KR20240126800A - Covid-19 백신 - Google Patents

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KR20240126800A
KR20240126800A KR1020230162895A KR20230162895A KR20240126800A KR 20240126800 A KR20240126800 A KR 20240126800A KR 1020230162895 A KR1020230162895 A KR 1020230162895A KR 20230162895 A KR20230162895 A KR 20230162895A KR 20240126800 A KR20240126800 A KR 20240126800A
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Abstract

본 발명은 종래 이용되는 DNA 및 mRNA 백신보다 안정적이고, 최종 농도가 확보되며, SARS-CoV-2에 대한 T 세포 면역반응을 더 잘 일으킬 수 있는 COVID 19 예방용 펩타이드 기반 백신을 제공한다. 본 발명의 폴리펩타이드 백신은 SARS-CoV-2 스파이크 단백질의 구조 및 면역원성을 고려하여 고른 스파이크 단백질의 4개의 단편 중 적어도 하나를 포함한다.

Description

COVID-19 백신{COVID-19 Vaccine}
본 발명은 새로운 백신 조성물에 대한 것이다. 구체적으로 SARS-CoV-2 바이러스의 스파이크 단백질의 일부를 항원으로 포함하는 새로운 폴리펩타이드 백신에 대한 것이다.
2023년 현재 SARS-CoV-2라 불리는 코로나바이러스에 의해 유발되는 COVID-19 감염증은 여전히 전세계적으로 유행 중이며 7.5억 이상의 인구가 확진 되었고, 6백만명 이상의 사람들이 사망했다(https://covid19.who.int/, 2023.2.23 기준). 이 질병의 증상은 일반적인 감기와 비슷하고 경증에서 중증까지 범위가 넓으며, 기침, 콧물, 호흡곤란, 피로, 발열 등을 포함한다. 감염자의 대부분은 경증으로 지나가지만, 노인이나 고혈압, 비만, 당뇨 등의 기저질환자들은 중증으로 진행될 위험이 크다. 또한, SARS-CoV-2와 연관된 심각한 합병증으로 '사이토카인 폭풍'이라 불리는 급성 호흡곤란 증후군이 있다.
현재, 이 대유행병에 대한 대응은 주로 백신 접종과 대증치료이다. 특히 COVID-19에 대한 여러 백신이 개발되어 수십억 용량 분량 이상이 전세계적으로 공급되어 COVID-19 감염증으로 인한 사망을 줄였다. 그러나, 백신 부스터 접종 후의 중증 사례 및 백신 접종 후 감염 사례가 많이 나타나 기존에 허가된 백신의 효능에 대한 의문이 제기되고 있어, SARS-CoV-2 바이러스에 대한 더 효과적인 백신이 여전히 필요한 상태이다.
COVID-19 백신 개발에 있어서, ACE2 수용체와 상호작용하여 인간 세포로 침입하는 데 중요한 역할을 하는 것으로 여겨지는 SARS-CoV-2의 스파이크 단백질이 항원으로서 주목받고 있다. 또한 코비드-19에서 회복한 환자들의 혈청에서 발견되는 중화 항체의 1차 표적이 스파이크 단백질이라는 것이 알려져 있다.
SARS-CoV-2 스파이크 단백질의 전체 길이는 아미노산 1273개이며, N-말단에 있는 신호 펩타이드(아미노산 1~13), S1 서브유닛(잔기 14~685), 및 S2 서브유닛(잔기686~1273)로 구성되어 있다. 뒤쪽 두 개의 영역이 각각 수용체 결합 및 막 융합에 관여한다. S1 서브유닛에 N-말단 도메인(잔기 14~305) 및 수용체 결합 도메인(RBD, 잔기 319~541)이 있고, 융합 펩타이드(fusion peptide, FP) (잔기 788~806), 헵타펩타이드 반복 서열 1 (HR1) (잔기 912~984), HR2 (잔기 1163~1213), TM 도메인 (잔기 1213~1237), 및 세포질 도메인 (잔기 1237~1273)이 S2 서브유닛을 구성한다.
현재 임상시험 중이거나 전임상 중인 COVID-19 백신 중 S 단백질 또는 그 일부를 항원으로 포함하는 백신이 많은 수를 차지하고 있다(https://www.who.int/publications/m/item/draft-landscape-of-covid-19-candidate-vaccines, 2023.3.9. 확인).
현재 가장 많이 사용되고 있는 COVID-19 백신은 mRNA 기반 백신과 일부 DNA 백신인데, 이러한 백신들이 중증 감염을 예방하고 전파를 상대적으로 줄이는 등의 효과가 있음에도 불구하고, 여전히 안전성, 면역원성, 장기 효능 및 RNA의 안정성 등의 문제가 있다. 이러한 백신 플랫폼과 비교하여, 펩타이드 기반 백신은 세포독성 T-세포 반응이나 기억 T-세포 형성에 기여하는 뛰어난 특성을 나타낸다. 따라서, 본 발명자들은 개별 개체에서의 전사 및/또는 번역 능력에 의존하여 개체 별 변이가 있는 mRNA 또는 DNA 기반 백신 대신 펩타이드 기반 백신 플랫폼을 선택하였다. 더욱이, DNA 및 mRNA 백신과 달리, 펩타이드 서브유닛 백신은 필요한 형태를 보유하고 최종 농도가 보장된다는 장점이 있다.
본 발명은 종래 이용되는 DNA 및 mRNA 백신보다 안정적이고, 최종 농도가 확보되며, SARS-CoV-2에 대한 T 세포 면역반응을 더 잘 일으킬 수 있는 펩타이드 기반 백신을 제공한다.
