KR20240121820A - 이형이량체 릴랙신 융합체를 이용한 치료 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 특히 폐고혈압을 동반한 심부전 치료를 위한, 이형이량체 릴랙신 융합체 폴리펩티드의 용도에 관한 것이다.
Description
본 발명은 이형이량체 릴랙신 융합체를 이용한 치료 방법에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 릴랙신-2 융합체를 이용한 치료 방법에 관한 것이다.
릴랙신은 인슐린 슈퍼패밀리에 속하는 펩티드 호르몬이다. 인간에서, 릴랙신 펩티드 패밀리는 구조적 유사성은 높지만, 서열 유사성은 낮은 7가지 펩티드를 포함한다: 릴랙신 1, 2 및 3, 및 인슐린-유사 펩티드 INSL3, INSL4, INSL5 및 INSL6. 천연 유래 릴랙신은 2개의 쇄간 이황화결합에 의해 공유적으로 연결된 A 및 B 폴리펩티드쇄로 이루어진다. A 쇄는 추가적인 쇄내 이황화결합을 갖는다. 릴랙신 유전자는 구조 B-C-A를 갖는 프로호르몬을 암호화한다(C 펩티드에 의해 연결되는 B 및 A 폴리펩티드 쇄). 프로호르몬은 성숙 릴랙신의 분비 전에 C 펩티드를 제거하기 위해 PC1 및 PC2 효소에 의한 단백질 분해(endoproteolytic) 절단을 겪는다.
릴랙신은 임신 중 전신 혈류역학 및 신장 적응 변화를 매개하는 것으로 알려진 다면발현성 호르몬이다. 릴랙신은 또한 항섬유화 특성을 갖고 있으며, 예를 들어 급성 비대상성 심부전(ADHF)과 같은 심부전에 유익한 효과가 있는 것으로 나타났다. 심부전은 상당한 이환율 및 사망률과 관련이 있다. 이는 증가된 심근세포 사멸 및 간질 섬유증을 수반하는 복잡한 조직 리모델링을 특징으로 한다. 릴랙신은 허혈-재관류 및 심부전 상황에 유익한 것으로 밝혀진 여러 신호전달 캐스케이드를 활성화시킨다. 이들 신호전달 경로는 포스포이노시티드 3-키나제 경로의 활성화 및 산화질소 신호전달 경로의 활성화를 포함한다(Bathgate RA et al. (2013) Physiol. Rev. 93(1): 405-480; Mentz RJ et al. (2013) Am. Heart J. 165(2): 193-199; Tietjens J et al. (2016) Heart 102: 95-99; Wilson SS et al. (2015) Pharmacology 35: 315-327).
심부전 환자에서, 상당한 하위 집단이 폐고혈압(HF+PH 환자)도 앓고 있다. 박출률 보존 심부전 환자의 약 50%는 또한 폐고혈압을 앓고 있으며, 박출률 감소 심부전 환자의 60%까지 증가하는 것으로 추정되었다(Guazzi, (2014) Circ Heart Fail., 7:367-377; Miller et al., (2013) JACC Heart Fail., 1(4):290-299). 폐고혈압을 동반한 심부전을 앓고 있는 환자는 폐고혈압이 없는 심부전 환자에 비해 생존율이 감소한 것으로 나타났다(Barnett and De Marco, (2012) Heart Fail. Clin. 8: 447-459). 심부전 환자에서, 예상 폐동맥 확장기압(ePAD)이 3 mmHg 증가 또는 감소하면(평균 폐동맥압(mPAP)이 약 4 mmHg 증가 또는 감소하는 것과 동일) 심혈관 사망률에서 각각 24%의 증가 또는 19%의 감소와 관련이 있었다(Zile MR, et al. (2017) Circ Heart Fail., 10:e003594). mPAP의 4 mmHg의 감소는 심부전 및 폐고혈압을 앓는 환자에서 호흡곤란 개선과도 관련이 있다(Solomonica A, et al. (2013) Circ Heart Fail., 6:53-60).
변형되지 않은 재조합 인간 릴랙신-2, 세레락신(serelaxin)을 사용하여 임상 시험이 수행된 바 있다. 입원 환자에 대한 세레락신의 지속적 투여는 심장, 신장 및 간 손상 및 울혈의 마커를 개선시켰다(Felker GM et al. (2014) J. Am. Coll. Cardiol. 64(15): 1591-1598; Metra M et al. (2013) J. Am. Coll. Cardiol. 61(2): 196-206; Teerlink JR et al. (2013) Lancet 381(9860): 29-39). 세레락신은 또한 대략 20시간 연속 주입을 통해 이들 환자에서 폐동맥 압력과 심박출량, 전신 및 폐혈관 저항의 개선을 입증했다(Ponikowski et al., (2014) European Heart Journal 35:431-441). 그러나, 환자의 순환계로부터 세레락신이 빠르게 제거됨으로 인해 치료 효과가 제한되었고, 긍정적 효과는 정맥 주사가 중단되면 빠르게 사라졌다. 또한, 환자의 약 1/3이 세레락신의 정맥내 투여 후 유의미한 혈압 강하(>40 mm Hg)를 경험했으며, 그 결과 용량을 절반 이상 줄여야 했다.
WO 2013/004607 및 WO 2018/138170은 릴랙신 A 및 릴랙신 B가 링커 펩티드에 의해 단일 쇄로 융합되는 재조합 릴랙신 폴리펩티드를 기재한다. WO2013/004607은 적어도 5개의 아미노산 및 15개 미만의 아미노산의 링커 펩티드를 갖는 재조합 릴랙신을 기재한다. WO 2018/138170은 적어도 15개의 아미노산의 링커 펩티드를 갖는 재조합 릴랙신을 기재한다.
지금까지 비변형 재조합 릴랙신에 의해 수행된 유망한 임상 연구를 고려하면, 릴랙신 생물학적 활성을 보유하며 장기간의 반감기, 편리한 투여 경로 및 편리한 투약과 같은 이점을 제공하는 추가적인 재조합 릴랙신에 대한 요구가 남아있다.
본 발명은 폐고혈압을 동반한 심부전(HF+PH)을 앓고 있는 대상체의 치료에서 릴랙신 활성을 갖는 이형이량체 융합체의 용도에 관한 것이다. 특히 HF+PH 대상체의 치료는 여전히 충족되지 않은 중요한 요구 사항으로 남아 있다.
따라서, 일 양상에서, 본 발명은 폐고혈압을 동반한 심부전이 있는 대상체를 치료하는 방법을 제공하며, 방법은 대상체에게 유효량의 이형이량체 융합체를 투여하는 단계를 포함하고, 이형이량체 융합체는
(i) 적어도 하나의 릴랙신 A 쇄 폴리펩티드 또는 이의 변이체에 연결된 제1 이형이량체화 도메인; 및
(ii) 적어도 하나의 릴랙신 B 쇄 폴리펩티드 또는 이의 변이체에 연결된 제2 이형이량체화 도메인을 포함하고,
제1 이형이량체화 도메인은 제2 이형이량체화 도메인과 이형이량체화하고, 이형이량체 융합체는 릴랙신 활성을 갖는다.
유사하게, 본 발명은 폐고혈압을 동반한 심부전이 있는 대상체를 치료하는 데 사용하기 위한 이형이량체 융합체를 제공하며, 이형이량체 융합체는
(i) 적어도 하나의 릴랙신 A 쇄 폴리펩티드 또는 이의 변이체에 연결된 제1 이형이량체화 도메인; 및
(ii) 적어도 하나의 릴랙신 B 쇄 폴리펩티드 또는 이의 변이체에 연결된 제2 이형이량체화 도메인을 포함하고,
제1 이형이량체화 도메인은 제2 이형이량체화 도메인과 이형이량체화하고, 이형이량체 융합체는 릴랙신 활성을 갖는다.
유사하게, 본 발명은 폐고혈압을 동반한 심부전이 있는 대상체를 치료하기 위한 의약의 제조에 있어서 이형이량체 융합체의 용도를 제공하며, 이형이량체 융합체는
(i) 적어도 하나의 릴랙신 A 쇄 폴리펩티드 또는 이의 변이체에 연결된 제1 이형이량체화 도메인; 및
(ii) 적어도 하나의 릴랙신 B 쇄 폴리펩티드 또는 이의 변이체에 연결된 제2 이형이량체화 도메인을 포함하고,
제1 이형이량체화 도메인은 제2 이형이량체화 도메인과 이형이량체화하고, 이형이량체 융합체는 릴랙신 활성을 갖는다.
일부 실시형태에서, 이형이량체 융합체의 릴랙신 A 쇄 및 릴랙신 B 쇄는 하나 이상(예를 들어, 2개)의 쇄간 결합, 바람직하게는 하나 이상(예를 들어, 2개)의 쇄간 이황화결합에 의해 공유 결합된다. 일부 실시형태에서, 릴랙신 A 쇄 및 릴랙신 B 쇄는 서로 아미노산 링커에 의해 공유적으로 연결되지 않는다.
일부 실시형태에서, 릴랙신 A 쇄는 릴랙신-2 A 쇄이고, 릴랙신 B 쇄는 릴랙신-2 B 쇄이다.
바람직한 실시형태에서, 제1 및 제2 이형이량체화 도메인은 면역글로불린 Fc 영역, 예를 들어, 면역글로불린 G (IgG) Fc 영역("제1 Fc 영역" 및 "제2 Fc 영역")으로부터 유래된다. 제1 및 제2 Fc 영역은 불변 도메인 CH2 및/또는 CH3을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 제1 및 제2 Fc 영역은 CH2 및 CH3을 포함한다.
대안의 실시형태에서, 제1 및 제2 이형이량체화 도메인은 면역글로불린 Fab 영역으로부터 유래된다.
또한 추가 대안의 실시형태에서, 제1 및 제2 이형이량체화 도메인은 이형이량체화되어 평행한 코일드 코일(coiled coil)을 형성한다.
일부 실시형태에서, 릴랙신 A 쇄는 커넥터를 통해 제1 이형이량체화 도메인(예를 들어, 제1 Fc 영역)에 연결되고, 릴랙신 B 쇄는 커넥터를 통해 제2 이형이량체화 도메인(예를 들어, 제2 Fc 영역)에 연결된다. 바람직한 실시형태에서, 커넥터 하나 또는 바람직하게는 둘 다는 폴리펩티드이다.
일부 실시형태에서, 적어도 하나의 커넥터는 6 내지 40개 아미노산 길이를 갖는 폴리펩티드이다. 바람직하게는, 커넥터 둘 다 6 내지 40개의 아미노산 길이를 갖는 폴리펩티드이다. 바람직한 실시형태에서, 적어도 하나의 커넥터는 21개의 아미노산 길이를 갖는 폴리펩티드이다. 특히 바람직한 실시형태에서, 커넥터 둘 다 21개의 아미노산 길이를 갖는 폴리펩티드이다. 특정 실시형태에서, 커넥터 둘 다 서열 GGGGSGGGGSGGGGSGGGGGS [서열번호 5]을 갖는다.
바람직한 실시형태에서, 제1 이형이량체화 도메인(예를 들어, 제1 Fc 영역)의 C-말단은 릴랙신 A 쇄의 N-말단에 연결되고, 제2 이형이량체화 도메인(예를 들어, 제2 Fc 영역)의 C-말단은 릴랙신 B 쇄의 N-말단에 연결된다. 대안의 실시형태에서, 제1 이형이량체화 도메인(예를 들어, 제1 Fc 영역)의 N-말단은 릴랙신 A 쇄의 C-말단에 연결되고, 제2 이형이량체화 도메인(예를 들어, 제2 Fc 영역)의 N-말단은 릴랙신 B 쇄의 C-말단에 연결된다.
일부 실시형태에서, 제1 및 제2 이형이량체화 도메인(예를 들어, 제1 및 제2 Fc 영역)은 이형이량체화-촉진 아미노산 돌연변이 및/또는 변형, 바람직하게는 비대칭 이형이량체화-촉진 아미노산 돌연변이 및/또는 변형을 포함한다. 바람직한 실시형태에서, 이형이량체화-촉진 아미노산 돌연변이는 "Fc 노브(Knob)" 및 "Fc 홀(Hole)" 돌연변이이다. 특히 바람직한 실시형태에서, "Fc 노브" 및 "Fc 홀" 돌연변이는 CH3 도메인에 존재한다. 바람직한 실시형태에서, 제1 Fc 영역은 "Fc 노브" 돌연변이를 포함하고, 제2 Fc 영역은 "Fc 홀" 돌연변이를 포함한다. 대안적으로, 제1 Fc 영역은 "Fc 홀" 돌연변이를 갖고, 제2 Fc 영역은 "Fc 노브" 돌연변이를 갖는다. 바람직하게는, 이형이량체화-촉진 아미노산 돌연변이는 하나의 CH3 도메인에서의 "Fc 홀" 돌연변이 Y349C, T366S, L368A 및 Y407V 또는 이들의 보존적 치환; 및 다른 CH3 도메인에서의 "Fc 노브" 돌연변이 S354C 및 T366W, 또는 이들의 보존적 치환을 포함하되, 아미노산 넘버링은 Kabat에서와 같이 EU 지표에 따른다.
본 발명의 임의의 양상의 실시형태에서, 릴랙신-2 A 쇄 폴리펩티드는 서열번호 1에 제시된 바와 같은 서열 또는 이의 변이체를 포함하고, 릴랙신-2 B 쇄 폴리펩티드는 서열번호 2에 제시된 바와 같은 서열 또는 이의 변이체를 포함한다. 일부 실시형태에서, 릴랙신-2 A 쇄 폴리펩티드는 아미노산 돌연변이 K9H, K17M 또는 K17I, 바람직하게는 K9H를 포함한다.
또한, 폐고혈압을 동반한 심부전이 있는 대상체를 치료하는 방법이 본 발명에 의해 제공되며, 방법은 대상체에게 유효량의 이형이량체 융합체를 투여하는 단계를 포함하고, 이형이량체 융합체는
(i) FcX-con-A 융합체 폴리펩티드; 및
(ii) FcY-con-B 융합체 폴리펩티드를 포함하고,
여기서,
A는 릴랙신 A 쇄 또는 이의 변이체, 예를 들어, 릴랙신-2 A 쇄 또는 이의 변이체이고;
B는 릴랙신 B 쇄 또는 이의 변이체, 예를 들어, 릴랙신-2 B 쇄 또는 이의 변이체이고;
FcY는 "Fc 홀" 아미노산 돌연변이 및/또는 변형을 갖고, 바람직하게는 아미노산 돌연변이 Y349C:T366S:L368A:Y407V 또는 이들의 보존적 치환을 갖는 CH3 도메인을 포함하는 면역글로불린(예를 들어, IgG1) Fc 영역이고;
FcX는 "Fc 노브" 아미노산 돌연변이 및/또는 변형을 갖고, 바람직하게는 아미노산 돌연변이 S354C:T366W 또는 이들의 보존적 치환을 갖는 CH3 도메인을 포함하는 면역글로불린(예를 들어, IgG1) Fc 영역이며;
con은 커넥터, 예를 들어, 바람직하게는 서열 GGGGSGGGGSGGGGSGGGGGS [서열번호 5]를 갖는 커넥터 폴리펩티드이되,
아미노산 넘버링은 Kabat에서와 같이 EU 지표에 따르며, FcX는 FcY와 이형이량체화하고, 이형이량체 융합체는 릴랙신 활성을 갖는다.
유사하게, 본 발명은 폐고혈압을 동반한 심부전이 있는 대상체를 치료하는 방법에 사용하기 위한 이형이량체 융합체를 제공하며, 이형이량체 융합체는
(i) FcX-con-A 융합체 폴리펩티드; 및
(ii) FcY-con-B 융합체 폴리펩티드를 포함하고,
여기서,
A는 릴랙신 A 쇄 또는 이의 변이체, 예를 들어, 릴랙신-2 A 쇄 또는 이의 변이체이고;
B는 릴랙신 B 쇄 또는 이의 변이체, 예를 들어, 릴랙신-2 B 쇄 또는 이의 변이체이고;
FcY는 "Fc 홀" 아미노산 돌연변이 및/또는 변형을 갖고, 바람직하게는 아미노산 돌연변이 Y349C:T366S:L368A:Y407V 또는 이들의 보존적 치환을 갖는 CH3 도메인을 포함하는 면역글로불린(예를 들어, IgG1) Fc 영역이고;
FcX는 "Fc 노브" 아미노산 돌연변이 및/또는 변형을 갖고, 바람직하게는 아미노산 돌연변이 S354C:T366W 또는 이들의 보존적 치환을 갖는 CH3 도메인을 포함하는 면역글로불린(예를 들어, IgG1) Fc 영역이며;
con은 커넥터, 예를 들어, 바람직하게는 서열 GGGGSGGGGSGGGGSGGGGGS [서열번호 5]를 갖는 커넥터 폴리펩티드이되,
아미노산 넘버링은 Kabat에서와 같이 EU 지표에 따르며, FcX는 FcY와 이형이량체화하고, 이형이량체 융합체는 릴랙신 활성을 갖는다.
유사하게, 본 발명은 폐고혈압을 동반한 심부전이 있는 대상체를 치료하기 위한 의약의 제조에 있어서 이형이량체 융합체의 용도를 제공하며, 이형이량체 융합체는
(i) FcX-con-A 융합체 폴리펩티드; 및
(ii) FcY-con-B 융합체 폴리펩티드를 포함하고,
여기서,
A는 릴랙신 A 쇄 또는 이의 변이체, 예를 들어, 릴랙신-2 A 쇄 또는 이의 변이체이고;
B는 릴랙신 B 쇄 또는 이의 변이체, 예를 들어, 릴랙신-2 B 쇄 또는 이의 변이체이고;
FcY는 "Fc 홀" 아미노산 돌연변이 및/또는 변형을 갖고, 바람직하게는 아미노산 돌연변이 Y349C:T366S:L368A:Y407V 또는 이들의 보존적 치환을 갖는 CH3 도메인을 포함하는 면역글로불린(예를 들어, IgG1) Fc 영역이고;
FcX는 "Fc 노브" 아미노산 돌연변이 및/또는 변형을 갖고, 바람직하게는 아미노산 돌연변이 S354C:T366W 또는 이들의 보존적 치환을 갖는 CH3 도메인을 포함하는 면역글로불린(예를 들어, IgG1) Fc 영역이며;
con은 커넥터, 예를 들어, 바람직하게는 서열 GGGGSGGGGSGGGGSGGGGGS [서열번호 5]를 갖는 커넥터 폴리펩티드이되,
아미노산 넘버링은 Kabat에서와 같이 EU 지표에 따르며, FcX는 FcY와 이형이량체화하고, 이형이량체 융합체는 릴랙신 활성을 갖는다.
특히 바람직한 실시형태에서, 이형이량체 융합체는 서열번호 11의 아미노산 서열을 갖는 융합체 폴리펩티드 및 서열번호 20의 아미노산 서열을 갖는 융합체 폴리펩티드를 포함한다.
본 발명의 임의의 양상의 일부 실시형태에서, 이형이량체 융합체는 하나 이상의 Fab를 추가로 포함하되, 선택적으로 이형이량체 융합체는 제1 이형이량체화 도메인(예를 들어, 제1 Fc 영역)의 N-말단에 연결된 하나의 Fab 및 제2 이형이량체화 도메인(예를 들어, 제2 Fc 영역)의 N-말단에 연결된 제2 Fab를 포함한다.
본 발명의 임의의 양상의 일부 실시형태에서, 이형이량체 융합체는 제1 이형이량체화 도메인(예를 들어, 제1 Fc 영역)의 N-말단에 연결된 제2 릴랙신 A 쇄 폴리펩티드 또는 이의 변이체 및 제2 이형이량체화 도메인(예를 들어, 제2 Fc 영역)의 N-말단에 연결된 제2 릴랙신 B 쇄 폴리펩티드 또는 이의 변이체를 추가로 포함하되, 선택적으로 제2 릴랙신 A 쇄는 커넥터 폴리펩티드를 통해 제1 이형이량체화 도메인(예를 들어, 제1 Fc 영역)에 연결되고, 제2 릴랙신 B 쇄는 커넥터 폴리펩티드를 통해 제2 이형이량체화 도메인(예를 들어, 제2 Fc 영역)에 연결된다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 폐고혈압을 동반한 심부전이 있는 대상체를 치료하는 방법을 제공하며, 방법은 대상체에게 유효량의 이형이량체 융합체를 투여하는 단계를 포함하고, 이형이량체 융합체는
(i) FcX-B-L-A 및 FcY, 선택적으로 FcY-B-L-A; 또는
(ii) FcY-B-L-A 및 FcX, 선택적으로 FcX-B-L-A를 포함하고,
여기서,
FcY는 "Fc 홀" 아미노산 돌연변이 및/또는 변형을 갖고, 바람직하게는 아미노산 돌연변이 Y349C:T366S:L368A:Y407V 또는 이들의 보존적 치환을 갖는 CH3 도메인을 포함하는 면역글로불린(예를 들어, IgG1) Fc 영역이고;
FcX는 "Fc 노브" 아미노산 돌연변이 및/또는 변형을 갖고, 바람직하게는 아미노산 돌연변이 S354C:T366W 또는 이들의 보존적 치환을 갖는 CH3 도메인을 포함하는 면역글로불린(예를 들어, IgG1) Fc 영역이며;
B는 릴랙신 B 쇄 또는 이의 변이체, 예를 들어, 릴랙신-2 B 쇄 또는 이의 변이체이고;
A는 릴랙신 A 쇄 또는 이의 변이체, 예를 들어, 릴랙신-2 A 쇄 또는 이의 변이체이고;
L은 바람직하게는 아미노산 서열 GGGSGGGSGG[서열번호 60]를 갖는 링커 폴리펩티드이며,
아미노산 넘버링은 Kabat에서와 같이 EU 지표에 따르며, FcX는 FcY와 이형이량체화하고, 이형이량체 융합체는 릴랙신 활성을 갖는다. 대안적으로, FcX 및 FcY는 본원에 기재된 바와 같은 비-Fc 이형이량체화 도메인이다. 일부 실시형태에서, 릴랙신 B 쇄는 커넥터, 선택적으로 6 내지 40개의 아미노산 길이, 예를 들어, 21개의 아미노산 길이를 갖는 커넥터 폴리펩티드를 통해 FcX 및/또는 FcY에 연결된다.
