KR20240119292A - 높은 용해도를 갖는 foxy-5 헥사펩타이드의 안정적인 조성물 - Google Patents

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KR20240119292A
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Abstract

본 개시내용은 Wnt 헥사펩타이드 Foxy-5의 신규하고 가용성이 높은 조성물에 관한 것이다. 본 개시내용은 또한 상기 조성물의 제조방법 및 이의 안정성 평가에 관한 것이다.

Description

높은 용해도를 갖는 FOXY-5 헥사펩타이드의 안정적인 조성물
본 개시내용은 Wnt 헥사펩타이드 Foxy-5의 신규하고 가용성이 높은 조성물에 관한 것이다. 본 개시내용은 또한 상기 조성물의 제조방법 및 이의 안정성 평가에 관한 것이다.
Foxy-5는 포르밀화된 WNT5A 유래 헥사펩타이드 및 잠재적인 항전이 활성을 지닌 WNT5A 모방체로 현재 여러 일반적인 형태의 암에서 종양 확산 및 재발을 예방하기 위한 약물 후보로 개발되고 있다. Foxy-5에는 다음 공식이 있다. For-Met-Asp-Gly-Cys-Glu-Leu-OH (SEQ_NO 1
, 도 1).
정맥 투여 시 Foxy-5는 주로 Frizzled 계열의 WNT5A 수용체에 결합하여 이를 활성화하여 WNT5A 매개 신호 전달을 활성화한다.
Foxy-5는 전이 위험을 줄이기 위해 WNT5A 리간드가 암 억제 인자로 작용하는 암 유형 환자에서 나타나는 종양 조직의 WNT5A 단백질 결핍을 보상하기 위한 것이다. 최근 3기 대장암 환자를 대상으로 한 후향적 연구의 하위 분석에서는 WNT5A 발현이 낮은 환자의 비율이 2기 대장암(CRC) 환자를 대상으로 한 이전 연구에서 관찰된 비율보다 훨씬 높은 것으로 나타났다. CRC 3기 종양 환자는 주로 원발 종양에 인접한 림프절에 종양 세포가 존재하여 더 공격적이고 빠르게 진행된다는 점에서 2기와 다르다. 저수준의 WNT5A는 3기 환자의 약 70%에서 관찰되었는데 이는, 덜 진행된 종양 단계의 환자에서 약 45%가 관찰된 것과 대비되는 것이다. 유방암 조직에서도 비슷한 결과가 나타났는데, 공격적인 삼중음성 유방암의 70%에서 WNT5A의 부재 또는 낮은 수준이 관찰된 반면, 덜 공격적인 유방암 유형에서는 약 45%가 관찰되었다. 유방암, 결장암, 전립선암 및 간세포암을 포함한 여러 유형의 암에서 원발 종양의 WNT5A 결핍 또는 낮은 수준은 WNT5A 단백질이 정상적으로 또는 정상에 가깝게 발현되는 종양과 비교할 때 더 빠른 재발과 관련이 있음이 입증되었다. 이는 WNT5A 수준이 질병 경과에 큰 영향을 미친다는 가설을 뒷받침한다.
약물 후보의 안전성 프로파일, 약동학 및 2상 용량 결정을 문서화하기 위한 Foxy-5의 완료된 1b상 연구에 기초하여, Foxy-5에 대해, 현재 진단 시점에서 원발 종양을 외과적으로 절제한 후 재발 위험이 높은 것으로 간주되는 II/III기 대장암 환자를 포함하는 2상 임상 시험인 NeoFox 연구가 진행 중에 있다. 재발 위험 평가는 확립된 평가 기준에 따라 수행된다. 연구의 목적은 Foxy-5가 주로 WNT5A 발현이 낮은 환자에서 재발 위험을 감소시킨다는 것을 입증하는 것이다. 해당 연구는 현재 스페인(16)과 헝가리(12)의 28개 병원에서 진행 중이다.
Foxy-5 그 자체와 그 제조를 위한 고전적 고체상(SPSS) 방법은 국제특허 공개번호 WO 2006/130082(암 세포 이동을 손상시키는 펩타이드 리간드)에 설명되어 있다. 전임상 및 초기 임상 연구를 위한 활성 제약 성분(API)이 이 경로를 통해 생산되었다. 출원인이 개발한 Foxy-5의 용액상 경로는 국제특허 공개번호 WO 2020/038878(Wnt 헥사펩타이드용 용액상 경로) 및 WO 2020/120198(Wnt 헥사펩타이드용 선형 용액상 합성)에 개시되어 있다.
현재 Foxy-5 제조 공정에서는 물에 대한 무염 약물 물질(DS: drug substance)의 제한된 용해도로 인해 단지 3g/L의 최종 동결건조를 위한 제품 농도가 적용된다. 이는 Foxy-5의 상업적 제조에 대한 생산 처리량을 심각하게 제한하는 병목 현상을 일으킨다.
이 문제를 극복하려는 초기 시도에서는 30% 아세토니트릴 수용액(순수한 물 대신)을 용매로 사용하는 대체 동결건조 공정이 개발되었다. 35g 규모의 소규모 실험을 통해, 개발된 공정이 최대 7g/L의 DS 농도에 적용 가능하다는 것이, 즉 >100%의 생산성 증가가 입증되었다. 이 성과는 인상적이기는 하지만 그럼에도 불구하고, 최종 단계에서 그와 같이 높은 희석을 필요로 한다는 점에서 Foxy-5를 상업적 규모로 생산하는 것은 여전히 문제가 남아 있다.
결과적으로, 용매 극성 조정이 아닌 다른 가용화 기술을 통한 배치 크기의 증가가 제안되었다. 약물 제품(DP: drug product) 제형 연구를 통해 Foxy-5의 무염 형태에서 나트륨 염으로의 변화는 DS 용해도를 적어도 20g/L 수준으로 증가시키는 것으로 알려졌다.
이러한 맥락에서 Foxy-5는 3개의 카르복실산 모이어티를 포함하고 말단 아미노기가 포르밀화됨에 따라 유리 아미노기가 없다는 것이 주목된다(도 1 ). 따라서 염기성/알칼리성 화합물을 사용하여 Foxy-5 염을 제조하는 것만 가능하다. 일부 정밀 화학 공급업체는 "Foxy-5의 트리플루오로아세트산 염"으로 판매되는 화합물을 제공하는데, 이는 실제로 유리 트리플루오로아세트산을 함유한 동결건조물일 뿐이다.
Foxy-5의 나트륨염으로의 전환이 출원인에 의해 조사되었다. Foxy-5에는 3개의 카르복실기(Asp2, Glu5, 및 C-말단 카르복실산)가 포함되어 있으므로 Foxy-5의 수성 슬러리(25 g/L)를 1eq., 2eq. 및 3eq.의 수산화나트륨으로 처리하여 일, 이 및 삼나트륨 염이 생성되었다. 출발 물질로서, 두 가지 알려진 불순물인 아스파르트이미드(< 0.1%)와 이량체(< 0.1%)를 매우 적은 양으로 함유하는 Foxy-5 유리산 배치를 사용하였다(구조, 도 2 참조).
Foxy-5의 일나트륨 염은 완전히 용해되지 않았으며 NaOH 첨가(1 eq., pH = 3.84) 직후 겔 형성이 관찰되었다.
이나트륨 염은 NaOH(2 eq., pH = 4.57)를 첨가한 후 10분 이내에 완전히 용해될 수 있었다. 이 용액을 HPLC 분석하자, 아스파르트이미드 불순물의 함량이 증가한 반면 이량체 형성은 무시할 수 있는 수준으로만 검출되었다. 동결건조 후 0.07% 이량체와 0.79% 아스파르트이미드가 검출되었다.
삼나트륨 염은 NaOH(3 eq., pH = 6.76)를 첨가한 후 5분 이내에 용해되었으며 아스파르티미드 불순물은 최소한으로 증가했지만, 이량체 형성은 증가한 것으로 관찰되었다. 동결건조 후, 0.41% 이량체와 0.17%의 아스파르트이미드가 검출되었다.
이들 세 가지 염 중에서 삼나트륨 염이 용해도가 > 100gr/ltr로서 가장 높은 것으로 밝혀졌으므로, 처음에는 유망한 신약 물질 후보로 보였다.
그러나 40℃에서의 안정성 테스트에서 Foxy-5의 삼나트륨 염은 전술한 불순물을 상당한 양으로 빠르게 생성하여(도 3), 40℃에서 4주 후에는 15-20% 수준에 도달한다는 것이 질량 분석법으로 밝혀졌다.
다양한 pH 값에서의 Foxy-5 수용액에 대한 추가 연구를 통해 pH 9에서 완전히 용해된 직후에 아스파르트이미드 함량이 크게 감소하는 것으로 나타났다. Foxy-5 용액을 pH 9에서 2시간 동안 교반한 후(도 4 참조), HPLC 크로마토그램의 아스파르트이미드 피크가 완전히 사라졌다(<LOD). 아스파르티미드의 개환은 높은 pH에서 발생하여 모 화합물과 β-Asp 및 D-Asp 유도체의 형성을 초래하는 것으로 알려져 있다. 그러나 상당한 이량체 형성이 관찰되었다(pH = 9에서 2시간 후 2.5%). 크로마토그램에서 이량체의 식별은 별도로 합성된 표준 물질과의 동시 용리를 통해 확인되었다. 두 가지 알려진 불순물(아스파르트이미드 및 이량체) 외에도 놀랍게도 삼나트륨 염의 세 번째 불순물이 비록 적은 양이기는 하지만, Foxy-5의 탈황된 Cys→Ala 유사체로 확인되었다(도 2 및 3 참조).
요약하자면, Foxy-5를 삼나트륨 염으로 전환하면 물에 대한 용해도를 높일 수 있지만 이 화합물은 너무 불안정하여 약물 물질로서 적합하지 않다. 따라서 추가 임상 시험 공급 및 향후 상업적 목적 모두를 위해 만족스러운 용해도 및 안정성을 갖는 다른 DS 형태의 Foxy-5에 대한 필요성이 여전한 실정이다.
정의
본 명세서에 사용된 용어 "질소 염기(nitrogen base)"는 하나 이상의 질소 원자를 포함하는 염기성 화합물을 의미한다.
본원에 사용된 용어 "일염(mono salt 또는 mono-salt)"은 본원에 정의된 바와 같이 Foxy-5 1 당량 및 질소 염기 0.5-1.45 당량을 포함하는 조성물을 의미할 것이다.
본원에 사용된 용어 "이염(di salt 또는 di-salt)"은 본원에 정의된 바와 같이 Foxy-5 1 당량 및 질소 염기 1.50 - 2.49 당량을 포함하는 조성물을 의미할 것이다.
본원에 사용된 용어 "삼염(tri salt 또는 tri-salt)"은 본원에 정의된 Foxy-5 1 당량 및 질소 염기 2.5 - 3.1 당량을 포함하는 조성물을 의미한다.
본 명세서에 사용된 용어 HT-XRPD는 고처리량 X선 분말 회절을 의미한다.
본 명세서에 사용된 HPLC-CAD라는 용어는 하전 에어로졸 검출 기능이 있는 HPLC를 의미한다.
본 명세서에 사용된 UPLC-MS라는 용어는 질량 분석법 검출 기능을 갖춘 초고성능 액체 크로마토그래피를 의미한다.
본원에 사용된 용어 "열순환(thermocycling)"은 본 발명에 따른 고체 조성물을 용매 또는 용매 혼합물에 현탁시킨 후, 각 사이클에서 생성된 현탁액을 50℃±2℃의 온도에 도달할 때까지 10℃±2℃/hr의 속도로 교반하면서 가열한 다음, 5℃±2℃의 온도가 될 때까지 아래 a. 내지 c.의 속도로 현탁액을 냉각하는 것을 1-3 사이클 수행하는 것을 의미한다:
a. 첫 번째 사이클은 20℃±2℃/h,
b. 두 번째 사이클은 10℃±2℃/hr,
c. 세 번째 사이클은 5℃±2℃/hr.
현탁액을 5℃±2℃에서 1~3일 동안 교반하여 최종 에이징시킨다. 온도 프로파일은 도 11에 나와 있다.
발명의 개요
Foxy-5는 3개의 카르복실산기, 즉 Asp2, Glu5, 및 C-말단 카르복실산기를 포함하는 식 For-Met-Asp-Gly-Cys-Glu-Leu-OH의 포르밀화된 헥사펩타이드로서, 따라서 염기성 화합물과 함께 일염, 이염, 삼염을 형성할 수 있다. Foxy-5는 대략 1:1, 1:2 및 1:3(Foxy-5: 염기)의 비율로 다양한 질소 염기 (본원에서는 적어도 하나의 질소 원자를 함유하는 염기성 화합물로 정의됨)와 함께 가용성이 높은 조성물을 형성한다는 사실이 밝혀졌다. 무정형 동결건조물로 분리된 이들 조성물이 모두 적절하게(화학양론적으로) 염으로 특징화되지는 않았지만, 이하에서는 이들 조성물을 편의상 Foxy-5의 일염, 이염 및 삼염으로 지칭한다.
