KR20240135699A - 개파보바이러스 특이적 항체 cpv-f12 및 이를 포함하는 개파보바이러스 감염증 치료용 약제학적 조성물 - Google Patents
개파보바이러스 특이적 항체 cpv-f12 및 이를 포함하는 개파보바이러스 감염증 치료용 약제학적 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 개파보바이러스 특이적 항체 CPV-B3 및 이를 포함하는 개파보바이러스 감염증 치료용 약제학적 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 개파보바이러스 특이적 항체 CPV-B3 및 이를 포함하는 개파보바이러스 감염증 치료용 약제학적 조성물을 이용하는 경우, 동물사육시설이 필요하지 않아 동물 복지 측면의 문제를 해소할 수 있으며, 항체 라이브러리에서 목표항체의 선발부터 생산까지에 소요되는 시간을 단축시킬 수 있다. 또한, 개파보바이러스 특이적 항체를 이용한 치료제를 개발하여 개파보바이러스 감염증을 효과적으로 치료할 수 있다.
본 발명의 개파보바이러스 특이적 항체 CPV-B3 및 이를 포함하는 개파보바이러스 감염증 치료용 약제학적 조성물을 이용하는 경우, 동물사육시설이 필요하지 않아 동물 복지 측면의 문제를 해소할 수 있으며, 항체 라이브러리에서 목표항체의 선발부터 생산까지에 소요되는 시간을 단축시킬 수 있다. 또한, 개파보바이러스 특이적 항체를 이용한 치료제를 개발하여 개파보바이러스 감염증을 효과적으로 치료할 수 있다.
Description
본 발명은 개파보바이러스 특이적 항체 CPV-F12 및 이를 포함하는 개파보바이러스 감염증 치료용 약제학적 조성물에 관한 것이다.
개파보바이러스 (Canine parvovirus, CPV) 감염증은 1978년경 북아메리카 지역에서 발생하여 전세계적으로 퍼졌으며, 우리나라에서도 1981년 처음 발생하여 매년 전국적으로 발생하고 있는 전염병이다. 나이와 계절에 상관없이 발병할 수 있고 치사율이 높으며, 병원균은 저항성이 강해 분변 내에 7일까지 감염성을 유지한다.
개파보바이러스 감염증은 크게 심근염형과 장염형으로 구분할 수 있으며, 심근염형은 약 4주령 미만의 강아지에서 드물게 나타나며, 심장형에서는 좌심실을 중심으로 비화농성 심근염을 특징으로 하고, 일반적으로 급성으로 진행되어 폐사율이 높고 예후도 불량하다. 장염형은 4주령 강아지에서 어른 개까지 널리 발병하며, 백혈구의 현저한 감소, 출혈성 설사, 구토, 탈수 또는 저혈량성/독혈성 쇼크와 같은 증상이 발생한다. 임상증상과 병리소견은 고양이 범백혈구 감소증 (Feline Panleukopenia: FPL)과 유사하고 이에 대한 치료는 대중요법이 효과적으로 알려져 있다. 파보바이러스는 감염된 개의 설사분변을 통해 입으로 감염되며, 급성형의 경우 감염 후 1-2주간 엄청난 양의 바이러스가 분변을 통해 배출되고, 배출된 바이러스는 보통의 생활환경에서 수개월간 생존하며 병원성이 유지된다. 현재, 개파보바이러스에 감염된 환축의 치료를 위한 치료제로, 동물병원에서는 고도면역혈청을 구매하여 치료제로 사용되고 있다.
CPV는 파보바이러스 개 미니트 바이러스 (CMV 또는 CPV-1)과 구분하기 위해 "CPV-2"로 기재한다. CPV-2는 일반적으로 고양이 범백혈구 감소증 바이러스 (Feline panleukopenia virus: FPV)나 밍크 장 바이러스 (Mink enteric virus: MEV)의 유전자 변이체인 것으로 생각되었으며, 밍크, 여우, 라쿤 및 그 외 육식 동물을 감염시키는 파보바이러스와 유전자 및 항원 측면에서 매우 가까운 관계이다. CPV 캡시드는 선택적 mRNA 스플라이싱으로 인해 4개 이상의 단백질이 코딩되지만, 2개의 ORF (open reading frame)를 가진 약 5,200개의 염기로 구성된 단일 가닥의 DNA 게놈을 포함하고 있다. 파보바이러스의 캡시드는 2종의 바이러스 단백질 (VP) VP1 및 VP2로 구성되어 있으며, 이중 VP2가 주요 면역원성 파보바이러스 캡시드 단백질이다.
1975년, Kohler와 Milstein에 의해 개발된 하이브리도마 (hybridoma) 융합기술과 마우스 단클론항체 (monoclonality antibody, mAb)를 유전자 조작하여 인간화시키는 인간화 항체 제작이 가능해짐에 따라 단클론항체의 대량 생산이 가능해져 치료용 항체가 활용될 수 있는 기틀을 마련하였다. 사람에서는 병원체에 감염된 환자의 병원체 특이 항체를 가진 B 림프구 세포를 분리하여 단클론항체 유전자를 클로닝하여 발현하는 기술을 치료용 항체 개발에 활용하고 있다. 약 1,010개 이상의 방대한 인간 B세포 항체 유전자 라이브러리를 가진 파아지 발현 기술 또한 높은 친화력을 가진 항체를 쉽고 신속하게 선발할 수 있어, 치료용 항체 개발에 활용하고 있다.
하지만 현재 수의 분야에서 바이러스 치료용 항체는 주로 숙주동물의 항혈청, 토끼와 같은 실험동물을 이용하여 생산된 항체 또는 마우스 하이브리도마를 이용한 단클론항체 등을 동물병원에서 제한적으로 사용하고 있지만, 항체 치료제로 제품화되어 있지 않은 실정이다. 동물을 사용한 항체 치료제 생산은 6 ~ 12개월의 장기간의 제작기간이 소요되고, 동물 복지 측면의 문제가 있으며, 항체 생산 공여 동물의 다른 감염원 오염 가능성이 있다.
따라서, 개 항체 라이브러리를 구축하고, 개파보바이러스에 반응하는 항체만을 선발해 시험관 내에서 대량 생산하는 시스템을 구축하게 된다면, 동물사육시설이 필요하지 않아 동물 복지 측면의 문제를 해소할 수 있으며, 항체 라이브러리에서 목표항체의 선발부터 생산까지에 소요되는 시간을 단축시킬 수 있다. 또한, 개파보바이러스 특이적 항체를 이용한 치료제를 개발하여 개파보바이러스 감염증을 효과적으로 치료할 수 있을 것으로 기대된다.
Sook Hee Yoon et al., Molecular insights into the phylogeny of canine parvovirus 2 (CPV-2) with emphasis on Korean isolates: a Bayesian approach, Arch Virol., 2009, 154 (8): 1353-60
본 발명자들은 개파보바이러스 특이적 항체 CPV-F12 및 이를 포함하는 개파보바이러스 감염증 치료용 약제학적 조성물을 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 개 항체 라이브러리를 구축하고, 개파보바이러스에 특이적인 항체를 선발하였으며, 개파보바이러스 특이적 항체를 이용한 치료제를 개발함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명의 목적은 개파보바이러스 (Canine parvovirus, CPV)에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 항체 또는 항원 결합 단편을 인코딩하는 핵산을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 재조합 벡터를 포함하는 숙주세포를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 개파보바이러스에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항원 결합 단편 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1, 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2 및 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3를 포함하는 경쇄 가변영역; 및 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1, 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2, 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3를 포함하는 중쇄 가변영역을 포함하는 개파보바이러스 (Canine parvovirus, CPV)에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 제공한다.
본 발명에서 "개파보바이러스 (Canine Parvovirus, CPV)"는 강아지를 감염시키는 장내 병원체를 의미한다. 개파보바이러스에 감염되면 5주령이 지난 강아지 및 개에서는 급성 설사, 탈수, 구토, 발열 및 백혈구 감소증과 같은 증상이 나타나며, 보다 어린 강아지에서는 심근 질환이 발생한다. 백신 접종을 하지 않은 개의 경우, 개파보바이러스 감염에 의해 치사율이 매우 높다.
