KR900003304B1 - 항생물질 니코마이신 x,z의 제조방법 - Google Patents

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Description

항생물질 니코마이신 X,Z의 제조방법

본 발명은 돌연변이 유발로 개량된 균체와 이를 이용한 항생물질 니코마이신 X와 Z의 제조에 관한 것이다.

농작물의 병원성 곰팡이류에 의한 병해를 방제할 목적으로 사용된 핵산계 항생물질인 폴리 옥신류와 화학구조상으로 유사한 니코마이신 X,Z는 독일의 우르슬라덴, 한스 파울 하켄마이어 등에 의하여 최초로 발견되었다.

(U.DAHN, H.HAGENMAIER ET AL.ARCH.MICROBIAL. 107, 143-160,(1976) 니코마이신 X,Z는 곰팡이의 세포벽물질인 키딘질의 생합성을 저해시킴으로써 곰팡이류의 생육을 저해시키는 물질로 잘알려진 바이다. G.U.BRILLINGER. ET AL., PESTIC. BIOCHEM. PHYSIOL. 13 129-130(1980)) 니코마이신 X,Z는 현재 농용 살균제로 쓰이는 폴리옥신에 비하여 저 농도에서도 강력한 살균 효과를 갖고 있으며 살응애제로도 사용 가능하고 자연계에서 쉽게 분해되어 토양 잔류성이 적고 인축에 대한 독성이 적기 때문에 농약으로 개발할 가치가 크다고 할 수 있다.(미합중국 특허 4,315,922호).

현재까지 알려진 바로는 니코마이신 X와 Z를 생산하는 방사상목의 방선균 스트렙토마이세스 텐다에 ATCC31160(KFCC 11400)은 특정한 아미노산, 예를들면 이소루이신, 루이신, 메치오닌 등과, 핵산계 물질인 우라실, 티아민 등에 의하여 니코마이신 각 유도체들이 선택적으로 생합성 촉진 및 저해를 받는 것으로 알려져(H.P.FIEDLER, R.KURTH ET AL., J. CHEM.TECH.BIOTECHNOL.,32,271-280(1982)) 대량의 니코마이신 X와 Z를 생산함에 많은 어려움이 있었다.

본 발명에서는 친 균주의 이러한 점을 보완한 돌연변이 균주를 얻으므로써, 특히 배양중 다량의 우라실을 투여 하여도 니코마이신 X가 생합성 저해를 받지 않고 다량의 니코마이신 X와 Z를 생합성 할 수 있는 균주를 개발 하였다.

한편, 호기적 액체 배양시 배지 성분중 탄소원의 종류와 조성에 따른 니코마이신 X와 Z의 생성 정도가 현재까지 알려진바 없었으나, 본 발명에서는 그 조성 비율에 따라 니코마이신 X와 Z가 생성되는 비율이 다르게 나타남을 밝히고 이중 니코마이신 X와 Z의 생성비율이 가장 좋은 배지 성분을 조합하게 되었으며 배양중 적절한 아미노산이나, 핵산 물질을 배양액에 넣어줌으로써 니코마이신의 생산성을 더욱 증대시킬 수 있었다. 정제 방법은 이미 알려진(미합중국 특허 4,552,954호, 미합중국 특허 4,046,881호) 바와같이 배양액을 원심분리 및 여과시켜 균체를 제거한 그 여액을 여러개의 양이온교환 수지와 약한 음이은 교환수지를 사용하여 크로마토그라피를 실시하여 니코마이신 X와 Z를 얻을수 있으나, 단계가 복잡하고 회수율도 낮기 때문에 본 발명에서는 유기 용매를 사용한 새로운 침전법을 개발 하였다.

본 발명을 상세히 설명하면 다음과 같다.

니코마이신 X,Z생성력이 매우 우수한 균주로 선발된 돌연 변이체를 스트랩토마이세스 텐다에 HB-501(STREPTOMYCES TENDAE HB-501)이라 명명 하였으며 이 균주는 한국종균협회에 기탁되어있다. (기탁일 87.12.24 기탁번호 KFCC-10481)그리고 이 균주의 균학적 특성은 다음과 같다.