본 발명의 폴리펩타이드 백신은 SARS-CoV-2 스파이크 단백질의 구조 및 면역원성을 고려하여 서열번호 9의 스파이크 단백질을 잘라낸 단편 중에서 고른 4개의 폴리펩타이드 단편을 포함하는 항원 중 적어도 하나를 포함한다. 구체적으로 4개의 항원은 표 1에 기재된 펩타이드 서열을 가지는 폴리펩타이드 항원이다.
아미노산 서열 S 단백질 내 위치
항원 1(서열번호 1) QCVNLTTRTQLPPANNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNFNFNG 14-134
항원 2(서열번호 2) ISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNFNFNGLTGTGVLTESNKKFLPFQQFGRDIADTTDAVRDPQTLEILDITPCSFGGVSVITPGTNTSNQVAVLYQDVNCTEVPVAIHADQLTPTWRVYSTGSNVFQTRAGCLIGAEHVNNSYECDIPIGAGICASYQTQTNSPRR 358-683
항원 3(서열번호 3) PYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNFNFNGLTGTGVLTESNKKFLPFQQFGRDIADTTDAVRDPQTLEILDITPCSFGGVSVITPGTNTSNQVAVLYQDVNCTEVPVAIHADQLTPTWRVYSTGSNVFQTRAGCLIGAEHVNNSYECDIPIGAGICASYQTQTNSPRR 507-683
항원 4(서열번호 4) VDFCGKGYHLMSFPQSAPHGVVFLHVTYVPAQEKNFTTAPAICHDGKAHFPREGVFVSNGTHWFVTQRNFYEPQIITTDNTFVSGNCDVVIGIVNNTVYDPLQPELDSFKEELDKYFKNHTSPDVDLGDISGINASVVNIQKEIDRLNEVAKNLNESLIDLQELGKYEQYIKWP 1040-1213
본 발명의 바람직한 실시예에서, 본 발명의 백신은 항원 1 내지 항원 4를 모두 포함하는 백신이다. 항원 1 내지 항원 4를 모두 포함하는 백신은 단일 항원만을 포함하는 백신에 비해 중화항체의 형성, 폐 내부 바이러스 역가 감소, 폐/비장/신장/소장을 포함하는 주요장기의 병증예방 및/또는 완화에 더욱 효과적이다.
바람직한 실시예에서, 본 발명의 백신은 프로인드 완전 아쥬번트, 프로인드 불완전 아쥬번트, 스쿠알렌 기반 아쥬번트, 광물 기반 아쥬번트, 식물 기반 아쥬번트, 합성 DNA 기반 아쥬번트, 미립자 단백질 아쥬번트로 구성되는 모둠에서 선택되는 아쥬번트를 더 포함한다.
바람직한 실시예에서, 본 발명의 백신은 주사용 증류수, 등장 염화나트륨 주사액, 링겔 주사액, 덱스트로스 주사액, 하트만 주사액, 참기름, 콩기름, 면실유, PEG, 에탄올, 프로필렌글리콜, 안식향산나트륨, 살리실산나트륨, 초산나트륨, 트윈류, 프로필렌글리콜, 초산 및 그의 염, 암모니아, 초산 암모니아, 알부민, 치메로살, EDTA, 포도당, 염산프로카인에서 선택되는 약학적으로 허용가능한 첨가제를 더 포함한다.
본 발명은 또한 서열번호 1 내지 서열번호 4 중 어느 하나의 폴리펩타이드로 구성되는 단백질을 포함하는 COVID-19 백신용 항원을 제공한다.
본 발명은 또한 서열번호 1 내지 서열번호 4 중 어느 하나의 폴리펩타이드를 인코딩하는 유전자를 포함하는 뉴클레오타이드를 제공한다. 서열번호 1 내지 서열번호 4의 폴리펩타이드를 인코딩하는 유전자는 예를 들면, 서열번호 5 내지 서열번호 8의 뉴클레오타이드를 포함할 수 있으나 이에 한정되지 않고, 서열번호 1 내지 4의 폴리펩타이드를 발현할 수 있으면 서열번호 5 내지 8의 뉴클레오타이드 중 일부 염기가 치환, 삭제 및/또는 부가된 서열도 가능하다.
본 발명은 또한 서열번호 1 내지 서열번호 4 중 어느 하나의 폴리펩타이드를 인코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다. 추가적으로 본 발명은, 서열번호 1 내지 서열번호 4 중 어느 하나의 폴리펩타이드를 발현하도록 형질전환된 숙주세포를 제공한다. 본 발명의 구체예에서 상기 숙주세포는 대장균이다.
본 발명의 폴리펩타이드 백신은 SARS-CoV-2에 대한 면역 반응을 잘 일으켜 코비드-19에 대한 예방 효과가 있을 뿐 아니라, mRNA 백신에 비해 더 쉽고 더 저렴하게 백신의 대량 생산이 가능하며, 극저온의 보관 조건이 필요하지 않다. 이러한 특성은 극저온 백신 유통이 어렵고 소득 수준이 낮은 저개발 국가들의 백신 접종율을 올릴 수 있게 할 것이다.
도 1은 백신 접종의 실험적 디자인을 보여주는 개괄도이다. K18-hACE2 TG 마우스에게 2주 간격으로 A 백신 또는 B 백신을 피하로 접종했다. 2번째 접종 1주 후에, 마우스를 비강 내 경로로 SARS-CoV-2에 감염시켰고(105 PFU), 감염 7일 후의 변화를 평가했다.
