KR20240130161A - 오르니틴 트랜스카르바밀라제 (otc) 구축물 및 그의 사용 방법 - Google Patents

오르니틴 트랜스카르바밀라제 (otc) 구축물 및 그의 사용 방법 Download PDF

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Abstract

본 개시내용은 특히 폴리뉴클레오티드 구축물, 조성물, 및 오르니틴 트랜스카르바밀라제 결핍증 치료를 필요로 하는 대상체에게, 5' UTR, 오르니틴 트랜스카르바밀라제를 코딩하는 코돈 최적화된 mRNA, 및 3' UTR을 포함하는 폴리뉴클레오티드 구축물을 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 오르니틴 트랜스카르바밀라제 결핍증을 치료하는 방법을 제공한다.

Description

오르니틴 트랜스카르바밀라제 (OTC) 구축물 및 그의 사용 방법
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2019년 10월 22일 출원된 미국 가출원 번호 62/924,567을 우선권 주장하고, 그의 내용은 그 전문이 본원에서 참조로 포함된다.
서열 목록
본 출원과 함께 제출된 ASCII 텍스트 파일 (파일명: 4170_021PC01_Seqlisting_ST25; 크기: 13,467 바이트; 및 작성일: 2020년 10월 21일)의 전자적으로 제출된 서열 목록의 내용은 그 전문이 본원에서 참조로 포함된다.
오르니틴 트랜스카르바밀라제 결핍증 (OTC 결핍증 또는 OTCD)은 전형적으로 OTC 유전자의 돌연변이의 결과인 기능성 오르니틴 트랜스카르바밀라제 (OTC) 효소의 완전한 또는 부분적 결핍을 특징으로 하는 X-연관 유전적 장애이다. OTC 유전자의 돌연변이는 (간 및 소장에서) 카르바모일 포스페이트 (CP) 및 오르니틴 (Orn)으로부터 시트룰린 (Cit) 및 포스페이트 (Pi)의 합성을 촉매하는 OTC 효소의 능력을 제거하거나, 감소시킬 수 있다. 이러한 요소 회로 기능 장애는 과도한 암모니아로 이어질 수 있으며, 이는 혈액 중에 축적될 수 있고 (고암모니아혈증), 신경계로 이동하여 OTC 결핍증과 연관된 증상을 유발할 수 있다.
OTC 결핍증은 요소 회로 장애의 가장 흔한 유형이다. 인간 OTC에서 수백 가지의 돌연변이가 보고되었다. OTC 결핍증의 중증도 및 발병 연령은 심지어 같은 가족인 경우에도 및/또는 원인 돌연변이가 동일한 경우에도 개인마다 달라진다. 중증 형태의 장애는 출생 직후 일부 영아, 일반적으로 남성에게 영향을 미친다. 더 가벼운 형태의 장애는 일부 영아, 전형적으로는 출생 직후 남아에서 발병한다. 남성과 여성 둘 모두 아동기 동안 OTC 결핍증 증상이 발생할 수 있다.
현재, OTC 결핍증을 앓는 사람들을 위한 간 이식 이외의 치료법은 없으며, 장기 요법은 평생 단백질 섭취 제한 및 질소 제거 요법 (예를 들어, 소듐 페닐 아세테이트 또는 소듐 페닐 부티레이트 및/또는 벤조산나트륨)을 포함한다. 중증의 신생아 발병 OTC 결핍증을 앓는 환자 또는 빈번한 고암모니아혈증 에피소드를 앓는 환자에서도 간 이식이 고려될 수 있다.
RNA 분자는 시험관내 및 생체내에서 유전자 발현의 강력한 조정자로서 작용할 수 있는 능력을 가지고 있는 바, 따라서, 핵산 기반 약물로서의 잠재능을 갖고 있다. 이러한 분자는 세포 단백질과의 특이적인 상호작용 또는 다른 RNA 분자와의 염기쌍 형성 상호작용을 이용하는 여러 기전을 통해 작용할 수 있다. 불충분하거나, 또는 결함이 있는 단백질 생산을 특징으로 하는 장애의 경우, 치료 mRNA는 리보솜이 미확인(missing) 단백질, 또는 결함이 있는 단백질을 생산하도록 지시할 수 있는 잠재성이 있다. RNA 치료제의 효율적이고, 효과적인 세포내 전달은 상기 치료제가 혈류에서 빠르게 분해 및 배설되는 경향이 있고, 세포막을 자유롭게 통과하지 못하기 때문에 어렵다.
예컨대, RNA 분자 및 다른 막 불투과성 화합물과 같은 외인성 폴리뉴클레오티드를 살아있는 세포 내로 전달하는 것은 세포의 복잡한 막 시스템에 의해 크게 제한을 받는다. 전형적으로, 안티센스 및 유전자 요법에 사용되는 분자는 크고, 음으로 하전되고, 친수성인 분자이다. 이러한 특징은 세포막을 가로질러 세포질로 진행되는 그의 직접적인 확산을 방해할 수 있다. 따라서, 유전자 발현 조정을 위해 폴리뉴클레오티드를 치료적으로 사용하는 것에 대한 주요 장벽은 폴리뉴클레오티드를 세포질로 전달하는 것이다. 형질감염제는 전형적으로 양이온성 성질의 펩티드, 중합체, 지질 뿐만 아니라, 나노입자 및 마이크로입자를 포함한다. 상기 형질감염제는 시험관내 반응에서 성공적으로 사용되어 왔다. 그러나, 생체내에서는 효능과 독성에 있어 문제가 있다. 추가로, 상기 시스템의 양이온성 전하는 혈청 성분과의 상호작용을 유발할 수 있으며, 이는 폴리뉴클레오티드-형질감염 시약 상호작용의 불안정화 및 불량한 생체이용성 및 표적화를 유발한다. 생체내에서 핵산을 형질감염시키는 경우, 전달제는 핵산 페이로드를 초기 세포외 분해, 예컨대, 뉴클레아제로부터 보호하여야 한다. 추가로, 전달제는 적응 면역계 (면역원성)에 의해 인식되지 않아야 하고, 급성 면역 반응을 자극하지 않아야 한다.
본 개시내용은 5'에서 3'으로: 서열식별번호(SEQ ID NO:) 2의 서열을 포함하는 5' UTR; 기능성 인간 오르니틴 트랜스카르바밀라제 (OTC)를 코딩하는 오픈 리딩 프레임 (ORF)을 포함하는 mRNA 서열이며, 여기서 ORF는 서열식별번호 1과 적어도 약 95% 동일한 코돈 최적화된 서열을 포함하는 것인 mRNA 서열; 및 서열식별번호 3의 서열을 포함하는 3' UTR을 포함하는 폴리뉴클레오티드 구축물을 제공한다.
특정 측면에서, 본 개시내용은 기능성 인간 오르니틴 트랜스카르바밀라제 (OTC)를 코딩하는 오픈 리딩 프레임 (ORF)을 포함하는 mRNA 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 구축물이며, 여기서 mRNA 서열은 서열식별번호 4와 상이한 5개 이하의 핵산을 갖는 서열을 포함하는 것인 폴리뉴클레오티드 구축물을 제공한다. 일부 측면에서, 폴리뉴클레오티드 구축물은 5'에서 3'으로: 5' UTR; OTC를 코딩하는 ORF를 포함하는 mRNA 서열; 및 3' UTR을 포함한다. 특정 측면에서, 5' UTR은 서열식별번호 2의 서열을 포함하고/거나, 3' UTR은 서열식별번호 3의 서열을 포함한다. 일부 측면에서, 기능성 OTC는 서열식별번호 7의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 측면에서, ORF 서열은 서열식별번호 1을 포함한다.
일부 측면에서, mRNA 서열은 서열식별번호 4와 상이한 4, 3, 2, 또는 1개 이하의 핵산을 갖는다. 특정 측면에서, 폴리뉴클레오티드 구축물은 서열식별번호 4의 서열을 포함한다.
일부 측면에서, 폴리뉴클레오티드 구축물은 5' 말단 캡, 예컨대, Cap1을 추가로 포함한다. 일부 측면에서, 폴리뉴클레오티드 구축물은 폴리A 테일을 추가로 포함한다. 특정 측면에서, 폴리A 테일은 80 내지 1000개의 핵산 길이, 예컨대, 100 내지 500개의 핵산 길이이다.
일부 측면에서, mRNA는 적어도 하나의 화학적으로 변형된 우리딘을 포함한다. 특정 측면에서, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 또는 약 100%의 우리딘이 화학적으로 변형된 것이다. 일부 측면에서, 화학적으로 변형된 우리딘은 슈도우리딘 (ψ), N1-메틸 슈도우리딘 (N1-me-ψ), 및/또는 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 개시내용의 특정 측면은 본 개시내용의 폴리뉴클레오티드 구축물; 및 전달제를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 일부 측면에서, 전달제는 지질 나노입자 (LNP), 리포솜, 중합체, 미셀, 플라스미드, 바이러스, 또는 그의 임의의 조합을 포함한다.
특정 측면에서, LNP는 LNP1 (PEG2000-C-DMA:13-B43:콜레스테롤:DSPC), LNP2 (PEG2000-S:13-B43:콜레스테롤:DSPC 또는 PEG2000-S:18-B6:콜레스테롤:DSPC), 및 LNP3 (PEG750-C-DLA:18-B6:콜레스테롤:DSPC) 그룹 중의 조성물로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 측면에서, 폴리뉴클레오티드 구축물은 LNP에 캡슐화된다. 일부 측면에서, 조성물은 제약상 허용되는 담체를 추가로 포함한다. 일부 측면에서, 폴리뉴클레오티드 구축물은 LNP에 완전히 캡슐화된다. 일부 측면에서, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 그의 초과의 폴리뉴클레오티드 구축물은 LNP에 완전히 캡슐화된다.
본 개시내용의 특정 측면은 세포에 본 개시내용의 폴리뉴클레오티드 구축물을 포함하는 조성물 또는 본 개시내용의 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 세포에서 OTC 발현의 양을 증가시키는 방법에 관한 것이다. 일부 측면에서, 세포는 간 세포이다.
본 개시내용의 특정 측면은 오르니틴 트랜스카르바밀라제 결핍증 (OTCD)과 연관된 증상 치료 또는 감소를 필요로 하는 대상체에게 치료 유효량의, 본 개시내용의 폴리뉴클레오티드 구축물을 포함하는 조성물 또는 본 개시내용의 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, OTCD와 연관된 증상을 치료 또는 감소시키는 방법에 관한 것이다.
본 개시내용의 특정 측면은 고암모니아혈증 치료, 또는 그의 위험 감소를 필요로 하는 대상체에게 치료 유효량의, 본 개시내용의 폴리뉴클레오티드 구축물을 포함하는 조성물 또는 본 개시내용의 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, OTCD를 앓는 대상체에서 고암모니아혈증을 치료하거나, 또는 그의 위험을 감소시키는 방법에 관한 것이다.
본 개시내용의 특정 측면은 서열식별번호 8과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 DNA 서열을 포함하는 발현 카세트에 관한 것이다. 일부 측면에서, 발현 카세트는 프로모터, 예컨대, T7 프로모터를 추가로 포함한다. 본 개시내용의 일부 측면은 본 개시내용의 발현 카세트를 포함하는 플라스미드에 관한 것이다. 일부 측면에서, 발현 카세트는 (예를 들어, 서열식별번호 1 또는 서열식별번호 4를 포함하는) 본 개시내용의 mRNA를 전사한다. 본 개시내용의 일부 측면은 본 개시내용의 발현 카세트, 또는 본 개시내용의 플라스미드를 포함하는 숙주 세포에 관한 것이다.
본 개시내용의 특정 측면은 OTCD 치료를 필요로 하는 대상체에서의 OTCD 치료를 위한, 또는 OTCD를 앓는 대상체에서 고암모니아혈증 치료 또는 그의 위험 감소를 위한 의약의 제조를 위한, 본 개시내용의 폴리뉴클레오티드 구축물, 또는 본 개시내용의 조성물, 또는 본 개시내용의 발현 카세트, 또는 본 개시내용의 플라스미드, 또는 본 개시내용의 숙주 세포의 용도에 관한 것이다.
본 개시내용의 특정 측면은 포유동물 대상체에게 본 개시내용의 폴리뉴클레오티드 구축물, 또는 본 개시내용의 조성물, 또는 본 개시내용의 발현 카세트, 또는 본 개시내용의 플라스미드, 또는 본 개시내용의 숙주 세포를 투여하는 단계를 포함하는, 핵산의 생체내 전달 방법에 관한 것이다.
본 개시내용의 특정 측면은 질환 또는 장애 치료를 필요로 하는 포유동물 대상체에게 치료 유효량의, 본 개시내용의 폴리뉴클레오티드 구축물, 또는 본 개시내용의 조성물, 또는 본 개시내용의 발현 카세트, 또는 본 개시내용의 플라스미드, 또는 본 개시내용의 숙주 세포를 투여하는 단계를 포함하는, 질환 또는 장애 치료를 필요로 하는 포유동물 대상체에서 질환 또는 장애를 치료하는 방법에 관한 것이다. 일부 측면에서, 질환 또는 장애는 요소 회로 장애이다.
상기 및 다른 측면은 하기의 상세한 설명을 읽으면 명백해질 것이다.
일부 경우에, 본 개시내용은 첨부된 도면과 관련하여 본 개시내용의 다양한 측면에 대한 하기의 상세한 설명을 고려하여 더 완전하게 이해될 수 있으며, 여기서:
도 1은 PBS 대조군과 비교하여 상이한 폴리(A) 테일 길이 (80, 161, 208, 262, 322, 또는 440개의 뉴클레오티드)를 갖는 코돈 최적화된 OTC 구축물 (OTC mRNA)을 캡슐화하는 LNP를 투여받은 래트에서의 1차 투약 후 6시간째의 MCP-1 유도를 보여주는 것이다. 80개의 뉴클레오티드 폴리(A)는 코딩된 것이었고, 다른 시험된 폴리(A)는 효소적 (enz)인 것이었다.
도 2a는 PBS 대조군과 비교하여 상이한 폴리(A) 테일 길이 (80, 161, 208, 262, 322, 또는 440개의 뉴클레오티드)를 갖는 코돈 최적화된 OTC 구축물 (OTC mRNA)을 캡슐화하는 LNP를 투여받은 래트에서의, 각각 0, 7, 및 14일째의 1차, 2차, 및 3차 투약 후 6시간째의 MCP-1 유도를 보여주는 것이다. 80개의 뉴클레오티드 폴리(A)는 코딩된 것이었고, 다른 시험된 폴리(A)는 효소적 (enz)인 것이었다.
도 2b는 PBS 대조군과 비교하여 상이한 폴리(A) 테일 길이 (80, 161, 208, 262, 322, 또는 440개의 뉴클레오티드)를 갖는 코돈 최적화된 OTC 구축물 (OTC mRNA)을 캡슐화하는 LNP를 투여받은 래트에서의, 각각 0, 7, 및 14일째의 1차, 2차, 및 3차 투약 후 6시간째의 IP-1 유도를 보여주는 것이다. 80개의 뉴클레오티드 폴리(A)는 코딩된 것이었고, 다른 시험된 폴리(A)는 효소적 (enz)인 것이었다.
도 3a는 PBS 대조군과 비교하여 상이한 폴리(A) 테일 길이 (80, 161, 208, 262, 322, 또는 440개의 뉴클레오티드)를 갖는 코돈 최적화된 OTC 구축물 (OTC mRNA)을 캡슐화하는 LNP의 단일 투약 투여 후 래트 간에서의 hOTC 단백질 발현을 보여주는 것이다. 80개의 뉴클레오티드 폴리(A)는 코딩된 것이었고, 다른 시험된 폴리(A)는 효소적 (enz)인 것이었다.
도 3b는 PBS 대조군과 비교하여 상이한 폴리(A) 테일 길이 (80, 161, 208, 262, 322, 또는 440개의 뉴클레오티드)를 갖는 코돈 최적화된 OTC 구축물 (OTC mRNA)을 보유하는 LNP의 단일 투약 투여 대 다중 투약 투여 후 래트 간에서의 hOTC 단백질 발현을 보여주는 것이다. 80개의 뉴클레오티드 폴리(A)는 코딩된 것이었고, 다른 시험된 폴리(A)는 효소적 (enz)인 것이었다.
도 4는 PBS 대조군과 비교하여 상이한 변형: PsU, N1MePsU, 또는 5MoU를 갖는 OTC 구축물 (OTC mRNA)을 캡슐화하는 LNP1 또는 LNP2 (이온화가능한 지질: 13-B43) 그룹을 투여받은 마우스에서의 1차 투약 후 6시간째의 MCP-1 유도를 보여주는 것이다.
도 5는 PBS 대조군과 비교하여 상이한 변형: PsU, N1MePsU, 또는 5MoU를 갖는 OTC 구축물을 캡슐화하는 LNP1 또는 LNP2 (이온화가능한 지질: 13-B43) 그룹을 투여받은 마우스에서의 투약 후 24시간째의 hOTC 발현을 보여주는 것이다.