놀랍게도, 40℃에서 측정했을 때 이들 조성물의 안정성은 상당히 다양한 것으로 밝혀졌는데, 이에 대해서는 이하에서 논의한다. 본 발명에 따른 모든 조성물 및 이들의 불순물 프로파일의 개요가 도 10에 도시되어 있다.
첫 번째 측면에서 본 발명은 For-Met-Asp-Gly-Cys-Glu-Leu-OH(SEQ_NO 1, Foxy-5) 및 암모니아, 4차 수산화암모늄, 알킬화 구아니딘, 아미노산과 1차 및 2차 아민으로부터 선택된 질소 염기를 포함하는 고체 조성물을 제공한다..
두 번째 측면에서 본 발명은 첫 번째 측면에 따른 조성물을 제조하는 방법을 제공하되, 이 방법은 다음 단계들, 즉:
a) i. 용매 중 현탁액, 또는
ii. 순수 분말
로서 For-Met-Asp-Gly-Cys-Glu-Leu-OH(SEQ_NO 1, Foxy-5)의 유리산 형태를
iii. Foxy-5의 일염을 제조하기 위해 질소 염기 0.5-1.49 당량, 또는
iv. Foxy-5의 이염을 제조하기 위해 질소 염기 1.50-2.49 당량, 또는
v. Foxy-5의 삼염을 제조하기 위해 질소 염기 2.5-3.1 당량
과 혼합하는 단계,
b) 투명한 용액이 얻어질 때까지 반응 혼합물을 교반하는 단계,
c) 용액의 침전, 또는 동결건조 또는 분무건조에 의해 고체 조성물을 분리하는 단계
를 포함하고, 여기서 질소 염기는 암모니아, 4차 수산화암모늄, 알킬화 구아니딘, 아미노산, 및 1차 및 2차 아민으로부터 선택된 화합물이고, 모든 단계 a - c는 선택적으로 불활성 대기에서 수행된다.
본 발명의 세 번째 측면에서, 두 번째 측면의 단계 c)의 생성된 고체 조성물은 다음 단계들, 즉:
i. 용매 또는 용매 혼합물에 동결건조되거나 분무건조된 생성물의 현탁액을 제공하는 단계,
ii. 현탁액을 5℃ - 50℃±2℃ 사이에서 1 - 3 사이클을 포함하는 열순환 공정에 적용한 후, 현탁액을 5℃±2℃에서 1-3일 동안 에이징시키는 단계,
iii. 예를 들어 여과 또는 원심분리를 통해 열순환된 제품을 분리하는 단계
를 포함하는 열순환 공정을 추가로 거치게 되며, 열순환 공정 동안 현탁액은 50℃±2℃의 온도에 도달할 때까지 10℃±2℃/hr의 속도로 가열된 후, 5℃±2℃의 온도에 도달할 때까지 다음 속도로 냉각된다:
a. 첫 번째 사이클의 경우 20℃±2℃ /h,
b. 두 번째 사이클의 경우 10℃±2℃/hr,
c. 세 번째 사이클의 경우 5℃±2℃/hr.
현탁액은 예컨대 여과 또는 원심분리 등을 통해 분리되기 전에 5℃±2℃에서 1~3일 동안 교반에 의해 최종적으로 에이징된다.
열순환 공정의 온도 프로파일은 도 11에 나와 있다.
도 1
이 도면은 Foxy-5(SEQ_NO 1)의 화학 구조를 보여준다. Foxy-5는 포르밀화된 N 말단을 가진 6개의 아미노산으로 구성된 선형 펩타이드이다. 모든 광학 활성 아미노산 잔기는 L-배열로 되어 있다. Foxy-5의 분자식은 C26H42N6O12S2이고, 분자질량은 694.8 g/mol(평균질량)이다.
도 2
이 도면은 Foxy-5의 세 가지 주요 불순물의 화학 구조를 보여준다.
A) Foxy-5의 아스파르트이미드 유도체
B) Foxy-5의 Cys-Cys 이량체 유도체
다) Foxy-5의 Cys → Ala 유사체
도 3
이 도면은 삼나트륨염에 알려진 세 가지 불순물인 "아스파르트이미드", "이량체" 및 "Ala-유사체"의 40℃에서 0주, 2주 및 4주 보관 시 순도(HPLC 면적%) 값을 보여준다. 자세한 내용은 상세한 설명을 참조할 것.
도 4
이 도면은 HPLC에 의한 Foxy-5의 높은 pH 처리 추적을 보여준다: 출발 물질(하단 트레이스), 용해 후(중간 트레이스) 및 pH 9에서 2시간 후(상단 트레이스). HPLC 트레이스는 비교를 위해 y 방향으로 오프셋되었다.
도 5
이 도면은 본 발명의 삼염(상단 도면) 및 이염(하단 도면)의 40℃에서 0주, 2주 및 4주 보관 시 순도(HPLC 면적%) 값을 보여준다. 도시된 바와 같이, 4주에서 이염보다 삼염의 경우 안정성의 변동성이 더 크다.
도 6
상단 도면은 아미노산(즉 Lys, Arg 및 His) 대 기타 염 형성물질(즉 콜린, 디에틸아민, 암모니아, N-Me-글루카민 및 트로메타민)의 40℃에서 0주, 2주 및 4주 보관 시 순도(HPLC 면적%) 값을 보여준다. 하단 도면은 이염에 대한 유사한 비교를 보여준다. 도시된 바와 같이, 아미노산으로 생성된 염은 다른 염 형성제로 생성된 염보다 일반적으로 안정성이 더 높은 경향이 있다.
도 7
이 도면은 본 발명에 따라 선택된 염의 40℃에서 0주, 2주 및 4주 보관 시 40℃에서 4주 후 HPLC에 의해 측정된 순도(HPLC 면적%) 값이 90% 이상임을 보여준다.
도 8
이 도면은 1) 공정 전반에 걸쳐 pH <6을 유지하면서, Foxy-5의 수성액에 염기를 서서히 첨가하거나, 또는 2) 염기 전량을 한 번에 첨가함으로써 제조된 Foxy-5의 새로 동결건조된 트리암모늄(NH3), 트리-트로메타민(TRO) 및 트리-N-메틸-글루카민(NMG) 염의 순도(HPLC 면적%) 값을 보여준다. 도시된 바와 같이, 트리암모늄 염의 순도는 첨가 방식에 따라 크게 영향을 받는 반면, 트리-TRO 및 트리-NMG 염의 순도는 상대적으로 영향을 받지 않는다.
도 9
이 도면은 Foxy-5의 3가 염의 동결건조물의 분말 X선 회절분석(PXRD)을 도시한다(아래에서 위로): 암모니아 삼염, N-메틸-D-글루카민 삼염, 트로메타민 삼염 및 히스티딘 삼염. 비교를 위해 회절도는 y 방향으로 오프셋되었다.
도 10
이 도면은 "이염"과 "삼염"으로 나누어진, 본 발명에 따른 단리된 고체 조성물을 생성하는 모든 수행된 실험의 개요를 나타낸 표이다. 이 표는 각 조성물 및 출발 물질(Foxy-5 유리산)에 있어서 시간 경과에 따른(40℃에서 0주, 2주 및 4주 보관) 불순물 프로파일의 변화를 입증한다.
도 11
이 도면은 Foxy-5 조성물 HIS-GEN14, HIS-GEN15(L-히스티딘 1:2 및 1:3) 및 NMG -GEN16(N-메틸-D-글루카민(1:2))의 "열순환"에 사용된 온도 프로파일을 보여준다. 샘플을 유기 용매에 현탁시키고 5 - 50℃±2℃ 사이의 온도에서 교반하였다. 이 열순환 프로필에는 5 - 50℃±2℃ 사이에서 3개 사이클과 5℃±2℃에서 3일 동안의 에이징이 포함되었다. 따라서 샘플을 50℃±2℃의 온도에 도달할 때까지 10℃/h로 가열한 다음, 5℃±2℃의 온도에 도달할 때까지 20℃/h(1번째 사이클), 10℃/h(2번째 사이클) 및 5℃/h(3번째 사이클)로 냉각하였다. 마지막으로 현탁액을 5℃±2℃에서 3일 동안 교반하여 에이징시켰다.
도 12
도 12에는 두 개의 표가 포함되어 있다. 상단 표는 Foxy-5-L-히스티딘 염의 HPLC-CAD 분석 결과를 나타낸다. 하단 표는 Foxy-5의 N-메틸-D-글루카민 염에 대한 HPLC-CAD 분석 결과를 나타낸다. 도시된 바와 같이, HPLC-CAD 방법을 사용하여 결정된 비율은 모두 예상 비율인 1:1, 1:2 및 1:3에 가깝다. 관찰된 약간의 편차는 아마도 샘플의 흡습성 때문인 듯 하다.
도 13
도 13은 Foxy-5-L-히스티딘(1:2)의 HT-XRPD 패턴을 아래에서 위로 오버레이한 도면이다(Exp. ID GEN5, Exp. ID TCP7(아세톤에서 열순환됨), Exp. ID TCP9(아세토니트릴/물(90/10)에서 열순환됨).
도 14
도 14는 Foxy-5-L-히스티딘(1:3)의 HT-XRPD 패턴을 아래에서 위로 오버레이한 도면이다(실험 ID GEN8, 실험 ID TCP11(에탄올에서 열순환됨), 실험 ID TCP15(에틸 아세테이트에서 열순환됨).
도 15
도 15는 Foxy-5-N-메틸-D-글루카민(MEG)(1:2)의 HT-XRPD 패턴을 아래에서 위로 오버레이한 도면이다(Exp. ID GEN7, Exp. ID TCP18(테트라히드로푸란에서 열순환됨), Exp. ID TCP20(에틸 아세테이트에서 열순환됨).
전술한 개요란에서 언급한 바와 같이 Foxy-5 헥사펩타이드(이하 "Foxy-5"로 지칭함)에 대한 선형 용액상 제조방법은 국제 특허출원 WO 2020/120198에 공개된 바 있는데, 여기서는 물에 대한 무염 약물 물질(DS)의 제한된 용해도로 인해 단지 3g/L의 최종 동결건조를 위한 제품 농도가 적용된다. 추가로 언급한 바와 같이, 이 문제를 극복하기 위한 초기 전략은 Foxy-5의 삼나트륨염을 생산하는 결과를 낳았는데, 이는 수용해도는 좋지만 안정성이 극도로 낮아 삼나트륨염은 신약물질 후보로 사용할 수 없는 것으로 나타났다.
이제 Foxy-5가 다양한 질소 염기와 함께 가용성이 높은 조성물을 형성한다는 것이 밝혀졌다. 놀랍게도, 이들 조성물 중 다수는 Foxy-5의 삼나트륨 염보다 상당히 더 안정하므로, 이는 잠재적으로 Foxy-5의 상업적 제조를 위한 생산 처리량의 실질적인 증가를 가능하게 한다.
이러한 발견은 다음과 같은 잠재적인 "염 형성제"를 사용하여 Foxy-5 염에 대한 스크리닝을 수행할 때 이루어졌다: 수산화암모늄, L-아르기닌, 수산화칼슘, 수산화콜린, 디에틸아민, L-리신, L-히스티딘, 수산화마그네슘, N-메틸-D-글루카민 및 트로메타민. Foxy-5의 나트륨 염과 관련된 알려진 문제를 고려할 때, 염 형성제의 이러한 선택은 궁극적으로 제약 성분 및 부형제에 대한 규제 요구 사항을 충족시킬 수 있는 화학적으로 다른 후보의 충분한 범위를 제공하는 것으로 믿어졌다. 따라서 선택된 "염 형성제"는 GRAS 승인되고/승인되거나 Stahl 클래스 1 또는 2 지정된 화합물 중에서 선택된다(P. H. Stahl and C. G. Wermuth, Handbook of Pharmaceutical Salts: Properties, Selection, and Use, Second Edition, Wiley-VCH: Zurich (2011) 참조)).
전술한 바와 같이, 염 스크리닝 연구에서 생성된 조성물은 비록 이들 조성물들(무정형 동결건조물로서 단리됨)이 염으로서 적절히(화학양론적으로) 특징화되지 않았으나, 편의상 Foxy-5의 일염, 이염 및 삼염으로 지칭된다.
Foxy-5의 삼염은 다음의 두 가지 다른 접근법, 즉: Foxy-5 유리산의 수성 현탁액에 계산된 양의 염기를 한 번에 첨가하거나, 또는 공정 전반에 걸쳐 현탁액의 pH를 < 6.0으로 유지하면서 관련 염기를 서서히 적정하는 접근법을 사용하여 Foxy-5 유리산 20-30 mg/ mL의 수성 현탁액에 약 3당량의 염기를 첨가하여 생성되었다.
