KR820000420B1 - 세포의 벽조직을 구성하는 고형화된 제약 조성물의 제조방법 - Google Patents

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유우이찌 야마무라
이찌로오 아스마
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Abstract

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Description

세포의 벽조직을 구성하는 고형화된 제약 조성물의 제조방법
본 발명은 미생물의 세포벽 조직을 구성하며 효과적인 보조능력 및 항종양 활성을 갖는 고형화된 제약 조성물의 제조방법에 관한 것이다.
보다 상세히 설명하자면, 본 발명은 미생물의 세포벽조직, 기초유, 현탁제 및 분산제를 구성하며, 사람에게 발생된 종양에 대한 면역요법제로 유용한 고형화된 제약조성물 및 그의 제조 방법에 관한 것이다.
미코박테륨속(Mycobacterium bovis BCG)노카르디아속(Noc
Figure kpo00001
rdia rubra)과 같은 미생물에서 유도된 세포 벽조직(하기부터 CWS로 언급)은 보조능력 및 종양 활성을 갖는 것으로 알려졌다. 그러나, CWS는 물에 용해되지 않는 물질이므로, 인체에 통상적인 수성주사액 형태로 투여할 수 없으며, 따라서, 인체를 치료하기 위한 효과적인 투여 방법은 상기 CWS를 현탁물의 형태로 사용하는 것으로 CWS를 오일이 첨가된 형태로 만든 다음 오일내 물의 현탁액으로 제조하는 것이 효과적이다.
예를 들어, 광유(Drakeol 6VR)로 처리되고 샐린-0.2%트 윈 80(상표명)에 현탁된 미코박테륨 보비스 BCG의 CWS는 앞의 성장을 억제하고 동물에 고유한 종양을 퇴행시키는데 효과적이다. (I. Azuma dt al, Gann(cancer), 65, 493 505(1974) T. Yoshimoto et al, Gann(cancer) 67,441 445(1976) 및 B. Zbar, et al), J. Nath. Cancer Inst., 52, 1571 1577(1974)상기와 같이 오일이 첨가된 BCG CWR는 종양이 발생한 환자의 면역 상태를 증강시키고 생존 기간을 연장시키는데 효과적이다. (Y. Yamamura et al, Gann(cancer), 66,355363(1975) 및 K. Yasumoto et al, Gann(cancer), 67,787 795(1976)최근에 들어와서 상기에서 언급된 방법으로 제조된 노카르디아 루브라의 오일이 첨가된 CWS의 현탁액은 사람에게 발생된 종양의 면역요법제로서 유용하다는 사실이 밝혀졌다(I. Azuma et al, Gann(cancer)67,669-677(1976)).
상기에서 언급한 바와 같이, 오일이 첨가된 CWS는 면역요법제로서 살아있는 미생물보다 합병증 및 질적 콘드롤면에서 많은 잇점을 갖고 있으나 오일이 첨가된 CWS의 현탁액은 불안정하여 동일조건하에서 하루 이상 보관할 수 없으므로 질적으로 열화되며 그 활성능력이 감소하는 경향이 있다. 따라서, 상기 오일이 첨가된 CWS의 현탁액은 환자에게 투여할 때와 같이 사용 직전에 제조하여 사용하는 것이 필요하나, 매우 번거롭고 치료시 불편하므로 병원에서의 실질적인 치료를 위하여 상기와 같은 현탁물을 사용하는 것은 실제적으로 불가능하다.
상기에서 설명한 바와 같이, 오일이 첨가된 CWS의 현탁물이 갖는 난점및 결점을 제거함으로써 병원에서 효과적이고도 실질적으로 사용할 수 있도록 하기 위하여, 본 발명의 발명자는 오일이 첨가된 CWS가 예를들어 수일 내지 1주일 이상의 기간동안 활성능력이 감소되지 않는 상태로 유지될수 있도록 안정하게 제조하는 방법을 연구하였다. 상기 연구의 결과, 본 발명의 발명자는 안정하며 공업적 생산단위및 병원용도에 적합한 고형화된 오일이 첨가된 CWS의 조성물을 제공하게 되었다.