도 6a는 EPO 및 Luc 페이로드와 비교하여 코돈 최적화된 OTC 구축물 (OTC mRNA)을 캡슐화하는 상이한 LNP (LNP1, LNP2 (이온화가능한 지질: 13-B43), LNP2 (이온화가능한 지질: 18-B6), 또는 LNP3) 그룹을 투여받은 래트에서의 항-PEG IgG 항체 반응을 보여주는 것이다.
도 6b는 EPO 및 Luc 페이로드와 비교하여 코돈 최적화된 OTC 구축물 (OTC mRNA)을 캡슐화하는 상이한 LNP (LNP1, LNP2 (이온화가능한 지질: 13-B43), LNP2 (이온화가능한 지질: 18-B6), 또는 LNP3) 그룹을 투여받은 래트에서의 항-PEG IgM 항체 반응을 보여주는 것이다.
도 7은 0, 7 및 14일째 EPO 및 Luc 페이로드 및 PBS와 비교하여 코돈 최적화된 OTC 구축물 (OTC mRNA)을 캡슐화하는 상이한 LNP (LNP1, LNP2 (이온화가능한 지질: 13-B43), LNP2 (이온화가능한 지질: 18-B6), 또는 LNP3) 그룹을 투여받은 래트에서의 6시간째의 MCP-1 유도를 보여주는 것이다.
도 8은 1 및 3회 투약 후 코돈 최적화된 OTC 구축물 (OTC mRNA)을 캡슐화하는 상이한 LNP (LNP1, LNP2 (이온화가능한 지질: 13-B43), LNP2 (이온화가능한 지질: 18-B6), 또는 LNP3) 그룹을 투여받은 래트에서의 OTC 단백질 발현을 보여주는 것이다.
도 9는 1 및 3회 투약 후 코돈 최적화된 OTC 구축물 (OTC mRNA)을 캡슐화하는 상이한 LNP (LNP1, LNP2 (이온화가능한 지질: 13-B43), LNP2 (이온화가능한 지질: 18-B6), 또는 LNP3) 그룹을 투여받은 이후의 래트 간에서의 지질 농도 (제거)를 보여주는 것이다.
도 10a는 1 및 3회 투약 후 코돈 최적화된 OTC 구축물 (OTC mRNA)을 캡슐화하는 상이한 LNP (LNP1, LNP2 (이온화가능한 지질: 13-B43), LNP2 (이온화가능한 지질: 18-B6), 또는 LNP3) 그룹을 투여받은 이후의 래트에서의 ALT 수준을 보여주는 것이다.
도 10b는 1 및 3회 투약 후 코돈 최적화된 OTC 구축물 (OTC mRNA)을 캡슐화하는 상이한 LNP (LNP1, LNP2 (이온화가능한 지질: 13-B43), LNP2 (이온화가능한 지질: 18-B6), 또는 LNP3) 그룹을 투여받은 이후의 래트에서의 AST 수준을 보여주는 것이다.
도 11a-11c는 매주 수행된 반복 투약 후의 코돈 최적화된 OTC 구축물을 캡슐화하는 LNP2 (이온화가능한 지질: 13-B43) 조성물의 투여 이후의 시토카인 반응을 보여주는 것이다. 도 11a는 투약 후 6시간째의 MCP-1 유도를 보여주는 것이고, 도 11b는 투약 후 6시간째의 IP-10 유도를 보여주는 것이고, 도 11c는 투약 후 6시간째의 MIP-1a를 보여주는 것이다.
도 12는 PBS 대조군과 비교하여 매주 수행된 반복 투약 후의 코돈 최적화된 OTC 구축물을 캡슐화하는 LNP2 (이온화가능한 지질: 13-B43)의 투여 이후의 항-PEG IgM 항체 반응을 보여주는 것이다.
도 13은 PBS 대조군과 비교하여 매주 수행된 반복 투약 후의 코돈 최적화된 OTC 구축물을 캡슐화하는 LNP2 (이온화가능한 지질: 13-B43) 조성물의 투여 이후의 항-PEG IgG 항체 반응을 보여주는 것이다.
도 14는 PBS 대조군과 비교하여 매주 수행된 반복 투약 후의 코돈 최적화된 OTC 구축물을 캡슐화하는 LNP2 (이온화가능한 지질: 13-B43) 조성물의 투여 이후의 항-OTC IgM 항체 반응을 보여주는 것이다.
도 15는 PBS 대조군과 비교하여 매주 수행된 반복 투약 후의 코돈 최적화된 OTC 구축물을 캡슐화하는 LNP2 (이온화가능한 지질: 13-B43) 조성물의 투여 이후의 항-OTC IgM 항체 반응을 보여주는 것이다.
도 16은 매주 수행된 반복 투약 후의 코돈 최적화된 OTC 구축물을 캡슐화하는 LNP2 (이온화가능한 지질: 13-B43) 조성물을 투여받은 래트에서의 OTC 단백질 발현을 보여주는 것이다.
도 17a-17b는 코돈 최적화된 OTC 구축물을 캡슐화하는 LNP2 (이온화가능한 지질: 13-B43) 조성물을 투여받은 래트의 (a) 간 및 (b) 혈장에서의 인간 OTC mRNA (hOTC mRNA)를 보여주는 것이다.
도 18a는 코돈 최적화된 OTC 구축물을 캡슐화하는 LNP1, LNP2 (이온화가능한 지질: 13-B43) 또는 LNP2 (이온화가능한 지질: 18-B6) 조성물을 투여받은 래트의 간에서의 투약 후 24시간째의 평균 ALT 수준을 보여주는 것이다.
도 18b는 코돈 최적화된 OTC 구축물을 캡슐화하는 LNP1, LNP2 (이온화가능한 지질: 13-B43) 또는 LNP2 (이온화가능한 지질: 18-B6) 조성물을 투여받은 래트의 간에서의 투약 후 24시간째의 평균 AST 수준을 보여주는 것이다.
도 18c는 코돈 최적화된 OTC 구축물을 캡슐화하는 LNP1, LNP2 (이온화가능한 지질: 13-B43) 또는 LNP2 (이온화가능한 지질: 18-B6) 조성물을 투여받은 래트의 간에서의 투약 후 24시간째의 개별 (R1, R2, 또는 R3) 및 평균 ALT 수준을 보여주는 것이다.
도 18d는 코돈 최적화된 OTC 구축물을 캡슐화하는 LNP1, LNP2 (이온화가능한 지질: 13-B43) 또는 LNP2 (이온화가능한 지질: 18-B6) 조성물을 투여받은 래트의 간에서의 투약 후 24h째의 개별 (R1, R2, 또는 R3) 및 평균 AST1 수준을 보여주는 것이다.
도 19a-19d는 코돈 최적화된 OTC 구축물을 캡슐화하는 LNP1, LNP2 (이온화가능한 지질: 13-B43) 또는 LNP2 (이온화가능한 지질: 18-B6) 조성물을 투여받은 래트의 투약 후 24시간째의 (a) 평균 GGT 수준, (b) 총 빌리루빈 수준, (c) 개별 (R1, R2, 또는 R3) 및 평균 GGT 수준, 및 (d) 개별 (R1, R2, 또는 R3) 및 평균 총 빌리루빈 수준을 보여주는 것이다.
도 20a-20c는 코돈 최적화된 OTC 구축물을 캡슐화하는 LNP1, LNP2 (이온화가능한 지질: 13-B43) 또는 LNP2 (이온화가능한 지질: 18-B6) 조성물을 투여받은 래트의 투약 후 24시간째의 (a) 호중구 수준, (b) 단핵구 수준, 및 (c) 혈소판 수준을 보여주는 것이다.
도 21a-21c는 코돈 최적화된 OTC 구축물을 캡슐화하는 LNP1, LNP2 (이온화가능한 지질: 13-B43) 또는 LNP2 (이온화가능한 지질: 18-B6) 조성물을 투여받은 래트의 투약 후 6시간째의 (a) MCP-1 수준, (b) MIP-1a 수준, 및 (c) IP-10 수준을 보여주는 것이다.
도 22는 코돈 최적화된 OTC 구축물을 캡슐화하는 LNP1 또는 LNP2 (이온화가능한 지질: 13-B43) 조성물을 투여받은 래트의 투약 후 24시간째의 OTC 발현을 보여주는 것이다.
도 23a-23c는 0.25 mg/kg, 1 mg/kg, 및 3 mg/kg으로 코돈 최적화된 OTC mRNA 구축물을 캡슐화하는 LNP1을 투여받은 비-인간 영장류의 간에서의 (a) 인간 OTC (hOTC), (b) MCP-1, 및 (c) IL-6 단백질 발현 수준을 보여주는 것이다. hOTC 단백질 발현은 내인성 발현 대비의 비율(%)로서 제시되어 있고, MCP-1 및 IL-6 단백질 발현은 0 mg/kg 대조군과의 대비로 제시되어 있다.
본 개시내용은 세포에서 오르니틴 트랜스카르바밀라제 (OTC)를 발현시키기 위한 개선된 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, mRNA), 조성물, 및 방법, 및 OTC 결핍증을 앓는 대상체를 치료하기 위한, 상기 폴리뉴클레오티드, 조성물, 및 방법의 용도에 관한 것이다. 달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 기술된 방법 및 조성물과 관련하여 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본원에 제공된 정의는 본원에서 자주 사용되는 특정 용어의 이해를 돕기 위한 것이다.
본 명세서 및 첨부된 청구범위에서 사용되는 바, 단수 형태 "하나"는 문맥상 명백하게 달리 명시되지 않는 한, 복수의 지시대상을 갖는 측면을 포함한다.
본원에서 사용되는 바, 용어 "핵산"은 가장 넓은 의미에서, 예컨대, 포스포디에스테르 연결을 통해 폴리뉴클레오티드 쇄에 도입되거나, 또는 도입될 수 있는 임의의 화합물 및/또는 물질을 지칭한다. 일부 측면에서, "핵산"은 개별 핵산 잔기(예를 들어, 뉴클레오티드 및/또는 뉴클레오시드)를 지칭한다. 일부 측면에서, "핵산"은 개별 핵산 잔기를 포함하는 폴리뉴클레오티드 쇄를 지칭한다. 일부 측면에서, "핵산"은 RNA, 예컨대, mRNA 뿐만 아니라, 단일 및/또는 이중 가닥 DNA 및/또는 cDNA를 포함한다.
본원에서 사용되는 바 용어 "폴리뉴클레오티드" 또는 "올리고뉴클레오티드"는 7-20,000개의 뉴클레오티드 단량체 단위 (즉, 7개의 뉴클레오티드 단량체 단위 내지 20,000개의 뉴클레오티드 단량체 단위(7 및 20,000개의 뉴클레오티드 단량체 단위 포함))를 포함하는 중합체를 지칭한다. 폴리뉴클레오티드는 데옥시리보핵산 (DNA) 및 리보핵산 (RNA), 또는 그의 유도체, 및 DNA 및 RNA의 조합을 포함한다. 예를 들어, DNA는 cDNA, 시험관내 중합체화된 DNA, 플라스미드 DNA, 플라스미드 DNA의 일부, 발현 벡터, 발현 카세트, 키메라 서열, 재조합 DNA, 염색체 DNA, 또는 그의 임의의 유도체 형태일 수 있다. 추가 예에서, RNA는 메신저 RNA (mRNA), 시험관내 중합체화된 RNA, 재조합 RNA, 전달 RNA (tRNA), 소형 핵 RNA (snRNA), 리보솜 RNA (rRNA), 키메라 서열, 재조합 RNA, 또는 그의 임의의 유도체 형태일 수 있다. 추가로, DNA 및 RNA는 단일, 이중, 삼중 또는 사중 가닥일 수 있다.
본원에서 사용되는 폴리뉴클레오티드의 추가 예로는 변형 또는 비변형된 것일 수 있는 단일 가닥 mRNA를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 변형된 mRNA는 적어도 2개의 변형 및 번역가능한 영역을 갖는 것을 포함한다. 변형은 핵산 분자의 백본 및/또는 뉴클레오시드에 위치할 수 있다. 변형은 뉴클레오시드와 백본 연결부, 둘 모두에 위치할 수 있다.
본원에서 사용되는 바, 용어 "메신저 RNA (mRNA)"는 적어도 하나의 폴리펩티드를 코딩하는 폴리리보뉴클레오티드를 지칭한다. 본원에서 사용되는 바, mRNA는 변형된 RNA 및 비변형된 RNA, 둘 모두를 포함한다. mRNA는 하나 이상의 코딩 및 비코딩 영역을 포함할 수 있다. mRNA는 천연 공급원으로부터 정제되고, 재조합 발현 시스템을 사용하여 생성되고, 임의적으로, 정제되고, 시험관내 전사되고, 화학적으로 합성될 수 있는 등 그러하다. 적절한 경우, 예컨대, 화학적으로 합성된 분자의 경우, mRNA는 예컨대, 화학적으로 변형된 염기 또는 당, 백본 변형 등을 갖는 유사체와 같은 뉴클레오시드 유사체를 포함할 수 있다. 달리 명시되지 않는 한, mRNA 서열은 5'에서 3' 방향으로 제시된다. 일부 측면에서, mRNA는 천연 뉴클레오시드 (예를 들어, 아데노신, 구아노신, 시티딘, 우리딘); 뉴클레오시드 유사체 (예를 들어, 2-아미노아데노신, 2-티오티미딘, 이노신, 피롤로-피리미딘, 3-메틸 아데노신, 5-메틸시티딘, C-5 프로피닐-시티딘, C-5 프로피닐-우리딘, 2-아미노아데노신, C5-브로모우리딘, C5-플루오로우리딘, C5-아이오도우리딘, C5-프로피닐-우리딘, C5-프로피닐-시티딘, C5-메틸시티딘, 2-아미노아데노신, 7-데아자아데노신, 7-데아자구아노신, 8-옥소아데노신, 8-옥소구아노신, O(6)-메틸구아닌, 및 2-티오시티딘); 화학적으로 변형된 염기; 생물학적으로 변형된 염기 (예를 들어, 메틸화된 염기); 개재 염기; 변형된 당 (예를 들어, 2'-플루오로리보스, 리보스, 2'-데옥시리보스, 아라비노스, 및 헥소스); 및/또는 변형된 포스페이트 기 (예를 들어, 포스포로티오에이트 및 5'-N-포스포르아미다이트 연결)이거나, 또는 그를 포함한다.
본원에서 사용되는 바, 핵산 서열의 "발현"은 폴리뉴클레오티드, 예컨대, mRNA의 폴리펩티드로의 번역, 다중 폴리펩티드의 무손상 단백질 (예를 들어, 효소)로의 어셈블리 및/또는 폴리펩티드 또는 완전히 어셈블리된 단백질 (예를 들어, 효소)의 번역 후 변형을 지칭한다. 본 개시내용에서, "발현" 및 "생산"이라는 용어, 및 문법상 동의어는 상호교환적으로 사용된다.
본원에서 사용되는 바, 용어 "아미노산"은 가장 넓은 의미에서 폴리펩티드 쇄 내로 도입될 수 있는 임의의 화합물 및/또는 물질을 지칭한다. 일부 측면에서, 아미노산은 일반 구조식 H2N-C(H)(R)-COOH를 갖는다. 펩티드의 카르복시- 및/또는 아미노-말단 아미노산을 포함한 아미노산은 그의 활성에 부정적인 영향을 미치지 않으면서, 메틸화, 아미드화, 아세틸화, 보호기, 및/또는 펩티드의 순환 반감기를 변경할 수 있는 다른 화학기로의 치환에 의해 변형될 수 있다. 아미노산은 이황화 결합에 참여할 수 있다. 아미노산은 하나 이상의 화학적 엔티티 (예를 들어, 메틸 기, 아세테이트 기, 아세틸 기, 포스페이트 기, 포르밀 모이어티, 이소프레노이드 기, 술페이트 기, 폴리에틸렌 글리콜 모이어티, 지질 모이어티, 탄수화물 모이어티, 비오틴 모이어티 등)와의 회합과 같은 하나 이상의 번역 후 변형을 포함할 수 있다. 용어 "아미노산"은 "아미노산 잔기"와 상호교환적으로 사용되며, 유리 아미노산 및/또는 펩티드의 아미노산 잔기를 지칭할 수 있다. 용어가 유리 아미노산 또는 펩티드의 잔기를 지칭하는지 여부는 용어가 사용되는 맥락에서 명백할 것이다.
"폴리펩티드"는 천연적으로 제조되든, 또는 합성적으로 제조되든 간에 펩티드 결합에 의해 연결된 아미노산 잔기의 중합체이다.
본원에서 사용되는 바, 용어 "펩티드"는 2-100개의 아미노산 단량체를 갖는 폴리펩티드를 지칭한다.
"단백질"은 하나 이상의 폴리펩티드 쇄를 포함하는 거대분자이다. 단백질은 또한 탄수화물 기와 같은 비-펩티드 성분을 포함할 수 있다. 탄수화물 및 다른 비-펩티드 치환기는 단백질이 생산되는 세포에 의해 단백질에 추가될 수 있고, 세포 유형에 따라 달라질 것이다. 본원에서 일부 단백질은 그의 아미노산 백본 구조의 관점에서 정의된다.