본 발명에서 사용되는 용어 "항체 (antibody)"는 상기 개파보바이러스에 대해 특이적인 항체로서, 완전한 항체 형태뿐만 아니라 항체 분자의 항원 결합 단편을 포함한다.
완전한 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 이종이량체 (heterodimer) 구조이며, 각각의 경쇄는 중쇄와 이황화 결합 (disulfide bond)으로 연결되어 있다.
항체의 "불변 영역 (constant region, C region)"은 중쇄 불변 영역과 경쇄 불변 영역으로 나뉘어지며, 중쇄 불변 영역은 알파 (α), 감마 (γ), 뮤 (μ), 델타 (δ) 및 엡실론 (ε) 타입을 가지고, 서브클래스로 알파1 (α1), 알파2 (α2), 감마1 (γ1), 감마2 (γ2), 감마3 (γ3), 및 감마4 (γ4)를 가진다. 중쇄의 불변 영역의 타입에 따라 IgA, IgM, IgD, IgG, IgE 와 같이 항체의 class가 결정된다. 알파 (α) 사슬과 감마 (γ) 사슬의 종류에 따라 subclass로 더 나뉠 수 있다. 경쇄의 불변영역은 카파 (κ) 및 람다 (λ) 타입을 가진다.
"가변 영역 (variable region, V region)"은 항체를 항원에 결합시키는 것과 관련되는 중쇄 또는 경쇄의 도메인을 의미한다. Native 항체의 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인 (각각 VH 및 VL)은 일반적으로 유사한 구조를 가지며, 각 도메인은 4 개의 보존된 프레임워크 영역 (framework regions, FR) 및 3 개의 초가변 영역 (hypervariable regions, HVR)을 포함한다. 단일 VH 또는 VL 도메인은 항원-결합 특이성을 부여하기에 충분할 수 있다. 또한, 특정 항원에 결합하는 항체는, 항원과 결합하여 각각 상보적인 VL 또는 VH 도메인의 라이브러리를 스크리닝하는 항체로부터, VH 또는 VL 도메인을 사용하여 분리될 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어 "항원 결합 단편 (antigen-binding fragment)"은 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 의미하며, 예를 들어, Fab, Fab', F(ab')2, Fv 또는 scFv일 수 있으나, 이에 한정하지 않는다. 항체 단편 중 Fab는 경쇄 및 중쇄의 가변영역과 경쇄의 불변 영역 및 중쇄의 첫 번째 불변 영역 (CH1)을 가지는 구조로 1개의 항원 결합 부위를 가진다. Fab'는 중쇄 CH1 도메인의 C-말단에 하나 이상의 시스테인 잔기를 포함하는 힌지 영역 (hinge region)을 가진다는 점에서 Fab와 차이가 있다. F(ab')2 항체는 Fab'의 힌지 영역의 시스테인 잔기가 이황화 결합을 이루면서 생성된다. Fv는 중쇄 가변부위 및 경쇄 가변부위만을 가지고 있는 최소의 항체조각으로 Fv 단편을 생성하는 재조합 기술은 PCT 국제 공개특허출원 WO 88/10649, WO 88/106630, WO 88/07085, WO 88/07086 및 WO 88/09344에 개시되어 있다. 이중쇄 Fv (two-chain Fv)는 비공유 결합으로 중쇄 가변부위와 경쇄 가변부위가 연결되어 있다. 단쇄 Fv (single-chain Fv, scFv)는 일반적으로 펩타이드 링커를 통하여 중쇄의 가변 영역과 단쇄의 가변 영역이 공유 결합으로 연결되거나 또는 C-말단에서 바로 연결되어 있어서 이중쇄 Fv와 같이 다이머 (dimer)와 같은 구조를 이룰 수 있다. 이러한 항원 결합 단편은 파파인 (papain) 및 펩신 (pepsin)과 같은 단백질 가수분해 효소를 이용한 방법 또는 유전자 재조합 기술을 통하여 제작할 수 있다.
본 발명에서 항체는 scFv 형태이거나 완전한 항체 형태일 수 있다. 또한, 중쇄 불변 영역은 알파 (α), 감마 (γ), 뮤 (μ), 델타 (δ) 또는 엡실론 (ε) 타입중의 어느 한 아이소타입 (isotype)으로부터 선택될 수 있으며, 경쇄 불변 영역은 카파 (κ) 또는 람다 (λ) 타입일 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어 "중쇄 (heavy chain)"는 항원에 특이성을 부여하기 위해 충분한 가변 영역 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변 영역 도메인 VH 및 3개의 불변 영역 도메인 CH1, CH2 및 CH3를 포함하는 전체길이 중쇄 및 이의 단편을 모두 의미한다.
본 발명에서 사용되는 용어 "경쇄 (light chain)"은 항원에 특이성을 부여하기 위한 충분한 가변영역 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변 영역 도메인 VL 및 불변 영역 도메인 CL을 포함하는 전체길이 경쇄 및 이의 단편을 모두 의미한다.
본 발명에서 사용되는 용어 "상보성 결정 영역 (complementarity determining region, CDR)"은 면역글로불린 중쇄 및 경쇄의 초가변 영역 (hypervariable region, HVR)의 아미노산 서열을 의미한다. 중쇄 (HCDR1, HCDR2 및 HCDR3) 및 경쇄 (LCDR1, LCDR2 및 LCDR3)에는 각각 3개의 CDRs이 포함되어 있다. CDR은 항체가 항원 또는 에피토프 (epitope)에 결합하는 데 있어서 주요한 접촉 잔기를 제공한다.
본 발명에서 사용되는 용어 "프레임 워크 (Framework, FR)"는 초가변 영역 (hypervariable region, HVR) 잔기 이외의 가변 도메인 잔기를 나타낸다. 가변 도메인의 FR은 일반적으로 4 개의 FR 도메인 FR1, FR2, FR3 및 FR4로 구성된다. 따라서, HVR 및 FR 서열은 일반적으로 VH (또는 VL)에서 다음의 순서로 나타난다:
(a) FRH1(Framework region 1 of Heavy chain)-CDRH1 (complementarity determining region 1 of Heavy chain)-FRH2-CDRH2-FRH3-CDRH3-FRH4; 및
(b) FRL1(Framework region 1 of Light chain)-CDRL1(complementarity determining region 1 of Light chain)-FRL2-CDRL2-FRL3-CDRL3-FRL4.
본 발명의 항체는 또한 당 업계에 알려져 있는 다양한 파지 디스플레이 (phage display) 방법을 사용하여 생성될 수 있고, [Brinkman et al., 1995, J. Immunol. Methods, 182:41-50]; [Ames et al., 1995, J. Immunol. Methods, 184, 177-186]; [Kettleborough et al., 1994, Eur. J. Immunol, 24, 952-958]; [Persic et al., 1997, Gene, 187, 9-18]; 및 [Burton et al., 1994, Adv. Immunol., 57, 191-280]; WO 90/02809; WO 91/10737; WO 92/01047; WO 92/18619; WO 93/11236; WO 95/15982; 및 WO 95/20401; 및 US 5,698,426; 5,223,409; 5,403,484; 5,580,717; 5,427,908; 5,750,753; 5,821,047; 5,571,698; 5,427,908; 5,516,637; 5,780,225; 5,658,727; 5,733,743; 및 5,969,108 에 게시된 것을 포함한다.
본 발명에서 사용되는 용어 "특이적으로 결합한다" 또는 이와 같은 용어는, 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 또는 scFv와 같은 다른 구성물이 생리적 조건 하에서 비교적 안정한 항원과 복합체를 형성한다는 것을 의미한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명의 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 서열번호 7번의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄가변영역; 및 서열번호 8번의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄가변영역을 포함한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명의 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 서열번호 9번의 아미노산 서열을 포함하는 scFv (single chain variable fragment)을 포함한다.
상기 개파보바이러스에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 통상의 기술자가 인지하는 바와 같이, 개파보바이러스를 특이적으로 인식할 수 있는 범위 내에서 아미노산 서열의 변이체를 포함할 수 있다. 예를 들면, 항체의 결합 친화도 및/또는 기타 생물학적 특성을 개선시키기 위하여 항체의 아미노산 서열에 변화를 줄 수 있다. 이러한 변형은 예를 들어, 항체의 아미노산 서열 잔기의 결실, 삽입 및/또는 치환을 포함한다.
