JPS63309185A - ウイルス特異的遺伝子コントロール下にインジケータ遺伝子産生物を発現する安定なヒト細胞系 - Google Patents
ウイルス特異的遺伝子コントロール下にインジケータ遺伝子産生物を発現する安定なヒト細胞系Info
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
発明の分野
本発明は、ウィルス特異的（ＨＩＶ−特異的）調節ＤＮ
Ａ配列（例えばＨＩＶ ＬＴＲ）および調節タンパク（
例えばＨＩＶ ｔａｔ遺伝子産生物）の遺伝子コントロ
ール下に容品にアッセイ可能なインジケータ・タンパク
（例えば大腸ＩＭ（Ｅ、 ｃｏｌｉ）β−ガラクトシダ
ーゼ）を特異的に発現する安定な哺乳動物細胞系の遺伝
子工学による誘導に関する。本発明は、特定のクラスの
抗ウィルス（抗−ＨＩＶ ）治療化合物の効率的なスク
リーニングを可能にするシステムを提供する。
Ａ配列（例えばＨＩＶ ＬＴＲ）および調節タンパク（
例えばＨＩＶ ｔａｔ遺伝子産生物）の遺伝子コントロ
ール下に容品にアッセイ可能なインジケータ・タンパク
（例えば大腸ＩＭ（Ｅ、 ｃｏｌｉ）β−ガラクトシダ
ーゼ）を特異的に発現する安定な哺乳動物細胞系の遺伝
子工学による誘導に関する。本発明は、特定のクラスの
抗ウィルス（抗−ＨＩＶ ）治療化合物の効率的なスク
リーニングを可能にするシステムを提供する。
背 景
ヒト免疫不全ウィルス−（（ＨＩＶ−Ｉ 、そのほかＬ
ＡＶ 、 ＨＴＬＶ −［１１、またはＡＲＶともいう
）は後天性免疫不全症候群（エイズ）の主な病原体であ
る〔Ｂａｒｒｅ−８ｉｎｏｕｓｓｉ等、５ｃｉｅｎｃｅ
２２０：８６８〜８７１ （１９８３） ；Ｇａ１ｌ
ｏ等、５ｃｉｅｎｃｅ ２２４：５００〜５０３（１９
８４） ；Ｌｅｖｙ等、５ｃｉｅｎｃｅ ２２５：８４
０〜８４２（１９８４））。
ＡＶ 、 ＨＴＬＶ −［１１、またはＡＲＶともいう
）は後天性免疫不全症候群（エイズ）の主な病原体であ
る〔Ｂａｒｒｅ−８ｉｎｏｕｓｓｉ等、５ｃｉｅｎｃｅ
２２０：８６８〜８７１ （１９８３） ；Ｇａ１ｌ
ｏ等、５ｃｉｅｎｃｅ ２２４：５００〜５０３（１９
８４） ；Ｌｅｖｙ等、５ｃｉｅｎｃｅ ２２５：８４
０〜８４２（１９８４））。
主なウィルス構造タンパクをコードするｇａｇ、ｐｏｌ
およびｅｎｖ遺伝子のほかに、ＨＩＶのゲノムは付加的
なりイルスタン／ぐりをコードするｓｏｒ、ｔａｔ 、
ａｒｔ／ｌｒｓおよび３’−ｏｒｆと称されるいくつ
かの他の読み取り枠を含有する。これらのタン、２りは
ＨＩＶ感染サイクルにおいて重要な調節機能を果してい
ることが知られている。
およびｅｎｖ遺伝子のほかに、ＨＩＶのゲノムは付加的
なりイルスタン／ぐりをコードするｓｏｒ、ｔａｔ 、
ａｒｔ／ｌｒｓおよび３’−ｏｒｆと称されるいくつ
かの他の読み取り枠を含有する。これらのタン、２りは
ＨＩＶ感染サイクルにおいて重要な調節機能を果してい
ることが知られている。
本明細書において用いられる「遺伝子」という用語は特
定のタンパク産生物の発現を特定するＤＮＡ配列情報を
意味する。
定のタンパク産生物の発現を特定するＤＮＡ配列情報を
意味する。
ＨａＳ８１ｔｉｎ６およびＷｏｎｇ−８ｔａａｌおよび
彼等の共同研究者により最初に報告されたように、重要
な調節タンパクであるｔａｔ遺伝子の産生物は、ＨＩＶ
ＬＴＲプロモータ領域に連結された遺伝子配列の発現
の活性化を仲介する（８ｏ、ｄｒｏｓｋｉ等。
彼等の共同研究者により最初に報告されたように、重要
な調節タンパクであるｔａｔ遺伝子の産生物は、ＨＩＶ
ＬＴＲプロモータ領域に連結された遺伝子配列の発現
の活性化を仲介する（８ｏ、ｄｒｏｓｋｉ等。
７４〜７７（１９８５））。ｔａｔタンパクによるこの
遺伝子発現の正コントロールはトランスーアクチベーシ
ョン（ｔｒａｎｓ−ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）と称される
現象の一例である。トランスーアクチベーションとは。
遺伝子発現の正コントロールはトランスーアクチベーシ
ョン（ｔｒａｎｓ−ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）と称される
現象の一例である。トランスーアクチベーションとは。
特定の調節タンパクによる特定の標的遺伝子の発現の正
の調節のことである。
の調節のことである。
正に作用する調節タンパクおよび対応する応各棟的遺伝
子は原核および真核細胞システム、および多くのウィル
スにおいてよく知られている。例えば、ＨＩＶの場合と
同様、多くの他の動物ウィルスは、ウィルス遺伝子発現
を正に調節することが知られているトランスーアクチベ
ータ・タンパクをコードしている。これらのウィルスに
はヘルはスクイルス（例えば単純庖疹ウィルス、サイト
メガロウィルス）、アデノウィルス、バポーバクイルス
（ｐａｐｏｖａｖｉｒｕｓ） （例えばＳＶ４０ 、ポ
リオーマウィルス、ＪＣウィルス）。
子は原核および真核細胞システム、および多くのウィル
スにおいてよく知られている。例えば、ＨＩＶの場合と
同様、多くの他の動物ウィルスは、ウィルス遺伝子発現
を正に調節することが知られているトランスーアクチベ
ータ・タンパクをコードしている。これらのウィルスに
はヘルはスクイルス（例えば単純庖疹ウィルス、サイト
メガロウィルス）、アデノウィルス、バポーバクイルス
（ｐａｐｏｖａｖｉｒｕｓ） （例えばＳＶ４０ 、ポ
リオーマウィルス、ＪＣウィルス）。
白血病レトロウィルス（例えばウシ白血病クイル、Ｃ、
ＨＴＬＶ−１、ＨＴＬＶ−Ｉ［）およびその他のレンチ
ウィルス（Ｌｅｎｔｙｉｒｕｓ） （例えばビナス（ｖ
ｉｓｎａ）フィルス、馬の感染性貧血ウィルス、猿免疫
不全ウィルス）が含まれる。正に作用する調節タンパク
のほか、特定の標的遺伝子の発現を負に調節、すなわち
抑制、することができる、内因性の細胞およびウィルス
の負に作用する調節タンパクの例が知られている。
ＨＴＬＶ−１、ＨＴＬＶ−Ｉ［）およびその他のレンチ
ウィルス（Ｌｅｎｔｙｉｒｕｓ） （例えばビナス（ｖ
ｉｓｎａ）フィルス、馬の感染性貧血ウィルス、猿免疫
不全ウィルス）が含まれる。正に作用する調節タンパク
のほか、特定の標的遺伝子の発現を負に調節、すなわち
抑制、することができる、内因性の細胞およびウィルス
の負に作用する調節タンパクの例が知られている。
ｔａｔによるトランスーアクチベーションに応答するＨ
ＩＶ ＬＴＲ内の配列情報はヌクレオチド−１７と＋５
８（転写開始部位に関連させて番号付けが行われる）の
間に存在する（Ｒｏｓｅｎ等。
ＩＶ ＬＴＲ内の配列情報はヌクレオチド−１７と＋５
８（転写開始部位に関連させて番号付けが行われる）の
間に存在する（Ｒｏｓｅｎ等。
Ｃｅ１ｌ ４１：８１３〜８２５（１９８５）：Ｍｕｅ
ｓｉｎａ等、Ｃｅ１ｌ ４８：６９１〜７０１（１９８
７））。このトランスーアクチペーション標的配列は、
ｔａｔタンパクにより直接認識され得る。ｔａｔによる
ＬＴＲ一連結配列発現の活性化は、 ｍＲＮＡ蓄積の増
加〔Ｃｕ１ｌｅｎ、 Ｃｅ１ｌ ４（Ｓ：９７３〜９Ｂ
２（１９８６） ；Ｇｅｎｄｅｌｍａｎ等、Ｐｒｏｃ、
Ｎａｔｌ。
ｓｉｎａ等、Ｃｅ１ｌ ４８：６９１〜７０１（１９８
７））。このトランスーアクチペーション標的配列は、
ｔａｔタンパクにより直接認識され得る。ｔａｔによる
ＬＴＲ一連結配列発現の活性化は、 ｍＲＮＡ蓄積の増
加〔Ｃｕ１ｌｅｎ、 Ｃｅ１ｌ ４（Ｓ：９７３〜９Ｂ
２（１９８６） ；Ｇｅｎｄｅｌｍａｎ等、Ｐｒｏｃ、
Ｎａｔｌ。
Ａｃａｄ、 ８ｃｉ、 ８３：９７５９〜９７６３（１
９Ｂ６）；Ｗｒｉｇｈｔ等。
９Ｂ６）；Ｗｒｉｇｈｔ等。
５ｃｉｅｎｃｅ ２３４：９８８〜９３４（１９８６）
；Ｐｅｔｅｒｌｉｎ等、 Ｐｒｏｃ。
；Ｐｅｔｅｒｌｉｎ等、 Ｐｒｏｃ。
Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、 ８５：９７３４〜
９７３８（１９８６）：Ｍｕｅｓｉｎｇ等、Ｃｅ１ｌ
４８：６９１〜７０１（１９８７））および場合により
転写後調節（Ｒｏｓｅｎ等、Ｎａｔｕｒｅ ５１９：５
５５〜５５９（１９８６）；Ｃｕ１ｌｅｎ、 Ｃｅ１ｌ
４６：９７５〜９８２（１９８６）：Ｆｅｉｎ−ｂｅ
ｒｇ等、 Ｃｅ１ｌ ４６：８０７〜８１７（１９Ｂ６
））を伴う。機能性ＨＩＶ ｔａｔを発現する一体化さ
れた異種遺伝子（Ｒｏｓｅｎ等、Ｊ、 Ｖｉｒｏｌ、
５７：３７９〜５８４（１９８６） ｐＣｕｌｌｅｎ、
Ｃｅ１ｌ ４６：９７５〜９８２（１９８６））を含
む、またはＨＩＶ ＬＴＲに連結されたクロラムフェニ
コールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）コーディ
ング配列を含む遺伝子［：Ｗｒ ｉ ｇｈ を等、 ５
ｃｉｅｎｃｅ ２３４：９８８〜９９２（１９Ｂ６）：
ｌを含む安定なヒト細胞系の誘導が既に報告されている
。Ｗｒｉｇｈｔ等は、更に、一体化されたＬＴＲ−Ｃａ
ｔ遺伝子が過渡的に導入されたｔａｔ発現遺伝子により
誘導可能であることを示した。しかしながら、 ｔａ
ｔ−発現遺伝子とＬＴＲ一連結インジケータ遺伝子の両
方を含む安定なヒト細胞系の誘導については従来全く報
告されていない。
９７３８（１９８６）：Ｍｕｅｓｉｎｇ等、Ｃｅ１ｌ
４８：６９１〜７０１（１９８７））および場合により
転写後調節（Ｒｏｓｅｎ等、Ｎａｔｕｒｅ ５１９：５
５５〜５５９（１９８６）；Ｃｕ１ｌｅｎ、 Ｃｅ１ｌ
４６：９７５〜９８２（１９８６）：Ｆｅｉｎ−ｂｅ
ｒｇ等、 Ｃｅ１ｌ ４６：８０７〜８１７（１９Ｂ６
））を伴う。機能性ＨＩＶ ｔａｔを発現する一体化さ
れた異種遺伝子（Ｒｏｓｅｎ等、Ｊ、 Ｖｉｒｏｌ、
５７：３７９〜５８４（１９８６） ｐＣｕｌｌｅｎ、
Ｃｅ１ｌ ４６：９７５〜９８２（１９８６））を含
む、またはＨＩＶ ＬＴＲに連結されたクロラムフェニ
コールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）コーディ
ング配列を含む遺伝子［：Ｗｒ ｉ ｇｈ を等、 ５
ｃｉｅｎｃｅ ２３４：９８８〜９９２（１９Ｂ６）：
ｌを含む安定なヒト細胞系の誘導が既に報告されている
。Ｗｒｉｇｈｔ等は、更に、一体化されたＬＴＲ−Ｃａ
ｔ遺伝子が過渡的に導入されたｔａｔ発現遺伝子により
誘導可能であることを示した。しかしながら、 ｔａ
ｔ−発現遺伝子とＬＴＲ一連結インジケータ遺伝子の両
方を含む安定なヒト細胞系の誘導については従来全く報
告されていない。
ｔａｔ−遺伝子産生物はＨＩＶ複製に重要であることが
知られている（Ｄａｙｔｏｎ等、 Ｃｅ１ｌ ４４：９
４１〜９４７（１９８６） ；Ｆｉｓｈｅｒ等、 Ｎａ
ｔｕｒｅ ３２０：３６７〜３７１（１９８（５）”）
。ｔａｔ遺伝子産生物が遺伝子発現を誘導する分子機構
をつきとめることは極めて興味深いことである。ｔａｔ
がＨＩＶライフサイクルの本質的かつウィルス特異的な
成分であることから、 ｔａｔ機能の特異的阻害剤は重
要な抗−ＨＩＶウィルス治療剤である可能性が高い。本
発明は、ＨＩＶ ｔａｔ機能を特異的に妨げる化合物の
迅速スクリーニングおよび確認を可能にするシステムを
提供する。ウィルスを、その哺乳動物宿主に害を与える
ことなく選択的に攻撃できる化合物を確認できるため、
有効かつ無毒性抗−ウイルス剤が得られる潜在的可能性
が提供される。
知られている（Ｄａｙｔｏｎ等、 Ｃｅ１ｌ ４４：９
４１〜９４７（１９８６） ；Ｆｉｓｈｅｒ等、 Ｎａ
ｔｕｒｅ ３２０：３６７〜３７１（１９８（５）”）
。ｔａｔ遺伝子産生物が遺伝子発現を誘導する分子機構
をつきとめることは極めて興味深いことである。ｔａｔ
がＨＩＶライフサイクルの本質的かつウィルス特異的な
成分であることから、 ｔａｔ機能の特異的阻害剤は重
要な抗−ＨＩＶウィルス治療剤である可能性が高い。本
発明は、ＨＩＶ ｔａｔ機能を特異的に妨げる化合物の
迅速スクリーニングおよび確認を可能にするシステムを
提供する。ウィルスを、その哺乳動物宿主に害を与える
ことなく選択的に攻撃できる化合物を確認できるため、
有効かつ無毒性抗−ウイルス剤が得られる潜在的可能性
