KR830001800B1 - 페니실린 아미다제의 생산방법 - Google Patents

Abstract

내용 없음.

Description

페니실린 아미다제의 생산방법

본 발명은 바실루스 메가테리움(Bacillus megaterium ATCC 14945)(미국특허 제3,144,395호)을 자외선과 에틸메탄술폰산으로 처리하여 변이주를 육성하고, 발효 조건을 크게 개선함으로써, 페니실린 아미다제 생산성을 증가시키는 방법에 관한 것이다. 현재 국내에는 위 균주와는 기탁번호가 다른 바실루스메가테리움(ATCC 14946)을 이용하는 방법이 특허로 나와 있으나(대한민국 특허공보 76-263), 그 발효조건은 상기 미국특허와 비교하여 볼때별로 개선점이 보고되어 있지 않다.

본 발명자들은 국제 수준의 효소생산성을 갖는 균주확보를 위해 꾸준한 균주개량을 시도한 결과, 종래의 균주와는 달리 유도물질인 페닐아세트산 없이도 효소를 생산할 수 있으며, 배양 조건과 유도물질의 첨가시간 및 첨가량을 조절함으로써 효소생산성을 공지의 생산방법보다 700%이상 증가시킬 수 있는 부분적 항상성(恒常性)변이주 바실루스 메가테리움(KFCC 10029)을 개발하였다.

종래의 균주는 페니실린 아미다제를 생산하는데 70-72시간의 발효기간이 소요 되었으나[J. Bacteriol., 93, -302-308(1967)] 본 발명자들이 개량한 변이주는 22-26시간이면 그에 상응하는 효소를 생산할 수 있으며 유도물질이 존재하며 효소생산성은 7배로 증가된다. 따라서 이 변이주를 산업적으로 사용하면 발효시간이 단축되고, 효소의 생산성이 현저히 높기 때문에 발효시설의 가동비와 배지의 원료비를 절감시킬 수 있는 장점이 있다.

본 발명자들이 분리한 변이주 바실루스 메가테리움(KFCC 10029)과 원 균주인 바실루스 메가테리움(ATCC 14945)의 효소 생산성, 생리적 특성 및 형태적 특성은 표 1과 같다. 즉, 변이주는 육즙한천배지에서 원 균주보다 집락의 크기가 더 작고, 점도도 별로 없으며, 현미경하에서 관찰하면 짧은 사슬 혹은 단일세포로 많이 존재한다. 그리고, 원균주의 육즙한 천사면에서의 생장모양은 실모양(filiform)인데 비해 변이주는 구슬모양(bead)으로 나타난다. 또한 변이주는 5% 염화나트륨 첨가 육즙한천배지에서 전혀 자라지 못하고, 소이론(soytone) 한천배지에서 더 어두운 갈색 색소를 분비한다. 그리고 최소배지에 각종 아미노산을 첨가한 배지에서 변이주는 원균주에 비해 더 잘자랄 뿐만아니라, 형태도 크고 배열상태는 단일세포로 더 많은 것이 특징이다. 특히 소이론배지에서의 변이주는 유도물질 없이도 효소가 생산될 뿐만아니라 유도물질이 존재하는 경우에는 효소생산성은 현저히 증가된다. 그림 1은 소이론 배지를 사용하여 30℃에서 18시간 동안 배양한 후 변이주와 원균주를 비교한 전자현미경 사진이다. 여기에서도 그 형태적 차이는 현저하여 변이주의 크기는 직경이 원균주보다 2배 정도가 된다.

[표 1]

원균주와 변이주의 생리적, 형태적 특성 비교

그림 1

소이론 배지를 이용한 원균주 변이주와의 전자현미경

사진. 가:원균주(×10,000), 나:변이주(×10,000)