상기 변이체는 "실질적 유사성"을 가지는 것으로, 2개의 펩타이드 서열이 디폴트 갭 가중치를 사용하는 프로그램 GAP 또는 BESTFIT에 의해서와 같이 최적으로 정렬되는 경우에 적어도 약 90%의 서열 동일성, 더욱 바람직하게는 적어도 약 95%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 공유함을 의미한다. 바람직하게는, 동일하지 않은 잔기 위치는 보존적 아미노산 치환에 의해 상이하다. "보존적 아미노산 치환"은 아미노산 잔기가 유사한 화학적 특성 (예: 전하 또는 소수성)을 갖는 측쇄 (R기)를 갖는 또 다른 아미노산 잔기에 의해 치환된 것이다. 일반적으로, 보존적 아미노산 치환은 단백질의 기능성을 실질적으로 변화시키지 않는다. 2개 이상의 아미노산 서열이 보존적 치환에 의해 서로 상이한 경우에, 유사성의 퍼센트 또는 정도는 치환의 보존적 성질을 보정하기 위해 상향 조절될 수 있다.
이러한 아미노산의 변이는 아미노산 곁사슬 치환체의 상대적 유사성, 예를 들어, 소수성, 친수성, 전하, 크기와 같은 특성에 기초하여 이루어진다. 예를 들어, 아르기닌, 라이신과 히스티딘은 모두 양전하를 띤 잔기이고, 알라닌, 글라이신과 세린은 유사한 크기를 가지며, 페닐알라닌, 트립토판과 타이로신은 유사한 모양을 갖는다. 따라서, 상기 고려 사항에 기초하여, 아르기닌, 라이신과 히스티딘; 알라닌, 글라이신과 세린; 및 페닐알라닌, 트립토판과 타이로신은 생물학적으로 기능 균등물이라 할 수 있다.
변이를 도입하는 데 있어서, 아미노산의 소수성 인덱스 (hydropathic idex)가 고려될 수 있다. 각각의 아미노산은 소수성과 전하에 따라 소수성 인덱스가 부여되어 있다: 아이소류신 (+4.5); 발린 (+4.2); 류신 (+3.8); 페닐알라닌 (+2.8); 시스테인 (+2.5); 메티오닌 (+1.9); 알라닌 (+1.8); 글라이신 (-0.4); 트레오닌 (-0.7); 세린 (-0.8); 트립토판 (-0.9); 타이로신 (-1.3); 프롤린 (-1.6); 히스티딘 (-3.2); 글루타메이트 (-3.5); 글루타민 (-3.5); 아스팔테이트 (-3.5); 아스파라긴 (-3.5); 라이신 (-3.9); 및 아르기닌 (-4.5).
단백질의 상호적인 생물학적 기능 (interactive biological function)을 부여하는 데 있어서 소수성 아미노산 인덱스는 매우 중요하다. 유사한 소수성 인덱스를 가지는 아미노산으로 치환하여야 유사한 생물학적 활성을 보유할 수 있다는 것은 공지된 사실이다. 소수성 인덱스를 참조하여 변이를 도입시키는 경우, 바람직하게는 ± 2 이내, 보다 바람직하게는 ± 1 이내, 보다 더 바람직하게는 ± 0.5 이내의 소수성 인덱스 차이를 나타내는 아미노산 사이에서 치환을 한다.
한편, 유사한 친수성 값 (hydrophilicity value)을 가지는 아미노산 사이의 치환이 균등한 생물학적 활성을 갖는 단백질을 초래한다는 것도 잘 알려져 있다. 미국 특허 제4,554,101호에 개시된 바와 같이, 다음의 친수성 값이 각각의 아미노산 잔기에 부여되어 있다: 아르기닌 (+3.0); 라이신 (+3.0); 아스팔테이트 (+3.0± 1); 글루타메이트 (+3.0±1); 세린 (+0.3); 아스파라긴 (+0.2); 글루타민 (+0.2); 글라이신 (0); 트레오닌 (-0.4); 프롤린 (-0.5 ± 1); 알라닌 (-0.5); 히스티딘 (-0.5); 시스테인 (-1.0); 메티오닌 (-1.3); 발린 (-1.5); 류신 (-1.8); 아이소류신 (-1.8); 타이로신 (-2.3); 페닐알라닌 (-2.5); 트립토판 (-3.4).
친수성 값을 참조하여 변이를 도입시키는 경우, 바람직하게는 ± 2 이내, 보다 바람직하게는 ± 1 이내, 보다 더 바람직하게는 ± 0.5 이내의 친수성 값 차이를 나타내는 아미노산 사이에서 치환을 한다.
한편, 분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 단백질에서의 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다. 가장 통상적으로 일어나는 교환은 아미노산 잔기 Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Thy/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, Asp/Gly 간의 교환이다.
상기 생물학적 균등 활성을 갖는 변이를 고려한다면, 상기 개파보바이러스에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 서열번호에 기재된 서열과 실질적인 동일성 (substantial identity)을 나타내는 서열도 포함하는 것으로 해석될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 본 발명의 개파보바이러스에 특이적으로 결합하는 상기 항체 또는 항원 결합 단편은 CPV-F12로 표현된다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 개파보바이러스에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 인코딩하는 핵산 분자를 제공한다.
본 발명에 사용되는 용어 "핵산 분자"는 DNA (gDNA 및 cDNA) 그리고 RNA 분자를 포괄적으로 의미한다. 핵산 분자에서 기본 구성 단위인 뉴클레오타이드는 자연의 뉴클레오타이드뿐만 아니라, 당 또는 염기 부위가 변형된 유사체 (analogue)도 포함한다. 상기 뉴클레오타이드는 상기 개파보바이러스에 특이적으로 결합하는 항체의 중쇄 가변 영역 또는 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열뿐만 아니라, 그 서열에 상보적인 (complementary) 서열도 포함한다.
상술한 생물학적 균등 활성을 갖는 변이를 고려한다면, 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 구성하는 아미노산 서열을 코딩하는 본 발명의 핵산 분자는 이와 실질적인 동일성 (substantial identity)을 나타내는 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 상기의 실질적인 동일성은, 상기한 본 발명의 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인 (align)하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인된 서열을 분석한 경우에, 최소 60% 이상의 상동성 (예컨대 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 또는 69%), 보다 구체적으로는 70% 이상의 상동성 (예컨대 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 또는 79%), 보다 더 구체적으로는 80% 이상의 상동성 (예컨대 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 또는 89%), 보다 더욱더 구체적으로는 90% 이상의 상동성 (예컨대 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%), 가장 구체적으로는 95% 이상의 상동성 (예컨대 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%)을 나타내는 서열을 의미한다. 상기 60% 이상 100% 이하의 모든 정수 및 이 사이에 존재하는 소수는 % 상동성과 관련하여 본 발명의 범위 내에 포함된다.
본 발명의 또 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 상기 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.
본 명세서에서 용어 "벡터 (vector)"는 숙주 세포에서 목적 유전자를 발현시키기 위한 수단으로 플라스미드 (plasmid) 벡터, 박테리오파지 (bacteriophage) 벡터, 파지미드 (phagemid) 벡터, 코스미드 (cosmid) 벡터, 세균 인공 염색체 (bacterial artificial chromosomes, BACs), 효모 인공 염색체 (yeast artificial chromosomes, YACs), 아데노바이러스 (adenoviruses) 벡터; 레트로바이러스(retroviruses) 벡터 및 렌티바이러스 (lentiviruses) 벡터 등을 포함한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 벡터에서 경쇄 가변영역을 코딩하는 핵산 분자 및 중쇄 가변영역을 코딩하는 핵산 분자는 프로모터와 작동적으로 결합 (operatively linked)되어 있다.