도 2는 본 발명의 백신에서 사용한 4개의 재조합 항원을 보여 준다. (a) 본 발명에서 사용한 스파이크 단백질 항원의 서열을 나타낸다. 여기서 굵은 글씨체는 바이러스 항원 서열이 아닌 단백질 발현을 위한 서열이고, 붉은 글씨는 His 태그를 나타낸다. (b) 2단계, 즉 미니-탈론 및 HPLC로 정제한 재조합 항원의 10% SDS-PAGE 은 염색 사진을 보여준다. HPLC 단편 번호는 각 레인의 위쪽에 표시하였다. 각 항원의 예상 분자량을 기재하였다. 4개의 항원의 서열은 도 2a 및 표 1에 나타낸 바와 같다.
도 3은 4개의 항원에 대한 혈청 항원 역가이다. (A) ELISA 플레이트는 백신 접종한 동물의 혈청(V1~V5), 음성 대조군(N), 및 자연적으로 감염된 환자로부터의(P1/2) 혈청(아래쪽)의 항원과의 결합 및 그것들의 수치화 된 OD450 값(위쪽)을 나타낸다. 환자 1 및 환자 2의 COVID-19 중화 지수는 각각 20 및 640이었다. (B) ELISA 플레이트는 2개의 백신을 접종한 마우스 모둠에서 형성된 항체의 항원과의 역가 결과(왼쪽) 및, 그것의 수치화 된 OD450 값(오른쪽)을 보여준다. 항체 역가는 1:1,000 (103) 내지 1:1,000,000 (106)까지의 일련의 희석액으로 측정했다. 본 연구에 포함된 모든 백신 접종한 사람들은 화이자 mRNA 백신을 접종 받았다.
도 4는 SARS-CoV-2 백신 접종하고 감염시킨 마우스의 체중, 활동성 및 생존율 변화를 나타낸다. (A) 접종 시간으로부터 시작된 체중 변화(아래) 및/또는 감염 동안 ARS-CoV-2 감염 모둠(A 백신 및 B 백신)을 포함하는 3 모둠(각 모둠 n=5)의 체중 변화를 비교한 퍼센티지 변화를 플로팅한 그래프이고(아래), 감염 후 7일까지 마우스의 체중을 모니터링하고 백신 접종한 모둠을 생검 했다(dpi). (B) 감염 후 세 모둠에서의(각 모둠 n=5) 0일부터 7일까지의 활동성 변화(위), 및 활동성의 퍼센티지 변화를 플로팅한 그래프이다(아래). (C) 세 모둠의 마우스 생존율을 7 dpi까지 매일 모니터링했다. 평균과 표준편차를 나타냈고, 모둠 간 유의적인 차이는 보이지 않는다.
도 5는 백신 접종 또는 접종하지 않은 K18-hACE2 TG 마우스의 SARS-CoV-2 감염 후의 폐의 병리적 변화를 보여준다. (A) A 백신 접종 모둠, B 백신 접종 모둠 및 백신 접종하지 않은 SARS-CoV-2 감염 모둠(각 모둠 n=5) 마우스에서 누적 바이러스 부하를 왼쪽 막대 그래프로 나타냈다. 세 모둠의 각 마우스의 개별적인 바이러스 부하량은 오른쪽 그래프에 평균 및 표준편차와 함께 나타냈고 모둠 간 유의적 차이는 없었다. (B) 폐 부종의 조직병리학적 점수, (C) 체중 대비 폐 무게의 %, (D) 총 병리학적 점수를 나타내는 그래프이다. (E) 마우스 폐의 헤마톡실린-에오신(H&E) 염색사진이다. 폐 육아종을 화살표로 나타냈다. 단위 막대는 각각 50 μm (위) 및 100 μm (아래)이다.
도 6은 백신 접종 또는 접종하지 않은 K18-hACE2 TG 마우스의 SARS-CoV-2 감염 후의 비장의 병리학적 변화를 보여준다. (A) 체중 대비 비장 무게 %, (B) 백색 속질 위축 %, (C) H&E 염색한 마우스 비장 조직 사진. 비장 속질 위축 부위를 화살표로 나타냈다. 단위 막대는 각각 50 μm (위) 및 100 μm (아래)이다.
도 7은 백신 접종 또는 접종하지 않은 K18-hACE2 TG 마우스의 SARS-CoV-2 감염 후의 소장의 병리학적 변화를 보여준다. (A) 세 모둠의 마우스 소장 융모의 술잔 세포의 수를 나타내는 막대 그래프이다. (B) H&E 염색한 마우스 소장 조직 사진. 술잔 세포를 화살표로 나타냈다. 단위 막대는 각각 50 μm (위) 및 100 μm (아래)이다.
도 8은 백신 접종 또는 접종하지 않은 K18-hACE2 TG 마우스의 SARS-CoV-2 감염 후의 간, 비장, 좌/우 신장 및 폐의 체중 대비 조직 중량의 퍼센티지를 나타낸다. 평균과 표준편차로 표시하였으며 모둠 간 유의적 차이는 보이지 않는다.
본 발명은 서열번호 1 내지 서열번호 4의 서열로 구성되는 폴리펩타이드 중 적어도 하나의 폴리펩타이드를 포함하는 COVID-19 백신 조성물을 제공한다.