포자는 타원형으로서 크기는 0.4-0.6X 1.2-1.4μm이며 표면은 매끄럽다.

호기성 균사체의 색은 초기에는 백색이다가 성숙 단계에서는 짙은 회색이고 포자쇄는 단축으로 분리되어 있으며 느슨한 나선형으로 분리되어있다.

펩톤-철 한천 배지상에서 흑갈색 색소를 형성한다. 이 균주는 흑색, 갈색, 적색의 색소를 형성한다.

친 균주인 스트렙토마이세스 텐다에 ATCC 31160(STREPTOMYCES TENDAE ATCC 31160)에 비하여 돌연 변이체인 스트렙토마이세스 텐다에 HB-501의 생리적 가장 두드러진 차이점은 배양시 우라실에 의하여 니코마이신 X가 전혀 생합성 저해를 받지 않는 것으로 특징지어질 수 있다.

니코마이신 X와 Z를 제조하기 위하여 스트렙토마이세스 텐다에 HB-501의 호기적 액체 배양에 필요한 영양원은 탄소원으로 대두유, 옥수수전분, 포도당, 만니톨, 유기산, 과당, 맥아당 등이 사용될 수 있으며, 질소원으로 대두박, 어분, 건조 효모, 아미노산, 질산 화합물, 암모니아 화합물, 펩톤, 우유 부산물, 옥수수 침지액 등이 이용될 수 있고 그외 무기물로는 인산, 칼슘, 나트름, 칼륨, 구리, 철, 마그네슘, 아연, 코발트 등의 황산염 또는 염소화합물 형태로 이용될 수 있다. 배양 시작후 2일-8일 사이에 유가식 배양방법으로 투여할 수 있는 영양원으로는 아미노산, 즉 이소루이신, 루이신, 아스파탐산과 핵산물질인 티아민, 우라실 등을 들수 있다. 배양온도는 25℃-35℃범위가 적합하며, 통기량은 0.7-2.0VVM, pH는 4.0-9.0, 교반 속도100-600PPM으로 할수 있다.

니코마이신의 정제 과정은 배양액을 원심 분리하여 그 상등액을 여과막에 통과 시키는 그 여액을 흡착제에 통과시킨후 활성 분획을 모아 농축시키고 적당량의 유기용매를 첨가함으로써 불순물을 제거한 다음, 다시 유기 용매를 첨가하여 결정을 얻는 방법이다.

흡착제는 통상의 무기, 유기 흡착제, 예를 들면 활성탄, 실리카겔, 셀룰로오스, 합성수지를 사용할 수 있다. 특히 pH 4-6에서 강한 음이온 교환수지의 적용은 니코마이신 발효 배양액에 포함되어 있는 많은 불순물을 제거할 수 있으며 이러한 음이온 교환수지는 4개의 암모니움 이온들이 스틸렌 디비닐 벤젠에 붙어있는 합성수지로서 예를들면 도엑스-1,2, 엠버라이트IRA-400,401,411, 듀어라이트A-41,101,102등이다. 농축은 회전 증발기 또는 역 삼투압 장치를 이용하여 50-100배로 농축하는 것이 좋다. 용매에 의한 불순물 첨전법은 용해도 차이를 이용하는 것이며 첨가하는 용매의 양은 농축액의 1-8배로 하는것이 좋다. 용매 첨가로 인하여 많은 불순물이 제거된 용액은 용매의 구성 비율이 10배 이상 되도록 용매를 첨가함으로서 니코마이신을 침전시킬 수 있다.

이때 사용하는 용매는 케톤, 알콜, 에스테르, 에테르를 포함하는 유기 용매이다.

본 발명의 활성 화합물이 통상 제제 방법은 유효 성분이 0.001-20%범위까지 사용 가능하며 유제, 유탁액, 현탁액, 수화제, 입제, 분제, 등으로 할 수 있다.

다음 실시예에서 본 발명에 따른 돌연변이주의 선별 과정을 구체적으로 설명하고자 한다.

