KR20240110172A - 지방세포의 지방축적 억제능을 갖는 Lactobacillus pentosus KCL032 균주, 이의 배양액 또는 균체 추출물을 포함하는 조성물 - Google Patents
지방세포의 지방축적 억제능을 갖는 Lactobacillus pentosus KCL032 균주, 이의 배양액 또는 균체 추출물을 포함하는 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 지방세포의 지방축적 억제능을 갖는 Lactobacillus pentosus KCL032 균주, 이의 배양액 또는 균체 추출물을 포함하는 조성물에 관한 것이다.
Description
본 발명은 지방세포의 지방축적 억제능을 갖는 Lactobacillus pentosus KCL032 균주, 이의 배양액 또는 균체 추출물을 포함하는 조성물에 관한 것이다.
인류가 풍요로운 사회로 점점 발전해 감에 따라 비만은 심각한 만성 질환 중 하나로 대두되고 있다. 비만은 다양한 원인에 의해 나타나는데, 열량의 섭취와 소비의 불균형으로 발생되는 대사성 질환으로, 형태학적으로 볼 때 체내 지방세포의 크기의 증가(hypertrophy) 또는 수의 증가(hyperplasia)에 의해 초래된다고 알려져 있다.
비만은 심리적으로 개인을 위축시킬 뿐만 아니라 사회적으로도 여러 가지 성인병의 발병 위험을 증가시키는 직접적인 원인이 되고 있으므로, 국가 의료 지출액 증가의 주 원인이다.
구체적으로 비만은 2형 당뇨병, 고혈압, 고지혈증, 심질환 등 여러 가지 성인병의 유병율 증가와 직접적인 관련이 있으며, 비만과 관련된 질환들을 함께 묶어서 대사증후군(metabolic syndrome) 또는 인슐린 저항성 증후군(insulin resistance syndrome)이라고 한다. 이들은 동맥경화증 및 심혈관질환의 원인으로 작용한다.
비만은 서구사회에서 가장 흔한 영양장애일 뿐만 아니라, 최근 우리나라에서도 경제발전에 의한 식생활의 향상과 생활방식의 서구화로 비만의 빈도가 급속히 증가하는 추세에 있고, 한국성인의 비만 비율은 해마다 3%씩 증가하고 있는 추세이기 때문에, 그 문제성이 점차 심각해지고 있는 상황이다.
따라서, 비만을 치료하고, 예방하기 위한 치료제 혹은 치료방법의 개발이 요구되고 있다.
현재까지 알려진 비만치료제로는 제니칼(Xenical, 로슈제약회사, 스위스), 리덕틸(Reductil, 에보트사, 미국), 엑소리제(Exolise, 아토파마, 프랑스) 등으로 크게 식욕억제제, 에너지소비 촉진제, 지방흡수억제제로 분류되며, 대부분의 비만치료제는 시상하부와 관련된 신경전달물질을 조절함으로써 식욕을 억제하는 식욕억제제이다. 그러나 종래의 치료제들은 심장질환, 호흡기질환, 신경계질환 등의 부작용과 함께 그 효능의 지속성도 낮아, 더욱 개선된 비만치료제의 개발이 필요하고 또한, 현재 개발되고 있는 제품도 부작용 없이 만족할 만한 치료 효과를 가지는 치료제는 거의 없어 새로운 비만치료제의 개발이 요구되고 있다.
이에 반해 안전한 미생물로 여겨져 온 유산균을 이용하여 혈중 콜레스테롤 수준을 감소시키고자 하는 노력 역시 많이 이루어졌다. 유산균은 당류를 에너지원으로 사용한 대사산물로 다량의 유산을 생성하고, 그 외 여러 유기산 및 박테리오신(bacteriocin) 등의 항균물질도 함께 생성하나, 사람이나 동물의 장에 해로운 인돌, 스케톨, 페놀, 아민 또는 암모니아 등은 생성하지 않아 부패를 방지하고 유해균을 억제하며 사람에게 도움이 되는 생리활성을 보이는 유익한 세균이다. 이 중에서도 락토바실러스 속 균주는 인체의 장내에 서식하는 정상 미생물 군집의 주요 구성원으로서, 건강한 소화기관과 질 내 환경을 유지하는 데 있어서 중요한 것으로 오래 전부터 알려져 왔고 미국의 공중건강 가이드라인(US Public Health Service guidelines)에 의하면, 현재 미국 균주 기탁기관(ATCC)에 기탁된 락토바실러스 균주 모두 인체나 동물에 질병을 유발할 잠재적 위험에 대해서는 알려진 것이 없다고 인정되는 '안정수준(Bio-safty Level) 1'로 분류되어 있다.
