현하는 세포주.
  7. 제 5 항에 있어서, 제 2 DNA서열이 세균성 β-갈락토시다제인 지시인자 단백질을 발현하는 세포주.
  8. 제 6 항에 있어서, 제 2 DNA서열에 세균성 β-갈락토시다제인 지시인자 단백질을 발현하는 세포주.
  9. 제 7 항에 있어서, 지시인자 단백질이 이.콜라이(E. coli)β-갈락토시다제인 세포주.
  10. 제 8 항에 있어서, 지시인자 단백질이 이.콜라이(E. coli)β-갈락토시다제인 세포주.
  11. 목적 단백질이 지시인자 단백질인 제 1 항에 따른 유전공학적으로 조작된 안정한 포유동물 세포주를 사용하여, 전사-활성 조절 단백질의 기능을 특이적으로 억제하는 물질을 선별하는 방법.
  12. 목적 단백질이 지시인자 단백질인 제 2 항에 따른 유전공학적으로 조작된 안정한 포유동물 세포주를 사용하여, 바이러스성 전사-활성 조절 단백질의 기능을 특이적으로 억제하는 항-바이러스성 물질을 선별하는 방법.
  13. 제 3 항에 따른 세포주를 사용하여, HIV tat 단백질의 기능을 특이적으로 억제하는 항-바이러스성 물질을 선별하는 방법.
  14. 제 4 항에 따른 세포주를 사용하여, HIV tat 단백질의 기능을 특이적으로 억제하는 항-바이러스성 물질을 선별하는 방법.
  15. 제 5 항에 따른 세포주를 사용하여, HIV tat 단백질의 기능을 특이적으로 억제하는 항-바이러스성 물질을 선별하는 방법.
  16. 제 6 항에 따른 세포주를 사용하여, HIV tat 단백질의 기능을 특이적으로 억제하는 항-바이러스성 물질을 선별하는 방법.
  17. 제 7 항에 따른 세포주를 사용하여, HIV tat 단백질의 기능을 특이적으로 억제하는 항-바이러스성 물질을 선별하는 방법.
  18. 제 8 항에 따른 세포주를 사용하여, HIV tat 단백질의 기능을 특이적으로 억제하는 항-바이러스성 물질을 선별하는 방법.
  19. 제 7 항에 따른 세포주, 및 대조군으로서 tat의 조절과 무관하게 세균성 β-갈락토시다제를 발현하는 유전공학적으로 조작된 안정한 사람 세포주를 이용하여, HIV tat 단백질의 기능을 특이적으로 억제하는 항-바이러스성 물질을 선별하는 방법.
  20. 제 8 항에 따른 세포주, 및 대조군으로서 tat의 조절과 무관하게 세균성 β-갈락토시다제를 발현하는 유전공학적으로 조작된 안정한 사람 세포주를 이용하여, HIV tat단백질의 기능을 특이적으로 억제하는 항-바이러스성 물질을 선별하는 방법.
  21. 제 9 항에 따른 세포주, 대조군으로서 tat의 조절과 무관하게 이,콜라이 β-갈락토시다제를 발현하는 유전공학적으로 조작된 안정한 사람 세포주를 이용하여, HIV tat단백질의 기능을 특이적으로 억제하는 항-바이러스성 물질을 선별하는 방법.
  22. 제 10 항에 따른 세포주, 및 대조군으로서 tat의 조절과 무관하게 이.콜라이 β-갈락토시다제를 발현하는 유전공학적으로 조작된 안정한 사람 세포주를 이용하며, HIV tat단백질의 기능을 특이적으로 억제하는 항-바이러스성 물질을 선별하는 방법.
  23. 제 19 항에 있어서, 반자동적, 비면역학적, 비방사성 직접적, 효소 색도측정 마이크로 분석인 방법.
  24. 제 20 항에 있어서, 반자동적, 비면역학적, 비방사성 직접적, 효소 색도측정 마이크로 분석인 방법.
  25. 제 21 항에 있어서, 반자동적, 비면역학적, 비방사성 직접적, 효소 색도측정 마이크로 분석인 방법.
  26. 제 22 항에 있어서, 반자동적, 비면역학적, 비방사성 직접적, 효소 색도측정 마이크로 분석인 방법.
  27. 계놈내에 a) 전사-활성 조절 단백질을 발현하는 제 1 DNA 서열, 및 b) 전사-활성 조절 단백질에 대해 반응성인 표적 DNA조절서열에 연결되어 있고 목적단백질을 발현하는 제 2 DA서열인 2가지의 이종 DNA서열이 삽입되어 있는 유전공학적으로 조작된 안정한 포유동물 세포주를 이용하여, 제 2 DNA서열이 표적 DNA조절서열에 연결되어 있지 않은 상기의 포유동물 세포주를 이용하는 방법보다, 10배 이상의 수준으로 목적 단백질의 발현을 유도하는 방법.
  28. 제 27 항에 있어서, 사용된 세포주가 제 2 항에 따르는 안정한 포유동물 세포주인 방법.
  29. 제 28 항에 있어서, 사용된 세포주가 제 3 항에 따르는 안정한 포유동물 세포주인 방법.
  30. 제 29 항에 있어서, 사용된 세포주가 제 4 항에 따르는 안정한 포유동물 세포주인 방법.
KR1019880005719A 1987-05-19 1988-05-17 바이러스-특이성 유전적 조절하에서 지시인자 유전자 산물을 발현하는 안정한 포유동물 세포주 KR910004101B1 (ko)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US5197087A 1987-05-19 1987-05-19
US051,970 1987-05-19