が提供される。
重要なことに本発明による。 ＨＩＶインヒビターを見
付けるためのシステムは、感染性阻■を含まない簡単で
半自動化された非放射性アツセイを可能にする。更に、
ＨＩＶに対してここで実証された実験手法およびスク
リーニング方法は。
付けるためのシステムは、感染性阻■を含まない簡単で
半自動化された非放射性アツセイを可能にする。更に、
ＨＩＶに対してここで実証された実験手法およびスク
リーニング方法は。
遺伝子発現のその他の特異的な正に作用するまたは負に
作用するレギュレータのインヒビターを見付けるための
その他のウィルスおよびｆｆＩ乳動物細胞システムに適
用することができた。すなわち、ここで実証されたシス
テムは、抗−フィルス治療剤の検索に限らず、他の病的
状態に対する治療剤の検索にも適用することができた。
作用するレギュレータのインヒビターを見付けるための
その他のウィルスおよびｆｆＩ乳動物細胞システムに適
用することができた。すなわち、ここで実証されたシス
テムは、抗−フィルス治療剤の検索に限らず、他の病的
状態に対する治療剤の検索にも適用することができた。
発明の概要
本発明は、２つのタイプの組換え異種遺伝子を宿主ケ゛
ツム中に一体化された状態で含有する遺伝子工学的処理
を受けた安定な哺乳動物細胞系の誘導に関する。第１の
遺伝子は第２の遺伝子の発現を調節できるタンパクを発
現する。その第２の遺伝子は、第１の遺伝子により発現
された調節タンパクに応答する。または該調節タンパク
により認識される標的ＤＮＡ調節配列を含有する。第２
の遺伝子は特定の重要性を有する任意の遺伝子産生物を
コードし発現する。調節タンパクが応答ＤＮＡ配列から
の遺伝子発現に影響する分子機構を詳細に理解する必要
はない。
ツム中に一体化された状態で含有する遺伝子工学的処理
を受けた安定な哺乳動物細胞系の誘導に関する。第１の
遺伝子は第２の遺伝子の発現を調節できるタンパクを発
現する。その第２の遺伝子は、第１の遺伝子により発現
された調節タンパクに応答する。または該調節タンパク
により認識される標的ＤＮＡ調節配列を含有する。第２
の遺伝子は特定の重要性を有する任意の遺伝子産生物を
コードし発現する。調節タンパクが応答ＤＮＡ配列から
の遺伝子発現に影響する分子機構を詳細に理解する必要
はない。
２つのタイプの組換え異種遺伝子（すなわち、１つの遺
伝子はＨ工ｖ ｔａｔ遺伝子産生物を発現し、そして第
２の遺伝子はＨＩＶ ＬＴＥ配列に連結されたコーディ
ング配列１例えばインジケータ・タンパク・コーディン
グ配列を含有する）の一体化されたコピーを含有する安
定なヒト細胞系が誘導された。ＨＩＶ ｔａｔタンパク
を発現させるために、ＨＩＶ ｔａｔコーディング配列
をサルウィルス４０ （５Ｖ４０）初期領域に由来する
転写信号のコントロール下に置いてプラスミドｐＳＶ−
ｔａ ｔを作成した。ＬＴＲ一連結インジケータ遺伝子
は。
伝子はＨ工ｖ ｔａｔ遺伝子産生物を発現し、そして第
２の遺伝子はＨＩＶ ＬＴＥ配列に連結されたコーディ
ング配列１例えばインジケータ・タンパク・コーディン
グ配列を含有する）の一体化されたコピーを含有する安
定なヒト細胞系が誘導された。ＨＩＶ ｔａｔタンパク
を発現させるために、ＨＩＶ ｔａｔコーディング配列
をサルウィルス４０ （５Ｖ４０）初期領域に由来する
転写信号のコントロール下に置いてプラスミドｐＳＶ−
ｔａ ｔを作成した。ＬＴＲ一連結インジケータ遺伝子
は。
細菌クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ
（Ｃａｔ） 、大腸菌β−ガラクトシダーゼ、およびヒ
トＩＬ２ （インターロイキン２）に由来するコーディ
ング配列を用いて構築してそれぞれプラスミドｐＬＴＲ
−ｃａｔ％ｐＬＴＲ−βｇａｌ、およびｐＬＴＲ−ＩＬ
２を作成した。ＨＩＶ ＬＴＲは、ｔａｔタンパクに応
答しそして、ＬＴＲに連結された配列の発現のｔａｔ−
依存性活性化を仲介する配列情報を含んでいることが知
られている。すなわち、ＬＴＲ一連結インジケータ遺伝
子産生物の発現は、ＨＩＶｔａｔ遺伝子産生物に依存し
そして緊密にコントロールされる。ＨＩＶ ＬＴＲおよ
びｔａｔ遺伝子産生物のコントロール下にＣＡＴ 、β
−ガラクトシダーゼまたはＩＬ２を比較的高水準で発現
する安定なヒト ＨｅＬａ−由来細胞系が単離された。
（Ｃａｔ） 、大腸菌β−ガラクトシダーゼ、およびヒ
トＩＬ２ （インターロイキン２）に由来するコーディ
ング配列を用いて構築してそれぞれプラスミドｐＬＴＲ
−ｃａｔ％ｐＬＴＲ−βｇａｌ、およびｐＬＴＲ−ＩＬ
２を作成した。ＨＩＶ ＬＴＲは、ｔａｔタンパクに応
答しそして、ＬＴＲに連結された配列の発現のｔａｔ−
依存性活性化を仲介する配列情報を含んでいることが知
られている。すなわち、ＬＴＲ一連結インジケータ遺伝
子産生物の発現は、ＨＩＶｔａｔ遺伝子産生物に依存し
そして緊密にコントロールされる。ＨＩＶ ＬＴＲおよ
びｔａｔ遺伝子産生物のコントロール下にＣＡＴ 、β
−ガラクトシダーゼまたはＩＬ２を比較的高水準で発現
する安定なヒト ＨｅＬａ−由来細胞系が単離された。
機能性ｔａｔが存在しない場合には、ＨＩＶ ＬＴＲに
より支配されるβ−ガラクトシダーゼまたはＩＬ２の発
現は、本発明の検出限界よりも低い。ＣＡＴは。
より支配されるβ−ガラクトシダーゼまたはＩＬ２の発
現は、本発明の検出限界よりも低い。ＣＡＴは。
機能性ｔａｔが存在しない場合には、 ＨＩＶ ＬＴＲ
から極めて低水準で発現される。すなわち、これら安定
細胞系におけるインジケータ遺伝子の高水準の発現は１
機能性ｔａｔタンパクの存在に依存する。所定の遺伝子
産生物を構成的に発現する安定細胞系を得る４二は、そ
の遺伝子産生物が発現される水準では宿主細胞に対して
致死的でないことが必要である。従って、ＣＡＴ、ＩＬ
２またはβ−ガラクトシダーゼの比較的高水準の発現は
ＨｅＬａ細抱に対して致死的でないことが確認された。
から極めて低水準で発現される。すなわち、これら安定
細胞系におけるインジケータ遺伝子の高水準の発現は１
機能性ｔａｔタンパクの存在に依存する。所定の遺伝子
産生物を構成的に発現する安定細胞系を得る４二は、そ
の遺伝子産生物が発現される水準では宿主細胞に対して
致死的でないことが必要である。従って、ＣＡＴ、ＩＬ
２またはβ−ガラクトシダーゼの比較的高水準の発現は
ＨｅＬａ細抱に対して致死的でないことが確認された。
詳細な説明
哺乳動物細胞のトランスフェクション、生長および選択
曙乳動物細抱系を、グルコースを高濃度で含み１０％仔
牛血清（Ｈａｚｌｅｔｏｎ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ Ｐｒｏ
ｄｕｃｔｓ 。
牛血清（Ｈａｚｌｅｔｏｎ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ Ｐｒｏ
ｄｕｃｔｓ 。
Ｄｅｎｖｅｒ、ＰＡ）を補給したＤｕｌｂｅｃｃｏの改
変された最小Ｅａｇｌｅ培地（Ｄ■■）中で単層として
維持した。
変された最小Ｅａｇｌｅ培地（Ｄ■■）中で単層として
維持した。
細胞を５Ｘ１０５細胞／ ６０１ＩＩＩ組織培養皿とな
るようにプレートし、そして翌日（＝燐酸カルシウム共
沈法［ＧｒａｈａｍとＶａｎ ｄｅｒ Ｅｂ、 Ｖｉｒ
ｏｌｏｇｙ ５２：４５６〜４６７（１９７３）；Ｗｉ
ｇｌｅｒ等、 Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ。
るようにプレートし、そして翌日（＝燐酸カルシウム共
沈法［ＧｒａｈａｍとＶａｎ ｄｅｒ Ｅｂ、 Ｖｉｒ
ｏｌｏｇｙ ５２：４５６〜４６７（１９７３）；Ｗｉ
ｇｌｅｒ等、 Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ。
Ｓｃ１．７６＝１５７５〜１３７６（１９７９）〕を用
いてトランスフェクションした。過渡的研究では、トラ
ンスフェクション後４８時間口に細胞を集めた。
いてトランスフェクションした。過渡的研究では、トラ
ンスフェクション後４８時間口に細胞を集めた。
一体化されたトランスフェクションされたプラスミドＤ
ＮＡのコピーを含む安定な浦乳動物細胞を、 ｐｓｖ２
−ｎｅｏ優性可選択性マーカーおよび抗生物質Ｇ４１８
（Ｇｉｂｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、 Ｇｒａｎ
ｄ ｌ５ｌａｎｄ。
ＮＡのコピーを含む安定な浦乳動物細胞を、 ｐｓｖ２
−ｎｅｏ優性可選択性マーカーおよび抗生物質Ｇ４１８
（Ｇｉｂｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、 Ｇｒａｎ
ｄ ｌ５ｌａｎｄ。
Ｎｙ）に対する抵抗性を指標とする選択を用いて誘導し
た（ＳｏｕｔｈｅｒｎとＢｅｒｇ、 Ｊ、 Ｍｏ１．
Ａｐｐｌ、。
た（ＳｏｕｔｈｅｒｎとＢｅｒｇ、 Ｊ、 Ｍｏ１．
Ａｐｐｌ、。
Ｇｅｎｅｔ、 Ｇ３２７〜３４１（１９８２）；Ｃｏ１
ｂｅｒｅ−Ｃ）ａｒａｐｉｎ等、ＪｌＭｏｌ、 Ｂｉｏ
ｌ、 １５０：１−４（１９８１）］。プラスミドｐｓ
Ｖ２−ｎｅｏはＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕ１ｔ
ｕｒｅ Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、
ＭＤ）から得た。トランスフェクション稜２４時間目
に、各６０罪培養皿中の細胞を６個の１００ｍ培養皿に
分けた。トランスフェクション後４８時間口に、細胞を
０４１８（６ｆ）０μｇ／ｍｌ ）含有完全培地に入れ
た。選択培地中で１０〜１４日間生長後、０４１８選択
Ｉａ胞コロニーをクローニング・シリンダーを用いてプ
ールするか単離した。生長の続く間、細胞を０４１８含
有培地中に維持した。
ｂｅｒｅ−Ｃ）ａｒａｐｉｎ等、ＪｌＭｏｌ、 Ｂｉｏ
ｌ、 １５０：１−４（１９８１）］。プラスミドｐｓ
Ｖ２−ｎｅｏはＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕ１ｔ
ｕｒｅ Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、
ＭＤ）から得た。トランスフェクション稜２４時間目
に、各６０罪培養皿中の細胞を６個の１００ｍ培養皿に
分けた。トランスフェクション後４８時間口に、細胞を
０４１８（６ｆ）０μｇ／ｍｌ ）含有完全培地に入れ
た。選択培地中で１０〜１４日間生長後、０４１８選択
Ｉａ胞コロニーをクローニング・シリンダーを用いてプ
ールするか単離した。生長の続く間、細胞を０４１８含
有培地中に維持した。
プラスミドの構築
Ｍａｎｉａｔｉｓ等ｌＭｏ１ｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉ
ｎｇ：Ａ ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｌａｓｕｍｉｄ、Ｃ
ｏ１ｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔ
ｏｒｙ、 ＮｅｗＹｏｒｋ（１９８２）に記載されてい
るような標準的方法を用いてプラスミドの構築を行った
。前記文献の教示を本明細書の記載の一部として含める
こととする。プラスミド構築）二用いられる酵素および
その他の試薬は、Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ
″Ｌａｂ−ｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕ
ｒｇ、 ＭＤ）またはＮｅｗ Ｅｎｇ−１ａｎｄ Ｂｉ
ｏｌａｂｓ（Ｂ６ｖ６ｒｌｙ、 ＭＡ）から得た。本発
明に用いられる各種ヌクレオチド配列を消化し、同定し
、回収し、および精製する方法は、それら配列をベクタ
ー中に連結し、宿主微生物株を形質転換し、クローン化
し、そして合成生成物を回収する方法として当業者に知
られている。