본 발명에서 표현 "작동적으로 연결된 (operatively liked)"은 핵산 발현 조절 서열과 목적하는 단백질 또는 RNA를 코딩하는 핵산 서열이 기능적으로 연결 (functional linkage)되어 있는 것을 의미한다. 즉, 상기 표현은 단백질 또는 RNA를 코딩하는 핵산 서열이 발현 조절 서열에 의해 유전자 발현이 가능하게 되는 방식으로 연결된 것을 의미하는 것으로, 예를 들어, 프로모터와 단백질 또는 RNA를 코딩하는 핵산 서열이 작동 가능하게 연결되어야 코딩하는 핵산 서열의 발현에 영향을 미칠 수 있다. 재조합 벡터와의 작동적 연결은 당해 기술분야에서 잘 알려진 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조할 수 있으며, 부위-특이적 DNA 절단 및 연결은 당해 기술 분야에서 일반적으로 알려진 효소 등을 사용한다.
본 발명의 벡터는 전형적으로 클로닝을 위한 벡터 또는 발현을 위한 벡터로서 구축될 수 있다. 또한, 본 발명의 벡터는 원핵 세포 또는 진핵 세포를 숙주로 하여 구축될 수 있다.
예를 들어, 본 발명의 벡터가 발현 벡터이고, 진핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 포유동물 세포의 게놈으로부터 유래된 프로모터 (예: 메탈로티오닌 프로모터, 베타-액틴 (β-actin) 프로모터, 사람 헤로글로빈 프로모터 및 사람 근육 크레아틴 프로모터) 또는 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터 (예: 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40 프로모터, 사이토메갈로바이러스 프로모터, HSV의 tk 프로모터, 마우스 유방 종양 바이러스 (MMTV) 프로모터, HIV의 LTR 프로모터, 몰로니 바이러스의 프로모터 엡스타인 바 바이러스 (EBV)의 프로모터 및 로우스 사코마 바이러스 (RSV)의 프로모터)가 이용될 수 있으며, 전사 종결 서열로서 폴리아데닐화 서열을 일반적으로 갖는다.
본 발명의 벡터는 그로부터 발현되는 항체의 정제를 용이하게 하기 위하여, 다른 서열과 융합될 수도 있다. 융합되는 서열은 예컨대, 글루타티온 S-트랜스퍼레이즈 (Pharmacia, USA), 말토스 결합 단백질 (NEB, USA), FLAG (IBI, USA) 및 6x His (hexahistidine; Quiagen, USA) 등이 있다.
또한, 본 발명의 벡터에 의해 발현되는 단백질이 항체이기 때문에, 정제를 위한 추가적인 서열 없이도, 발현된 항체는 단백질 A 컬럼 등을 통하여 용이하게 정제할 수 있다.
한편, 본 발명의 발현 벡터는 선택표지로서, 당업계에서 통상적으로 이용되는 항생제 내성 유전자를 포함하며, 예를 들어 암피실린, 겐타마이신, 카베니실린, 클로람페니콜, 스트렙토마이신, 카나마이신, 제네티신, 네오마이신 및 테트라사이클린에 대한 내성 유전자가 있다.
한편, 상기 항체의 중쇄 가변영역 및 경쇄 가변영역을 발현할 수 있는 벡터는 중쇄 가변영역 및 경쇄 가변영역이 하나의 벡터에서 동시에 발현되는 벡터 시스템이거나 또는 중쇄 가변영역 및 경쇄 가변영역을 각각 별도의 벡터에서 발현시키는 시스템 모두 가능하다. 후자의 경우, 두 벡터는 동시 형질전환 (co-transformation) 및 표적 형질전환 (targeted transformation)을 통하여 숙주세포로 도입될 수 있다.
본 발명에 일 양태에 따르면, 본 발명은 재조합 벡터를 포함하는 숙주세포를 제공한다.
본 발명의 벡터를 안정되면서 연속적으로 클로닝 및 발현시킬 수 있는 숙주 세포는 당업계에 공지되어 어떠한 숙주 세포도 이용할 수 있으며, 예컨대, 상기 벡터의 적합한 진핵세포 숙주 세포는 원숭이 신장 세포 7 (COS7: monkey kidney cells), NSO 세포, SP2/0, 차이니즈 햄스터 난소 (CHO: Chinese hamster ovary) 세포, W138, 어린 햄스터 신장 (BHK: baby hamster kidney) 세포, MDCK, 골수종 세포주, HuT 78 세포 및 HEK-293 세포를 포함하나 이에 한정되지 않는다.
본 명세서에서 용어 "형질전환된", "형질도입된" 또는 "형질감염된”은 외인성 핵산이 숙주세포 내로 전달되거나 도입되는 과정을 지칭한다. "형질전환된”, "형질도입된" 또는 "형질감염된" 세포는 외인성 핵산으로 형질전환, 형질도입 또는 형질감염된 세포이며, 상기 세포는 당해 세포 및 그의 계대 배양으로 인한 자손 세포를 포함한다.
본 발명의 또 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 본 발명의 개파보바이러스에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항원 결합 단편을 포함하는, 개파보바이러스 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "치료"란, 본 발명에 따른 약제학적 조성물의 투여에 의해 상기 질병의 발생 또는 재발 억제, 증상의 완화, 질병의 임의의 직접 또는 간접적인 병리학적 결과의 감소, 질병 진행 속도의 감소, 질병 상태의 개선, 호전, 완화 또는 개선된 예후 등을 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "예방"이란, 본 발명에 따른 약제학적 조성물의 투여에 의해 상기 질병의 발병을 억제시키거나 진행을 진행시키는 모든 행위를 의미한다.
본 발명의 개파보바이러스에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항원 결합 단편을 포함하는 본 발명의 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체 및 희석제를 추가로 포함할 수 있다. 상기 약제학적으로 허용되는 담체 및 희석제는 이를 이식받을 수혜 동물에 대해 생물학적 및 생리학적으로 친화적인 것일 수 있다. 약제학적으로 허용되는 희석제의 예로는 염수, 수용성 완충액, 용매 또는 분산제 (dispersion media)를 들 수 있으나 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 약제학적 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구 투여 (예를 들어, 정맥 내, 피하, 잇몸, 근육 내, 복강 내 또는 국소에 적용)할 수 있으며, 투여량은 환축의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경 로 및 시간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 약제학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에 있어서 "약제학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효량은 환축의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다.
본 발명에 따른 약제학적 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고, 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
구체적으로 본 발명의 약제학적 조성물의 유효량은 환축의 나이, 성별, 상태, 체중, 체내에 활성 성분의 흡수도, 불활성율 및 배설속도, 질병 종류, 병용되는 약물에 따라 달라질 수 있다.
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:
(a) 본 발명은 개파보바이러스 (Canine parvovirus, CPV)에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 제공한다.
(b) 본 발명은 상기 항체 또는 항원 결합 단편을 인코딩하는 핵산을 제공한다.
(c) 본 발명은 상기 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.
(d) 본 발명은 상기 재조합 벡터를 포함하는 숙주세포를 제공한다.
(e) 본 발명은 개파보바이러스에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항원 결합 단편 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.
(f) 본 발명의 개파보바이러스 특이적 항체 CPV-F12 및 이를 포함하는 개파보바이러스 감염증 치료용 약제학적 조성물을 이용하는 경우, 동물사육시설이 필요하지 않아 동물 복지 측면의 문제를 해소할 수 있으며, 항체 라이브러리에서 목표항체의 선발부터 생산까지에 소요되는 시간을 단축시킬 수 있다. 또한, 개파보바이러스 특이적 항체를 이용한 치료제를 개발하여 개파보바이러스 감염증을 효과적으로 치료할 수 있다.
도 1은 VH, VLλ 및 VLκ chain의 PCR 증폭을 확인한 결과를 나타낸다.
도 2는 2개 클론 (CPV-B3, CPV-F12)의 아미노산 서열을 비교한 결과를 나타낸다.
도 3은 항체치료제 후보주 (CPV-B3-Fc, CPV-F12-Fc)와 개파보바이러스를 CRFK 세포에 감작 후 Immunofluorescence assay로 염색한 결과를 나타낸다.
도 4는 항체치료제 후보주 (CPV-B3-Fc, CPV-F12-Fc) 농도별 개파보바이러스 증식 억제능을 확인한 결과를 나타낸다.