본 발명의 발명자들은 서열번호 5의 SARS-CoV-2 S 단백질의 구조와 항체와의 결합 등을 감안하여 스파이크 단백질의 여러 단편을 제작하였고, 후보 단백질 중 COVID-19 백신 접종한 사람 및 COVID-19 자연 감염 후 회복된 환자의 혈청에 존재하는 중화항체와의 결합력을 확인하여 최종적으로 4개의 백신 항원을 선택했다. 백신의 항원으로 이용되는 폴리펩타이드는 서열번호 1 내지 서열번호 4의 폴리펩타이드이다.
본 발명의 백신에 이용되는 항원은 서열번호 1 내지 서열번호 4의 폴리펩타이드 서열 외에 단백질 발현을 위한 추가적인 아미노산을 포함할 수 있다. 이들 재조합 단백질 항원을 발현하기 위한 발현용 구성체는 발현 시에 원형질막 주위 영역(periplasmic region) 또는 혹은 배양 배지로 재조합 단백질이 방출될 수 있도록 각 발현 시스템에 적당한 신호 펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 추가하거나 원래 가지고 있는 신호 펩타이드 대신 이종의 신호 펩타이드가 발현될 수 있도록 폴리뉴클레오티드를 변형할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서 백신 항원으로 이용되는 폴리펩타이드는 서열번호 1 내지 서열번호 4 중 어느 하나의 서열의 N 말단에 M을, C 말단에 LEHHHHHH를 더 포함한다.
본 발명의 펩타이드 항원은 알려진 폴리펩타이드 합성 기술, 또는 벡터 및 숙주세포를 이용한 단백질 발현기술을 이용하여 제조할 수 있어 백신의 대량 생산에 적합하다. 이러한 폴리펩타이드 생산 방법은 당업자에게 잘 알려져 있다. 본 발명의 단백질 항원은 배큘로바이러스 시스템, CHO 세포, 포유류 세포, 곤충세포, 세균 세포에서 발현될 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서, 본 발명의 항원은 벡터를 통해 형질 전환시킨 E.coli 세포에서 발현한다.
본 발명의 바람직한 실시예에서, 상기 백신 조성물은 적어도 항원 4를 항원으로 포함한다.
본 발명의 또 다른 바람직한 실시예에서, 상기 백신 조성물은 항원 1 내지 항원 4를 모두 포함한다. 항원 1 내지 항원 4를 모두 포함하는 백신은 단일 항원만을 포함하는 백신에 비해 중화항체의 형성, 폐 내 바이러스 역가 감소, 폐/비장/신장/소장을 포함하는 주요 장기의 병증 예방 및/또는 완화에 더욱 효과적이다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 백신 조성물은 아쥬번트를 추가로 포함할 수 있다. 아쥬번트는, 예를 들어 프로인드 완전 아쥬번트, 프로인드 불완전 아쥬번트, 광물 유래 아쥬번트, 식물 유래 아쥬번트, 스쿠알렌 기반 아쥬번트, 합성 DNA 기반 아쥬번트, 미립자 단백질 아쥬번트 중에 선택되나 이에 한정되지 않는다. 구체적으로 알루미늄 기반 아쥬번트로서 무정형 수산화인산 알루미늄 황산염(AAHS), 수산화 알루미늄, 인산 알루미늄, 칼륨 알루미늄 황산염(Alum) 등이 있다. 또한 모노포스포릴 지질 A(Monophosphoryl lipid A)를 기반으로 하는 AS01 및 AS04, 사이토신 포스포구아닌(CpG) 기반 아쥬번트, 사포닌 기반 아쥬번트인 Matrix-M™, 스쿠알렌 기반 아쥬번트인 MF59 등이 사람에 대해 사용가능한 아쥬번트이고, 본 발명의 백신 조성물에 포함될 수 있다.
본 발명의 백신 조성물은 항원 및/또는 아쥬번트를 함께 동결건조하여 백신 조성물로 제공될 수 있다. 동결 건조되어 분말형태로 제공되는 경우 백신 보관 온도의 영향을 크게 받지 않을 수 있기 때문에 저온/냉장 유통 시스템이 없는 국가에서도 이용이 가능하다. 주사용 바이알에 분말 상태로 넣어 유통되다가 이용 직전에 분말형태의 백신 조성물에 주사용수나 멸균 식염수 등을 혼합하여 녹이거나 현탁한 후 주사할 수 있다.
또한 본 발명의 백신 조성물은 약학적으로 허용가능한 첨가제를 더 포함할 수 있다. 약학적으로 허용가능한 첨가제는, 주사용 증류수, 등장 염화나트륨 주사액, 링겔 주사액, 덱스트로스 주사액, 하트만 주사액과 같은 수성 용제, 참기름, 콩기름, 면실유 등의 주사용 기름과 같은 유성용제, PEG, 에탄올, 프로필렌글리콜 등의 유기용제, 안식향산나트륨, 살리실산나트륨, 초산나트륨, 트윈류, 프로필렌글리콜과 같은 용해보조제, 초산 및 그의 염, 암모니아, 초산 암모니아, 알부민 등과 같은 완충제, 치메로살 또는 EDTA와 같은 보존제, 포도당 또는 염산프로카인과 같은 무통화제를 포함하나 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 일 실시예에서 본 발명의 백신 조성물은 프리필드 실린지 형태로 제공된다. 또는 본 발명의 또 다른 실시예에서 본 발명의 백신 조성물은 주사용 바이알의 형태로 제공될 수 있다.