현탁액으로 남아 있는 칼슘 및 마그네슘 염을 제외한 모든 것에 대해 투명한 용액이 얻어졌으며, 이는 칼슘 및 마그네슘 염을 제외한 모든 염에 대해 최소 20gr/L의 용해도가 얻어졌음을 나타낸다. 투명한 용액을 동결건조하고 고체 동결건조물을 PXRD 및 HPLC로 특징화시켰다(모든 조성물에 대한 개관은 실험 섹션 및 도 10 참조). 이들 모두는 무정형인 것으로 밝혀졌다(예시적인 PXRD 다이어그램은 도 9 참조). 일부 염 형성제의 경우 용해도가 ~50gr/L인 삼염을 제조하는 데 성공했으며, 일부 삼염의 경우 용해도가 100 gr/L를 초과하였다.
이전에 연구된 가용성이 높은 삼나트륨 염(배경기술 섹션 참조)도 비교를 위해 생성되었다.
이염은 또한 또한 3가 염 실험에서 투명한 용액을 생성하는 모든 염 형성제, 즉 수산화암모늄, L-아르기닌, 수산화콜린, 디에틸아민, L-리신, L-히스티딘, N-메틸-D-글루카민, 및 트로메타민을 사용하여서도 제조되었다. 다시 말하지만, 모든 경우에 투명한 용액이 얻어졌으며, 이는 Foxy-5의 이염 역시도 물에 대한 용해도가 20 mg/ mL 이상임을 나타낸다. 용액을 동결건조하고 고체 동결건조물을 PXRD 및 HPLC로 특징화하였다(실험 섹션 참조). 모두 무정형인 것으로 확인됐다. 일부 염 형성제의 경우 용해도가 ~50gr/L인 이염을 제조하는 데 성공하였다. 일염도 비슷한 방식으로 제조되었다.
생성된 동결건조물은 PXRD 분석에 의해 입증된 바와 같이 모두 무정형 고체였다. 많은 경우에 고체는 약간 흡습성이 있었다.
첫 번째 측면에서 본 발명은 For-Met-Asp-Gly-Cys-Glu-Leu-OH(SEQ_NO 1, Foxy-5) 및 질소 염기를 포함하는 고체 조성물을 제공하며, 여기서 질소 염기는 암모니아, 4차 수산화암모늄, 알킬화 구아니딘, 아미노산, 1차 및 2차 아민으로부터 선택된 화합물이다.
첫 번째 측면의 일 구현예에서, 고체 조성물은 암모니아, 4차 수산화암모늄, 알킬화 구아니딘, 아미노산, 1차 및 2차 아민으로부터 선택된 질소 염기 0.5 - 3.1 당량을 함유한다.
첫 번째 측면의 바람직한 구현예에서, 본 발명은 Foxy-5(For-Met-Asp-Gly-Cys-Glu-Leu-OH, SEQ_NO 1) 및 암모니아, 4차 수산화암모늄, 알킬화 구아니딘, 아미노산, 1차 및 2차 아민으로부터 선택된 질소 염기 2.5~3.1 당량을 포함하는 "삼염"을 제공한다.
첫 번째 측면의 또 다른 바람직한 구현예에서, 본 발명은 Foxy-5(For-Met-Asp-Gly-Cys-Glu-Leu-OH, SEQ_NO 1) 및 암모니아, 4차 수산화암모늄, 알킬화 구아니딘, 아미노산, 1차 및 2차 아민으로부터 선택된 질소 염기 1.50 - 2.49 당량을 포함하는 "이염"을 제공한다.
첫 번째 측면의 또 다른 구현예에서, 본 발명은 Foxy-5(For-Met-Asp-Gly-Cys-Glu-Leu-OH, SEQ_NO 1) 및 암모니아, 4차 수산화암모늄, 알킬화 구아니딘, 아미노산, 1차 및 2차 아민으로부터 선택된 질소 염기 0.5 - 1.49 당량을 포함하는 "일염"을 제공한다.
배경기술 섹션에서 언급한 바와 같이, Foxy-5의 삼나트륨 염은 높은 수용해도를 가지지만 유리산 형태에 비해 놀라울 정도로 불안정한 것으로 밝혀졌다. 나트륨 염의 주요 불순물은 다음과 같다(도 2 참조).
● Foxy 5의 Cys 이황화물(이량체),
● Cys → Ala 치환, 즉 Foxy 5의 탈황 유도체, 및
● Asp 아스파르트이미드 유도체.
본 발명의 첫 번째 측면에 따른 조성물의 안정성 분석은 이들 조성물이 비록 양은 다르지만 공지된 나트륨염과 동일한 불순물을 함유한다는 것을 입증하였다. 시간이 지남에 따라 상기 불순물의 발생 정도는 또한 조성물 마다 상당히 다르다.
40℃에서 2주 및 4주 동안 첫 번째 측면에 따른 조성물(및 이전에 제조된 삼나트륨 염)의 안정성 연구를 수행하였다. 몇 가지 일반적인 경향이 발견되었다. 도 5에 나타난 바와 같이, 동결건조 직후(0주) 및 40℃에서 2주 및 4주 동안 모니터링한 경우 조성물의 절대 순도는 실질적으로 다른 것으로 밝혀졌다. 삼염의 순도는 이염의 순도보다 더 다양하였다(삼염의 경우 4주차의 HPLC 순도 78-95% 대 이염의 경우 4주차의 HPLC 순도 87-96%). 또한, 도 6에서 알 수 있듯이, 아미노산을 포함하는 조성물의 절대 순도는 다른 염 형성제를 포함하는 조성물과 비교할 때 40℃에 4주 후에 일반적으로 더 높았다(4주에서의 값: 삼염의 경우 ~90% 대 ~85%, 및 이염의 경우 ~95% 대 ~90%).
본 발명의 일 구현예에서 본 발명은 Foxy-5 및 2.5~3.1 당량의 아미노산, 예컨대 2.8~3.05 당량의 아미노산, 예컨대 2.9~3.02 당량의 아미노산, 예컨대) 2.95 - 3.01 당량의 아미노산, 에컨대 3.0 당량의 아미노산을 포함하는 조성물을 제공한다.
또 다른 구현예에서 본 발명은 Foxy-5 및 1.50 - 2.49 당량의 아미노산, 예컨대 1.7 - 2.1 당량의 아미노산, 예컨대 1.8 - 2.05 당량의 아미노산, 예컨대 1.9 - 2.03 당량의 아미노산, 예컨대 1.95 - 2.01 당량의 아미노산, 예컨대 2.0 당량의 아미노산을 포함하는 조성물을 제공한다.
바람직한 일 구현예에서, 본 발명은 Foxy-5와 리신, 아르기닌 또는 히스티딘으로부터 선택된 아미노산을 포함하는 조성물을 제공한다.
본 발명의 대부분의 조성물은 언급된 바와 같이 어느 정도 흡습성이 있으며, 다수는 습한 공기에 노출될 때 점착성으로 변하는 것으로 밝혀졌다. 그러나 원소 분석과 검정 분석을 조합한 결과, 본 발명의 조성물 중 일부가 이수화물 및 사수화물과 같은 비점착성 수화물을 형성하는 적절한 염으로 특징화될 수 있는 것으로 밝혀졌다(실험 섹션 참조). 본 발명의 조성물은 동결건조된 무정형 고체(동결건조물)로서 분리되었기 때문에, 이러한 수화물은 결정질 수화물만큼 정확하게 정의될 수 없지만, 그럼에도 불구하고 많은 조성물은 예컨대 Foxy-5와 염 형성 염기 사이의 대략적인 비율이 1:2("이염") 또는 1:3("삼염")인 염과 같이, 상당히 잘 정의된 것으로 밝혀졌다.
마지막으로, 도 7은 40℃에서 4주간 보관한 후 HPLC로 측정한 순도( 면적%)가 90% 이상인 조성물을 보여준다. 도시된 바와 같이, 안정성이 높은 본 발명의 조성물은 특정 염 형태로 국한되지 않는다.
첫 번째 측면이 또 다른 구현예에서, 본 발명은 따라서 질소 염기가 아미노산, 암모니아, 및 1차 및 2차 아민으로부터 선택된 화합물인 조성물을 제공한다.
첫 번째 측면의 바람직한 구현예에서, 사용된 질소 염기는 암모니아, L-리신, L-히스티딘, N-메틸-D-글루카민 및 트로메타민으로부터 선택된다.
또 다른 바람직한 구현예에서, 본 발명은 Foxy-5와 암모니아, L-리신, L-히스티딘 및 트로메타민으로부터 선택된 질소 염기 1.50 - 2.49 당량, 예컨대 1.7 - 2.1 당량, 예컨대 1.9 - 2.03 당량, 예컨대 1.95 - 2.01 당량, 예컨대 2.0 당량을 포함하는 조성물을 제공한다.
또 다른 바람직한 구현예에서, 본 발명은 Foxy-5와 L-히스티딘 및 N-메틸-D-글루카민으로부터 선택된 질소 염기 2.5 - 3.1 당량, 예컨대 2.9 - 3.03 당량, 예컨대 2.95 - 3.01 당량, 예컨대 3.0 당량을 포함하는 조성물을 제공한다.
또 다른 바람직한 구현예에서, 본 발명은 Foxy-5의 이-암모늄염, 이-히스티딘 염, 삼-히스티딘 염, 이-리신 염, 이-N-메틸-D-글루카민 염, 삼-N-메틸-D-글루카민 염 및 이-트로메타민 염을 포함하는 조성물을 제공하며, 이들 염은 선택적으로 Foxy-5와 관련하여 계산된 0-5 당량의 물을 포함한다.
두 번째 측면에서 본 발명은 첫 번째 측면에 따른 조성물을 제조하는 방법을 제공하되, 이 방법은 다음 단계들, 즉:
a) i. 용매 중 현탁액, 또는
ii. 순수 분말
로서 For-Met-Asp-Gly-Cys-Glu-Leu-OH(SEQ_NO 1, Foxy-5)의 유리산 형태를
iii. Foxy-5의 일염을 제조하기 위해 질소 염기 0.5-1.49 당량, 또는
iv. Foxy-5의 이염을 제조하기 위해 질소 염기 1.50-2.49 당량, 또는
v. Foxy-5의 삼염을 제조하기 위해 질소 염기 2.5-3.1 당량
과 혼합하는 단계,
b) 투명한 용액이 얻어질 때까지 반응 혼합물을 교반하는 단계,
c) 용액의 침전, 또는 동결건조 또는 분무건조에 의해 고체 조성물을 분리하는 단계
를 포함하고, 여기서 질소 염기는 암모니아, 4차 수산화암모늄, 알킬화 구아니딘, 아미노산, 및 1차 및 2차 아민으로부터 선택된 화합물이고, 모든 단계 a - c는 선택적으로 불활성 대기에서 수행된다.
두 번째 측면의 바람직한 구현예에서, 단계 iii), iv) 또는 v)에서 염 형성에 사용되는 질소 염기는 암모니아, L-리신, L-히스티딘, N-메틸-D-글루카민 및 트로메타민으로부터 선택된다.
바람직한 일 구현예에서, 단계 i)에서 Foxy-5의 농도는 물에서 약 20-30 mg/ mL이다. 또 다른 바람직한 구현예에서, 단계 vi)에서 염 형성에 사용된 질소 염기는 암모니아, L-리신, L-히스티딘 및 트로메타민으로부터 선택된 질소 염기 1.50 - 2.49 당량, 예컨대 1.7 - 2.1 당량, 예컨대 1.9 - 2.03 당량, 예컨대 1.95 - 2.01 당량, 예컨대 2.0 당량이다.
또 다른 바람직한 구현예에서, 단계 v)에서 염 형성을 위해 사용된 질소 염기는 L-히스티딘 및 N-메틸-D-글루카민으로부터 선택된 질소 염기 2.5 - 3.1 당량, 예컨대 2.9 - 3.03 당량, 예컨대 2.95 - 3.01 당량, 예컨대 3.0 당량이다.
전술한 바와 같이, 두 가지 다른 접근법이 첫 번째 측면에 따른 조성물의 제조에 사용되었다, 즉: 계산된 양의 염기를 Foxy-5 유리산의 수성 현탁액에 한 번에 첨가하거나, 또는 공정 전반에 걸쳐 반응 혼합물의 pH를 < 6.0으로 유지하면서, 관련 염기를 천천히 적정하여 유지하는 접근법.
새로 동결건조된 조성물을 HPLC로 분석한 결과, "느린" 적정이 "빠른" 접근법을 사용하여 제조한 조성물보다 불순물을 더 낮은 수준으로 함유하는 조성물을 생성한 것으로 나타났다(도 8 참조). 도시된 바와 같이, 이러한 효과는 암모니아의 "삼염"에서 가장 큰데, 여기서 순도는 약 98%에서 95%로 떨어진다(느린 첨가 → 빠른 첨가). 이에 비해, 트로메타민 및 트리-N-메틸-글루카민의 "삼염"의 순도는 이들 염이 빠른 첨가에 의해 형성될 경우 단지 약간만 더 낮다. 본 발명자들은 이 현상이 염 형성 염기의 pKa 값과 관련될 수 있다고 믿지만 특정 이론에 구애되는 것은 아니다: 수산화암모늄은 pKa가 9.3으로 세 가지 염기 중 가장 강한 반면, 트로메타민과 N-메틸-글루카민은 둘 다 pKa 8.0을 갖는다.