본원에서 사용되는 바, "기능성" 생물학적 분자, 예컨대, 단백질은 특징화 기준이 되는 특성 및/또는 활성을 보이는 형태의 생물학적 분자이다.
본원에서 사용되는 바, 용어 "전달"은 국소 전달 및 전신 전달, 둘 모두를 포함한다. 예를 들어, 폴리뉴클레오티드, 예컨대, mRNA의 전달은 폴리뉴클레오티드가 표적 조직으로 전달되고, 코딩된 단백질이 표적 조직 내에서 발현되고, 유지되는 상황을 포함한다 ("국소 분포" 또는 "국소 전달"로도 지칭). 다른 예시적인 상황은 폴리뉴클레오티드가 표적 조직으로 전달되고, 코딩된 단백질이 발현되고, 환자의 순환계 (예를 들어, 혈청)로 분비되고, 전신 분포되고, 다른 조직에 의해 흡수되는 상황을 포함한다 ("전신 분포" 또는 "전신적 전달로도 지칭). 다른 예시적인 상황에서, 폴리뉴클레오티드는 전신적으로 전달되고, 생체내에서 매우 다양한 세포 및 조직에서 흡수된다. 일부 예시적인 상황에서, 전달은 정맥내, 근육내 또는 피하이다.
본원에서 사용되는 바, 용어 "시험관내"는 다세포 유기체 내에서가 아닌, 인공 환경, 예컨대, 테스트 튜브 또는 반응 베쓸내, 세포 배양물 등에서 발생하는 이벤트를 지칭한다.
본원에서 사용되는 바, 용어 "생체내"는 예컨대, 인간 및 비-인간 동물과 같은 다세포 유기체 내에서 발생하는 이벤트를 지칭한다. 세포 기반 시스템과 관련하여, 상기 용어는 (예를 들어, 시험관내 시스템과 대조적으로) 살아있는 세포 내에서 발생하는 이벤트를 지칭하는 데 사용될 수 있다.
"제약상 허용되는"이라는 어구는 타당한 의학적 판단의 범주에서, 과도한 독성, 자극, 알레르기 반응, 또는 다른 문제 또는 합병증 없이, 합리적인 이익/위험 비에 알맞게 인간 및 동물의 조직과의 접촉 사용에 적합한, 화합물, 물질, 조성물, 및/또는 투여 형태를 지칭하는 것으로 본원에서 사용된다.
본원에서 사용되는 바, "치료하는"이라는 용어는 치료 중인 질환 및 장애 중 어느 하나의 병리학적 특징 또는 증상 중 어느 하나 이상을 부분적으로 또는 전체적으로 제거, 완화, 그의 진행을 억제 또는 그의 진행을 역전시키는 전달제 및 핵산의 투여를 지칭한다. 상기 질환은 오르니틴 트랜스카르바밀라제 결핍증 (OTCD)을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
본원에서 사용되는 바, "치료 유효"라는 어구는 폴리뉴클레오티드 또는 제약 조성물의 양, 또는 조합 요법의 경우, 활성 성분의 조합된 양을 한정하는 것으로 의도된다. 상기 양 또는 조합된 양은 관련 질환 또는 병태를 치료하는 목적을 달성할 것이다.
본원에서 사용되는 바, 용어 "대상체"는 인간 또는 임의의 비-인간 동물 (예를 들어, 마우스, 래트, 토끼, 개, 고양이, 소, 돼지, 양, 말 또는 영장류)을 지칭한다. 인간은 출생 전 형태와 출생 후 형태를 포함한다. 다수 측면에서, 대상체는 인간이다. 대상체는 질환의 진단 또는 치료를 위해 의료 제공자에게 제시하는 인간을 지칭하는 환자일 수 있다. 용어 "대상체"는 본원에서 "개체" 또는 "환자"와 상호교환적으로 사용될 수 있다. 대상체는 질환 또는 장애에 걸리거나, 또는 그에 취약할 수 있지만, 질환 또는 장애의 증상을 나타내거나, 또는 나타내지 않을 수 있다.
용어 "지질"은 지방산의 에스테르인 유기 화합물의 기를 지칭하고, 물에는 블용성이지만, 다수의 유기 용매에는 가용성인 것을 특징으로 한다. 이는 일반적으로 적어도 3개 부류로 분류된다: (1) 지방 및 오일 뿐만 아니라, 왁스를 포함하는 "단순 지질"; (2) 인지질 및 당지질을 포함하는 "복합 지질"; (3) 예컨대, 스테로이드와 같은 "유도된 지질".
용어 "양친매성 지질"은 부분적으로, 지질 물질의 소수성 부분이 소수성 상으로 배향되고, 친수성 부분은 수성 상으로 배향되는 임의의 적합한 물질을 지칭한다. 양친매성 지질은 일반적으로 지질 LNP의 주요 구성성분이다. 친수성 특징은 예컨대, 탄수화물, 포스파토, 카르복실, 술페이토, 아미노, 술프히드릴, 니트로, 히드록시 및 다른 유사 기과 같은, 극성 기 또는 하전된 기의 존재에서 비롯된다. 소수성은 장쇄 포화 및 불포화 지방족 탄화수소 기 및 하나 이상의 방향족, 지환족 또는 헤테로시클릭 기(들)에 의해 치환된 상기 기를 포함하나, 이에 제한되지 않는 무극성 기의 포함에 의해 부여될 수 있다. 양친매성 화합물의 예는 인지질, 아미노지질 및 스핑고리피드를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 인지질의 대표적인 예로는 포스파티딜콜린, 포스파티딜에탄올아민, 포스파티딜세린, 포스파티딜이노시톨, 포스파티딘산, 팔미토일올레오일 포스파티딜콜린, 리소포스파티딜콜린, 리소포스파티딜에탄올아민, 디팔미토일포스파티딜콜린, 디올레오일포스파티딜콜린, 디스테아로일포스파티딜콜린 또는 디리놀레오일포스파티딜콜린을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 스핑고리피드, 글리코스핑고리피드 패밀리, 디아실글리세롤 및 β-아실옥시산과 같이 인이 결여된 다른 화합물도 양친매성 지질로 지정된 군에 포함된다. 추가로, 상기 기술된 양친매성 지질은 트리글리세리드 및 스테롤을 비롯한 다른 지질과 혼합될 수 있다.
용어 "음이온성 지질"은 생리학적 pH에서 음으로 하전된 임의의 지질을 지칭한다. 이러한 지질로는 포스파티딜글리세롤, 카디오리핀, 디아실포스파티딜세린, 디아실포스파티딘산, N-도데카노일 포스파티딜에탄올아민, N-숙시닐 포스파티딜에탄올아민, N-글루타릴포스파티딜에탄올아민, 리실포스파티딜글리세롤, 및 중성 지질에 결합된 다른 음이온성 변형 기를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
용어 "양이온성 지질"은 예컨대, 생리학적 pH와 같은 선택적 pH에서 순 양전하를 보유하는 다수의 지질 종 중 임의의 것을 지칭한다. 상기 지질로는 N,N-디올레일-N,N-디메틸암모늄 클로라이드 ("DODAC"); N-(2,3-디올레일옥시)프로필)-N,N,N-트리메틸암모늄 클로라이드 ("DOTMA"); N,N-디스테아릴-N,N-디메틸암모늄 브로마이드 ("DDAB"); N-(2,3-디올레오일옥시)프로필)-N,N,N-트리메틸암모늄 클로라이드 ("DOTAP"); 3-(N-(N',N'-디메틸아미노에탄)-카르바모일)콜레스테롤 ("DC-Chol") 및 N-(1,2-디미리스틸옥시프롭-3-일)-N,N-디메틸-N-히드록시에틸 암모늄 브로마이드 ("DMRIE")를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 추가로, 본 개시내용에서 사용될 수 있는 양이온성 지질의 다수의 상업적 제제가 이용가능하다. 이는 예를 들어, 리포펙틴(LIPOFECTIN)® (GIBCO/BRL (미국 뉴욕주 그랜드 아일랜드)로부터의, DOTMA 및 1,2-디올레오일-sn-3-포스포에탄올아민 ("DOPE")을 포함하는 상업적으로 이용가능한 양이온성 리포솜); 리포펙타민(LIPOFECTAMINE)® (GIBCO/BRL로부터의, N-(1-(2,3-디올레일옥시)프로필)-N-(2-(스페르민카르복스아미도)에틸)-N,N-디메틸암모늄 트리플루오로아세테이트 ("DOSPA") 및 ("DOPE")를 포함하는 상업적으로 이용가능한 양이온성 리포솜); 및 트랜스펙탐(TRANSFECTAM)® (프로메가 코포레이션(Promega Corp.: 미국 위스콘신주 매디슨)으로부터의, 에탄올 중 디옥타데실아미도글리실 카르복시스페르민 ("DOGS")을 포함하는 상업적으로 이용가능한 양이온성 지질)을 포함한다. 하기 지질은 양이온성이며, 생리학적 pH 미만에서 양전하를 갖는다: DODAP, DODMA, DMDMA 등.
용어 "지질 나노입자"는 수성 부피가 양친매성 지질 이중층에 의해 캡슐화된 리포솜; 또는 지질이 예컨대, 플라스미드와 같은 큰 분자 구성성분을 포함하는 내부를 감소된 수성 내부로 코팅하는 것인 리포솜; 또는 캡슐화된 구성성분이 상대적으로 무질서한 지질 혼합물 내에 함유되어 있는 것인 지질 응집체 또는 미셀을 포함하나, 이에 제한되지 않는, 화합물 (예를 들어, 폴리뉴클레오티드 구축물)을 전달하는 데 사용될 수 있는 임의의 지질 조성물을 지칭한다.
본원에서 사용되는 바, "캡슐화된 지질" 또는 "지질 캡슐화"는 화합물 (예를 들어, 폴리뉴클레오티드 구축물)을 완전히 캡슐화, 부분적으로 캡슐화, 또는 그 둘 모두가 수행된 지질 제제를 지칭할 수 있다. "완전한 캡슐화" 또는 "완전히 캡슐화된"은 본원에서 지질 제제 중 적어도 90%의 화합물 (예를 들어, 폴리뉴클레오티드 구축물)이 지질 (예를 들어, LNP)에 의해 캡슐화된 것을 의미하는 것으로 이해된다. 일부 측면에서, 지질 제제 중 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 그 초과의 화합물 (예를 들어, 폴리뉴클레오티드 구축물)이 지질 (예를 들어, LNP)에 의해 캡슐화된다.
폴리뉴클레오티드 구축물
본원에 개시된 폴리뉴클레오티드 구축물은 세포에서 (시험관내 또는 생체내에서) OTC 단백질의 수준을 본원에 개시된 폴리뉴클레오티드 구축물의 부재하에서 수득 및/또는 관찰된 수준보다 더 큰 수준으로 증가시키기 위한 치료제로서 사용될 수 있다.
특정 측면에서, 폴리뉴클레오티드 구축물은 기능성 인간 오르니틴 트랜스카르바밀라제 (OTC) 단백질을 코딩하는 오픈 리딩 프레임 (ORF)을 포함하는 핵산 서열, 예컨대, mRNA 서열을 포함한다. ORF는 전장 OTC 단백질 또는 그의 기능적 단편을 코딩할 수 있다. 일부 측면에서, ORF는 서열식별번호 7과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 코딩한다. 일부 측면에서, 전장 OTC는 서열식별번호 7의 아미노산 서열을 포함한다.
일부 측면에서, 폴리뉴클레오티드 구축물은 코돈 최적화된 ORF를 포함하는 mRNA 서열을 포함한다. 일부 측면에서, ORF는 서열식별번호 1과 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 측면에서, ORF는 서열식별번호 1의 핵산 서열을 포함한다.
일부 측면에서, 폴리뉴클레오티드 구축물은 5' UTR을 포함한다. 5' UTR은 서열식별번호 2의 서열을 포함할 수 있다.
일부 측면에서, 폴리뉴클레오티드 구축물은 3' UTR을 포함한다. 3' UTR은 서열식별번호 3의 서열을 포함할 수 있다.
일부 측면에서, 본 개시내용의 폴리뉴클레오티드 구축물은 5'에서 3'으로: (i) 예컨대, 서열식별번호 2의 서열을 포함하는 5' UTR; (ii) 기능성 인간 오르니틴 트랜스카르바밀라제 (OTC)를 코딩하는 오픈 리딩 프레임 (ORF)을 포함하는 핵산 서열, 예컨대, mRNA로서, 여기서 ORF는 서열식별번호 1과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 또는 100% 동일한 서열을 포함하는 것인 핵산 서열; 및 서열식별번호 3의 서열을 포함하는 3' UTR을 포함한다.
일부 측면에서, 폴리뉴클레오티드 구축물은 서열식별번호 4와 상이한 5개 이하의 핵산을 갖는 서열을 포함한다. 일부 측면에서, 폴리뉴클레오티드 구축물은 서열식별번호 4와 상이한 5, 4, 3, 2, 또는 1개의 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 측면에서, 핵산 차이는 서열식별번호 4의 뉴클레오티드 2 내지 1221 내에 존재할 수 있다. 폴리뉴클레오티드 구축물은 서열식별번호 4의 서열을 포함할 수 있다.
폴리뉴클레오티드 구축물은 폴리A 테일을 추가로 포함할 수 있다. 일부 측면에서, 폴리A 테일은 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 또는 150개의 핵산보다 길다. 일부 측면에서, 폴리A 테일의 길이는 80 내지 1000, 85 내지 1000, 90 내지 1000, 95 내지 1000, 100 내지 1000, 105 내지 1000, 110 내지 1000, 115 내지 1000, 120 내지 1000, 125 내지 1000, 130 내지 1000, 135 내지 1000, 140 내지 1000, 145 내지 1000, 150 내지 1000, 155 내지 1000, 160 내지 1000, 80 내지 800, 85 내지 800, 90 내지 800, 95 내지 800, 100 내지 800, 105 내지 800, 110 내지 800, 115 내지 800, 120 내지 800, 125 내지 800, 130 내지 800, 135 내지 800, 140 내지 800, 145 내지 800, 150 내지 800, 155 내지 800, 또는 160 내지 800개의 핵산 길이이다. 일부 측면에서, 폴리A 테일의 길이는 100 내지 500개의 핵산 길이이다.
일부 측면에서, 폴리뉴클레오티드 구축물은 ORF의 5' 말단에 개시 코돈을 포함한다. 일부 측면에서, 폴리뉴클레오티드 구축물은 ORF의 3' 말단에 정지 코돈을 포함한다.
특정 측면에서, 폴리뉴클레오티드 구축물은 변형된 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 측면에서, 폴리뉴클레오티드 구축물은 기능성 인간 오르니틴 트랜스카르바밀라제 (OTC)를 코딩하는 오픈 리딩 프레임 (ORF)을 포함하는 mRNA 서열을 포함하고, 여기서 mRNA 서열은 변형된 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 측면에서, 변형된 뉴클레오티드는 우리딘이다. 일부 측면에서, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 99%, 또는 100%의 우리딘은 화학적으로 변형된 것이다.
일부 측면에서, 화학적으로 변형된 우리딘은 슈도우리딘 (ψ), N1-메틸 슈도우리딘 (N1-me-ψ), 5-메톡시 우리딘 (5moU), 및 그의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 측면에서, 화학적으로 변형된 우리딘은 슈도우리딘 (ψ), N1-메틸 슈도우리딘 (N1-me-ψ), 및 그의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 특정 측면에서, 예컨대, 서열식별번호 1을 포함하는 ORF는 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 약 100% 변형된 우리딘, 예컨대, 변형된 슈도우리딘 (ψ) 또는 변형된 N1-메틸 슈도우리딘 (N1-me-ψ)을 포함한다.
특정 측면에서, 폴리뉴클레오티드 구축물은 서열식별번호 8과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 발현 카세트를 사용하여 제조될 수 있다. 일부 측면에서, 발현 카세트는 프로모터, 예컨대, T7 프로모터를 추가로 포함한다. 일부 측면에서, T7 프로모터는 5'에서 3'으로 하기 서열: TAATACGACTCACTATA (서열식별번호 9)를 포함한다. 일부 측면에서, 발현 카세트의 5' UTR은 프로모터, 예컨대, T7 프로모터의 하류 방향으로 바로 옆에 아데닌 (A)을 포함한다. 일부 측면은 발현 카세트를 포함하는 플라스미드에 관한 것이다. 일부 측면에서, 플라스미드는 항생제 내성 유전자를 추가로 포함한다. 일부 측면에서, 폴리뉴클레오티드 구축물은 시험관내 전사를 사용하여 제조된다.
예시적인 OTC 아미노산 서열 및 코딩 뉴클레오티드 서열은 본원 표 1에 제시되어 있다.
표 1: 폴리뉴클레오티드 구축물과 관련된 서열
Figure pct00001
Figure pct00002
Figure pct00003
Figure pct00004
일부 측면에서, 본 개시내용의 폴리뉴클레오티드 구축물은 전달제, 예컨대, LNP와 함께 제제화된다.
전달제
본원에 개시된 전달제는 시험관내 및 생체내에서 본원에 개시된 폴리뉴클레오티드 구축물, 카세트, 및 mRNA를 세포 내로 효과적으로 수송할 수 있다.