본 발명의 백신의 투여 용량은 일반적인 재조합 단백질 백신과 비슷하게 결정될 수 있으며, 당업자라면 면역 반응을 일으키기에 적절한 항원의 양을 결정할 수 있다. 본 발명의 바람직한 실시예에서, 상기 백신 조성물은 1회 용량에 0.1~100mg의 항원 펩타이드를 포함한다. 본 발명의 일 실시예에서, 상기 백신 조성물은 항원과 아쥬번트가 1: 0.5~2의 비율로 혼합된다. 본 발명의 일 실시예에서 백신 조성물에 항원과 아쥬번트가 1:1의 비율로 혼합된다.
본 발명의 백신 조성물은 피하, 근육 내, 피내 주사 또는 비강 내나 설하 점막 투여로 접종할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서 백신 조성물이 피하주사로 접종된다.
본 발명은 또한 서열번호 1 내지 서열번호 4 중 어느 하나의 폴리펩타이드로 구성되는 단백질을 포함하는 COVID-19 백신용 항원을 제공한다. 또한 본 발명의 백신용 항원은 서열번호 1 내지 서열번호 4의 폴리펩타이드와 80%, 바람직하게는 90%, 더욱 바람직하게는 98%, 더욱 바람직하게는 99%의 서열 상동성을 가질 수 있으며, 본 발명의 항원 1 내지 항원 4에 대한 중화항체를 형성할 수 있는 항원은 본 발명의 범위 내에 포함된다.
본 발명은 또한 서열번호 1 내지 서열번호 4 중 어느 하나의 폴리펩타이드를 인코딩하는 유전자를 포함하는 뉴클레오타이드를 제공한다. 본 발명의 일 실시예에서 상기 뉴클레오타이드는 서열번호 5 내지 8의 뉴클레오타이드이다.
또한 본 발명은 서열번호 1 내지 서열번호 4 중 어느 하나의 폴리펩타이드를 인코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다. 상기 재조합 벡터로는 시판되는 플라스미드, 코스미드(cosmid), 백미드(bacmid)나 박테리오파지, 렌티바이러스, 아데노바이러스 등을 사용할 수 있으며 적절한 벡터를 선택하는 것은 당업자에게 잘 알려진 기술이다. 본 발명의 항원 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 DNA 분자들은 전사 및 번역 조절 신호를 갖는 벡터에 삽입시킬 수 있다. 서열번호 1 내지 서열번호 4 중 어느 하나의 폴리펩타이드를 인코딩하는 유전자는 공지된 기법, 예를 들어 Dai L, Zheng T, Xu K, et al A Universal Design of Betacoronavirus Vaccines against COVID-19, MERS, and SARS Cell 2020;182(3):722-733e11 doi:101016/jcell202006035 (CHO시스템)을 사용하여 발현될 수 있다. CHO 세포 외에도 인체용 단백질을 발현하기에 적당하다고 알려진 다른 포유류 세포 및 다양한 E. coli 벡터를 이용할 수 있으나 이에 한정되지 않는다. 본 발명의 일 구현예에서 발현벡터는 pET21a 벡터이다.
본 발명은 또한 서열번호 1 내지 서열번호 4 중 어느 하나의 폴리펩타이드를 발현하도록 형질전환된 숙주세포를 제공한다. 숙주세포로는 원핵세포 또는 진핵세포를 이용할 수 있다. 진핵 숙주세포로서는 곤충세포, 효모, 식물, 포유류 세포 등을 이용할 수 있다. 원핵 숙주 세포로서 예를 들어, 대장균(E. coli), 살모넬라균(Salmonella typhi) 및 마이코박테리아와 같은 박테리아 세포를 이용할 수 있다. 본 발명의 일 구현예에서 숙주세포는 대장균이다. 벡터의 도입 후, 상기 숙주 세포를 일반 배지 또는 벡터 함유 세포 성장용 선택성 배지에서 배양한다. 상기 클로닝된 유전자 서열의 발현 결과 목적하는 항원 단백질이 생산된다. 생산된 항원 단백질은 공지된 정제 방법, 즉 추출, 침전, 크로마토그래피, 전기영동 등과 같은 통상적인 과정에 의해 정제할 수 있다.
이하에서 본 발명의 상세한 실시예를 기술한다. 이하의 실시예는 본 발명이 수행되는 구체적 예시를 보여주지만, 이는 본 발명을 명확하게 이해하기 위한 것이며 본 발명은 본 실시예의 내용에 한정되지 않는다.
실시예 1: 방법 및 재료
1.1 항원 제작
SARS-CoV-2 스파이크 단백질로 백신용 항원을 제작했다. 우선, pET21a 벡터(Takara, Shiga, Japan)로 표 1의 폴리펩타이드 항원을 발현하는 스파이크 cDNA를 클로닝하고 PCR로 증폭했다. 삽입된 폴리펩타이드 cDNA를 함유하는 클론을 각각 대응하는 DNA 시퀀싱을 통해 확인했다(Cosmogen, Seoul, Korea). 그 다음, 열 충격 기법을 통해 발현 벡터로 BL21-Codon Plus (Stratagene, San Diego, CA, USA)를 형질전환 하였다. 발현된 폴리펩타이드를 수집하여 TALON® 자성 비즈(Takara)로 C-말단의 His 태그를 이용하여 정제하고, 그 후에 HPLC 정제 과정을 거쳤다. 은 염색과 브래드포드 분석(Bradford assay)을 통해 그것들의 농도를 측정했다.