ｎｇ：Ａ ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｌａｓｕｍｉｄ、Ｃ
ｏ１ｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔ
ｏｒｙ、 ＮｅｗＹｏｒｋ（１９８２）に記載されてい
るような標準的方法を用いてプラスミドの構築を行った
。前記文献の教示を本明細書の記載の一部として含める
こととする。プラスミド構築）二用いられる酵素および
その他の試薬は、Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ
″Ｌａｂ−ｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕ
ｒｇ、 ＭＤ）またはＮｅｗ Ｅｎｇ−１ａｎｄ Ｂｉ
ｏｌａｂｓ（Ｂ６ｖ６ｒｌｙ、 ＭＡ）から得た。本発
明に用いられる各種ヌクレオチド配列を消化し、同定し
、回収し、および精製する方法は、それら配列をベクタ
ー中に連結し、宿主微生物株を形質転換し、クローン化
し、そして合成生成物を回収する方法として当業者に知
られている。
従って、それらの方法は、後述される本発明の特定の態
様に関連して記載する（＝とどめる。
様に関連して記載する（＝とどめる。
プラスミドｐｓＶ２−ｃａｔは、ＳＶ４０初期プロモー
ターおよびポリアデニル化信号の転写コントロール下に
置かれた細菌クロラムフェニコールアセチルトランスフ
ェラーゼ（ｃｕｔ）コーディング配列を含有する［ｏｏ
ｒｍａｎ等、捧已エユリ」１里玉。
ターおよびポリアデニル化信号の転写コントロール下に
置かれた細菌クロラムフェニコールアセチルトランスフ
ェラーゼ（ｃｕｔ）コーディング配列を含有する［ｏｏ
ｒｍａｎ等、捧已エユリ」１里玉。
２：１０４４〜１０５１ （１９８２）〕。プラスミド
ｐＣＨ１１０においては、太陽菌由来β−ガラクトシダ
ーゼコーディング配列を、同じ＜ ＳＶ４０初期転写コ
ントロール下に置＜（Ｈａｌｌ等、Ｊ、 Ｍｏｌ、 Ａ
ｐｐｌ、（）ｅｎｅｔ、２：１０１〜１０９（１９８７
Ｉ） ）。ｐｓＶ、）−ｃａｔおよびｐｃＨｌｌｏは、
Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕ１ｔｕｒｅ Ｃｏ１
１ｅｃｔｉｏｎおよびＰｈａ−ｒｍａｃｉａ（Ｐｉｓｃ
ａｔａｗａｙ、 ＮＪ）からそれぞれ得た。全体にわた
り、 ｐｓＶ２−ＣＩ！ＬｔおよびｐｃＨｌｌ ［１を
それぞれｐｓＶ−ｃａｔおよびｐｓＶ−βｇａｌと呼ぶ
。
ｐＣＨ１１０においては、太陽菌由来β−ガラクトシダ
ーゼコーディング配列を、同じ＜ ＳＶ４０初期転写コ
ントロール下に置＜（Ｈａｌｌ等、Ｊ、 Ｍｏｌ、 Ａ
ｐｐｌ、（）ｅｎｅｔ、２：１０１〜１０９（１９８７
Ｉ） ）。ｐｓＶ、）−ｃａｔおよびｐｃＨｌｌｏは、
Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕ１ｔｕｒｅ Ｃｏ１
１ｅｃｔｉｏｎおよびＰｈａ−ｒｍａｃｉａ（Ｐｉｓｃ
ａｔａｗａｙ、 ＮＪ）からそれぞれ得た。全体にわた
り、 ｐｓＶ２−ＣＩ！ＬｔおよびｐｃＨｌｌ ［１を
それぞれｐｓＶ−ｃａｔおよびｐｓＶ−βｇａｌと呼ぶ
。
プラスミドｐ５’ＬＴＲ−ｃａｔは、ｐｓＶ−ｃａｔか
ら、Ｓ■４０ａ！製開始領域を含む２５９塩基対Ｐｖｕ
ＩＩ −Ｈ１ｎｄｍ断片を生物活性プロフィルスフロ
ーンｐＨＸＢ２ｇｐｔ （これはＡ、 Ｆｉｓｈｅｒ氏
（ＮＩＨ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ。
ら、Ｓ■４０ａ！製開始領域を含む２５９塩基対Ｐｖｕ
ＩＩ −Ｈ１ｎｄｍ断片を生物活性プロフィルスフロ
ーンｐＨＸＢ２ｇｐｔ （これはＡ、 Ｆｉｓｈｅｒ氏
（ＮＩＨ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ。
ＭＤ）から得た）からの６５０塩基対Ｈｐａ ｌ −Ｈ
ｌｎｄ ｍ ５’ ＬＴＲ−含有ＤＮＡ断片で置き換え
ることにより誘導した（Ｆｉｓｈｅｒ等、Ｎａｔｕｒｅ
３２０：３６７〜３７１ （１９８６））。同様にし
てプラスミドｐ３’ＬＴＲ−ｃａｔは、ｐＨＸＢ２ｇｐ
ｔからの７２０壇基対Ｘｈｏ １−Ｈｌｎｄ ■３’Ｌ
ＴＲ−含有ＤＮＡ断片を用いて構築した。
ｌｎｄ ｍ ５’ ＬＴＲ−含有ＤＮＡ断片で置き換え
ることにより誘導した（Ｆｉｓｈｅｒ等、Ｎａｔｕｒｅ
３２０：３６７〜３７１ （１９８６））。同様にし
てプラスミドｐ３’ＬＴＲ−ｃａｔは、ｐＨＸＢ２ｇｐ
ｔからの７２０壇基対Ｘｈｏ １−Ｈｌｎｄ ■３’Ｌ
ＴＲ−含有ＤＮＡ断片を用いて構築した。
Ｘｈｏ １部位は連結に先立ちクレノワ（Ｋｌｅｎｏｗ
）反応により平滑末端に変えた。
）反応により平滑末端に変えた。
プラスミドｐＬＴＲ−βｇａｌは、ｐ５’ＬＴＲ−ｃａ
ｔからのｃａｔコーディング配列を含有するＨｌｎｄ
１−Ｂａ址Ｉ断片をｐｓＶ−βｇａｌからのＨｌｎｃｌ
ｍ−ＢａｍＨＩβｇａｌ含有セグメントで置き換える
ことにより構築した。
ｔからのｃａｔコーディング配列を含有するＨｌｎｄ
１−Ｂａ址Ｉ断片をｐｓＶ−βｇａｌからのＨｌｎｃｌ
ｍ−ＢａｍＨＩβｇａｌ含有セグメントで置き換える
ことにより構築した。
プラスミドｐＳＶ−ｔａｔは、ｐｓＶ−Ｃａｔから、
Ｈｌｎｄ［−Ｈｐａ ｌ ｃａｔ含有断片をｐＨＸＢ２
ｇｐｔからのＨＩＶ ｔａｔコーディング配列を含有
する２６２８塩基対Ｓａ１１−ＢａｍＨｌ断片で置き換
えることにより誘導した。
Ｈｌｎｄ［−Ｈｐａ ｌ ｃａｔ含有断片をｐＨＸＢ２
ｇｐｔからのＨＩＶ ｔａｔコーディング配列を含有
する２６２８塩基対Ｓａ１１−ＢａｍＨｌ断片で置き換
えることにより誘導した。
連結（＝先立ち、Ｓａｌ ｒ部位はＨｉｎｄ ［１ｌ−
８ａｌ Ｉオリゴヌクレオチドリンカーを用いてＨ１ｎ
ｄ１部位に変え、またＢａｍＨ１部位はクレノク反応に
より平滑末端に変えた。
８ａｌ Ｉオリゴヌクレオチドリンカーを用いてＨ１ｎ
ｄ１部位に変え、またＢａｍＨ１部位はクレノク反応に
より平滑末端に変えた。
プラスミドｐＬＴＲ−ＩＬ２は、ｐ３’ＬＴＲ−ｃａｔ
から。
から。
Ｈｌｎｄ ｌ１ｌ−Ｈｐａ ｌ ｃａｔ含有セグメント
を、プラスミドｐＹ３からのヒト ＩＬ２コーディング
配列を含有する４００塩基対Ｒｓａ ■−８ｔｕ ｌ断
片で置き換えることにより誘導した。プラスミドｐＹ３
は、ヒトＩＬ２ ｃＤＮＡを含有し、またに、Ｌｉｖａ
ｋ氏（Ｄｕ ｐｏｎｔＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ５ｔ
ａｔｉｏｎ ％Ｗｉ１ｍｉｎｇｔｏｎ 、 ＤＥ）から
得た。ｐＹ３におけるＩＬ２コーディング配列は。
を、プラスミドｐＹ３からのヒト ＩＬ２コーディング
配列を含有する４００塩基対Ｒｓａ ■−８ｔｕ ｌ断
片で置き換えることにより誘導した。プラスミドｐＹ３
は、ヒトＩＬ２ ｃＤＮＡを含有し、またに、Ｌｉｖａ
ｋ氏（Ｄｕ ｐｏｎｔＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ５ｔ
ａｔｉｏｎ ％Ｗｉ１ｍｉｎｇｔｏｎ 、 ＤＥ）から
得た。ｐＹ３におけるＩＬ２コーディング配列は。
Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ等、Ｎａｔｕｒｅ 王：３０５〜３
１０（１９８３）により報告されたものと同一である。
１０（１９８３）により報告されたものと同一である。
クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼおよ
びβ−ガラクトシダーゼのアッセイ１ ｍＭ ＥＤＴＡ
（ＰＢＳ中）を用いて細胞を６０鶴培養プレートから取
り出し、はレット化し、そして−７０℃で貯蔵するかま
たは直ちにアッセイした。細胞バレットを２５０ｍＭス
クロース、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｊ（ｐｔ（７，４
）、１０ ｍＭ ＥＤＴＡを含有する５０μノに懸濁し
、次いで凍結融解サイクルを３回繰り返し、そして遠心
分離により細胞破片を除去することにより細胞溶解液を
調製した。
びβ−ガラクトシダーゼのアッセイ１ ｍＭ ＥＤＴＡ
（ＰＢＳ中）を用いて細胞を６０鶴培養プレートから取
り出し、はレット化し、そして−７０℃で貯蔵するかま
たは直ちにアッセイした。細胞バレットを２５０ｍＭス
クロース、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｊ（ｐｔ（７，４
）、１０ ｍＭ ＥＤＴＡを含有する５０μノに懸濁し
、次いで凍結融解サイクルを３回繰り返し、そして遠心
分離により細胞破片を除去することにより細胞溶解液を
調製した。
Ｇｏｒｍａｎ等、Ｍｏｌ、 Ｃｅ１ｌ Ｂｉｏｌ、 ２
：１０４４〜１０５１（１９８２）に従って細胞溶解液
のクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（
ＣＡＴ）活性をアッセイした。アセチル型へのクロラム
フェニコールの転化をシリカゲル薄層グロマトグラフイ
およびプレートから取り出したスポットの液体シンチレ
ーション計数により定量した。
：１０４４〜１０５１（１９８２）に従って細胞溶解液
のクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（
ＣＡＴ）活性をアッセイした。アセチル型へのクロラム
フェニコールの転化をシリカゲル薄層グロマトグラフイ
およびプレートから取り出したスポットの液体シンチレ
ーション計数により定量した。
β−ガラクトシダーゼアッセイは、 （Ｐｈａｒｍａｃ
ｉａＡｎａｌｅｃｔｓ Ｎｅｖｒｓｌｅｔｔｅｒ、 ｖ
ｏｌ、 １４． Ｊｉ ２ ） Ｅ記載されている如く
に行った。相対的ＣＡＴまたはβ−ガラクトンダーゼ活
性を測定するために、初期反応速度を測定しくすなわち
、生成物の形成はアッセイされる細胞抽出液量およびア
ッセイ・インキュ（−ジョン時開に比例した）、そして
各アッセイを細胞抽出液量およびアッセイ・インキュベ
ーション時間に対して規格化した。
ｉａＡｎａｌｅｃｔｓ Ｎｅｖｒｓｌｅｔｔｅｒ、 ｖ
ｏｌ、 １４． Ｊｉ ２ ） Ｅ記載されている如く
に行った。相対的ＣＡＴまたはβ−ガラクトンダーゼ活
性を測定するために、初期反応速度を測定しくすなわち
、生成物の形成はアッセイされる細胞抽出液量およびア
ッセイ・インキュ（−ジョン時開に比例した）、そして
各アッセイを細胞抽出液量およびアッセイ・インキュベ
ーション時間に対して規格化した。
ＩＬ２のアッセイ
細胞培地の分泌ＩＬ２を直接アッセイし、またＩＬ２−
依存性マクス細胞系ＣＴＬＬを用いて行った〔例えばＲ
ｏｂｂ、 Ｍｏｔｈ、 Ｅｎｚｙｍｏｌ、 １１６：４
９３〜５２５（１９８５）参照〕。精製ヒトＪｕｒｋａ
ｔ細胞由来ＩＬ２゛は、ここで行われたアッセイを用い
ると約５００単位／ｐｇの比活性を有する（Ｌ、 Ｂｒ
ｅｔｈ 、 Ｄｕ ＰｏｎｔＧｒａｓｇｏｗ ５ｉｔｅ
、 ＤＢ）。
依存性マクス細胞系ＣＴＬＬを用いて行った〔例えばＲ
ｏｂｂ、 Ｍｏｔｈ、 Ｅｎｚｙｍｏｌ、 １１６：４
９３〜５２５（１９８５）参照〕。精製ヒトＪｕｒｋａ
ｔ細胞由来ＩＬ２゛は、ここで行われたアッセイを用い
ると約５００単位／ｐｇの比活性を有する（Ｌ、 Ｂｒ
ｅｔｈ 、 Ｄｕ ＰｏｎｔＧｒａｓｇｏｗ ５ｉｔｅ
、 ＤＢ）。
図面および表についての説明
第１図： ＨＩＶ ’ｔａｔ遺伝子産生物によるＨＩＶ
ＬＴＲのトランスセアクチベーションを実証するため
に用いられるシステムの概略図である。２つのタイプの
異種遺伝子がヒト細胞中に移されている。すなわち、第
１の遺伝子（ｅＶ−ｔａｔ）はＨＩＶ ｔａｔ遺伝子産
生物（ＴＡＴ ）を発現し、１そして第２の遺伝子は、
ＨＩｖＬＴＲに連結されたインジケータ・タンパクコー
ディング配列（Ｔ圧ｃａｔ 、 ＬＴＲ−βｇａｌまた
はＬＴＦＩ−■Ｌ２ ）を含有する。
ＬＴＲのトランスセアクチベーションを実証するため
に用いられるシステムの概略図である。２つのタイプの
異種遺伝子がヒト細胞中に移されている。すなわち、第