도 5는 항체치료제 후보주 (CPV-B3-Fc, CPV-F12-Fc)가 세포(A72, CRFK, MDCK cell)의 세포생존율에 영향을 주는지 여부를 확인한 결과를 나타낸다.
도 6은 항체치료제 후보주 (CPV-B3-Fc, CPV-F12-Fc)를 마우스에 접종 후 체온과 체중 변화를 확인한 결과를 나타낸다.
도 7은 개파보바이러스 야외주(CPV2a)를 마우스에 접종 후 체온과 체중변화를 확인한 결과를 나타낸다.
도 8은 개파보바이러스 항체치료제 후보주(CPV-B3-Fc)의 바이러스 증식 억제 확인 시험을 위한 모식도와 그룹을 나타낸다.
도 9는 개파보바이러스 야외주 감염 전후에 개파보바이러스 항체치료제(CPV-B3-Fc)를 농도별로 접종 후 체온과 체중 변화를 나타낸다.
도 2는 2개 클론 (CPV-B3, CPV-F12)의 아미노산 서열을 비교한 결과를 나타낸다.
도 3은 항체치료제 후보주 (CPV-B3-Fc, CPV-F12-Fc)와 개파보바이러스를 CRFK 세포에 감작 후 Immunofluorescence assay로 염색한 결과를 나타낸다.
도 4는 항체치료제 후보주 (CPV-B3-Fc, CPV-F12-Fc) 농도별 개파보바이러스 증식 억제능을 확인한 결과를 나타낸다.
도 5는 항체치료제 후보주 (CPV-B3-Fc, CPV-F12-Fc)가 세포(A72, CRFK, MDCK cell)의 세포생존율에 영향을 주는지 여부를 확인한 결과를 나타낸다.
도 6은 항체치료제 후보주 (CPV-B3-Fc, CPV-F12-Fc)를 마우스에 접종 후 체온과 체중 변화를 확인한 결과를 나타낸다.
도 7은 개파보바이러스 야외주(CPV2a)를 마우스에 접종 후 체온과 체중변화를 확인한 결과를 나타낸다.
도 8은 개파보바이러스 항체치료제 후보주(CPV-B3-Fc)의 바이러스 증식 억제 확인 시험을 위한 모식도와 그룹을 나타낸다.
도 9는 개파보바이러스 야외주 감염 전후에 개파보바이러스 항체치료제(CPV-B3-Fc)를 농도별로 접종 후 체온과 체중 변화를 나타낸다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예
본 명세서 전체에 걸쳐, 특정 물질의 농도를 나타내기 위하여 사용되는 "%"는 별도의 언급이 없는 경우, 고체/고체는 (중량/중량) %, 고체/액체는 (중량/부피) %, 그리고 액체/액체는 (부피/부피) %이다.
실시예 1: 개파보바이러스 (CPV) 항원의 준비
본 발명자들은 본 발명에 사용되는 개파보바이러스 (CPV)에 특이적으로 결합하는 항체를 생산하기 위하여, 설사 증상이 있는 강아지 3두의 분변에서 CPV를 분리하여 CPV 2a, 2b, 2c 바이러스를 획득하였고, 유전자 분석을 진행하였다. 항체치료제 개발 후 공격접종용 바이러스 및 항체치료제 테스트용 항원으로 활용하고자 분리한 야외 바이러스 (CPV 2a, 2b, 2c)를 계대 배양하였다.
실시예 2: 파아지 디스플레이 방법을 이용한 항체 라이브러리 제작
본 발명자들은 CPV 항체 라이브러리를 구축하기 위하여, 비글 3두를 개파보바이러스 백신 (CPV2)으로 고도면역시키고, 비장(spleen) 조직을 채취하였다. splenocyte에서 RNeasy kit를 사용하여 total RNA를 추출하였고, Oligo dT 및 역전사 효소를 이용하여 cDNA를 합성하였다.
항체 분자인 VH, VLλ 및 VLκ chain은 표 1의 프라이머 조합을 사용하여 증폭하였으며, PCR 증폭결과는 도 1에 나타내었다.
| - | Primer 명 | 서열 (5' →3') | 서열번호 |
| Canine VH forward primers | CSCVH1-F | ggtggttcctctagatcttcctcctctggtggcggtggctcgggcggtggtggggaggtvcarctggtgsartct | 19 |
| CSCVH2-F | ggtggttcctctagatcttcctcctctggtggcggtggctcgggcggtggtggggaggtrmvdytggtggartct | 20 | |
| CSCVH3-F | ggtggttcctctagatcttcctcctctggtggcggtggctcgggcggtggtggggrsgtgcagctggtggagtct | 21 | |
| CSCVH4-F | ggtggttcctctagatcttcctcctctggtggcggtggctcgggcggtggtggggaggtrcagctgstggagwmt | 22 | |
| CSCVH5-F | ggtggttcctctagatcttcctcctctggtggcggtggctcgggcggtggtggggarkwgcarctggtggagytt | 23 | |
| CSCVH6-F | ggtggttcctctagatcttcctcctctggtggcggtggctcgggcggtggtggggaggggcagctggcggagtct | 24 | |
| CSCVH7-F | ggtggttcctctagatcttcctcctctggtggcggtggctcgggcggtggtggggarbtnmarytggtngarwsn | 25 | |
| CSCVH8-F | ggtggttcctctagatcttcctcctctggtggcggtggctcgggcggtggtggggaggtbcarctggtrsagtct | 26 | |
| CSCVH9-F | ggtggttcctctagatcttcctcctctggtggcggtggctcgggcggtggtggggaggtgcaactgvwgragtcy | 27 | |
| Canine VH reverse primers | CSCG1234-B | cctggccggcctggccactagaaccgagggggccgtggtgga | 28 |
| Canine VLλ forward primers | CSCLam1a-F | gggcccaggcggccgagctcgtgctgamtcmgcyrssytcd | 29 |
| CSCLam1b-F | gggcccaggcggccgagctcrysctgactcarmmgscctcm | 30 | |
| CSCLam1c-F | gggcccaggcggccgagctcgtsctgactcagcydvcctca | 31 | |
| CSCLam1d-F | gggcccaggcggccgagctcgygytgacycarcyrgcctcm | 32 | |
| CSCLam2-F | gggcccaggcggccgagctcnbvytgackcarccddcctcr | 33 | |
| CSCLam3-F | gggcccaggcggccgagctcgtgctgwcwcagcygccatcm | 34 | |
| CSCLam4-F | gggcccaggcggccgagctcgtgctgactcagcctccytc | 35 | |
| CSCLam5-F | gggcccaggcggccgagctcgrgytgactcagcyrccwtc | 36 | |
| CSCLam6-F | gggcccaggcggccgagctcgggytgaatcagsctycctc | 37 | |
| CSCLam7-F | gggcccaggcggccgagctcgtdntvacycarsmrvcmtca | 38 | |
| CSCLam8-F | gggcccaggcggccgagctctgctgacccagactccaagtg | 39 | |
| CSCLam9-F | gggcccaggcggccgagctckctgacccagmctmcaagtgc | 40 | |
| CSCLam10-F | gggcccaggcggccgagctcgtrctgacycarcckccktcw | 41 | |
| CSCLam11-F | gggcccaggcggccgagctcgtrmgsaaycarcckccktcw | 42 | |
| CSCLam12-F | gggcccaggcggccgagctcctgctgacycarcckgcytcw | 43 | |
| CSCLam13-F | gggcccaggcggccgagctcgtrctgaaycarcckccktcw | 44 | |
| Canine VLλ reverse primers | CSCJLam1-B | ggaagatctagaggaaccaccgccgaggacggtcagstgggtscc | 45 |
| CSCJLam2-B | ggaagatctagaggaaccaccaccwaggacggtsagytsgrttcc | 46 | |
| Canine VLκ forward primers | CSCK1-F | gggcccaggcggccgagctccagatgacccagtccccaa | 47 |
| CSCK24-F | gggcccaggcggccgagctcgtsatgayrcagacyccac | 48 | |
| CSCK34-F | gggcccaggcggccgagctcgtgatgacmcagtctccag | 49 | |
| CSCK4-F | gggcccaggcggccgagctcaysmtgacycagtkyccag | 50 | |
| CSCK5-F | gggcccaggcggccgagctcgtsatgayrcagrcbccac | 51 | |
| CSCK6-F | gggcccaggcggccgagctctgtcatgacacagacccca | 52 | |
| Canine VLκ reverse primers | CSCJK1-B | ggaagatctagaggaaccacctttgagytccacctkggtwcc | 53 |
| CSCJK2-B | ggaagatctagaggaaccacctttgagctcctccttggttcg | 54 | |
| CSCJK3-B | ggaagatctagaggaaccacctttgaggtccaccttggttcc | 55 | |
| CSCJK4-B | ggaagatctagaggaaccacctttkatctccavcttggtycc | 56 |
증폭시킨 heavy chain과 light chain을 linker로 연결하여 scFv (single chain variable fragment)를 구축하고, 파아지 디스플레이 방법으로 항체 라이브러리를 제작하였다.