본 발명의 고형화된 제약 조성물은 미생물의 CWS, 기초유, 현탁제 및 분산제를 구성하며 CWS, 기초유 현탁제 및 분산제의 현탁물을 친액성화하여 제조할 수 있다.
본 발명에 사용되는 CWS는 노카르디아속(예, 노카르디아 루브라, 노카르디아 파라피니카, 노카르디아 아스터로이드등), 미코박테륨속(예, 미코박테륨 보비스등), 코리네 박테륨속(예, 코리네박테륨 디프테리아등), 아트로박터속(예, 아트로박터 파라핀너스등)등과 같은 미생물중 하나에서 유도해 낸 것이다.
본 발명에 사용되는 CWS는 재배된 박테리아의 세포중에서 공지된 방법(I. Azuma et al, J, Nath. Cancer Inst., 52,95 (1974) 및 I. Azuma et al Biken J., 18, 1(1975)으로 세포벽을 분류, 정제하여 제조한다. CWS의 제조방법에 관한 예는 하기 실시예에 기재되어 있다.
본 발명에 사용되는 기초유는 보조능력 및 항종양 활성을 강화시키는 작용을 하는 오일을 의미한다. 상기 기초유로는 천연 및 합성 혹은 반합성 오일등이 있으며 예를 들어 면역학, 27,311-329(1924),에 기재된 오일, 바람직하게는 동물오일(스쿠알렌, 비타민 A바일, 비타민A 오일, 유비퀴논등) 및 그의 대사산물, 식물오일(미글리올, AD-65)상표명, 땅콩유, 아라셀 및 알루미늄 모노스테아레이트의 혼합물), 그의 합성 혹은 반합성 오일(스쿠알란, 비타민 A 팔미테이트등), 미네랄오일(파라핀액, 바이올 F(상표명), 드라-케올 6VR(상표명, 펜실바니아 정제회사)등, 보다 바람직하게는 스쿠알렌, 스쿠알란, 미글리올, 드라케올6VR 및 비타민 A팔미테이트등의 있다. 상기에서 언급된 기초유에 있어서, 상기 오일은 CWS가 영역(예티무스 세포영역)으로 이동하는 것을 촉진하고 CWS가 영역에서 장시간 지지될 수 있도록 하며 CWS의 면역활성을 강화하는데 효과적이며 유용하다.
본 장에서 예를들은 기초유 가운데, 스쿠알렌과 같은 동물 오일은 천연원에서 유출해낸 기초유라는 점에서 바람직하게 사용할 수 있으며, 따라서 인체와 같은 생체에 대한 친화력을 갖는다.
본 장에서 사용되는 현탁제는 탄화수소물(분말화된 아카시아검, 트라가칸트 파우더, 아가, 펙틱물질, 나트륨알지네이트, 메틸셀룰로오즈, 카르복시메틸셀룰로오즈등)프로테인 혹은 포스포리피트(듀토플라즘, 카제인, 젤라틴, 레시친등), 폴리알코홀 에스테르(폴리-옥시에틸렌소르비탄-모노라우레이트(트윈-20), 모노팔미테이트(트윈-40),-모노스테아레이트(트윈-60),-모노올리에이트(트윈-80), 소르비탄-모노라우레이트(스팬-20), 모노팔미테이트(스팬-40),-모노스테아레이트(스팬-60),-모노올리에이트(스팬-80등)등의 공지된 유화제를 의미하며 상기 현탁제중, 폴리알코홀 에스테르가 바람직하고 특히 폴리옥시-에틸렌소르비탄 모노올 리에이트등의 폴리옥시에틸렌소르비탄 에스테르가 보다 바람직하다.
본 장에 사용되는 분산제의 예로는 당, 글루코오즈, 맨니톨, 소르비톨등의 당 알코홀, 바람직하게는 당 알코홀보다 바람직하게는 맨니톨 등이 있다.