두 번째 측면의 구현예에서, 단계 b)에서 염 형성을 위해 사용된 질소 염기는 Foxy-5 유리산의 수성 현탁액에 한 번에 첨가된다. 두 번째 측면의 또 다른 구현예에서, 단계 b)에서 염 형성을 위해 사용된 질소 염기는 공정 전반에 걸쳐 반응 혼합물의 pH를 < 6.0으로 유지하면서 Foxy-5 유리산의 수성 현탁액에 점진적으로 첨가된다.
두 번째 측면의 또 다른 구현예에서, 단계 b의 최종 투명한 용액을 동결건조하여 본 발명의 고체 조성물을 제공한다. 두 번째 측면의 또 다른 구현예에서, 결정화를 포함하여 침전에 의해 단계 b의 최종 투명 용액으로부터 고체 조성물이 얻어진다. 일부 구현예에서, 침전 또는 결정화는 하나 이상의 역용매의 첨가, 증발, 냉각 또는 이들의 조합에 의해 달성된다.
본 발명의 조성물 중 일부는 규모 확대를 위해 선택되었다. 본원의 일부로서, 초기에 분리된 무정형 생성물을 열순환 공정에 적용하였다. 여기서 유기 용매 중 무정형 생성물의 현탁액은 5℃ - 50℃±2℃에서 교대로 가열 및 냉각하는 1-3 사이클을 거친 후 이어서, 현탁액은 5℃±2℃에서 1~3일 동안 교반하는 에이징 단계를 거쳤다. 놀랍게도 획득된 열순환된 물질은 초기에 획득된 물질보다 덜 푹신하고 정적(static)이어서 취급하기 더 쉬운 것으로 밝혀졌다.
본 발명의 세 번째 측면에서, 두 번째 측면의 단계 c)의 생성된 고체 조성물은 다음 단계들, 즉:
i. 용매 또는 용매 혼합물에 동결건조되거나 분무건조된 생성물의 현탁액을 제공하는 단계,
ii. 현탁액을 5℃ - 50℃±2℃ 사이에서 1 - 3 사이클을 포함하는 열순환 공정에 적용한 후, 현탁액을 5℃±2℃에서 1-3일 동안 에이징시키는 단계,
iii. 예를 들어 여과 또는 원심분리를 통해 열순환된 제품을 분리하는 단계
를 포함하는 열순환 공정을 추가로 거치게 되며, 열순환 공정 동안 현탁액은 50℃±2℃의 온도에 도달할 때까지 10℃±2℃/hr의 속도로 가열된 후, 5℃±2℃의 온도에 도달할 때까지 다음 속도로 냉각된다:
a. 첫 번째 사이클의 경우 20℃±2℃ /h,
b. 두 번째 사이클의 경우 10℃±2℃/hr,
c. 세 번째 사이클의 경우 5℃±2℃/hr.
현탁액은 예컨대 여과 또는 원심분리 등을 통해 분리되기 전에 5℃±2℃에서 1~3일 동안 교반에 의해 최종적으로 에이징된다.
열순환 공정의 온도 프로파일은 도 11에 도시되어 있다.
세 번째 측면의 바람직한 구현예에서, 유기 용매는 에탄올, 아세톤, 테트라히드로푸란(THF), 아세토니트릴/물(90/10) 및 에틸 아세테이트로부터 선택된다.
바람직한 구현예에서 열순환된 생성물은 1:2 및 1:3 비율의 Foxy-5-L-히스티딘 염, 또는 1:2 비율의 Foxy-5-N-메틸-D-글루카민 염이다. 전형적인 HT-XRPD 다이어그램은 도 13-15에서 찾을 수 있다.
실험
Foxy-5의 pKa 값 결정
Foxy-5 유리산(로트: 1058263)의 pKa 값은 SiriusT3Control Vers. 2.0.0.0 소프트웨어가 장착된 Sirius T3 장비를 사용하여 25℃에서 전위차 적정으로 측정되었다. 1.5 mL의 ISA 물에 용해된 1.0 mg의 고체 API의 초기 값과 동일한 샘플에 대한 3개의 연속 적정을 사용하여 자동 수성 적정 방법을 사용하였다. 세 가지 적정 모두에서 샘플 용액을 0.5M KOH를 사용하여 시작 pH 12로 조정하고 0.5M HCl을 사용하여 최종 pH 2까지 천천히 적정하였다.
각 적정 곡선은 SiriusT3Refine Vers. 2.0.0.0 소프트웨어를 사용하여 적합화하고 해당 pKa 값을 계산하였다. 이론적으로 예측된 4개의 산성 부위 모두에 대한 pKa 값은 RMSD가 0.071인 실험적으로 접근 가능한 범위에서 관찰되었다. 적합 결과는 아래 표 1에 요약되어 있다.
이론적인 pKa 값은 클래식 및 GALAS 모드를 사용하는 ACD/Percepta 14.51.0(빌드 3382) 및 Sirius T3 Vers. 2.0.0.0 소프트웨어의 패키지의 ACD_Prediction Vers. 2.0.0.0 패키지를 사용하여서도 구하였으며, 여기서 후자는 pKa를 측정하는 데 사용되는 프로그램이다. 계산된 값을 분자의 특정 부위에 할당하는 것은 소프트웨어에 의해 수행되었다. 표 1에서 볼 수 있듯이 세 가지 예측 방법은 0.1~0.5 단위 내에서 서로 일치하는 값을 제공하였다. 실험값은 예측된 값에 합리적으로 근접하며 시스테인 기의 티올과 L-아스파르트산의 카르복실산에 대한 측정값은 본질적으로 해당 예측 범위의 중간에 있고 L-글루타민산 기의 카르복실산과 말단 카르복실산은 예측된 범위의 상한값 바로 바깥에 있다.
표 1. Foxy-5에 대한 pKa 측정치 및 계산치

pKa
[측정치]		 pKa [계산치]
예측 부위 (유형)
ACD Labs a) ACD Labs b) Sirius T3 c)
9.01
4.79
3.98
3.39		 9.2±0.1
4.4±0.1
4.1±0.1
3.3±0.1		 8.7±0.5
4.7±0.4
3.9±0.5
3.2±0.4		 9.16
4.45
4.19
3.34		 CYS 티올(산성)
GLU 카르복실산(산성)
ASP 카르복실산(산성)
말단 카르복실산(산성)

a) 이들 값은 ACD/Percepta 14.51.0(Build 3382)의 클래식 접근법을 이용하여 구하였다.
b) 이들 값은 ACD/Percepta 14.51.0(Build 3382)의 GALAS 접근법을 이용하여 구하였다.
c) 이들 값은 Sirius T3 Vers.2.0.0.0 소프트웨어의 ACD Prediction Vers. 2.0.0.0
패키지를 이용하여 구하였다.
다음에서는 "삼염", 즉 약 3 당량의 질소 염기를 함유하는 Foxy-5 조성물, "이염", 즉 약 2 당량의 질소 염기를 함유하는 Foxy-5 조성물, 및 "일염", 즉 약 1 당량의 질소 염기를 함유하는 Foxy-5 조성물로 구분되는, 본 발명에 따라 생성된 각 조성물에 대해 상세한 설명한다.
형성된 모든 조성물 및 출발 물질 자체(Foxy-5 유리산)에 대한 안정성 테스트 데이터는 40℃에서 0주, 2주 및 4주 보관 시 측정되었으며 도 10에 포함되었다.
안정성 측정을 위한 분석 조건
물질별 UPLC 방법에 대해 다음의 매개변수들을 안정성 샘플의 순도 측정에 사용하였다:
Foxy-5 염의 비율 결정
원소 분석(C, H, N, O 및 S)은 처음에 다수의 분리된 Foxy-5 염(다음 실험 섹션 참조), 즉 암모니아 이염, 삼염 및 히스티딘 이염 및 삼염에 대해 수행되었다. 이들 염의 경우 발견된 값은 염의 다양한 수화물과만 합리적으로 일치하므로 Foxy-5의 1:1, 1:2 및 1:3 염이 본원에 개시된 방법에 의해 생성되었음을 명확하게 증명하기 위해 비율 결정을 위한 다른 분석 방법을 조사하기로 결정되었다.
따라서 9종의 서로 다른 Foxy-5 염(각각 3 가지 서로 다른 비율 1:1, 1:2 및 1:3의 L-히스티딘 암모늄 및 N-메틸-D-글루카민)의 비율 결정을 HPLC-CAD 및 1H-NMR을 이용하여 시도하였다.
물에 대한 용해도
9가지 염의 수용해도는 정량적 용해도 방법을 사용하여 구하였다. 물질을 24시간 동안 물에 현탁시킨 후, 모액의 분취량을 UPLC로 분석하였다. 24시간 후에 물질이 용해된 경우 용해도는 보다 큰 것(>)으로 주어졌다.
용해도 결과의 개요는 아래 표 3에서 확인할 수 있다.
표 3. 용해도 결과 Foxy-5 NMG, NH3 및 HIS 염

실험 ID

카운터이온(Cl)
Foxy-5 : Cl 비율 		수용해도
(mg/ mL)
NMG-GEN4 NMG 1:1 22.8
NH3-GEN3 NH3 1:1 19.5
HIS-GEN2 HIS 1:1 20.3
NMG-GEN7 NMG 1:2 >140
NH3-GEN6 NH3 1:2 31.2
HIS-GEN5 HIS 1:2 >71
MNG-GEN10 NMG 1:3 >140
NH3-GEN9 NH3 1:3 >130
HIS-GEN8 HIS 1:3 >140
제조된 1:2 및 1:3 염의 수용해도는 모두 20 mg/ mL를 초과하는 반면, 1:1 염의 수용해도는 약 20 mg/ mL인 것으로 결론지을 수 있다. 비교를 위해, 유리 Foxy-5 헥사펩타이드의 수용해도는 약 3 mg/ mL이다.
HPLC-CAD
Foxy-5-L-히스티딘-염과 Foxy-5-N-메틸-D-글루카민-염의 비율을 측정하기 위해 HPLC-CAD 방법이 개발되었다. 그러나 이 방법은 이동상에 암모늄염이 포함되어 있기 때문에 Foxy-5의 암모늄염에는 적합하지 않다.
0.1 mg/ mL 농도의 원액(stock solution)과 10 가지 다른 주입량(0.5 μl 단계별로 1 μl 내지 5.5 μl)을 사용하여 L-히스티딘과 N-메틸-D-글루카민에 대한 교정 라인을 측정하였다. 분석에 사용된 Foxy-5-염의 양은 카운터이온의 농도가 약 0.1 mg/ mL가 되도록 계산되었다. 그런 다음 예상 면적 대 실제 측정 면적을 사용하여 비율을 계산하였다(L-히스티딘의 경우 도 12 상단 표, N-메틸-D-글루카민의 경우 도 12 하단 표 참조). HPLC-CAD 방법을 사용하여 결정된 비율은 모두 예상 비율인 1:1, 1:2 및 1:3에 가깝다. 따라서 HPLC-CAD는 Foxy-5와 그의 해당 카운터이온 간의 비율을 결정하는 데 매우 적합하다. 현재의 특정 HPLC 방법은 Foxy-5의 암모늄염에 대한 비율 결정은 방지하지만, 이 문제는 HPLC 이동상의 적절한 변형을 통해 해결할 수 있다.
1 H-NMR
1H-NMR은 보조-형성제(co-former)가 유기적이고 1H-NMR에서 볼 수 있는 한, 염 스크리닝 공정에서 API와 보조-형성제의 비율을 결정하는 표준 방법이다. L-히스티딘과 N-메틸-D-글루카민은 양자 모두 1H-NMR에서 볼 수 있는 양성자를 함유하고 있다. 암모니아에는 양성자가 포함되어 있지만, 일반적으로 1H-NMR에서는 볼 수 없으므로 정량화할 수 없다.
따라서 1H-NMR을 사용하여서는 Foxy-5와 L-히스티딘 및 N-메틸-D-글루카민의 비율을 결정하려는 시도만 있었다. N-메틸-D-글루카민의 메틸기는 염 형성 전 2.26 ppm에서 염 형성 후 2.48 ppm으로 이동했기 때문에 Foxy-5-N-Methyl-D-글루카민 1:2 염 사용시 비율 결정이 잘 이루어졌다. 메틸기의 통합으로 인해 GEN16의 경우 1:2.15, TCP18의 경우 1:2.01, TCP20의 경우 1:2.02의 비율이 생성되었다. 따라서 1H-NMR은 Foxy-5-L-NMG 염의 비율을 결정하는 좋은 방법이다.
그러나 Foxy-5-L-히스티딘 염의 비율 결정은 더 어려웠다. GEN14의 예상 비율은 1:2 로 결정되었다. 그러나 다른 샘플은 약 1:0.1의 비율을 갖는 것으로 결정되었으며 이는 DMSO-d6에서 L-히스티딘의 낮은 용해도로 설명될 수 있다. L-히스티딘은 아마도 일정 시간이 지나면 NMR 용매에서 결정화되기 시작하여 측정 중에 검출되지 않았을 것이다.