특정 측면에서, 전달제는 지질 나노입자, 리포솜, 중합체, 미셀, 플라스미드, 바이러스 전달제, 또는 그의 임의의 조합이다.
어느 특정 이론으로 제한하지 않으면서, 전달제에 의한 본원에 개시된 폴리뉴클레오티드 구축물, 발현 카세트, 및/또는 mRNA의 수송은 세포의 세포질로의 폴리뉴클레오티드 구축물의 전달을 통해 발생할 수 있다. 유전자 발현 및 mRNA 번역이 세포의 세포질에서 일어나기 때문에, 폴리뉴클레오티드는 표적 유전자의 효과적인 조정 또는 수송된 mRNA의 효과적인 번역을 위해 세포질로 진입하여야 한다. 폴리뉴클레오티드가 세포질로 진입하지 못하면, 분해되거나, 또는 세포외 매질에 그대로 남아 있을 수 있다.
생물학적으로 활성인 폴리뉴클레오티드를 표적 세포로 세포내 전달하는 방법의 예로는 세포가 예를 들어, 인간, 설치류, 뮤린, 소, 개, 고양이, 양, 말과 유인원 포유동물을 비롯한 포유동물인 동물에 있는 것을 포함한다. 일부 측면에서, 세포내 전달을 위한 표적 세포는 간 세포이다.
일부 측면에서, 전달제는 지질 나노입자 (LNP)이다. 본 개시내용의 폴리뉴클레오티드 구축물은 LNP 내에서 제제화될 수 있다. 특정 측면에서, 폴리뉴클레오티드 구축물은 LNP 내에 캡슐화된다. 본원에서 사용되는 바, "캡슐화된"이란, LNP의 내부 공간 내에 예컨대, 폴리뉴클레오티드와 같은 분자를 함유하는 것을 지칭한다. 일부 측면에서, 예컨대, LNP와 같은 전달제 내에 (예를 들어, mRNA를 포함하는) 폴리뉴클레오티드 구축물을 캡슐화함으로써, 핵산을 분해하는 효소 또는 화학물질, 및/또는 핵산의 빠른 배출을 유발하는 시스템 또는 수용체를 함유할 수 있는 환경으로부터 핵산 (예를 들어, 본 개시내용의 폴리뉴클레오티드 구축물)을 보호할 수 있다. 지질 나노입자는 전형적으로 관심 페이로드, 예컨대, 본원에 개시된 폴리뉴클레오티드 구축물로 제제화될 수 있는 이온화가능한 (예를 들어, 양이온성) 지질, 비-양이온성 지질 (예를 들어, 콜레스테롤 및 인지질), 및 PEG 지질 (예를 들어, 접합된 PEG 지질)을 포함한다. 본 개시내용의 폴리뉴클레오티드 구축물, 예컨대, mRNA는 지질 입자에 캡슐화되어 효소적 분해로부터 보호될 수 있다. 일부 측면에서, 분자 (예를 들어, 폴리뉴클레오티드 구축물)는 LNP에 의해 완전히 캡슐화된다. 일부 측면에서, 지질 제제 중 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 그 초과의 분자 (예를 들어, 폴리뉴클레오티드 구축물)는 LNP에 의해 캡슐화된다.
특정 측면은 본 개시내용의 폴리뉴클레오티드 구축물; 및 전달제를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 전달제는 LNP, 예컨대, LNP1 (PEG2000-C-DMA:13-B43:콜레스테롤:DSPC), LNP2 (PEG2000-S:13-B43:콜레스테롤:DSPC 또는 PEG2000-S:18-B6:콜레스테롤:DSPC), 또는 LNP3 (PEG750-C-DLA:18-B6:콜레스테롤:DSPC) 그룹 중의 LNP 조성물을 포함할 수 있다.
일부 측면에서, 본 개시내용의 LNP는 PEG2000-C-DMA, PEG2000-S, 및 PEG750-C-DLA로 이루어진 군으로부터 선택되는 PEG 지질을 포함한다. 일부 측면에서, LNP는 PEG2000-C-DMA인 PEG 지질을 포함한다. 일부 측면에서, LNP는 PEG2000-S인 PEG 지질을 포함한다. 일부 측면에서, LNP는 PEG750-C-DLA인 PEG 지질을 포함한다.
일부 측면에서, 본 개시내용의 LNP는 13-B43 또는 18-B6인 이온화가능한 지질을 포함한다.
일부 측면에서, 이온화가능한 지질은 화학식 13-B43의 화합물, 또는 그의 염이다. 상기 지질은 예컨대, WO 2013/126803 (PCT/US2013/027469)에 기술되어 있다.
Figure pct00005
일부 측면에서, 이온화가능한 지질은 화학식 18-B6의 화합물, 또는 그의 염이다.
Figure pct00006
일부 측면에서, 본 개시내용의 LNP는 비-양이온성 지질을 포함한다. 특정 측면에서, 비-양이온성 지질은 콜레스테롤, 디스테아로일 포스파티딜콜린 (DSPC), 또는 그의 조합이다. 일부 측면에서, LNP는 콜레스테롤을 포함한다. 일부 측면에서, LNP는 디스테아로일 포스파티딜콜린 (DSPC)을 포함한다. 일부 측면에서, LNP는 콜레스테롤 및 디스테아로일 포스파티딜콜린 (DSPC)을 포함한다.
일부 측면에서, 본 개시내용의 LNP는 (a) PEG 지질 (예를 들어, PEG2000-C-DMA, PEG2000-S, 또는 PEG750-C-DLA); (b) 이온화가능한 지질 (13-B43 또는 18-B6); (c) 콜레스테롤; 및 (d) 디스테아로일 포스파티딜콜린 (DSPC)을 포함한다.
특정 측면에서, 본 개시내용의 LNP는 LNP의 0.1-4 mol%; 0.5-4 mol%, 2-3.5 mol%, 0.1-2 mol%; 0.5-2 mol%, 또는 1-2 mol%인 양으로 PEG 지질을 포함한다. 특정 측면에서, LNP는 LNP의 50-85 mol%; 50-65 mol%, 또는 50-60 mol%인 양으로 이온화가능한 지질을 포함한다. 특정 측면에서, LNP는 45-50 mol%, 또는 최대 약 50 mol%인 양으로 비-양이온성 지질을 포함한다. 특정 측면에서, LNP는 LNP의 30-40 mol% 또는 30-35 mol%인 양으로 콜레스테롤을 포함한다. 특정 측면에서, LNP는 LNP의 3-15 mol% 또는 6-12 mol%인 양으로 DSPC를 포함한다.
일부 측면에서, 본 개시내용의 LNP는 (a) 1-4 mol% PEG 지질 (예를 들어, PEG2000-C-DMA, PEG2000-S, 또는 PEG750-C-DLA); (b) 50-60 mol% 이온화가능한 지질 (13-B43 또는 18-B6); 및 (c) 45-50 mol% 비-양이온성 지질을 포함한다.
일부 측면에서, 본 개시내용의 LNP는 (a) 1-4 mol% PEG 지질 (예를 들어, PEG2000-C-DMA, PEG2000-S, 또는 PEG750-C-DLA); (b) 50-60 mol% 이온화가능한 지질 (13-B43 또는 18-B6); (c) 30-35 mol% 콜레스테롤; 및 (d) 6-12 mol% 디스테아로일 포스파티딜콜린 (DSPC)을 포함한다.
일부 측면에서, LNP의 크기는 직경이 약 50-200 nm인 크기이다. 일부 측면에서, LNP 입자 크기는 약 50-150 nm, 약 50-100 nm, 약 50-120 nm, 또는 약 50-90 nm 범위이다.
LNP 제제
관련 기술분야의 통상의 기술자는 하기 설명이 단지 예시를 위한 것임을 이해할 것이다. 본 개시내용의 프로세스는 광범위한 지질 나노입자 유형 및 크기에 적용가능하다. 추가 입자로는 미셀, 지질-핵산 입자, 바이로솜 등을 포함한다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 본 개시내용의 프로세스 및 장치가 적합한 다른 지질 LNP를 알 것이다.
한 측면에서, 본 개시내용의 다중핵산 구축물을 캡슐화하는 본 방법은 우수 의약품 제조 관리 기준(Good Manufacturing Practice: GMP) 하에 합성된 임상 등급 지질과 같은 지질 용액을 제공하고, 이는 이후에 유기 용액(예를 들어, 에탄올) 중에 가용화된다. 유사하게, 치료 제품, 예컨대, 치료 활성제, 예컨대, 핵산 또는 다른 작용제는 GMP 하에 제조된다. 이어서, 완충제 (예를 들어, 시트레이트 또는 에탄올)를 함유하는 치료제 용액 (예를 들어, mRNA)을 저급 알칸올 중에 가용화된 지질 용액과 혼합하여 리포솜 제제을 형성한다. 본 개시내용의 바람직한 측면에서, 치료제는 리포솜의 형성과 실질적으로 동시에, 리포솜에 "수동적으로 포획"된다. 그러나, 관련 기술분야의 통상의 기술자는 본 개시내용의 프로세스 및 장치가 LNP 형성 후 리포솜의 능동적 포획 또는 로딩에 동등하게 적용가능하다는 것을 이해할 것이다.
본 개시내용의 프로세스 및 장치에 따라, 예컨대, 혼합 챔버와 같은 혼합 환경 내로 지질 및 완충제 용액을 연속적으로 도입하는 작용은 지질 용액을 완충제 용액으로 연속적으로 희석하여 실질적으로 혼합 즉시 리포솜을 생성한다. 본원에서 사용되는 바, "지질 용액을 완충제 용액으로 연속적으로 희석한다"라는 어구 (및 어미 변화)는 일반적으로 지질 용액이 LNP 생성을 달성하기에 충분한 힘으로 수화 프로세스에서 충분히 빠르게 희석된다는 것을 의미한다. 수용액과 유기 지질 용액을 혼합함으로써, 유기 지질 용액은 완충제 (수성) 용액의 존재하에 연속적인 단계적 희석을 거쳐 리포솜을 생성한다.
용액, 예컨대, 지질 용액 및 수성 치료제 (예를 들어, 폴리뉴클레오티드 구축물) 용액을 제조한 후, 이들은 예를 들어, 연동 펌프 믹서를 사용하여 함께 혼합한다. 한 측면에서, 용액을 실질적으로 동일한 유속으로 혼합 환경으로 펌핑한다. 특정 측면에서, 혼합 환경은 "T"-커넥터 또는 혼합 챔버를 포함한다. 이 경우, 유체 라인, 따라서, 유체 유동은 서로에 대해 대략 180°로 반대 유동으로 "T"-커넥터 내의 좁은 개구에서 만나는 것이 바람직하다. 예를 들어, 27°내지 90° 및 90°내지 180°와 같은 다른 상대 도입 각이 사용될 수 있다. 혼합 환경에서 용액 유동을 만나고, 혼합되었을 때, 지질 LNP는 실질적으로 즉시 형성된다. 지질 LNP는 용해된 지질을 포함하는 유기 용액과 수용액 (예를 들어, 완충제)이 동시에 및 연속적으로 혼합될 때 형성된다. 유리하게 및 놀랍게도, 수용액과 유기 지질 용액을 혼합함으로써, 유기 지질 용액은 연속적으로 단계적으로 희석됨으로써 실질적으로 즉시 리포솜을 생성한다. 펌프 기전은 높은 알칸올 환경에서 지질 LNP를 생성하는 혼합 환경으로 지질 용액 및 수용액을 동일하거나, 또는 상이한 유속으로 제공하도록 구성될 수 있다.
유리하게, 본원에 제공된 바와 같은 지질 용액 및 수용액의 혼합을 위한 프로세스 및 장치는 적어도 90-95%의 캡슐화 효율로 리포솜 형성과 실질적으로 동시에, 형성된 리포솜에 치료제의 캡슐화를 제공한다. 본원에서 논의된 추가 프로세싱 단계는 원하는 경우, 샘플을 농축시키거나, 또는 희석함으로써 특정 mRNA 농도를 표적화하는 데 사용될 수 있다.
일부 측면에서, 평균 직경이 약 150nm 미만 (예를 들어, 약 50-90 nm)인 LNP가 형성되며, 이는 예컨대, 막 압출, 초음파처리 또는 미세유동화와 같은 고에너지 프로세스에 의한 추가의 크기 축소를 필요로 하지 않는다.
특정 측면에서, LNP는 유기 용매 (예를 들어, 에탄올)에 용해된 지질이 수용액 (예를 들어, 완충제)과 혼합함으로써 단계적 방식으로 희석될 때 형성된다. 이 제어된 단계적 희석은 예컨대, T-커넥터와 같은 개구에서 수성 스트림 및 지질 스트림을 함께 혼합함으로써 달성된다. 생성된 지질, 용매 및 용질 농도는 LNP 형성 프로세스 내내 일정하게 유지될 수 있다.
한 측면에서, 본 개시내용의 프로세스를 사용하여, LNP는 구배 없이 2단계 단계적 희석에 의해 제조된다. 예를 들어, 제1 단계적 희석에서, LNP는 높은 알칸올 (예를 들어, 에탄올) 환경 (예를 들어, 약 30% v/v 내지 약 50% v/v 에탄올)에서 형성된다. 이어서, 이들 LNP는 알칸올 (예를 들어, 에탄올) 농도를 약 25% v/v 이하, 예컨대, 약 17% v/v 내지 약 25% v/v로 단계적 방식으로 낮춤으로써 안정화시킬 수 있다. 바람직한 측면에서, 수용액 중에 또는 지질 용액 중에 존재하는 치료제와 함께, 치료제는 리포솜 형성과 동시에 캡슐화된다.
특정 측면에서, 지질 스톡은 100% 에탄올에서 제조될 수 있고, 이어서, T-커넥터를 통해 아세테이트 완충제 중에서 mRNA LNP와 혼합될 수 있다. 지질 및 mRNA 스톡은 T-커넥터에서 400 mL/min의 유속으로 PBS를 포함하는 수집 베쓸 내로 혼합할 수 있다. 일부 측면에서, 지질은 먼저 알칸올 환경 중에 약 40% v/v 내지 약 90% v/v, 더욱 바람직하게, 약 65% v/v 내지 약 90% v/v, 및 가장 바람직하게, 약 80% v/v 내지 약 90% v/v로 희석된다 (A). 이어서, 지질 용액은 수용액과의 혼합으로 단계적으로 희석되고, 그 결과, 알칸올 (예를 들어, 에탄올) 농도 약 37.5-50%의 LNP가 형성된다 (B). 수용액을 유기 지질 용액과 혼합함으로써, 유기 지질 용액은 연속적인 단계적 희석을 거쳐 리포솜을 생성한다. 추가로, 지질 LNP는 약 25% 이하, 바람직하게, 약 15-25%의 알칸올 농도로 LNP를 추가로 단계적으로 희석함으로써 추가로 안정화될 수 있다 (C).
일부 측면에서, 두 단계적 희석 (A→B 및 B→C) 모두, 생성된 에탄올, 지질 및 용질 농도는 수용 베쓸에서 일정한 수준으로 유지된다. 초기 혼합 단계 후 이러한 더 높은 에탄올 농도에서, 지질 단량체의 이중층으로의 재배열은 더 낮은 에탄올 농도에서 희석에 의해 형성되는 LNP와 비교하여 더욱 정돈된 방식으로 진행된다. 특정 이론으로 제한하고자 하지 않으면서, 이러한 더 높은 에탄올 농도는 이중층에서 핵산과 양이온성 지질의 회합을 촉진시키는 것으로 간주된다. 특정 측면에서, 핵산 캡슐화는 22% 초과의 알칸올 (예를 들어, 에탄올) 농도 범위 내에서 발생한다.
특정 측면에서, 지질 LNP가 형성된 후, 이들은 또 다른 베쓸, 예를 들어, 스테인리스강 베쓸에 수집된다. 한 측면에서, 제2 희석은 예컨대, 약 100-200 mL/min의 속도로 수행될 수 있다.
한 측면에서, 혼합 단계 후, 지질 농도는 약 1-10 mg/mL (예를 들어, 약 7 mg/mL)이고, 치료제 (예를 들어, mRNA) 농도는 약 0.1-4 mg/mL이다.
혼합 단계 후, 지질 LNP 현탁액이 임의적으로 희석된다면, 치료제 (예를 들어, 핵산) 캡슐화 정도가 증진될 수 있다. 예를 들어, 희석 단계 이전에, 치료제 포획이 약 30-40%인 경우, 희석 단계 이후 인큐베이션 후에는 약 70-80%로 증가될 수 있다. 단계에서, 리포솜 제제는 수용액, 예컨대, 완충제 (예를 들어, PBS)와 혼합함으로써 약 10% 내지 약 40%, 바람직하게는 약 20% 알칸올로 희석된다. 상기 추가 희석은 바람직하게는 완충제로 달성된다. 특정 측면에서, 리포솜 용액을 추가로 희석하는 것은 연속적인 단계적 희석이다. 이어서, 희석된 샘플을 임의적으로 실온에서 인큐베이션시킬 수 있다.