[실시예 1]

돌연변이 균체를 얻는 방법으로는 친 균주 스트렙토마이세스 텐다에 ATCC 31160의 포자를 분리하여 37℃에서, 사멸률이 92%되는 조건으로 NTG(N-메틸 N-니트로-N-니트로소구아닌)을 처리하여 니코마이신 X, Z의 생성율이 높은 균주를 선별하여 포자를 형성시킨후 수거하여 37℃에서 사멸률 94%되는 조건으로 NQO(4-니트로-퀴놀린-1-옥사이드)를 처리하여 돌연변이를 유도하였다.

니코마이신 X와 Z 생성 우수 균주 선별은 두단계로 나누어 실시하였다.

돌연 변이 선별 첫 단계는 NTG.나 NQO. 처리를 한 포자를 한천 배지, 즉 포도당 1.5%, 효모 추출액 0.15%, 육즙 0.15%, 카세인 분해물 0.3%,에 30℃로 배양하여 충분히 자라게한 후 돌연변이 선별 한천배지, 즉 포도당 1.5%, 효모추출액 0.15%, 육즙 0.15% 카세인분해물 0.3%, 우라실 0.35%, 이소루이신 0.24%, 한천 1.5%에 이식하여 28℃에서 4일에서 5일간 배양한 다음 각각의 균집체 주위를 일정한 부피의 조각으로 절단한 다음, 이미 준비된 원예 직물의 점무늬 낙엽병원균인 알타나리아 말라이 IFO 8984(ALTERNARIA MALI IFO 8984)를 대상균으로 한 한천 배지위에 올려놓는다. 두번째 단계로 일차 선별된 돌연 변이 균주를 액체배지(포도당 2.0%, 효모추출액 2.0%, 만니톨 2.0%, 옥수수전분 2.0%, 대두박 2.0%, 이소루이신 0.26%, 우라실 0.23%, 제1인산 칼륨 0.05%)를 500ml 진탕용 삼각 플라스크에 80ml씩 넣고 121℃에서 15분간 멸균후 28℃, 180RPM에서 5일간 진탕 배양한다.

배양이 종결된 배양액을 원심 분리후 여과막을 이용하여 전 처리한후 그 여액을 고분리 액체 크로마토그라피를 이용하여 니코마이신 X와 Z의 함량을 측정한다.

이때 액체 크로마토그래피의 운영 조건은 컬럼은 노바팍 C18(3.9mm×15mm WATERS CAT.NO.86344)흡수파장은 280mm이며 이 크로마토그래피의 이동상은 10mM의 핵산 술포네이트를 포함하는 30mM 암모늄포메이트용액으로서 pH 4.5, 산도보정은 아세트산으로 하였다.

본 발명에 의해 식물탄저병, 점무늬낙엽병 방제제로 제조된 화합물을 다음 실시예로 살균 효과를 설명한다.

[실시예 2]

방제효과 실험/사과 탄저병/보호성

수화제 조성

니코마이신 0.05-5.0%

계면 활성제

(폴리옥시 에틸렌 알킬 아릴 에테르 폴리머) 2.0%

pH 조절제(아세트산) 3.0%

중량제

(고령토, 납석, 규조토, 벤토나이트, 타르크 등) 94.95-90%

대조액제인 디포락탄 100ppm과 니코마이신 10ppm-50ppm은 거의 같은 방제 효과를 나타냈지만 니코마이신의 경우 100ppm 이상에서는 탁월한 효과를 나타냈다.

[실시예 3]

방제 효과 실험/포도 만부병/보호성

수화제 조성

니코마이신 0.05-5.0%

계면 활성제

(폴리옥시 에틸렌 알킬 아릴 에테르 폴리머) 2.0%

pH 조절제(아세트산) 3.0%

습전제 (TRITON X-100, TWEEN-20 ) 2.0%

중량제

(고령토, 납석, 규조토, 벤토나이트, 탈크, 등) 92.95-88%

위 조성중 실시예 2의 결과에 의하여 니코마이신 최종 농도가 100ppm(0.01 %)되도록한 후 포도 만부병 방제 효과에 대한 야외 검정을 실시 하였다.