유사하게, 본 발명은 폐고혈압을 동반한 심부전이 있는 대상체를 치료하는 방법에 사용하기 위한 이형이량체 융합체를 제공하며, 이형이량체 융합체는
(i) FcX-B-L-A 및 FcY, 선택적으로 FcY-B-L-A; 또는
(ii) FcY-B-L-A 및 FcX, 선택적으로 FcX-B-L-A를 포함하고,
여기서,
FcY는 "Fc 홀" 아미노산 돌연변이 및/또는 변형을 갖고, 바람직하게는 아미노산 돌연변이 Y349C:T366S:L368A:Y407V 또는 이들의 보존적 치환을 갖는 CH3 도메인을 포함하는 면역글로불린(예를 들어, IgG1) Fc 영역이고;
FcX는 "Fc 노브" 아미노산 돌연변이 및/또는 변형을 갖고, 바람직하게는 아미노산 돌연변이 S354C:T366W 또는 이들의 보존적 치환을 갖는 CH3 도메인을 포함하는 면역글로불린(예를 들어, IgG1) Fc 영역이며;
B는 릴랙신 B 쇄 또는 이의 변이체, 예를 들어, 릴랙신-2 B 쇄 또는 이의 변이체이고;
A는 릴랙신 A 쇄 또는 이의 변이체, 예를 들어, 릴랙신-2 A 쇄 또는 이의 변이체이고;
L은 바람직하게는 아미노산 서열 GGGSGGGSGG[서열번호 60]를 갖는 링커 폴리펩티드이며,
아미노산 넘버링은 Kabat에서와 같이 EU 지표에 따르며, FcX는 FcY와 이형이량체화하고, 이형이량체 융합체는 릴랙신 활성을 갖는다. 대안적으로, FcX 및 FcY는 본원에 기재된 바와 같은 비-Fc 이형이량체화 도메인이다. 일부 실시형태에서, 릴랙신 A 쇄는 커넥터, 선택적으로 6 내지 40개의 아미노산 길이, 예를 들어, 21개의 아미노산 길이를 갖는 커넥터 폴리펩티드를 통해 FcX 및/또는 FcY에 연결된다.
유사하게, 본 발명은 폐고혈압을 동반한 심부전이 있는 대상체를 치료하기 위한 의약의 제조에 있어서 이형이량체 융합체의 용도를 제공하며, 이형이량체 융합체는
(i) FcX-B-L-A 및 FcY, 선택적으로 FcY-B-L-A; 또는
(ii) FcY-B-L-A 및 FcX, 선택적으로 FcX-B-L-A를 포함하고,
여기서,
FcY는 "Fc 홀" 아미노산 돌연변이 및/또는 변형을 갖고, 바람직하게는 아미노산 돌연변이 Y349C:T366S:L368A:Y407V 또는 이들의 보존적 치환을 갖는 CH3 도메인을 포함하는 면역글로불린(예를 들어, IgG1) Fc 영역이고;
FcX는 "Fc 노브" 아미노산 돌연변이 및/또는 변형을 갖고, 바람직하게는 아미노산 돌연변이 S354C:T366W 또는 이들의 보존적 치환을 갖는 CH3 도메인을 포함하는 면역글로불린(예를 들어, IgG1) Fc 영역이며;
B는 릴랙신 B 쇄 또는 이의 변이체, 예를 들어, 릴랙신-2 B 쇄 또는 이의 변이체이고;
A는 릴랙신 A 쇄 또는 이의 변이체, 예를 들어, 릴랙신-2 A 쇄 또는 이의 변이체이고;
L은 바람직하게는 아미노산 서열 GGGSGGGSGG[서열번호 60]를 갖는 링커 폴리펩티드이며,
아미노산 넘버링은 Kabat에서와 같이 EU 지표에 따르며, FcX는 FcY와 이형이량체화하고, 이형이량체 융합체는 릴랙신 활성을 갖는다. 대안적으로, FcX 및 FcY는 본원에 기재된 바와 같은 비-Fc 이형이량체화 도메인이다. 일부 실시형태에서, 릴랙신 A 쇄는 커넥터, 선택적으로 6 내지 40개의 아미노산 길이, 예를 들어, 21개의 아미노산 길이를 갖는 커넥터 폴리펩티드를 통해 FcX 및/또는 FcY에 연결된다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 폐고혈압을 동반한 심부전이 있는 대상체를 치료하는 방법을 제공하며, 방법은 대상체에게 유효량의 이형이량체 융합체를 투여하는 단계를 포함하고, 이형이량체 융합체는
(i) FcX-A-L-B 및 FcY, 선택적으로 FcY-A-L-B; 또는
(ii) FcY-A-L-B 및 FcX, 선택적으로 FcX-A-L-B를 포함하고,
여기서,
FcY는 "Fc 홀" 아미노산 돌연변이 및/또는 변형을 갖고, 바람직하게는 아미노산 돌연변이 Y349C:T366S:L368A:Y407V 또는 이들의 보존적 치환을 갖는 CH3 도메인을 포함하는 면역글로불린(예를 들어, IgG1) Fc 영역이고;
FcX는 "Fc 노브" 아미노산 돌연변이 및/또는 변형을 갖고, 바람직하게는 아미노산 돌연변이 S354C:T366W 또는 이들의 보존적 치환을 갖는 CH3 도메인을 포함하는 면역글로불린(예를 들어, IgG1) Fc 영역이며;
A는 릴랙신 A 쇄 또는 이의 변이체, 예를 들어, 릴랙신-2 A 쇄 또는 이의 변이체이고;
B는 릴랙신 B 쇄 또는 이의 변이체, 예를 들어, 릴랙신-2 B 쇄 또는 이의 변이체이고;
L은 바람직하게는 아미노산 서열 GGGSGGGSGG[서열번호 60]를 갖는 링커 폴리펩티드이며,
아미노산 넘버링은 Kabat에서와 같이 EU 지표에 따르며, FcX는 FcY와 이형이량체화하고, 이형이량체 융합체는 릴랙신 활성을 갖는다. 대안적으로, FcX 및 FcY는 본원에 기재된 바와 같은 비-Fc 이형이량체화 도메인이다. 일부 실시형태에서, 릴랙신 A 쇄는 커넥터, 선택적으로 6 내지 40개의 아미노산 길이, 예를 들어, 21개의 아미노산 길이를 갖는 커넥터 폴리펩티드를 통해 FcX 및/또는 FcY에 연결된다.
유사하게, 본 발명은 폐고혈압을 동반한 심부전이 있는 대상체를 치료하는 방법에 사용하기 위한 이형이량체 융합체를 제공하며, 이형이량체 융합체는
(i) FcX-A-L-B 및 FcY, 선택적으로 FcY-A-L-B; 또는
(ii) FcY-A-L-B 및 FcX, 선택적으로 FcX-A-L-B를 포함하고,
여기서,
FcY는 "Fc 홀" 아미노산 돌연변이 및/또는 변형을 갖고, 바람직하게는 아미노산 돌연변이 Y349C:T366S:L368A:Y407V 또는 이들의 보존적 치환을 갖는 CH3 도메인을 포함하는 면역글로불린(예를 들어, IgG1) Fc 영역이고;
FcX는 "Fc 노브" 아미노산 돌연변이 및/또는 변형을 갖고, 바람직하게는 아미노산 돌연변이 S354C:T366W 또는 이들의 보존적 치환을 갖는 CH3 도메인을 포함하는 면역글로불린(예를 들어, IgG1) Fc 영역이며;
A는 릴랙신 A 쇄 또는 이의 변이체, 예를 들어, 릴랙신-2 A 쇄 또는 이의 변이체이고;
B는 릴랙신 B 쇄 또는 이의 변이체, 예를 들어, 릴랙신-2 B 쇄 또는 이의 변이체이고;
L은 바람직하게는 아미노산 서열 GGGSGGGSGG[서열번호 60]를 갖는 링커 폴리펩티드이며,
아미노산 넘버링은 Kabat에서와 같이 EU 지표에 따르며, FcX는 FcY와 이형이량체화하고, 이형이량체 융합체는 릴랙신 활성을 갖는다. 대안적으로, FcX 및 FcY는 본원에 기재된 바와 같은 비-Fc 이형이량체화 도메인이다. 일부 실시형태에서, 릴랙신 A 쇄는 커넥터, 선택적으로 6 내지 40개의 아미노산 길이, 예를 들어, 21개의 아미노산 길이를 갖는 커넥터 폴리펩티드를 통해 FcX 및/또는 FcY에 연결된다.
유사하게, 본 발명은 폐고혈압을 동반한 심부전이 있는 대상체를 치료하기 위한 의약의 제조에 있어서 이형이량체 융합체의 용도를 제공하며, 이형이량체 융합체는
(i) FcX-A-L-B 및 FcY, 선택적으로 FcY-A-L-B; 또는
(ii) FcY-A-L-B 및 FcX, 선택적으로 FcX-A-L-B를 포함하고,
여기서,
FcY는 "Fc 홀" 아미노산 돌연변이 및/또는 변형을 갖고, 바람직하게는 아미노산 돌연변이 Y349C:T366S:L368A:Y407V 또는 이들의 보존적 치환을 갖는 CH3 도메인을 포함하는 면역글로불린(예를 들어, IgG1) Fc 영역이고;
FcX는 "Fc 노브" 아미노산 돌연변이 및/또는 변형을 갖고, 바람직하게는 아미노산 돌연변이 S354C:T366W 또는 이들의 보존적 치환을 갖는 CH3 도메인을 포함하는 면역글로불린(예를 들어, IgG1) Fc 영역이며;
A는 릴랙신 A 쇄 또는 이의 변이체, 예를 들어, 릴랙신-2 A 쇄 또는 이의 변이체이고;
B는 릴랙신 B 쇄 또는 이의 변이체, 예를 들어, 릴랙신-2 B 쇄 또는 이의 변이체이고;
L은 바람직하게는 아미노산 서열 GGGSGGGSGG[서열번호 60]를 갖는 링커 폴리펩티드이며,
아미노산 넘버링은 Kabat에서와 같이 EU 지표에 따르며, FcX는 FcY와 이형이량체화하고, 이형이량체 융합체는 릴랙신 활성을 갖는다. 대안적으로, FcX 및 FcY는 본원에 기재된 바와 같은 비-Fc 이형이량체화 도메인이다. 일부 실시형태에서, 릴랙신 A 쇄는 커넥터, 선택적으로 6 내지 40개의 아미노산 길이, 예를 들어, 21개의 아미노산 길이를 갖는 커넥터 폴리펩티드를 통해 FcX 및/또는 FcY에 연결된다.
본 발명의 모든 양상에 따르면, 심부전은 박출률 감소 심부전, 중간 범위 박출률 심부전 또는 박출률 보존 심부전일 수 있다.
본 발명의 모든 양상에 따르면, 대상체의 평균 폐동맥압은 약 25 mmHg 이상 및/또는 우심실 수축기압은 약 40 mmHg 이상일 수 있다. 전형적으로, 이는 본 발명의 이형이량체 융합체를 사용한 치료 전이다.
본 발명의 모든 양상에 따르면, 대상체는 3.0 우드 단위(wood unit) 미만의 폐혈관 저항을 가질 수 있다. 대안적으로, 대상체는 3.0 이상의 우드 단위의 폐혈관 저항을 가질 수 있다. 전형적으로, 이는 본 발명의 이형이량체 융합체를 사용한 치료 전이다.
본 발명의 모든 양상에 따르면, 대상체는 혈압 모니터링 장치, 바람직하게는 폐동맥 압력 모니터링 장치가 장착되어 있을 수 있다. 바람직하게는, 폐동맥 압력 모니터링 장치는 CardioMEMS 압력 모니터링 장치이다.
본 발명의 임의의 양상의 일부 실시형태에서, 참조 릴랙신 단백질의 릴랙신 활성에 대한 이형이량체 융합체의 릴랙신 활성의 비율은 약 0.001 내지 약 10이다.
본 발명의 모든 양상에 따르면, 이형이량체 융합체는 본 발명의 이형이량체 융합체를 포함하는 약제학적 조성물로서 투여될 수 있다.
본 발명의 이형이량체 융합체를 암호화하는 핵산 분자(예를 들어, DNA 분자), 핵산 분자를 포함하는 벡터, 벡터 또는 핵산을 포함하는 숙주 세포, 및 숙주 세포를 배양하고 융합체 단백질을 수집함으로써 본 발명의 이형이량체 융합체를 생산하는 방법이 또한 본원에 기재된다.
본 발명의 양상 및 실시형태는 첨부된 청구범위에 기재되어 있다. 본 발명의 이들 및 다른 양상 및 실시형태가 또한 본원에 기재된다.
도 1은 본 발명의 일부 실시형태에 따른 이형이량체 융합체의 예시적인 형식을 나타낸다. 이형이량체 융합체의 각각의 융합체 폴리펩티드의 형식이 FcX, FcY, A, B, con 및 L에 관해 주어지되, FcX("Fc 노브") 및 FcY("Fc 홀")는 이형이량체화-촉진 아미노산 돌연변이 및/또는 변형을 포함하는 2개의 Fc 영역이고; A("Rlx A") 및 B("Rlx B")는 릴랙신 A 쇄 및 릴랙신 B 쇄 폴리펩티드이며; "con"은 커넥터 폴리펩티드이고; L은 링커 폴리펩티드, HC X 및 HC Y - 항체의 중쇄, LC - 항체의 경쇄, 힌지 - 항체의 힌지 영역 및 Fab는 항체의 Fab 단편이다.
도 2는 RELAX0019 및 RELAX0023의 LC-MS 분석 A) 무손상(intact) 분자의 질량을 나타내는 RELAX0019 및 RELAX0023 탈글리코실화 및 비환원 분석 B) 개개 Fc-융합 쇄 - 노브 릴랙신 쇄 A 및 홀 릴랙신 쇄 B의 질량을 나타내는 RELAX0019 및 RELAX0023 탈글리코실화 및 환원 분석을 나타낸다.
도 3은 LC-MS를 이용하는 비환원 펩티드 매핑에 의한 RELAX0019 및 RELAX0023의 C-말단 펩티드 분석을 나타낸다. 선으로 나타낸 예측된 이황화결합을 갖는 C-말단 펩티드의 아미노산 서열을 상단 패널에 나타낸다. 패널 A 및 E - 환원제의 부재 하(-DTT)의 C-말단 펩티드의 추출 이온 크로마토그램. 패널 C 및 G - 환원제의 부재 하의 C-말단 펩티드의 디콘볼루션된(deconvoluted) 질량 스펙트럼. 패널 B 및 F - 환원제의 존재 하(+DTT)의 추출된 이온 크로마토그램 및 패널 D 및 H - 환원제의 존재 하의 디콘볼루션된 질량 스펙트럼. 도 3은 나타낸 순서대로 각각 서열번호 75, 77 및 76이 개시되어 있다.
도 4는 재조합 인간 RXFP1을 발현시키는 세포에서의 cAMP 유도에 의해 측정된 본 발명의 일부 이형이량체 융합체의 시험관내 생물학적 활성을 나타낸다.
도 5는 본 발명의 이형이량체 융합체가 마우스에게 정맥내로 투여된 일련의 ELISA 실험으로부터의 생체내 약물동태학(PK) 프로파일을 나타낸다. 데이터를 5분 시점(T1)에 cMax%로서 정규화시킨다.
도 6은 RELAX0019 및 RELAX0023으로 처리한 마우스에서의 이소프로테레놀-유발 심장 섬유증 및 비대의 반전을 나타낸다. (1) 비히클(기준선), (2) 이소프로테레놀, (3) 이소프로테레놀 + 릴랙신-2, (4) 이소프로테레놀 + RELAX0019 및 (5) 이소프로테레놀 + RELAX0023에 대한 섬유증 및 비대 수준을 나타낸다.
도 7은 바큘로바이러스(BV) ELISA 분석에서의 본 발명의 이형이량체 융합체의 시험관내 비-특이적 결합을 나타낸다.
도 8은 보관 시 용액 중 RELAX0023, RELAX0127 및 RELAX0128의 순도 손실, 응집 및 단편화 백분율을 나타낸다.
도 9는 환원 LC-MS 분석에 의해 평가되는 시간에 따른 용액 중 RELAX0023, RELAX0127 및 RELAX0128의 안정성을 나타낸다. A) 총 이온 크로마토그램 B) 환원 분자의 질량 스펙트럼
도 10은 정맥내 및 피하 주사 후 사이노몰거스 원숭이에서의 RELAX0023의 PK 프로파일을 나타낸다.
도 11은 본 발명의 폴리펩티드의 일부를 암호화하는 뉴클레오티드 서열(나타낸 순서대로 각각 서열번호 80 내지 140)을 나타낸다.
도 12는 심부전 및 좌심실 박출률(LVEF) 감소가 있는 사이노몰거스 원숭이(Macaca fascicularis)에서 RELAX0023의 만성 효능 연구 결과를 보여준다. LVEF, 심박수(HR) 및 평균 동맥압(MAP)에 대한 RELAX0023의 효과는 20주 동안 상대적 저용량, 중간 용량 또는 고용량의 RELAX0023 또는 비히클 대조군으로 치료하고 관찰 기간이 있었던 상기 원숭이에서 각각 (A), (B) 및 (C)에 제시되어 있다. 각 데이터 포인트는 그룹의 평균 값을 나타낸다(치료 그룹의 경우 n=8, 비히클 그룹의 경우 n=14). (A), (B) 및 (C) 각각의 x축은 치료 기간 시작으로부터의 주 수를 나타낸다.
도 13a 내지 도 13f는 RELAX0023 투여 후 MAD 코호트에서의 심장 기능, 전신 혈관 저항 및 기관 관류를 보여준다. 도 6a는 HFpEF 대상체에서의 박출률(EF)을 보여준다. 도 6b는 HFrEF 대상체에서의 EF를 보여준다. 도 6c는 통합된 대상체에서의 심박출량을 보여준다. 도 6d는 통합된 대상체에서의 전신 혈관 저항(SVR)을 보여준다. 도 6e는 통합된 대상체에서의 일회박출량(stroke volume, SV)을 보여준다. 도 6f는 통합된 대상체에서의 추정 사구체 여과율(eGFR)을 보여준다. HFpEF = 박출률 보존 심부전. HFrEF = 박출률 감소 심부전. 위약과 비교하여 유의미함(p<0.1).
[표 1]
도 2는 RELAX0019 및 RELAX0023의 LC-MS 분석 A) 무손상(intact) 분자의 질량을 나타내는 RELAX0019 및 RELAX0023 탈글리코실화 및 비환원 분석 B) 개개 Fc-융합 쇄 - 노브 릴랙신 쇄 A 및 홀 릴랙신 쇄 B의 질량을 나타내는 RELAX0019 및 RELAX0023 탈글리코실화 및 환원 분석을 나타낸다.
도 3은 LC-MS를 이용하는 비환원 펩티드 매핑에 의한 RELAX0019 및 RELAX0023의 C-말단 펩티드 분석을 나타낸다. 선으로 나타낸 예측된 이황화결합을 갖는 C-말단 펩티드의 아미노산 서열을 상단 패널에 나타낸다. 패널 A 및 E - 환원제의 부재 하(-DTT)의 C-말단 펩티드의 추출 이온 크로마토그램. 패널 C 및 G - 환원제의 부재 하의 C-말단 펩티드의 디콘볼루션된(deconvoluted) 질량 스펙트럼. 패널 B 및 F - 환원제의 존재 하(+DTT)의 추출된 이온 크로마토그램 및 패널 D 및 H - 환원제의 존재 하의 디콘볼루션된 질량 스펙트럼. 도 3은 나타낸 순서대로 각각 서열번호 75, 77 및 76이 개시되어 있다.
도 4는 재조합 인간 RXFP1을 발현시키는 세포에서의 cAMP 유도에 의해 측정된 본 발명의 일부 이형이량체 융합체의 시험관내 생물학적 활성을 나타낸다.
도 5는 본 발명의 이형이량체 융합체가 마우스에게 정맥내로 투여된 일련의 ELISA 실험으로부터의 생체내 약물동태학(PK) 프로파일을 나타낸다. 데이터를 5분 시점(T1)에 cMax%로서 정규화시킨다.
도 6은 RELAX0019 및 RELAX0023으로 처리한 마우스에서의 이소프로테레놀-유발 심장 섬유증 및 비대의 반전을 나타낸다. (1) 비히클(기준선), (2) 이소프로테레놀, (3) 이소프로테레놀 + 릴랙신-2, (4) 이소프로테레놀 + RELAX0019 및 (5) 이소프로테레놀 + RELAX0023에 대한 섬유증 및 비대 수준을 나타낸다.
도 7은 바큘로바이러스(BV) ELISA 분석에서의 본 발명의 이형이량체 융합체의 시험관내 비-특이적 결합을 나타낸다.
