KR790001786B1

KR790001786B1 - Process for isolation & purification of 5-nucleotides

Info

Publication number: KR790001786B1
Application number: KR7801676A
Authority: KR
Inventors: 정갑택
Original assignee: 임철수; 미원 주식회사
Priority date: 1978-06-02
Filing date: 1978-06-02
Publication date: 1979-12-18

Abstract

5'-Nucleotides were isolated and purified by strong acidic cation exchange resin and weak basic anion exchange regin. Thus, Liquid contg. 5'-riboucleotide was passed through a mixed column of Amberite IR120 and Amberite IR45 resin with SV = 15, and passed again through a column of Amberite IR 120 with SV = 0.5, nucleotides adsorped. Products was isolated by water and adjusted pH 7.0-8.5 by NaOH to give 5'-nucleotides.

Description

Separation and Purification Method of 5'-nucleotides

본 발명은 염을 함유하는 5'-누클레오타이드를 유리형의 강산성 양이온 교환수지 및 약염기성음이온 교환수지에 통액시켜 염이 제거된 5'-누클레오타이드 함유 통과액을 얻어 이것을 다시 유리형 강산성 양이온 교환수지에 흡착시킨 후 적당한 용리제를 사용하여 흡착된 5'-누클레오타이드를 분별 제조하는 5'-누클레오타이드의 분리 정제 방법에 관한 것이다.In the present invention, the 5'-nucleotide containing a salt is passed through a free strong acid cation exchange resin and a weakly basic anion exchange resin to obtain a 5'-nucleotide containing translucent salt. The present invention relates to a method for separating and purifying 5'-nucleotides by fractionating 5'-nucleotides adsorbed using a suitable eluent after adsorption on a cation exchange resin.

5'-누클레오 타이드는 의약부분에 있어서 대사장해병의 예방치료제, 생장촉진제, 항암제등의 원료로 사용되며 식품분야에 있어서는 조미료로 사용되며 우유를 모유화 시키는데도 사용된다.5'-Nucleotide is used as a raw material for prevention, growth promoting, and anticancer drugs of large intestinal diseases in medicine. It is also used as a seasoning in the food field, and it is also used to breast milk milk.

5'-누클레오타이드 함유액은 직접발효나 합성법, 반합성법 또는 생체조직, 미생물의 배양물이나 이들의 처리물로부터 추출한 핵산에 누클레아제등의 효소를 작용시켜 얻은 핵산 분해물을 포함한다. 이들 5'-누클레오타이드 함유액중에는 단백질분해물로 균체를 포함한 아미노산류, 다당류, 유기산류, 무기염류, 색소등의 불순물을 다량 함유하고 있어 이들을 분리하여 정제하는 방법이 오랫동안 연구되어 왔다.The 5'-nucleotide-containing solution includes a nucleic acid degradation product obtained by applying an enzyme such as nuclease to a nucleic acid extracted from direct fermentation, synthesis, semi-synthesis or biological tissue, microorganism culture or processed product thereof. These 5'-nucleotide-containing liquids contain a large amount of impurities such as amino acids, polysaccharides, organic acids, inorganic salts, and pigments including cells as proteolytic products, and a method of separating and purifying them has long been studied.

지금까지 알려진 정제방법으로는 활성탄처리법, 이온교환막 처리법, 전기투석법, 침전법, 강염기성음이온 교환수지에 의한 정제법, 강산성 양이온 교환수지에 의한 정제법, 탈색수지에 의한 정제법, 탈색수지와 강염기성 음이온 교환수지에 의한 정제법, 2종류의 강산성 양이온 교환수지에 의한정제법, 강산성 양이온 교환수지와 약염기성 음이온 교환수지에 의한 정제법 등이 있다.Purification methods known to date include activated carbon treatment, ion exchange membrane treatment, electrodialysis, precipitation, purification with strong basic anion exchange resin, purification with strong acid cation exchange resin, purification with decoloring resin, decoloring resin and There are a purification method using a strong basic anion exchange resin, a purification method using two strong acid cation exchange resins, and a purification method using a strong acid cation exchange resin and a weakly basic anion exchange resin.

본 발명자등은 여러가지로 검토한 결과 다량의 불순물이 포함된 5'-누클레오타이드 함유액을 유리형 강산성 양이온 교환수지와 약염기성음이온 교환수지의 혼상탑에 통액함으로써, 불순물이 제거된 5'-누클레오타이드 용액을 얻은 후 이것을 다시 강산성 양이온 교환수지에 통액하여 흡착되지 않는 불순물과 구별을 하여 수지에 흡착된 5'-누클레오타이드를 물로써 분획 용출하여 만족스러운 결과를 얻었다.As a result of various studies, the inventors of the present invention have passed 5'-nucleotide-containing liquid containing a large amount of impurities into a mixed column of a free strong acid cation exchange resin and weakly basic anion exchange resin, thereby removing 5'-Nu After obtaining the nucleotide solution, it was passed through the strongly acidic cation exchange resin again to distinguish it from the non-adsorbed impurities, and the 5'-nucleotide adsorbed on the resin was fractionated and eluted with water to obtain satisfactory results.