공시 품종 : 포도(NIAGARA)

처리내용 :

처리당 1주(난괘법 3회 반복)

이제까지 널리 알려져 있는 공지의 배지조성, 즉 멸균된 증류수 1ℓ 에 대하여 만니톨 3.0%, 전분 1.0%, 대두박 2.0%, 효모추출액 1.0%(JOURNAL OF ANTIBIO TICS 28(1) P9-16 1985)에 원균주 ATCC31160과 본 발명 변이주 HB 501을 이용하여 13.7ℓ의 발효조에 배지를 8ℓ씩 채우고 초기배지의 pH를 6.8로 보정한 후 121.5℃에서 22분간 살균한 다음, 통기량은 1VVM, 교반속도 300RPM 배양온도는 28℃에서 8일간 배양하여 니코마이신 X,Z의 생산량을 확인한 결과 X와 Z를 합한 농도는 친균주(ATCC 31160)는 0.35g/ℓ 변이주(HB-501)는 1.2g/ℓ의 생산성을 나타냈으며 다음의 실시예 4에서 변이주를 배양하여 니코마이신 X,Z의 생산성을 높이는데 적합한 배지조성을 구체적으로 설명한다.

[실시예4]

스트렙토 마이세스 텐다에 HB-501의 종균배양을 위하여 다음과 같이 실시하였다.

배지조성

포도당 2.0%

옥수수 전분 2.0%

만니톨 1.0%

대두박 1.0%

효모추출액 1.0%

육즙 0.1%

(멸균된 증류수에 대한 농도) pH 7.2

위 배지를 500ml 진탕용 삼각 플라스크에 100ml씩 넣고 멸균한 다음 준비된 포자 용액을 접종하여 28℃, 180RPM으로 진탕배양기에서 48시간 배양후 종균으로 사용하였다. 니코마이신 X와 Z를 제조하기 위하여 본 배양배지로서 질소원 및 무기염류외에 탄소원의 구성비율이 다른 배지 1 배지 2 배지 3을 사용하여 니코마이신 X,Z의 생산성을 확인하였다.

13.71의 발효조에 각각의 배지를 8l씩 채우고 초기배지의 pH를 6.8로 보정한 후 121.5℃에서 22분간 살균한 다음, 통기량은 1VVM, 교반속도 300RPM 배양온도는 28℃에서 8일간 배양한다.

이때 배양종료 후 니코마이신 X와 Z의 생성비율은 각각 배지 1의 경우 80-85(X) : 20-15(Z), 배지 2의 경우 75-80 : 25-20, 배지 3의 경우 90-95 : 10-5로 나타났으며 니코마이신 X와 Z를 합한 농도는 배지 1의 경우 4.0-4.3g/l, 배지 2의 경우 4.5-4.8g/l, 배지 3의 경우 4.9-5.3g/l로 나타났다.

즉, 공지의 배지조성에 비하여 탄소원, 질소원, 무기염류의 종류와 농도를 재조합하여 주었을때 공지의 배지조성으로 생성된 니코마이신 X,Z의 양에 비해 최고 4.5배 생산성 증가를 확인할 수 있었다.

따라서 변이주 HB-501(KFCC-10481)를 이용하여 니코마이신 X와 Z의 생성에 적합한 배지조성으로 탄소원으로서 옥수수전분 3-6.0% 포도당 2-5.0%, 만니톨 2.0%과 질소원 및 무기염류를 포함하는 배지조성이 좋았으며 특히 탄소원으로서 옥수수 전분 4.0%, 포도당 4.0% 만니톨 2.0%를 사용하였을때 최대로 니코마이신 X와 Z를 생산해 낼 수 있었다.

[실시예 5]

개량된 균주의 각 아미노산과 핵산류에 의한 영향을 검토하고자 배지 3을 1L 진탕 배양용 플라스크에 150ml씩 넣고 실시예 4에서와 같이 준비된 종균을 접종한 다음 배양 후 3일, 4일, 5일, 6일되는 때 배양액의 10%되는 증류수에 각각의 아미노산과 핵산류가 10mM되도록 녹인 다음 멸균하여 첨가하여 주었다. 배양종료 후 니코마이신 X+Z 함량은 다음과 같이 나타났다.