고형화된 제약 조성물에 포함되는 분산제의 유효도에 있어서, 상기 분산제는 상기 분산제를 현탁물로 보다 쉽게 재생성하며, 재생성된 동중성자성 현탁액을 제조하는데 효과적인 것으로 알려졌다.
본 발명의 고형화된 조성물을 구성하는 각 성분의 비율(즉, CWS, 기초유, 현탁제 및 분산제비율)은 임의로 결정되며, 바람직하고 효과적인 비율은 하기 기재된 실시예에서 확실하게 설명될 것이다.
고형화된 제약 조성물은 예를 들어, 상기에서 언급된 각 성분을 공지된 방법으로 현탁하고, 그 현탁물을 유탁하여 제조할 수 있다. 보다 바람직하게는, 예를 들어, CWS를 조직 균등기에 배치하고, 기초유를 첨가한 다음, 필요에 따라, 부드러운 페이스트 형태로 분마된 상기 혼합물에 현탁제를 함유하는 분산제의 수성 용액을 적가하고 상기 혼합물을 분마하여 단일 현탁물이 되도록 균질화 한 후 상기와 같이 제조된 현탁물을 작은병(vial)에 옮겨 담고, 질소액을 사용하여 급히 냉동한 다음 유탁화한다.
본 발명에 따라 제조되는 고형화된 제약 조성물은 환자에게 투여하기 전에 무균물을 첨가하는 방법으로 재현탁하여 사용할 수 있으며 하기 관점으로 설명되는 효용 및 잇점을 갖는다.
(1) 본 발명의 고형화된 제약 조성물은 새로 제조된 오일이 첨가된 CWS의 현탁액과 비교할 경우, 물리적 안정도 및 실질적으로 불변하는 활성능력을 유지하면서 보다 장시간 저장될 수 있다.
또한, 새로 제조된 오일이 첨가된 CWS의 현탁액은 적어도 1시간내에 비-단일성의 고르지 못한 현탁액으로 분해 되어 버리므로, 단일형태의 현탁액으로 재생성하기가 어려우며 오랜 저장기간이 경과한 다음 CWS자체에 고유한 치료효과를 나타내지 못하게 된다.
(2) 본 발명의 고형화된 제약 조성물은 오일이 첨가된 CWS의 단일 현탁물로 쉽게 재생성될 수 있으며, 상기 현탁물은 오랜 저장기간이 경과한 다음에도 무균물을 첨가하는 간단한 방법에 의하여 새로 제조된 현탁물과 마찬가지의 높은 안정성을 나타낼 뿐 아니라, 재현탁된 제조물은 새로 생성되는 오일이 첨가된 CWS의 현탁물과 동일한 활성을 나타내고, 또한 상기에서 언급한 대로, 오랜 기간 동안 저장된 오일이 첨가된 CWS의 현탁물보다 훨씬 높은 치료효과를 나타낼 수 있다.
(3) 상기에서 언급한 대로 오일이 첨가된 CWS의 현탁물은 투여하기 직전에 제조하여야 만 했다. 또한, CWS의 단일 투여량은 아주 소량이므로(약 100-300ug)오일이 첨가된 CWS의 현탁물을 제조하는 공정은 많은 난점을 갖고 있으며 정해진 양을 함유하는 동질의 현탁물을 제조하기가 대단히 어렵다. 상기 결점을 극복하기 위하여, 많은양의 오일이 첨가된 CWS현탁물을 동시에 제조하는 경우에도, 상기에서 언급된 바와같이 현탁물 그 자체는 대단히 불안정하며 장기간 보관할 수 없으므로 대부분의 현탁물은 치료상 사용될 수 없으며 처분되게 된다. 그러나, 본 발명에 따라서 오일이 첨가된 정해진 양의 CWS를 함유하는 고형화된 조성물을 대단위로 쉽게 생산할 수 있으며 생산품의 질을 쉽게 조절할 수 있다.