임의적 희석 단계 후에, 치료제 (예를 들어, 핵산)의 약 70-80% 이상이 지질 LNP 내에 포획된다. 특정 측면에서, 음이온 교환 크로마토그래피가 사용된다.
특정 경우에, 리포솜 용액은 임의적으로, 예를 들어, 예를 들어, 한외여과 (예를 들어, 접선 유동 투석)를 사용하여 약 2-6배, 바람직하게, 약 4배 농축된다. 한 측면에서, 샘플은 한외여과 시스템의 공급 저장소로 이동되고, 완충제는 제거된다. 완충제는 다양한 프로세스를 사용하여, 예컨대, 한외여과에 의해 제거될 수 있다.
일부 측면에서, 이어서, 농축된 제제를 정용여과하여 알칸올을 제거한다. 단계 완료시 알칸올 농도는 약 1% 미만이다. 바람직하게, 지질 및 치료제 (예를 들어, 핵산) 농도는 변함없이 그대로 유지되고, 치료제 포획 수준 또한 일정하게 유지된다.
알칸올 제거 후, 이어서, 수용액 (예를 들어, 완충제)은 또 다른 완충제에 대한 정용여과에 의해 대체된다. 바람직하게, 지질 대 치료제 (예를 들어, 핵산)의 농도 비는 변함없이 그대로 유지되고, 핵산 포획 수준은 거의 일정하다. 특정 경우에, 카트리지를 농축된 샘플의 약 10% 부피로 완충제로 세정함으로써 샘플 수율은 개선될 수 있다. 특정 측면에서, 이 린스는 농축된 샘플에 추가된다.
특정 측면에서, 샘플의 멸균 여과는 임의적으로 수행될 수 있다. 특정 측면에서, 여과는 약 40 psi 미만의 압력에서 캡슐 필터 및 가열 재킷이 있는 가압 분배 베쓸을 사용하여 수행된다. 샘플을 약간 가열함에 따라 여과의 용이성은 개선될 수 있다.
멸균 충전 단계는 통상적인 리포솜 제제화를 위한 프로세스를 사용하여 수행될 수 있다. 일부 측면에서, 본 개시내용의 프로세스를 통해 최종 생성물에서 투입 치료제 (예를 들어, 핵산)의 약 50-60%가 생성된다. 특정 바람직한 측면에서, 최종 생성물의 치료제 대 지질 비는 대략 0.04 대 0.07이다.
이어서, 캡슐화된 LNP 제제는 멸균 조건하에서 여과되고, 분취되고, -80℃에서 보관될 수 있다.
공중합체
일부 측면에서, 본 개시내용의 조성물은 공중합체를 추가로 포함한다. 일부 측면에서, 본원에 개시된 공중합체는 "막 탈안정화 중합체" 또는 "막 파괴 중합체"이다. 막 탈안정화 중합체 또는 막 파괴 중합체는 예를 들어, 세포막 구조, 예를 들어, 엔도솜 막에서 예를 들어, 작용제, 예를 들어, 올리고뉴클레오티드 또는 공중합체, 또는 그 둘 모두가 상기 막 구조를 통과할 수 있도록 허용하기 위해 예컨대, 투과성 변화와 같은 변화를 직접 또는 간접적으로 유도할 수 있다. 일부 측면에서, 막 파괴 중합체는 예를 들어, 세포막 집단의 상당한 부분에 대해 관찰된 바와 같이, 세포 소포체의 용해를 직접 또는 간접적으로 유도하거나, 그렇지 않으면 세포막을 파괴할 수 있다.
본원에 개시된 바와 같은 전달제, 공중합체 및 조성물은 시험관내, 생체외 및 생체내 표적 세포를 비롯한, 표적 세포로의 본 개시내용의 폴리뉴클레오티드 구축물의 세포내 전달 방법에 유용할 수 있다. 일부 측면에서, 표적 세포로 예컨대, mRNA를 포함하는 폴리뉴클레오티드 구축물을 전달하는 방법은 세포의 세포질로의 전달을 포함한다.
조성물
본원에 개시된 전달제는 시험관내 및 생체내, 둘 모두에서 폴리뉴클레오티드 구축물을 세포 내로 효과적으로 수송할 수 있다. 일부 측면에서, 본 개시내용의 폴리뉴클레오티드 구축물은 전달제, 예컨대, LNP와 함께 제제화된다. 일부 측면에서, 조성물은 제약상 허용되는 담체를 추가로 포함한다.
본 개시내용의 특정 측면은 세포에서 OTC 단백질의 양을 증가시키기 위한 조성물 또는 방법에 관한 것이다. 일부 측면에서, 기능성 인간 오르니틴 트랜스카르바밀라제 (OTC)를 코딩하는 오픈 리딩 프레임 (ORF)을 포함하는 코돈 최적화된 mRNA 서열을 포함하는 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 구축물은 LNP 및/또는 공중합체와 함께 조성물로 제제화된다. 특정 측면에서, mRNA 분자는 서열식별번호 7과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 OTC 단백질을 코딩한다. 코딩된 OTC 단백질을 세포의 미토콘드리아로 유도하기 위해, OTC 단백질을 코딩하는 mRNA 분자는 미토콘드리아 표적화 신호 펩티드를 코딩하는 서열 (본원에서 "미토콘드리아 리더 서열"로도 지칭)을 포함할 수 있다. 미토콘드리아 리더 서열은 천연 OTC 단백질의 것일 수 있거나 (예를 들어, 서열식별번호 7의 잔기 1-32를 포함하는 것) (천연 인간 미토콘드리아 리더 서열), 또는 미토콘드리아 표적화 신호 펩티드를 포함하는 또 다른 단백질로부터 유래될 수 있거나, 또는 새로 합성될 수 있다. 조작된 절단 부위는 세포에서 단백질 분해 프로세싱을 최적화하기 위해 미토콘드리아 리더 서열과 폴리펩티드의 나머지 부분 사이의 접합부에 포함될 수 있다. 미토콘드리아 리더 서열은 성숙한 OTC 단백질을 코딩하는 mRNA 서열에 작동가능하게 연결되고, 즉, 두 서열은 올바른 리딩 프레임에 연결되고, 새로 합성된 폴리펩티드를 세포의 미토콘드리아로 유도하도록 위치한다. 미토콘드리아 리더 서열은 일반적으로 단백질의 아미노 말단에 위치한다. 특정 변형에서, 미토콘드리아 리더 서열을 포함하는 코딩된 OTC 단백질은 서열식별번호 7에 기재된 아미노산 서열을 갖는다. 서열식별번호 7의 OTC 단백질을 코딩하고, 본 개시내용의 조성물로 제제화될 수 있는 적합한 mRNA 서열은 서열식별번호 1 또는 서열식별번호 4에 제시된 바와 같은 서열들을 포함할 수 있다. 서열식별번호 7의 OTC 단백질을 코딩하고, 본 개시내용의 조성물로 제제화될 수 있는 적합한 mRNA 서열은 서열식별번호 1 또는 서열식별번호 4에 제시된 바와 같은 서열을 포함할 수 있다. 본 개시내용에서의 제제화를 위한 OTC-코딩 mRNA는 전형적으로 그의 3' 말단에 폴리(A) (예를 들어, 80개 초과, 예컨대, 100 내지 800개의 아데닌 잔기로 이루어진 예컨대, 폴리A 테일)를 추가로 포함할 수 있고, 이는 (예를 들어, PCR 또는 효소적 폴리-A 테일을 통해) 널리 공지된 유전 공학 기술을 사용하여 구축물에 부가될 수 있다. 본 개시내용의 폴리뉴클레오티드 구축물의 생성 및 제조를 위해 적절한 DNA 벡터 내로의 삽입에 사용될 수 있는 예시적인 DNA 서열.
사용 방법
본 개시내용의 특정 측면은 세포를 본원에 개시된 폴리뉴클레오티드 구축물 및 제약상 허용되는 희석제 또는 담체를 포함하는 조성물과 접촉시킴으로써 세포에서 오르니틴 트랜스카르바밀라제 (OTC)의 양을 증가시키는 것에 관한 것이다. 일부 측면에서, 폴리뉴클레오티드 구축물은 본원에 개시된 LNP와 함께 제제화된다. 추가 측면에서, 폴리뉴클레오티드는 공중합체와 함께 제제화될 수 있다.
일부 측면은 본 개시내용의 세포에 본 개시내용의 폴리뉴클레오티드 구축물을 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 세포에서 OTC 발현량을 증가시키는 방법에 관한 것이다. 세포는 간 세포일 수 있다.
오르니틴 트랜스카르바밀라제 결핍증 (OTCD) 치료를 필요로 하는 대상체에게 치료 유효량의, 본 개시내용의 폴리뉴클레오티드 구축물을 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 OTCD를 치료하는 방법.
고암모니아혈증 치료, 또는 그의 위험 감소를 필요로 하는 대상체에게 치료 유효량의, 본 개시내용의 폴리뉴클레오티드 구축물을 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, OTCD를 앓는 대상체에서 고암모니아혈증을 치료하거나, 또는 그의 위험을 감소시키는 방법.
본 개시내용의 다른 측면은 OTCD 치료를 필요로 하는 대상체에서의 OTCD 치료를 위한 의약의 제조를 위한, 또는 OTCD를 앓는 대상체에서 고암모니아혈증 치료 또는 그의 위험 감소를 위한 의약의 제조를 위한, 본 개시내용의 폴리뉴클레오티드 구축물 또는 본 개시내용의 조성물, 또는 본 개시내용의 벡터, 또는 본 개시내용의 숙주 세포의 용도에 관한 것이다.
본원에 개시된 방법에 의해 치료가능한 대상체에서 결함이 있는 유전자 발현 및/또는 활성과 연관된 질환 또는 병태는 오르니틴 트랜스카르바밀라제 결핍증 (OTCD)을 포함한다.
특정 측면에서, 결함이 있는 유전자 발현과 연관된 질환 또는 병태는 기능성 폴리펩티드의 결핍을 특징으로 하는 질환 (본원에서 "단백질 결핍과 연관된 질환"으로도 지칭)이다. 본 개시내용의 전달제, 예컨대, LNP는 단백질의 결핍을 초래하는 유전적 결함에 상응하는 단백질을 코딩하는 메신저 RNA (mRNA) 분자를 포함하는 조성물로 제제화될 수 있다. 단백질 결핍과 연관된 질환 치료를 위해, 예컨대, mRNA를 포함하는 다중핵산 구축물은 제제는 적절한 표적 조직으로의 mRNA의 전달을 위해 대상체 (예를 들어, 포유동물, 예컨대, 예를 들어, 마우스, 비-인간 영장류, 또는 인간)에게 투여될 수 있고, 상기 조직에서 mRNA는 단백질 합성 동안 번역되고, 코딩된 단백질은 질환을 치료하기에 충분한 양으로 생성된다.
대상체, 예컨대, 포유동물에서, 결함이 있는 유전자 발현 및/또는 활성과 연관된 질환 또는 병태를 치료하는 방법의 예는 예를 들어, 그를 필요로 하는 포유동물에게, 치료 유효량의, LNP 및/또는 공중합체와 함께 조성물로 제제화되는, 기능성 인간 오르니틴 트랜스카르바밀라제 (OTC)를 코딩하는 오픈 리딩 프레임 (ORF)을 포함하는 코돈 최적화된 mRNA 서열을 포함하는 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 구축물을 투여하는 단계를 포함한다. 특정 측면에서, mRNA 분자는 서열식별번호 7과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 OTC 단백질을 코딩한다. 코딩된 OTC 단백질을 세포의 미토콘드리아로 유도하기 위해, OTC 단백질을 코딩하는 mRNA 분자는 미토콘드리아 표적화 신호 펩티드를 코딩하는 서열 (본원에서 "미토콘드리아 리더 서열"로도 지칭)을 포함할 수 있다. 미토콘드리아 리더 서열은 천연 OTC 단백질의 것일 수 있거나 (예를 들어, 서열식별번호 7의 잔기 1-32를 포함하는 것) (천연 인간 미토콘드리아 리더 서열), 또는 미토콘드리아 표적화 신호 펩티드를 포함하는 또 다른 단백질로부터 유래될 수 있거나, 또는 새로 합성될 수 있다. 조작된 절단 부위는 세포에서 단백질 분해 프로세싱을 최적화하기 위해 미토콘드리아 리더 서열과 폴리펩티드의 나머지 부분 사이의 접합부에 포함될 수 있다. 미토콘드리아 리더 서열은 성숙한 OTC 단백질을 코딩하는 mRNA 서열에 작동가능하게 연결되고, 즉, 두 서열은 올바른 리딩 프레임에 연결되고, 새로 합성된 폴리펩티드를 세포의 미토콘드리아로 유도하도록 위치한다. 미토콘드리아 리더 서열은 일반적으로 단백질의 아미노 말단에 위치한다. 특정 변형에서, 미토콘드리아 리더 서열을 포함하는 코딩된 OTC 단백질은 서열식별번호 7에 기재된 아미노산 서열을 갖는다. 서열식별번호 7의 OTC 단백질을 코딩하고, 본 개시내용의 조성물로 제제화될 수 있는 적합한 mRNA 서열은 서열식별번호 1 또는 서열식별번호 4에 제시된 바와 같은 서열들을 포함할 수 있다. 서열식별번호 7의 OTC 단백질을 코딩하고, 본 개시내용의 조성물로 제제화될 수 있는 적합한 mRNA 서열은 서열식별번호 1 또는 서열식별번호 4에 제시된 바와 같은 서열을 포함할 수 있다. 본 개시내용에서의 제제화를 위한 OTC-코딩 mRNA는 전형적으로 그의 3' 말단에 폴리(A) (예를 들어, 80개 초과, 예컨대, 100 내지 800개의 아데닌 잔기로 이루어진 예컨대, 폴리A 테일)를 추가로 포함한다.
결함이 있는 유전자 발현과 연관된 질환 또는 병태를 치료하는 방법의 추가 예는 기능성 폴리펩티드 결핍증을 앓는 대상체에게 적어도 일부가 기능성 폴리펩티드를 코딩하는 것인 적어도 하나의 mRNA 분자를 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 포함하고, 여기서 투여 후, 기능성 폴리펩티드의 발현은 투여 이전보다 더 큰 것인, 기능성 폴리펩티드 결핍증을 앓는 대상체를 치료하는 방법을 포함한다. 일부 측면에서, mRNA는 기능성 오르니틴 트랜스카르바밀라제 (OTC) 단백질을 코딩한다.
특정 변형에서, 오르니틴 트랜스카르바밀라제 (OTC) 단백질을 코딩하는 mRNA를 포함하는 조성물은 오르니틴 트랜스카르바밀라제 결핍증 (OTCD)을 치료하는 방법에 사용된다. OTCD는 뇌 손상, 혼수 또는 심지어는 사망으로 이어지는 생명을 위협하는 질병인, 고암모니아혈증을 유발할 수 있는 요소 회로 장애이다. 이는 주로 간에서 일어나고, 체내에서 암모니아 제거를 담당하는 요소 회로의 핵심 효소인 OTC의 활성 결핍에 기인하는 것이다. 암모니아는 단백질 섭취 뿐만 아니라, 체내 단백질 분해로부터 생성된다. 간에서, 이 암모니아는 요소 회로에서 효소에 의해 요소로 전환된다. 요소는 비독성이고, 일반적으로 소변에서 신장을 통해 쉽게 제거된다. 그러나, OTC 효소가 결핍되면, 혈액내 암모니아 수준이 상승하여 심각한 뇌 손상을 일으킬 수 있다. 심각한 OTC 결핍증을 앓는 환자는 가장 흔히 생후 2-3일에 확인되는데, 이 경우, 환자는 상당히 상승된 혈중 암모니아 수준을 보이며, 결국에는 혼수 상태에 빠지게 된다. 좀 더 경미한 OTC 결핍증을 앓는 환자는 스트레스를 받는 동안 위기에 처하게 되고, 그 결과로 상승된 암모니아 수준을 보이며, 이 또한 결국에는 혼수 상태에 빠지게 될 수 있다. 현행 요법은 고암모니아혈증 환자에게 사용하기 위한 암모니아 제거 약물 (부페닐(Buphenyl), 라빅티(Ravicti))을 포함한다.
OTC 유전자는 X-연관 유전자이다. 본 질환은 한 돌연변이체 대립유전자를 갖는 남성, 및 돌연변이체 대립유전자와 동형접합성 또는 이형접합성인 여성에 존재한다. 가장 중증인 OTC 결핍증을 앓는 남성 환자는 전형적으로 출생 직후에 발견된다. 혈중 암모니아 수준 상승 이외에도, 소변 오로트산 수준 또한 상승한다. 중증 OTC 결핍증을 앓는 환자에서, OTC 효소 활성은 정상 수준의 <2%이다. 좀 더 경미한 OTC 결핍증을 앓는 환자에서, OTC 효소는 정상 수준의 최대 30%이다.