생성된 니코마이신 X+Z(g/l)

특히 알라닌, 아스파탐산, 루이신, 이소루이신, 구아닌은 니코마이신 생합성을 촉진시키는 것으로 나타났다.

[실시예 6]

니코마이신 X,Z를 대량 생산하기 위하여 배지 3을 13.7L 발효조에 8L 채운 다음 121℃에서 20분간 멸균 후 통기량은 1VVM, 교반속도 300RPM 배양 온도는 28℃는 초기 pH는 7.2로하고 배양중 적절한 아미노산, 예를 들면 이소 루이신을 총 배양액양의 20% 되는 증류수에 20mM 농도가 되도록 녹여 무균 여과시킨 다음 배양 3일 경과후 4일부터 7일째까지 일정한 유속으로 투여했다.

배양액의 pH는 아세트산을 사용하여 8일째부터 급격하게 내려 pH 5.0으로 유지하도록 하였다.

각 시간 별 배양중 이소 루이신을 첨가한것과 첨가하지 않은 것을 비교한 결과 니코마이신 X+Z의 농도는 다음과 같았다.

생성된 니코마이신 X+Z(g/l)

이소 루이신을 첨가한 경우가 배양액중 니코마이신 최종 농도가 1.9g/l 더 많이 생성 되었다.

[실시예 7]

2l의 니코마이신 발효 배양액을 원심 분리(5000g,30분)하여 얻은 상충액을 아세트산을 사용 pH 5.0으로 산성화 하고 한외 여과장치(분자량 30,000이하)를 이용 여과한 후, 이 여액을 도엑스 1×2(500-100메쉬 C1-형)로 채운 컬럼에 주입시켰다. 이때 유량은 0.5l/hr였다.

280mm에서 강한 흡광을 갖는 분획 2.5l를 회전 증발기를 사용하여 50ml의 용액으로 농축시켰다. 이 농축액에 150ml의 아세톤을 첨가한 후 1시간동안 교반하고 원심 분리하여 침전물을 제거시키고, 이 상등액에 500ml의 아세톤을 첨가하여 니코마이신 결정을 얻었다. 이때 회수율은 85% 순도는 60% 였다.

Claims (4)

1. 스트렙토 마이세스 텐다에 ATCC 31160의 돌연변이주로서 핵산계 물질(우라실)에 의하여 니코마이신 X가 생합성 저해를 받지 않음을 특징으로 하는 스트렙토 마이세스 텐다에 HB-501(KFCC-10481)을 이용하여 멸균된 증류수에 대해 옥수수 전분 3.0-6.0%, 포도당 2.0-5.0%, 만니톨 2.0%, 대두분 2.0%, 건조효모 1.0%, 질산나트름 0.5%, 염화칼륨 0.04%, 탄산칼슘 0.1%, 염화칼슘 0.05%, 인산칼륨 0.01, 염화아연 0.001%, 황산마그네슘 0.12%, 황산철 0.001%, 염화나트륨 0.03% 황산코발트 0.001%로 이루어진 배지에서 호기적으로 배양하여 배지중에 니코마이신 X와 Z를 축적시킨 후 회수함을 특징으로 하는 항생물질 니코마이신 X,Z의 제조방법.
2. 제 1 항에 있어서, 배양중 유가식 배양방법(FED-BATCH CULTURE)으로 특정한 아미노산이나 핵산류를 투입하여 니코마이신의 생산성을 증가시킴을 특징으로 하는 항생물질 니코마이신 Z,X의 제조방법.
3. 제 1 항에 있어서, 배양 말기(약 8일 정도)에 각종 유기산을 첨가하여 배양액의 pH를 급격히 내려 5.0으로 유지하여 가수분해를 방지시킴을 특징으로 하는 항생물질 니코마이신 X,Z의 제조방법.
4. 제 1 항에 있어서, 배지에 축적된 니코마이신을 통상의 유기용매(케톤류, 알콜류, 에스테르, 에테르등)를 이용하여 결정, 침전하여 회수함을 특징으로 하는 항생물질 니코마이신 X,Z의 제조방법.