새로운 샘플은 D2O에서 제조되었으며 실제로 L-히스티딘의 양성자는 훨씬 더 강한 신호를 제공했지만 Foxy-5 대 L-히스티딘의 비율은 여전히 예상보다 낮게 결정되었다(즉, 1:2 샘플의 경우 1:1.4 및 1:3 샘플의 경우 1:2.1). 펩타이드 자체 내 통합도 분자 구조에서 벗어났다. 따라서 이완 지연(relaxation delay)이 더 긴, "qNMR"이라 명명된 NMR 방법을 테스트하기로 결정되었다. 이는 Foxy-5-L-히스티딘 염이 1:3 비율인 GEN15와 TCP11의 두 샘플에서 테스트되었다. qNMR 방법은 펩타이드의 분자식과 잘 맞는 양성자 통합을 가져왔고 L-히스티딘과의 비율은 1:3에 가까운 것으로 결정되었다.
결론적으로, 비율 결정을 위해 위에 기술된 분석 방법에 의해, 우수한 수용해도를 갖는 Foxy-5의 1:1, 1:2 및 1:3 염이 개시된 방법에 의해 생성될 수 있음이 입증되었다고 말할 수 있다. 용해도 측정 결과 유리 Foxy-5 펩타이드의 낮은 용해도(3 mg/ mL)로부터 1:1 염의 용해도 증가(약 20 mg/ mL)에 비해 1:2 및 1:3 비율의 염에서는 용해도가 크게 증가(최대 150 mg/ mL)하는 명확한 경향을 보여준다.
Foxy-5 염의 규모 확장 및 열순환
규모 확장을 위해 세 가지 염, 즉 1:2 및 1:3 비율의 Foxy-5-히스티딘과 1:2 비율의 Foxy-5-N-메틸-D-글루카민이 선택되었다. 이들 염은 용해도가 31 mg/ mL보다 높고 제조 중에 pH < 6을 유지할 수 있기 때문에 선택되었다. 수산화암모늄 1:2 염도 이러한 요구 사항을 충족하지만 현재 이 염의 비율을 결정하는 데 사용할 수 있는 정확한 분석 방법이 없기 때문에 이번에 규모 확장을 위해서는 선택되지 않았다.
선택된 모든 염에 대해 300 mg 규모로 규모 확대가 수행되었다. 모든 경우(Foxy-5-L-히스티딘(1:2), Foxy-5-L-히스티딘(1:3) 및 Foxy-5-N-메틸-D-글루카민(1:2)) 고체가 얻어졌다. 고체를 1H-NMR, UPLC-MS, HPLC-CAD 및 TGMS를 사용하여 분석하였다. 얻은 고체를 5가지 다른 용매에서 온도 프로파일에 적용하였다(도 11 참조). 열순환 실험의 결과를 아래 표 4에 나타내었다.
표 4 Foxy-5 NMG 및 HIS 염의 열순환 결과
실험 ID 설명 API mg 용매 부피, μL XRPD
TCP6 HIS 1:2 53 에탄올 1000 Am
TCP7 HIS 1:2 53 아세톤 1000 Am
TCP8 HIS 1:2 53 THF 1000 Am
TCP9 HIS 1:2 53 MeCN/H2O (90/10) 200 Am
TCP10 HIS 1:2 53 EtOAc 2000 Am
TCP11 HIS 1:3 55 에탄올 1000 Am*
TCP12 HIS 1:3 55 아세톤 1000 Am
TCP13 HIS 1:3 55 THF 1000 Am
TCP14 HIS 1:3 55 MeCN/H2O (90/10) 200 Am*
TCP15 HIS 1:3 55 EtOAc 2000 Am
TCP16 NMG 1:2 52 에탄올 1000 Deliq.
TCP17 NMG 1:2 52 아세톤 1000 Am
TCP18 NMG 1:2 52 THF 1000 Am
TCP19 NMG 1:2 52 MeCN/H2O (90/10) 200 Deliq.
TCP20 NMG 1:2 52 EtOAc 2000 Am
Am = 무정형
Am* = 무정형 + 결정형 His로부터 일부 피크
Deliq.= 조해성
열순환된 샘플의 XRPD 다이어그램은 도 13-15에서 확인할 수 있다. 규모 확대와 열순환으로 인해 대부분 무정형 물질이 생성되었지만 열순환 전후 모두에서 일부 샘플이 조해성인 것으로 나타났다. HIS 1:3 염의 경우 XRPD 다이어그램에 결정성을 나타내는 일부 피크가 포함되어 있는 것으로 관찰되었다. 자세히 조사한 결과 피크는 소량의 순수 L-히스티딘에서 유래한 것으로 나타났다. 이는 단사정계 결정 변형으로 침전되었다.
놀랍게도, 획득된 열순환된 물질은 덜 푹신하고 정적이기 때문에 초기에 획득된 동결건조된 물질보다 취급하기 더 쉬운 것으로 밝혀졌다.
"삼염"의 형성
Foxy-5 삼염은 일반적으로 물이나 다른 적합한 용매에 용해된 Foxy-5 현탁액에 관련 염기를 첨가하여 제조된다. 염기는 순수하게 첨가하거나 용액 상태로 첨가할 수 있으며, 공정 내내 pH < 6을 유지하면서 한 번에 첨가하거나 또는 서서히 첨가할 수 있다.
아르기닌 삼염
실험 ARG-P1
Foxy-5 헥사펩타이드 89.7 mg(0.129 mmol)을 칭량하여 4 mL Supelco 바이알에 넣었다. 탈기된 초순수 3 mL를 첨가하여(비저항 ≥ 18.2M Ωcm) → 유리질의 흰색 현탁액이 얻어졌다; 67.7 mg(3 당량)의 L-아르기닌을 N2 퍼지 하에 첨가하여 →pH 7.31의 투명한 무색 용액을 얻었다; 실온에서 2시간 동안 교반하여 → pH 7.27의 투명한 무색 용액이 얻어졌다; 주사기 필터(직경 13 mm, 0.2μm PVDF)를 통해 10 mL 둥근 바닥 플라스크로 여과하고; 생성된 용액을 드라이아이스에서 동결시키고; 18시간 15분 동안 동결건조하여 → 흰색 고체를 얻었다; PXRD에 의해 특징화하고; 냉동고에 보관하고 14일 후에 HPLC로 이중으로 특징화하였다. PXRD 결과 샘플이 무정형인 것으로 확인되었다; HPLC는 두 주입에 대해 96.47 면적% 및 96.40 면적%의 순도를 보여준다.
칼슘 삼염
실험 Ca-P1
Foxy-5 헥사펩타이드 89.6 mg(0.129 mmol)을 칭량하여 4 mL Supelco 바이알에 넣었다; 탈기된 초순수 3 mL를 첨가하여(비저항 ≥ 18.2M Ωcm) → 유리질의 흰색 현탁액을 얻었다; Ca(OH)2 28.8 mg(3 당량)을 첨가하여 → pH 12.36의 묽은 흰색 현탁액을 얻었다; 실온에서 2시간 동안 교반하여 → pH 12.34의 묽은 흰색 현탁액을 얻었다; 실온에서 밤새 교반하자 → 백색 현탁액이 얻어졌다; 최소 용해도에 도달하지 않아 실험이 종료되었다.
콜린 삼염
실험 CHO-P1
Foxy-5 헥사펩타이드 89.6 mg(0.129 mmol)을 칭량하여 4 mL Supelco 바이알에 넣었다; 탈기된 초순수 3 mL를 첨가하여(비저항 ≥ 18.2M Ωcm) → 흰색 현탁액을 얻었다; 46% 수산화콜린 (aq)(밀도 = 1.073g/mL) 95.4μL(3 당량)를 N2 하에 첨가하여 → pH 8.51의 베이지색 용액을 얻었다; 실온에서 2시간 동안 교반하여 → pH 8.43의 베이지색 용액을 얻었다; 0.2μm PVDF 주사기 필터를 통해 10 mL 둥근 바닥 플라스크로 여과하고; 용액을 냉동 및 동결건조하여 베이지색 고체를 얻었다; PXRD로 특징화하고; HPLC에 의해 이중으로 특징화하였다. PXRD 결과 샘플은 무정형인 것으로 확인되었다. HPLC는 두 주입에 대해 92.14 면적% 및 92.08 면적%의 순도를 보여준다.
디에틸아민 삼염
실험 DEA-P1
Foxy-5 헥사펩타이드 90.5 mg(0.130 mmol)을 칭량하여 4 mL Supelco 바이알에 넣었다; 탈기된 초순수 3 mL를 첨가하여 (비저항 ≥ 18.2M Ωcm) → 유리질의 흰색 현탁액을 얻었다; 40.2 μ L (3 당량)의 디에틸아민 (밀도 = 0.707 g/mL)을 N2 퍼지 하에 첨가하여 → pH 5.43의 투명한 무색 용액을 얻었다; 실온에서 2시간 동안 교반하여 → pH 5.45의 투명한 무색 용액을 얻었다; 주사기 필터(직경 13 mm, PVDF 0.2μm)를 통해 10 mL 둥근 바닥 플라스크로 여과하고; 생성된 용액을 드라이아이스에서 동결시키고; 18시간 15분 동안 동결건조하여 → 흰색 고체를 얻었다; PXRD로 특징화하고; 냉동고에 보관하고 14일 후에 HPLC에 의해 이중으로 특징화하였다; 이 샘플의 분취량을 밀폐 용기에 담아 40℃에서 2주 및 4주 동안 보관하고 HPLC로 검사하였다; 이들은 40℃에서 2주 및 4주 동안 보관 후 유리 같은 외관을 갖는 것으로 관찰되었다. PXRD 결과 샘플은 무정형인 것으로 확인되었다. HPLC는 두 주입에 대해 97.26 면적% 및 97.22 면적%의 순도를 보여준다.
리신 삼염
실험 LYS-P1
Foxy-5 헥사펩타이드 90.3 mg(0.130 mmol)을 칭량하여 4 mL Supelco 바이알에 넣었다; 탈기된 초순수 3 mL를 첨가하여(비저항 ≥ 18.2M Ωcm) → 유리질의 흰색 현탁액을 얻었다; 56.8 mg(3 당량)의 L-리신을 N2 퍼지 하에 첨가하여 → pH 6.39의 투명한 무색 용액을 얻었다; 실온에서 2시간 동안 교반하여 → pH 6.46의 투명한 무색 용액을 얻었다; 주사기 필터(직경 13 mm, PVDF 0.2μm)를 통해 10 mL 둥근 바닥 플라스크로 여과하고; 생성된 용액을 드라이아이스에서 동결시키고; 18시간 15분 동안 동결건조하여 → 흰색 고체를 얻었다; PXRD로 특징화하였다; 냉동고에 보관하고 14일 후에 HPLC로 특징화하였다; 이 샘플의 분취량을 밀폐 용기에 담아 40℃에서 2주 및 4주 동안 보관하고 HPLC로 이중 특징화하였다. PXRD 결과 샘플은 무정형인 것으로 확인되었다. HPLC는 두 주입에 대해 97.44 면적% 및 97.39 면적% 의 순도를 보여준다.
마그네슘 삼염
실험 mg-P1
Foxy-5 헥사펩타이드 89.6 mg(0.129 mmol)을 칭량하여 4 mL Supelco 바이알에 넣었다; 탈기된 초순수 3 mL를 첨가하여(비저항 ≥ 18.2M Ωcm) → 유리질의 흰색 현탁액을 얻었다; Mg(OH)2 22.7 mg(3 당량)을 첨가하여 → 걸쭉한 흰색 현탁액을 얻었다(pH를 측정하기에는 너무 걸쭉함); 실온에서 2시간 동안 교반하여 → pH 9.06의 흰색 현탁액을 얻었다; 실온에서 밤새 교반하여 → 백색 현탁액을 얻었다; 최소 용해도에 도달하지 않아 실험이 종료되었다. 30 g/L를 초과하는 용해도를 갖는 염은 얻어지지 않았으므로 특징화는 수행되지 않았다.
나트륨 삼염
실험 Na-P1
Foxy-5 헥사펩타이드 90.5 mg(0.130 mmol)을 칭량하여 4 mL Supelco 바이알에 넣었다;탈기된 초순수(비저항 ≥ 18.2 M Ω cm) 3 mL를 첨가하여; → 유리질의 흰색 현탁액을 얻었다; 1M NaOH(aq) 388.6μL(3당량)를 N2 퍼지 하에 첨가하여 → pH 8.23의 투명한 무색 용액을 얻었다; 실온에서 2 시간 교반하여 → pH 8.17의 투명한 무색 용액을 얻었다; 주사기 필터(직경 13 mm, PVDF 0.45μm)를 통해 10 mL 둥근 바닥 플라스크로 여과하고; 생성된 용액을 드라이아이스에서 동결시키고; 24시간 5분 동안 동결건조하여 → 흰색 고체를 얻었다; 냉동고에 보관하고 5일 후에 HPLC로 특징화하였다; 샘플은 흡습성이 매우 높기 때문에 무게를 측정하기 어려웠다; 이 샘플의 분취량을 밀폐 용기에 40℃에서 2주 및 4주 동안 보관하고 HPLC로 이중으로 검사하였다; 4주 샘플은 흡습성으로 인해 무게를 측정하기가 어려웠다. PXRD 결과 샘플은 무정형인 것으로 확인되었다. 흔적량의 NaCl이 존재할 가능성이 있다; HPLC는 두 주입 모두에 대해 95.11 면적%의 순도를 보여준다.