도 8은 보관 시 용액 중 RELAX0023, RELAX0127 및 RELAX0128의 순도 손실, 응집 및 단편화 백분율을 나타낸다.
도 9는 환원 LC-MS 분석에 의해 평가되는 시간에 따른 용액 중 RELAX0023, RELAX0127 및 RELAX0128의 안정성을 나타낸다. A) 총 이온 크로마토그램 B) 환원 분자의 질량 스펙트럼
도 10은 정맥내 및 피하 주사 후 사이노몰거스 원숭이에서의 RELAX0023의 PK 프로파일을 나타낸다.
도 11은 본 발명의 폴리펩티드의 일부를 암호화하는 뉴클레오티드 서열(나타낸 순서대로 각각 서열번호 80 내지 140)을 나타낸다.
도 12는 심부전 및 좌심실 박출률(LVEF) 감소가 있는 사이노몰거스 원숭이(Macaca fascicularis)에서 RELAX0023의 만성 효능 연구 결과를 보여준다. LVEF, 심박수(HR) 및 평균 동맥압(MAP)에 대한 RELAX0023의 효과는 20주 동안 상대적 저용량, 중간 용량 또는 고용량의 RELAX0023 또는 비히클 대조군으로 치료하고 관찰 기간이 있었던 상기 원숭이에서 각각 (A), (B) 및 (C)에 제시되어 있다. 각 데이터 포인트는 그룹의 평균 값을 나타낸다(치료 그룹의 경우 n=8, 비히클 그룹의 경우 n=14). (A), (B) 및 (C) 각각의 x축은 치료 기간 시작으로부터의 주 수를 나타낸다.
도 13a 내지 도 13f는 RELAX0023 투여 후 MAD 코호트에서의 심장 기능, 전신 혈관 저항 및 기관 관류를 보여준다. 도 6a는 HFpEF 대상체에서의 박출률(EF)을 보여준다. 도 6b는 HFrEF 대상체에서의 EF를 보여준다. 도 6c는 통합된 대상체에서의 심박출량을 보여준다. 도 6d는 통합된 대상체에서의 전신 혈관 저항(SVR)을 보여준다. 도 6e는 통합된 대상체에서의 일회박출량(stroke volume, SV)을 보여준다. 도 6f는 통합된 대상체에서의 추정 사구체 여과율(eGFR)을 보여준다. HFpEF = 박출률 보존 심부전. HFrEF = 박출률 감소 심부전. 위약과 비교하여 유의미함(p<0.1).
[표 1]
릴랙신
본 발명은 릴랙신 A 쇄 및 릴랙신 B 쇄가 아미노산 링커를 통해 서로 공유적으로 연결되지 않을 때, 본원에 기재된 이형이량체 융합체가 릴랙신 활성을 나타낼 수 있다는 발견에 적어도 부분적으로 기반한다. 이는 릴랙신 A 및 릴랙신 B가 단쇄에 융합된 재조합 릴랙신을 기재하는, WO 2013/004607 및 WO 2018/138170의 개시내용에 기반해 놀라운 것이다. 본 발명자들은 이형이량체화 도메인의 이형이량체화가 릴랙신 A 및 릴랙신 B 쇄의 정확한 폴딩 및 이형이량체화를 유발한다는 것을 추가로 발견하였다(실시예 2 참조). 또한, 야생형 릴랙신 단백질과 달리, 본 발명의 융합체 폴리펩티드는 생물학적 활성의 단백질 분해 가공을 필요로 하지 않는다.
본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "이형이량체 융합체"는 융합체 폴리펩티드의 이형이량체를 지칭하되, 하나의 융합체 폴리펩티드는 이형이량체 단백질의 제1 서브유닛(예를 들어, 릴랙신 A 쇄)에 연결된 제1 이형이량체화 도메인을 포함하고, 다른 융합체 폴리펩티드는 이형이량체 단백질의 제2 서브유닛(예를 들어, 릴랙신 B 쇄)에 연결된 제2 이형이량체화 도메인을 포함한다.
본 발명의 이형이량체 융합체는 릴랙신-1, 릴랙신-2 및 릴랙신-3으로부터 선택된 릴랙신의 군으로부터 릴랙신 A 및 B 쇄 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 본 발명의 릴랙신 A 쇄 폴리펩티드는 릴랙신-2 A 쇄 폴리펩티드 또는 이의 변이체이고; 본 발명의 릴랙신 B 쇄 폴리펩티드는 릴랙신-2 B 쇄 폴리펩티드 또는 이의 변이체이다. 특정 실시형태에서, 릴랙신 A 쇄 폴리펩티드는 인간 릴랙신-2 A 쇄 폴리펩티드 또는 이의 변이체 및 인간 릴랙신-2 B 쇄 폴리펩티드 또는 이의 변이체를 포함한다.
용어 "쇄", "폴리펩티드" 및 "펩티드"는 펩티드 결합을 통해 연결된 둘 이상의 아미노산의 쇄를 지칭하기 위해 본원에서 상호 호환적으로 사용될 수 있다.
일부 실시형태에서, 릴랙신-2 A 쇄 폴리펩티드는 서열번호 1에 제시된 바와 같은 서열 또는 이의 변이체를 갖고, 릴랙신-2 B 쇄 폴리펩티드는 서열번호 2에 제시된 바와 같은 서열 또는 이의 변이체를 갖는다. 변이체는 하나 이상의 아미노산 치환, 결실 및/또는 삽입을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 릴랙신-2 A 쇄 폴리펩티드는 K9E, K9H, K9L, K9M, R18E, R18H, R22A, R22I, R22M, R22Q, R22S, R22Y, F23E, F23A 및 F23I로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 돌연변이를 포함한다. 바람직한 실시형태에서, 릴랙신-2 A 쇄는 아미노산 돌연변이 K9H를 포함한다.
릴랙신 A 및 B 쇄 변이체는 당업계에 공지되어 있다. 또한, 당업자는 릴랙신 A 및 B 쇄 변이체의 설계에 대한 가이드를 이용할 수 있다. 예를 들어, 변이체가 릴랙신 기능에 필요한 해당 아미노산을 보유할 수 있다는 것이 이해될 것이다. 예를 들어, 릴랙신-2 B 쇄 변이체는 보존된 모티프 Arg-X-X-X-Arg-X-X-lle(Claasz AA et al. (2002) Eur. J. Biochem. 269(24): 6287-6293) 또는 Arg-X-X-X-Arg-X-X-Val(Bathgate RA et al. (2013) Physiol Rev. 93(1): 405-480)을 포함할 수 있다. 변이체는 하나 이상의 아미노산 치환 및/또는 삽입을 포함할 수 있다. 예를 들어, 릴랙신-2 B 쇄 변이체는 서열번호 62에 비해서 하나 이상의 추가적인 아미노산, 예를 들어, K30 및 R31 및 N-말단 V-2, A-1 및 M-1을 가질 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 변이체는 하나 이상의 아미노산 유도체를 포함할 수 있다. 예를 들어, 릴랙신-2 B 쇄 변이체의 제1 아미노산은 파이로글루타메이트일 수 있다.
바람직한 실시형태에서, 릴랙신 A 쇄와 릴랙신 B 쇄는 2개의 쇄간 이황화결합에 의해 공유 결합된다(실시예 2 참조).
펩티드의 릴랙신 패밀리는 G 단백질-결합 수용체(GPCR)의 활성화 및 각각 Gs 또는 Gi 단백질 서브유닛에 의한 cAMP 신호전달 경로의 후속적 자극 또는 저해를 통해 적어도 부분적으로 이들의 생물학적 효과를 매개한다. 릴랙신-2는 GPCR RXFP1(LGR7로도 알려짐) 및 더 적은 정도로, GPCR RXFP2(LGR8로도 알려짐)를 활성화시키는 것으로 알려져 있으며, 따라서 Gs-cAMP-의존적 신호전달 경로를 자극하여, 제2 전령 분자인 cAMP의 증가를 야기한다.
본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "릴랙신 활성"은 릴랙신 분자가 릴랙신 수용체에 결합하고/하거나 상기 릴랙신 수용체를 활성화시키고/시키거나 세포 내부의 신호전달 캐스케이드를 개시하는 능력을 지칭한다. 릴랙신 활성이 릴랙신-2 활성인 실시형태에서, 릴랙신 활성은 수용체 RXFP1 및/또는 RXFP2에 결합하고/하거나 이를 활성시키는 능력을 지칭할 수 있다. 용어 "릴랙신 활성"은 "생물학적 활성"과 상호 호환적으로 사용될 수 있다.
릴랙신 활성은 릴랙신 수용체에 대한 릴랙신 분자의 결합을 측정하고/하거나, 릴랙신 수용체에 대한 결합으로부터의 하류의 사건을 측정함으로써 결정될 수 있다.
릴랙신 활성은 시험관내 및/또는 생체내에서 결정될 수 있다. 일부 실시형태에서, 릴랙신 활성은 시험관내에서 결정된다.
릴랙신 활성은 수용체의 릴랙신 활성화로부터 하류의 분자의 양 및/또는 존재를 측정함으로써 결정될 수 있다. 예를 들어, 릴랙신 활성은 수용체의 릴랙신 활성화 후에 cAMP 생산을 측정함으로써 결정될 수 있다. 릴랙신-유발 cAMP 생성의 검출 방법은 당업계에 공지되어 있다. 이러한 방법은 cAMP ELISA, HTRF cAMP 분석 및 HitHunter®cAMP 분석을 포함한다. 일부 실시형태에서, 릴랙신 활성은, 예를 들어, 실시예 3에 수행되는 바와 같이, HTRF cAMP 분석에 의해 릴랙신-유발 cAMP 생산을 측정함으로써 결정된다. 릴랙신 활성은 또한 수용체의 릴랙신 활성화 후에 산화질소(NO) 생산을 측정함으로써 결정될 수 있다. 릴랙신 활성은 또한 수용체의 릴랙신 활성화로부터 하류의 분자의 활성화를 측정함으로써 결정될 수 있다. 예를 들어, 릴랙신 활성은 p42/44 MAPK의 활성화를 측정함으로써 결정될 수 있다.
대안적으로 또는 추가로, 릴랙신 활성은 공지된 릴랙신 표적 유전자의 활성화를 측정함으로써 결정될 수 있다. 예를 들어, 릴랙신 활성은 THP-1 세포에서 알려진 릴랙신 표적 유전자인 VEGF의 전사 활성화를 측정함으로써 결정될 수 있다. 유전자의 전사 활성화를 결정하는 방법은 당업계에 공지되어 있으며, mRNA의 정량적 PCR 분석을 포함한다. VEGF mRNA의 상대 발현은 문헌[Xiao et al. (2013) Nat Commun. 4: 1953]에 기재된 바와 같이 릴랙신과 함께 THP-1 세포의 인큐베이션 후에 VEGF 전사체의 정량적 실시간 PCR 유도에 의해 측정될 수 있다.
대안적으로 또는 추가로, 릴랙신 활성은 릴랙신의 하나 이상의 하류 효과를 측정함으로써 결정될 수 있다. 예를 들어, 심장 비대 감소는 표준 방법에 따른, 심장 초음파 검사, 체중 및/또는 경골 길이에 비한 좌심실 중량에 의해 측정될 수 있다. 다른 예에서, 릴랙신 활성은 마손 삼색 염색(Masson's Trichrome stain)에 의해 섬유증 감소를 측정함으로써 결정될 수 있다. 다른 예에서, 릴랙신 활성은 결합 조직 대사의 조절, 예컨대, 전섬유성 인자(예컨대, TGF-베타)의 저해, 섬유아세포 증식 및 분화의 저해 및/또는 MMP-매개 세포외 기질 분해의 활성화를 측정함으로써 결정될 수 있다(Bathgate RA et al. (2013) Physiol Rev. 93(1): 405-480).
일부 실시형태에서, 릴랙신 활성은, 예를 들어, 실시예 7에서 수행한 바와 같이, 이소프로테레놀-유발 심장 비대(경골 길이에 대한 심장 중량으로서 측정됨) 및 섬유증(심장 중량에 대한 콜라겐 함량으로서 측정됨)의 반전을 측정함으로써 결정된다.
본 발명의 이형이량체 융합체의 활성은 참조 릴랙신 단백질에 관해 결정될 수 있다. 일부 실시형태에서, 참조 릴랙신 단백질은 재조합 단백질이다. 바람직한 실시형태에서, 참조 릴랙신 단백질은 성숙 릴랙신 단백질의 릴랙신 A 쇄 및 릴랙신 B 쇄 어레이를 갖는 릴랙신 단백질이다. 성숙 릴랙신 단백질의 릴랙신 A 쇄 및 릴랙신 B 쇄 어레이를 갖는 재조합 릴랙신은 상업적으로 입수 가능하다. 예를 들어, 재조합 인간 릴랙신-2, 뮤린 릴랙신-1 및 INSL3은 R&D systems으로부터 입수 가능하다(각각 카탈로그 번호 6586-RN, 6637-RN 및 4544-NS).
일부 실시형태에서, 참조 릴랙신 단백질은 본 발명의 이형이량체 융합체와 동일한 릴랙신 A 및 B 쇄를 갖거나 또는 본 발명의 이형이량체 융합체의 릴랙신 A 및 B 쇄와 최대 10개의 아미노산, 예를 들어, 1 또는 2개의 아미노산만큼 상이하다. 일부 실시형태에서, 참조 릴랙신-2의 B 쇄의 제1 아미노산은 D이고, 이 아미노산은 본 발명의 이형이량체 융합체의 릴랙신 B 쇄에서 결실된다.
참조 릴랙신 단백질은 하기로부터 선택될 수 있다:
(i) 재조합 인간 릴랙신-2(본원에서 RELAX0013으로서 지칭됨);및
(ii) 재조합 뮤린 릴랙신-1(본원에서 RELAX0014로서 지칭됨); 및
(iii) 릴랙신 A 및 릴랙신 B가 단일 쇄에서 융합되고, Fc는 반감기 연장 Fc 영역인, 재조합 Fc-융합 릴랙신-2(본원에서 RELAX0010으로서 지칭되고 WO2018/138170에 기재됨); 및
(iv) 릴랙신 A 및 릴랙신 B가 단일 쇄에서 융합되고, Fc는 반감기 연장 Fc 영역인, 재조합 Fc-융합 릴랙신-2(본원에서 RELAX0009로서 지칭되고 WO2018/138170에 기재됨); 및
(v) 릴랙신 A 및 릴랙신 B가 단일 쇄에서 융합된 재조합 Fc-융합 릴랙신-2(본원에서 RELAX0126으로서 지칭되고 WO 2013/004607에 기재됨); 및
(vi) 릴랙신 A 및 릴랙신 B가 단일 쇄에서 융합된 재조합 Fc-융합 릴랙신-2(본원에서 RELAX0127로서 지칭되고 WO 2013/004607에 기재됨); 및
(vii) 릴랙신 A 및 릴랙신 B가 단일 쇄에서 융합된 재조합 Fc-융합 릴랙신(본원에서 RELAX0128로서 지칭되고 WO 2013/004607에 기재됨).
특히 바람직한 실시형태에서, 참조 릴랙신 단백질은 UniProtKB/Swiss-Prot 수탁 번호 P04090.1 하에 개시된 바와 같은 성숙 릴랙신-2 단백질의 릴랙신-2 쇄 A 및 릴랙신-2 B 쇄 어레이를 갖는 릴랙신-2 단백질이다.
본 발명의 이형이량체 융합체는 참조 릴랙신 단백질 활성의 적어도 일부를 나타내는 경우에 릴랙신 활성을 갖는 것으로 간주될 수 있다. 예를 들어, 융합체 폴리펩티드는 참조 릴랙신 단백질 활성의 적어도 약 절반을 갖는 경우에 릴랙신 활성을 갖는 것으로 간주될 수 있다. 참조 릴랙신 단백질 활성에 대한 상기 융합체 폴리펩티드 활성의 비율이 약 10-5 내지 약 1, 약 10-4 내지 약 1, 약 10-3 내지 약 1, 약 10-2 내지 약 1, 약 1/50 내지 약 1, 약 1/20 내지 약 1, 약 1/15 내지 약 1, 약 1/10 내지 약 1, 약 1/5 내지 약 1, 또는 약 ½ 내지 약 1인 경우에, 본 발명의 이형이량체 융합체는 릴랙신 활성을 갖는 것으로 간주될 수 있다. 대안적으로, 참조 릴랙신 단백질 활성에 대한 상기 융합체 폴리펩티드 활성의 비율이 약 1 내지 약 105, 약 1 내지 약 104, 약 1 내지 약 103, 약 1 내지 약 100, 약 1 내지 약 50, 약 1 내지 약 20, 약 1 내지 약 15, 약 1 내지 약 10, 약 1 내지 약 5, 또는 약 1 내지 약 2인 경우에, 본 발명의 이형이량체 융합체는 릴랙신 활성을 갖는 것으로 간주될 수 있다.
일부 실시형태에서, 참조 릴랙신 단백질의 릴랙신 활성에 대한 이형이량체 융합체의 릴랙신 활성은 약 0.001 내지 약 10이다.
릴랙신 활성은 EC50 값으로서 결정될 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "EC50"(절반의 최대 유효 농도)은 명시된 노출 시간 후에 기준선과 최대값 사이의 중간에서 반응을 유도하는 치료 화합물의 유효 농도를 지칭한다.
이형이량체화 도메인
본 발명의 이형이량체 융합체는 제1 이형이량체화 도메인 및 제2 이형이량체화 도메인을 포함한다. 바람직한 실시형태에서, 제1 및 제2 이형이량체화 도메인은 면역글로불린 Fc 영역으로부터 유래된다.
용어 "Fc 영역"은 무손상 항체의 파파인 분해에 의해 생성될 수 있는 면역글로불린 중쇄의 C-말단 영역을 정한다. 면역글로불린의 Fc 영역은 일반적으로 2개의 불변 도메인, CH2 도메인 및 CH3 도메인을 포함하고, 및 선택적으로 CH4 도메인을 포함한다.
제1 및 제2 Fc 영역은 면역글로불린 도메인 CH2 및/또는 CH3를 포함할 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 제1 및 제2 Fc 영역은 면역글로불린 도메인 CH2 및 CH3를 포함한다.
Fc 영역은 임의의 종, 바람직하게는 인간(예를 들어, 인간 IgG)으로부터의 면역글로불린(예를 들어, IgG)으로부터 유래될 수 있다. Fc 영역이 IgG로부터 유래된 실시형태에서, Fc 영역은 임의의 하위부류의 IgG(예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4), 바람직하게는 IgG1로부터 유래될 수 있다. 바람직하게는, 제1 및 제2 Fc 영역은 인간 IgG1 면역글로불린으로부터 유래된다. 다른 실시형태에서, 제1 및 제2 Fc 영역은 인간 IgG4 면역글로불린으로부터 유래된다.
바람직한 실시형태에서, 제1 및 제2 Fc 영역은 이형이량체화-촉진 아미노산 돌연변이 및/또는 변형을 포함한다. 이러한 변형은 제1 및 제2 Fc 영역 각각에 비대칭 상보성 변형의 도입을 포함하여, 쇄 둘 다 서로 양립 가능하고 따라서 이형이량체를 형성할 수 있지만, 각각의 쇄는 그 자체와 이량체화할 수 없다. 이러한 변형은 삽입, 결실, 보존적 및 비보존적 치환 및 재배열을 포함할 수 있다. 이러한 변형의 도입은 동형이량체와 같은 다른 원치 않는 최종 생성물 이상으로 재조합 세포 배양물에 의해 생성된 이형이량체 수율을 증가시키는 방법을 제공한다.
제1 및 제2 Fc 영역은 당업계에 알려진 임의의 이형이량체화-촉진 아미노산 돌연변이 및/또는 변형을 포함할 수 있다. 항체 안정성에 대한 영향을 최소화하면서 조립체의 효율을 최대화하기 위해 변형의 조합이 사용될 수 있다.
"노브 인 홀" 방법에서, 이형이량체화는 접촉 잔기 사이에 입체 장애를 도입함으로써 촉진될 수 있다. "돌출부'는 하나의 Fc 영역("Fc 노브")의 계면으로부터의 하나 이상의 작은 아미노산 측쇄를 더 큰 측쇄(예를 들어, 티로신 또는 트립토판)로 대체함으로써 생성된다. 거대 측쇄(들)와 동일 또는 유사한 크기의 상보성 "공동(cavity)"은 거대 측쇄를 갖는 아미노산을 더 작은 것을 갖는 아미노산(예를 들어, 알라닌 또는 발린)으로 대체함으로써 다른 Fc 영역("Fc 홀")의 계면 상에서 생성된다. "노브-인-홀" 변형은, 예를 들어, 문헌[Ridgway JB et al. (1996) Protein Eng. 9(7) 617-621; Merchant AM et al. (1998) Nat. Biotechnol. 16(7): 677-681]에 상세하게 기재되어 있다.
이형이량체를 생성하기 위해 사용될 수 있는 다른 변형은 두 Fc 영역 사이의 유리한 정전기적 상호작용을 생성하는 것을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 예를 들어, 하나 이상의 양으로 하전된 아미노산은 하나의 Fc 영역에 도입될 수 있고, 하나 이상의 음으로 하전된 아미노산은 다른 Fc 영역에서의 대응하는 위치에 도입될 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, Fc 영역은 이황화결합을 형성할 수 있는 시스테인 잔기를 도입하는 돌연변이를 포함하도록 변형될 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, Fc 영역은 이형이량체 형성이 동형이량체 형성보다 더 엔트로피 및 엔탈피적으로 유리할 수 있도록 하기 위해, 쇄 사이의 계면에서 친수성 및 소수성 잔기에 대해 하나 이상의 변형(들)을 포함할 수 있다.