１の遺伝子（ｅＶ−ｔａｔ）はＨＩＶ ｔａｔ遺伝子産
生物（ＴＡＴ ）を発現し、１そして第２の遺伝子は、
ＨＩｖＬＴＲに連結されたインジケータ・タンパクコー
ディング配列（Ｔ圧ｃａｔ 、 ＬＴＲ−βｇａｌまた
はＬＴＦＩ−■Ｌ２ ）を含有する。
遺伝子転移の後、インジケータ遺伝子産生物（ＣＡＴ、
βｇａｌまたはＩＬ２）の発現を定量する。
βｇａｌまたはＩＬ２）の発現を定量する。
第１表：過渡的発現アッセイにおける、ＨＩＶＬＴＲｔ
一連結されたインジケータ遺伝子の発現のＨＩＶ ｔａ
ｔ−依存性誘導を示す０ＨｅＬａ細胞をＳ己載のプラス
ミドでトランスフェクションし、そして細胞溶解液を遺
伝子転移後４８時間目（＝調製した。トランスフェクシ
ョンは６０ｗｍ培養プレート１個あたり全部で１０〜１
５μｇのＤＮＡを含有した。（超音波処理サケ精子ＤＮ
Ａな担体として用いた）。各トランスフェクションに用
いたプラスミドＤＮ人量は次のとおりである： Ａ）
５ μｇ ｐｓＶ−ｃａｔまたはｐＬＴＲ−ｃａｔ 、
５ｐｇ ｐｓＶ−ｔａｔ 、および１０μｇ総ＤＮＡ；
Ｂ） ５ μｇｐＬＴＲ−ＩＬ２．１０ ｔｓｇ ｐｓ
Ｖ−ｔａｔ 、および１５μｇ総ＤＮＡ；Ｃ） ５ ｐ
ｇ ｐＬＴＲ−βｇａｌ 、１０ ｐｇ ｐｓＶ−ｔａ
ｔ。
一連結されたインジケータ遺伝子の発現のＨＩＶ ｔａ
ｔ−依存性誘導を示す０ＨｅＬａ細胞をＳ己載のプラス
ミドでトランスフェクションし、そして細胞溶解液を遺
伝子転移後４８時間目（＝調製した。トランスフェクシ
ョンは６０ｗｍ培養プレート１個あたり全部で１０〜１
５μｇのＤＮＡを含有した。（超音波処理サケ精子ＤＮ
Ａな担体として用いた）。各トランスフェクションに用
いたプラスミドＤＮ人量は次のとおりである： Ａ）
５ μｇ ｐｓＶ−ｃａｔまたはｐＬＴＲ−ｃａｔ 、
５ｐｇ ｐｓＶ−ｔａｔ 、および１０μｇ総ＤＮＡ；
Ｂ） ５ μｇｐＬＴＲ−ＩＬ２．１０ ｔｓｇ ｐｓ
Ｖ−ｔａｔ 、および１５μｇ総ＤＮＡ；Ｃ） ５ ｐ
ｇ ｐＬＴＲ−βｇａｌ 、１０ ｐｇ ｐｓＶ−ｔａ
ｔ。
および１５ μｇＩｖＤＮＡ 。
第２表：過渡的アッセイにおける、異なる生物種からの
細胞タイプでのｖＬＴＲ−ｃａｔからのＣＡＴ発現のＨ
ＩＶ ｔａｔ−依存性誘導を示す。哺乳動物細胞を記載
のプラスミドでトランスフェクションシ、そして遺伝子
転移後４８時間目に細胞溶解液を調製した。トランスフ
ェクションは６０ＩＩＩＩ培養プレ一ト１個あたり全部
で７μｇのＤＮＡを含有した（超音波処理サケ精子Ｉ）
ＮＡを担体として使用）。各トランスフェクションに用
いたプラスミドＤＮＡの量は次のとおりである： ２
μｇ ｐｓＶ−ｃａｔ 、 ２１１ｇ ｐＬＴＲ−Ｃａ
Ｚおよび５μｇ ｐＥＩＶ−ｔａｔ ６ ）ランスフエ
クションされた細胞培養液中のＣＡＴ活性を定量し、そ
して、 ｐＬＴＲ−ｃａｔまたはｐｓＶ−Ｃａｔでトラ
ンスフェクションされた同タイプの細胞において発現さ
れたＣＡＴしにルに対して、またはｐＳＶ−ｃａｔでト
ランスフェクションされたＨｅＬａ細胞において発現さ
れたＣＡＴレベルに対して正規化した。使用された細胞
系の給源は次のとおりである： Ｎ１）Ｉ３Ｔ３ 、Ｃ
ＨＯ、およびＨｅＬａ（ＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅ Ｃ
ｕ１ｔｕｒｅ Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ） ；ＰＫ（Ｍ、
Ｗｈｅａｌｙ 、 Ｄｕｐｏｎｔ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎ
ｔａｌ ５ｔａｔｉｏｎ 、 Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ
。
細胞タイプでのｖＬＴＲ−ｃａｔからのＣＡＴ発現のＨ
ＩＶ ｔａｔ−依存性誘導を示す。哺乳動物細胞を記載
のプラスミドでトランスフェクションシ、そして遺伝子
転移後４８時間目に細胞溶解液を調製した。トランスフ
ェクションは６０ＩＩＩＩ培養プレ一ト１個あたり全部
で７μｇのＤＮＡを含有した（超音波処理サケ精子Ｉ）
ＮＡを担体として使用）。各トランスフェクションに用
いたプラスミドＤＮＡの量は次のとおりである： ２
μｇ ｐｓＶ−ｃａｔ 、 ２１１ｇ ｐＬＴＲ−Ｃａ
Ｚおよび５μｇ ｐＥＩＶ−ｔａｔ ６ ）ランスフエ
クションされた細胞培養液中のＣＡＴ活性を定量し、そ
して、 ｐＬＴＲ−ｃａｔまたはｐｓＶ−Ｃａｔでトラ
ンスフェクションされた同タイプの細胞において発現さ
れたＣＡＴしにルに対して、またはｐＳＶ−ｃａｔでト
ランスフェクションされたＨｅＬａ細胞において発現さ
れたＣＡＴレベルに対して正規化した。使用された細胞
系の給源は次のとおりである： Ｎ１）Ｉ３Ｔ３ 、Ｃ
ＨＯ、およびＨｅＬａ（ＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅ Ｃ
ｕ１ｔｕｒｅ Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ） ；ＰＫ（Ｍ、
Ｗｈｅａｌｙ 、 Ｄｕｐｏｎｔ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎ
ｔａｌ ５ｔａｔｉｏｎ 、 Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ
。
ＤＥ）； Ｌ （Ｍ＋Ｌｉｎｎ 、Ｄｕ Ｐｏｎｔ Ｅ
ｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌＳｔａｔｉｏｎ 、 Ｗｉｌｍ
ｉｎｇｔｏｎ 、 ＤＩ’ｍ）。
ｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌＳｔａｔｉｏｎ 、 Ｗｉｌｍ
ｉｎｇｔｏｎ 、 ＤＩ’ｍ）。
第６表： ＨＩＶ ＬＴＲおよびＨＩＶ ｔａｔ遺伝子
産生物のコントロール下で機能性分泌ＩＬ２を発現する
安定なヒト細胞系の誘導。ＨｅＬａ細胞を記載のプラス
ミド（６０鵡培養プレ一ト１個あたり０．５ μｇ ｐ
ｓｉ−ｎｅｏ 、５ μｇ ｐＬＴＲ−ＩＬ２ 、１０
ｐｇｐ８Ｖ−ｔａｔ 、１６ μｇ ｖｇＤＮＡ）で
トランスフェクションし、そして０４１８中での生長で
選択した。
産生物のコントロール下で機能性分泌ＩＬ２を発現する
安定なヒト細胞系の誘導。ＨｅＬａ細胞を記載のプラス
ミド（６０鵡培養プレ一ト１個あたり０．５ μｇ ｐ
ｓｉ−ｎｅｏ 、５ μｇ ｐＬＴＲ−ＩＬ２ 、１０
ｐｇｐ８Ｖ−ｔａｔ 、１６ μｇ ｖｇＤＮＡ）で
トランスフェクションし、そして０４１８中での生長で
選択した。
０４１８で選択された細胞コロニーをプールするかまた
は個別にクローン化した後分泌ＩＬ２をアッセイした。
は個別にクローン化した後分泌ＩＬ２をアッセイした。
第４表： ＨＩＶ ＬＴＲおよびＨＩＶ ｔａｔ遺伝子
産生物のコントロール下で機能性β−ガラクトシダーゼ
を発現する安定なＨｅＬａ細施系の誘導。ＨｅＬａ細胞
を記載のプラスミド（６０龍培養プレ一ト１個あたり、
０．５ ｔｔｇ ｐｓＶ−ｎｅｏ、５ ｔｔｇ ｐＬ
ＴＲ−βｇａｌ 、 １５ ｐｇ ｐｓｖ−ｔａｔ 、
１６ ｔｔｇ総ＤＮＡ ）でトランスフェクションし
、そして０４１８の存在下での生長を選択した。０４１
８で選択された細胞のコロニーをプールし、そして個々
にクローン化した後、β−ガラクトシダーゼをアッセイ
した（第２欄）。貯留されまたはクローン化された、０
４１８で選択された細胞の一部をｔａｔ−発現性ｐｓＶ
−ｔａｔプラスミドの過渡的導入により、ｔａｔ−誘導
性β−ガラクトシダーゼすなわちｔａｔ−誘導性ＬＴＲ
−βｇａｌ遺伝子について分析した。ｐｓＶ−ｔａｕの
遺伝子転移後４８時間目に、細胞のβ−ガラクトシダー
ゼ活性を分析した（第６欄）。プールされまたはクロ−
ン化された０４１８で選択された細胞の一部の機能性ｔ
ａｔ遺伝子産生物を過渡的にｐＬＴＲ−ｃａ ｔインジ
ケータ遺伝子を導入することにより分析した。ｐＬＴＲ
−ｃａｔの遺伝子転移後４８時時間−細胞のＣＡＴ活性
を測定した（第４欄）。ｔａｔ活性は、 ｐＬＴＲ−ｃ
ａｔからのＣＡＴの発現水準に対応した任意の単位で表
現される。
産生物のコントロール下で機能性β−ガラクトシダーゼ
を発現する安定なＨｅＬａ細施系の誘導。ＨｅＬａ細胞
を記載のプラスミド（６０龍培養プレ一ト１個あたり、
０．５ ｔｔｇ ｐｓＶ−ｎｅｏ、５ ｔｔｇ ｐＬ
ＴＲ−βｇａｌ 、 １５ ｐｇ ｐｓｖ−ｔａｔ 、
１６ ｔｔｇ総ＤＮＡ ）でトランスフェクションし
、そして０４１８の存在下での生長を選択した。０４１
８で選択された細胞のコロニーをプールし、そして個々
にクローン化した後、β−ガラクトシダーゼをアッセイ
した（第２欄）。貯留されまたはクローン化された、０
４１８で選択された細胞の一部をｔａｔ−発現性ｐｓＶ
−ｔａｔプラスミドの過渡的導入により、ｔａｔ−誘導
性β−ガラクトシダーゼすなわちｔａｔ−誘導性ＬＴＲ
−βｇａｌ遺伝子について分析した。ｐｓＶ−ｔａｕの
遺伝子転移後４８時間目に、細胞のβ−ガラクトシダー
ゼ活性を分析した（第６欄）。プールされまたはクロ−
ン化された０４１８で選択された細胞の一部の機能性ｔ
ａｔ遺伝子産生物を過渡的にｐＬＴＲ−ｃａ ｔインジ
ケータ遺伝子を導入することにより分析した。ｐＬＴＲ
−ｃａｔの遺伝子転移後４８時時間−細胞のＣＡＴ活性
を測定した（第４欄）。ｔａｔ活性は、 ｐＬＴＲ−ｃ
ａｔからのＣＡＴの発現水準に対応した任意の単位で表
現される。
第２図：１２−８細胞の生長およびβ−ガラクトシダー
ゼ発現に対するマイトマイシンＣの作用。９６−ウェル
式マイクロタイター・プレトにおいて、 ＨｅＬａ由来
クローン１２−８細胞（第５図参照）を５Ｘ１０５細胞
／クエルに接種した。
ゼ発現に対するマイトマイシンＣの作用。９６−ウェル
式マイクロタイター・プレトにおいて、 ＨｅＬａ由来
クローン１２−８細胞（第５図参照）を５Ｘ１０５細胞
／クエルに接種した。
接種後１日経過時に培地を各種濃度のマイトマイシンＣ
を含有する培地で置き換えた。接種後１日経過時に細胞
の生長およびβ−ガラクトシダーゼをアッセイした。
を含有する培地で置き換えた。接種後１日経過時に細胞
の生長およびβ−ガラクトシダーゼをアッセイした。
実施例 １
トランジェント・アッセイにおける。 ＬＴＲ一連結遺
伝子発現のｔａｔ介在トランスアクテベーションの実証 ｐＥ３Ｖ−ｔａ ｔから発現されたｔａｔ遺伝子産生物
のＬＴＲ一連結Ｃａｔ 、β−ガラクトシダーゼおよび
ＩＬ２の発現をトランスアクチベートする能力をトラン
ジェントなトランスフェクションおよび発現アッセイに
より分析した。これらのアッセイは、様々な組合せのプ
ラスミドをＨｅＬａ細胞に遺伝子転移またはトランスフ
ェクションさせ、そして遺伝子転移後４８時時間−発現
されたインジケータ遺伝子産生物の水準を定量すること
より成る。使用条件の下では、標的細胞のうち約５チが
、トランスフェクションされたプラスミドＤＮＡ中に存
在する遺伝子を吸収し機能的に発現するものと期待され
る。しかしながら、トランスフェクションされ、発現さ
れたＤＮＡは宿主ゲノム中に必ずしも安定に一体化され
ていない。実際トランスフェクションされたＤＮＡが安
定に一体化および発現される頻度は、相当に低い（標的
ＨｅＬａ＃胞の約０．１％）。そこで、遺伝子転移後４
８時時間−遺伝子発現アッセイは、過渡的発現アッセイ
と称される。
伝子発現のｔａｔ介在トランスアクテベーションの実証 ｐＥ３Ｖ−ｔａ ｔから発現されたｔａｔ遺伝子産生物
のＬＴＲ一連結Ｃａｔ 、β−ガラクトシダーゼおよび
ＩＬ２の発現をトランスアクチベートする能力をトラン
ジェントなトランスフェクションおよび発現アッセイに
より分析した。これらのアッセイは、様々な組合せのプ
ラスミドをＨｅＬａ細胞に遺伝子転移またはトランスフ
ェクションさせ、そして遺伝子転移後４８時時間−発現
されたインジケータ遺伝子産生物の水準を定量すること
より成る。使用条件の下では、標的細胞のうち約５チが
、トランスフェクションされたプラスミドＤＮＡ中に存