1.2 바이러스 항체 시험 및 중화능력 평가
SARS-CoV-2 백신 접종한 사람들과 자연 감염된 사람들로부터 채취된 시료를 이용하여 정제된 스파이크 항원의 중화능을 평가하였고, 본 시험은 영남대학교 연구윤리심의위원회의 승인을 받았다(승인번호 2020-07-063). 정제된 스파이크 항원에 대한 인간 혈청 내의 중화 항체를 탐지하기 위해 자체 제작한 ELISA를 이용하였고, 상기 항원을 분석 전 최종 농도 1 μg/ml가 되도록 96-웰 플레이트에 넣고 4℃에서 하루 동안 두어 코팅했다. 다음 날, 0.1% Tween 인산염 완충식염수(PBS-T)로 3번 씻어내고 실온에서 1시간 동안 2% BSA를 200 μl/웰의 양으로 넣어 차단했다. PBS-T로 다시 3번 씻어낸 다음 일련의 혈청 희석액을 실온에서 2시간 동안 배양했다. 그 다음, PBS-T로 세 번 세척하고 실온에서 항체-HRP와 함께 넣고 교반 하며 0.5시간 동안 배양한 뒤에 PBS-T로 세 번 씻어냈다. 실온에서 100 μl/웰의 TMP-기질과 함께 20분간 배양한 후에 100 μl/웰의 정지용액으로 반응을 중지시켰다. 450 nm에서 마이크로플레이트 판독기로 ELISA 플레이트를 읽었다. 동일한 ELISA 과정을 마우스 혈청에 대한 역가 분석에서도 사용하였다.
1.3 백신 제작, 마우스 백신 접종 및 감염
모든 동물 실험은 건국대학교 동물실험 윤리위원회(Institutional Animal Care and Use Committee, IACUC)의 승인을 받았다. 정제한 스파이크 단백질 항원 중에서 항원을 선택하여 A 백신과 B 백신을 설계하였다. A 백신은 표 1의 항원 1을 단독으로 사용하였고, B 백신은 표 1의 4개의 항원(항원 1~4)을 모두 혼합하여 항원으로 이용했다.
백신 접종 및 SARS-CoV-2 감염에 대한 개괄도를 도 1에 나타냈다. 두 백신 모두 2주 간격으로 피하로 접종하였다. 첫 번째 접종일(D-21일)에는 완전 아쥬번트와 함께 제제화한 백신을 접종하였고, 두 번째 접종일(D-7일)에는 불완전 프로인드 아쥬번트와 함께 제제화한 백신을 접종하였다. 항원과 아쥬번트를 1:1 비율로 혼합하여 최종 농도로 만들었다. 각 모둠은 7주령의 K18-hACE2 TG 수컷 마우스로 구성되어 있고, 마우스 당 2mg의 용량으로 투여했다. 모든 마우스의 물과 사료 급여를 동일하게 유지하고 매일 체중을 재고 모니터링했다. 첫 번째 모둠은 A 백신을 접종하고 2차 접종 7일 후에 SARS-CoV-2 바이러스를 감염시켰다(n=5). 두 번째 모둠은 B-백신을 접종하고 2차 접종 7일 후에 SARS-CoV-2 바이러스를 감염시켰다(n=5). 대조 모둠은 백신 접종 없이 SARS-CoV-2 만을 감염시켰다(n=5). 바이러스 감염일(D-day)에 모든 모둠의 마우스에게 1 x 105 TCID50의 SARS-CoV-2 바이러스(NCCP 43326)를 비강 내로 투여했다. 대한민국 질병관리청의 지침에 따라 실시간 RT-PCR로 바이러스 감염을 확인했다. 그 다음, 6일 및 7일에 혈청을 채취하였고, 모든 혈청은 사용시까지 4℃에서 보관하였다.
1.4 백신 효과 평가
세 모둠의 마우스를 다음의 항목들에 대해 비교하고 평가했다: 체중, 활동성, 및 7 dpi까지의 생존율. 또한, 7일에 마우스를 희생시키고, 폐, 비장 및 소장 조직을 적출하여 조직병리학적 평가를 수행했다. 폐 조직에서의 바이러스 역가를 측정하였고, 폐 조직 중량/체중 퍼센티지를 구했다.
1.5 폐, 비장, 소장의 조직병리학적 분석
감염 7일 후에 희생시킨 마우스로부터 폐, 비장 및 소장을 적출하였다. 조직병리학적 검사를 위해, 적출한 조직을 4% 파라포름알데히드로 고정하고, 파라핀 임베딩 후에 헤마톡실린-에오신(H&E) 염색하여 조직 절편을 만들었다. 폐 조직의 염증, 부종 및 기관지염 병변을 관찰했다. 비장 조직에서는 비장 백색속질의 위축이 있는지 확인하고, 소장에서는 술잔세포의 수를 셌다.
1.6 통계적 분석
Prism 8.0 (GraphPad Software)을 이용하여 통계 분석을 했다. 일방향 또는 양방향 ANOVA 분석하고 투키스 사후 교정(Tukey's post-hoc correction)했다. P-값이 < 0.05일 때 유의적인 것으로 보았다.
실시예 2: 결과 분석
2.1 SARS-CoV-2 백신 접종한 사람 및 자연 감염된 환자로부터의 혈청 시료로부터 잠재적인 보호 항원 동정
SARS-CoV-2 스파이크 단백질의 다양한 폴리펩타이드 부분 항원을 구성했고 정제하여 백신 항원 후보로서의 가능성을 평가했다. 백신 접종한 사람들 또는 자연 감염된 사람으로부터의 혈청 내 중화항체와 정제한 항원들이 결합하는 능력을 확인했다. 여러 항원 중에서, 표 1에 정리된 4개의 항원을 추가적인 실험을 위해 선택했다. 이 항원들을 이용하여 코로나 19 백신을 제작하였고 다중 항원과 단일 항원이 비슷한 보호효과를 주는지 확인했다.