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR880014097A KR880014097A (ko) 1988-12-22
KR910004101B1 true KR910004101B1 (ko) 1991-06-22

Family

ID=21974555

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1019880005719A KR910004101B1 (ko) 1987-05-19 1988-05-17 바이러스-특이성 유전적 조절하에서 지시인자 유전자 산물을 발현하는 안정한 포유동물 세포주

Country Status (8)

Country Link
EP (1) EP0291893A1 (ko)
JP (1) JPS63309185A (ko)
KR (1) KR910004101B1 (ko)
AU (1) AU1632788A (ko)
DK (1) DK271688A (ko)
IL (1) IL86418A0 (ko)
NZ (1) NZ224667A (ko)
ZA (1) ZA883529B (ko)

Families Citing this family (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1989002472A1 (en) * 1987-09-21 1989-03-23 Amrad Corporation Limited Regulation of expression of gm-csf gene
ATE208813T1 (de) * 1988-02-16 2001-11-15 Greatbatch Gen Aid Ltd Modifizierte zellen mit resistenz gegen retroviralinfektionen
US5070012A (en) * 1988-03-30 1991-12-03 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Monitoring of cells and trans-activating transcription elements
WO1989012461A1 (en) * 1988-06-16 1989-12-28 St. Louis University Antagonists of viral transactivating proteins
US5278042A (en) * 1989-02-06 1994-01-11 The United States Of America As Represented By The Department Of Health & Human Services Method for detecting inhibitors of tat protein
US6251675B1 (en) 1989-05-25 2001-06-26 Duke University Methods utilizing mutant rev genes encoding transdominant repressors of HIV replication
US5871958A (en) * 1989-05-25 1999-02-16 Duke University Mutant rev genes encoding transdominant repressors of HIV replication
FR2651005B1 (fr) * 1989-08-17 1992-01-03 Pasteur Institut Lignees de cellules infectables par un retrovirus et contenant un marqueur activable a l'occasion de l'infection
GB9003010D0 (en) * 1990-02-09 1990-04-04 Glaxo Group Ltd Gene expression in yeast cells
IT1241123B (it) * 1990-04-19 1993-12-29 Consiglio Nazionale Ricerche Cellule umane per l'elevata espressione di geni inseriti in dna ricombinanti episomiali,loro preparazione e loro impiego
DE4036784A1 (de) * 1990-11-17 1992-05-21 Behringwerke Ag Antivirale aktivitaet des vom adeno-assoziierten virus typ 2 codierten rep-gens
GB9114437D0 (en) * 1991-07-03 1991-08-21 Health Lab Service Board Recombinant adenoviruses and the use thereof for detecting the presence in eukaryotic cells of the expression products of specific genes
ES2049691T3 (es) * 1992-03-13 2000-10-16 Monsanto Co Produccion de proteinas recombinantes utilizando promotores del virus herpes y transactivadores vp16.
US6242187B1 (en) 1996-01-29 2001-06-05 Virologic, Inc. Compositions and methods for determining anti-viral drug susceptibility and resistance and anti-viral drug screening
PL328068A1 (en) * 1996-01-29 1999-01-04 Virologic Compositions for and methods of determining susceptibility to and immunity against an antiviral drug and selecting appropriate antiviral drug
US5928888A (en) * 1996-09-26 1999-07-27 Aurora Biosciences Corporation Methods and compositions for sensitive and rapid, functional identification of genomic polynucleotides and secondary screening capabilities
KR20010022420A (ko) * 1997-07-30 2001-03-15 추후제출 항 바이러스성 약품의 민감성과 내성의 결정 및 항바이러스성 약품의 스크리닝을 위한 조성물 및 방법
WO1999009175A1 (en) * 1997-08-15 1999-02-25 E.I. Du Pont De Nemours And Company Plant genes encoding dr1 and drap1, a global repressor complex of transcription