파아지 디스플레이 방법으로 제작된 항체들을 3회 biopanning 후, 개파보바이러스 (CPV 2c) VP2 재조합 단백질 (곤충세포 발현)을 코팅한 ELISA로 항체 클론 총 223개를 선별하였다. 선별된 223개 클론의 개파보바이러스와 반응성을 확인하기 위하여 개파보바이러스 (CPV 2c)를 감염시킨 A72 세포에 IFA (Immunofluorescence assay)를 수행한 결과, 43개의 클론에서 양성을 확인하였다.
본 발명자들은 43개의 클론 중에서 scFv FRs (framework regions)와 CDRs (complementarity-determining regions) 유전자 염기서열 11개를 확보하였으며, 확보한 11개의 항체 클론 중, 대장균에서 증식이 잘되고, 개파보바이러스와 반응성이 좋은 항체 후보주 CPV-B3과 CPV-F12를 선정하였다.
실시예 3: 개파보바이러스 항체 후보주 2개의 클론 발현
본 발명자들은 항체 후보주로 선정한 CPV-B3, CPV-F12 2개의 클론을 in vitro, in vivo 조건에서 안정성을 유지하기 위해 Fc와 융합하였다. human Fc가 발현되어 있는 포유동물 발현 벡터에 클로닝하였고, 293T 세포에 발현하여 CPV-B3-Fc, CPV-F12-Fc 항체를 제작하였다.
또한, 2개의 클론 중 증식 효율이 좋은 CPV-B3-Fc를 개파보바이러스 감염증 치료제로 적용하기 위해 human Fc를 canine Fc로 변경하여 항체 후보주를 제작하였다.
2개 클론의 아미노산 서열을 비교한 결과는 도 2에 나타내었다.
도 2에 나타낸 바와 같이, VL 도메인의 CDR1과 CDR3는 2개 클론 모두 동일하지만 CDR2는 다른 것을 확인할 수 있었다. VH 도메인은 CDR1, CDR2, CDR3 모두 다른 것을 확인하였으며, CPV-B3의 경우 linker가 다른 클론보다 1/2배가량 짧은 것을 확인할 수 있었다. 결과적으로 2개의 클론이 최종적으로 아미노산 서열이 다름을 확인하였다.
실시예 4: 항체치료제 후보주의 혈구응집억제시험 (HI)과 중화항체가 (VN) 항체가 비교 분석 (scFv-Fc, human Fc)
본 발명자들은 항체치료제 후보주의 효능을 분석하기 위해, 1 mg/mL 농도의 CPV-B3, CPV-F12의 개파보 바이러스 백신주와 야외주 (2a, 2b, 2c)에 대한 혈구응집억제시험과 중화항체가 측정시험을 수행하였다.
CPV-B3, CPV-F12, 고도면역혈청 및 단클론항체 (330, 620)의 HI 및 중화항체가 측정 결과는 표 2에 나타내었다.
| Minibody | Hemagglutination inhibition test | Neutralization test | ||||||
| CPV2 (백신주) |
CPV2a | CPV2b | CPV2c | CPV2 (백신주) |
CPV2a | CPV2b | CPV2c | |
| CPV-B3 | 213 (8,142) |
<2 | <2 | <2 | 213 (8,192) |
215 (32,768) |
215 (32,768) |
216 (65,536) |
| CPV-F12 | 215(32,768) | <2 | <2 | <2 | 214 (16,384) |
216 (65,536) |
216 (65,536) |
213 (8,192) |
| 고도면역혈청 | 26 (64) |
<2 | <2 | <2 | 26 (64) |
28 (256) |
28 (256) |
29 (512) |
| 330 | 27(128) | <2 | <2 | <2 | 28 (256) |
26 (64) |
26 (64) |
25 (32) |
| 620 | 29(512) | <2 | <2 | <2 | 28 (256) |
27 (128) |
25 (32) |
25 (32) |
표 2에 나타낸 바와 같이, 혈구응집억제시험에서 CPV-B3, CPV-F12는 모두 백신주에서만 213 이상 항체가를 보였으나, 중화항체가는 백신주와 야외주 모두 213 이상의 항체가를 보였다. 양성대조로 사용한 1 mg/mL의 고도면역혈청 (시판되는 개파보바이러스 감염증 치료제)은 혈구응집억제시험에서 백신주에만 26 항체가를 보이고, 중화항체 시험에서는 백신주와 야외주 26 이상의 항체가를 보였다. 개파보바이러스 단클론항체 2종 (330 및 620) 또한 혈구응집억제시험에서 백신주에서만 27 이상의 항체가를 보였으나, 중화항체가는 백신주와 야외주 모두 25 이상의 항체가를 보였다.
이러한 결과는, 항체 후보주인 CPV-B3, CPV-F12가 고도면역혈청 및 단클론항체 (330, 620) 대비 더 높은 항체가를 갖는 것을 보여준다.
추가적으로 개파보바이러스와 유사한 고양이파보바이러스 (FPV)에 대한 항체치료제 후보주 (CPV-B3, CPV-F12) 들의 중화항체능 여부를 조사하였다.
고양이파보바이러스에 대한 CPV-B3, CPV-F12의 중화항체능 결과는 표 3에 나타내었다.
| Minibody | Neutralization test | |
| FPV | CPV2a | |
| CPV-B3 | 27(128) | 215(32,768) |
| CPV-F12 | 27(128) | 216(65,536) |
| 고도면역혈청 | 27(128) | 28(256) |
표 3에 나타낸 바와 같이 항체치료제 후보주들은 고양이파보바이러스에 대해서도 27 이상 항체능을 가지고 있음을 확인하였다.
실시예 5: 항체치료제 후보주 (CPV-B3-Fc, CPV-F12-Fc)의 개파보바이러스 증식억제능 조사 (scFv-Fc, human Fc)
본 발명자들은 항체치료제 후보주 (CPV-B3-Fc, CPV-F12-Fc)의 개파보바이러스 증식억제능을 확인하고자 하였다. 항체치료제 후보주 (CPV-B3-Fc, CPV-F12-Fc, 1 mg/mL)와 개파보바이러스 (CPV 2a, 100 TCID50)를 1:1로 혼합하여 CRFK 세포에 1시간 동안 감작 후, 감작시킨 혼합액을 빼주고 72시간 동안 배양하였다. 상층액은 역가 측정을 진행하였고, CRFK 세포는 고정하여 형광염색 (Immunofluorescence assay, IFA)을 통해 바이러스 감염여부를 확인하였다. 항체치료제 후보주 (CPV-B3-Fc, CPV-F12-Fc)는 1 mg/mL, 0.1 mg/mL, 0.02 mg/mL, 0.01 mg/mL의 농도로 희석하여 실험에 사용하였고, 대조군으로 사용한 개파보바이러스 고도면역혈청은 commercial kit로 IgG 농도를 측정하여 6.14 mg/mL, 0.6 mg/mL, 0.12 mg/mL, 0.06 mg/mL의 농도로 희석하여 실험에 사용하였다.