따라서, 일부 실시형태에서, 이형이량체화-촉진 아미노산 돌연변이 및/또는 변형은 (예를 들어, "노브-인-홀"에 의해) 접촉 잔기 사이의 입체 장애를 생성하고/하거나, 두 Fc 영역 사이의 유리한 정전기적 상호작용을 생성하고/하거나, 이황화결합을 형성할 수 있는 시스테인 잔기를 도입하고/하거나 두 Fc 영역 사이의 계면에서 친수성 및 소수성 잔기를 변형시킨다.
바람직한 실시형태에서, 이형이량체화-촉진 아미노산 돌연변이는 "Fc 노브" 및 "Fc 홀" 돌연변이이다. 바람직한 실시형태에서, "Fc 노브" 및 "Fc 홀" 돌연변이는 CH3 도메인에 존재한다.
일부 실시형태에서, 제1 및 제2 Fc 영역은 인간 IgG1 면역글로불린으로부터 유래되고, CH3 도메인에 돌연변이를 갖는 "Fc X" 및 "Fc Y"를 포함하되, "Fc X" 및 "Fc Y" 돌연변이는 표 2에 제시된 조합(또는 이들의 보존적 치환)으로부터 선택된다.
[표 2]
바람직한 실시형태에서, "Fc Y"는 돌연변이 Y349C, T366S, L368A 및 Y407V, 또는 이들의 보존적 치환을 갖는 "Fc 홀"이고, "Fc X"는 돌연변이 S354C 및 T366W, 또는 이들의 보존적 치환을 갖는 "Fc 노브"이되, 아미노산 넘버링은 Kabat에서와 같이 EU 지표에 따른다.
용어 "Kabat에서와 같은 EU 지표"는 문헌[Kabat EA et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed. Public Health Service. National Institutes of Health. Bethesda, MD]에 기재된 인간 IgG1 EU 항체의 넘버링 시스템을 지칭한다. 본 출원에 언급된 모든 아미노산 위치는 EU 지표 위치를 지칭한다.
일부 실시형태에서, 제1 Fc 영역은 "Fc 홀" 돌연변이를 갖고, 제2 Fc 영역은 "Fc 노브" 돌연변이를 갖는다. 대안 및 바람직한 실시형태에서, 제1 Fc 영역은 "Fc 노브" 돌연변이를 갖고, 제2 Fc 영역은 "Fc 홀" 돌연변이를 갖는다.
Fc 영역은 야생형 Fc 영역에 대해 다른 아미노산 변형을 추가로 포함할 수 있다는 것이 이해될 것이다. Fc 영역은, 예를 들어, FcRn에 대한 IgG 분자의 친화도를 증가시키기 위해 변형될 수 있다. WO 02/060919는 하나 이상의 아미노산 변형을 갖는 Fc 영역을 포함하는 변형된 면역글로불린을 개시하고, 이의 전문은 본원에 참조로 포함된다. 하나 이상의 아미노산 변형을 갖는 Fc 영역의 제조 방법은 당업계에 공지되어 있다.
일부 실시형태에서, 제1 및/또는 제2 Fc 영역은 Fc 영역의 효과기 기능을 감소시키거나 없애기 위해 하나 이상의 아미노산 변형을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 아미노산 변형은 세포독성, 예를 들어 항체-의존적 세포-매개 세포독성(ADCC) 및 보체-의존적 세포독성(CDC)을 감소시키거나 피한다.
일부 실시형태에서, 제1 및/또는 제2 Fc 영역은 이형이량체 융합체의 반감기를 증가시키기 위해 하나 이상의 아미노산 변형을 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 제1 및/또는 제2 Fc 영역은 아미노산 돌연변이의 다음의 조합 중 적어도 하나를 포함한다:
(i) M252Y, S254T 및 T256E, 또는 이들의 보존적 치환;
(ii) L234F, L235Q 및 K322Q, 또는 이들의 보존적 치환;
(iii) L234F, L235E 및 P331S, 또는 이들의 보존적 치환;
(iv) M252Y, S254T, T256E, L234F, L235Q 및 K322Q, 또는 이들의 보존적 치환; 또는
(v) M252Y, S254T, T256E, L234F, L235E 및 P331S, 또는 이들의 보존적 치환,
아미노산 넘버링은 Kabat에서와 같이 EU 지표에 따른다.
일부 실시형태에서, 제1 및/또는 제2 Fc 영역은 아미노산 돌연변이 L234F, L235E 및 P331S, 또는 이들의 보존적 치환을 포함할 수 있되, 아미노산 넘버링은 Kabat에서와 같이 EU 지표에 따른다.
일부 실시형태에서, "Fc 홀" 돌연변이를 포함하는 Fc 영역은 서열번호 3에 제시된 서열 또는 이의 변이체를 갖고, "Fc 노브" 돌연변이를 포함하는 Fc 영역은 서열번호 4에 제시된 서열 또는 이의 변이체를 갖는다.
일부 실시형태에서, Fc 영역은 Y349로 반전되는 아미노산 돌연변이 Y349C를 갖는 서열번호 3 변이체 및 S354로 반전되는 아미노산 돌연변이 S354C를 갖는 서열번호 4 변이체를 포함하여, Fc 영역은 안정화 이황화결합을 형성할 수 없다.
일부 실시형태에서, Fc 영역은 서열번호 3 변이체 및/또는 서열번호 4 변이체를 포함하되, 처음 5개의 잔기 DKTHTCPPC(서열번호 69)는 변형된다. 일부 실시형태에서, 이 영역은 서열 DKTHTACPPC (서열번호 70)로 대체된다. 대안의 실시형태에서, 이 영역은 서열 GGAGGACPPC (서열번호 71)로 대체된다. 대안의 실시형태에서, 이 영역은 서열 ACPPC (서열번호 72)로 대체된다.
대안의 실시형태에서, 제1 및 제2 이형이량체화 도메인은 면역글로불린 Fab 영역으로부터 유래된다. 일부 실시형태에서, 이형이량체화 도메인은 CH1 및 CL 영역을 포함한다. L 및 Fd 쇄를 포함하는 Fab 영역은 효율적인 이형이량체화를 매개한다는 것이 발견되었다(Schoonjans R et al. (2000) J. Immunol. 165 (12): 7050-7057). 따라서, 대안의 실시형태에서, 이형이량체화 도메인은 L 및 Fd 쇄를 포함한다. 일부 실시형태에서, L 및 Fd 쇄는 이형이량체되어 이황화물-브리지 안정화된 이형이량체를 형성한다.
또한 추가 대안의 실시형태에서, 제1 및 제2 이형이량체화 도메인은 이형이량체화되어 평행한 코일드 코일을 형성한다. 이형이량체 코일드 코일은, 예를 들어, 문헌[Aronsson et al. (2015) Sci. Rep. 5: 14063]에 기재되어 있다. 일부 실시형태에서, 이형이량체화 도메인은 원치않는 폴딩된 조립체의 형성을 방지하고/하거나 평행한 코일드 코일의 형성을 촉진시키기 위해 아미노산 돌연변이 및/또는 변형을 포함한다.
제1 및 제2 이형이량체화 도메인(예를 들어, 제1 및 제2 Fc 영역)은 반감기 연장 모이어티를 형성할 수 있다. 따라서, 일부 실시형태에서, 본 발명의 이형이량체 융합체는 참조 릴랙신에 비해서 연장된 반감기를 갖는다.
본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "반감기"는 혈장 중 융합체 단백질 농도가 본래 수준의 50%까지 감소되는 데 걸린 시간을 지칭하기 위해 사용된다. 혈장 중 단백질의 "반감기"는 단백질의 크기, 이의 안정성, 이의 제거율, 전환율, 생체내 단백질 분해, 신체 또는 특정 조직에 의한 흡수 속도 등과 같은 상이한 인자에 따라 다를 수 있다. 단백질의 반감기를 결정하는 방법은 당업계에 공지되어 있고, 아래의 실시예에 기재되어 있다.
본 발명자들은 면역글로불린 Fc로부터 유래된 제1 및 제2 이형이량체화 도메인을 갖는 본 발명의 이형이량체 융합체가 마우스 모델에서 적어도 5시간의 반감기를 갖는다는 것을 나타냈다(실시예 6 참조). 이에 비해, IV 투여 후 인간 릴랙신-2의 반감기는 인간에서 약 0.09 +/- 0.04시간, 즉, 5.4 +/- 2.4분이다(Chen SA et al. (1993) Pharm. Res. 10(6): 834-838).
치료 단백질이 안전하고 편리한 투약 스케줄, 예를 들어, 덜 빈번하게 투여될 수 있는 보다 저용량에 따라 투여될 수 있기 때문에, 연장된 반감기가 유리하다는 것이 인식될 것이다. 또한, 보다 저용량의 달성은 개선된 안전성 프로파일의 제공 및/또는 생체내 작용의 다중 메커니즘의 활성화와 같은 추가적인 이점을 제공할 수 있다.
커넥터
릴랙신 A 및 B 쇄 중 하나 또는 둘 다는 커넥터 폴리펩티드에 의해 이들의 각 이형이량체화 도메인에 연결될 수 있다. 일부 실시형태에서, 릴랙신 A 쇄는 커넥터 폴리펩티드를 통해 제1 이형이량체화 도메인(예를 들어, 제1 Fc 영역)에 연결되고, 릴랙신 B 쇄는 커넥터 폴리펩티드를 통해 제2 이형이량체화 도메인(예를 들어, 제2 Fc 영역)에 연결된다.
커넥터 폴리펩티드는 임의의 적합한 길이, 예를 들어, 약 6 내지 40개의 아미노산 길이, 바람직하게는 약 6 내지 21개의 아미노산 길이일 수 있다. 일부 실시형태에서, 커넥터 폴리펩티드는 적어도 6개의 아미노산 잔기 길이, 바람직하게는 적어도 11개의 아미노산 길이, 바람직하게는 적어도 16개의 아미노산 길이이다. 일부 실시형태에서, 커넥터 폴리펩티드는 40개 미만의 아미노산 길이이다. 상이한 또는 동일한 길이의 커넥터 폴리펩티드가 본 발명의 이형이량체 융합체의 각 아암에 대해 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 적어도 하나의 커넥터 폴리펩티드는 21개의 아미노산 길이를 갖는다. 바람직한 실시형태에서, 커넥터 폴리펩티드는 둘 다 21개의 아미노산 길이를 갖는다. 커넥터 폴리펩티드는 임의의 아미노산 서열을 가질 수 있다. 상이한 또는 동일한 아미노산 조성의 커넥터 폴리펩티드는 본 발명의 이형이량체 융합체의 각 아암에 대해 사용될 수 있다.
일부 실시형태에서, 하나 또는 바람직하게는 둘 다의 커넥터 폴리펩티드는 프롤린 및 알라닌 반복부(PA)x(서열번호 73)를 포함하되, 바람직하게는 x는 3 내지 15이고, 바람직하게는 커넥터 폴리펩티드는 16개 초과의 아미노산 길이를 갖고, 바람직하게는 커넥터 폴리펩티드는 21개의 아미노산 서열 PAPAPAPAPAPAPAPAPAPAG (서열번호 6)로 구성된다.
일부 실시형태에서, 하나 또는 바람직하게는 둘 다의 커넥터 폴리펩티드는 글리신 및 세린 반복부, 예컨대, 문헌[Chen X et al. (2013) Adv. Drug. Deliv. Rev. 65(10): 1357-1369]에 기재된 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 하나 또는 둘 다의 커넥터 폴리펩티드는 모티프 (GGGGS)n (서열번호 74)을 포함하되, n은 1 내지 8일 수 있고, 예를 들어, n은 4이다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 커넥터 폴리펩티드는 21개의 아미노산 서열 GGGGSGGGGSGGGGSGGGGGS (서열번호 5)로 구성된다. 특정 실시형태에서, 둘 다의 커넥터 폴리펩티드는 21개의 아미노산 서열 GGGGSGGGGSGGGGSGGGGGS (서열번호 5)로 구성된다.
일부 실시형태에서, 하나의 커넥터 폴리펩티드는 본원에 기재된 바와 같은 프롤린 및 알라닌 반복부를 포함하고, 다른 커넥터 폴리펩티드는 본원에 기재된 바와 같은 글리신 및 세린 반복부를 포함한다.
대안적으로, 릴랙신 A 및 B 쇄 중 하나 또는 둘 다는 합성 커넥터 폴리펩티드, 예컨대, 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 중합체 쇄에 의해 이들의 각각의 이형이량체화 도메인에 연결될 수 있다. 따라서, 릴랙신 A 쇄는 합성 커넥터, 예컨대, 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 중합체 쇄를 통해 제1 이형이량체화 도메인(예를 들어, 제1 Fc 영역)에 연결될 수 있고, 릴랙신 B 쇄는 합성 커넥터, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 중합체 쇄를 통해 제2 이형이량체화 도메인(예를 들어, 제2 Fc 영역)에 연결될 수 있되, 합성 커넥터는 이형이량체화 도메인(예를 들어, Fc 영역)에 공유적 또는 비공유적으로 부착될 수 있다. 분자에 PEG 중합체 쇄를 부착하는 과정인 페길화(PEGylation)는 당업계에 공지된 방법에 따라 수행될 수 있다.
안정성
본 발명자들은 본 발명의 이형이량체 융합체가 예상치 못한 우수한 물리적 및 화학적 안정성을 갖는다는 것을 보여주었다. 따라서, 일부 실시형태에서, 본 발명의 이형이량체 융합체는 참조 릴랙신 단백질에 비해 우수한 물리적 및/또는 화학적 안정성을 갖는다.
릴랙신의 물리적 안정성은, 예를 들어, 실시예 9에서와 같이 HP-SEC에 의해 순도 및 응집을 측정함으로써 결정될 수 있다. 릴랙신의 화학적 안정성은, 예를 들어, 실시예 9에서와 같이 LC-MS에 의해 분자의 단편화 및 변형을 측정함으로써 결정될 수 있다.
놀랍게도, 본 발명자들은 본 발명의 이형이량체 융합체가 (별개의 융합체 폴리펩티드에서 릴랙신 A 및 B와 대조적으로) 릴랙신 A 및 릴랙신 B가 단일 쇄에서 융합된 재조합 Fc-융합 릴랙신과 비교할 때 우수한 물리적 및 화학적 안정성을 갖는다는 것을 보여주었다. WO 2013/004607은 면역글로불린 Fc 영역에 융합된 재조합 단일 쇄 릴랙신 융합체 폴리펩티드, 예를 들어, 본원에서 RELAX0127 및 RELAX0128로서 지칭되는 융합체 폴리펩티드를 기재한다. 따라서, 일부 실시형태에서, 본 발명의 이형이량체 융합체는 RELAX0127 및 RELAX0128에 비해 우수한 물리적 및/또는 화학적 안정성을 갖는다.
이형이량체 융합체는 제1 및 제2 이형이량체화 도메인에 추가로 반감기 연장 모이어티를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 반감기 연장 모이어티는 단백질성 반감기 연장 모이어티이다. 단백질성 반감기 연장 모이어티는 면역글로불린의 Fc 영역, 알부민-결합 도메인 및 혈청 알부민으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 추가 실시형태에서, 반감기 연장 모이어티는 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 중합체 쇄와 같은, 단백질 또는 펩티드가 아닌 화학적 독립체이다.
반감기 연장 모이어티는 제1 또는 제2 이형이량체화 도메인의 N-말단 또는 C-말단에 부착될 수 있다. 일부 실시형태에서, 반감기 연장 모이어티는 제1 또는 제2 이형이량체화 도메인의 N-말단에 부착된다. 다른 실시형태에서, 반감기 연장 모이어티는 제1 또는 제2 이형이량체화 도메인의 C-말단에 부착된다. 이형이량체 융합체에 반감기 연장 모이어티를 부착하기 위한 방법은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 반감기 연장 모이어티는 화학적 접합 또는 재조합 기술에 의해 부착될 수 있다. 반감기 연장 모이어티는 직접적으로 또는 커넥터(예를 들어, 커넥터 폴리펩티드)를 통해 이형이량체 융합체에 부착될 수 있다. 커넥터 폴리펩티드의 사용은, 융합체 폴리펩티드가 Fc 영역과 같은 단백질성 반감기 연장 모이어티를 포함할 때 특히 적절할 수 있다.
예시적인 실시형태
본 발명의 이형이량체 융합체는 다양한 형식 및/또는 서열을 가질 수 있다.
용어 "본 발명의 융합체 폴리펩티드" 및 "본 발명의 융합체 폴리펩티드들"은 릴랙신 A 쇄에 융합된 제1 이형이량체화 도메인, 및/또는 릴랙신 B 쇄에 융합된 제2 이형이량체화 도메인을 지칭하기 위해 사용될 수 있다. 본 발명의 융합체 폴리펩티드는 재조합 융합체 폴리펩티드일 수 있으며, 즉, 재조합 DNA 기술에 의해 생성되었다.
바람직한 실시형태에서, 제1 이형이량체화 도메인(예를 들어, 제1 Fc 영역)의 C-말단은 릴랙신 A 쇄의 N-말단에 연결되고, 제2 이형이량체화 도메인(예를 들어, 제2 Fc 영역)의 C-말단은 릴랙신 B 쇄의 N-말단에 연결된다. 일부 실시형태에서, 릴랙신 A 쇄 폴리펩티드 및/또는 릴랙신 B 쇄 폴리펩티드는 유리 C-말단을 갖는다.
대안의 실시형태에서, 제1 이형이량체화 도메인(예를 들어, 제1 Fc 영역)의 N-말단은 릴랙신 A 쇄의 C-말단에 연결되고, 제2 이형이량체화 도메인(예를 들어, 제2 Fc 영역)의 N-말단은 릴랙신 B 쇄의 C-말단에 연결된다. 일부 실시형태에서, 릴랙신 A 쇄 폴리펩티드 및/또는 릴랙신 B 쇄 폴리펩티드는 유리 N-말단을 갖는다.
본 발명의 이형이량체 융합체는 하나 이상의 Fab를 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 이형이량체 융합체는 제1 이형이량체화 도메인(예를 들어, 제1 Fc 영역)의 N-말단에 연결된 하나의 Fab 및 제2 이형이량체화 도메인(예를 들어, 제2 Fc 영역)의 N-말단에 연결된 제2 Fab를 포함한다.
본 발명의 이형이량체 융합체는 제2 릴랙신 A 쇄 폴리펩티드 또는 이의 변이체 및 제2 릴랙신 B 쇄 폴리펩티드 또는 이의 변이체를 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 제2 릴랙신 A 쇄 폴리펩티드 또는 이의 변이체는 제1 이형이량체화 도메인(예를 들어, 제1 Fc 영역)의 N-말단에 연결되고 제2 릴랙신 B 쇄 폴리펩티드 또는 이의 변이체는 제2 이형이량체화 도메인(예를 들어, 제2 Fc 영역)의 N-말단에 연결되되, 선택적으로 제2 릴랙신 A 쇄는 커넥터(예를 들어, 커넥터 폴리펩티드)를 통해 제1 이형이량체화 도메인(예를 들어, 제1 Fc 영역)에 연결되고, 제2 릴랙신 B 쇄는 커넥터(예를 들어, 커넥터 폴리펩티드)를 통해 제2 이형이량체화 도메인(예를 들어, 제2 Fc 영역)에 연결된다.
따라서, 일부 실시형태에서, 이형이량체 융합체의 형식은 하기로부터 선택된다:
(i) FcX-con-A/ FcY-con-B (예를 들어, 도 1 참조);
(ii) FcX-con-B/ FcY-con-A (예를 들어, 도 1 참조);
(iii) A-con-FcX/ B-con-FcY (예를 들어, 도 1 참조);
(iv) B-con-FcX/ A-con-FcY (예를 들어, 도 1 참조);
(v) Fab-FcX-con-A/ Fab-FcY-con-B (예를 들어, 도 1 참조);
(vi) Fab-FcX-con-B/ Fab-FcY-con-A;
(vii) A-con-FcX-con-A/ B-con-FcY-con-B (예를 들어, 도 1 참조);
(viii) B-con-FcX-con-B/ A-con-FcY-con-A;
(ix) FcX-con-B-L-A 및 FcY, 선택적으로 FcY-con-B-L-A (예를 들어, 도 1 참조);
(x) FcY-con-B-L-A 및 FcX, 선택적으로 FcX-con-B-L-A;
(xi) FcX-con-A-L-B 및 FcY, 선택적으로 FcY-con-A-L-B; 및
(xii) FcY-con-A-L-B 및 FcX, 선택적으로 FcX-con-A-L-B,
여기서,
FcY는 "Fc 홀" 아미노산 돌연변이 및/또는 변형을 갖고, 바람직하게는 아미노산 돌연변이 Y349C:T366S:L368A:Y407V 또는 이들의 보존적 치환을 갖는 CH3 도메인을 포함하는 면역글로불린 Fc 영역이고;
FcX는 "Fc 노브" 아미노산 돌연변이 및/또는 변형을 갖고, 바람직하게는 아미노산 돌연변이 S354C:T366W 또는 이들의 보존적 치환을 갖는 CH3 도메인을 포함하는 Fc 영역이며;
"con"은 커넥터 폴리펩티드이고;
B는 릴랙신 B 쇄 또는 이의 변이체이며;
A는 릴랙신 A 쇄 또는 이의 변이체이고;
L은 바람직하게는 아미노산 서열 GGGSGGGSGG (서열번호 60)을 갖는 링커 폴리펩티드이다.