대한민국등록특허공보 제10-1471033호에는 비만 억제능이 우수한 웨이젤라 에스피(Weissella sp) F22(수탁번호: KACC 91867P) 균주가 개시되어 있어 있다.
그러나, 상업적으로 성공할 만큼 항비만 효과가 우수한 유산균 관련 기술은 출현하지 않고 있으므로, 본 발명자들은 체내 부작용이 없고, 비만 치료 효과가 우수한 프로바이오틱스에 대한 연구를 수행하던 중, 새롭게 Lactobacillus pentosus KCL032 균주를 발견하고, 이의 균체 추출물이 우수한 비만 개선, 예방, 치료 효과가 우수함을 확인함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명이 해결하고자 하는 과제는 Lactobacillus pentosus KCL032 균주, 이의 배양액 또는 균체 추출물을 포함하는 지방세포의 지방축적을 억제하는 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명이 해결하고자 하는 또 다른 과제는 Lactobacillus pentosus KCL032 균주, 이의 배양액 또는 균체 추출물을 포함하는 비만 예방 또는 치료용 약학 조성물 및 식품 조성물을 제공하는 것이다.
일 양태에서, 본 발명은 지방세포의 지방축적 억제능을 갖는 Lactobacillus pentosus KCL032 균주, 이의 배양액 또는 균체 추출물을 포함하는 조성물을 제공한다.
본 발명에서 Lactobacillus pentosus KCL032 균주는 반려견의 침에서 분리한 것일 수 있다.
본 발명에서 상기 균체 추출물은 균체를 이용하여 현탁액을 제조한 다음에 5~15분 동안 초음파 추출할 수 있다.
본 발명에서 상기 조성물은 PPARγ, C/EBPα, aP2 및 FAS의 발현을 억제할 수 있다.
다른 양태에서, 본 발명은 Lactobacillus pentosus KCL032 균주, 이의 배양액 또는 균체 추출물을 포함하는 비만 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.
또 다른 양태에서 본 발명은 Lactobacillus pentosus KCL032 균주, 이의 배양액 또는 균체 추출물을 포함하는 비만 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명에 따르면, Lactobacillus pentosus KCL032 균주는 반려견의 침에서 분리된 것이며, 균주, 이의 배양액 또는 균체 추출물은 PPARγ, C/EBPα, aP2, FAS의 발현을 억제하여 지방세포의 지방축적을 저하시킬 수 있어, 비만 개선 또는 예방 또는 치료용 약학 조성물 및 식품 조성물 등에 활용할 수 있다.
도 1은 Lactobacillus pentosus KCL032 균주 및 KCTC 3164 균주의 항산화 활성을 비교한 결과이다.
도 2 Lactobacillus pentosus KCL032 및 KCTC 3163 균체 추출물의 세포독성을 비교한 결과이다.
도 3은 Lactobacillus pentosus KCL032의 균체 추출물의 처리 이후에 3T3-L1 cell 분화 및 oil red O 염색 결과를 나타낸 결과이다.
도 4는 3T3-L1 cell의 분화과정에 Lactobacillus pentosus KCL032 의 균체 추출물이 PPARγ, C/EBPα, aP2 및 FAS의 발현에 미치는 영향을 분석한 결과이다.
도 2 Lactobacillus pentosus KCL032 및 KCTC 3163 균체 추출물의 세포독성을 비교한 결과이다.
도 3은 Lactobacillus pentosus KCL032의 균체 추출물의 처리 이후에 3T3-L1 cell 분화 및 oil red O 염색 결과를 나타낸 결과이다.
도 4는 3T3-L1 cell의 분화과정에 Lactobacillus pentosus KCL032 의 균체 추출물이 PPARγ, C/EBPα, aP2 및 FAS의 발현에 미치는 영향을 분석한 결과이다.
이하, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 본 발명의 실시형태에 대하여 첨부한 도면을 참고로 하여 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 여러 가지 상이한 실시형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시형태에 한정되지 않는다. 명세서 전체를 통하여 유사한 부분에 대해서는 동일한 도면 부호를 붙였다.
또한, 본 발명에서 수치와 관련하여 용어 “약(about)”, “대략(approximately)” 또는, 적어도(at least)와 같은 유사한 표현이 사용되는 경우, 해당 수치를 기준으로 ±10%, ±7%, ±5%, ±3%, ±2%, 또는 ±1%의 이론적, 실험적, 통계적, 또는 경험칙상의 오차가 허용되는 것으로 의도된다.
일 양태에서, 본 발명은 지방세포의 지방축적 억제능을 갖는 Lactobacillus pentosus KCL032 균주, 이의 배양액 또는 균체 추출물을 포함하는 조성물을 제공한다.
본 발명에서 Lactobacillus pentosus KCL032 균주는 반려견의 침에서 분리한 것이며, 한국 생물자원센터(KCTC)에 2022년 5월 30일 기탁된 균주이다.