CPV-B3-Fc, CPV-F12-Fc와 개파보바이러스 감작 후 상층액 역가에 대한 결과는 표 4에 나타내었고, 항체치료제 후보주와 바이러스 감작 후 세포 염색 결과는 도 3에 나타내었다. 또한, 항체치료제 후보주 농도별 개파보바이러스 증식 억제능은 도 4에 나타내었다.
| Candidates | 농도별 (mg/mL) | |||
| 1 | 0.1 | 0.5 | 0.01 | |
| Minibody (CPV-B3-Fc, 1 mg/mL) | - a | 10 2.0 | 10 2.0 | 10 2.25 |
| Minibody (CPV-F12-Fc, 1 mg/mL) | 10 1.75 | 10 1.75 | - | - |
| 고도면역혈청 (1 mg/mL) | - | 10 1.75 | - | 10 2.25 |
a: negative. Positive control: CPV 2a (10 4.0 TCID50/mL)
도 4에 나타낸 바와 같이, 항체 치료제 후보주 (CPV-B3-Fc, CPV-F12-Fc)가 개파보바이러스를 억제함을 확인할 수 있었으며, 도 3에 나타낸 바와 같이, IFA 결과, 0.1 mg/mL의 농도까지 유효함을 확인할 수 있었다.
실시예 6: 개파보바이러스 항체치료제 후보주의 첨가 시간대별 바이러스 증식 억제능 조사 (
in vitro
, scFv-Fc, human Fc)
본 발명자들은 항체치료제 후보주의 첨가 시간대별 바이러스 증식 억제능을 확인하기 위하여, 감염 전 2시간, 감염과 동시에 첨가, 감염 후 3시간과 5시간 이후에 항체치료제 후보주들을 첨가하여 72시간 배양하였다. 개파보바이러스는 CPV 2a 야외주를 사용하였으며, 배양 상층액은 A72 세포에서 바이러스 역가를 측정하였다.
항체치료제 후보주의 첨가 시간대별 상층액 역가는 표 5에 나타내었다.
| 항체치료제 후보 | 농도 (mg/mL) |
prior to infection | during infection | post infection | |
| 3hr | 5hr | ||||
| CPV-B3 | 1 | - a | - | 10 2.5 | 10 4.5 |
| 0.1 | 10 2.5 | 10 2.5 | 10 3.5 | 10 4.5 | |
| CPV-F12 | 1 | - | - | 10 2.5 | 10 4.5 |
| 0.1 | - | 10 2.5 | 10 3.5 | 10 4.5 | |
| 단클론항체 330 | 1 | - | 10 1.5 | 10 3.5 | 10 4.5 |
| 0.1 | 10 2.75 | 10 2.5 | 10 3.5 | 10 4.5 | |
| 고도면역혈청 | 1 | - | - | 10 3.5 | 10 4.5 |
| 0.1 | 10 3.5 | 10 3.5 | 10 3.5 | 10 4.5 | |
a; negative, Potivite control: CPV 2a: 10 4.5 TCID50/mL
표 5에 나타낸 바와 같이, 항체치료제 후보주들의 첨가 시간대별 개파보바이러스 증식억제능을 확인한 결과 CPV-B3, CPV-F12, 단클론항체 330과 고도면역혈청에서 접종 전과 접종과 동시에 투여했을 때 바이러스 증식이 억제되는 것을 확인하였다. 또한, 바이러스 감염 후 3시간과 5시간 이후 역가 측정시 모두 양성 대조와 유사한 역가를 보여 바이러스 증식 후에 치료제 투여의 억제 효능이 떨어지는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 7: 항체치료제 후보주 (Canine CPV-B3-Fc)의 혈구응집억제시험 (HI)과 중화항체가 (VN) 항체가 비교 분석 (scFv-Fc, Canine Fc)
본 발명자들은 Canine CPV-B3-Fc 항체치료제 후보주의 효능을 분석하기 위해, 0.5 mg/mL 농도의 Canine CPV-B3-Fc의 개파보 바이러스 백신주와 야외주 (2a, 2b, 2c)에 대한 혈구응집억제시험과 중화항체가 측정시험을 수행하였다.
Canine CPV-B3-Fc의 혈구응집억제시험과 중화항체 측정 결과는 표 6에 나타내었다.
| Minibody | Hemagglutination inhibition test | Neutralization test | ||||||
| CPV2 (백신주) |
CPV2a | CPV2b | CPV2c | CPV2 (백신주) |
CPV2a | CPV2b | CPV2c | |
| CPV-B3 (0.5mg/ml) |
211 (2,048) |
<2 | <2 | <2 | > 212 (4,096) |
> 212 (4,096) |
> 212 (4,096) |
> 212 (4,096) |
표 6에서 나타낸 바와 같이, HI에서는 백신주에 대해서만 211 항체가를 보였으나 중화항체가는 백신주와 야외주 모두 212 이상의 항체가를 보였다. 이러한 결과를 통해, Canine Fc가 발현된 CPV-B3 항체 후보주는 기존 human Fc가 발현된 클론과 HI 항체가, 중화항체가의 차이가 없음을 확인하였다.
실시예 8: 항체치료제 후보주 (CPV-B3, CPV-F12)의 세포독성 실험 (scFv-Fc, human Fc)
본 발명자들은 4개의 항체치료제 후보주 (CPV-B3, CPV-F12: human Fc)의 세포독성을 확인하기 위해, A72 cell, CRFK cell, MDCK cell에서 MTT assay를 수행하였다.
A72 cell, CRFK cell, MDCK cell에서 항체치료제 후보주들의 세포생존율 측정 결과는 도 5에 나타내었다.
도 5에서 나타낸 바와 같이, 항체치료제 후보주 (CPV-B3, CPV-F12: human Fc)와 양성 대조로 사용한 개파보바이러스 고도면역혈청은 A72 cell, CRFK cell, MDCK cell에 대해 세포 독성이 없음을 확인하였다.
실시예 9: 개파보바이러스 항체치료제 후보주들의 안전성 시험 (
in vivo
, scFv-Fc, human Fc)
본 발명자들은 개파보바이러스 항체치료제 후보주 (CPV-B3, CPV-F12: human Fc)의 목적동물 적용 전, 안전성을 확인하기 위하여, Balb/c 마우스 각 5두씩 복강으로 100 μg의 항체치료제를 접종하여 체온과 체중 변화를 관찰하였다.
항체치료제 후보주들의 마우스 접종 후 체온과 체중 변화는 도 6에 나타내었다.
도 6에 나타낸 바와 같이, 항체치료제 후보주 (CPV-B3, CPV-F12: human Fc)를 마우스에 접종시, 체온과 체중에 큰 이상이 없음을 확인하였다.
실시예 10: 개파보바이러스 항체치료제 후보주(CPV-B3)의 바이러스 증식 억제 확인 시험 (
in vivo
, scFv-Fc, human Fc)
본 발명자들은 목적동물 적용 전, in vivo 상으로 항체치료제에 의하여 체내에서 바이러스 증식이 억제되는지 Balb/c 마우스를 이용하여 증식 억제 확인 시험을 수행하였다.
개파보바이러스 항체치료제의 바이러스 증식 억제 확인 시험 전에 개파보바이러스 야외주가 마우스에 감염되는지 여부를 확인하기 위해 감염 확인 시험을 수행하였다. Balb/c 마우스 각 7두씩 복강으로 10 4.5 TCID50/mL씩 CPV2a를 접종하여 체온과 체중 변화를 관찰하였다.
개파보바이러스 야외주(CPV 2a)를 마우스 접종 후 체온과 체중 변화는 도 7에 나타내었다.
도 7에 나타낸 바와 같이, 개파보바이러스 야외주를 접종하였을 때, 체온과 체중의 변화가 없음을 확인하였다.