마우스를 2개의 백신 및 비접종 모둠으로 나눠서, 접종 모둠에는 최종 용량 2 μg을 피하로, D-21일 및 D-7일에 접종했다(2주 간격). 그 후 D-0일에 105 PFU의 SARS-CoV-2 바이러스로 마우스를 감염시키고 혈청을 채취한 후에, D+7일에 마우스를 부검했다.
2단계 정제한 재조합 항원들을 10% SDS-PAGE 및 은 염색으로 가시화했다(도 2B). 도 2a 및 표 1에 나타낸 바와 같은 4개의 항원은 COVID-19 백신 접종 또는 자연 감염된 인간의 혈청 시료 항체와의 높은 결합력을 바탕으로 항원으로 선택된 것이다. COVID-19 환자 2 시료의 경우, 4개 항원 모두에 대한 결합 역가가 높게 나왔고 COVID-19 중화지수가 640에 근접했다(도 3A). 그러나, 백신 접종한 인간 혈청 시료는 자연 감염된 환자의 혈청에 비해 매우 낮은 결합 역가를 보였다. 추가로 백신 접종한 마우스 혈청의 역가를 4개의 항원을 이용하여 확인했다(도 3B). 전체적으로 다중 스파이크 폴리펩타이드(B 백신) 접종 모둠에서 단일 폴리펩타이드(A 백신) 접종 모둠에 비해 높은 역가를 보였다.
2.2 SARS-CoV-2 감염 후 마우스에서의 생존율, 체중 및 활동 상태 변화 평가
도 1에 도시된 바와 같이 백신 접종을 한 후에 세 모둠의 K18-hACE2 TG 마우스를 비강 내로 감염시키고, 감염 7일 후에 희생시켜서 혈액과 조직 시료를 채취했다. 감염 전/후의 백신 접종한 두 모둠(A 백신 및 B 백신)의 마우스의 체중을 모니터링했고, 감염시키는 날까지 두 모둠 간의 체중에는 유의적인 차이가 없었다. 백신 접종 2 모둠 및 비접종 모둠을 포함하는 세 모둠의 마우스들을 감염시킨 후 0일부터 7일까지 체중 변화 퍼센티지를 비교했다(도 4A, 위). 6 dpi에, 비접종 감염 모둠과 A 백신 접종 모둠에서 체중이 거의 15%까지 줄어든 데 비해, B 백신 접종 모둠에서는 체중이 11%까지 감소했다. 4 dpi에서 7 dpi까지, 세 마리의 마우스가(A 백신 접종 모둠에서 1마리, B 백신 접종 모둠에서 2마리) 체중 감소로부터 회복되었다(도 4A 아래). 세 모둠에서 체중 변화에 통계적으로 유의한 차이가 있다고 할 수는 없어도, B 백신 접종 모둠에서 체중 감소가 더 적었고 더 잘 개선되었다.
또한, 세 모둠의 마우스의 활동성을 관찰했고, 변화를 퍼센티지로 정리했다(도 4B, 위쪽 그래프). 비접종 음성 대조 모둠의 활동성은 5 dpi부터 감소하기 시작했고 점점 나빠져서 7 dpi에는 거의 빈사 상태에 이르렀다. 한편, 백신을 접종한 두 모둠에서는 활동성이 6 dpi부터 감소하기 시작해서 7 dpi에는 몇몇 마우스가 빈사 상태가 되었다: A 백신 접종 모둠의 마우스 2마리와 B 백신 접종 모둠의 마우스 2마리는 7 dpi까지 100%의 활동성을 유지했고, A 모둠의 마우스 2마리와 B 모둠의 마우스 1마리가 빈사 상태가 되었다(도 4B, 아래 그래프). 7 dpi까지 모니터링한 생존 여부를 모니터링한 후에 7일째에 모든 마우스를 희생시켰다(도 4C). 실험한 모든 모둠 간에 체중 변화, 활동성 및 생존율에 있어 통계적으로 유의적인 차이는 보이지 않았지만 B 백신 접종 모둠의 마우스들이 가장 긍정적인 결과를 보였다.
3.3 백신 접종 및 비접종 감염 마우스에서의 폐 내 SARS-CoV-2 역가 및 조직병리학적 변화
7 dpi에 세 모둠의 마우스를 희생시키고 바이러스 역가 및 조직병리학적 변화를 평가하였다. 폐에서의 바이러스 역가와 조직병리학적 변화를 도 5에 나타냈다. B 백신 접종 모둠에서 비접종 대조 모둠(3.7 x 107)에 비해 눈에 띄게 바이러스 역가가 낮았다(2.1 x 104). 또한, A 백신 접종 모둠에서도 비접종 대조 모둠에 비해 낮은 바이러스 역가를 보였다(9.2 x 105).
세 모둠에서 전체적인 조직병리학적 점수는 통계적으로 유의한 차이를 보이지 않았다(도 5D). 그러나 폐 부종의 경우 A 백신 접종한 마우스 모둠에서 B 백신접종 모둠이나 비접종 모둠에 비해 부종이 심했고, B 백신 접종 모둠에서 부종 점수가 가장 낮았다(도 5B). 또한, B 백신 접종 모둠의 마우스 5마리 중 2 마리는 세 모둠의 전체 15 마리의 마우스 중 조직병리학 점수가 가장 낮았다(도 5D, 오른쪽). 이러한 정량적인 조직병리학적 점수는 마우스 폐를 분석한 사진에서도 확인된다(도 5E). 폐의 육아종이 비접종 모둠에서 가장 많이 형성되었고, 그 다음 A 백신 접종 모둠인데 비해, B 백신 접종 모둠에는 가장 적게 형성되었다. 종합해보면, B 백신이 가장 바이러스 역가가 낮고 조직병리학적 점수가 낮아(즉, 증세가 경미하여) 가장 유망한 백신임을 추정할 수 있다.