다른 양상에서, 본 발명은 하기를 포함하는 이형이량체 융합체를 제공한다:
(i) X-B-L-A 및 Y, 선택적으로 Y-B-L-A; 또는
(ii) Y-B-L-A 및 X, 선택적으로 X-B-L-A,
여기서,
X 및 Y는 본원에 기재된 바와 같은 이형이량체화 도메인이며;
B는 릴랙신 B 쇄 또는 이의 변이체, 예를 들어, 릴랙신-2 B 쇄 또는 이의 변이체이고;
A는 릴랙신 A 쇄 또는 이의 변이체, 예를 들어, 릴랙신-2 A 쇄 또는 이의 변이체이고;
L은 바람직하게는 아미노산 서열 GGGSGGGSGG (서열번호 60)을 갖는 링커 폴리펩티드이되,
X는 Y와 이형이량체화되고, 이형이량체 융합체는 릴랙신 활성을 갖는다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 하기를 포함하는 이형이량체 융합체를 제공한다:
(i) X-A-L-B 및 Y, 선택적으로 Y-A-L-B 또는
(ii) Y-A-L-B 및 X, 선택적으로 X-A-L-B,
여기서,
X 및 Y는 본원에 기재된 바와 같은 이형이량체화 도메인이며;
A는 릴랙신 A 쇄 또는 이의 변이체, 예를 들어, 릴랙신-2 A 쇄 또는 이의 변이체이고;
B는 릴랙신 B 쇄 또는 이의 변이체, 예를 들어, 릴랙신-2 B 쇄 또는 이의 변이체이고;
L은 바람직하게는 아미노산 서열 GGGSGGGSGG (서열번호 60)을 갖는 링커 폴리펩티드이되,
X는 Y와 이형이량체화되고, 이형이량체 융합체는 릴랙신 활성을 갖는다.
본 발명의 모든 양상에 따른 특히 바람직한 실시형태에서, 이형이량체 융합체는 서열번호 11에 제시된 바와 같은 융합체 폴리펩티드 Rlx011DD 및 서열번호 20에 제시된 바와 같은 Rlx014DD를 포함한다. 이 이형이량체 융합체는 "RELAX0023" 또는 "AZD3427"로도 지칭될 수 있다.
대안의 바람직한 실시형태에서, 이형이량체 융합체는 서열번호 17에 제시된 바와 같은 융합체 폴리펩티드 Rlx013DD 및 서열번호 14에 제시된 바와 같은 Rlx012DD를 포함한다.
본 발명의 양상에서, 표 3에 제시된 FcX와 FcY 조합으로부터 선택된 융합체 폴리펩티드 조합을 포함하는 이형이량체 융합체가 제공된다.
[표 3]
본 발명의 모든 양상에 따르면, 본원에 기재된 바와 같이 폐고혈압을 동반한 심부전이 있는 대상체를 치료하는 방법에 사용하기 위한 서열번호 11 및 서열번호 20에 제시된 융합체 폴리펩티드를 포함하는 이형이량체 융합체가 제공된다.
대안적으로, 본 발명의 모든 양상에 따르면, 본원에 기재된 바와 같이 폐고혈압을 동반한 심부전이 있는 대상체를 치료하는 방법에 사용하기 위한 서열번호 17 및 서열번호 14에 제시된 융합체 폴리펩티드를 포함하는 이형이량체 융합체가 제공된다.
본 발명의 융합체 폴리펩티드는 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해 생산될 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 융합체 폴리펩티드는 숙주 세포에서 융합체 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 분자의 재조합 발현에 의해 생산된다.
당업자에게 공지된 방법은 본 발명의 융합체 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 분자를 함유하는 발현 벡터를 작제하기 위해 사용될 수 있다. 적합한 벡터는, 예를 들어, 플라스미드, 파지미드, 파지 또는 바이러스 벡터를 포함한다.
본 발명의 융합체 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 분자를 함유하는 벡터는 통상적인 기법에 의해 숙주 세포에 전달될 수 있다. 적합한 숙주 세포는 당업계에 공지되어 있다. 숙주 세포는 HEK293 세포 또는 CHO 세포와 같은 포유류 세포일 수 있다.
형질감염된 세포는 본 발명의 융합체 폴리펩티드를 생산하기 위해 통상적인 기법에 의해 배양될 수 있다.
일단 본 발명의 융합체 폴리펩티드가, 예를 들어, 재조합 발현에 의해 생산되었다면, 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해 정제될 수 있다. 예시적인 단백질 정제 기법은 크로마토그래피(예를 들어, 이온 교환, 친화도 및/또는 사이징 칼럼 크로마토그래피), 원심분리 및 차별적 용해도를 포함한다. 본 개시내용은 선택적으로 적어도 1회의 정제 단계에 의해 세포 배양물로부터 분리된 단리된 융합체 폴리펩티드를 제공한다.
치료 방법
본 발명의 융합체 폴리펩티드는 약제학적 조성물에서 제공될 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 하나 이상의 부형제(들)를 포함할 수 있다. 약제학적으로 허용가능한 부형제는 당업계에 공지되어 있고, 예를 들어, 본원에 그 전문이 포함된 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences(by Joseph P. Remington, 18th ed., Mack Publishing Co., Easton, PA)]을 참조한다.
본 발명은 본원에 기재된 바와 같은 이형이량체 융합체(또는 약제학적 조성물)를 투여함으로써 폐고혈압을 동반한 심부전이 있는 대상체를 치료하는 방법, 뿐만 아니라 상기 이형이량체 융합체(또는 상기 약제학적 조성물)의 용도 및 상기 방법에 사용하기 위한 상기 이형이량체 융합체(또는 상기 약제학적 조성물)에 관한 것이다. 특히, 대상체는 동물, 바람직하게는 포유류, 더욱 바람직하게는 인간일 수 있다.
용도 또는 방법은 야생형 릴랙신 분자의 치료적으로 유효한 투약 스케줄보다 본 발명의 이형이량체 융합체/융합체 폴리펩티드의 덜 빈번한 용량을 갖는 치료적으로 유효한 스케줄을 투여하는 단계를 포함할 수 있다.
본원에서 사용되는 "심부전"이라는 용어는 급성 심부전, 만성 심부전(CHF), 및 급성 비대상성 심부전(ADHF)을 포함한다. "심부전"이라는 용어는 또한 박출률 보존 심부전(HFpEF), 중간 범위 박출률 심부전, 또는 박출률 감소 심부전(HFrEF)과 같은 보다 구체적인 진단을 포함할 수 있다. 이는 또한 비대성 심근병증이나 확장성 심근병증으로 인한 심부전을 포함할 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "폐고혈압"은 일반적으로 대상체가 휴식을 취하고 있을 때 평균 폐동맥압이 약 20 mmHg 이상, 바람직하게는 25 mmHg 이상인 대상체로서 정의될 수 있다. 이는 또한 일반적으로 대상체가 운동 중이거나 최근에 운동을 했을 때 약 30 mmHg 이상의 평균 폐동맥압으로 정의될 수 있다. 따라서, 대상체의 평균 폐동맥압은 약 20 mmHg 내지 약 30 mmHg, 바람직하게는 약 25 mmHg 내지 약 30 mmHg 또는 그 이상의 범위일 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 대상체는 다음을 가질 수 있다:
a. 약 40 mmHg 이상의 우심실 수축기압;
b. 15 mmHg를 초과하는 폐동맥 쐐기압(PAWP); 및/또는
c. 다음의 폐혈관 저항:
i. 3.0 미만의 우드 단위; 또는
ii. 3.0 이상의 우드 단위.
따라서, 일부 경우에, 폐고혈압은 세계보건기구(WHO)에서 정의한 그룹 2 폐고혈압으로 분류될 수 있다. 이는 "좌심장병으로 인한 폐고혈압을 동반한 심부전"으로도 지칭될 수 있다. 다른 경우에, 폐고혈압은 세계보건기구에서 정의한 그룹 1 폐동맥 고혈압으로 분류될 수 있다(문헌[Ryan et al., 2012, Pulm. Circ. 2(1):107-121] 참조).
폐고혈압 및 심부전의 매개변수는 당업계에 공지된 기술을 사용하여 측정되거나 추정될 수 있다. 예를 들어, 여기에는 심장초음파검사, 폐동맥 카테터 및 이식형 모니터링 장치가 포함된다. 특정 실시형태에서, 대상체에게는 당업계에 공지된 혈압 모니터링 장치, 바람직하게는 폐동맥 압력 모니터링 장치가 장착되어 있을 수 있다. 특정 실시형태에서, 폐동맥 압력 모니터링 장치는 CardioMEMS 압력 모니터링 장치이다. 전형적으로, 장치는 본원에 기재된 바와 같이 본 발명의 이형이량체 융합체로 치료하기 전에 장착된다. 대안적으로, 치료 기간 동안 또는 치료 기간 후에 대상체에게 장치가 장착된다.
본원에서 사용되는 "폐고혈압을 동반한 심부전"이라는 용어는 동시에 폐고혈압을 앓고 있는 심부전 대상체(HF+PH 대상체)의 하위 집합을 지칭한다.
"치료"는 표적 질환의 하나 이상의 증상 또는 원인의 개선 및/또는 제거를 지칭한다. 일부 실시형태에서, 이는 하나 이상의 생물학적 마커 또는 기능의 수준을 (건강한 코호트와 비교하여) 질환이 없는 범위 내로 조정하는 것을 수반할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 이형이량체 융합체는 대상체에서 폐혈관 저항(PVR)을 감소시킬 수 있다. 예를 들어, 치료 후 PVR은 기준선 PVR(본 발명의 이형이량체 융합체를 대상체에게 투여하기 전)과 비교하여 적어도 1%~10%, 1%~20%, 1%~30%, 1%~40% 또는 1%~50% 이상 감소될 수 있다. 따라서, 본 발명의 이형이량체 융합체는 기준선 PVR(본 발명의 이형이량체 융합체를 대상체에게 투여하기 전)과 비교하여 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50% 이상만큼 대상체에서 PVR을 감소시킬 수 있다. 추가적으로, 또는 대안적으로, 본 발명의 이형이량체 융합체는 대상체에서 평균 폐동맥압(mPAP)을 감소시킬 수 있다. 예를 들어, mPAP는 적어도 1 mmHg 내지 15 mmHg 이상만큼 감소될 수 있다. 따라서, 본 발명의 이형이량체 융합체는 대상체의 평균 폐동맥압을 적어도 1 mmHg, 적어도 2 mmHg, 적어도 3 mmHg, 적어도 4 mmHg, 적어도 5 mmHg, 적어도 6 mmHg, 적어도 7 mmHg, 적어도 8 mmHg, 적어도 9 mmHg, 적어도 10 mmHg, 적어도 11 mmHg, 적어도 12 mmHg, 적어도 13 mmHg, 적어도 14 mmHg 또는 적어도 15 mmHg 또는 그 이상만큼 감소시킬 수 있다. 마찬가지로, 본 발명의 이형이량체 융합체는 대상체에서 예상 폐동맥 확장기압(ePAD)을 감소시킬 수 있다. 예를 들어, ePAD는 적어도 1 mmHg 내지 15 mmHg 이상만큼 감소될 수 있다. 따라서, 본 발명의 이형이량체 융합체는 대상체의 예상 폐동맥 확장기압을 적어도 1 mmHg, 적어도 2 mmHg, 적어도 3 mmHg, 적어도 4 mmHg, 적어도 5 mmHg, 적어도 6 mmHg, 적어도 7 mmHg, 적어도 8 mmHg, 적어도 9 mmHg, 적어도 10 mmHg, 적어도 11 mmHg, 적어도 12 mmHg, 적어도 13 mmHg, 적어도 14 mmHg 또는 적어도 15 mmHg 또는 그 이상만큼 감소시킬 수 있다. 추가로 또는 대안적으로, 본 발명의 이형이량체 융합체는 심박출량의 척도로서 대상체의 박출률(EF%)을 증가시킬 수 있다. 예를 들어, EF%는 적어도 1%~10%, 1%~20%, 1%~30%, 1%~40% 또는 1%~50% 이상만큼 증가할 수 있다. 따라서, 본 발명의 이형이량체 융합체는 대상체에서 박출률(EF%)을 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50% 이상만큼 증가시킬 수 있다. 추가적으로 또는 대안적으로, 본 발명의 이형이량체 융합체는 투여 전 기준선 수준과 비교하여 대상체에서
(a) 심장의 일회박출량(SV)을 증가시키고/거나;
(b) 전신 혈관 저항(SVR)을 감소시키고/거나 추정 사구체 여과율(eGFR)을 증가시키고/거나;
(c) 박출률을 증가시키고/거나;
(d) 심박출량을 증가시킬 수 있다. SVR의 감소와 eGFR의 증가의 조합은 개선된 기관 관류를 나타낸다.
따라서, 본 발명의 이형이량체 융합체는 투여 전 기준선 수준과 비교하여 대상체에서
(a) PVR을 감소시키고/거나;
(b) mPAP를 감소시키고/거나;
(c) ePAD를 감소시키고/거나;
(d) 심장의 일회박출량(SV)을 증가시키고/거나;
(e) 전신 혈관 저항(SVR)을 감소시키고/거나 추정 사구체 여과율(eGFR)을 증가시키고/거나;
(f) 박출률을 증가시키고/거나;
(g) 심박출량을 증가시킬 수 있다. SVR의 감소와 eGFR의 증가의 조합은 개선된 기관 관류를 나타낸다. 이러한 매개변수 중 하나 이상 또는 전부의 변화는 각각 1~24주의 치료 후에 나타날 수 있다. 일부 실시형태에서, 이들 매개변수 중 하나 이상 또는 전부의 변화는 24주의 치료 후에 발생한다.
특정 실시형태에서, 본원에 기재된 mPAP의 감소는 문헌[Solomonica A, et al. (2013) Circ Heart Fail. 6:53-60]에 기재된 바와 같이 호흡곤란의 개선을 초래할 수 있다.
본 발명의 융합체 폴리펩티드(따라서 이형이량체 융합체를 포함) 및/또는 약제학적 조성물은 대상체 또는 환자에 대한 비경구 투여에 적합하다. 일부 실시형태에서, 대상체 또는 환자는 포유류, 특히 인간이다.
야생형 인간 릴랙신-2는 생체내에서 몇 분의 반감기를 갖는다. 결과적으로, 이는 입원 환자에서 지속적 정맥내 주입에 의해 투여되어야 하고, 혈압 강하를 포함하는 심각한 부작용을 나타낸다. 대조적으로, 본 발명의 융합체 폴리펩티드(따라서 이형이량체 융합체를 포함) 및/또는 약제학적 조성물의 실시형태는 주사에 의해, 예컨대, 정맥내, 피하 또는 근육내 주사에 의해 대상체 또는 환자에게 투여될 수 있다는 것이 이해될 것이다. 일부 실시형태에서, 융합체 폴리펩티드(따라서 이형이량체 융합체를 포함) 및/또는 약제학적 조성물은 피하 주사에 의해 투여된다. 주사에 의한, 예컨대 피하 주사에 의한 투여는 대상체 또는 환자에게 더 나은 편안함이라는 이점 및 병원 환경의 외부에서 대상체 또는 환자에게 투여할 기회를 제공한다. 일부 실시형태에서, 융합체 폴리펩티드(따라서 이형이량체 융합체를 포함) 또는 약제학적 조성물은 자가-투여에 의해 투여된다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 융합체 폴리펩티드(따라서 이형이량체 융합체를 포함)는 야생형 릴랙신에 비해 증가된 반감기를 갖는데, 이는 몰 농도를 기준으로 더 낮은 전체 노출을 허용한다. 예를 들어, 본 발명의 융합체 폴리펩티드(따라서 이형이량체 융합체를 포함)는 야생형 릴랙신보다 덜 빈번하게 투여될 수 있으며, 따라서, 더 편리한 투약 스케줄을 제공할 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물을 포함하는 키트가 제공될 수 있다. 키트는 본 발명의 약제학적 조성물 및 지침을 포함하는 패키지를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 약제학적 조성물은 단일 용량 바이알 또는 용기 밀폐 시스템(예를 들어, 사전 충전된 주사기)에 제형화된다. 선택적으로 이러한 용기(들)와 연관되는 것은 약제학적 또는 생물학적 제품의 제조, 사용 또는 판매를 규제하는 정부 기관에 의해 규정된 서식의 공고일 수 있으며, 이러한 공고는 인간 투여용으로의 제조, 사용 또는 판매의 기관에 의한 승인을 반영한다.
본원에서 사용되는 관사 "a" 및 "an"은 관사의 문법적 대상 중 하나 또는 하나 이상(예를 들어 적어도 하나)을 지칭할 수 있다.
"약"은 일반적으로 측정의 특성 또는 정밀도를 고려하여 측정된 양에 대해 허용 가능한 정도의 오차를 의미할 수 있다. 예시적인 오차 정도는 주어진 값 또는 값의 범위의 백분율(%) 이내, 전형적으로 10% 이내, 더 전형적으로는, 5% 이내이다.
하나 이상의 특징을 "포함하는" 것으로 본원에 기재된 실시형태는 또한 이러한 특징들"로 "이루어진" 대응하는 실시형태의 개시내용으로서 간주될 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이 용어 "약제학적으로 허용가능한"은 동물, 및 보다 구체적으로 인간에서의 사용에 대해 연방 또는 주 정부의 규제 당국에 의해 승인되거나 미국 약전, 유럽 약전 또는 다른 일반적으로 인식되는 약전에 나열되어 있음을 의미한다.
농도, 양, 부피, 백분율 및 기타 수치 값은 본원에서 범위 형식으로 제시될 수 있다. 또한 이러한 범위 형식은 단지 편리함 및 간결함을 위해 사용되며, 범위의 한계로 인해 명확하게 열거되는 수치 값을 포함할 뿐만 아니라 각각의 수치 값 및 하위 범위가 명확하게 열거된 것과 같이 해당 범위 내에 포괄되는 모든 개별적인 수치 값 또는 하위 범위를 포함하는 것으로 유연하게 해석되어야 한다는 사실이 이해되어야 한다.
상기 실시형태는 예시적인 예로서 이해되어야 한다. 추가의 실시형태가 상정된다. 임의의 하나의 실시형태와 관련하여 기재된 임의의 특징은 단독으로 또는 기재된 다른 특징과 조합하여 사용될 수 있고, 또한 임의의 다른 실시형태의 하나 이상의 특징, 또는 임의의 다른 실시형태의 임의의 조합과 조합하여 사용될 수 있음이 이해되어야 한다. 더욱이, 상기에 기재되지 않은 등가물 및 변형이 또한 첨부된 청구범위에 정의된 본 발명의 범주를 벗어나지 않으면서 이용될 수 있다.
본 발명의 개시의 맥락에서, 본원에 기재된 융합체 폴리펩티드 및 방법의 다른 예 및 변형은 당업자에게 명백할 것이다.
다른 예 및 변형은 첨부된 청구범위에 제시된 바와 같이, 본 개시내용의 범주 내에 있다. 본원에 인용된 모든 문헌은 인용된 문헌에 제시된 모든 데이터, 표, 도면, 및 본문을 포함하여, 본원에 각각의 전문이 참조로 포함된다.
실시예
실시예 1: 재조합 이형이량체 Fc 릴랙신-2 융합체 단백질의 생성
본원에 기재된 Fc 릴랙신-2 융합체 단백질은 릴랙신-2의 쇄 A 및 B의 정확한 폴딩 및 이형이량체화를 유도하기 위해 노브-인-홀 Fc 도메인(Fc 노브 및 Fc 홀)의 이형이량체화 특성을 이용하여 설계하였다.
더 정확하게는, 릴랙신-2 쇄 A 및 B는 도 1에 도시한 바와 같이 커넥터를 통해, (Fc의 N- 및/또는 C-말단에서) 2개의 상보성 Fc에 유전적으로 융합되었다. 이어서, CHO 세포를 각각의 단일 Fc-릴랙신 쇄(A 및/또는 B)를 포함하는 두 발현 벡터로 공동 형질감염시켰다. 두 상보성 Fc 모이어티는 CHO 세포 내에서 조립되고, 따라서, 릴랙신-2의 조립 및 정확한 폴딩을 용이하게 한다. 다음의 실시예 2에서 입증되는 바와 같이, 이어서, 이황화결합은 상보성 Fc 쇄 사이 및 쇄 A와 쇄 B 사이에 형성되어, 자연적 릴랙신-2 구조를 재생성한다.
이형이량체 Fc 릴랙신-2 융합체 단백질이 상청액에서 분비되었고, 이어서, 친화도 크로마토그래피에 의한 자동 시스템을 이용하여 정제되며, 단백질의 Fc 영역은 칼럼 기질에 결합한다.
실시예 2: Fc 릴랙신-2 노브-인-홀 이형이량체의 LC-MS 분석
비환원과 환원 탈글리코실화 Fc-릴랙신-2 이형이량체 둘 다에 대해 LC-MS 분석을 수행하였다. 탈글리코실화를 위해, 샘플을 1 mg/ml까지 희석시키고, 10 mM Tris-Cl을 이용하여 pH 7.80에서 완충시켰다. PNGase F(Roche)를 50 μg의 Fc-릴랙신-2당 1단위의 효소 농도로 샘플에 첨가하고, 37℃에서 밤새 인큐베이션시켰다. 비환원 분석을 위해, 샘플을 물에 0.05 mg/ml까지 희석시키고, 20 μL를 프리-슬릿 캡이 있는 LC-MS-인증 총 회수 바이알(Waters 파트 번호: 186005663CV)에 장입시켰다. 환원 분석을 위해, 10 mM TCEP를 첨가하고, 샘플을 분석 전에 37℃에서 추가 30분 동안 인큐베이션시켰다.