在する遺伝子を吸収し機能的に発現するものと期待され
る。しかしながら、トランスフェクションされ、発現さ
れたＤＮＡは宿主ゲノム中に必ずしも安定に一体化され
ていない。実際トランスフェクションされたＤＮＡが安
定に一体化および発現される頻度は、相当に低い（標的
ＨｅＬａ＃胞の約０．１％）。そこで、遺伝子転移後４
８時時間−遺伝子発現アッセイは、過渡的発現アッセイ
と称される。
かかる過渡的トランスフェクションおよび発現アッセイ
の結果を第１表に示す。
の結果を第１表に示す。
第１表
Ａ。
担体 ０ １９５ ２０ ０ＳＶ−ｃａｔ
Ｏ，７２３０２，５７６ＬＴＲ−ｃａｔ
Ｏ，２８１９５２０１ＳＶ−ｔａｔ Ｏ１
９５２００ＬＴＲ−ｃａｔ ＋ ５Ｖ−ｔａｔ ３０．
２ ３０ ２．５ ５６００ＬＴＲ−ＩＬ２
＜０．Ｄ ＩＬＴＲ−工Ｌ２
＋５Ｖ−ｔａｔ ５ＬＴＲ−ｃａｔ
＜ ０． ＯＩＬＴＲ−Ｃａｔ
＋ ＳＶ−ｔａｔ ＜ ０．０１Ｊｕｒｋａ
ｔ ５〜’２５単位ＩＬ２／ｄ／１０’細胞り、０１〜
Ｑ、０８μｇ ＩＬ２／ｄ／１０６細胞Ｃ６ 担体 １０１８０α０１！１ １．６ＬＴＲ−βｇａ
ｌ １０ １８０ ０．０１０ １．
２ｅＶ−ｔａｔ １０ １８０ ０
．０１０ １．２ＬＴＲ−βｇａｌ＋ｓ’Ｖ−ｔａ
ｔ １０ １０ Ｑ、７９７ １７７０ｐＬＴＲ−
ｃａｔの場合、ｃｕｔ発現のｔ４を一依存性誘導は約５
６００倍である。ＣＡＴアッセイは、非誘導ＬＴＲ−Ｃ
ａ を遺伝子からのＣＡＴ検出を可能とするのに十分な
感度を有している。ｐＬＴＲ−ＩＬ２およびｐＬＴＲ−
βｇａｌの場合には、ＩＬ２またはβ−ガラクトシダー
ゼの発現の非誘導時水準は検出限界よりも低い。ｔａｔ
が存在する場合には、著しく増大したレベルのＩＬ２お
よびβ−ガラクトシダーゼがｐＬＴＲ−ＩＬ２およびｐ
ＬＴＲ−βｇａｌからそれぞれ発現される。ＨｅＬａ細
胞におけるＬ’ｒＲ−ＩＬ２およびＬＴＲ−βｇａｌの
ｔａｔ−依存性誘導は、それぞれ５００倍または１７７
０倍よりも大であると測定される。
Ｏ，７２３０２，５７６ＬＴＲ−ｃａｔ
Ｏ，２８１９５２０１ＳＶ−ｔａｔ Ｏ１
９５２００ＬＴＲ−ｃａｔ ＋ ５Ｖ−ｔａｔ ３０．
２ ３０ ２．５ ５６００ＬＴＲ−ＩＬ２
＜０．Ｄ ＩＬＴＲ−工Ｌ２
＋５Ｖ−ｔａｔ ５ＬＴＲ−ｃａｔ
＜ ０． ＯＩＬＴＲ−Ｃａｔ
＋ ＳＶ−ｔａｔ ＜ ０．０１Ｊｕｒｋａ
ｔ ５〜’２５単位ＩＬ２／ｄ／１０’細胞り、０１〜
Ｑ、０８μｇ ＩＬ２／ｄ／１０６細胞Ｃ６ 担体 １０１８０α０１！１ １．６ＬＴＲ−βｇａ
ｌ １０ １８０ ０．０１０ １．
２ｅＶ−ｔａｔ １０ １８０ ０
．０１０ １．２ＬＴＲ−βｇａｌ＋ｓ’Ｖ−ｔａ
ｔ １０ １０ Ｑ、７９７ １７７０ｐＬＴＲ−
ｃａｔの場合、ｃｕｔ発現のｔ４を一依存性誘導は約５
６００倍である。ＣＡＴアッセイは、非誘導ＬＴＲ−Ｃ
ａ を遺伝子からのＣＡＴ検出を可能とするのに十分な
感度を有している。ｐＬＴＲ−ＩＬ２およびｐＬＴＲ−
βｇａｌの場合には、ＩＬ２またはβ−ガラクトシダー
ゼの発現の非誘導時水準は検出限界よりも低い。ｔａｔ
が存在する場合には、著しく増大したレベルのＩＬ２お
よびβ−ガラクトシダーゼがｐＬＴＲ−ＩＬ２およびｐ
ＬＴＲ−βｇａｌからそれぞれ発現される。ＨｅＬａ細
胞におけるＬ’ｒＲ−ＩＬ２およびＬＴＲ−βｇａｌの
ｔａｔ−依存性誘導は、それぞれ５００倍または１７７
０倍よりも大であると測定される。
実施例 ２
ＨＩＶ ｔａｔおよびＬＴＲ−介在トランスアクチベー
ションの種特異性 ＨＩＶ ＬＴ’Ｒ連結遺伝子のｔａｔ介在発現に関する
我々の研究目的の一つが、このアクテベータ・プロモー
タ組合せを、哺乳動物細胞における異種タンパクの高水
準発現のための一般的ツールとして評価するところにあ
ったことから、我々は、異なる生物種からの様々な線維
芽細胞様細胞における絶対的発現水準、およびｔａｔ遺
伝子産生物によるトランスアクチベーション度の両方に
ついて検討した。この分析のために過渡的トランスフェ
クションおよび発現アッセイを行った。その結果を第２
表に示す。
ションの種特異性 ＨＩＶ ＬＴ’Ｒ連結遺伝子のｔａｔ介在発現に関する
我々の研究目的の一つが、このアクテベータ・プロモー
タ組合せを、哺乳動物細胞における異種タンパクの高水
準発現のための一般的ツールとして評価するところにあ
ったことから、我々は、異なる生物種からの様々な線維
芽細胞様細胞における絶対的発現水準、およびｔａｔ遺
伝子産生物によるトランスアクチベーション度の両方に
ついて検討した。この分析のために過渡的トランスフェ
クションおよび発現アッセイを行った。その結果を第２
表に示す。
第２表
ＣＨＯ５Ｖ−ｃａｔ ５１ １．０ ０．７
４ＨｅＬａ ５Ｖ−ｃａｔ ７６ ｔｏ
１．０（ヒト） ＬＴＲ−ｃａｔ
ｔｏ ０．０１５ ０．０１３ＬＴＲ−ｃ
ａｔ＋５Ｖ−ｔａｔ ４２００ ５５ ５５′５Ｔ３
８Ｖ−ｃａｔ ５．３ １．０ ０．８
６（マクス） ＬＴＲ−ｃａｔ １．０
０．１９ ０．１６ＬＴＲ−ｃａｚ＋５Ｖ−ｔａ
ｔ １０ １．９ ’Ｌ６ＰＫ ５Ｖ−ｃ
ａｔ ｉ、３ １．０ ０．５４（ブタ）
ＬＴＲ−ｃａｔ １．ＯＧ、７９
Ｃ１，４２ＬＴＲ−ｃａｔ＋５Ｖ−ｔａｔ ！１
．６ ５２ ２．８Ｌ Ｓ’／−ｃａｔ
２１ １．０ ０．１６驚くべきことに、我々は
、）（工Ｖ ＬＴＲのｔａｔ介在トランスアクチベーシ
ョンは、試験された非ヒト細胞系の各々と比較した場合
、試験されたヒト細胞系（ＨｅＬａ）における方が一段
と効率的であることを見出した。すなわち、示された実
験においてＨｅＬａ細胞におけるＣａｔ発現のｔａｔ−
依存性誘導倍率は４２００倍であったのに対し、非ヒト
細胞における誘導倍率はわずか５．６〜２５倍であった
。ＨＩＶ ｔａｔ遺伝子産生物の示すトランスアクチベ
ーションの主成分は種物異的であると思われる。
４ＨｅＬａ ５Ｖ−ｃａｔ ７６ ｔｏ
１．０（ヒト） ＬＴＲ−ｃａｔ
ｔｏ ０．０１５ ０．０１３ＬＴＲ−ｃ
ａｔ＋５Ｖ−ｔａｔ ４２００ ５５ ５５′５Ｔ３
８Ｖ−ｃａｔ ５．３ １．０ ０．８
６（マクス） ＬＴＲ−ｃａｔ １．０
０．１９ ０．１６ＬＴＲ−ｃａｚ＋５Ｖ−ｔａ
ｔ １０ １．９ ’Ｌ６ＰＫ ５Ｖ−ｃ
ａｔ ｉ、３ １．０ ０．５４（ブタ）
ＬＴＲ−ｃａｔ １．ＯＧ、７９
Ｃ１，４２ＬＴＲ−ｃａｔ＋５Ｖ−ｔａｔ ！１
．６ ５２ ２．８Ｌ Ｓ’／−ｃａｔ
２１ １．０ ０．１６驚くべきことに、我々は
、）（工Ｖ ＬＴＲのｔａｔ介在トランスアクチベーシ
ョンは、試験された非ヒト細胞系の各々と比較した場合
、試験されたヒト細胞系（ＨｅＬａ）における方が一段
と効率的であることを見出した。すなわち、示された実
験においてＨｅＬａ細胞におけるＣａｔ発現のｔａｔ−
依存性誘導倍率は４２００倍であったのに対し、非ヒト
細胞における誘導倍率はわずか５．６〜２５倍であった
。ＨＩＶ ｔａｔ遺伝子産生物の示すトランスアクチベ
ーションの主成分は種物異的であると思われる。
ＨＩＶ ｔａｔ−活性化ＬＴＲにより支配されるＨｅＬ
ａ細胞中での遺伝子発現水準は、５ｖ４０初期プロモー
タを用いた場合にみられる水準よりも約５５倍高かった
。このように、ＨＩＶ ｔａｔおよびＬＴＲ−介在発現
システムは、挿入遺伝子配列を比較的高水準に発現させ
るための有用なツールになると思われる。このシステム
は、例えばＩＬ２などといった有用ボリハプチドの生産
手段として相当な価値を有し得る。しかしながら、ＨＩ
Ｖ ｔａｔおよびＬＴＲ介在発現系の主たる有用性はヒ
ト細胞宿主に限られるものと思われる。とはいえ、同様
のトランスアクチベータ含有発現システムが他の唾乳動
物細胞系中に安定的に一体化されることもあり得る。ｔ
ａｔ機能の主成分はヒト特異的であると思われることか
ら、我々はヒト細胞宿主（すなわち、 ＨｅＬａ細胞）
を用いてｔａｔ機能を示す安定な細胞系を誘導した。
ａ細胞中での遺伝子発現水準は、５ｖ４０初期プロモー
タを用いた場合にみられる水準よりも約５５倍高かった
。このように、ＨＩＶ ｔａｔおよびＬＴＲ−介在発現
システムは、挿入遺伝子配列を比較的高水準に発現させ
るための有用なツールになると思われる。このシステム
は、例えばＩＬ２などといった有用ボリハプチドの生産
手段として相当な価値を有し得る。しかしながら、ＨＩ
Ｖ ｔａｔおよびＬＴＲ介在発現系の主たる有用性はヒ
ト細胞宿主に限られるものと思われる。とはいえ、同様
のトランスアクチベータ含有発現システムが他の唾乳動
物細胞系中に安定的に一体化されることもあり得る。ｔ
ａｔ機能の主成分はヒト特異的であると思われることか
ら、我々はヒト細胞宿主（すなわち、 ＨｅＬａ細胞）
を用いてｔａｔ機能を示す安定な細胞系を誘導した。
実施例 ３
ＨＩＶ ｔａｔ機能を示す安定なヒト細胞系の誘導ｔａ
ｔ活性化の分子機構を研究するために、またヒト細胞に
おいて異種タンパクを安定的に発現させるためのｔａｔ
介在発現の有用性を更に評価するために、我々は、機能
的ｔａｔ遺伝子のみ、ｔａｔタンパクにより活性化され
得る形のＬＴＲ−インジケータ遺伝子、またはｔａｔ−
およびＬＴＲ−含有遺伝子の双方を含む安定なトランス
フェクションされた細胞系を誘導したかった。特にｔａ
ｔおよびＬＴＲコントロール下で容易にアッセイ可能な
インジケータ遺伝子産生物を発現する安定な細胞系はｔ
ａｔ機能のインヒビターなスクリーニングするための標
的細胞として有用であろう。
ｔ活性化の分子機構を研究するために、またヒト細胞に
おいて異種タンパクを安定的に発現させるためのｔａｔ
介在発現の有用性を更に評価するために、我々は、機能
的ｔａｔ遺伝子のみ、ｔａｔタンパクにより活性化され
得る形のＬＴＲ−インジケータ遺伝子、またはｔａｔ−
およびＬＴＲ−含有遺伝子の双方を含む安定なトランス
フェクションされた細胞系を誘導したかった。特にｔａ
ｔおよびＬＴＲコントロール下で容易にアッセイ可能な
インジケータ遺伝子産生物を発現する安定な細胞系はｔ
ａｔ機能のインヒビターなスクリーニングするための標
的細胞として有用であろう。
安定細胞系の誘導にはｐｓＶ２− ｎｅｏ優性可選択性
マーカーを用いた。そのｎｅｏ遺伝子の発現により薬物
０４１８に対する抵抗性が付与される。実際にはｐｓＶ
２− ｎｅｏ ＤＮＡを安定的に発現するトランスフェ
クションされた細胞が、 ｐｓＶ２−ｎｅｏプラスミド
で同時トランスフェクションされた遺伝子をも発現させ
てしまう確率も高い。そこで桟状は、我々のｔａｔ−含
有およびＬＴＲ−含有プラスミド構築物とｐｓＶ２−ｎ
ｅｏとの様々な組合せをＨｅＬａ細胞中にトランスフェ
クションし、そして０４１８ｔ：、対して抵抗性のある
細胞を選択した。
マーカーを用いた。そのｎｅｏ遺伝子の発現により薬物
０４１８に対する抵抗性が付与される。実際にはｐｓＶ
２− ｎｅｏ ＤＮＡを安定的に発現するトランスフェ
クションされた細胞が、 ｐｓＶ２−ｎｅｏプラスミド
で同時トランスフェクションされた遺伝子をも発現させ
てしまう確率も高い。そこで桟状は、我々のｔａｔ−含
有およびＬＴＲ−含有プラスミド構築物とｐｓＶ２−ｎ
ｅｏとの様々な組合せをＨｅＬａ細胞中にトランスフェ
クションし、そして０４１８ｔ：、対して抵抗性のある
細胞を選択した。
０４１８で選択された細胞のコロニーを次いで貯留また
はクローン化し、そしてその機能性ｔａｔの発現および
／またはＬＴＲ一連結インジケータ遺伝子のｔａｔ−依
存性発現を分析した。
はクローン化し、そしてその機能性ｔａｔの発現および
／またはＬＴＲ一連結インジケータ遺伝子のｔａｔ−依
存性発現を分析した。
このプロトコールを用いて、我々は、（ＬＴＲ一連結イ
ンジケータ遺伝子の非存在下（＝）機能的ｔａｔ遺伝子
産生物を発現するＨｅＬａ−由来Ｍ胞系を単離した。例
えば第４表のＨｅ Ｌａ−由来クローン１２−１１を参
照されたい。ｔａｔにより誘導可能な状態にあるｐＬＴ
Ｒ−ｃａｔまたはｐＬＴＲ−βｇａｌを含む安定細胞系
も単離した。例えば第４表のＨｅＬａ−由来クローン１
１−３．１１−４および１１−５を参照されたい。更に
我々は、ＨＩＶ ＬＴＲおよびｔａｔ遺伝子産生物のコ
ントロール下に比較的高水準でＣＡＴ 、 ＩＬ２また