본 개시내용의 폴리뉴클레오티드 구축물, 또는 본 개시내용의 OTC-코딩 mRNA를 포함하는 조성물로 OTCD를 처리하는 방법은 일반적으로 OTCD를 앓는 대상체에게 치료 유효량의 조성물을 투여하는 단계를 포함하고, 이에 의해 OTC-코딩 mRNA는 간 세포로 전달되고, 단백질 합성 동안 번역되어 OTC 단백질을 생성한다. OTC-코딩 mRNA는 세포에서 OTC 단백질을 증가시키기 위한 조성물 또는 방법과 관련하여 상기 기술된 바와 같은 mRNA일 수 있다.
질환을 치료하기 위한 mRNA 조성물의 효능은 질환을 앓는 동물 모델에서 생체내에서 평가될 수 있다. 예를 들어, OTCD의 치료를 위한 mRNA 조성물의 효능을 평가하는 데 적합한 동물 모델은 간에서 OTC 효소가 결핍된 공지된 마우스 모델을 포함한다. 그러한 마우스 모델 중 하나인 Otc spf -ash (드문드문난 털, 및 비정상적인 피부 및 모발) 마우스는 R129H 돌연변이를 포함하고, 그 결과로 감소된 OTC 단백질 수준을 보이며, 간에서 정상 수준의 효소 활성의 5-10%만 갖는다 (문헌 [Hodges et al., PNAS 86:4142-4146, 1989] 참조). 또 다른 모델인 Otc spf 마우스는 H117N 돌연변이를 포함하고, 그 결과로 효소 활성 수준이 정상 수준의 5-10%까지 감소하게 된다 (문헌 [Rosenberg et al., Science 222:426-428, 1983] 참조). 이들 두 마우스 모델 모두 그의 야생형 한배 새끼 마우스와 비교하여 상승된 소변 오로트산 수준을 보인다. OTC 결핍증에 대한 세 번째 모델은 Otc spf 또는 Otc spf -ash 마우스에서 고암모니아혈증을 유도하는 것이다 (Cunningham et al., Mol Ther 19(5): 854-859, 2011). 상기 마우스를 잔류 내인성 OTC 발현 및 활성을 녹다운시키기 위해 OTC siRNA 또는 AAV2/8 벡터/OTC shRNA로 처리한다. 혈장 암모니아 수준은 상승하고, 마우스는 대략 2-14일 후 사망한다.
일단 특정 분석물의 검출이 진단 가능성을 좁히고 나면, 결핍 효소의 활성을 확인 시험으로서 림프구 또는 배양된 섬유모세포에서 점검한다. 많은 경로에서, 단일 효소 검정으로는 진단을 내릴 수 없다. 다른 경우, 보완 연구와 같은 시험을 수행하여야 한다.
특정 측면에서, 요법의 목표는 생화학적 및 생리학적 항상성을 회복시키는 것이다. 신생아는 특정 생화학적 병변, 대사 블록의 위치 및 독성 화합물의 효과에 따라 응급 진단 및 치료를 필요로 할 수 있다. 치료 전략법은 (1) 전구체 아미노산의 식이 제한 및 (2) (a) 독성 대사산물을 처리하거나, 또는 (b) 결핍된 효소의 활성을 증가시키기 위한 보조 화합물의 사용을 포함한다. 간 이식은 소수의 이환된 개체에서 성공적이었다. 심지어 현행 임상 관리 접근법에도 불구하고, 유기산혈증을 앓는 개체는 감염 위험이 더 높고, 치명적일 수 있는 췌장염 발병률이 더 높다.
특정 측면에서, 본 개시내용의 폴리뉴클레오티드 구축물 및 조성물은 대상체에서 결함이 있는 유전자 발현 및/또는 활성과 연관된 질환 또는 병태 치료를 위한 의약의 제조에서 유용하다.
본 개시내용의 폴리뉴클레오티드 구축물 및 조성물은 예컨대, 비경구, 경구, 국소, 직장, 흡입 등과 같은, 다양한 투여 경로로 투여될 수 있다. 제제는 선택된 투여 경로에 따라 달라질 것이다. 일부 측면에서, 투여 경로는 정맥내, 근육내로, 피내로, 피하로, 십이지장내 또는 복강내로의 것이다.
특정 상황에 대한 적절한 투여량의 결정은 관련 기술분야의 기술 범위 내에 있다. 본 개시내용의 조성물의 유효 용량은 투여 수단, 표적 부위, 환자의 생리학적 상태, 환자가 인간인지 동물인지 여부, 투여되는 다른 약물 뿐만 아니라, 조성물 자체의 특이적인 활성, 및 개체에서 원하는 반응을 유도할 수 있는 그의 능력을 포함하는 많은 상이한 인자에 따라 달라진다. 일반적으로, 환자는 인간이지만, 일부 질환에서, 환자는 비-인간 포유동물일 수 있다.
실시예
실시예 1. OTC 폴리뉴클레오티드 구축물 제조
플라스미드 DNA 구축물을 사용하여 시험관내 전사 (IVT)에 의해 서열식별번호 4의 서열을 포함하는 OTC 폴리뉴클레오티드 구축물을 제조하였다. 플라스미드 DNA 구축물은 5'UTR, ORF 및 3'UTR에 대한 지침을 포함하였고, 동시에 IVT 반응에 원하는 뉴클레오티드를 추가하여 화학적 변형 (예를 들어, 슈도우리딘)을 결정하였다. 시작하기 위해, 플라스미드 DNA 1 ug당 XbaI 제한 효소 5 단위를 사용하여 플라스미드 DNA를 선형화시켰다. 37도에서 밤새도록 인큐베이션시킨 후, DNA를 페놀/클로로포름 추출에 의해 정제하였다. 공동 전사 캡핑 (예를 들어, Cap1)에 추가로 IVT 반응을 T7 폴리머라제 및 클린캡(CleanCap)을 사용하여 37도에서 3시간 동안 수행하였다. IVT 반응 후, 생성된 mRNA 생성물을 DNase 처리 후, 정용여과를 통해 정제하였다. 이어서, 정제된 mRNA를 RNA 1 mg당 300 단위의 폴리 A 폴리머라제로 폴리 아데닐화하고, 원하는 폴리 A 테일 길이에 따라 15 내지 60분 동안 인큐베이션시켰다. 이어서, mRNA 생성물을 원하는 농도로 조정하기 전에 정용여과 및 HPLC로 정제하고, 멸균 여과하고, 분취하였다.
실시예 2. 폴리(A) 테일 길이가 효능 및 내약성에 미치는 효과
가변 길이를 갖는 폴리(A) 테일을 사용하여 실시예 1에 기술된 바와 같은 OTC mRNA 구축물을 제조하였다. 제1 실험에서, OTC mRNA를 전사시키고, 미정제 전사체를 미리 가온된 또는 냉 폴리A 폴리머라제와의 반응을 위한 주형으로서 사용하였다. 제2 실험에서, OTC mRNA를 전사시키고, 정제하고, 정제된 전사체를 미리 가온된 또는 냉 폴리A 폴리머라제와의 반응을 위한 주형으로서 사용하였다. 제3 실험에서, 올바른 폴리A 테일을 생성하는 반응 시간을 측정하였다.
폴리A 실험 1 및 2 결과, 생성된 폴리A 테일의 길이에 있어 유의적인 차이는 없었다. 추가로, 효소 온도는 실행 성능에 영향을 미치지 않았다. 실험 1 및 2에서, 반응 시간은 30 min이었다. 실험 3에서, 45, 60, 및 75 min의 반응 시간을 시험하였다. 60 및 75분 반응 시간을 거쳐 길이가 300개 초과의 뉴클레오티드 (nts) 길이인 폴리A 테일을 생성할 수 있었다. 반응 시간이 길수록 더욱 긴 테일을 생성할 수 있지만, 반응 시간은 또한 생성물의 순도에도 영향을 미쳤다.
(코딩된 또는 효소적) 상이한 폴리(A) 테일 길이가 효능 및 내약성에 미치는 효과를 평가하기 위해, 래트 반복 투약 연구를 수행하였다. LNP2 (PEG2000-S:13-B43:콜레스테롤:DSPC)에 캡슐화된, 폴리(A) 테일 길이가 상이한 (80, 161, 208, 262, 322, 또는 440 nts) mRNA를 포함하는 OTC 구축물을 D0, 7, 및 14에 수컷 스프라구 돌리(Srague Dawley) 래트 (7-8주령)에게 투여하였다 (표 2A). 실험은 D1 (투약 후 24h째) 또는 D15 (최종 투약 후 24h째)에 종료하였다. 투여된 각 제제의 Z-Avg, PDI, 및 % Encaps는 표 2B에 제공되어 있다. 모든 제제를 사내 LAL 검정법에 의해 내독소에 대해 시험하였다. 모든 제제는 0.5 mg/mL일 때, 2 EU/mL 미만이었다.
표 2A. LNP2 제제의 투여 및 투약
Figure pct00007
표 2B. LNP2 제제 특징
Figure pct00008
다양한 폴리A 구축물에 대해 1차 투약 후 6h째 단핵구 화학유인물질 단백질-1 (MCP-1) 유도 수준을 분석하였고, 그 결과는 도 1에 제시되어 있다.
반복 투약시 다양한 폴리A 테일 길이를 갖는 mRNA를 포함하는 OTC 구축물과 함께 제제화된 LNP의 투여에 대한 면역 반응의 유도를 분석하기 위해, 각 투여 당일에 투약 후 6h째에 테일 포크를 수득하고, 래트 시토카인 유도를 정량화하였다. (0일째, 7일째, 및 14일째) 투약 후 6h째 단핵구 화학유인물질 단백질-1 (MCP-1) 유도 수준을 분석하였다 (도 2a). 80 nts 코딩된 폴리(A)를 갖는 OTC mRNA를 통해 161, 208, 262, 322, 또는 440 nt 효소적 폴리(A) 테일을 갖는 OTC mRNA 구축물과 비교하여 더 높은 MCP-1 유도 수준을 얻었다. 시점 (일째) D0, D7, 및 D14에 투약 후 6h째 MCP-1 및 인터페론 γ-유도된 단백질 10 (IP-10) 유도 수준을 분석하였다 (도 2b). 모든 반응을 PBS 대조군과 비교하였다. 80 nt 코딩된 폴리(A) 테일을 갖는 OTC mRNA 구축물은 80개 초과의 뉴클레오티드인 효소적 폴리(A) 테일을 갖는 시험된 OTC mRNA 구축물과 비교하여 더 높은 MCP-1 (도 2a) 및 IP-10 (도 2b) 유도를 보였다.
OTC 단백질 발현을 분석하기 위해, 최종 투약 후 24hr째에 래트 간 샘플을 수득하고, 급냉시켰다. 80개의 뉴클레오티드인 코딩된 폴리(A)를 갖는 OTC 구축물은 80개 초과의 뉴클레오티드인 효소적 폴리(A) 테일을 갖는 OTC 구축물과 비교하여 간에서 가장 낮은 hOTC 단백질 발현을 보였다 (도 3a 및 도 3b).
실시예 3. 변형된 OTC mRNA 구축물
화학적 변형이 효능 및 내약성에 미치는 효과를 평가하기 위해, 마우스 연구를 수행하였다. 실시예 1에서 제조된 OTC mRNA (폴리A 테일 범위 ~180-480개의 뉴클레오티드 길이)는 TriLink 방법을 사용하여 슈도우리딘 (PsU), N1-메틸-슈도우리딘 (N1MePsU), 또는 5-메톡시우리딘 (5MoU) (표 3A)을 이용하여 화학적으로 변형시켰다.
화학적으로 변형된 mRNA를 LNP1 또는 LNP2 (PEG2000-S:13-B43:콜레스테롤:DSPC)로 제제화하고 (표 3B), 마우스에 투여하였다 (0.5 mg/kg) (표 3C).
표 3A. mRNA의 화학적 변형
Figure pct00009
표 3B. 화학적으로 변형된 mRNA의 LNP 제제
Figure pct00010
표 3C. 화학적으로 변형된 mRNA의 투여
Figure pct00011
변형된 OTC mRNA 제제의 투여 후 MCP-1 수준을 분석하였다 (도 4). 시험된 상이한 OTC mRNA 화학적 변형 사이에 MCP-1 반응에 있어서는 어떤 유의적인 차이는 없었다. LNP2 (PEG2000-S:13-B43:콜레스테롤:DSPC)는 LNP1에 비해 약간 더 자극적이었다.
이어서, 인간 OTC 발현을 ELISA에 의해 분석하였다 (도 5). 두 LNP 모두에서 OTC mRNA PsU와 N1MePsU 변형 사이에 OTC 발현 수준은 유사하였다. 최저 OTC 발현은 OTC mRNA 5MoU-LNP로 처리된 동물에서 검출되었다. OTC mRNA N1MePsU-LNP1 로 처리된 동물은 OTC mRNA PsU-LNP1로 처리된 동물보다 더 높은 OTC 발현을 보였다. OTC mRNA PsU-LNP2로 처리된 동물은 OTC mRNA N1MePsU로 처리된 동물보다 더 높은 OTC 발현을 보였다.
실시예 4. 래트에서의 OTC mRNA-LNP 내약성 및 OTC 발현
래트 반복 투약 연구에서 OTC mRNA-PsU 효능 및 내약성을 평가하였다. OTC mRNA-PsU (0.25 mg/kg)를 LNP1 (PEG2000-C-DMA:13-B43:콜레스테롤:DSPC), LNP2 (PEG2000-S:13-B43:콜레스테롤:DSPC 또는 PEG2000-S:18-B6:콜레스테롤:DSPC), 또는 LNP3 (PEG750-C-DLA:18-B6:콜레스테롤:DSPC)에서 제제화하고, 0일째, 7일째, 및 14일째 마우스에 투여하였다 (표 4A). EPO 및 LUC는 LNP1에 포함되었고, 대조군으로서 투여하였다.
표 4A. OTC mRNA 구축물- PsU의 투여 및 투약
Figure pct00012
Figure pct00013
투여된 각 제제의 Z-Avg, PDI, 및 % Encaps는 표 4b에 제공되어 있다. 투입 배치 크기는 3 mg이었다. LNP를 100 mM 아세테이트 (pH5)와 함께 제제화하고, TFU에 대해 워크업하였다. 분취물을 -80℃에서 보관하고, 매 투약 당일 시험 물품을 제조하였다.
표 4B. LNP1 , LNP2 , 및 LNP3 제제 특징
Figure pct00014
PEG-항체 수준을 조사하기 위해, 투약 당일 (D0, 7, 및 14) 투약 전 혈액을 수집하였다. 항-PEG IgG (도 6a) 및 항-PEG IgM (도 6b) 항체 반응, 둘 모두를 정량화하였다. 항-PEG 항체는 LNP1로만 처리한 래트에서 관찰되었다. 시험된 OTC mRNA 구축물은 EPO 및 LUC 페이로드보다 면역원성이 더 적었다. LNP1을 사용한 항-PEG 항체의 생성은 반복 투약시, 혈액 제거를 가속화하고, 효능을 손실시켰다 (데이터는 제시되지 않음).
MCP-1 유도를 조사하기 위해, 각 투약 후 6h째 혈액을 수집하였다. 면역원성이 더 낮은 것과 상관관계가 있는 OTC mRNA 구축물을 함유하는 LNP의 반복 투약시 MCP-1의 증가는 거의 없거나, 또는 전혀 없었다 (도 7).
OTC 발현 수준을 조사하기 위해, 각 투약 당일 투여 전에 혈액을 수집하였다. LNP2 제제가 가장 강력한 효능을 보인 반면, LNP1 제제는 가장 작은 효력을 보였다 (도 8). LNP2 제제의 경우, OTC 단백질 축적이 가장 높았다. 이 데이터는 어떤 항체도 생성되지 않았고, 혈액 제거가 가속화되지 않았다는 것을 보여주는 면역원성 데이터로 뒷받침된다. OTC mRNA 구축물-LNP2 조성물 또한 더 낮은 반복 투약 MCP-1 수준을 보였다.
투약 후 24h째 지질 제거를 질량 분광법으로 정량화하였다. 단일 투약 연구에서는 LNP1 및 LNP2 (13-B43)가 투약 후 14일째에 존재한 반면, LNP2 (18-B6) 및 LNP3은 투약 후 6h까지 신속하게 제거된 것으로 나타났다 (데이터는 제시되지 않음). OTC mRNA 구축물-LNP1 또는 OTC mRNA 구축물-LNP2 (13-B43) 반복 투약 결과, 간에 지질이 축적되었다 (도 9). 심지어 반복 투약시에도 OTC mRNA 구축물-LNP2 (18-B6) 또는 OTC mRNA 구축물-LNP3 축적은 관찰되지 않았다 (모든 수준 < 500 ng/g의 LLOQ).
간 손상의 마커를 분석하기 위해, 알라닌 아미노트랜스퍼라제 (ALT) 및 아스파르테이트 아미노트랜스퍼라제 (AST) 수준을 정량화하였다. 투약 첫날 및 마지막 날 24h째에 혈청을 수집하였다. 반복 투약 (0.25 mg/kg씩 매주 투여 x 3회 투약; 총 0.75 mg/kg)시 ALT/AST 수준에 있어 유의적인 변화는 없었다 (도 10a 및 10b). LNP1 및 LNP2 (13-B43) 제제 군, 둘 모두 3차 투약 후 LNP2 (18-B6) 및 LNP3 제제에 비해 상대적으로 더 높은 AST를 보인다.