모두 UNIFI Scientific Information System을 이용하여 작동되는 Xevo G2-XS Q-TOF 기기에 결합된 ACQUITY I-Class UPLC(Waters, 매사추세츠주 밀포드 소재)를 이용하여 실험을 수행하였다. LC 시스템의 경우, 용매 A는 0.1% 포름산과 물이었고, 용매 B는 0.1% 포름산과 아세토니트릴이었다(둘 다 UPLC-MS 등급, BioSolve). UV 검출기를 220 nm 및 280 nm 파장에서 측정하도록 설정하고, 바이알을 4℃의 온도를 유지하면서 샘플 챔버에 넣었다. 1 μL 용적을 역상 ACQUITY UPLC 단백질 BEH C4 칼럼, 300 Å-포어 칼럼(Waters 파트 번호: 186004495) 상에 주입하였고, 6분에 걸쳐 5%에서 75%까지 용매 B의 증가되는 구배를 이용하여 단백질을 용리시켰다.
질량분석기를 50% 2-프로판올 중 2 μg/μL 요오드화나트륨을 주입함으로써 500 내지 5000 m/z로 교정하였고, 락스프레이(lockspray)는 200 pg/μL 류신 엔케팔린이었다. 다음과 같은 핵심 설정으로, 기기를 양의 이온화 모드 및 민감도 분석 모드에서 작동시켰다: 모세관 전압 = 3.0 V; 샘플 콘 전압(cone voltage) = 40 V; 소스 온도 = 120℃; 탈용매화 온도 = 450℃; 콘 기체 유량 = 120 L/h; 탈용매화 기체 유량 = 1000 L/h; 질량 범위 = 500~5000 m/z, 스캔 시간 = 1.0초.
데이터를 UNIFI 소프트웨어에서 처리하였다. 관심 단백질이 용리된 크로마토그램에서 체류 시간으로부터 스펙트럼을 합하였다. 원 데이터를 배경 차감하고, 거대 분자의 경우 MaxEnt1 알고리즘을 이용하여 디콘볼루션하였다. 실험 데이터를 비환원 분석의 경우 이황화결합을 고려하고 환원 분석의 경우 유리 시스테인을 고려한 이론적 서열 질량과 비교하였다. PNGasE F 탈글리코실화 후에 아스파라긴의 탈아미드화(+1 Da)를 또한 고려하였다.
LC-MS 분석은 이황화결합이 상보성 Fc 쇄 사이 및 쇄 A와 쇄 B 사이에 형성되어, 자연적 릴랙신-2 구조를 재생성한다는 것을 확인하였다. 도 2의 A는, 예로서, RELAX0019 및 RELAX0023에 대한 LC-MS 데이터를 나타낸다. 비환원 분석은 RELAX0019 및 RELAX0023에 대해 예상 질량이 각각 58932 Da 및 59361Da인 이형이량체의 형성을 확인하였다: 동형이량체는 검출되지 않았다. 환원 분석(도 2의 B)은 쇄 둘 다의 서열 정체를 확인하였고, 이들이 변형이 없다는 것을 나타냈다.
이황화결합을 확인하기 위한 비환원 펩티드 맵핑
이형이량체 Fc-릴랙신(50 μg)을 깨끗한 샘플 튜브에 넣고, 17 μL의 100 mM 인산나트륨 pH 7.0 중에 희석시켰다. 유리 시스테인의 알킬화는 0.5 μL의 5 mg/ml 요오도아세트아미드의 첨가 후에 실온에서 20분 동안의 인큐베이션에 의해 달성되었다. 알킬화 후에, 추가 2.5 μL의 100 mM 인산나트륨 완충제 pH 7.0을 첨가하고, 2.5 μL의 염화나트륨을 첨가하였다. 40 μL 8.0 M 구아니딘 HCl의 첨가에 의해 단백질을 변성시키고, 37℃에서 30분 동안 인큐베이션시켰다. 125 μL의 100 mM 인산나트륨 완충제 pH 7.0을 첨가한 후에 0.5 μL의 40 mM EDTA의 첨가에 의해 희석을 달성하였다. 엔도프로테이나제 Lys-C(Wako Chemicals)를 1 mg/ml의 농도로 물에서 재구성하고, 5 μL를 Fc-릴랙신-2에 첨가하였다. 37℃에서 2시간 동안 분해를 수행하고, 그 후 추가 5 μL의 Lys-C를 첨가하고, 추가 2시간 동안 인큐베이션을 지속하였다. 펩티드 분석을 위해, 42.5 μL의 샘플을 UPLC 바이알에 옮기고, 2.5 μL의 물을 첨가하였다. 이황화결합의 환원을 위해, 2.5 μL의 500 mM DTT를 다른 42.5 μL의 샘플 분취액에 첨가하고, LC-MS 분석 전에 실온에서 15분 두었다.
모두 UNIFI Scientific Information System을 이용하여 작동되는 Xevo G2-XS Q-TOF 기기에 결합된 ACQUITY I-Class UPLC(Waters, 매사추세츠주 밀포드 소재)를 이용하여 펩티드 분석을 수행하였다. LC 시스템의 경우, 용매 A는 0.1% 포름산과 물이었고, 용매 B는 0.1% 포름산과 아세토니트릴이었다(둘 다 UPLC-MS 등급, BioSolve). UV 검출기를 214 nm의 파장에서 측정하도록 설정하고, 바이알을 4℃의 온도를 유지하면서 샘플 챔버에 넣었다. 10 μl 용적을 역상 ACQUITY BEH C18 300 Å-포어 칼럼(Waters 파트 번호: 186003687) 상에 주입하고, 73.5분에 걸쳐 5%에서 37% B까지 용매 B의 증가되는 구배를 이용하여 단백질을 용리시키고, 이어서, 추가 2.5분에 걸쳐 60% B까지 증가시켰다. 77.5분 후에, 칼럼을 5분 동안 95% B에서 유지시켰다.
질량분석기를 50% 2-프로판올 중 2 μg/μL 요오드화나트륨을 주입함으로써 100 내지 2600 m/z로 교정하였고, 락스프레이는 200 pg/μL 류신 엔케팔린이었다. 다음과 같은 핵심 설정으로, 기기를 양의 이온화 모드 및 민감도 분석 모드에서 작동시켰다: 모세관 전압 = 3.0 V; 샘플 콘 전압 = 25 V; 소스 온도 = 100℃; 탈용매화 온도 = 250℃; 콘 기체 유량 = 0 L/h; 탈용매화 기체 유량 = 500 L/h; 질량 범위 = 100~2600 m/z, 스캔 시간 = 0.5초.
예상된 이황화결합을 갖는 서열을 불러오고 Lys-C 생성 펩티드를 매칭하기 위한 검색을 수행함으로써 UNIFI 소프트웨어에서 데이터를 처리하였다. 일단 환원되면, 확인된 이황화-결합된 펩티드가 더 이상 관찰되지 않았다는 것을 입증하기 위해 환원제의 부재 및 존재 하에 얻은 크로마토그램을 오버레이하였다.
쇄 A 및 B를 모두 혼입하는 이황화-결합 릴랙신-2 펩티드에 대한 예상 질량을 매칭하는 펩티드를 도 3 상부에 도시한 바와 같이 확인하였다(SLSLSPGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGGSQLYSALANKCCHVGCTK= LCGRELVRAQIAICGMSTWS=RSLARFC (각각 서열번호 75 내지 77), 3개의 이황화결합을 포함하는 예상 질량 6836.23 Da). 도 3(A 내지 D)은 RELAX0019에 대한 이 펩티드의 식별 및 환원제를 첨가했을 때 펩티드가 더 이상 관찰되지 않았다는 확인을 나타낸다: 패널 A 및 B는 DTT의 부재 및 존재 하에 추출된 이온 크로마토그램을 나타내고, 패널 C 및 D는 펩티드의 대응하는 질량 스펙트럼을 나타낸다. 도 3(E 내지 H)은 RELAX0023에 대한 동일한 펩티드의 식별 및 환원제를 첨가했을 때 펩티드가 더 이상 관찰되지 않았다는 확인을 나타낸다: 패널 E 및 F는 DTT의 부재 및 존재 하에 추출된 이온 크로마토그램을 나타내고, 패널 G 및 H는 펩티드의 대응하는 질량 스펙트럼을 나타낸다. 이들 데이터는 릴랙신 쇄 A 및 B가 이형이량체 RELAX0019 및 RELAX0023 내의 이황화결합을 통해 상호작용한다는 것을 확인한다.
실시예 3: Fc-릴랙신-2 융합체 단백질의 시험관내 활성(세포 기반 cAMP 활성 분석)
다음의 방법에 의해 생물학적 활성, 예를 들어, 하나 이상의 세포 수용체 반응의 자극에 대해 상기 기재한 바와 같이 생성된 릴랙신-2 융합체 폴리펩티드를 시험하였다.
CHO 세포에서 생성된 인간 또는 마우스 수용체를 발현시키는 안정한 세포주를 DiscoverX로부터 구입하였다.
- cAMP Hunter™ CHO-K1 RXFP1 Gs, 세포주 (DiscoverX 카탈로그 번호 95-0127C2)
- cAMP Hunter™ CHO-K1 RXFP2 Gs 세포주 (DiscoverX 카탈로그 번호 95-0140C2)
- cAMP Hunter™ CHO-K1 mRXFP1 Gs 세포주 (DiscoverX 카탈로그 번호 95-0180C2)
이들 수용체의 활성화는 기능적 활성 분석에서 측정될 수 있는 cAMP 제2 전령의 하류 생성을 일으킨다.
소 혈청 알부민(BSA)-기반 분석 완충제를 이용하여 일상적 cAMP 분석을 수행하였다: 0.1% BSA(Sigma # A9418) 및 0.5 mM IBMX(Sigma # I7018)로 보충하고, 1 M NaOH로 pH 7.4까지 조절한 행크스 균형 염 용액(Sigma # H8264).
관심 수용체를 발현하는 세포의 냉동 크리오-바이알을 수조에서 신속히 해동하고, 사전-가온된 세포 배지로 옮기고, 5분 동안 240 × g에서 회전시켰다. 세포를 최적화된 농도(예를 들어, 3.33x104개의 세포/mL에서 hRXFP1)로 세포 배지에서 재현탁시키고, 30 μL의 세포 현탁액을 폴리-D-리신-코팅된 384-웰 플레이트(Greiner # 781946)에 첨가하고, 밤새 부착시켰다. 다음 날 배지를 플레이트에서 튕겨내고, 5 uL의 분석 완충제로 교체하였다. 비-접촉 액체 디스펜서(ECHOTM, Labcyte)를 이용하여 시험 재조합 펩티드 또는 Fc 융합 샘플의 11점 연속 희석물을 세포에 첨가하였다. 모든 샘플 희석을 2회씩 수행하였다. 추가 5 μL 분석 완충제를 각 웰에 첨가하고, 플레이트를 실온에서 30분 동안 인큐베이션시켰다.
제조업체의 권장사항에 따라, 2단계 프로토콜을 따라 상업적으로 이용 가능한 cAMP 다이내믹 GS HTRF 키트(Cisbio, Cat # 62AM4PEJ)를 사용하여 cAMP 수준을 측정하였다. 간략하게, 키트에 제공되는 접합 및 용해 완충액 중 각각 1/20으로 희석하여 항-cAMP 크립테이트(공여자 형광단) 및 cAMP-d2(수용자 형광단)를 개별적으로 제조하였다. 5 μL 항-cAMP 크립테이트를 분석 플레이트의 모든 웰에 첨가하고, 콘주게이트 및 용해 완충액을 첨가한 비-특이적 결합(NSB) 웰을 제외하고, 5 μL cAMP-d2를 모든 웰에 첨가하였다. 플레이트를 1시간 동안 실온에서 인큐베이션한 후, 여기 파장 320 nm 및 방출 파장 620 nm 및 665 nm를 사용하여 Envision(Perkin Elmer) 상에서 판독하였다. 제조업자의 가이드라인에 기재된 바와 같이 데이터를 델타 F%로 전환하고, 이어서, 최대 천연 작용제 반응의 활성화%로 전환하고, EC50 값을 결정하기 위해 4-매개변수 로지스틱 적합화에 의해 분석하였다. 결과를 hRXFP1 세포의 경우에 재조합 h릴랙신-2(h릴랙신-2)(R&D Systems Cat # 6586 RN), mRXFP1 세포에서 m릴랙신-1(mRelaxin-1)(R&D Systems Cat # 6637 RN) 및 hRXFP2 세포에서 INSL3(R&D Systems Cat # 4544 NS)에 대한 대응하는 결과와 비교한다.
통계학 분석 소프트웨어(GraphPad Prism, V6)를 이용하여 데이터 분석을 수행하였다.
시험 작제물의 생물학적 활성을 표 4 및 도 4에서 제공한다. 몇몇 분석으로부터 재조합 인간 릴랙신-2 및 융합체 폴리펩티드 둘 다에 대한 평균 EC50 측정을 표 4에 요약하였다.
RELAX0013, RELAX0014 및 RELAX0010은 참조 단백질이며, 여기서, RELAX0013은 재조합 인간 릴랙신-2이고, RELAX0014는 재조합 뮤린 릴랙신-1이며, RELAX0010은 쇄 A, 15개 아미노산의 링커, 쇄 B, 15개 아미노산의 커넥터 및 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 Fc를 포함하는, WO2018/138170에 기재된 단일 쇄 융합체 단백질이다.
[표 4]
표 4에 제시한 결과로부터, 시험한 이형이량체 Fc 릴랙신 융합체 단백질이 단일 쇄 융합체 RELAX0010 또는 재조합 인간 릴랙신-2 펩티드보다는 덜 강력하였지만, 이들은 여전히 고수준의 생물학적 활성(인간 RXFP1 세포주에서 대략 10 pM 내지 대략 80 pM)을 보유한다는 결론을 내릴 수 있다.
이들 결과는 릴랙신 A 및 B 쇄가 말단 중 하나/둘 다(커넥터는 릴랙신 쇄의 N 또는 C 말단 중 하나에 부착될 수 있음) 이형이량체 Fc의 쇄 중 하나(X 또는 Y)에 융합될 수 있고, 생물학적 활성을 보유한다는 것을 나타낸다. 따라서 본원에 기재한 이형이량체 Fc 릴랙신 융합체 단백질의 형식은 긴 반감기 활성 릴랙신을 생성하기 위한 강한 형식을 구성한다.
이형이량체 Fc를 안정화시키기 위한 이황화결합의 존재는 융합체 단백질의 효력에 영향을 미치지 않았다(RELAX0023 대 RELAX0021, 및 RELAX0024 대 RELAX0022를 비교함).
사용한 두 상부 힌지 영역(GGAGGA (서열번호 78) 및 천연 DKTHT(서열번호 79))는 효력에 영향을 미치지 않았다(RELAX0023 대 RELAX0019, 및 RELAX0024 대 RELAX0020을 비교함). 상부 힌지의 정확한 아미노산 서열은 융합체 단백질의 활성에 중요하지 않다.
실시예 4: 이형이량체 릴랙신-2 Fc 융합체 단백질에서의 커넥터 조성 및 길이의 효과
커넥터는 글리신 및 세린 잔기(GS)로 구성될 수 있거나, 프롤린 및 알라닌 반복부 (PA)로 구성될 수 있다. 본원에 사용되는 커넥터는 6 내지 21개 잔기의 길이를 가졌다. 긴 GS 커넥터의 예는 GGGGSGGGGSGGGGSGGGGGS (서열번호 5)(21개 아미노산)이다. 긴 PA 커넥터의 예는 PAPAPAPAPAPAPAPAPAPAG (서열번호 6)(21개 아미노산)이다.
상이한 길이 및 조성의 커넥터는 이형이량체 릴랙신-2 Fc 융합체 폴리펩티드의 각 Fc-쇄 상에 위치될 수 있다.
다양한 커넥터를 갖는 이형이량체 릴랙신-2 Fc 융합체 단백질의 예를 표 5에 나타낸다. 이 표는 또한 개발 가능성/제조 가능성(세포 배양물 상청액으로부터 단백질 A 포획 후 단량체/비-응집 릴랙신-2 Fc 융합체 단백질의 발현 수율 및 백분율) 및 생물학적 활성에 관한 정보를 나타낸다.
[표 5]
커넥터의 길이 및 조성은 분자의 개발 가능성 양상에 영향을 미친다. 표 5에 나타낸 바와 같이, 16개 이하의 아미노산의 PA 커넥터를 갖는 이형이량체 릴랙신-2 Fc 융합체 폴리펩티드는 제대로 발현하지 않았다. 대조적으로, 21-잔기 길이의 PA 커넥터는 발현 수율을 유의미하게 증가시켰다. GS 커넥터를 갖는 작제물의 발현 수율은 더 일정하다.
짧고 비대칭인(상이한) 커넥터를 갖는 이형이량체 릴랙신-2 Fc 융합체 단백질은 효력을 보유하였다. 생물학적 활성의 감소는 낮은 단량체 함량을 갖는 융합체 단백질(RELAX0109, RELAX0110 및 RELAX0111)에서만 관찰되었다.
실시예 5: 릴랙신-2 서열에서의 점 돌연변이
릴랙신 단일 점 돌연변이 유사체를 이형이량체 Fc 릴랙신-2 융합체 단백질로서 생성하였다. 표 6은 효력 및 유리한 개발 가능성 특성을 보유한 이러한 분자의 예를 나타낸다.
표적화된 천연 잔기는 양으로 하전되며, 단백질분해되기 쉬울 수 있지만, 이의 수용체에 대한 릴랙신 결합에 관여되지 않는다.
예를 들어, 이형이량체 Fc 릴랙신-2 융합체 단백질의 R22X 유사체는 개선된 개발 가능성/제조 가능성 특성을 일관되게 갖는 것으로 여겨진다.
[표 6]
표 6에 제시된 결과는 릴랙신-2 쇄 A의 아미노산 서열의 일부 가변성이 유리한 개발 가능성 특성을 보유하는 동안에 효력의 손실 없이 용인된다는 것을 입증한다.
실시예 6: Fc-릴랙신-2 융합체 단백질의 PK 프로파일
릴랙신 ELISA 분석 및/또는 cAMP 분석을 이용하여 릴랙신-2 융합체 폴리펩티드의 약물동태학(PK) 프로파일을 결정하였다. 6 mg/kg으로 피하(SC) 및/또는 정맥내 (IV) 경로 중 하나에 의해 6 내지 10주령 수컷 C57BL/6J(Jax) 마우스(Jackson Laboratories)에 릴랙신-2 융합체 폴리펩티드를 투여하였다. IV 투여 경로의 경우, 혈청 샘플을 약물 투여 후 5분, 30분 및 60분에 수집한 후에, 3시간 및/또는 6시간 및/또는 8시간 및 24시간에, 그 이후에는 일련의 최소 1일 간격으로 최대 21일까지 수집했다. 유사한 스케줄은 처음 8시간 이내에 덜 빈번한 수집과 함께 SC 투여 경로에 따랐고; 예를 들어, 30분에 첫 번째 샘플을 수집한 후에, 3시간, 8시간, 24시간, 30시간 및 48시간에, 그 이후에는 일련의 최소 1일 간격으로 최대 21일까지 수집했다. 심장 천자에 의해 혈청관 내로 샘플을 수집하고, 15 내지 30분 동안 실온에서 유지하고, 이어서, 수집 30분 이내에 10000 rpm으로 10분 동안 원심분리시켰다. 분취 샘플을 -80℃ 미만에서 보관하고, 이어서, ELISA 또는 cAMP 활성 분석에 의해 시험하였다.
대다수의 분자의 경우, 항-인간 Fc 포획 및 항-h릴랙신-2 검출(인간 릴랙신-2 ELISA 키트로부터의 다클론성 HRP-표지 항체를 이용, R&D Systems Cat# DRL200)을 이용하여 ELISA에서 시험한 RELAX0010(WO2018/138170에 기재함)을 제외하고, PK 샘플을 항-h릴랙신-2 포획(사전 코팅한 인간 릴랙신-2 Quantikine ELISA 키트, R&D Systems Cat# DRL200) 및 항-인간 Fc 검출 항체(HRP로 표지한 AU003)를 이용하여 ELISA에서 시험하였다. 분석 둘 다에서, 포획 항체로 코팅한 플레이트를 1시간 동안 실온에서 100 μL RD1-19 분석 희석제로 차단하였다. 50 μL의 표준 또는 샘플을 각 웰에 첨가하고, 2시간 동안 실온에서 인큐베이션시켰다. 샘플을 흡입하고, 웰을 분석 세척 완충제로 3회 세척하였다. 50 μL의 HRP-표지 검출 항체를 웰마다 첨가하고, 항-인간 Fc-특이적 검출의 경우에 PBS/1% BSA 중 1:1000으로 희석하거나, 항-h릴랙신-2 검출의 경우에 희석하지 않고 사용하였다. 실온에서 1시간 인큐베이션 후에, 3회 세척하고, 웰당 50 μL의 TMB(SureBlue Reserve KPL 53-00-03)를 첨가하고, 일단 색 변화가 발생되면, TMB 중단 용액(KPL 50-85-06)을 웰당 50 μL 첨가함으로써 반응을 중단시켰다.
세포 기반 cAMP 활성 분석에서의 PK 샘플의 생물학적 활성.
Fc-릴랙신-2 융합체 폴리펩티드의 완전성을 평가하도록 기능성 릴랙신-2를 측정하기 위해 상기 약술한 바와 같이 동물로부터 수집한 혈청 샘플을 생물학적 활성에 대해 시험하였다. CHO 세포에서 생성된 인간 RXFP1 수용체를 발현시키는 안정한 세포주를 DiscoverX로부터 구입하였다. 이 수용체의 활성화는 기능적 활성 분석에서 측정될 수 있는 cAMP 제2 전령의 하류 생성을 초래한다.