はβ−ガラクトシダーゼを発現する安定Ｈｅ Ｌａ−由
来細胞系を単離した。
ンジケータ遺伝子の非存在下（＝）機能的ｔａｔ遺伝子
産生物を発現するＨｅＬａ−由来Ｍ胞系を単離した。例
えば第４表のＨｅ Ｌａ−由来クローン１２−１１を参
照されたい。ｔａｔにより誘導可能な状態にあるｐＬＴ
Ｒ−ｃａｔまたはｐＬＴＲ−βｇａｌを含む安定細胞系
も単離した。例えば第４表のＨｅＬａ−由来クローン１
１−３．１１−４および１１−５を参照されたい。更に
我々は、ＨＩＶ ＬＴＲおよびｔａｔ遺伝子産生物のコ
ントロール下に比較的高水準でＣＡＴ 、 ＩＬ２また
はβ−ガラクトシダーゼを発現する安定Ｈｅ Ｌａ−由
来細胞系を単離した。
例えばそれぞれ比較的高水準のＩＬ２およびβ−ガラク
トシダーゼを発現するＨｅＬａ−由来クローン１４−８
（第３表）および１２−８（第４表）がそれらである。
トシダーゼを発現するＨｅＬａ−由来クローン１４−８
（第３表）および１２−８（第４表）がそれらである。
ｔｌｃｓ表
第４表
３Ｖ−Ｈｅ。
１１−１１ ４．１ ４．１クローン１２
−８のサブクローンを単離したが、これをＢ−９と称す
る。
−８のサブクローンを単離したが、これをＢ−９と称す
る。
同様にして、我々はｐＳｖ−βｇａｌを含有し、そして
検出可能な水準のβ−ガラクトシダーゼを構成的に発現
するＨｅＬａ−由来細胞クローンをも単離した。かかる
）ｌｅＬａ−由来クローンの一つを８−１０と称する。
検出可能な水準のβ−ガラクトシダーゼを構成的に発現
するＨｅＬａ−由来細胞クローンをも単離した。かかる
）ｌｅＬａ−由来クローンの一つを８−１０と称する。
クローン８−１０におけるβ−ガラクトシダーゼの発現
はＨＩＶ ｔａｔから独立しているので、これらの細胞
は、ＨＩＭ ｔａｔに対するあらゆる潜在的インヒビタ
ーの特異性を試験するためのターゲットとしてｔａｔ−
インヒビター・スクリーニング・プロトコールの特に有
用な成分である。すなわち、ＨｅＬａ−由来クローン１
２−８またはＢ−９におけるｔａｔ−依存性β−ガラク
トシダーゼ発現は阻害するがクローン８−１０（＝おけ
るｔａｔ−非依存性β−ガラクトシダーゼ発現には影響
しない化合物はｔａｔ機能の潜在的（＝特異的なインヒ
ビターである。
はＨＩＶ ｔａｔから独立しているので、これらの細胞
は、ＨＩＭ ｔａｔに対するあらゆる潜在的インヒビタ
ーの特異性を試験するためのターゲットとしてｔａｔ−
インヒビター・スクリーニング・プロトコールの特に有
用な成分である。すなわち、ＨｅＬａ−由来クローン１
２−８またはＢ−９におけるｔａｔ−依存性β−ガラク
トシダーゼ発現は阻害するがクローン８−１０（＝おけ
るｔａｔ−非依存性β−ガラクトシダーゼ発現には影響
しない化合物はｔａｔ機能の潜在的（＝特異的なインヒ
ビターである。
実施例３に記載されているＨｅＬａ−由来クローンＢ−
９および８−１０はＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕ
１ｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ
、 ＭＤ）に寄託されており、それぞれＣＲＬ ９４
５２およびＣＲＬ ９４３３の受託番号を有する。これ
らの寄託物は出願人に特許付与された時点で公衆に対し
て利用可能となる。しかしながら、寄託物の利用可能性
は政府の行為により付与された特許権を減損させて特許
発明（ｓｕｂｊｅｃｔ ｍａｔｔｅｒ）を実施するため
の実施許諾権を構成するものでないことを理解すべきで
ある。
９および８−１０はＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕ
１ｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ
、 ＭＤ）に寄託されており、それぞれＣＲＬ ９４
５２およびＣＲＬ ９４３３の受託番号を有する。これ
らの寄託物は出願人に特許付与された時点で公衆に対し
て利用可能となる。しかしながら、寄託物の利用可能性
は政府の行為により付与された特許権を減損させて特許
発明（ｓｕｂｊｅｃｔ ｍａｔｔｅｒ）を実施するため
の実施許諾権を構成するものでないことを理解すべきで
ある。
ＨＩＶ ｔａｔ遺伝子のコン）ｃｒ−ル下に、容易にア
ッセイされるインジケータ遺伝子産生物の高水準発現を
示す安定細胞系の誘導は、 ｔａｔ遺伝子産生物の作用
機構についての更なる研究、およびｔａｔが介在しＬＴ
Ｒにより引き起こされる遺伝子発現を干渉する化合物を
見付けるために設計される薬物発見研究に相当有用なは
ずである。
ッセイされるインジケータ遺伝子産生物の高水準発現を
示す安定細胞系の誘導は、 ｔａｔ遺伝子産生物の作用
機構についての更なる研究、およびｔａｔが介在しＬＴ
Ｒにより引き起こされる遺伝子発現を干渉する化合物を
見付けるために設計される薬物発見研究に相当有用なは
ずである。
ＨＩＭ ｔａｔ遺伝子の突然変異は、活性化可能なＬＴ
Ｒ−ｃａｔまたはＬＴＲ−βｇａｌを含有する細胞中に
トランスフェクションすることにより、生物活性を指標
に容易に検索することができる。これらのアッセイは感
染性ウィルスの非存在下に行うことができ、そして（特
にＣＡＴがインジケータ遺伝子として用いられる場合）
高感度であり。
Ｒ−ｃａｔまたはＬＴＲ−βｇａｌを含有する細胞中に
トランスフェクションすることにより、生物活性を指標
に容易に検索することができる。これらのアッセイは感
染性ウィルスの非存在下に行うことができ、そして（特
にＣＡＴがインジケータ遺伝子として用いられる場合）
高感度であり。
またβ−ガラクトシダーゼがインジケータ遺伝子として
選択される場合は、迅速かつ安価であり、非放射性であ
る。かかるｔａｔにより活性化可能な一体化されたＬＴ
Ｒ遺伝子構築物を用いた実験は、ＨＩＶ感染ライフサイ
クルにおけるｔａｔによるトランスアクチに一ジョンの
標的である一体化されたＨＩＶプロクィルスＬＴＲに酷
似している。Ｈ工ｖライフサイクルにおいて、一体化さ
れたプロフィルスＬＴＲがトランスアクチベーションを
受けるとフィルス遺伝子の発現が増大し。
選択される場合は、迅速かつ安価であり、非放射性であ
る。かかるｔａｔにより活性化可能な一体化されたＬＴ
Ｒ遺伝子構築物を用いた実験は、ＨＩＶ感染ライフサイ
クルにおけるｔａｔによるトランスアクチに一ジョンの
標的である一体化されたＨＩＶプロクィルスＬＴＲに酷
似している。Ｈ工ｖライフサイクルにおいて、一体化さ
れたプロフィルスＬＴＲがトランスアクチベーションを
受けるとフィルス遺伝子の発現が増大し。
それに伴って感染性ウィルスが生産される。
実施例 ４
９６ウ工ル式マイクロタイター・プレートにおける細胞
生長およびβ−ガラクトシダーゼの測定 ＨＩＶ ｔａｔ遺伝子産生物の緊密なコントロール下に
、そしてまた該産生物の活性に依存して。
生長およびβ−ガラクトシダーゼの測定 ＨＩＶ ｔａｔ遺伝子産生物の緊密なコントロール下に
、そしてまた該産生物の活性に依存して。
容易に検出されるインジケータ遺伝子産生物を高水準に
発現する細胞系、例えばＨｅＬａ−由来クローン１２−
８または１２−１０（第４表参照）は。
発現する細胞系、例えばＨｅＬａ−由来クローン１２−
８または１２−１０（第４表参照）は。
ｔａｔ活性化を妨げる化合物を見付けるのに極めて有用
であり得る。多数の化合物のスクリーニングを容易にす
るべく、我々はβ−ガラクトシダーゼ発現を定量化する
ための半自動式マイクロアッセイの開発を試みた。９６
ウ工ル式マイクロタイター・プレートで生長させた細胞
における！−ガラクトシダーゼ発現を検出するために、
まず我々は間接的で免疫学的な酵素結合免疫収着アッセ
イ（ＥＬｒｓ＊）を用いた。しかしながらこの方法では
感度が不十分なため、マイクロタイター・プレートのフ
ェル内で生長させたりａ−ン１２−８（Ｂ−９）におけ
るβ−ガラクトシダーゼを検出することができない。意
外にも、マイクロフェル中で生長させたクローン１２−
８（Ｂ−９）細胞（；おけるβ−ガラクトシダーゼ発現
の定量化には直接的なβ−ガラクトシダーゼ酵素アッセ
イの方がはるかに感度の高い方法であることが分った（
後記参照）。
であり得る。多数の化合物のスクリーニングを容易にす
るべく、我々はβ−ガラクトシダーゼ発現を定量化する
ための半自動式マイクロアッセイの開発を試みた。９６
ウ工ル式マイクロタイター・プレートで生長させた細胞
における！−ガラクトシダーゼ発現を検出するために、
まず我々は間接的で免疫学的な酵素結合免疫収着アッセ
イ（ＥＬｒｓ＊）を用いた。しかしながらこの方法では
感度が不十分なため、マイクロタイター・プレートのフ
ェル内で生長させたりａ−ン１２−８（Ｂ−９）におけ
るβ−ガラクトシダーゼを検出することができない。意
外にも、マイクロフェル中で生長させたクローン１２−
８（Ｂ−９）細胞（；おけるβ−ガラクトシダーゼ発現
の定量化には直接的なβ−ガラクトシダーゼ酵素アッセ
イの方がはるかに感度の高い方法であることが分った（
後記参照）。
β−ガラクトシダーゼアッセイと並行して。
細胞生存をマイクロタイター・プレート・フォーマット
を用いて監視することもできる（後記参照）。ｔａｔに
対するインヒビターの特異性の第１チエツクとして、供
試化合物に呼応したβ−ガラクトシダーゼ発現および細
胞生長を並行的に監視するのが望ましい。実施例３に記
載したように、ｔａｔに対するインヒビターの特異性の
第２チエツクは、β−ガラクトシダーゼの発現がｔａｔ
機能から独立している細胞系、例えば８−１０における
β−ガラクトシダーゼ発現に対するインヒビターの作用
を試験することより成る。すなわち、 ｔａｔ機能の
インヒビターに対する標準的スクリーニング・プロトコ
ールは。
を用いて監視することもできる（後記参照）。ｔａｔに
対するインヒビターの特異性の第１チエツクとして、供
試化合物に呼応したβ−ガラクトシダーゼ発現および細
胞生長を並行的に監視するのが望ましい。実施例３に記
載したように、ｔａｔに対するインヒビターの特異性の
第２チエツクは、β−ガラクトシダーゼの発現がｔａｔ
機能から独立している細胞系、例えば８−１０における
β−ガラクトシダーゼ発現に対するインヒビターの作用
を試験することより成る。すなわち、 ｔａｔ機能の
インヒビターに対する標準的スクリーニング・プロトコ
ールは。
ＨｅＬａ−由来りＣｌ−：／Ｂ −９（ｔａｔ−依存性
β−ガラクトシダーゼ発現）および８−１０（ｔ３ｔ−
非依存性β−ガラクトシダーゼ発現）を用いて、細胞生
長およびβ−ガラクトシダーゼに対する化合物の用量依
存性作用を定量することより成る。
β−ガラクトシダーゼ発現）および８−１０（ｔ３ｔ−
非依存性β−ガラクトシダーゼ発現）を用いて、細胞生
長およびβ−ガラクトシダーゼに対する化合物の用量依
存性作用を定量することより成る。
細胞生長およびβ−ガラクトシダーゼ発現の定量に用い
られる手順を以下に示す。マイクロワエル１個あたり０
．１艷の培地として細胞を９６ク工ル式マイクロタイタ
ー・プレートに接種する。細胞接種後１日目に供試化合
物を培地に添加してもよい。４日間生長させた後、レプ
リカ・プレートを細胞数またはβ−ガラクトシダーゼ活
性についてアッセイする。
られる手順を以下に示す。マイクロワエル１個あたり０
．１艷の培地として細胞を９６ク工ル式マイクロタイタ
ー・プレートに接種する。細胞接種後１日目に供試化合
物を培地に添加してもよい。４日間生長させた後、レプ
リカ・プレートを細胞数またはβ−ガラクトシダーゼ活
性についてアッセイする。
マイクロフェル中の生存細胞数は、黄色テトラゾリクム
塩ＭＴＴ （ジメチルテアゾールテトラゾリクムプロマ
イド）の添加径比色測定する。
塩ＭＴＴ （ジメチルテアゾールテトラゾリクムプロマ
イド）の添加径比色測定する。
ＭＴＴは細胞培養培地に添加される（マイクロ９エル１
個あたり、および培地０．１−あたり、Ｈ２Ｏ中にＭＴ
Ｔを１巧／−濃度で含むもの５０μｊ）。
個あたり、および培地０．１−あたり、Ｈ２Ｏ中にＭＴ
Ｔを１巧／−濃度で含むもの５０μｊ）。
それら細胞を３７℃で４時間インキュベーションした後