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4738922A (en) * 1984-05-25 1988-04-19 Dana Farber Cancer Institute Trans-acting transcriptional factors

Also Published As

Publication number Publication date
DK271688D0 (da) 1988-05-18
ZA883529B (en) 1990-01-31
KR880014097A (ko) 1988-12-22
JPS63309185A (ja) 1988-12-16
IL86418A0 (en) 1988-11-15
DK271688A (da) 1988-11-20
EP0291893A1 (en) 1988-11-23
NZ224667A (en) 1990-03-27
AU1632788A (en) 1988-11-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR910004101B1 (ko) 바이러스-특이성 유전적 조절하에서 지시인자 유전자 산물을 발현하는 안정한 포유동물 세포주
US5026635A (en) Stable human cell lines expressing an indicator gene product under virus-specific genetic controls
Ostrove et al. Activation of the human immunodeficiency virus by herpes simplex virus type 1
Strebel et al. A novel gene of HIV-1, vpu, and its 16-kilodalton product
Fisher et al. The trans-activator gene of HTLV-III is essential for virus replication
Hauber et al. Mutational analysis of the conserved basic domain of human immunodeficiency virus tat protein
Yang et al. The human immunodeficiency virus Tat proteins specifically associate with TAK in vivo and require the carboxyl-terminal domain of RNA polymerase II for function
Selby et al. Trans-activation by HIV-1 Tat via a heterologous RNA binding protein
Gendelman et al. Trans-activation of the human immunodeficiency virus long terminal repeat sequence by DNA viruses.
Paxton et al. Incorporation of Vpr into human immunodeficiency virus type 1 virions: requirement for the p6 region of gag and mutational analysis
Wu et al. Targeting foreign proteins to human immunodeficiency virus particles via fusion with Vpr and Vpx
Bogerd et al. Dominant negative mutants of human T-cell leukemia virus type I Rex and human immunodeficiency virus type 1 Rev fail to multimerize in vivo
Flemington et al. Autoregulation of Epstein-Barr virus putative lytic switch gene BZLF1
Majello et al. Different members of the Sp1 multigene family exert opposite transcritional regulation of the long terminal repeat of HIV-1
Laimins et al. Characterization of enhancer elements in the long terminal repeat of Moloney murine sarcoma virus
Kjems et al. Specific regulation of mRNA splicing in vitro by a peptide from HIV-1 Rev
Cullen et al. Subcellular localization of the human immunodeficiency virus trans-acting art gene product
Mahalingam et al. Identification of residues in the N-terminal acidic domain of HIV-1 Vpr essential for virion incorporation
van Wamel et al. The first strand transfer during HIV-1 reverse transcription can occur either intramolecularly or intermolecularly
EP0230222A1 (en) Expression of HTLV-III gag-Gene
US6001985A (en) Fusion protein delivery systems and uses thereof
Bachelerie et al. Constitutive expression of human immunodeficiency virus (HIV) nef protein in human astrocytes does not influence basal or induced HIV long terminal repeat activity
Campbell et al. Characterization of the internal promoter of simian foamy viruses
Nakamura et al. Differential activation of the 21-base-pair enhancer element of human T-cell leukemia virus type 1 by its own trans-activator and cyclic AMP
Meier et al. Varicella-zoster virus DNA polymerase and major DNA-binding protein genes have overlapping divergent promoters

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
G160 Decision to publish patent application
E701 Decision to grant or registration of patent right
NORF Unpaid initial registration fee