본 발명의 고형화된 조성물에서 재생산된 현탁물의 높은 안정도 및 우수한 활성능력은 예상하지 못한 놀라운 성질로서, 상기와 같은 특성은 오일이 첨가된 CWS가 재생산된 현탁물에 균등하게 분산되며 분산된 오일이 첨가된 CWS는 보다 큰 입자로 응집되지 않고 미세한 구(약 5μ의 직경)형태로 존재하지 때문인 것으로 풀이된다.
상기에서 설명한 대로, 본 발명은 지금까지 오일이 첨가된 CWS의 우수한 항종양제를 대단위 규모로 생산할때의 난점 및 불가능성을 세계 최초로 해결하였으며 따라서 CWS를 병원에서 실제적으로 사용할 수 있도록 하였다. 상기 사실은 획기적은 일로써 암 환자에게는 하나의 혜택을 의미하는 것이다.
본 발명의 고형화된 제약 조성물이 갖는 발명 및 기술상의 잇점을 제시하고 지지하기 위하여 하기에 제약 및 약리학적 테스트의 결과를 설명하였다.
[재료 및 방법]
보조물질 : 노카르디아루브라(지금부터 N. 루브라로 언급)의 CWS를 제조하는 방법을 상기에 언급되어 있다. 드라케올 6VR(펜실바니아 정제회사, 버틀러, 미합중국), 스쿠알렌(토쿄 카세이 회사, 일본) 및 스쿠알란(카타야마 카가구회사, 일본)은 N. 루브라의 오일이 첨가된 CWS를 제조하는 오일로 사용한다.
항원 : m-[4(4′-모노페닐라조)-페닐」-N-아세틸-L-티로신(ABA-N-아세틸-티로신) 및 ABA-박테리아성 α-아밀라제(ABA-BαA)는 생물화학지 23,1726 1730 (1959)에 설명된 방법으로 제조된다. 고초균에서 정제된 박테리아성 α-아밀라제(액화형태, Lnt No. E5XQ1)는 일본국 세이카가구 코교 회사에서 연구되었다.
종양 : 백혈병 EL4에 걸린 C57BL/6J 생쥐, 비만세포종 P815-X2에 걸린 DBA/2 생쥐, 메스(MethA)A에 걸린 BALB/c 생쥐, 3-메틸콜안트렌으로 유발된 섬유육종에 걸린 C57BL/6J 생쥐 MC1 04 로명명)를 사용하였다. EL4, 비만세포종 P815-X2 및 메스 A를 유성생식의 여성 쥐에서 복수증을 유발시켜 차례로 유지시킨다. MC104는 유성생식의 생쥐에 피하이식하여 교대로 경과시킨다.
생쥐 : 6내지 8개월된 BALB/c, C578BL/6J 및 DBA/2의 여성 생쥐를 얻는다(Shizuoka Jikken Dobutsu Nokyo. Shizuoka, Japan). 상기 생쥐에게 음식 및 물을 마음껏 준다(일본의 오리엔탈 이스트 회사제품)
배양용액 : 100μ/ml의 페니실린 및 100㎍/ml의 스트렙토마이신을 함유하는 이글의 최소필수 배지(NEM)를 제조한다. (일본, 오사카대학, 미생물성 질병 연구소 제고), 조직 배얄을 하는 배지 RPMI-1640을 얻는다. (일본, 니슈 세이야쿠회사품). 플루우 연구실(미합중국, 로크빌)에서 치사 송아지 혈청(Lot No. 4055722)을 추출한 다음 사용 30분전에 56℃로 가열하여 불활성화 한다.
직접적인 세포독소도 테스트 : MEM용액에 들어있는 종양세포(메스 A)현탁물을 오일이 첨가된 동량의 CWS 혹은 동량의 오일 비말과 혼합한 다음 얼음으로 냉각된 물탕에 60분간 방치해둔다. 종양 세포의 생육성은 에오신 Y배제 테스트로 결정한다.