소 혈청 알부민(BSA)-기반 분석 완충제를 이용하여 cAMP 분석을 수행하였다: 0.1% BSA(Sigma # A9418) 및 0.5 mM IBMX(Sigma # I7018)로 보충하고, 1 M NaOH로 pH 7.4까지 조절한 행크스 균형 염 용액(Sigma # H8264).
릴랙신-2 융합체 폴리펩티드 또는 재조합 릴랙신-2 펩티드(R&D Systems Cat# 6586-RN)의 투약 용액을 분석 완충제 중에 희석시키고, 4가지 기질 농도로 11점 표준 곡선을 생성하기 위해 비-접촉 액체 디스펜서(ECHO, Labcyte)를 사용하였다. 사용한 기질은 모의-투약 동물로부터의 블랭크 혈청이었고, 필요한 농도의 두 배로 웰에 수동으로 첨가하여 세포 첨가를 가능하게 하였다. 시험 샘플을 혈청 관으로부터 384-웰 공급원 플레이트까지 옮기고, 분석 완충제에 4가지 희석제를 설정하는 데 비-접촉 액체 디스펜서(ECHO, Labcyte)에 의해 이를 사용하였다. 모든 샘플 희석을 2회씩 수행하였다.
hRXFP1을 발현시키는 세포의 냉동 크리오-바이알(cryo-vial)을 수욕에서 신속히 해동시키고, 사전-가온된 세포 배지에 옮기고, 5분 동안 240 × g에서 교반하였다. 세포를 8 mL의 세포 배양물 배지에서 재현탁시키고, 10 mL 배양물 배지를 함유하는 T75 플라스크에 파종하고, 밤새 부착시켰다. 어큐타제(accutase)를 이용하여 다음 날 세포를 탈착하고, 5분 동안 240xg에서 교반하였다. 얻어진 세포 펠릿을 최적 농도에서 재현탁시키고, 2.5 μL 세포 현탁액을 Combi-drop 디스펜서를 이용하여 분석 플레이트의 각 웰에 첨가하였다.
제조업체의 권장사항에 따라, 2단계 프로토콜을 따라 상업적으로 이용 가능한 cAMP 다이내믹 2 HTRF 키트(Cisbio, Cat # 62AM4PEJ)를 사용하여 cAMP 수준을 측정하였다. 간략하게, 키트에 제공되는 접합 및 용해 완충액 중 각각 1/20으로 희석하여 항-cAMP 크립테이트(공여자 형광단) 및 cAMP-d2(수용자 형광단)를 개별적으로 제조하였다. 2.5 μL 항-cAMP 크립테이트를 분석 플레이트의 모든 웰에 첨가하고, 콘주게이트 및 용해 완충액을 첨가한 비-특이적 결합(NSB) 웰을 제외하고, 2.5 μL cAMP-d2를 모든 웰에 첨가하였다. 플레이트를 1시간 동안 실온에서 인큐베이션한 후, 여기 파장 320 nm 및 방출 파장 620 nm 및 665 nm를 사용하여 Envision(Perkin Elmer) 상에서 판독하였다. 데이터를 제조업자의 가이드라인에 기재된 바와 같이 델타 F%로 전환하고, 표준 곡선의 선형 부분으로부터 샘플 값을 계산하였다.
결과 및 결론
도 5는 Fc-릴랙신-2 폴리펩티드를 마우스에게 IV 투여한 일련의 생체내 PK 실험으로부터의 데이터의 요약을 나타낸다. 데이터를 5분 시점에 대해 정규화한다.
IV 투여 후 인간 릴랙신-2의 반감기는 인간에서 약 0.09 +/- 0.04시간, 즉, 5.4 +/- 2.4분이다(Chen et al. 1993). 재조합 릴랙신 Fc 융합체 폴리펩티드는 모두 천연 릴랙신-2에 비해 반감기 개선을 나타낸다. 릴랙신 A-쇄 및 B-쇄가 상이한 이형이량체 Fc-쇄에 연결된 Fc-릴랙신 폴리펩티드(RELAX0019, RELAX0023, RELAX0034, RELAX0046 및 RELAX0117로 예시)는 릴랙신 쇄가 링커에 의해 연결된 해당 Fc-릴랙신 폴리펩티드(RELAX0010 및 RELAX0009로 예시)에 비해서 개선된 PK 특성을 갖는다. 그러나, 링커-함유 분자 RELAX0088 및 RELAX0122가 둘 다 양호한 생체내 안정성을 나타내기 때문에, 릴랙신 쇄 A와 쇄 B 사이의 연결 링커의 존재 그 자체는 Fc-릴랙신 폴리펩티드의 빠른 생체내 제거와 직접 연관되지 않는다.
예상치 못하게 본 연구에서, 이형이량체 Fc-릴랙신 융합체 폴리펩티드(RELAX0019, RELAX0023, RELAX0034, RELAX0046, RELAX0117, RELAX0088 및 RELAX0122)는 모두 Fc-릴랙신 융합체 폴리펩티드 RELAX0010 및 RELAX0009에 비해 유의미하게 개선된 약물동태학 특성을 갖는다.
실시예 7: RELAX0019 및 RELAX0023에 의해 확립된 비대 및 섬유증의 반전
심장 비대 및 섬유증을 유도하기 위해 10일 동안 C57B6 마우스에 미니펌프(15 mg/kg/일)를 통해 이소프로테레놀을 주입하였다. 동일한 지속기간 동안 비히클을 주입한 마우스를 기준선 대조군으로서 사용하였다. 10일 후에, 미니펌프를 제거하고, 마우스에 r릴랙신-2(rRelaxin-2)(500 ug/kg/일)을 함유하는 새로운 미니펌프를 제공하거나 또는 RELAX0019(20 mg/kg) 또는 RELAX0023(20 mg/kg)의 피하 주사를 주 1회(QW)로 2회 중 첫 번째로 받았다. 14일의 치료 기간 후에, 마우스를 희생시키고, 비대 및 섬유증의 분석을 위해 이들의 심장을 수집하였다. 비히클 미니펌프의 제거 후에 기준선 대조군 마우스로부터의 심장을 수집하였다. 비대를 경골 길이에 대한 심장 중량의 척도로서 결정하였고, 심장 중량에 대한 콜라겐 함량의 정량화에 의해 섬유증을 확립하였다. 이소프로테레놀의 주입은 이 모델에서 비대와 섬유증을 둘 다 유의미하게 유발하였다. RELAX0019 및 RELAX0023의 QW 투약은 r릴랙신-2의 일정한 주입과 같이 이소프로테레놀-유발 비대를 기준선 수준까지 복귀시켰다. 모든 릴랙신 치료는 또한 심장 섬유증을 50% 초과만큼 감소시켰다. 각각의 군에 있어서 N=8이다. **p<0.01, ***p<0.001, ****p<0.0001
재조합 릴랙신 Fc 융합체 단백질 RELAX0019 및 RELAX0023은 천연 h릴랙신-2와 유사한 방식으로 비대 및 섬유증을 반전시킬 수 있었다(도 6).
실시예 8: 바큘로바이러스 ELISA를 이용하는 Fc-릴랙신-2 단백질의 비특이적 결합의 평가.
CHO 세포에서 RELAX 단백질을 발현시키고, 상기 기재한 바와 같이 정제하였다. 단클론성 항체의 비특이적 결합을 평가하기 위해 개발한 바큘로바이러스 ELISA(Ref: Hotzel et al 2012 mAbs 4:6, 753-760)를 적합화시켜 변형이 있는 Fc-릴랙신 폴리펩티드의 비특이적 결합을 결정하고, 이에 의해, 'BV 점수'(바큘로바이러스 플레이트 흡광도/블랭크 플레이트 흡광도)를 계산하는 대신에, 배경에 대한 신호로서 바큘로바이러스 플레이트 및 블랭크 플레이트에 대해 비특이적 결합을 별개로 계산하였다(배경은 Fc-릴랙신 폴리펩티드의 부재 하에 얻은 값임). 이 측정은, 단클론성 항체와 비교할 때, 코팅 플레이트와 비코팅(블랭크) 플레이트 둘 다에 대한 일부 Fc-펩티드의 비특이적 결합 증가를 반영하기 위해 도입하였다. 각 단백질의 제조는 PBS(Gibco 14190-086) + 0.5% BSA(Sigma A9576) 중 100 nM 또는 10 nM로 이루어졌고, 50 mM 탄산나트륨(BV 플레이트) 중 1% 바큘로바이러스 추출물의 50 μL/웰로 또는 50mM 탄산나트륨(블랭크 플레이트)으로 4℃에서 밤새 코팅한 96-웰 Nunc Maxisorp F 플레이트 상의 ELISA 분석에서 2회 사용하였다. PBS로 세척한 후에, 플레이트를 1시간 동안 실온에서 300 μL/웰의 PBS + 0.5% BSA로 차단하고 PBS로 3회 세척하였다. 50 μL/웰의 PBS + 0.5% BSA(배경) 또는 RELAX 단백질 희석물을 첨가하고, 1시간 동안 실온에서 인큐베이션시켰다. PBS 중 3회 세척한 후에, PBS + 0.5% BSA 중 1:5000으로 희석시킨 검출 항체(항-인간 Fc-특이적 -HRP Sigma A0170)를 50 μL/웰로 첨가하였다. 샘플을 1시간 동안 실온에서 인큐베이션시키고, 플레이트를 PBS 중 3회 세척하였다. 이어서, HRP 기질 - TMB(SureBlue Reserve KPL 53-00-03)을 50 μL/웰로 첨가하고, 색 변화 후에, 50 μL/웰의 0.5M 황산을 첨가함으로써 반응을 중단하였다. 450 nm에서 흡광도를 측정하고, 각 샘플에 대해 비-특이적 결합을 결정하였다. 비-특이적 결합(배경에 대한 배수 결합)을 Fc 릴랙신-2 단백질의 존재 및 Fc 릴랙신-2 단백질의 부재(배경) 하에 비-특이적 결합의 비로서 정하였다. 100 nM 또는 10 nM의 2가지 상이한 농도에서 시험한 Fc-릴랙신-2 단백질에 대한 데이터를 표 7에 나타낸다.
[표 7]
표 7 및 도 7에 나타낸 바와 같이, 이형이량체 릴랙신-2 Fc 융합체 폴리펩티드는, GS 커넥터를 이용하여 릴랙신 쇄를 C-말단에 부착시킬 때, 더 낮은 비-특이적 결합을 나타낸다. 일부 비대칭 및 PA 커넥터, 특정 점 돌연변이 및, 특히 2가 분자(RELAX0117)와 관련하여 N-말단에서의 릴랙신 쇄 배치는 블랭크와 BV-코팅 플레이트 둘 다에 대한 비-특이적 결합을 증가시킨다. 특히 높은 비-특이적 결합을 갖는 일부 Fc-릴랙신 단백질은 고농도(100 nM)와 저농도(10 nM) 둘 다에서 BV-코팅 플레이트보다 블랭크 플레이트에 대한 더 큰 비-특이적 결합을 나타낸다. 대조군 분자 - 링커-함유 2가 RELAX0009, RELAX0010, RELAX0126, RELAX0127 및 RELAX0128은 모두 높은 비-특이적 결합을 입증하지만, 릴랙신의 쇄 A와 B 사이의 링커의 존재도 또는 2-결합가 그 자체도 RELAX0122의 낮은 비-특이적 결합에 의해 입증될 수 있는 바와 같이 높은 비-특이적 결합을 유도하지 않는다.
실시예 9: 용액 중 안정성
RELAX0023의 안정성을 고성능 크기 배제 크로마토그래피(HP-SEC) 및 액체 크로마토그래피-질량 스펙트럼(LC-MS)을 이용하여 평가하였고, RELAX0127 및 RELAX0128과 비교하였다. 280 nm에서의 흡광도에 의한 검출을 이용하는 HP-SEC를 사용하여 순도, 응집 및 단편화를 측정할 수 있다. 분자를 최적화된 제형 조성물로 완충제 교환하고, 이어서, 최대 10 mg/mL까지 농축시켰다. 모든 샘플을 최대 4주 동안 스트레스 온도 조건(40℃)에 두었다. 1, 2 및 4주의 시점에, 샘플을 수집하고, 크기 배제 칼럼에 주입하고, 고정 유속에서 등용매적으로 수성 이동상으로 용리시켰다. 보다 큰 분자는 더 작은 분자보다 크기 배제 칼럼의 기공에서 더 큰 정도로 제외되고, 따라서 더 먼저 용리된다. 단량체 피크보다 더 먼저 용리되는 피크는 응집물로서 기록한다. 단량체 피크 다음에 용리되는 피크(완충제-관련 피크를 제외)를 단편으로서 기록한다. 결과를 순도 백분율; 응집물 백분율; 및 단편 백분율로서 기록하고, 도 8에 나타낸다. RELAX0023이 가장 안정적인 분자이며, 이는, RELAX0128 및 RELAX0127에 대해 순도 손실률이 각각 7.7% 및 9.3%인 것에 비해 1개월당 0.1%만의 순도 손실률%를 가졌다. RELAX0127과 RELAX0128은 둘 다 응집의 징후를 나타냈지만, 그러나 RELAX0023에 대한 응집물 수준은 증가되지 않았고, 이는 더 양호한 물리적 용해 안정성을 나타낸다. 단편화는, RELAX0127의 경우 1개월당 6.6% 단편화 및 RELAX0128의 경우 6.8% 단편화로, 순도 손실에 대한 주요 인자인 것으로 나타났다. RELAX0023만이 1개월당 0.7%의 단편화율을 가졌다. 한편으로, 40℃에서 4주 보관 후에, RELAX0128의 총 피크 면적은 22403에서 18216까지 하락하였고(19%의 감소), RELAX0127은 22225에서 18823까지 하락하였다(15%의 감소). 총 피크 면적의 이런 유의미한 손실은, 높은 단편화 비율과 함께, 이들 두 분자에 의한 잠재적인 높은 화학적 분해를 나타냈다. 총 면적의 이런 손실은 이들 두 분자의 크로마토그램 프로파일에 큰 영향을 미쳤다는 점을 지적해야 한다. 이는 보관 후에 응집 피크 면적의 분명한 증가에도 불구하고, RELAX0128 및 RELAX0127이 이전 시점에 비해 4주에 더 낮은 응집물 백분율을 나타낸 이유를 설명한다. 대조적으로, RELAX0023의 총 피크 면적은 단지 21828에서 21761까지 0.03%만큼 하락하였는데, 이는 RELAX0128 및 RELAX0127에 비해 더 양호한 안정성 프로파일을 나타낸다.
분자의 단편화는 감소된 질량 분석을 이용하는 LC-MS에 의해 추가로 입증되었는데, 이는 RELAX0127 및 RELAX0128의 단편 피크가 40℃에서 보관 후 강도가 증가되었다는 것을 나타냈다(도 9a). 대조적으로, RELAX0023에 대한 단편 피크는 스트레스 후에 변하지 않은 채로 남아있었다. 환원 조건 하에서 질량 스펙트럼은 또한 시간에 따른 RELAX0127 및 RELAX0128의 변형을 나타냈는데, 이는 더 큰 질량으로의 피크 이동 및 더 큰 불균질을 나타내는 피크의 광범위화(broadening)에 의해 입증된다(도 9b). 대조적으로, RELAX0023의 무손상 질량 스펙트럼은 변하지 않고 남아있었는데, 이는 변형이 일어나지 않았다는 것을 나타낸다. 본 연구는 RELAX0023이 RELAX0127 및 RELAX0128에 비해 우수한 물리적 및 화학적 안정성을 갖는다는 것을 나타낸다.
실시예 10: 사이노몰거스 원숭이에서 RELAX0023의 PK 프로파일
샌드위치 ELISA-기반 면역분석을 이용하여 사이노몰거스 원숭이에서 RELAX0023의 약물동태학(PK) 프로파일을 결정하였다. 그룹당 3마리 동물의 4개 그룹에 무작위 배정한 총 12마리의 암컷 사이노몰거스 원숭이에 RELAX0023을 투여하였다. 그룹 1, 2 및 3의 동물에 각각 0.1, 1 및 10 mg/kg의 RELAX0023 SC를 투여하였다. 그룹 4의 동물에 RELAX0023의 10 mg/kg IV 볼루스를 제공하였다. 약물 투여 후 0.25시간, 1시간, 2시간, 4시간, 8시간, 24시간, 48시간, 96시간, 7일, 14일 및 21일에 혈청 샘플을 수집하였다.
분석 플레이트를 염소 항-인간 IgG 항체로 코팅하고, 그룹 1 내지 4 동물로부터의 사이노몰거스 원숭이 혈청과 함께 인큐베이션시켰다. 플레이트에 결합된 RELAX0023을 HRP에 접합된 항-릴랙신 항체에 의해 검출하였다. 플레이트에 첨가하기 전에 사이노몰거스 혈청을 1:10으로 희석시켰다. 100% 혈청 중 정량하한은 0.010 μg/mL이고, 정량상한은 0.300 μg/mL이다.
결과 및 결론
도 10은 단일 용량 후 사이노몰거스 원숭이에서의 RELAX0023의 평균 혈청 농도-시간 프로파일을 나타낸다. 단일 용량을 SC로 투여한 후에, RELAX0023은 0.01 내지 10 mg/kg의 용량 범위에서 선형 PK를 나타냈다. Cmax의 용량 비례 증가가 관찰되었다. 평균 Cmax 값은 0.1, 1 및 10 mg/kg SC 용량 그룹에 대해 각각 0.400, 4.69, 34.8 μg/mL였다. 0.1 mg/kg 내지 10 mg/kg SC 그룹에서 AUC0-last 값에서의 용량-비례 증가가 또한 관찰되었다. 평균 AUC0-last 값은 0.1, 1 및 10 mg/kg SC 용량 그룹에 대해 각각 2.01, 25.5, 193 μg·일/mL였다. 전반적으로, RELAX0023 PK는 51.0 mL/일/kg의 평균 CL/F 및 3.07일의 평균 t1/2로, 0.1 mg/kg 내지 10 mg/kg 범위에서 선형이다. RELAX0023의 SC 생체 이용 가능성을 88.2%로서 추정하였다.
실시예 11: 심부전 및 좌심실 박출률(LVEF) 감소가 있는 사이노몰거스 원숭이(
Macaca fascicularis
)에서 RELAX0023의 만성 효능 평가
심장 기능에 대한 RELAX0023의 만성 효능을 비만 및 노령 사이노몰거스 원숭이(Macaca fascicularis)를 대상으로 평가하였다. 사이노몰거스 원숭이는 계통발생학적으로나 생리학적으로 인간과 밀접한 관계가 있기 때문에 다른 하등 포유류 종에 비해 선택 시험 종으로 선택되었다. 적어도 2년 동안 고지방식을 먹인 나이든 사이노몰거스 원숭이는 심혈관 질환에 취약한 인간 환자와 위험 인자를 공유하며 특징적으로 심부전 및 감소된 LVEF로 진행될 수 있는 대사 증후군을 발생시킨다. LVEF에 대한 RELAX0023의 효과는 연구 1주차에 첫 번째 용량을 투여한 후 18주간의 관찰 기간을 거쳐 20주 동안 다양한 용량 수준으로 피하(SC) 주사로 투여했을 때 평가하였다. 적어도 2년 동안 고지방식을 먹인, 체중이 6~15 kg인 12~20세의 나이든 비만 사이노몰거스 원숭이 약 100마리로 이루어진 풀에서, 38마리의 원숭이가 2D 심초음파 스크리닝에 의해 30~60%의 LVEF를 갖는 것으로 확인되었다. 이 연령의 건강한 원숭이의 체중은 5~8 kg이고 LVEF는 70~75%이므로 LVEF가 60% 이하이면 HFrEF 모델을 나타낸다. 확인된 동물을 선택하여 각각 8마리의 원숭이로 구성된 3개의 처리 그룹과 14마리의 원숭이로 구성된 비히클 그룹에 무작위로 할당했다. 투약 기간은 3가지 상승 용량 수준(모두 10 mg/kg 미만; 소위 각각 "저", "중" 및 "고" 용량)의 RELAX0023의 주 1회 피하 투여로 구성되었다.
2D 심장초음파에 의한 심장 기능 측정은 기준선 -2주차와 5주, 9주, 13주, 17주, 21주, 25주, 29주, 33주차의 투약 및 투약 후 관찰 기간에 9회 결정하였다. 추가 2D 심장초음파는 39주차(연구 종료)에 예정되어 있다. LVEF를 포함한 매개변수는 정점 2챔버 및 4챔버 뷰와 복엽 방법을 기반으로 했다. HDO(High Definition Oscillometry)를 사용하여 평균 동맥압(MAP) 및 심박수(HR)를 포함한 매개변수를 측정하였다.
결과 및 결론
RELAX0023은 심박수나 혈압에 영향을 미치지 않고 비히클 대조군과 비교하여 모든 RELAX0023 용량 수준에서 5주, 9주, 13주, 17주 및 21주에 LVEF를 크게 개선할 수 있었다(도 12). 놀랍게도, RELAX0023 치료 후 0주차(기준선)와 비교하여 개선된 LVEF는 치료 종료 후 연구 33주차까지 휴약 기간 전반에 걸쳐 관찰되었다. 이러한 놀라운 결과는 치료된 동물의 혈류역학이 현저히 개선되었음을 나타내며, 이 모델에서 심부전 치료에 있어 RELAX0023의 효능을 명확하게 입증한다. 더욱이, 치료 후 지속적인 반응의 규모는 본 발명자들이 아는 한, 이러한 작용 경로 기전을 표적으로 하는 임의의 다른 공지된 화합물에 의해 이전에 달성된 적이 없었다. 원숭이는 연구 39주차까지 계속 모니터링된다.