본 발명의 페니실린 아미다제를 생산함에 있어서, 본 발명의 특징을 자세히 설명하면, 표 2의 소이론 배지에 부분적 항상성 변이주 바실루스 메가테리움(KFCC 10029)을 배양한 다음, 이를 1.5VVM 내지 2.5VVM의 통기량과 350rpm 내지 550rpm의 교반속도하에서 10%비율로 접종하고 32℃ 내지 35℃에서 8시간 배양한 후 온도를 28℃ 내지 32℃로 낮추면서 0.3%의 페닐아세트산을 가하고 다시 12시간 후에 .3%의 페닐아세트산을 가하는 것을 특징으로 한다. 상기와 같은 조건을 한정진 것은 다음과 같은 이유 때문인바, 1.5VVM 이하의 통기량과 350rpm 이하의 교반속도에서는 배양액의 용존산소가 대수 증식기에 충분히 공급되지 못하여 효소 생산성을9감소시킨 반면, 2.5VVM 이상의 통기량과 550rpm 이상의 교반속도에서는 과도한 기포와의 접촉과 물리적 교반에 의한 전단력 때문에 생산되는 효소의 급격한 불활성화를 래초하여 효소 생산성이 감소되었기 때문이며, 이때 10%의 접종량이 균주 생장과 효소생산성을 최대로 되었다. 접종온도도 28-35℃로 한정하지 않고 그 이하 또는 그 이상으로 하여 페니실린 아미다제를 생산할 수 있으나 접종과 배양을 고려하여 이 범위의 온도가 페니실린 아미다제 생산의 최적 온도이었다. 그리고 페닐아세트산을 첨가할때에 0.3%의 페닐아세트산으로 한정한 것은 이 농도에서 최대의 효소 생산성을 보였고 그 이상의 농도에서는 균주성장을 저해하여 효소생산성이 급격히 감소하였다. 또 배양시간별 0.3%의 페닐아세트산 첨가 효과에서도 8시간예 첨가하는 것이 최대의 생산성을 보였고 그 전후 시간에 첨가 하였을 때에는 효소 생산성이 감소 내지 거의 생산되지 못하였기 때문이다.

다음 실시예는 본 발명을 더욱 상세히 예증하여 줄것이나 본 발명이 이에 극한 된다는 것은 아니다.

[실시예 1]

바실루사 메가테티움 KFCC10029의 배양에 사용된 배지 조성은 표 2와 같다.

종균배지는 위 배지 조성중 페닐아세트산을 제외시킨 것을 사용하였다. 먼저 500mι 삼각 플라스트에 종균배지 500ml를 넣어 pH를 7.0으로 조절한 뒤, 121℃에서 15분간 멸균한다. 종균은 30±1℃에서 20시간 배양시켜 5% 비율로 사용한다. 500ml 삼각 플라스크를 사용, 32℃에서 진탕배양하면서 페닐아세트산을 0.3%가 되도록 8시간 후에 무균적으로 첨가한다. 48시간 후에 배양액을 회수하여 원심 분리한뒤, 그 여액을 효소원으로 사용한다. 효소활성도는 벤질페니실린(최종농도 10mg/mι)과 pH 8.7,40℃ 조건에서 20분간 반응시킨뒤, 파라디메틸 아미노벤즈알데히드로 발색시켜서 측정한다. 효소 1unit는 시간당 1μmole의 6-아미노페니실린산을 생성하는 효소의 양으로 정하였다. 이때 얻어진 효소생산성은 55unit/ml(배양액)이었다.

[표 2]

배지 조성

* 한국 폴리올주식회사의 상품으로 소포제 임.

[실시예 2]

표 2의 배지조성을 사용하여 실시예 1과 같은 조건에서 종균을 배양한뒤, 500mι 발효조에 10% 비율로 점증시켜 통기량 2VVM, 교반속도 450rpm 온도 33℃에서 8시간 배양한다. 이때 0.3%페닐아세트산을 가하고, 2N-염산을 사용하여 pH를 8.7로 계속 유지시키면서, 온도는 30℃를 유지시킨다. 다시 12시간후에 0.3%페닐아세트산을 가하면 24시간후에 최대 65U/mι(배양액)의 효소 활성도에 도달한다.

[실시예 3]

표 2의 배지조성을 사용하여 실시예 1과 동일한 조건에서 종균을 배양하여, 다음 표 3의 조건에서 5ι발효조에 접종, 배양한다. 이때 28시간후에 배양액내의 효소활성도가 최대 67U/ml에 도달한다.

[표 3]

발효조건

[실시예 4]

실시예 1의 종균배지를 사용하여 표 3의 발효 조건으로 종균을 배양, 28mι 발효조에 10% 비율로 접종한 다음 33℃에서 8시간 배향한다. 온도를 다시 30℃로 낮추면서 0.3% 페닐아세트산을 가하고, 다시 12시간후에 0.3페닐아세트산을 가해준다. 발효조건은 통기량 2VVM, 교반속도 450rpm으로 조절한다. 26시간 배양후에 최대의 효소활성도인 95U/mι(배양액)에 도달한다. 배양액을 연속 원심분리하여 균체를 제거한 배양액 20ι를 얻어 효소를 회수, 정제한다.

Claims (1)

1. 페니실린 아미다제를 생산함에 있어서, 부분적 항상성 변이주인 바실루스 메가테리움(KFCC 10029)을 소이톤 배지에서 배양한 다음, 이를 1.5-2.5VVM의 통기량과 350-550rpm의 교반 속도하에서 10%비율로 접종하고 32-35℃에서 8시간 배양한 후 다시 28-32℃로 낮추면서 0.3%의 페닐아세트산을 가하고 다시 12시간 후에 0.3%의 페닐아세트산을 가하는 것을 특징으로 하는 페니실린 아미다제의 생산방법.