만발 형태의 감각과민도를 유발할 때의 보조능력 측정 : 기니아 픽의 네 발바닥에 오일에 물을 첨가한 유탁액인 여러 종류의 기초유에 용해한 N. 루브라의 CWS를 함유하거나 함유하지 않는 총 50㎍의 ABA-N-아세틸리토신을 투여하여 1차 면역한다. 2주일 후, 100㎍의 ABA-BA로 스킨테스트하고 테스트항원을 피내 주사한 후 각각 24시간, 48시간 경과할 때의 반응을 측정한다.
세포-중개의 세포독소도 테스트 : C57BL/6J 생쥐(H-2b)에 N. 루브라의 오일이 첨가된 CWS를 함유하거나 함유하지 않는 비만세포종 P815-X2(H-2)의 생육성 세포를 복강내로 투여하여 면역시킨다. 면역후 11일째 되는 날, 면역된 생쥐의 비장 세포 및 51CR로 표시된 비만세포중 pe15-X2 세포를 사용하는 브러너및 공동연구자(Brunner et al; 면역학, 18,501-515(1070)의 방법을 수정하여 세포-중개의 세포독소도 실험을 실시한다. (T Taniyama et al 일본, 미생물학지 19,255-264(1975) 51Cr로 표시된 비만세포종 P815-X2 세포(적상적혈구)에 대한 비장 세포(주효세포)의 비율은 100:1이다. 적상적혈구의 붕괴는 하기 도식에 따른 특수한 적상적혈구-붕괴의 %로 표시한다.
Figure kpo00002
최대 크로뮴 방출치는 적상적혈구만을 2차례 냉동-용해할 경우에 완전한 세포-붕괴로 측정된다.
N. 루브라의 오일이 첨가된 CW를 제조하는 방법;
N. 루브라의 CWS를 제조하는 고형물질을 하기 실시예에 서술된 방법으로 제조한다.
[결과]
[여러 종류의 오일로 처리된 N. 루브라의 CWS가 이유전(allogeniec)생쥐의 세포-중개의 세포독소도에 미치는 영향]
N. 루브라의 CWS를 스쿠알렌 혹은 드라케올 6VR로 처리하고 0.2%의 트윈 80용액을 함유하는 0.9% 샐린용액에 현탁한다. C57BL/6J생쥐에게 상기에서 언급한대로 비만세포종 세포 및 보조물질의 혼합물을 투여하여 면역한다. 도표 1에 도시된 바와 같이, 드라케올 6VR-샐린-스쿠알렌-샐린 혹은 스쿠알렌-맨니톨로 처리된 N. 루브라의 CWS를 제조하는 물질은 이유전 생쥐의 비장세포에 있는 주효세포를 유도할 때 보조물질로서 매우 효과적이다. 사용 전, 무균물을 첨가하여 재생산한 유탁된 보조물질은 사용전 새로이 생산한 보조물질만큼 효과적이다.
[종양세포에 대한 직접적인 세포독소도]
도표 Ⅱ에 도시된 바와 같이, N. 루브라의 CWS를 함유하는 모든 실험된 제조물질은 보조물질 및 종양세포(BALB/c에서 얻은 메스 A)를 일음-물탕에 60분간 방치할 경우 어떠한 세포독소도 나타내지 않으나, 0.2%의 트윈 80을 함유하는 스쿠알렌-0.9%샐린 용액의 유탁된 제조물질은 종양세포에 대한 독성을 나타낸다. 새로 제조되는 제조물질은 동일 상황하에서 세포독성을 나타내지 않는다. 그러나 스쿠알렌-맨니톨로 처리된 N. 루브라의 CWS를 제조하는 유탁 제조물질은 세포독성을 나타내지 않는다.