강산성 양이온 교환수지와 약염기성 음이온 교환수지를 혼상탑으로 사용함으로써 불순물제거가 더욱 효과적으로 수행되어 진것을 순수제조시에 혼상탑에 의하여 비저항이 아주 높은 순수한 물을 얻을 수 있는 것과 마찬가지로 다수단의 탈이온 장치가 연결되어 있는 것 같은 효과를 얻을 수 있어 강산성 양이온 교환수지 한가지만을 사용하였을 때 보다는 약염기성 음이온 교환수지와 같이 혼상으로 사용하였을때에 보다 큰 정제 효과를 얻을 수 있다. 이와 같이 불순물이 다량 제거된 5'-누클레오타이드 용액을 얻은후 강산성 양이온 교환수지에 통액하여 양이온 교환수지에 흡착되지 않는 5-우리딘산과 분별을 하고 수지에 흡착된 5'-누클레오타이드에 있어서는 물로서 분획 용출하여 1분획에서 5'-이노신산을 2분획에서 5'-구아노신산을 3분획에서 5'-시티딜산을 얻는다.By using strong acid cation exchange resin and weakly basic anion exchange resin as a mixed bed, impurities are removed more effectively. As a result of pure water, pure water with very high specific resistance can be obtained by the mixed bed. It is possible to obtain the effect that the device is connected, so that the purification effect is greater when used in a mixed phase such as weakly basic anion exchange resin than when only one strong acid cation exchange resin is used. Thus obtained 5'- nucleotide solution from which a large amount of impurities are removed, it is passed through a strong acid cation exchange resin, fractionated with 5-uridinic acid which is not adsorbed on the cation exchange resin, and then to 5'-nucleotide adsorbed on the resin. In the case of fractional elution as water, 5'-inosinic acid is obtained in one fraction, and 5'-guanocinic acid is obtained in two fractions, and 5'-cytidic acid is obtained in three fractions.

지금까지 알려진바로는 분리조작에 쓰이는 강산성 양이온 교환수지와 5'-누클레오타이드는 서로간에 친화력이 약하기때문에 보통 속도로 통액하면은 거의 수지에 포착되지 않고 대부분의 누클레오타이드가 유출되기 때문에 아주 느리게 통탑하여야만 되었으며 따라서 통액조작이 장시간 소요되어 액의 변질로 수율저하의 원인이 되었던 것이다. 따라서 다량의 이온교환수지가 필요하게되어 공업적으로 이용하기에는 많은 문제점을 가지고 있었다.As far as is known, the strong acid cation exchange resin and 5'-nucleotide used in the separation operation have a weak affinity with each other. It had to be a column tower, and thus, the liquid flow operation took a long time, causing the yield to drop due to the deterioration of the liquid. Therefore, a large amount of ion exchange resin is required, and there are many problems for industrial use.

본 발명에서는 5'-누클레오타이드 함유액을 강산성 양이온 교환수지와 약염기성 음이온 교환수지의 혼상탑에 S V 10-20으로 빠르게 통과시켜 정제된 5'-누클레오타이드 함유액을 얻은후, 이것을 강산성 양이온 교환수지를 이용하여 분리한 결과 혼상탑을 사용하지 않고 직접 5'-누클레오타이드 함유액을 강산성 양이온 교환수지에 의하여 사용할 때의 수지량에 비하여 5분의 1로도 충분하였으며 통탑후 용리제로는 물을 사용하고 통탑한 5'-누클레오타이드 함유액은 불순물이 제거 되었기 때문에 분획에 사용되는 강산성 양이온 교환수지는 재생을 하지 않고도 몇번이고 사용할수도 있다는 장점도 있다.In the present invention, a 5'-nucleotide containing solution is rapidly passed through a mixed column of a strong acid cation exchange resin and a weakly basic anion exchange resin with SV 10-20 to obtain a purified 5'-nucleotide containing solution, which is then strongly acidic. As a result of the separation using the cation exchange resin, one fifth was sufficient as the amount of resin when the 5'-nucleotide-containing liquid was directly used by the strong acid cation exchange resin without using a mixed column tower. Since the 5'-nucleotide containing liquid is water and impurities are removed, the strong acid cation exchange resin used in the fraction can be used again and again without regeneration.

여기에서 사용되는 양이온 교환수지로써는 Dia ion SKIB, PK216, PK212, Amberlite 1R120, 1R120, Dowex 50등이 사용될 수 있고 약염기성 음이온 교환수지로서는 Diaion WA30, Ambelite 1R45, 1R4B등이 사용된다.Dia ion SKIB, PK216, PK212, Amberlite 1R120, 1R120, Dowex 50, etc. may be used as the cation exchange resin used herein, and Diaion WA30, Ambelite 1R45, 1R4B, etc. may be used as the weakly basic anion exchange resin.