3.4 SARS-CoV-2 감염 후 백신 접종/비접종 모둠에서의 폐 이외의 장기의 조직병리학적 변화
백신을 맞은 경우 폐 이외에, 감염이 다른 장기에 퍼지는 정도를 확인하기 위해 본 발명자들은 비장과 소장에서의 조직병리학적 변화를 확인했다(도 6 및 도 7). 세 모둠의 비장의 병리적 변화는 도 7에 나타냈고, 간, 비장, 우/좌 신장 및 폐의 중량 변화는 도 8에 나타냈다.
체중 대비 비장의 무게는 백신 접종 모둠에서 비접종 모둠에 비해 유의적으로 높았다(A 백신: * p = 0.025, B 백신: * p = 0.042)(도 6A). 비장은 감염 상태일 때 감염에 대응하기 위해 면역 세포가 증식하고 분화하기 때문에 커지는 경향을 보인다. 지금까지, 감염 또는 손상 후의 중증도는 비장의 증대보다는 백색속질 위축으로 평가했다. 비장 백색 속질의 위축 병변이 A 백신 접종 모둠에서는 증가했지만 B 백신 접종 모둠과 비접종 모둠에서는 유의적 차이가 없었다(도 6B 및 6C).
또한 소장의 술잔세포도 면역에 관여하는 세포로서 이 세포의 수가 증가하는 것은 병세가 악화됨을 나타내고 그 경우 점액이 과분비된다. 도 7에서 볼 수 있는 바와 같이 B 백신 접종 모둠에서 융모 내의 술잔세포의 수가 유의하게 낮았고(* p = 0.027), 세 모둠 중에서 소장 상태가 가장 건강함을 나타낸다.
실시예 4-백신 접종 후 생성 항원
본 발명에서는 SARS-CoV-2의 S 단백질의 여러 부분을 백신 항원으로서 적합한지 확인하기 위해 중화항체와의 결합능을 평가했다. 그렇게 선택된 4개의 항원으로 백신을 제작하였고, 항원 1 내지 항원 4를 모두 혼합한 B 백신이 전반적으로 SARS-CoV-2에 대한 예방 백신으로서 두드러진 효과를 나타냈다.
또한 양 백신 접종 모둠에서의 항체 형성을 평가해 본 결과 B 백신 접종 모둠에서 항원 4에 대한 항체가 두드러졌다. 항원 1만을 포함하는 A 백신 접종 모둠에서는 항원 1에 대한 항체가 나타났는데, 놀랍게도 항원 3과도 교차반응을 보였다. 그에 비해 항원 3을 포함하고 있는 B 백신 접종 모둠에서는 Ag3에 대한 항체를 발달시키지 않았다. 이러한 결과는 항원을 혼합할 때 일부 항원이 다른 것에 비해 면역 시스템에서 두드러지게 감지된다는 것을 나타낸다.
서열목록 전자파일 첨부

Claims (10)

  1. 서열번호 1 내지 서열번호 4의 폴리펩타이드 중 적어도 하나의 폴리펩타이드를 포함하는 SARS-CoV-2 감염을 예방 및/또는 완화하기 위한 COVID-19 백신 조성물.
  2. 제 1 항에 있어서, 서열번호 4의 폴리펩타이드를 포함하는 것인 백신 조성물.
  3. 제 1 항에 있어서, 서열번호 1 내지 서열번호 4의 폴리펩타이드를 모두 포함하는 것인 백신 조성물.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 프로인드 완전 아쥬번트, 프로인드 불완전 아쥬번트, 스쿠알렌 기반 아쥬번트, 광물 기반 아쥬번트, 식물 기반 아쥬번트, 합성 DNA 기반 아쥬번트, 미립자 단백질 아쥬번트로 구성되는 모둠에서 선택되는 아쥬번트를 더 포함하는 것인 백신 조성물.
  5. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 주사용 증류수, 등장 염화나트륨 주사액, 링겔 주사액, 덱스트로스 주사액, 하트만 주사액, 참기름, 콩기름, 면실유, PEG, 에탄올, 프로필렌글리콜, 안식향산나트륨, 살리실산나트륨, 초산나트륨, 트윈류, 프로필렌글리콜, 초산 및 그의 염, 암모니아, 초산 암모니아, 알부민, 치메로살, EDTA, 포도당, 염산프로카인으로 구성되는 모둠에서 선택되는 약학적으로 허용가능한 첨가제를 더 포함하는 것인 백신 조성물.
  6. 서열번호 1 내지 서열번호 4 중 어느 하나의 폴리펩타이드로 구성되는 단백질을 포함하는 COVID-19 백신용 항원.
  7. 서열번호 1 내지 서열번호 4 중 어느 하나의 폴리펩타이드를 인코딩하는 유전자를 포함하는 뉴클레오타이드.
  8. 서열번호 1 내지 서열번호 4 중 어느 하나의 폴리펩타이드를 인코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터.
  9. 서열번호 1 내지 서열번호 4 중 어느 하나의 폴리펩타이드를 발현하도록 형질전환된 숙주세포.
  10. 제 9 항에 있어서, 상기 숙주세포는 대장균인 숙주세포.
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