、０．１−の０．０４ＮＨ（’ｌ！（インゾロパノール
中）を各マイクロウェルに添加し、そして内容物なピは
ツテイングにより混合する。その混合物の５７０ｎｍに
おける光学密度を、前記酸性インプロパツール添加後１
５分〜１時間内に、マイクロタイター・プレート・リー
ダー（Ｂｉｏｔｅｃｈ製）を用いて読む。生存細胞中で
のみ機能するデヒドロゲナーゼは黄色のＭＴＴを紫色の
ホルマザンに転化するが、これは次いで光学密度の分光
光度計による測定のために可溶化される。すなわち、生
存細胞数は、ＭＴＴ反応生成物であるホルマザンの濃度
（光学密度）に比例する。
、０．１−の０．０４ＮＨ（’ｌ！（インゾロパノール
中）を各マイクロウェルに添加し、そして内容物なピは
ツテイングにより混合する。その混合物の５７０ｎｍに
おける光学密度を、前記酸性インプロパツール添加後１
５分〜１時間内に、マイクロタイター・プレート・リー
ダー（Ｂｉｏｔｅｃｈ製）を用いて読む。生存細胞中で
のみ機能するデヒドロゲナーゼは黄色のＭＴＴを紫色の
ホルマザンに転化するが、これは次いで光学密度の分光
光度計による測定のために可溶化される。すなわち、生
存細胞数は、ＭＴＴ反応生成物であるホルマザンの濃度
（光学密度）に比例する。
β−ガラクトシダーゼ活性は、次のプロトコールを用い
て９６ク工ル式マイクロタイター。
て９６ク工ル式マイクロタイター。
プレート・フォーマットで定量される。培地をＨｅＬａ
−由来細胞単層から除去し、そして各ウェルに２５０ｍ
Ｍスクロース、１０ ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＪ（ｐｉ（
７、４）および１０ ｍＭ ＥＤＴＡを含有する５ ０
μｉを添加する。凍結・融解サイクルを３回繰り返し
て細胞を溶解した。各マイクロワエルに１５０μｌの緩
衝液Ｚ （６０ｍＭ Ｎａ２ＰＯ４、４０ｍＭ ＮａＨ
２ＰＯ４。
−由来細胞単層から除去し、そして各ウェルに２５０ｍ
Ｍスクロース、１０ ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＪ（ｐｉ（
７、４）および１０ ｍＭ ＥＤＴＡを含有する５ ０
μｉを添加する。凍結・融解サイクルを３回繰り返し
て細胞を溶解した。各マイクロワエルに１５０μｌの緩
衝液Ｚ （６０ｍＭ Ｎａ２ＰＯ４、４０ｍＭ ＮａＨ
２ＰＯ４。
１０ｍＭ ＫＣＩ １１ ｍＭ ＭｇＳＯ４，５０ｍＭ
β−メルカプトエタノール、ｐＨ７，０）を添加する。
β−メルカプトエタノール、ｐＨ７，０）を添加する。
β−ガラクトシダーゼ反応は、緩衝液Ｚ中に４巧／ｍ１
０ＮＰＣ） （０−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクト
ピラノシド）を含む４０μノを添加することにより開始
させ、そして３７℃で１０分〜４時間インキュベートす
る。生成物の形成は、マイクロタイター・プレート・リ
ーダーを用いて４１５ｎｍにおける光学密度を測定する
ことにより監視する。β−ガラクトシダーゼに対する他
のより高感度の基質を用いてもよい。
０ＮＰＣ） （０−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクト
ピラノシド）を含む４０μノを添加することにより開始
させ、そして３７℃で１０分〜４時間インキュベートす
る。生成物の形成は、マイクロタイター・プレート・リ
ーダーを用いて４１５ｎｍにおける光学密度を測定する
ことにより監視する。β−ガラクトシダーゼに対する他
のより高感度の基質を用いてもよい。
細胞数アッセイおよびβ−ガラクトシダーゼ・アッセイ
の両方に対し、データ操作および解析は慣用のソフトウ
ェアを有するコンピュータに対するインターフェイスを
介して行われた。
の両方に対し、データ操作および解析は慣用のソフトウ
ェアを有するコンピュータに対するインターフェイスを
介して行われた。
９６ク工ル式マイクロタイター・プレートのマイクロウ
ェル内でのＫｅ Ｌａ−由来クローン１２−８の生長お
よびβ−ガラクトシダーゼ発現に対する接種密度の効果
を試験した。クローン１２−８Ｅ対する至適接種密度は
約５×１０５細胞／マイクロウエルである。禰乳動物細
胞のＤＮＡ複製および生長を阻害することが知られてい
る薬物に対するこのシステムの反応をみる予備試験とし
て、１２−８細胞の生長およびβ−ガラクトシダーゼ発
現に対する細胞破壊薬マイトマイシン−〇の作用を調べ
た。図示（第２図）の如く。
ェル内でのＫｅ Ｌａ−由来クローン１２−８の生長お
よびβ−ガラクトシダーゼ発現に対する接種密度の効果
を試験した。クローン１２−８Ｅ対する至適接種密度は
約５×１０５細胞／マイクロウエルである。禰乳動物細
胞のＤＮＡ複製および生長を阻害することが知られてい
る薬物に対するこのシステムの反応をみる予備試験とし
て、１２−８細胞の生長およびβ−ガラクトシダーゼ発
現に対する細胞破壊薬マイトマイシン−〇の作用を調べ
た。図示（第２図）の如く。
１２−８細抱の生長およびβ−ガラクトシダーゼ発現に
対するマイトマイシン−Ｃの明らかな用量一応答効果が
認められた。
対するマイトマイシン−Ｃの明らかな用量一応答効果が
認められた。
細胞数およびβ−ガラクトシダーゼ発現の迅速定量につ
いて説明した半自動手順の開発により、ｔａｔ機能のイ
ンヒビターを検索する際にこの試験システムを多数の化
合物に適用することが極めて容易（＝なる。記載の細胞
系は、他の重要なＨＩＶ機能に対するものとしてのＨＩ
Ｖ ｔａｔ機能を特異的に妨げる化合物を見付けるため
の標的を提供する。すなわち感染性ＨＩＶの複製を妨げ
ることが示された化合物は我々のＨＩＶ ｔａｔお′よ
びＬＴＲ−インジケータ遺伝子含有細胞系で試験してこ
れら化合物の作用様式がｔｑｔ機能の阻害を伴うもので
あるかどうか調べることができよう。記載されたアッセ
イは、迅速、定量的、廉価であり、また感染性ＨＩＶそ
れ自体を用いて作業することにより課せられる制約を除
去する。
いて説明した半自動手順の開発により、ｔａｔ機能のイ
ンヒビターを検索する際にこの試験システムを多数の化
合物に適用することが極めて容易（＝なる。記載の細胞
系は、他の重要なＨＩＶ機能に対するものとしてのＨＩ
Ｖ ｔａｔ機能を特異的に妨げる化合物を見付けるため
の標的を提供する。すなわち感染性ＨＩＶの複製を妨げ
ることが示された化合物は我々のＨＩＶ ｔａｔお′よ
びＬＴＲ−インジケータ遺伝子含有細胞系で試験してこ
れら化合物の作用様式がｔｑｔ機能の阻害を伴うもので
あるかどうか調べることができよう。記載されたアッセ
イは、迅速、定量的、廉価であり、また感染性ＨＩＶそ
れ自体を用いて作業することにより課せられる制約を除
去する。
第１図はＨＩＶ ｔａｔ遺伝子産生物によるＨＩＶ Ｌ
ＴＲのトランスアクチベーションを実証するために用い
られるシステムの概略図であり、そして第２図は１２−
８細胞の生長およびβ−ガラクトシダーゼ発現に対する
マイトマイシンＣの作用を示す図である。 外２名 ＦＩＧ、１ アッセイ
ＴＲのトランスアクチベーションを実証するために用い
られるシステムの概略図であり、そして第２図は１２−
８細胞の生長およびβ−ガラクトシダーゼ発現に対する
マイトマイシンＣの作用を示す図である。 外２名 ＦＩＧ、１ アッセイ
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １）そのゲノム中に一体化された状態で２つの異種ＤＮ
Ａ配列、すなわちａ）トランスアクション作用を有する
（ｔｒａｎｓ−ａｃｔｉｎｇ）調節タンパクを発現する
第１のＤＮＡ配列、およびｂ）所望のタンパクを発現す
る第２のＤＮＡ配列を有し、該第２のＤＮＡ配列が前記
トランスアクション作用を有する調節タンパクに応答す
る標的ＤＮＡ調節コントロール配列に連結されている、
遺伝子工学的に処理された安定な哺乳動物細胞系。 ２）第１のＤＮＡ配列がウィルス由来のトランスアクシ
ョン作用を有する調節タンパクを発現し、そして所望の
タンパクを発現する第２のＤＮＡ配列が前記トランスア
クション作用を有するタンパクに応答するウィルス由来
の調節コントロール配列に連結されている請求項１記載
の安定な哺乳動物細胞系。 ３）第１のＤＮＡ配列がヒト免疫不全ウィルス（ＨＩＶ
）ｔａｔタンパクを発現し、そして第２のＤＮＡ配列が
ＨＩＶＬＴＲ調節コントロール配列に連結されている、
ヒト細胞系から誘導される請求項２記載の細胞系。 ４）ヒトＨｅＬａ細胞系から誘導される請求項３記載の
細胞系。 ５）第２のＤＮＡ配列が細菌β−ガラクトシダーゼ、細
菌クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、
およびヒトＩＬ２より成る群より選択されるインジケー
タ・タンパクを発現する請求項３記載の細胞系。 ６）第２のＤＮＡ配列が細菌β−ガラクトシダーゼ、細
菌クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、
およびヒトＩＬ２より成る群より選択されるインジケー
タ・タンパクを発現する請求項４記載の細胞系。 ７）第２のＤＮＡ配列が細菌β−ガラクトシダーゼであ
るインジケータ・タンパクを発現する請求項５記載の細
胞系。 ８）第２のＤＮＡ配列が細菌β−ガラクトシダーゼであ
るインジケータ・タンパクを発現する請求項６記載の細
胞系。 ９）インジケータ・タンパクが大腸菌β−ガラクトシダ
ーゼである請求項７記載の細胞系。 １０）インジケータ・タンパクが大腸菌β−ガラクトシ
ダーゼである請求項８記載の細胞系。 １１）請求項１記載の遺伝子工学的に処理された安定な
哺乳動物細胞系を用い、そして所望のタンパクがインジ
ケータ・タンパクである、トランスアクション作用を有
する調節タンパクの機能を特異的に阻害する剤のスクリ
ーニング方法。 １２）請求項２記載の遺伝子工学的に処理された安定な
哺乳動物細胞系を用い、そして所望のタンパクがインジ
ケータ・タンパクである、ウィルス由来のトランスアク
ション作用を有する調節タンパクの機能を特異的に阻害
する抗ウィルス剤のスクリーニング方法。 １３）請求項３記載の細胞系を用いる、ＨＩＶｔａｔタ
ンパクの機能を特異的に阻害する抗ウィルス剤のスクリ
ーニング方法。 １４）請求項４記載の細胞系を用いる、ＨＩＶｔａｔタ
ンパクの機能を特異的に阻害する抗ウィルス剤のスクリ
ーニング方法。 １５）請求項５記載の細胞系を用いる、ＨＩＶｔａｔタ
ンパクの機能を特異的に阻害する抗ウィルス剤のスクリ
ーニング方法。 １６）請求項６記載の細胞系を用いる、ＨＩＶｔａｔタ
ンパクの機能を特異的に阻害する抗ウィルス剤のスクリ
ーニング方法。 １７）請求項７記載の細胞系を用いる、ＨＩＶｔａｔタ
ンパクの機能を特異的に阻害する抗ウィルス剤のスクリ
ーニング方法。 １８）請求項８記載の細胞系を用いる、ＨＩＶｔａｔタ
ンパクの機能を特異的に阻害する抗ウィルス剤のスクリ
ーニング方法。 １９）請求項７記載の細胞系を用い、そして対照として
、ｔａｔのコントロールから独立した細菌β−ガラクト
シダーゼを発現する遺伝子工学的に処理された安定なヒ
ト細胞系を用いる、ＨＩＶｔａｔタンパクの機能を特異
的に阻害する抗ウィルス剤のスクリーニング方法。 ２０）請求項８記載の細胞系を用い、そして対照として
、ｔａｔのコントロールから独立した細菌β−ガラクト
シダーゼを発現する遺伝子工学的に処理された安定なヒ
ト細胞系を用いる、ＨＩＶｔａｔタンパクの機能を特異
的に阻害する抗ウィルス剤のスクリーニング方法。 ２１）請求項９記載の細胞系を用い、そして対照として
ｔａｔのコントロールから独立した大腸菌β−ガラクト
シダーゼを発現する遺伝子工学的に処理された安定なヒ
ト細胞系を用いる、ＨＩＶｔａｔタンパクの機能を特異
的に阻害する抗ウィルス剤のスクリーニング方法。 ２２）請求項１０記載の細胞系を用い、そして対照とし
て、ｔａｔのコントロールから独立した大腸菌β−ガラ
クトシダーゼを発現する遺伝子工学的に処理された安定
なヒト細胞系を用いる、ＨＩＶｔａｔタンパクの機能を