오일이 첨가된 N. 루브라 CWS의 항종양 활성도 스쿠알렌, 스쿠알란 혹은 드라케온 6VR로 처리되고 0.2% 트윈 80을 함유하는 5.6맨니톨 용액에 현탁된 N. 루브라 CWS의 항종양 활성도는 유성생식 생쥐의 이식할 수 있는 종양을 사용하여 테스트한다. 도표 Ⅲ, Ⅳ, Ⅴ 및 Ⅵ에 도시된대로, 여러 종류의 오일로 처리된 N. 루브라 CWS의 제조물질은 서로 다른 유성생식 생쥐가 걸린 EL-4 백혈병, 메스 A 및 MC104의 종양성장을 억제하는데도 거의 동일한 활성을 나타낸다. 도표 Ⅲ에 도시된 바와 같이, BALB/c생쥐가 걸린 메스 A의 성장에 대한 N. 루브라 CWS의 억제활성도는 새로 제조된-드라케올-샐린 제조 물질 및 사용전 무균물로 유탁하여 현탁한 스쿠알렌-맨니톨 혹은 스쿠알란-맨니톨 제조물질과 별로 다르지 않다.
[기니아 픽에 있는 만발 형태의 감각과 민도에 대한 오일조성물이 효능]
N. 루브라의 CWS를 85:15비율의 오일(드라케올 6VR, 스쿠알렌 혹은 스쿠알란등) 및 아르라셀 A혼합물에 현탁하고 오일에 물이 첨가된 유탁물인 N. 루브라의 CWS를 함유하거나함 유하지 않는 ABA-N-아세틸-티로신 용액과 혼합한다. 기니아 픽에게 상기의 항원 및 보조물질의 혼합물을 근육내로 주사하여 면역시킨다. 2주일 경과한 다음, ABA-BαA로 스킨테스트하고 테스트 항원을 피내 주사한지 각각 24시간 및 48시간 경과시의 스킨 반응을 검사한다. 도표Ⅶ에 도시된 대로, 오일에 물을 첨가한 유탁액으로서 드라케올 6VR, N. 루브라의 CWS 및 스쿠알렌 혹은 스쿠알란과 함께 ABA-N-아세틸티로신을 투여하여 면역시킨 기니아픽은 ABA-BαA에 대하여 양성 스킨 반응을 나타낸다.
테스트 결과는 하기 도표에 기재되어 있다.
[도표 I]
Figure kpo00003
주의 : 각 그룹의 C57BL/6J생쥐중 3마리는 비만세포종 세포 및 오일이 첨가된 N. 루브라 CWS의 혼합물을 복강내로 투여하여 면역시킨다. 11일 경과 후, 면역된 쥐의 비장 세포 및 51Cr로 표시된 비만세포종 세포(100:1의 비율)를 20시간 배양하여 세포중개의 세포독소도를 측정한다. 모든 실험은 중복하여 실시한다.
a) 새로 제조된 보조물질을 사용한다.
b) 유탁 물질은 사용전 무균물을 첨가하여 재생성 한다.
[도표 II]
Figure kpo00004
주의 : 종양 세포(BALB/c 생쥐의 메스 A) 현탁물 (MeM에 용해된 4×107/ml))을 오일이 첨가된 N. 루브라 CWS 혹은 오일 비말과 혼합하고 얼음-물탕에서 60분간 보관한 다음에오신 Y배출 테스트로 종양세포의 생육성을 실험한다. 수치는 MFM용액에 들어있는 종양 세포의 생육성에 대한 비율을 의미한다.
[도표 III]
Figure kpo00005
주의 : 종양세포(메스 A., 2×105) 및 N. 루브라의 오일이 첨가된 CWS 100㎍ 혹은 오일 비말의 혼합물을 BALB/c여성 생쥐에게 피내 배양한다.
수치는 배양 후 4주일 경과시의 결과에 관한 것이다.
a) N. 루브라 CWS를 여러 종류의 오일로 처리하고 0.2%트윈 80을 함유하는 0.9%샐린에 현탁한다.