실시예 12: 건강한 지원자 및 심부전 환자에서의 1상(Ph1) 연구
연구 D8330C00001은 Ia/b상 무작위 배정, 단일 맹검, 위약 대조, 인간 최초(FTIH) 연구였다(ClinicalTrials.gov 식별번호 NCT04630067). 연구의 1차 목적은 RELAX0023("AZD3427"이라고도 함)의 단일 및 다중 상승 용량의 안전성과 내약성을 평가하는 것이었고, 2차 목적은 AZD3427의 단일 및 다중 상승 용량의 (i) 약물동태학(PK) 및 (ii) 면역원성을 평가하는 것이었다.
연구는 파트 A와 파트 B의 2개 부분으로 수행되었다. 파트 A는 건강한 참가자(임신 가능성이 없는 여성 및 남성)에서의 단일 상승 용량(SAD) 연구였고, 파트 B는 HF 참가자(임신 가능성이 없는 여성 및 남성)에서의 다중 상승 용량(MAD) 연구였다.
파트 B에는 6개 코호트에 걸쳐 48명의 환자가 포함되었다(각 코호트에는 8명의 참가자). 이 중 3개 코호트는 HFrEF 참가자(코호트 1b, 3b 및 5b)로 구성되었으며 3개 코호트는 EF ≥41%인 HF 참가자(코호트 2b, 4b 및 6b)로 구성되었다. HFrEF 코호트 및 EF ≥41%인 HF 코호트의 용량 수준은 5주 동안 매주 1회(QW) 투여된 5 mg(코호트 1b, 2b), 15 mg(코호트 3b, 4b) 및 45 mg(코호트 5b, 6b)이었다(즉, 총 5회의 용량).
6개 코호트에 걸쳐 48명의 환자가 포함된 파트 B의 경우 포함 기준은 다음을 포함하였다: (i) 모든 코호트: C기 HF(NYHA 등급 I~III)의 임상 진단이 알려져 있고 스크리닝 전 적어도 12주 동안 상당한 용량 변화나 해당 기간 동안 추가된 새로운 약물 없이 안정적인 의학적 치료를 받고 있는 경우, (ii) 코호트 1b, 3b, 5b: EF≤ 40%로 정의된 HFrEF 진단을 받은 환자, (iii) 코호트 2b, 4b, 6b: EF ≥ 41%인 HF 진단을 받은 환자(EF ≥ 50%로 정의된 HFpEF 진단을 받은 환자 포함), (iv) 모든 코호트: BMI가 18~40 kg/m2이고 체중이 55 kg 이상 120 kg 이하, (v) 모든 코호트: NT-proBNP > 125 pg/mL 또는 BNP > 35 pg/mL의 사전 기록.
실시예 13: HF 환자에서의 Ph1 AZD3427 MAD 연구 결과
파트 B MAD 코호트에서는 HFpEF 및 HFrEF 환자에 대한 데이터가 통합되었다. 추세에 따르면 AZD3427은 개선된 심박출량 및 일회박출량(SV), 감소된 전신 혈관 저항(SVR) 및 개선된 기관 관류(SVR 및 eGFR)를 포함하여 심장 기능을 개선하였다(도 13a 내지 도 6f).
MAD 코호트에서는 대상체의 고혈압 상태가 확인되지 않았지만 심박출량 및 일회박출량(SV)의 개선, 전신 혈관 저항(SVR)의 감소, 추정 사구체 여과율(eGFR)의 증가 및 이에 따른 기관 관류(SVR 및 eGFR) 개선이 관찰되어 HF + PH 환자에게 도움이 될 것으로 예상된다.
실시예 14: Ph2b 연구 - 좌심장병으로 인한 심부전 및 폐고혈압(세계보건기구[WHO] 그룹 2)이 있는 참가자에서 AZD3427의 무작위, 위약 대조, 다기관, 용량 범위 연구.
본 연구(연구 ID 번호: D8330C00003)는 심부전(HF) 및 폐고혈압(PH) 그룹 2 참가자에서 24주 치료 후 AZD3427이 폐혈관 저항(PVR)을 감소시키는 능력을 평가하기 위한 것이다.
약 220명의 참가자가 4개의 치료 그룹(1:1:1:1 비)으로 무작위 배정되어 24주 동안 2주마다 AZD3427 또는 위약의 피하(SC) 주사를 받게 된다. 본 연구는 AZD3427의 3가지 용량 수준(용량 A, 용량 B 및 용량 C)을 평가한다. 용량 수정은 이 연구에 적용되지 않는다. 본 연구는 추정상 15개국의 약 60개 연구 센터에서 수행될 것이다. 이 연구에는 대략 16회의 연구 방문이 포함된다: 스크리닝 기간 동안 2회 방문, 치료 기간 동안 13회 방문, 추적조사 기간 동안 1회 방문. 예상되는 총 연구 기간은 스크리닝 기간의 길이에 따라 32~37주이다.
참가자는 1일부터 155일까지 24주 동안 2주에 한 번씩 AZD3427의 단일 피하 용량(용량 A, B 또는 C) 또는 위약을 투여받게 된다.
1차 결과 척도는 24주 치료 후 폐혈관 저항(PVR)의 기준선으로부터의 변화이다. 또한, HF 및 PH 그룹 2 참가자에서 24주 치료 후 우심도관삽입(RHC)으로 측정한 PVR 매개변수에 대한 AZD3427의 효과를 위약과 비교하여 평가할 것이다.
2차 결과 척도에는 다음이 포함된다:
* 평균 폐동맥압(mPAP)의 기준선으로부터의 변화
* 폐동맥 쐐기압(PAWP)의 기준선으로부터의 변화
* 심박출량의 기준선으로부터의 변화
* 일회박출량(SV)의 기준선으로부터의 변화
* 박출률(EF)의 기준선으로부터의 변화
* 좌심실 전반적인 종축 움직임(left ventricular global longitudinal strain, LVGLS)의 기준선으로부터의 변화
* 폐동맥 수축기압(PASP)의 기준선으로부터의 변화
* 우심실/좌심실(RV/LV) 비율의 기준선으로부터의 변화
* 우심실 유출로 가속 시간(RVOT AT)의 기준선으로부터의 변화
* 삼첨판 역류 속도(TRV)의 기준선으로부터의 변화
* TAPSE/PASP[삼첨판면 수축기 운동(Tricuspid annular plane systolic excursion)/폐동맥 수축기압]의 기준선으로부터의 변화
* 우심실 움직임/폐동맥 수축기압(RVS/PASP)의 기준선으로부터의 변화
* 흡기 허탈을 동반한 하대정맥(IVC) 직경의 기준선으로부터의 변화
* 전신 혈관 저항의 기준선으로부터의 변화
* 6분 보행 거리(6MWD)의 기준선으로부터의 변화
* 캔자스시티 심근병증 설문지 총 증상 점수(KCCQ TSS)의 기준선으로부터의 변화
* 뉴욕 심장 학회 기능 등급(NYHA FC)의 기준선으로부터의 변화
* 혈청 크레아티닌의 기준선으로부터의 변화
* 뇌 나트륨 이뇨펩티드(NT-proBNP)의 N-말단 프로호르몬의 기준선으로부터의 변화
* 시스타틴 C의 기준선으로부터의 변화
* eGFR(예상 사구체 여과율)의 기준선으로부터의 변화
포함 기준: 1. 참가자는 18세 이상이어야 한다. 2. 참가자는 HF, NYHA 기능 등급(FC) II ~ IV의 기존 진단 및 2022년 좌심장병으로 인한 폐고혈압(PH-LHD) 유럽심장학회/유럽호흡기학회(ESC/ESR) 지침에 따라 PH-LHD 또는 PH-LHD의 가능성 또는 중간 단계 가능성의 기존 진단을 받아야 한다. 참가자는 이뇨제를 포함한 안정적인 HF 표준 치료 약물을 복용 중이어야 한다. 3. 참가자는 2022 ESC/ERS 지침에 따라 PH의 중간 단계 또는 높은 가능성을 보여주는 심장초음파 매개변수의 조합을 가져야 한다. 4. 참가자는 스크리닝 방문 2에서 스폰서가 제공한 RHC 매뉴얼에 따라 수행된 RHC의 연구 중 폐동맥 압력 상승을 나타내야 한다: (a) PAWP ≥ 15 mmHg (b) mPAP ≥ 20 mmHg 5. 최소 체중 50 kg. 6. 서명된 사전 동의를 제공할 수 있다.
제외 기준 1. 세계보건기구(WHO) 그룹 1, WHO 그룹 3, WHO 그룹 4 또는 WHO 그룹 5에서 PH 진단. 2. 임상적으로 중요한 질환이나 장애의 과거 또는 현재 증거. 3. 비대상성 HF 또는 임의의 입원. 4. RHC에 대한 임의의 금기 사항. 5. SC 주사 또는 장치에 대한 과민증의 병력. 6. AZD3427 또는 AZD3427 의약품의 임의의 성분과 유사한 화학 구조 또는 클래스를 갖는 약물에 대한 과민증 병력, 또는 진행 중인 임상적으로 중요한 알레르기/과민증. 7. 1초 동안 강제 호기량/폐활량(FEV1/VC)< 30%인 알려진 폐 질환. 8. 선천성 긴 QT 증후군. 9. 치료를 필요로 하는 심장 심실 부정맥. 심방 세동 또는 조동이 있고 심실 박동수가 조절되는 참가자는 허용된다. 10. 심장 이식 또는 심실 보조 장치 이식의 병력 또는 예상. 11. 임의의 알려진 계획된(예정된) 고도로 침습적인 심혈관(CV) 시술(예를 들어, 관상동맥 재개통, 심방 세동/조동 절제, 판막 복구/교체, 대동맥류 수술 등). 12. 이전에 AZD3427을 받은 참가자.
[표 8]
서열목록 전자파일 첨부
Claims (33)
- 폐고혈압을 동반한 심부전이 있는 대상체를 치료하는 방법으로서, 대상체에게 유효량의 이형이량체 융합체를 투여하는 단계를 포함하고, 이형이량체 융합체는
(i) 적어도 하나의 릴랙신 A 쇄 폴리펩티드 또는 이의 변이체에 연결된 제1 이형이량체화 도메인; 및
(ii) 적어도 하나의 릴랙신 B 쇄 폴리펩티드 또는 이의 변이체에 연결된 제2 이형이량체화 도메인을 포함하고,
제1 이형이량체화 도메인은 제2 이형이량체화 도메인과 이형이량체화하고, 이형이량체 융합체는 릴랙신 활성을 갖는, 방법. - 제1항에 있어서, 이형이량체 융합체의 릴랙신 A 쇄 폴리펩티드 및 릴랙신 B 쇄 폴리펩티드는 적어도 하나의 쇄간 이황화결합에 의해 공유 결합된, 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 이형이량체 융합체의 릴랙신 A 쇄와 릴랙신 B 쇄는 서로 아미노산 링커에 의해 공유적으로 연결되지 않는, 방법.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 이형이량체 융합체의 릴랙신 A 쇄는 릴랙신-2 A 쇄이고, 이형이량체 융합체의 릴랙신 B 쇄는 릴랙신-2 B 쇄인, 방법.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 이형이량체 융합체의 릴랙신 A 쇄는 커넥터를 통해 제1 이형이량체화 도메인에 연결되고, 이형이량체 융합체의 릴랙신 B 쇄는 커넥터를 통해 제2 이형이량체화 도메인에 연결되되, 선택적으로 하나 또는 바람직하게는 둘 다의 커넥터는 폴리펩티드인, 방법.
- 제5항에 있어서, 이형이량체 융합체의 커넥터 중 하나 또는 바람직하게는 둘 다는 6 내지 40개의 아미노산 길이를 갖고, 예를 들어, 하나 또는 바람직하게는 둘 다의 커넥터는 21개의 아미노산 길이를 갖는, 방법.
- 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 이형이량체 융합체의 제1 및 제2 이형이량체화 도메인은 면역글로불린 Fc 영역(각각 "제1 Fc 영역" 및 "제2 Fc 영역")으로부터 유래되되, 선택적으로 제1 및 제2 Fc 영역은 불변 도메인 CH2 및 CH3을 포함하는, 방법.
- 제7항에 있어서, 제1 Fc 영역의 C-말단은 릴랙신 A 쇄의 N-말단에 연결되고, 제2 Fc 영역의 C-말단은 릴랙신 B 쇄의 N-말단에 연결된, 방법.
- 제7항 또는 제8항에 있어서, 제1 및 제2 Fc 영역은 이형이량체화-촉진 아미노산 돌연변이 및/또는 변형을 포함하되, 선택적으로 이형이량체화-촉진 아미노산 돌연변이는 "Fc 노브" 및 "Fc 홀" 돌연변이, 예를 들어, CH3 도메인에 존재하는 "Fc 노브" 및 "Fc 홀" 돌연변이인, 방법.
- 제7항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 및 제2 Fc 영역은 인간 IgG1 면역글로불린으로부터 유래된, 방법.
- 제10항에 있어서, 이형이량체화-촉진 아미노산 돌연변이는
a. 하나의 CH3 도메인에서의 "Fc 홀" 돌연변이 Y349C, T366S, L368A 및 Y407V; 및
b. 다른 CH3 도메인에서의 "Fc 노브" 돌연변이 S354C 및 T366W를 포함하고,
아미노산 넘버링은 Kabat에서와 같이 EU 지표에 따르는, 방법. - 제11항에 있어서,
a. 제1 Fc 영역은 "Fc 노브" 돌연변이를 포함하고, 제2 Fc 영역은 "Fc 홀" 돌연변이를 포함하거나;
b. 제2 Fc 영역은 "Fc 노브" 돌연변이를 포함하고, 제1 Fc 영역은 "Fc 홀" 돌연변이를 포함하는, 방법. - 제10항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 및/또는 제2 Fc 영역은 아미노산 돌연변이 L234F, L235E 및 P331S를 포함하되, 아미노산 넘버링은 Kabat에서와 같이 EU 지표에 따르는, 방법.
- 제4항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 이형이량체 융합체의 릴랙신-2 A 쇄 폴리펩티드는 서열번호 1에 제시된 바와 같은 서열 또는 이의 변이체를 포함하고, 이형이량체 융합체의 릴랙신-2 B 쇄 폴리펩티드는 서열번호 2에 제시된 바와 같은 서열 또는 이의 변이체를 포함하는, 방법.
- 제14항에 있어서, 이형이량체 융합체의 릴랙신-2 A 쇄 폴리펩티드는 아미노산 돌연변이 K9H, K17M 또는 K17I를 포함하는, 방법.
- 제5항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 이형이량체 융합체의 커넥터는 둘 다 서열 GGGGSGGGGSGGGGSGGGGGS [서열번호 5]를 갖는, 방법.
- 폐고혈압을 동반한 심부전이 있는 대상체를 치료하는 방법으로서, 대상체에게 유효량의 이형이량체 융합체를 투여하는 단계를 포함하고, 이형이량체 융합체는
(i) FcX-con-A 융합체 폴리펩티드; 및
(ii) FcY-con-B 융합체 폴리펩티드를 포함하고,
여기서,
A는 릴랙신 A 쇄 또는 이의 변이체, 예를 들어, 릴랙신-2 A 쇄 또는 이의 변이체이고;
B는 릴랙신 B 쇄 또는 이의 변이체, 예를 들어, 릴랙신-2 B 쇄 또는 이의 변이체이고;
FcY는 인간 IgG1 면역글로불린의 불변 도메인 CH2 및 CH3을 포함하는 Fc 영역이고, "Fc 홀" 아미노산 돌연변이 및/또는 변형, 바람직하게는 아미노산 돌연변이 Y349C: T366S:L368A:Y407V를 포함하며;
FcX는 "Fc 노브" 아미노산 돌연변이 및/또는 변형을 갖고, 바람직하게는 인간 IgG1 면역글로불린의 불변 도메인 CH2 및 CH3을 포함하는 Fc 영역이고, "Fc 노브" 아미노산 돌연변이 및/또는 변형, 바람직하게는 아미노산 돌연변이 S354C:T366W를 포함하며;
con은 바람직하게는 서열 GGGGSGGGGSGGGGSGGGGGS [서열번호 5]를 갖는 커넥터 폴리펩티드이되,
아미노산 넘버링은 Kabat에서와 같이 EU 지표에 따르며, FcX는 FcY와 이형이량체화하고, 이형이량체 융합체는 릴랙신 활성을 갖는, 방법. - 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 이형이량체 융합체는 서열번호 11의 아미노산 서열을 갖는 융합체 폴리펩티드 및 서열번호 20의 아미노산 서열을 갖는 융합체 폴리펩티드를 포함하는, 방법.
- 제8항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 이형이량체 융합체는 하나 이상의 Fab를 추가로 포함하되, 선택적으로 이형이량체 융합체는 제1 Fc 영역의 N-말단에 연결된 하나의 Fab 및 제2 Fc 영역의 N-말단에 연결된 제2 Fab를 포함하는, 방법.
- 제8항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 이형이량체 융합체는 제1 Fc 영역의 N-말단에 연결된 제2 릴랙신 A 쇄 폴리펩티드 또는 이의 변이체 및 제2 Fc 영역의 N-말단에 연결된 제2 릴랙신 B 쇄 폴리펩티드 또는 이의 변이체를 더 포함하되, 선택적으로 제2 릴랙신 A 쇄는 커넥터 폴리펩티드를 통해 제1 Fc 영역에 연결되고, 제2 릴랙신 B 쇄는 커넥터 폴리펩티드를 통해 제2 Fc 영역에 연결된, 방법.
- 폐고혈압을 동반한 심부전이 있는 대상체를 치료하는 방법으로서, 대상체에게 유효량의 이형이량체 융합체를 투여하는 단계를 포함하고, 이형이량체 융합체는
(i) FcX-B-L-A 및 FcY, 선택적으로 FcY-B-L-A; 또는
(ii) FcY-B-L-A 및 FcX, 선택적으로 FcX-B-L-A를 포함하고,
여기서,
FcY는 "Fc 홀" 아미노산 돌연변이 및/또는 변형을 갖고, 바람직하게는 아미노산 돌연변이 Y349C:T366S:L368A:Y407V를 갖는 CH3 도메인을 포함하는 면역글로불린 Fc 영역이고;
FcX는 "Fc 노브" 아미노산 돌연변이 및/또는 변형을 갖고, 바람직하게는 아미노산 돌연변이 S354C:T366W를 갖는 CH3 도메인을 포함하는 면역글로불린 Fc 영역이며;
B는 릴랙신 B 쇄 또는 이의 변이체, 예를 들어, 릴랙신 2 B 쇄 또는 이의 변이체이고;
A는 릴랙신 A 쇄 또는 이의 변이체, 예를 들어, 릴랙신 2 A 쇄 또는 이의 변이체이고;
L은 바람직하게는 아미노산 서열 GGGSGGGSGG[서열번호 60]을 갖는 링커 폴리펩티드이되,
아미노산 넘버링은 Kabat에서와 같이 EU 지표에 따르며, FcX는 FcY와 이형이량체화하고, 이형이량체 융합체는 릴랙신 활성을 갖는, 방법. - 제21항에 있어서, 이형이량체 융합체의 릴랙신 B 쇄는 커넥터, 선택적으로 6 내지 40개의 아미노산 길이, 예를 들어, 21개의 아미노산 길이를 갖는 커넥터 폴리펩티드를 통해 FcX 및/또는 FcY에 연결된, 방법.
- 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 참조 릴랙신 단백질의 릴랙신 활성에 대한 이형이량체 융합체의 릴랙신 활성의 비율은 약 0.001 내지 약 10인, 방법.
- 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 심부전은 박출률 감소 심부전, 중간 범위 박출률 심부전 또는 박출률 보존 심부전인, 방법.
- 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체의 평균 폐동맥압은 약 25 mmHg 이상, 폐동막 쐐기압(PAWP)은 15 mmHg 초과, 및/또는 우심실 수축기압은 약 40 mmHg 이상인, 방법.
- 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체의 폐혈관 저항은 3.0 미만의 우드 단위인, 방법.
- 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체의 폐혈관 저항은 3.0 이상의 우드 단위인, 방법.
- 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체는 혈압 모니터링 장치, 바람직하게는 폐동맥 압력 모니터링 장치가 장착되어 있는, 방법.
- 제28항에 있어서, 폐동맥 압력 모니터링 장치는 CardioMEMS 압력 모니터링 장치인, 방법.
- 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 이형이량체 융합체는 이형이량체 융합체 및 약제학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는 약제학적 조성물로서 투여되는, 방법.
- 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 이형이량체 융합체 또는 약제학적 조성물은 대상체에게 피하 주사에 의해 투여되는, 방법.
- 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 이형이량체 융합체 또는 약제학적 조성물은 자가-투여에 의해 투여되는, 방법.
- 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 이형이량체 융합체 또는 약제학적 조성물의 투여는 투여 전 기준선 수준과 비교하여 다음 중 하나 이상을 초래하는, 방법:
(a) 감소된 PVR;
(b) 감소된 mPAP;
(c) 감소된 ePAD;
(d) 증가된 심장의 일회박출량(SV);
(e) 감소된 전신 혈관 저항(SVR) 및/또는 증가된 추정 사구체 여과율(eGFR);
(f) 증가된 박출률; 및/또는
(g) 증가된 심박출량.
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