실시예 5. 래트에서 단일 투약 대 반복 투약시의 지질 제거
OTC mRNA 구축물-LNP의 단일 및 반복 투약으로 투여 후 지질 제거를 평가하였다. OTC mRNA를 LNP2 (PEG2000-S:13-B43:콜레스테롤:DSPC)에서 제제화하고, 투약당 0.25 mg/kg으로 래트에게 투여하였다. 단일 투약의 경우, D0에 래트에 제제를 투여하였고, 최종 시점은 30min, 1h, 3h, 6h, 및 24h째였다 (표 5A). 고용량의 단일 투약 (2 mg/kg)은 D0째에 투여하였고, 최종 시점은 D1이었다. 반복 투약의 경우, 최대 49일 동일 매 7일마다 한번씩 (7일째, 14일째, 21일째, 28일째, 35일째, 42일째, 및 49일째) 제제를 래트에 투여하였다. 8차 처리 (49일째) 후, 투약 후 30min, 1h, 3h, 6h, 및 24h (50일째)의 최종 시점에 수집하였다. 0일째, 7일째, 14일째, 21일째, 28일째, 35일째, 42일째, 및 49일째 PBS를 대조군으로서 투여하였다 (5 mL/kg). 투여된 각 제제의 Z-Avg, PDI, 및 % Encaps는 표 5B에 제공되어 있다.
표 5A. OTC mRNA 구축물- LNP2의 단일 및 반복 투약
Figure pct00015
Figure pct00016
표 5B. OTC mRNA 구축물- LNP2 (13-B43) 제제 특징
Figure pct00017
시토카인 반응을 측정하기 위해, 모든 최종 시점에서 혈액을 수집하였다. 측정된 시토카인은 MCP-1, IP-10 및 대식세포 염증성 단백질 1α (MIP-1α)였다. 0.25 mg/kg을 매주 반복 투약하였을 때 발생한 시토카인 반응은 없었다 (도 11a-11c). 2 mg/kg의 단일 투약 투여시 유의적인 시토카인 반응이 있었다.
PEG 및 OTC 항체 수준을 조사하기 위해, 각 투약 이전에 혈액을 수집하였다. 반복 투여시, 항-PEG IgM 수준이 증가하는 경향은 없었다 (도 12). 유사하게, OTC mRNA 구축물-LNP2의 반복 투여시에도 항-PEG IgG 수준 증가는 없었다 (도 13). 반복 투여시 항-OTC IgM 항체는 검출되지 않았다 (도 14). 유사하게, OTC mRNA 구축물-LNP2의 반복 투여에서도 항-OTC IgG 항체는 검출되지 않았다 (도 15).
매 투약 후 24시간째 hOTC 또한 간에서 검출되었다 (도 16). 간 및 혈장에서 OTC mRNA의 수준을 처리 1 또는 8 (49일째) 후 시간 경과에 따라 (30min, 1h, 3h, 6h, 및 24h) 정량화하였다 (도 17a 및 17b).
실시예 6. SD 래트에서의 단일 용량 범위 발견 연구
이어서, SD 래트에서의 용량 반응 연구에서 OTC mRNA 구축물과 함께 제제화된 LNP1 (PEG2000-C-DMA:13-B43:콜레스테롤:DSPC), LNP2 (PEG2000-S:13-B43:콜레스테롤:DSPC), 및 LNP2 (PEG2000-S:18-B6:콜레스테롤:DSPC)의 효능 및 내약성을 평가하였다. 래트에 OTC mRNA 구축물-LNP2를 다양한 농도 (0.5 mg/kg, 1 mg/kg, 또는 1.5 mg/kg)로 투여하고, 6h 또는 24h 동안 분석하였다 (표 6A). 대조군으로서, 일부 래트에게 5 mL/kg PBS, 1.5 mg/kg LNP1, 또는 1.5 mg/kg LNP2를 투여하였다. 투여된 각 제제의 Z-Avg, PDI 및 % Encaps는 표 6B에 제공되어 있다.
표 6A. LNP1 및 LNP2의 용량 반응 연구
Figure pct00018
표 6B. 용량 범위 연구를 위한 LNP의 제제
Figure pct00019
간 손상을 분석하기 위해, 최종 투약 후 24h째 간 샘플을 수집하고, ALT, AST, GGT 및 총 빌리루빈 수준을 분석하였다. ALT/AST 수준은 비어있는 것과 비교하여 mRNA LNP에 비해 더 상승되어 있다 (도 18a-18d 및 표 7). LNP1, LNP2 (13-B43), 또는 LNP2 (18-B6)의 투여량이 증가함에 따라 ALT/AST 수준이 증가하는 경향이 있었다. 1.5 mg/kg LNP2 (13-B43)의 투여시 동일한 양의 LNP1보다 더 높은 수준의 ALT/AST를 유도하였다.
표 7. 상이한 양의 LNP2를 투여받은 래트에서의 ALT 및 AST 수준
Figure pct00020
최종 투약 후 24h째 채취된 샘플에서 GGT 및 총 빌리루빈 수준을 분석하였다. LNP1 또는 LNP2 OTC mRNA 제제의 투여량이 증가함에 따라 GGT 및 총 빌리루빈 수준이 증가하는 경향이 있었다 (도 19a-19d). 1.5 mg/kg의 OTC mRNA 구축물-LNP2(13-B43) 투여시 동일한 양의 OTC mRNA 구축물-LNP1과 비교하여 유사한 수준의 GGT를 유도하였다. 1.5 mg/kg의 OTC mRNA 구축물-LNP2 투여시 동일한 양의 OTC mRNA 구축물-LNP1과 비교하여 더 높은 수준의 총 빌리루빈을 유도하였다.
최종 투약 후 24h째 수집된 혈액으로부터 완전 혈액 계수를 수득하였다. 1.5 mg/kg OTC mRNA 구축물-LNP1을 투여받은 래트는 1.5 mg/kg OTC mRNA 구축물-LNP2 (13-B43)를 투여받은 래트와 비교하여 유사한 개수의 호중구, 단핵구 및 혈소판을 가졌다 (도 20a- 20c). OTC mRNA 구축물-LNP2의 투여량 증가가 호중구 양은 증가시켰지만, 단핵구 및 혈소판의 양은 감소시켰다.
시토카인 수준을 조사하기 위해, 투약 후 6h째 혈액을 수집하고, MCP-1, MIP-1α 및 IP-10의 수준을 정량화하였다. 비어있는 것과 OTC mRNA 구축물-LNP 조성물 사이에는 MCP-1 및 MIP-1α 수준에 있어 어떤 유의적인 차이도 없었다 (도 21a-21c). LNP1 및 LNP2 OTC mRNA 제제는 비어 있는 것과 비교하여 더 높은 수준의 IP-10을 유도하였다. 또한, OTC mRNA 구축물-LNP2 (13-B43) 투여시, 시토카인 수준은 용량에 의존하는 방식으로 증가하였다.
최종 투약 후 24h째 웨스턴 블롯팅에 의해 hOTC 발현을 조사하였다. OTC mRNA 구축물-LNP2 (13-B43)의 투여량이 증가함에 따라, OTC 발현은 용량에 의존하는 방식으로 증가하였다 (도 22). 1.5 mg/kg의 OTC mRNA 구축물-LNP2 (13-B43)는 1.5 mg/kg의 OTC mRNA 구축물-LNP1과 비교하여 OTC 발현을 더 높게 증가시켰다.
실시예 7. 비-인간 영장류 용량 범위 연구
비-인간 영장류 (NHP)에서의 용량 반응 연구에서 OTC mRNA 구축물과 함께 제제화된 LNP1 (PEG2000-C-DMA:13-B43:콜레스테롤:DSPC)의 효능을 평가하였다. OTC mRNA 구축물은 서열식별번호 4의, 5', 오픈 리딩 프레임, 및 3' 서열을 갖는 뉴클레오티드 서열, 길이가 80개의 뉴클레오티드 내지 440개의 뉴클레오티드 (즉, 284개의 뉴클레오티드)인 폴리A 테일을 포함하였고, 슈도우리딘 (ψ) 변형된 것이었다. 3회에 걸쳐 다른 날(1일째, 8일째, 및 15일째)에 다양한 농도 (0.25 mg/kg, 1 mg/kg, 3 mg/kg, 또는 5 mg/kg)의 OTC mRNA 구축물-LNP1을 1회 용량으로 비-인간 영장류에 투여하였다 (표 8). 결과는 16일째에 분석하였다. 대조군으로서, 비-인간 영장류에는 5 mg/kg 비어있는 LNP1을 투여하였다.
표 8. 비-인간 영장류 용량 범위 연구를 위한 LNP의 제제
Figure pct00021
인간 OTC 발현은 16일째에 비-인간 영장류 간 샘플에서 분석하였다. 내인성 발현과 비교하여 가장 낮은 OTC 발현은 0.25 mg/kg 용량인 경우에 검출되었고, 가장 높은 발현은 3 mg/kg 용량인 경우에 검출되었다 (도 23a). 초기 표적 hOTC 발현 (8%)은 최저 용량 (0.25 mg/kg)에서 달성되었다.
시토카인 수준을 조사하기 위해, 1일째 1차 투약 후 6hr째에 샘플을 수집하고, MCP-1 및 IL-6의 수준을 분석하였다 (도 23b 및 23c). 0.25 mg/kg 용량에서는 MCP-1 및 IL-6이 검출되지 않았다. 3 mg/kg 용량에서 MCP-1 및 IL-6의 일시적인 상승이 관찰되었다.
이들 결과는 낮은 면역 자극에 의한 강한 hOTC 발현을 나타내었다.
따라서, 다양한 측면을 개시한다. 상기 기술된 구현 및 다른 구현은 하기 청구범위의 범주 내에 있다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 본 개시내용이 개시된 것과 다른 측면으로 실시될 수 있다는 것을 이해할 것이다. 개시된 측면은 제한이 아니라, 예시의 목적으로 제시되며, 본 개시내용은 하기 청구범위에 의해서만 제한된다.
SEQUENCE LISTING <110> Genevant Sciences GmbH <120> ORNITHINE TRANSCARBAMYLASE (OTC) CONSTRUCTS AND METHODS OF USING THE SAME <130> 4170.021PC01 <150> US 62/924,567 <151> 2019-10-22 <160> 9 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 1065 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ORF human OTC mRNA codon optimized for human expression <400> 1 augcuguuua accugaggau ucugcugaac aacgcugcuu uucggaacgg ccacaacuuu 60 auggugcgga acuuucggug cggacagcca cugcagaaca aagugcagcu gaaggggagg 120 gaccugcuga cccugaaaaa uuucacagga gaggaaauca aguacaugcu guggcugucu 180 gccgaucuga aguuccggau caagcagaag ggcgaauauc ugccacugcu gcagggcaaa 240 agucugggga ugaucuucga aaagaggagu acucggacca gacugucaac agagacugga 300 uucgcucugc ugggaggaca cccaugcuuu cugaccacac aggacauuca ucugggcgug 360 aacgagucac ugaccgacac agcucgaguc cugagcucca uggcagaugc cgugcuggca 420 cgggucuaca aacagagcga ccuggauacc cuggcuaagg aagcaagcau ccccaucauu 480 aaugggcugu ccgaccugua ucacccuauc cagauucugg ccgauuaccu gacccugcag 540 gagcauuauu cuagucugaa aggccugaca cugagcugga uuggggacgg aaacaauauc 600 cugcacucca uuaugauguc ugccgcuaag uuuggaaugc aucugcaggc agccacacca 660 aaaggcuacg aacccgaugc cagugugacu aagcuggccg aacaguaugc uaaagagaac 720 ggcacuaagc ugcugcugac caaugacccu cuggaggcug cacacggagg caacguccug 780 aucacugaua ccuggauuuc caugggccag gaggaagaga agaaaaagcg ccugcaggca 840 uuccaggggu accaggugac aaugaaaacu gccaaggucg ccgcuucuga uuggacuuuu 900 cugcauuguc ugccccgaaa accugaagag guggacgaug aggucuucua uucaccuagg 960 agccuggugu uuccagaagc cgagaaucgc aaguggacaa ucauggcugu gauggugucc 1020 cugcugacug auuauucccc ccagcugcag aaaccuaagu ucuga 1065 <210> 2 <211> 47 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 5' UTR <400> 2 aggaaauaag agagaaaaga agaguaagaa gaaauauaag agccacc 47 <210> 3 <211> 114 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3' UTR <400> 3 gcggccgcuu aauuaagcug ccuucugcgg ggcuugccuu cuggccaugc ccuucuucuc 60 ucccuugcac cuguaccucu uggucuuuga auaaagccug aguaggaagu cuag 114 <210> 4 <211> 1226 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 5' UTR, ORF human OTC mRNA codon optimized for human expression, 3' UTR <400> 4 aggaaauaag agagaaaaga agaguaagaa gaaauauaag agccaccaug cuguuuaacc 60 ugaggauucu gcugaacaac gcugcuuuuc ggaacggcca caacuuuaug gugcggaacu 120 uucggugcgg acagccacug cagaacaaag ugcagcugaa ggggagggac cugcugaccc 180 ugaaaaauuu cacaggagag gaaaucaagu acaugcugug gcugucugcc gaucugaagu 240 uccggaucaa gcagaagggc gaauaucugc cacugcugca gggcaaaagu cuggggauga 300 ucuucgaaaa gaggaguacu cggaccagac ugucaacaga gacuggauuc gcucugcugg 360 gaggacaccc augcuuucug accacacagg acauucaucu gggcgugaac gagucacuga 420 ccgacacagc ucgaguccug agcuccaugg cagaugccgu gcuggcacgg gucuacaaac 480 agagcgaccu ggauacccug gcuaaggaag caagcauccc caucauuaau gggcuguccg 540 accuguauca cccuauccag auucuggccg auuaccugac ccugcaggag cauuauucua 600 gucugaaagg ccugacacug agcuggauug gggacggaaa caauauccug cacuccauua 660 ugaugucugc cgcuaaguuu ggaaugcauc ugcaggcagc cacaccaaaa ggcuacgaac 720 ccgaugccag ugugacuaag cuggccgaac aguaugcuaa agagaacggc acuaagcugc 780 ugcugaccaa ugacccucug gaggcugcac acggaggcaa cguccugauc acugauaccu 840 ggauuuccau gggccaggag gaagagaaga aaaagcgccu gcaggcauuc cagggguacc 900 aggugacaau gaaaacugcc aaggucgccg cuucugauug gacuuuucug cauugucugc 960 cccgaaaacc ugaagaggug gacgaugagg ucuucuauuc accuaggagc cugguguuuc 1020 cagaagccga gaaucgcaag uggacaauca uggcugugau ggugucccug cugacugauu 1080 auucccccca gcugcagaaa ccuaaguucu gagcggccgc uuaauuaagc ugccuucugc 1140 ggggcuugcc uucuggccau gcccuucuuc ucucccuugc accuguaccu cuuggucuuu 1200 gaauaaagcc ugaguaggaa gucuag 1226 <210> 5 <211> 1311 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 5' UTR, ORF human OTC mRNA codon optimized for human expression, 3' UTR, and polyA (80) <400> 5 aggaaauaag agagaaaaga agaguaagaa gaaauauaag agccaccaug cuguuuaacc 60 ugaggauucu gcugaacaac gcugcuuuuc ggaacggcca caacuuuaug gugcggaacu 120 uucggugcgg acagccacug cagaacaaag ugcagcugaa ggggagggac cugcugaccc 180 ugaaaaauuu cacaggagag gaaaucaagu acaugcugug gcugucugcc gaucugaagu 240 uccggaucaa gcagaagggc gaauaucugc cacugcugca gggcaaaagu cuggggauga 300 ucuucgaaaa gaggaguacu cggaccagac ugucaacaga gacuggauuc gcucugcugg 360 gaggacaccc augcuuucug accacacagg acauucaucu gggcgugaac gagucacuga 420 ccgacacagc ucgaguccug agcuccaugg cagaugccgu gcuggcacgg gucuacaaac 480 agagcgaccu ggauacccug gcuaaggaag caagcauccc caucauuaau gggcuguccg 540 accuguauca cccuauccag auucuggccg auuaccugac ccugcaggag cauuauucua 600 gucugaaagg ccugacacug agcuggauug gggacggaaa caauauccug cacuccauua 660 ugaugucugc cgcuaaguuu ggaaugcauc ugcaggcagc cacaccaaaa ggcuacgaac 720 ccgaugccag ugugacuaag cuggccgaac aguaugcuaa agagaacggc acuaagcugc 780 ugcugaccaa ugacccucug gaggcugcac acggaggcaa cguccugauc acugauaccu 840 ggauuuccau gggccaggag gaagagaaga aaaagcgccu gcaggcauuc cagggguacc 900 aggugacaau gaaaacugcc aaggucgccg cuucugauug gacuuuucug cauugucugc 960 cccgaaaacc ugaagaggug gacgaugagg ucuucuauuc accuaggagc cugguguuuc 1020 cagaagccga gaaucgcaag uggacaauca uggcugugau ggugucccug cugacugauu 1080 auucccccca gcugcagaaa ccuaaguucu gagcggccgc uuaauuaagc ugccuucugc 1140 ggggcuugcc uucuggccau gcccuucuuc ucucccuugc accuguaccu cuuggucuuu 1200 gaauaaagcc ugaguaggaa gucuagaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1260 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaagc u 1311 <210> 6 <211> 1666 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 5' UTR, ORF human OTC mRNA codon optimized for human expression, 3' UTR, and polyA <400> 6 aggaaauaag agagaaaaga agaguaagaa gaaauauaag agccaccaug cuguuuaacc 60 ugaggauucu gcugaacaac gcugcuuuuc ggaacggcca caacuuuaug gugcggaacu 120 uucggugcgg acagccacug cagaacaaag ugcagcugaa ggggagggac cugcugaccc 180 ugaaaaauuu cacaggagag gaaaucaagu acaugcugug gcugucugcc gaucugaagu 240 uccggaucaa gcagaagggc gaauaucugc cacugcugca gggcaaaagu cuggggauga 300 ucuucgaaaa gaggaguacu cggaccagac ugucaacaga gacuggauuc gcucugcugg 360 gaggacaccc augcuuucug accacacagg acauucaucu gggcgugaac gagucacuga 420 ccgacacagc ucgaguccug agcuccaugg cagaugccgu gcuggcacgg gucuacaaac 480 agagcgaccu ggauacccug gcuaaggaag caagcauccc caucauuaau gggcuguccg 540 accuguauca