암모니아 삼염
실험 NH3-P8
100.3 mg(0.144 mmol)의 Foxy-5 헥사펩타이드를 칭량하여 15 mL Supelco 바이알에 넣었다. N2 퍼지 하에 3.333 mL의 초순수(비저항 ≥ 18.2 MΩ cm)를 첨가하여 → 유리질의 현탁액을 얻었다. 현탁액을 500 rpm으로 교반하고 pH 전극을 삽입하였다. 0.1 M의 NH4OH(aq)를 0.05 mL/분으로 투여하고, 잠시 멈춰서 pH를 주기적으로 측정하였다. 15분 후에 염기 0.50 mL를 첨가했고 pH는 3.84였다; 45분에 총 1.34 mL의 염기를 첨가했고 pH는 4.09였다; 1시간 6분에 총 2.37 mL의 염기를 첨가했고, pH는 4.42였다; 1시간 14분에 총 2.74 mL의 염기를 첨가했고 pH는 4.64였다; 투명한 무색 용액이 얻어졌다; 1시간 45분에 총 3.74 mL의 염기를 첨가했고(2.59당량에 해당) pH는 5.81이었다; 투여를 일시 중지하였다; 3시간 40분에 pH는 6.00이었고; 나머지 0.58 mL의 염기는 첨가되지 않았다; 실험이 종료되었다. 투명한 무색 용액을 20 mL 둥근바닥 플라스크에 넣고 드라이아이스와 이소프로판올의 혼합물에 동결시킨 후 동결건조하였다. HPLC(이중) 및 원소 분석이 수행되었다. HPLC는 두 주입에 대해 98.08 면적% 및 98.05 면적%의 순도 및 각각 68.76% 및 68.71%의 해당 분석 값을 나타냈다. 질소 대 황 함량비는 삼염과 완전히 일치하지 않지만, 첨가된 양(중량 계산 기준)이 단지 2.59 당량이었기 때문에 이는 놀라운 일이 아니다. 생성물(아래)의 원소 분석(C, H, N, O 및 S) 결과는 2.6 당량의 암모니아와 2 당량의 물로 구성된 염과 잘 일치한다.
N-메틸-D-글루카민 삼염
실험 NMG-P5
Foxy-5 헥사펩타이드 90.3 mg(0.130 mmol)을 칭량하여 7 mL Supelco 바이알에 넣었다; 탈기된 초순수 3 mL를 첨가하였다(비저항 ≥ 18.2M Ωcm). pH 측정기를 삽입하여 pH 2.66을 측정하였다. N2 퍼지를 적용하고 교반을 700rpm으로 설정하였다. N-메틸-D-글루카민의 0.5M 수용액 0.78 mL(물 50 mL 중 4.8803g)를 선량계를 사용하여 천천히 첨가하고 다양한 시점에서 pH를 측정하였다. 0.5M NMG(aq) 0.25 mL를 첨가한 후, 반응기 바닥에 일부 물질과 함께 탁한 용액이 관찰되었다. pH는 4.01이었다. 0.5M N-메틸-D-글루카민 용액 0.70 mL를 첨가하자 투명한 용액이 얻어졌다. pH는 5.51이었다. 총 0.74 mL의 0.5M N-메틸-D-글루카민 용액을 첨가하고(2.85 eq와 동일); pH는 5.99였다. 2시간 동안 교반한 후, 용액의 pH는 6.01이었다. 투명한 무색 용액을 20 mL 둥근바닥 플라스크에 넣고 드라이아이스로 냉동시켰다; 밤새 동결건조시켰다. 백색 고체를 얻었고 이를 PXRD 및 HPLC로 특징화하였다. PXRD 결과 샘플이 무정형인 것으로 확인되었다. HPLC는 두 주입에 대해 96.90 면적% 및 96.69 면적%의 순도를 보여준다.
트로메타민 삼염
실험 TRO-P3
Foxy-5 헥사펩타이드 90.0 mg(0.1295 mmol)을 칭량하여 7 mL Supelco 바이알에 넣었다; 탈기된 초순수 3 mL를 첨가하였다 (비저항 ≥ 18.2M Ωcm). pH 측정기를 삽입하자 pH 2.69이 측정되었다. N2 퍼지를 적용하고 교반을 700rpm으로 설정하였다. 현탁액이 관찰되었다. 0.5M 트로메타민 수용액(물 20 mL에 1.2115g) 0.39 mL를 선량계를 사용하여 30분에 걸쳐 천천히 첨가하고 다양한 시점에서 pH를 측정하였다. 0.5M TRO(aq) 0.29 mL(1.12eq)를 첨가한 후 거의 모든 고체가 용해되었으며 pH는 4.04였다. 0.59 mL의 0.5 M TRO 용액(2.28 eq)을 첨가한 후 투명한 용액을 얻었다; pH는 4.99였다. 총 0.71 mL의 0.5M TRO 용액을 첨가하였다(2.74eq와 동일); pH는 5.95였다. 2시간 동안 교반한 후, 용액의 pH는 5.97이었다. 투명한 무색 용액을 20 mL 둥근 바닥 플라스크에 넣었다; 냉동실에서 동결시키고; 밤새 동결건조시켰다. 백색 고체를 얻었고 PXRD로 특징화하였다. 그런 다음 샘플을 냉동고에 보관하고 5일 후에 HPLC로 이중으로 특징화하였다. HPLC는 두 주입에 대해 98.34 면적% 및 98.35 면적%의 순도를 보여준다.
히스티딘 삼염
HIS-P2 실험
100.4 mg(0.145 mmol)을 칭량하여 7 mL Supelco 바이알에 넣었다; 3.33 mL의 초순수 N2 퍼지 하에 물을 추가하자(비저항 ≥ 18.2 MΩ cm) → 흰색의 젤 같은 고체 현탁액이 관찰되었다; 이를 500 rpm으로 교반하고 전극을 삽입하여 pH를 측정하자 2.64였다; 0.0985 M의 L-히스티딘(aq)을 0.1 mL/분으로 첨가하고, 일시 중지하여, pH를 측정하였다; 2분에, 0.30 mL 염기를 첨가했고 pH는 3.50이었다; 9분에 총 1.00 mL의 염기를 첨가하였고 pH는 3.50이었다; 19분에 총 2.00 mL의 염기를 첨가하였고, pH는 4.23이었다; 대체로 맑은 젤 같은 고체 덩어리가 몇 개 있는 용액이 관찰되었다; 29분에 총 3.00 mL를 첨가하였고, pH는 4.61이었다; 39분에 총 4.00 mL의 염기를 첨가하였고, pH는 5.11이었다; 투명한 무색 용액이 관찰되었다; 43분에 총 4.38 mL의 염기를 첨가했고, pH는 5.29였다; 몇 시간 동안 교반하였다; 투여 개시 후 3시간 23분에 pH는 5.27로 측정되었으며, 실험이 종료되었다; 투명한, 무색의 용액을 20 mL 둥근 바닥 플라스크에 넣고, 생성된 용액을 드라이아이스에서 동결시키고 19시간 5분 동안 동결건조시키자 푹신한 백색 고체가 생성되었다; HPLC(이중) 및 원소분석을 실시했다. PXRD 결과 샘플은 무정형인 것으로 확인되었다(도 8). HPLC는 두 번의 주입에 대해 98.25 면적% 및 98.21 면적%의 순도, 그리고 이에 상응하는 각각 62.12% 및 61.95%의 해당 분석 값을 나타내었다. 생성물(아래)의 원소 분석(C, H, N, O 및 S)은 삼염 사수화물인 무정형 생성물과 잘 일치한다.
히스티딘 삼염에 대한 용해도 결정
상기 생성된 히스티딘 염 12.9 mg을 교반 속도 500rpm 및 물 투입 속도 0.01 mL/분으로 물에 조심스럽게 재용해시켰다. 총 0.08 mL의 물을 첨가한 후 완전한 용해가 관찰되었으며, 이는 최소 161 g/L의 용해도에 해당한다.
HIS-GEN8 실험
70.1 mg(0.101 mmol)의 Foxy-5 헥사펩타이드를 주변 온도에서 5 mL의 물에 슬러리화하고 약 2.97 - 2.98 몰 당량이 첨가될 때까지 교반하면서 0.1M 히스티딘(aq.)을 천천히 첨가하였다. pH는 5.45였다. 실험을 종료하고 무색 용액을 전술한 바와 같이 동결건조시켰다. HT-XRPD 결과 샘플은 무정형인 것으로 확인되었다. UPLC는 96.0 면적%의 순도를 보여준다.
HPLC-CAD는 샘플이 1:3 Foxy-5 헥사펩타이드:L-히스티딘 염임을 확인한다.
HIS-GEN15 실험
실험 HIS-P2는 다음과 같이 규모가 확대되었다: 199.7 mg Foxy-5 헥사펩타이드를 7 mL 탈기수(degassed water)에서 134.2 mg L-히스티딘과 혼합하고 출발 물질이 완전히 용해될 때까지 교반하였다. pH 5.41이 관찰되었다. 이어서 용액을 밤새 동결건조시켰다. 백색 고체를 얻었고 HPLC-CAD에 의해 Foxy-5와 L-히스티딘 사이의 비율이 1:3.19인 것으로 특징화되었지만 D2 O에서 qNMR에 의해 더 정확하게 결정된 것은 1:3 비율(Foxy-5:L-히스티딘)인 것으로 나타났다. UPLC 분석은 98.9 면적%의 화학적 순도를 보여주었다.
exp. HIS-GEN15(각각 약 50 mg)에서 얻은 고체 샘플 5개를 1000μL 에탄올(exp.TCP11), 1000μL 아세톤(exp.TCP12), 1000μL THF(exp.TCP13), 200μL 아세토니트릴/물(90:10)(exp.TCP14) 및 2000 μL 에틸 아세테이트(exp.TCP15)에 현탁시켰다. 현탁액을 열순환시키고 약 5℃에서 3일 동안 에이징시켰다(온도 프로파일 도 11 참조). 에이징 기간이 완료되면 원심분리로 고체를 수집하고 HT-XRPD를 이용하여 습식 및 진공 건조 샘플로서 분석하였다. 열순환 실험의 물질은 무정형이었지만, 특히 에틸 아세테이트의 경우 초기에 얻은 동결건조물과 비교했을 때 물질 취급과 관련하여 향상된 특성을 갖는 것으로 밝혀졌다. 동결건조된 Foxy-5(그 자체 로서 및 질소 염기를 함유한 조성물로서)는 종종 정적 경향이 뚜렷하여 취급하기 어려운 미세하고 부피가 큰 물질인 것으로 종종 발견된다(예를 들어 칭량 중에).
"이염"의 형성
Foxy-5 이염은 일반적으로 물이나 다른 적합한 용매에 용해된 Foxy-5 현탁액에 관련 염기를 첨가하여 제조된다. 염기는 순수하게 첨가하거나 용액 상태로 첨가할 수 있으며, 절차 동안 pH < 6을 유지하면서 한 번에 또는 점차적으로 첨가할 수 있다.
아르기닌 디염
실험 ARG-P2
Foxy-5 헥사펩타이드 90.5 mg(0.130 mmol)을 칭량하여 4 mL Supelco 바이알에 넣었다; 탈기된 초순수 3 mL를 첨가하여(비저항 ≥ 18.2M Ωcm) → 유리질의 흰색 현탁액을 얻었다; 45.1 mg(2 당량)의 L-아르기닌을 N2 퍼지 하에 첨가하여 → pH 4.57의 투명한 무색 용액을 얻었다; 실온에서 2시간 동안 교반하여 → pH 4.55의 투명한 무색 용액을 얻엇다; 주사기 필터(직경 13 mm, 0.2μm PVDF)를 통해 10 mL 둥근 바닥 플라스크로 여과하고; 생성된 용액을 드라이아이스에서 동결시키고; 19시간 30분 동안 동결건조하여 → 흰색 고체를 얻었다; PXRD로 특징화하고; 냉동고에 보관하고 6일 후에 HPLC로 이중으로 특징화하였다. PXRD 결과 샘플은 무정형인 것으로 확인되었다. HPLC는 두 주입에 대해 97.70 면적% 및 97.67 면적%의 순도를 보여준다.
콜린 이염
실험 CHO-P2
Foxy-5 헥사펩타이드 89.1 mg(0.128 mmol)을 칭량하여 4 mL Supelco 바이알에 넣었다; 탈기된 초순수 3 mL를 첨가하여(비저항 ≥ 18.2M Ωcm) → 유리질의 흰색 현탁액을 얻었다; 46% 수산화콜린 (aq)(밀도 = 1.073 g/mL) 63.6μL(2 당량)를 N2 퍼지 하에 첨가하여 → pH 4.78의 베이지색 용액을 얻었다; 실온에서 2시간 동안 교반하여 → pH 4.78의 베이지색 용액을 얻었다; 이를 주사기 필터(직경 13mm, 0.2μm PVDF)를 통해 10 mL 둥근 바닥 플라스크로 여과하고; 생성된 용액을 드라이아이스에서 동결시키고; 19시간 30분 동안 동결건조하여 → 흰색 고체를 얻었다; PXRD로 특징화하고; HPLC에 의해 이중으로 특징화하자 샘플은 무정형인 것으로 확인되었다; HPLC는 두 주입에 대해 94.42 면적% 및 94.27 면적%의 순도를 보여준다.