사용직전에 제조한다.
b) 여러 종류의 오일로 처리된 N.루브라 CWS를 0.2%트윈 80을 함유하는 5.6맨니톨에 현탁하여 유탁시킨다.
c) 종양이 생기지 않은 생쥐 수/실험된 생쥐수
[도표 IV]
Figure kpo00006
주의 : 섬유육종(메스 A:1×105)을 유발시키는 3-메틸 콜안트렌 및 N. 루브라의 오일이 첨가된 CWS 100㎍ 혹은 오일 비말의 혼합물을 BALB/c여성 생쥐에게 피내 배양한다. 수치는 배양 후 42일 경과시의 결과를 나타낸 것이다.
a) 유탁물질은 사용전무균물을 첨가하여 재생산한다.
b) 종양이 생기지 않은 생쥐수/실험된 생쥐수
[도표 V]
Figure kpo00007
주의 : 섬유육종(MC104, 1×106)을 유발하는 3-메틸콜 안트렌 및 오일이 첨가된 N. 루브라 CWS 100㎍ 혹은 오일 비말의 물혼합을 C57BL/J여성 생쥐에게 피내 배양한다. 수치는 배양 후 42일 경과시의 결과이다.
a) 유탁 물질은 사용전 무균물을 첨가하여 재생성한다.
b) 종양이 생기지 않은 생쥐수/실험된 생쥐수
[도표 VI]
Figure kpo00008
주의 : EL-4 백혈병 세포(1×105) 및 N. 루브라의 오일이 첨가된 CWS 100㎍ 혹은 오일 비말의 혼합물을 C57BL/6J여성 생쥐에게 피내 배양한다. 수치는 배양후 28일 경과시의 결과이다.
a) 유탁 물질은 사용전 무균물을 첨가하여 재생성한다.
b) 종양이 생기지 않은 생쥐수/실험된 생쥐수
[도표 VII]
Figure kpo00009
주의 : 각 그룹에 있는 5마리의 기니아 픽에게 물이 첨가된 오일 유탁제인 여러 종류의 기초유에 현탁되어 있는 N. 루브라의CWS100㎍을 첨가하거나 첨가하지 않은 ABA-N-아세틸티로신 50㎍을 투여하여 면역시킨다. 면역 후 2주일 경과한 다음, 100㎍의 ABA-박테리아성 α-아밀라제로 스킨 테스트한다.
a) 스킨 반응의 평균치(경변, 직경㎜)±표준오차
하기 실시예에서 사용되는 노카르디아 루브라-CWS는 하기 방법으로 제조된다.
노카르디아 루브라는 폴리펩톤(2%) 및 효모 추출액(1%, pH, 7.0)을 함유하는 30℃의 배지에서 3일간 배양하고 상기 배양육즙 18리터를 여과한다. 젖은 미아셀(mycel, 약 400g)을 물 1리터에 현탁하고 다이노밀(Dynomill, 0.1 0.2mm beads, 3000rpm, 2리터/시간)로 3차례 분마한다. 상기 물질을 버퍼화하고 (pH 7.5)핵산 분해효소(Dnase 및 RNase) 30분간 처리한 다음 원심분리(800×g, 15분)한다. 상징액을 분리하여 한 번 더 원심분리(10,000-20,000×g, 30분)한다. 침전물을 수집하여 아세톤 1리터에 현탁한 다음 24시간 교반한다. 침전물을 여과 수집하고, 2%트리톤×100 1리터에 현탁하여 24시간 교반한 다음 원심분리(10,000-20,000×g, 30분)한다. 상기 침전물을 상기방법에 따라 트리톤×-100으로 다시 한번 처리한다. 최종침전물을 에탄올 및 물(1:1)의 혼합물 1리터로 세척하고 물 1리터로 2번 더 세척한 다음 원심분리(10,000-20,000×g, 30분)한다. 침전물을 베로날 버퍼(pH9.5) 에 현탁하고 실온에서 프로나제 50mg으로 24시간 교반처리한 다음, 원심분리(10,000-20,000g, 30분)한다. 침전물을 물 1리터로 세차례 세척하여 원심분리(10,000-20,000g, 30분)한다. 침전물을 디에틸 에테르 및 에탄올(1:1)의 혼합물 1리터로 세척하고 실온의 감압하에서 3일간 건조시킨 다음 분마하고 체로걸러(125μ)미세한 분말의 N. 루브라 CWS 약 7g을 얻는다.