그 후, 개파보바이러스 야외주 접종 후, 전혈에서 PCR로 항원을 검출하였으며, 그 결과는 표 7에 나타내었고, 조직에서 항원 검출 결과는 표 8에 나타내었다.
| Group | Days post infection | |||||
| 0 | 3 | 5 | 7 | 10 | 12 | |
| CPV2a | - | - | 2/7 | - | - | - |
| Control | - | - | - | - | - | - |
| No. | Method | Tissues | ||||
| Heart | Spleen | Liver | Lung | Intestine | ||
| 1 | PCR | ++ | +++ | - | - | ++ |
| Virus titer 1) | - | 2.75 | - | - | - | |
| 2 | PCR | ++ | +++ | + | ++ | + |
| Virus titer | - | 2.75 | - | 3.25 | - | |
| 3 | PCR | - | ++ | +++ | + | + |
| Virus titer | - | 2.5 | 2.25 | - | - | |
| 4 | PCR | + | +++ | + | +++ | ++ |
| Virus titer | - | 4.0 | - | 2.5 | - | |
| 5 | PCR | ++ | +++ | + | ++ | ++ |
| Virus titer | - | 3.0 | - | 2.25 | - | |
| 6 | PCR | ++ | +++ | + | + | - |
| Virus titer | - | 2.25 | - | - | - | |
| 7 | PCR | ++ | +++ | - | + | ++ |
| Virus titer | - | 3.25 | - | - | - | |
| Positive rate (%) | PCR | 85.7 | 100 | 71.4 | 85.7 | 85.7 |
| Virus titer | 0 | 100 | 14.3 | 42.9 | 0 | |
1) log10 TCID50/mL
표 7에 나타낸 바와 같이, 5일째 2두의 마우스 전혈에서 viremia가 확인되었다. 또한 표 8에 나타낸 바와 같이, 접종 2주 후, 각 장기별 항원검사 결과 비장에서는 100% 항원이 검출되었고, 심장, 간, 폐, 장에서도 PCR 및 세포에서 바이러스 역가 측정이 되어 마우스 체내에서 증식함을 확인할 수 있었다.
개파보바이러스 야외주 감염 전후에 개파보바이러스 항체치료제 (CPV-B3-human Fc)를 농도별로 근육으로 접종하여 viremia, 체온, 체중 변화, 조직 내 항원검사를 수행하였다. 개파보바이러스 항체치료제 (CPV-B3-human Fc)의 바이러스 억제 확인 시험을 위한 모식도와 그룹은 도 8에 나타내었다.
CPV-B3-human Fc 접종 시, 체온 및 체중 변화는 도 9에 나타내었고, 부검 후 조직에서 항원 검사(PCR) 후 그룹별 양성율 산출 결과는 표 9에 나타내었다. 또한, 그룹별 항원 양성 마우스의 조직별 검사 결과(PCR 및 Virus titration)는 표 10에 나타내었다.
| Group | Injection type | Dose | No. of positive mice (%) | |
| G1* | 1 | scFv-Fc+CPV2a | 0.5 mg/kg | 2 (25%) |
| 2 | scFv-Fc+CPV2a | 1.0 mg/kg | 1 (12.5%) | |
| 3 | scFv-Fc+CPV2a | 1.5 mg/kg | 2 (25%) | |
| G2* | 1 | CPV2a+ scFv-Fc | 0.5 mg/kg | 2 (25%) |
| 2 | CPV2a+ scFv-Fc | 1.0 mg/kg | 1 (12.5%) | |
| 3 | CPV2a+ scFv-Fc | 1.5 mg/kg | 1 (12.5%) | |
| G3* | 1 | CPV2a+ scFv-Fc | 0.5 mg/kg | 2 (25%) |
| 2 | CPV2a+ scFv-Fc | 1.0 mg/kg | 2 (25%) | |
| 3 | CPV2a+ scFv-Fc | 1.5 mg/kg | 1 (12.5%) | |
| G4 | CPV2a | 104.5 TCID50/mL, IP. 500 μL | 8 (100%) | |
| G5 | PBS | IP, 500 μL | 0 (0%) | |
*; CPV2a:104.5 TCID50/mL, IP. 500 μL
| Group | No. of positive mice |
Method | Tissues | |||||
| Heart | Spleen | Liver | Lung | Intestine | ||||
| G1 | 1 | 1 | PCR | 1 2) | - | - | 2 | - |
| Virus titer1) | 2.0 | - | - | - | - | |||
| 2 | 1 | PCR | - | - | - | - | 1 | |
| Virus titer | - | - | - | - | - | |||
| 3 | 2 | PCR | - | 1 | - | 1,2 | 1 | |
| Virus titer | - | 2.5 | - | 0 & 1.75 | - | |||
| G2 | 1 | 2 | PCR | - | 1,2 | - | 2 | - |
| Virus titer | - | 0 & 2.5 | - | - | - | |||
| 2 | 1 | PCR | - | 1 | - | - | - | |
| Virus titer | - | 2.5 | - | - | - | |||
| 3 | 1 | PCR | - | - | - | 1 | - | |
| Virus titer | - | - | - | - | - | |||
| G3 | 1 | 2 | PCR | - | 1,2 | - | - | - |
| Virus titer | - | 0 & 2.0 | - | - | - | |||
| 2 | 2 | PCR | - | 1,2 | - | 1 | - | |
| Virus titer | - | 0 & 2.75 | - | - | - | |||
| 3 | 1 | PCR | - | 1 | - | - | - | |
| Virus titer | - | 2.5 | - | - | - | |||
| G4 | 8 | PCR | 3,4,7 | 1,2,3,4,6,7,8 | - | 3,4,5 | 5 | |
| Virus titer | 2.75~3.0 | 2.0~4.25 | - | 2.0~3.5 | 3.5 | |||
1): log10 TCID50/mL, 2): Object identification number by group
도 9에서 나타낸 바와 같이, CPV-B3-Fc (human Fc) 접종 후, 전 그룹 마우스의 체온 및 체중변화에 특이사항은 나타나지 않는 것을 확인하였다. 또한, 표 9에서 나타낸 바와 같이, 개파보바이러스 야외주 감염시 100% 마우스에서 항원 검출이 되었으나, 개파보바이러스 항체치료제를 감염 전후 적용시켰을 때, 12.5%~25% 마우스에서 항원이 검출되는 것을 확인하였다.
또한, 표 10에서 나타낸 바와 같이, 마우스 조직별로는 개파보바이러스 야외주 감염시 바이러스가 간을 제외하고 심장, 비장, 폐, 장에서 10 2.0~4.25 TCID50/ml 바이러스가 검출되었으나, 항체치료제 적용시 바이러스 검출이 75% 감소(10 0~2.75 TCID50/ml) 되는 것을 확인할 수 있었다.
이러한 결과는 개파보바이러스 항체후보주 (Canine CPV-B3-Fc)가 바이러스 검출 억제에 영향을 미치는 것을 보여준다.
서열목록 전자파일 첨부
Claims (7)
- 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1, 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2 및 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3를 포함하는 경쇄 가변영역; 및
서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1, 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2, 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3를 포함하는 중쇄 가변영역을 포함하는 개파보바이러스 (Canine parvovirus, CPV)에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
- 제1항에 있어서, 상기 경쇄 가변 영역은 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 중쇄 가변 영역은 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 것인, 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
- 제1항에 있어서, 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 scFv (single chain variable fragment)인, 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 인코딩하는 핵산 분자.
- 제4항의 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터.
- 제5항의 재조합 벡터를 포함하는 숙주세포.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 개파보바이러스 치료용 약제학적 조성물.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020230028043A KR20240135699A (ko) | 2023-03-02 | 2023-03-02 | 개파보바이러스 특이적 항체 cpv-f12 및 이를 포함하는 개파보바이러스 감염증 치료용 약제학적 조성물 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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| KR1020230028043A KR20240135699A (ko) | 2023-03-02 | 2023-03-02 | 개파보바이러스 특이적 항체 cpv-f12 및 이를 포함하는 개파보바이러스 감염증 치료용 약제학적 조성물 |
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| KR20240135699A true KR20240135699A (ko) | 2024-09-12 |
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ID=92758322
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
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| KR1020230028043A KR20240135699A (ko) | 2023-03-02 | 2023-03-02 | 개파보바이러스 특이적 항체 cpv-f12 및 이를 포함하는 개파보바이러스 감염증 치료용 약제학적 조성물 |
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| Country | Link |
|---|---|
| KR (1) | KR20240135699A (ko) |
-
2023
- 2023-03-02 KR KR1020230028043A patent/KR20240135699A/ko unknown
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Sook Hee Yoon et al., Molecular insights into the phylogeny of canine parvovirus 2 (CPV-2) with emphasis on Korean isolates: a Bayesian approach, Arch Virol., 2009, 154 (8): 1353-60 |
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