이하 상세한 내용을 실시예에 따라 설명하면 다음과 같다.Hereinafter, the details will be described as follows.

[실시예 1]Example 1

효모에서 얻은 리보핵산을 효소분해하여 얻은 5'-리보누클레오타이드 함유액은 11ℓ를 여과하여 여액을 Amberlite 1R120 수지 600ml와 Amberite 1R45 수지 600ml의 혼상탑에 SV=15로 통액하여 얻은 PH₂의 5'-누클레오타이드 함유 용액을 Amberlite IR 120수지 3ℓ의 강산성 양이온 교환수지탑에 SV=0.5로 통액하여 누클레오타이드를 수지에 흡착 시킨후 물로서 서서히 용리하여 흡착력의 차이에 의하여 5'-누클레오타이드류를 분별회수 하였다.Containing a ribonucleic acid is obtained by decomposing enzyme derived from yeast 5'-ribo nucleotide solution of 5 PH ₂ obtained by passing liquid and the filtrate was filtered a 11ℓ to SV = 15 to the horn sangtap of Amberlite 1R120 resin 600ml and 600ml Amberite 1R45 resin '-Nucleotide-containing solution was passed through a strong acid cation exchange resin column of 3 liters of Amberlite IR 120 resin (SV = 0.5) to adsorb nucleotides to the resin, and then slowly eluted as water. Tide was fractionated.

이때 5'-우리딜산이 통액시 먼저 유출되어 나오고 물로 용리할때 5'-이노신산 5'-구아닐산 5'-시티딜산의 순서로 용출되어 나온다.At this time, 5'-uricidic acid flows out first when it passes through, and when eluted with water, it is eluted in the order of 5'-inosinic acid 5'-guanylic acid 5'-cytidylic acid.

이들을 각각 분획하여 NaOH로서 PH 7.0∼8.5로 조정하여 나트륨염으로 만든후 공지의 방법에 의하여 감압하에 농축하여 50-70%함수 알콜로 결정을 석출시킨 결과 5'-우리딜산나트륨 10.2g 5'-이노신산나트륨 16.8g 5'-구아닐산나트륨 15.4g 5'-시티딜 산 12.7g을 얻었다.Each of these fractions were adjusted to pH 7.0 to 8.5 as NaOH, made into sodium salt, and concentrated under reduced pressure by a known method to precipitate crystals with 50-70% functional alcohol. 5'-Sodium uridine 10.2 g 5'- Sodium inosinoate 16.8 g 5'-sodium guanylate 15.4 g 5'-cytidylic acid 12.7 g was obtained.

[실시예 2]Example 2

직접 발효에 의하여 얻은 이노신산과 구아닐산을 함유한 액 6ℓ를 Diaion SKIB 수지 1ℓ와 Diaion WA 30수지 1ℓ의 혼상탑에 SV=10으로 통액하여 얻은 PH2, 3의 이노신산과 구아닐산을 함유한 산성용액을Diaion SKIB 수지 4ℓ의 강산성 양이온 교환수지탑에 SV=0.6으로 통액하여 흡착시킨후 물로서 서서히 용리한 결과 흡착력의 차이에 의하여 이노신산이 먼저 용출되었고 뒤이어 구아닐산이 용출되어 나왔다.6 ml of inosinic acid and guanylic acid obtained by direct fermentation were passed through a mixed column of 1 L of Diaion SKIB resin and 1 L of Diaion WA 30 resin with SV = 10. After 4L of strong acidic cation exchange resin resin was passed through and adsorbed with SV = 0.6, slowly eluted as water. Inosine acid was eluted first due to the difference in adsorption power, followed by guanylic acid.

이들을 분획하여 NaOH로서 PH 7.0-8.5로 조정하여 나트륨염으로 만든후 실시예 1과 같은 방법으로 처리하여 이노신산나트륨과 구아닐산나트륨의 제품 62g을 얻었다.The mixture was fractionated, adjusted to PH 7.0-8.5 as NaOH, made of sodium salt, and treated in the same manner as in Example 1 to obtain 62 g of a product of sodium inosinate and sodium guanylate.

Claims

The nucleotide-containing liquid obtained by fermentation and synthesis or ribonucleic acid was desalted by passing SV 10-20 through a mixed-phase or double-phase resin column using a strong acidic cation exchange resin and a weakly basic anion exchange resin. '-Nucleotide-containing pass-through liquid is fractionated with impurities which are not adsorbed on the strong acid cation exchange resin and passed through the resin to fractionally elute nucleotides adsorbed on the resin as water to obtain 5'-uridic acid 5'-inosinic acid 5 Separation and purification method of various nucleotides characterized by obtaining '-guanylic acid 5'-cytidylic acid.