본 발명의 고형화된 조성물에 무균물을 첨가하여 재생산한 다음, 단일 투여량 10-2,000㎍, 바람직하게는 100-300㎍의 CWS를 환자의 흉막내, 병변내, 피내, 피하내, 근육내 혹은 복강내로 투여한다.
하기 실시예는 본 발명을 보다 상세히 설명하는 것이다.
[실시예 1]
N. 루브라 CWS 4mg 0.2%트윈 80을 함유하는
미글리올 2방울 5.6%맨니톨 용액 1ml
N. 루브라의 CWS(140mg)를 테플론 유봉(Teflon pestle : 일본의 타카시마 쇼튼 회사)이 장치된 조직 균등기에 넣는다. 상기CWS에 27-게이거 주사기의 주사바늘로 미글리올 70방울을 첨가하고 상기 혼합물을 1000rpm으로 분마하여 부드러운 페이스트 형태로 만든다. 0.2%의 트윈 80을 함유하는 5.6% 맨니톨 수성용액(35ml)을 첨가하고 N. 루브라의 CWS가 들어있는 작은 오일 비말이 단일 현탁제로 될 때까지 계속분마한다. 유탁 물질을 제조하기 위하여, N. 르브라 CWS의 오일이 첨가된 현탁물을 10ml부피의 작은 병 35개에 담고 질소액을 사용하여 급히 냉동시킨 다음 실온에서, 유탁한다. 사용전 상기 유탁 물질에 무균물 1ml를 첨가하여 현탁물을 만든다.
[실시예 2]
N. 루브라 CWS 4mg 0.2%트윈 80을 함유하는
드라케올-6VR 2방울 5.6%맨니톨 용액 1ml
실시예 1에서 사용한 미글리올 대신 드라케올-6VR을 사용하여 만든 혼합물을 실시예 1의 방법으로 처리하여 고형화된 조성물을 얻는다.
[실시예 3]
N. 루브라 CWS 4mg 0.2%트윈 80을 함유하는
스쿠알렌 2방울 5.6%맨니톨 용액 1
실시예 1의 미글리올 대신 스쿠알렌을 사용하여 만든 혼합물을 실시예 1의 방법으로 처리하여 고형화된 조성물을 얻는다.
[실시예 4]
N. 루브라 CWS 4mg 0.2%트윈 80을 함유하는
비타민 A 팔미테이트 2방울 5.6%맨니톨 용액 1m
실시예 1의 미글리올 대신 비타민 A팔미레이트를 사용하여 만든 혼합물을 실시예 1의 방법으로 처리하여 고형화된 조성물을 얻는다.
[실시예 5]
N. 루브라 CWS 4mg 0.2%트윈 80을 함유하는
미글리올 2방울 5.6%맨니톨 용액 4ml
실시예 1의 5.6%맨니톨 수성 용액대신 글루코오즈 5%수성용을 사용하여 만든 혼합물을 실시예 1의 방법으로 처리하여 고형화된 조성물을 얻는다.

Claims (1)

  1. 노르카디아속 미생물의 세포벽조직(CWS), 동식물류, 광유 혹은 그의 반합성유의 기초유, 현탁제 및 당 혹은 알코홀의 분산제로 구성된 현탁액을 동결건조하는 것을 특징으로하는 항종양 활성과 부활성을 지니는 미생물 세포벽조직(CWS), 기초유, 현탁제 및 분산제로 구성되는 고형화된 제약학적 조성물의 제조방법.
KR7802907A 1978-09-23 1978-09-23 세포의 벽조직을 구성하는 고형화된 제약 조성물의 제조방법 KR820000420B1 (ko)

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