cccuauccag auucuggccg auuaccugac ccugcaggag cauuauucua 600 gucugaaagg ccugacacug agcuggauug gggacggaaa caauauccug cacuccauua 660 ugaugucugc cgcuaaguuu ggaaugcauc ugcaggcagc cacaccaaaa ggcuacgaac 720 ccgaugccag ugugacuaag cuggccgaac aguaugcuaa agagaacggc acuaagcugc 780 ugcugaccaa ugacccucug gaggcugcac acggaggcaa cguccugauc acugauaccu 840 ggauuuccau gggccaggag gaagagaaga aaaagcgccu gcaggcauuc cagggguacc 900 aggugacaau gaaaacugcc aaggucgccg cuucugauug gacuuuucug cauugucugc 960 cccgaaaacc ugaagaggug gacgaugagg ucuucuauuc accuaggagc cugguguuuc 1020 cagaagccga gaaucgcaag uggacaauca uggcugugau ggugucccug cugacugauu 1080 auucccccca gcugcagaaa ccuaaguucu gagcggccgc uuaauuaagc ugccuucugc 1140 ggggcuugcc uucuggccau gcccuucuuc ucucccuugc accuguaccu cuuggucuuu 1200 gaauaaagcc ugaguaggaa gucuagaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1260 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1320 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1380 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1440 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1500 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1560 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1620 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaa 1666 <210> 7 <211> 354 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> human OTC <400> 7 Met Leu Phe Asn Leu Arg Ile Leu Leu Asn Asn Ala Ala Phe Arg Asn 1 5 10 15 Gly His Asn Phe Met Val Arg Asn Phe Arg Cys Gly Gln Pro Leu Gln 20 25 30 Asn Lys Val Gln Leu Lys Gly Arg Asp Leu Leu Thr Leu Lys Asn Phe 35 40 45 Thr Gly Glu Glu Ile Lys Tyr Met Leu Trp Leu Ser Ala Asp Leu Lys 50 55 60 Phe Arg Ile Lys Gln Lys Gly Glu Tyr Leu Pro Leu Leu Gln Gly Lys 65 70 75 80 Ser Leu Gly Met Ile Phe Glu Lys Arg Ser Thr Arg Thr Arg Leu Ser 85 90 95 Thr Glu Thr Gly Phe Ala Leu Leu Gly Gly His Pro Cys Phe Leu Thr 100 105 110 Thr Gln Asp Ile His Leu Gly Val Asn Glu Ser Leu Thr Asp Thr Ala 115 120 125 Arg Val Leu Ser Ser Met Ala Asp Ala Val Leu Ala Arg Val Tyr Lys 130 135 140 Gln Ser Asp Leu Asp Thr Leu Ala Lys Glu Ala Ser Ile Pro Ile Ile 145 150 155 160 Asn Gly Leu Ser Asp Leu Tyr His Pro Ile Gln Ile Leu Ala Asp Tyr 165 170 175 Leu Thr Leu Gln Glu His Tyr Ser Ser Leu Lys Gly Leu Thr Leu Ser 180 185 190 Trp Ile Gly Asp Gly Asn Asn Ile Leu His Ser Ile Met Met Ser Ala 195 200 205 Ala Lys Phe Gly Met His Leu Gln Ala Ala Thr Pro Lys Gly Tyr Glu 210 215 220 Pro Asp Ala Ser Val Thr Lys Leu Ala Glu Gln Tyr Ala Lys Glu Asn 225 230 235 240 Gly Thr Lys Leu Leu Leu Thr Asn Asp Pro Leu Glu Ala Ala His Gly 245 250 255 Gly Asn Val Leu Ile Thr Asp Thr Trp Ile Ser Met Gly Gln Glu Glu 260 265 270 Glu Lys Lys Lys Arg Leu Gln Ala Phe Gln Gly Tyr Gln Val Thr Met 275 280 285 Lys Thr Ala Lys Val Ala Ala Ser Asp Trp Thr Phe Leu His Cys Leu 290 295 300 Pro Arg Lys Pro Glu Glu Val Asp Asp Glu Val Phe Tyr Ser Pro Arg 305 310 315 320 Ser Leu Val Phe Pro Glu Ala Glu Asn Arg Lys Trp Thr Ile Met Ala 325 330 335 Val Met Val Ser Leu Leu Thr Asp Tyr Ser Pro Gln Leu Gln Lys Pro 340 345 350 Lys Phe <210> 8 <211> 1226 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA sequence for 3' UTR, human OTC open reading frame and 5' UTR <400> 8 aggaaataag agagaaaaga agagtaagaa gaaatataag agccaccatg ctgtttaacc 60 tgaggattct gctgaacaac gctgcttttc ggaacggcca caactttatg gtgcggaact 120 ttcggtgcgg acagccactg cagaacaaag tgcagctgaa ggggagggac ctgctgaccc 180 tgaaaaattt cacaggagag gaaatcaagt acatgctgtg gctgtctgcc gatctgaagt 240 tccggatcaa gcagaagggc gaatatctgc cactgctgca gggcaaaagt ctggggatga 300 tcttcgaaaa gaggagtact cggaccagac tgtcaacaga gactggattc gctctgctgg 360 gaggacaccc atgctttctg accacacagg acattcatct gggcgtgaac gagtcactga 420 ccgacacagc tcgagtcctg agctccatgg cagatgccgt gctggcacgg gtctacaaac 480 agagcgacct ggataccctg gctaaggaag caagcatccc catcattaat gggctgtccg 540 acctgtatca ccctatccag attctggccg attacctgac cctgcaggag cattattcta 600 gtctgaaagg cctgacactg agctggattg gggacggaaa caatatcctg cactccatta 660 tgatgtctgc cgctaagttt ggaatgcatc tgcaggcagc cacaccaaaa ggctacgaac 720 ccgatgccag tgtgactaag ctggccgaac agtatgctaa agagaacggc actaagctgc 780 tgctgaccaa tgaccctctg gaggctgcac acggaggcaa cgtcctgatc actgatacct 840 ggatttccat gggccaggag gaagagaaga aaaagcgcct gcaggcattc caggggtacc 900 aggtgacaat gaaaactgcc aaggtcgccg cttctgattg gacttttctg cattgtctgc 960 cccgaaaacc tgaagaggtg gacgatgagg tcttctattc acctaggagc ctggtgtttc 1020 cagaagccga gaatcgcaag tggacaatca tggctgtgat ggtgtccctg ctgactgatt 1080 attcccccca gctgcagaaa cctaagttct gagcggccgc ttaattaagc tgccttctgc 1140 ggggcttgcc ttctggccat gcccttcttc tctcccttgc acctgtacct cttggtcttt 1200 gaataaagcc tgagtaggaa gtctag 1226 <210> 9 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> T7 Promoter <400> 9 taatacgact cactata 17

Claims (38)

  1. 5'에서 3'으로:
    (a) 서열식별번호(SEQ ID NO:) 2의 서열을 포함하는 5' UTR;
    (b) 기능성 인간 오르니틴 트랜스카르바밀라제 (OTC)를 코딩하는 오픈 리딩 프레임 (ORF)을 포함하는 mRNA 서열이며, 여기서 ORF는 서열식별번호 1과 적어도 약 95% 동일한 코돈 최적화된 서열을 포함하는 것인 mRNA 서열; 및
    (c) 서열식별번호 3의 서열을 포함하는 3' UTR
    을 포함하는 폴리뉴클레오티드 구축물.
  2. 기능성 인간 오르니틴 트랜스카르바밀라제 (OTC)를 코딩하는 오픈 리딩 프레임 (ORF)을 포함하는 mRNA 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 구축물이며, 여기서 mRNA 서열은 서열식별번호 4와 상이한 5개 이하의 핵산을 갖는 서열을 포함하는 것인 폴리뉴클레오티드 구축물.
  3. 제2항에 있어서, 5'에서 3'으로:
    (a) 5' UTR;
    (b) OTC를 코딩하는 ORF를 포함하는 mRNA 서열; 및
    (c) 3' UTR
    을 포함하는 폴리뉴클레오티드 구축물.
  4. 제3항에 있어서, 5' UTR이 서열식별번호 2의 서열을 포함하는 것인 폴리뉴클레오티드 구축물.
  5. 제3항 또는 제4항에 있어서, 3' UTR이 서열식별번호 3의 서열을 포함하는 것인 폴리뉴클레오티드 구축물.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 기능성 OTC가 서열식별번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 것인 폴리뉴클레오티드 구축물.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, OFR 서열이 서열식별번호 1을 포함하는 것인 폴리뉴클레오티드 구축물.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, mRNA 서열이 서열식별번호 4와 상이한 4, 3, 2, 또는 1개 이하의 핵산을 갖는 것인 폴리뉴클레오티드 구축물.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 서열식별번호 4의 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 구축물.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 5' 말단 캡을 추가로 포함하는 폴리뉴클레오티드 구축물.
  11. 제10항에 있어서, 5' 말단 캡이 Cap1인 폴리뉴클레오티드 구축물.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리A 테일을 추가로 포함하는 폴리뉴클레오티드 구축물.
  13. 제12항에 있어서, 폴리A 테일이 80 내지 1000개의 핵산 길이인 폴리뉴클레오티드 구축물.
  14. 제12항에 있어서, 폴리A 테일이 100 내지 500개의 핵산 길이인 폴리뉴클레오티드 구축물.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, mRNA가 적어도 하나의 화학적으로 변형된 우리딘을 포함하는 것인 폴리뉴클레오티드 구축물.
  16. 제15항에 있어서, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 또는 약 100%의 우리딘이 화학적으로 변형된 것인 폴리뉴클레오티드 구축물.
  17. 제15항 또는 제16항에 있어서, 화학적으로 변형된 우리딘이 슈도우리딘 (ψ), N1-메틸 슈도우리딘 (N1-me-ψ), 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 폴리뉴클레오티드 구축물.
  18. (a) 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항의 폴리뉴클레오티드 구축물; 및
    (b) 전달제
    를 포함하는 조성물.
  19. 제18항에 있어서, 전달제가 지질 나노입자 (LNP), 리포솜, 중합체, 미셀, 플라스미드, 바이러스, 또는 그의 임의의 조합을 포함하는 것인 조성물.
  20. 제19항에 있어서, LNP가 PEG2000-C-DMA:13-B43:콜레스테롤:DSPC, PEG2000-S:13-B43:콜레스테롤:DSPC, PEG2000-S:18-B6:콜레스테롤:DSPC, 및 PEG750-C-DLA:18-B6:콜레스테롤:DSPC로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 조성물.
  21. 제19항 또는 제20항에 있어서, 폴리뉴클레오티드 구축물이 LNP에 캡슐화된 것인 조성물.
  22. 제21항에 있어서, 폴리뉴클레오티드 구축물이 LNP에 완전히 캡슐화된 것인 조성물.
  23. 제22항에 있어서, 적어도 95%의 폴리뉴클레오티드 구축물이 LNP에 캡슐화된 것인 조성물.
  24. 제18항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 제약상 허용되는 담체를 추가로 포함하는 조성물.
  25. 세포에 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항의 폴리뉴클레오티드 구축물을 포함하는 조성물, 또는 제18항 내지 제24항 중 어느 한 항의 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 세포에서 OTC 발현량을 증가시키는 방법.
  26. 제25항에 있어서, 세포가 간 세포인 방법.
  27. 오르니틴 트랜스카르바밀라제 결핍증 (OTCD)과 연관된 증상 치료 또는 감소를 필요로 하는 대상체에게 치료 유효량의, 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항의 폴리뉴클레오티드 구축물을 포함하는 조성물, 또는 제18항 내지 제24항 중 어느 한 항의 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, OTCD와 연관된 증상을 치료 또는 감소시키는 방법.
  28. 고암모니아혈증 치료, 또는 그의 위험 감소를 필요로 하는 대상체에게 치료 유효량의, 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항의 폴리뉴클레오티드 구축물을 포함하는 조성물, 또는 제18항 내지 제24항 중 어느 한 항의 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, OTCD를 앓는 대상체에서 고암모니아혈증을 치료하거나, 또는 그의 위험을 감소시키는 방법.
  29. 서열식별번호 8과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 발현 카세트.
  30. 제29항에 있어서, 프로모터를 추가로 포함하는 발현 카세트.
  31. 제30항에 있어서, 프로모터가 T7 프로모터인 발현 카세트.
  32. 제29항 내지 제31항 중 어느 한 항의 발현 카세트를 포함하는 플라스미드.
  33. 제29항 내지 제31항 중 어느 한 항의 발현 카세트, 또는 제32항의 플라스미드를 포함하는 숙주 세포.
  34. OTCD 치료를 필요로 하는 대상체에서의 OTCD 치료를 위한 의약의 제조를 위한, 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항의 폴리뉴클레오티드 구축물, 또는 제18항 내지 제24항 중 어느 한 항의 조성물, 또는 제29항 내지 제31항 중 어느 한 항의 발현 카세트, 또는 제32항의 플라스미드, 또는 제33항의 숙주 세포의 용도.
  35. OTCD를 앓는 대상체에서의 고암모니아혈증 치료 또는 그의 위험 감소를 위한 의약의 제조를 위한, 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항의 폴리뉴클레오티드 구축물, 또는 제18항 내지 제24항 중 어느 한 항의 조성물, 또는 제29항 내지 제31항 중 어느 한 항의 발현 카세트, 또는 제32항의 플라스미드, 또는 제33항의 숙주 세포의 용도.
  36. 포유동물 대상체에게 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항의 폴리뉴클레오티드 구축물, 또는 제18항 내지 제24항 중 어느 한 항의 조성물, 또는 제29항 내지 제31항 중 어느 한 항의 발현 카세트, 또는 제32항의 플라스미드, 또는 제33항의 숙주 세포를 투여하는 단계를 포함하는, 핵산의 생체내 전달 방법.
  37. 질환 또는 장애 치료를 필요로 하는 포유동물 대상체에게 치료 유효량의, 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항의 폴리뉴클레오티드 구축물, 또는 제18항 내지 제24항 중 어느 한 항의 조성물, 또는 제29항 내지 제31항 중 어느 한 항의 발현 카세트, 또는 제32항의 플라스미드, 또는 제33항의 숙주 세포를 투여하는 단계를 포함하는, 상기 포유동물 대상체에서 질환 또는 장애를 치료하는 방법.
  38. 제37항에 있어서, 질환 또는 장애가 요소 회로 장애인 방법.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
PT3864163T (pt) 2018-10-09 2024-04-30 Univ British Columbia Composições e sistemas que compreendem vesículas competentes para transfeção isentas de solventes orgânicos e detergentes e métodos relacionados com as mesmas
US20240216545A1 (en) * 2021-04-28 2024-07-04 Genevant Sciences Gmbh Mrna delivery constructs and methods of using the same

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2015017519A1 (en) * 2013-07-30 2015-02-05 Phaserx, Inc. Block copolymers and their conjugates or complexes with oligonucleotides
CN107530436B (zh) * 2015-01-21 2022-03-29 菲泽尔克斯公司 用于将治疗剂和诊断剂递送到细胞中的方法、组合物和系统
US10835583B2 (en) * 2016-06-13 2020-11-17 Translate Bio, Inc. Messenger RNA therapy for the treatment of ornithine transcarbamylase deficiency
EP3568483A4 (en) * 2017-01-10 2020-08-19 Children's Medical Research Institute POLYNUCLEOTIDES AND VECTORS OF TRANSGEN EXPRESSION
WO2019104152A1 (en) * 2017-11-22 2019-05-31 Modernatx, Inc. Polynucleotides encoding ornithine transcarbamylase for the treatment of urea cycle disorders

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