디에틸아민 이염
실험 DEA-P2
Foxy-5 헥사펩타이드 90.1 mg(0.130 mmol)을 칭량하여 4 mL Supelco 바이알에 넣었다; 탈기된 초순수 3 mL를 첨가하여(비저항 ≥ 18.2M Ωcm) → 유리질의 흰색 현탁액을 얻었다; 26.8 μL (2 당량)의 디에틸아민(밀도 = 0.707 g/mL)을 N2 퍼지 하에 첨가하여 pH 4.68의 희석된 흰색 현탁액을 얻었다; 실온에서 2시간 동안 교반하여 → pH 4.54의 투명한 무색 용액을 얻었다; 이를 주사기 필터(직경 13 mm, 0.2μm PVDF)를 통해 10 mL 둥근 바닥 플라스크로 여과하고; 생성된 용액을 드라이아이스에서 동결시키고; 19시간 30분 동안 동결건조하여 → 흰색 고체를 얻었다; PXRD로 특징화하고; 냉동고에 보관하여 6일 후에 HPLC로 특징화한다; 이 샘플의 분취량을 밀폐 용기에 담아 40℃에서 2주 및 4주 동안 보관하고 HPLC로 이중으로 검사하였다. PXRD 결과 샘플이 무정형인 것으로 확인되었다; HPLC는 두 주입에 대해 97.30 면적% 및 97.41 면적%의 순도를 보여준다.
리신 이염
실험 LYS-P2
Foxy-5 헥사펩타이드 89.6 mg(0.129 mmol)을 칭량하여 4 mL Supelco 바이알에 넣었다; 탈기된 초순수 3 mL를 첨가하여(비저항 ≥ 18.2M Ωcm) → 유리질의 흰색 현탁액을 얻었다; 37.0 mg(2당량)의 L-리신을 N2 퍼지 하에 첨가하여 → pH 4.53의 투명한 무색 용액을 얻었다; 실온에서 2시간 동안 교반하여 → pH 4.52의 투명한 무색 용액을 얻었다; 이를 주사기 필터(직경 13 mm, 0.2μm PVDF)를 통해 10 mL 둥근 바닥 플라스크로 여과하고; 생성된 용액을 드라이아이스에서 동결시키고; 19시간 30분 동안 동결건조하여 → 흰색 고체를 얻었다; PXRD로 특징화하고; 냉동고에서 보관한 다음 6일 후에 HPLC로 특징화하였다; 이 샘플의 분취량을 밀폐 용기에 담아 40℃에서 2주 및 4주 동안 보관하고 HPLC로 이중으로 검사하였다. PXRD 결과 샘플은 무정형인 것으로 확인되었다; HPLC는 두 주입에 대해 97.69 면적% 및 97.73 면적%의 순도를 보여준다.
암모니아 이염
실험 NH3-P6
Foxy-5 헥사펩타이드 100.7 mg(0.145 mmol)을 칭량하여 7 mL Supelco 바이알에 넣었다; N2 퍼지 하에 3.33 mL의 초순수 (비저항 ≥ 18.2 MΩ cm)를 첨가하자 → 젤 같은 흰색 현탁액이 관찰되었다; 500 rpm으로 교반하고 전극을 삽입하자 pH 2.63으로 측정되었다; 1 M의 NH4OH(aq)를 0.05 mL/분으로 투여하고 pH를 측정하기 위해 일시 정지하였다; 2분에 염기 0.10 mL를 첨가했고 pH는 3.19였다; 4분에 총 0.20 mL의 염기를 첨가했고 pH는 3.11이었다; 흰색 현탁액 위에 무색 용액이 관찰되었다; 5분에 0.29 mL의 염기(이염 화학양론)를 첨가했고 pH는 3.18이었다; 7분에 pH는 5.49였으며 용액은 거의 투명하였다; 12분에 pH는 4.60이었고 용액은 투명하였다; 2시간 12분에 pH가 4.56으로 측정되었고 실험이 종료되었다; 투명한 무색 용액을 20 mL 둥근 바닥 플라스크에 넣고 용액을 드라이아이스로 동결시킨 후 냉장고에 5일 동안 보관하였다; 그 후 27시간 35분 동안 동결건조하여 흰색 고체를 얻었다; HPLC(이중) 및 원소 분석이 수행되었다. PXRD 결과 샘플은 무정형인 것으로 확인되었다. HPLC는 두 번의 주입에 대해 97.62 면적% 및 97.66 면적%의 순도와 각각 89.32% 및 89.08%의 해당 분석 값을 보여준다. 생성물(아래)의 원소 분석(C, H, N, O 및 S)은 이염 이수화물인 무정형 생성물과 잘 일치한다.
실험 NH3-GEN6
81.3 mg(0.117 mmol) Foxy-5 헥사펩타이드를 주변 온도에서 5 mL 물에 슬러리화하고 약 1.97 - 1.98 몰당량이 첨가될 때까지 교반하면서 0.1 M 히스티딘(aq.)을 천천히 첨가하였다. pH는 4.36이었다. 실험을 종료하고 무색 용액을 전술한 바와 같이 동결건조하였다. HT-XRPD 결과 샘플은 무정형인 것으로 확인되었다. UPLC는 93.7 면적%의 순도를 보여준다.
HPLC 이동상에 암모니아가 존재하기 때문에 분리된 화합물이 1:2 Foxy-5 헥사펩타이드:NH3 염인지 확인할 수 없었다.
N-메틸-D-글루카민 이염
실험 NMG-P6
Foxy-5 헥사펩타이드 90.2 mg(0.130 mmol)을 칭량하여 7 mL Supelco 바이알에 넣었다; 탈기된 초순수 3 mL를 첨가하였다(비저항 ≥ 18.2M Ωcm). pH 측정기를 삽입하여 pH 2.67을 측정하였다. N2 퍼지를 헤드스페이스(N2 대기)에 적용하고 교반을 700rpm으로 설정하였다. 현탁액이 관찰되었다. N-메틸-D-글루카민의 0.5M 수용액(물 50 mL에 4.8803g) 0.52 mL를 선량계를 사용하여 천천히 첨가하고 다양한 시점에서 pH를 측정하였다. 0.5M NMG(aq) 0.35 mL를 첨가한 후, 거의 모든 고체가 용해되었고 일부 덩어리가 있는 용액이 관찰되었다. pH는 4.13이었다. 0.5M N-메틸-D-글루카민 용액 0.50 mL를 첨가한 후 투명한 용액을 얻었다. pH는 4.57이었다. 총 0.52 mL의 0.5 MN 메틸-D-글루카민 용액을 첨가하였다(2.0 eq에 해당). pH는 4.64였다. 2시간 동안 교반한 후, 용액의 pH는 4.63이었다. 투명한 무색 용액을 20 mL 둥근 바닥 플라스크에 넣었다. 생성된 용액을 드라이아이스에서 동결시키고 밤새 동결건조시켰다. 백색 고체를 얻었고 PXRD 및 HPLC로 특징화하였다. 이 샘플의 분취량을 밀폐 용기에 담아 40℃에서 2주 및 4주 동안 보관하고 HPLC로 이중으로 검사하였다. 40℃에서 2주 동안 보관한 후에 끈적끈적하고 유리같은 외관을 갖는 것으로 관찰되었다. XRPD 결과 샘플은 무정형인 것으로 확인되었다. HPLC는 두 주입에 대해 96.64 면적% 및 96.58 면적%의 순도를 보여준다.
실험 NMG-GEN7
79.3 mg(0.114 mmol) Foxy-5 헥사펩타이드를 주변 온도에서 5 mL 물에 슬러리화하고 약 1.97 - 1.98 몰 당량이 첨가될 때까지 교반하면서 0.5 M N-메틸-D-글루카민 용액(aq.)을 천천히 첨가하였다. pH는 4.73이었다. 실험을 종료하고 무색 용액을 전술한 바와 같이 동결건조하였다. HT-XRPD 결과 샘플은 무정형인 것으로 확인되었다. UPLC는 95.0 면적%의 순도를 보여준다.
HPLC-CAD는 샘플이 1:2 Foxy-5 헥사펩타이드:N-메틸-D-글루카민 염임을 확인한다.
실험 NMG-GEN16
실험 NMG-P6은 다음과 같이 규모가 확대되었다: 200.3 mg의 Foxy-5 헥사펩타이드를 7 mL의 탈기수에서 113.5 mg의 N-메틸-D-글루카민과 혼합하고 출발 물질이 완전히 용해될 때까지 교반하였다. 4.68의 pH가 관찰되었다. 이어서 용액을 밤새 동결건조시켰다. 흰색 고체를 얻었고 UPLC, TGMS, 1H-NMR 및 HPLC-CAD로 특징화하였다. UPLC는 99.0%( 면적%)의 화학적 순도를 보여준다.
NMG-GEN16의 1H-NMR 측정 및 HPLC-CAD를 통해 샘플이 1:2 Foxy-5 헥사펩타이드:N-메틸-D-글루카민 염인 것으로 확인되었다.
얻은 고체를 다음과 같이 열순환시켰다:
exp.NMG-GEN16(각각 약 50 mg)에서 얻은 고체 샘플 5종을 1000μL 에탄올(exp.TCP16), 1000μL 아세톤(exp.TCP17), 1000μL THF(exp.TCP18), 200μL 아세토니트릴/물(90:10)(exp.TCP19) 및 2000 μL 에틸 아세테이트(exp.TCP20)에 현탁시켰다. 현탁액을 열순환시키고 약 5℃에서 3일 동안 에이징시켰다(온도 프로파일 도 11 참조). 에이징 기간이 종료되면 원심분리로 고체를 수집하고 HT-XRPD를 이용하여 습식 및 진공 건조 샘플로서 분석하였다. 열순환 실험의 물질은 무정형이었지만, 특히 에틸 아세테이트의 경우 초기에 얻은 동결건조물과 비교했을 때 물질 취급과 관련하여 향상된 특성을 갖는 것으로 밝혀졌다. 동결건조된 Foxy-5(그 자체로서 및 질소 염기를 함유한 조성물로서)는 종종 정적 경향이 뚜렷하여 취급하기 어려운 미세하고 부피가 큰 물질인 것으로 종종 발견된다(예를 들어 칭량 중에).
트로메타민 이염
실험 TRO-P2
90.1 mg(0.130 mmol)을 칭량하여 4 mL Supelco 바이알에 넣었다; 탈기된 초순수 3 mL를 첨가하여(비저항 ≥ 18.2M Ωcm) → 유리질의 흰색 현탁액을 얻었다; 31.4 mg(2 당량)의 트로메타민을 N2 퍼지 하에 첨가하여 → pH 4.88의 투명한 무색 용액을 얻었다; 실온에서 2시간 동안 교반하여 → pH 4.86의 투명한 무색 용액을 얻었다; 주사기 필터(직경 13mm, 0.2μm PVDF)를 통해 10 mL 둥근 바닥 플라스크로 여과하고; 생성된 용액을 드라이아이스에서 동결시키고; 19시간 30분 동안 동결건조하여 → 흰색 고체를 얻었다; PXRD를 이용하여 특징화하였다; 냉동고에 보관하고 6일 후에 HPLC로 이중으로 특징화하였다; XRPD 결과 샘플은 무정형인 것으로 확인되었다; HPLC는 두 주입에 대해 97.77 면적% 및 97.78 면적%의 순도를 보여준다.
히스티딘 이염
HIS-P3 실험
Foxy-5 헥사펩타이드 99.2 mg(0.143 mmol)을 칭량하여 7 mL Supelco 바이알에 넣었다; 3.33 mL(즉, 30 mg/ mL)의 초순수를 N2 퍼지 하에 첨가하자(비저항 ≥ 18.2 M Ω cm) → 흰색의 젤 같은 고체 현탁액이 관찰되었다; 500rpm으로 교반하고 전극을 삽입하여 pH 2.65를 측정하고; 0.0985 M의 L-히스티딘(aq)을 0.1 mL/분으로 투여하고 일시 중지하여 pH를 측정하였다;. 1분에 염기 0.17 mL를 첨가했고 pH는 3.10이었다; 10분에 총 1.00 mL의 염기를 첨가했고 pH는 3.90이었다; 20분에 총 2.00 mL의 염기를 첨가했고 pH는 4.40이었다; 몇 개의 겔형 고체 덩어리가 있는 대부분 투명한 용액이 관찰되었다; 28분에 총 2.82 mL를 첨가했고 pH는 4.73이었다; 1시간 10분에 투명한 무색 용액이 관찰되었다; 투여 개시로부터 2시간 28분 시점에서 pH가 4.50으로 측정되었고 실험이 종료되었다; 투명한 무색 용액을 20 mL 둥근 바닥 플라스크에 넣고 결과 용액을 드라이아이스에서 동결시키고 19시간 5분 동안 동결건조하여 푹신한 흰색 고체를 생성하였다. HPLC 및 원소 분석이 수행되었다. 이 샘플의 분취량을 밀폐 용기에 담아 40℃에서 2주 및 4주 동안 보관하고 HPLC로 검사하였다. 샘플은 40℃에서 2주 및 4주 동안 보관한 후에도 푹신한 흰색 고체로 남아 있는 것으로 관찰되었다. HPLC는 두 주입에 대해 98.02 면적% 및 98.00 면적%의 순도를 보여준다. 상응하는 분석 값은 각각 67.88%와 67.86%이다. 생성물의 원소 분석(아래 C, H, N, O 및 S)은 무정형 생성물이 이염 이수화물이라는 사실과 잘 일치한다.