特異的に阻害する抗ウィルス剤のスクリーニング方法。 ２３）半自動化され、非免疫学的であり、非放射性の直
接的酵素比色マイクロアッセイである請求項１９記載の
方法。 ２４）半自動化され、非免疫学的であり、非放射性の直
接的酵素比色マイクロアッセイである請求項２０記載の
方法。 ２５）半自動化され、非免疫学的であり、非放射性の直
接的酵素比色マイクロアッセイである請求項２１記載の
方法。 ２６）半自動化され、非免疫学的であり、非放射性の直
接的酵素比色マイクロアッセイである請求項２２記載の
方法。 ２７）請求項１記載の安定な哺乳動物細胞系を用いる、
所望のタンパクの高水準発現の誘導方法。 ２８）請求項２記載の安定な哺乳動物細胞系を用いる、
所望のタンパクの高水準発現の誘導方法。 ２９）請求項３記載の安定な哺乳動物細胞系を用いる、
ＨＩＶＬＴＲ−連結ＤＮＡ配列の高水準ｔａｔタンパク
介在発現の誘導方法。 ３０）請求項４記載の細胞系を用いる、ＨＩＶＬＴＲ−
連結ＤＮＡ配列の高水準ｔａｔタンパク介在発現の誘導
方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US5197087A | 1987-05-19 | 1987-05-19 | |
| US051,970 | 1987-05-19 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS63309185A true JPS63309185A (ja) | 1988-12-16 |
Family
ID=21974555
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP63119420A Pending JPS63309185A (ja) | 1987-05-19 | 1988-05-18 | ウイルス特異的遺伝子コントロール下にインジケータ遺伝子産生物を発現する安定なヒト細胞系 |
Country Status (8)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0291893A1 (ja) |
| JP (1) | JPS63309185A (ja) |
| KR (1) | KR910004101B1 (ja) |
| AU (1) | AU1632788A (ja) |
| DK (1) | DK271688A (ja) |
| IL (1) | IL86418A0 (ja) |
| NZ (1) | NZ224667A (ja) |
| ZA (1) | ZA883529B (ja) |
Families Citing this family (18)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH03502040A (ja) * | 1987-09-21 | 1991-05-16 | アムラド・コーポレイション・リミテッド | Ｇｍ‐ｃｓｆ遺伝子発現の調節 |
| ATE208813T1 (de) * | 1988-02-16 | 2001-11-15 | Greatbatch Gen Aid Ltd | Modifizierte zellen mit resistenz gegen retroviralinfektionen |
| US5070012A (en) * | 1988-03-30 | 1991-12-03 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Monitoring of cells and trans-activating transcription elements |
| AU3756789A (en) * | 1988-06-16 | 1990-01-12 | St. Louis University | Antagonists of viral transactivating proteins |
| US5278042A (en) * | 1989-02-06 | 1994-01-11 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health & Human Services | Method for detecting inhibitors of tat protein |
| US6251675B1 (en) | 1989-05-25 | 2001-06-26 | Duke University | Methods utilizing mutant rev genes encoding transdominant repressors of HIV replication |
| US5871958A (en) * | 1989-05-25 | 1999-02-16 | Duke University | Mutant rev genes encoding transdominant repressors of HIV replication |
| FR2651005B1 (fr) * | 1989-08-17 | 1992-01-03 | Pasteur Institut | Lignees de cellules infectables par un retrovirus et contenant un marqueur activable a l'occasion de l'infection |
| GB9003010D0 (en) * | 1990-02-09 | 1990-04-04 | Glaxo Group Ltd | Gene expression in yeast cells |
| IT1241123B (it) * | 1990-04-19 | 1993-12-29 | Consiglio Nazionale Ricerche | Cellule umane per l'elevata espressione di geni inseriti in dna ricombinanti episomiali,loro preparazione e loro impiego |
| DE4036784A1 (de) * | 1990-11-17 | 1992-05-21 | Behringwerke Ag | Antivirale aktivitaet des vom adeno-assoziierten virus typ 2 codierten rep-gens |
| GB9114437D0 (en) * | 1991-07-03 | 1991-08-21 | Health Lab Service Board | Recombinant adenoviruses and the use thereof for detecting the presence in eukaryotic cells of the expression products of specific genes |
| DK0566554T3 (da) * | 1992-03-13 | 2000-08-07 | Monsanto Co | Fremstilling af rekombinante proteiner ved anvendelse af herpesviruspromotorer og VP16-transaktivatorer |
| US6242187B1 (en) | 1996-01-29 | 2001-06-05 | Virologic, Inc. | Compositions and methods for determining anti-viral drug susceptibility and resistance and anti-viral drug screening |
| DE69739645D1 (de) * | 1996-01-29 | 2009-12-17 | Monogram Biosciences Inc | Verfahren zur Bestimmung antiviraler Wirkstoff Suszeptibilität und Resistenz sowie antivirales Wirkstoff-Screening |
| US5928888A (en) * | 1996-09-26 | 1999-07-27 | Aurora Biosciences Corporation | Methods and compositions for sensitive and rapid, functional identification of genomic polynucleotides and secondary screening capabilities |
| CA2298102A1 (en) * | 1997-07-30 | 1999-02-11 | Virologic, Inc. | Compositions and methods for determining anti-viral drug susceptibility and resistance and anti-viral drug screening |
| AU9017498A (en) * | 1997-08-15 | 1999-03-08 | E.I. Du Pont De Nemours And Company | Plant genes encoding dr1 and drap1, a global repressor complex of transcription |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4738922A (en) * | 1984-05-25 | 1988-04-19 | Dana Farber Cancer Institute | Trans-acting transcriptional factors |
-
1988
- 1988-05-14 EP EP88107778A patent/EP0291893A1/en not_active Withdrawn
- 1988-05-17 AU AU16327/88A patent/AU1632788A/en not_active Abandoned
- 1988-05-17 NZ NZ224667A patent/NZ224667A/xx unknown
- 1988-05-17 KR KR1019880005719A patent/KR910004101B1/ko active IP Right Grant
- 1988-05-18 JP JP63119420A patent/JPS63309185A/ja active Pending
- 1988-05-18 IL IL86418A patent/IL86418A0/xx unknown
- 1988-05-18 DK DK271688A patent/DK271688A/da unknown
- 1988-05-18 ZA ZA883529A patent/ZA883529B/xx unknown
Also Published As
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|---|---|
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| DK271688D0 (da) | 1988-05-18 |
| EP0291893A1 (en) | 1988-11-23 |
| AU1632788A (en) | 1988-11-24 |
| IL86418A0 (en) | 1988-11-15 |
| ZA883529B (en) | 1990-01-31 |
| DK271688A (da) | 1988-11-20 |
| KR880014097A (ko) | 1988-12-22 |
| NZ224667A (en) | 1990-03-27 |
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