히스티딘 이염에 대한 용해도 측정
Foxy-5 헥사펩타이드의 초기 슬러리화를 위해 물의 양(60 mg/ mL)의 절반을 사용하여 위의 실험을 반복하였다. pH 5.82에서 31.6 g/L의 최종 농도가 히스티딘 이염에 대해 달성되었다. 이 실험은 또한 순수(고체) Foxy-5 헥사펩타이드에 히스티딘 용액을 첨가하여 성공적으로 반복되었으며, 그 결과 pH 5.78에서 49.3 g/L의 최종 농도가 달성되었다. 두 경우 모두 최종 용액을 동결시키고 25시간 동안 동결건조하여 푹신한 흰색 고체를 생성하였다.
HIS-GEN5 실험
78.4 mg(0.113 mmol) Foxy-5 헥사펩타이드를 주변 온도에서 5 mL 물에 슬러리화하고 약 1.97 - 1.98 몰 당량이 첨가될 때까지 교반하면서 0.1 M 히스티딘(aq.)을 천천히 첨가하였다. pH는 4.61이었다. 실험을 종료하고 무색 용액을 전술한 바와 같이 동결건조시켰다. HT-XRPD 결과 샘플은 무정형인 것으로 확인되었다. UPLC는 93.9 면적%의 순도를 보여준다.
HPLC-CAD는 샘플이 1:2 Foxy-5 헥사펩타이드:L-히스티딘 염임을 확인한다.
HIS-GEN14 실험
HIS-P3 실험을 다음과 같이 규모 확장시켰다: 220.1 mg Foxy-5 헥사펩타이드를 7 mL 탈기수에서 98.5 mg L-히스티딘과 배합하고 출발 물질이 완전히 용해될 때까지 교반하였다. 4.65의 pH가 관찰되었다. 이어서 용액을 밤새 동결건조시켰다. 백색 고체를 수득하고 HPLC-CAD에 의해 Foxy-5와 L-히스티딘 사이의 비율이 1:2.10인 것으로 특징화되었는데 이 비율은 더 정확히는 1H NMR에 의해 1:2.03인 것으로 측정되었다. UPLC 분석은 98.9 면적%의 화학적 순도를 보여주었다.
exp. HIS-GEN14(각각 약 50 mg)에서 얻은 5종의 고체 샘플을 1000μL 에탄올(exp.TCP6), 1000μL 아세톤(exp.TCP7), 1000μL THF(exp.TCP8), 200μL 아세토니트릴/물(90:10)(exp.TCP9) 및 2000 μL 에틸 아세테이트(exp.TCP10)에 현탁시켰다. 현탁액을 열순환시키고 약 5℃에서 3일 동안 에이징시켰다(온도 프로파일 도 11 참조). 에이징 기간이 종료되면 원심분리로 고체를 수집하고 HT-XRPD로 습식 및 진공 건조 샘플로 분석하였다. 열순환 실험의 물질은 무정형이었지만, 특히 에틸 아세테이트의 경우 초기에 얻은 동결건조물과 비교했을 때 물질 취급과 관련하여 향상된 특성을 갖는 것으로 밝혀졌다. 동결건조된 Foxy-5(그 자체로서 및 질소 염기를 함유한 조성물로서)는 정적 경향이 뚜렷하여 취급하기 어려운 미세하고 부피가 큰 물질인 것으로 종종 발견된다(예를 들어 칭량 중에).
"일염"의 형성
Foxy-5 일염은 일반적으로 물이나 다른 적합한 용매에 용해된 Foxy-5 현탁액에 관련 염기를 첨가하여 제조된다. 염기는 순수하게 첨가하거나 용액 상태로 첨가할 수 있으며, 공정 내내 pH <6을 유지하면서 한 번에 또는 점차적으로 첨가할 수 있다. 이어서, 출발 물질이 용해될 때까지 반응 혼합물을 교반한다. 일염의 최종 용액은 선택적으로 여과된 후 동결건조되거나 분무 건조된다.
히스티딘 일염
HIS-GEN2 실험
90.6 mg(0.131 mmol)의 Foxy-5 헥사펩타이드를 주위 온도에서 5 mL의 물에 슬러리화하고 약 0.97 - 0.98 몰 당량이 첨가될 때까지 교반하면서 0.1M 히스티딘(aq.)을 천천히 첨가하였다. pH는 3.88이었다. 실험을 종료하고 약간 유백색의 무색 용액을 위에서 설명한 대로 동결건조하였다. HT-XRPD 결과 샘플은 무정형인 것으로 확인되었다. UPLC는 95.2 면적%의 순도를 보여준다.
HPLC-CAD는 샘플이 1:1 Foxy-5 헥사펩타이드:L-히스티딘 염임을 확인한다.
암모니아 일염
실험 NH3-GEN3
92.6 mg (0.134 mmol) Foxy-5 헥사펩타이드를 주변 온도에서 5 ml 물에서 슬러리화하고 약 0.99몰 당량이 첨가될 때까지 교반하면서 1M의 NH4OH(aq)를 0.05 mL/분으로 투입하였다. pH는 3.87이었다. 실험을 종료하고 약간 유백색의 무색 용액을 위에서 설명한 대로 동결건조하였다. HT-XRPD 결과 샘플은 무정형인 것으로 확인되었다. UPLC는 94.4 면적%의 순도를 보여준다.
HPLC 이동상에 암모니아가 존재하기 때문에 분리된 화합물이 1:1 Foxy-5 헥사펩타이드:NH3 염인지 확인할 수 없었다.
N-메틸-D-글루카민 일염
NMG-GEN4 실험
89.5 mg(0.129 mmol)의 Foxy-5 헥사펩타이드를 주위 온도에서 물 5 mL와 N-메틸-D-글루카민의 0.5M 수용액(물 50 mL에 4.88g) 0.26 mL(1몰 당량)에 슬러리화하였다. 교반하면서 천천히 첨가하였다. 약 2시간 후에 거의 투명하고 약간 유백색인 용액이 얻어졌다. 이 시점의 pH는 3.91이었다. 실험을 종료하고 용액을 위에서 설명한 대로 동결건조하였다. HT-XRPD 결과 샘플은 무정형인 것으로 확인되었다. UPLC는 94.3 면적%의 순도를 보여준다.
HPLC-CAD는 샘플이 1:1 Foxy-5 헥사펩타이드:NMG 염임을 확인한다.

Claims (16)

  1. For-Met-Asp-Gly-Cys-Glu-Leu-OH(SEQ_NO 1, Foxy-5) 및 질소 염기를 포함하는 고체 조성물로서, 여기서, 질소 염기는 암모니아, 4차 수산화암모늄, 알킬화 구아니딘, 아미노산, 및 1차 및 2차 아민으로부터 선택된 화합물을 포함하고, 여기서 상기 고체 조성물은 선택적으로 물을 포함하는 것인 고체 조성물.
  2. 제1항에 있어서, Foxy-5와 관련하여 계산시, 상기 질소 염기를 0.5 - 3.1 몰 당량으로 함유하는, 고체 조성물.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 질소 염기는 아미노산, 암모니아, 1차 및 2차 아민으로부터 선택되는 화합물인, 고체 조성물.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 질소 염기는 암모니아, L-리신, L-히스티딘, N-메틸-D-글루카민 및 트로메타민으로부터 선택되는, 고체 조성물.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 암모니아, L-리신, L-히스티딘 및 트로메타민으로부터 선택된 질소 염기 1.50 - 2.49 당량, 예컨대 1.7 - 2.1 당량, 예컨대 1.9 - 2.03 당량, 예컨대 1.95 - 2.01 당량, 예컨대 2.0 당량 및 Foxy-5를 포함하는, 고체 조성물.
  6. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, L-히스티딘 및 N-메틸-D-글루카민으로부터 선택된 질소 염기 2.5 - 3.1 당량, 예컨대 2.9 - 3.03 당량, 예컨대 2.95 - 3.01 당량, 예컨대 3.0 당량 및 Foxy-5를 포함하는, 고체 조성물.
  7. 제1항에 있어서, Foxy-5의 이-암모늄염, 이-L-히스티딘 염, 삼-L-히스티딘 염, 이-L-리신 염, 이-N-메틸-D-글루카민 염, 삼-N-메틸-D-글루카민 염 및 이-트로메타민 염으로부터 선택되고, 이들 염은 무정형이며, Foxy-5와 관련하여 계산시 0-5 당량의 물을 포함하는 것인, 고체 조성물.
  8. 제2항에 있어서, 질소 염기는 L-히스티딘인, 고체 조성물.
  9. 제8항에 있어서, Foxy-5 및 1.50 - 2.49 당량의 L-히스티딘, 예컨대 1.7 - 2.1 당량의 L-히스티딘을 포함하는, 고체 조성물.
  10. 제8항에 있어서, Foxy-5 및 2.5 - 3.1 당량의 L-히스티딘을 포함하는 고체 조성물.
  11. 선행하는 항들 중 어느 한 항에 따른 고체 조성물의 제조방법으로서, 다음 단계, 즉:
    a) i. 용매 중 현탁액, 또는
    ii. 순수 분말
    로서 For-Met-Asp-Gly-Cys-Glu-Leu-OH(SEQ_NO 1, Foxy-5)의 유리산 형태를
    iii. Foxy-5의 일염을 제조하기 위해 질소 염기 0.5-1.49 당량, 또는
    iv. Foxy-5의 이염을 제조하기 위해 질소 염기 1.50-2.49 당량, 또는
    v. Foxy-5의 삼염을 제조하기 위해 질소 염기 2.5-3.1 당량
    과 혼합하는 단계,
    b) 투명한 용액이 얻어질 때까지 반응 혼합물을 교반하는 단계, 및
    c) 용액의 침전, 또는 동결건조 또는 분무건조에 의해 고체 조성물을 분리하는 단계
    를 포함하고, 여기서 질소 염기는 암모니아, 4차 수산화암모늄, 알킬화 구아니딘, 아미노산, 및 1차 및 2차 아민으로부터 선택된 화합물이고, 모든 단계 a - c는 선택적으로 불활성 대기에서 수행되는 것인, 고체 조성물의 제조방법.
  12. 제11항에 있어서, 용매로서 물을 사용하는, 고체 조성물의 제조방법.
  13. 제11항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 반응 혼합물의 pH를 6.0 미만으로 유지하면서 질소 염기를 Foxy-5에 점진적으로 첨가하는, 고체 조성물의 제조방법.
  14. 제11항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 b)로부터 생성된 투명한 용액을 동결건조시키는, 고체 조성물의 제조방법.
  15. 제11항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 생성된 고체 조성물에 대해 다음 단계들, 즉:
    i. 용매 또는 용매 혼합물에 동결건조되거나 분무건조된 생성물의 현탁액을 제공하는 단계,
    ii. 현탁액을 5℃ - 50℃±2℃ 사이에서 1 - 3 사이클을 포함하는 열순환 공정에 적용한 후, 현탁액을 5℃±2℃에서 1-3일 동안 에이징시키는 단계,
    iii. 예를 들어 여과 또는 원심분리를 통해 열순환된 제품을 분리하는 단계
    를 포함하는 열순환 공정을 추가로 수행하되,
    상기 열순환 공정 동안 현탁액을 50℃±2℃의 온도에 도달할 때까지 10℃±2℃/hr의 속도로 가열한 다음, 5℃±2℃의 온도에 도달할 때까지 다음 속도, 즉:
    a. 첫 번째 사이클의 경우 20℃±2℃/h,
    b. 두 번째 사이클의 경우 10℃±2℃/hr,
    c. 세 번째 사이클의 경우 5℃±2℃/hr
    의 속도로 냉각하고, 이어서 상기 현탁액을 분리하기 전에 5℃±2℃에서 1~3일 동안 교반에 의해 최종적으로 에이징하는, 고체 조성물의 제조방법.
  16. 제15항에 있어서, 상기 유기용매는 에탄올, 아세톤, 테트라히드로푸란(THF), 아세토니트릴/물(90/10) 및 에틸아세테이트로부터 선택되는, 고체 조성물의 제조방법.
KR1020247022674A 2021-12-10 2022-12-08 높은 용해도를 갖는 foxy-5 헥사펩타이드의 안정적인 조성물 KR20240119292A (ko)

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