본 발명에서 Lactobacillus pentosus KCL032 균주는 하기의 표 1에 표시된 16S rDNA로 서열번호 1에 기재된 염기서열을 포함할 수 있다.
| GACTAACGCTGGCGGCGTGCCTAATACATGCAAGTCGAACGAACTCTGGTATTGATTGGT GCTTGCATCATGATTTACATTTGAGTGAGTGGCGAACTGGTGAGTAACACGTGGGAAACC TGCCCAGAAGCGGGGGATAACACCTGGAAACAGATGCTAATACCGCATAACAACTTGGAC CGCATGGTCCGAGTTTGAAAGATGGCTTCGGCTATCACTTTTGGATGGTCCCGCGGCGTA TTAGCTAGATGGTGGGGTAACGGCTCACCATGGCAATGATACGTAGCCGACCTGAGAGGG TAATCGGCCACATTGGGACTGAGACACGGCCCAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGA ATCTTCCACAATGGACGAAAGTCTGATGGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGGTTTCG GCTCGTAAAACTCTGTTGTTAAAGAAGAACATATCTGAGAGTAACTGTTCAGGTATTGAC GGTATTTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTG GCAAGCGTTGTCCGGATTTATTGGGCGTAAAGCGAGCGCAGGCGGTTTTTTAAGTCTGAT GTGAAAGCCTTCGGCTCAACCGAAGAAGTGCATCGGAAACTGGGAAACTTGAGTGCAGAA GAGGACAGTGGAACTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATATGGAAGAACACCAGT GGCGAAGGCGGCTGTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGCTCGAAAGTATGGGTAGCAAAC AGGATTAGATACCCTGGTAGTCCATACCGTAAACGATGAATGCTAAGTGTTGGAGGGTTT CCGCCCTTCAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCATTCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAG GCTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTC GAAGCTACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATACTATGCAAATCTAAGAGATTAGAC GTTCCCTTCGGGGACATGGATACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGA TGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATTATCAGTTGCCAGCATTAAGTTGG GCACTCTGGTGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATC ATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGATGGTACAACGAGTTGCGAAC TCGCGAGAGTAAGCTAATCTCTTAAAGCCATTCTCAGTTCGGATTGTAGGCTGCAACTCG CCTACATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCC CGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGAGAGTTTGTAACACCCGAAGTCGGTGGG GTAACCTTTTAGGAACCAGCCGCCTAAGGTGGGACAGATGATTAGGGTG |
본 발명에서 반려견은 푸들, 시추, 말티즈, 비숑, 닥스훈트, 리트리버, 시바견, 불독 및 비글으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 1종 이상일 수 있으며, 구체적으로 비글일 수 있고, 더욱 구체적으로 암컷 비글(5세)일 수 있다.
본 발명에서 Lactobacillus pentosus KCL032는 비만활성 외에, 항산화 및 항균 활성을 더 나타낼 수 있다.
본 발명에서 Lactobacillus pentosus KCL032는 내산성 및 내담즙성이 우수하여 pH3 이상에서 80% 이상의 생존율을 나타낼 수 있고, pH2의 조건에서 60% 이상의 생존율을 나타낼 수 있다.
또한, 본 발명에서 Lactobacillus pentosus KCL032는 0.2~0.3%의 담즙산 조건에서 90% 이상의 생존율을 나타낼 수 있으며, 구체적으로 92~95%의 생존율을 나타낼 수 있다.
본 발명에서 Lactobacillus pentosus KCL032는 장부착능이 우수하여 종래의 균주 대비 지방세포의 지방축적을 더 오랜 시간 동안 억제할 수 있다.
즉, 본 발명의 Lactobacillus pentosus KCL032는 숙주의 체내에서 높은 생존율을 나타낼 수 있고, 장부착능이 우수하여, 지방축적 억제 활성을 체내에서 오래 유지할 수 있다.
본 발명에서 상기 조성물은 지방축적에 관여하는 유전자인 PPARγ, C/EBPα, aP2 및 FAS의 발현을 억제할 수 있다.
본 발명에서 상기 균체 추출물은 초음파 처리하여 추출한 것일 수 있다.
일 실시형태로 본 발명에서 균체는 Lactobacillus pentosus KCL032 균주를 배양한 이후에 배양액을 수거하여 3,000~4,000 rpm으로 10~30분 동안 원심분리하고 상등액을 제거하여 수득할 수 있다.
또한, 일 실시형태로 본 발명에서 균체 추출물은 수득된 균체를 증류수에 현탁하고 5~15분 동안 초음파 처리한 다음에 10,000~15,000rpm의 조건으로 원심분리(상등액)하여 수득할 수 있다.
본 발명에서 Lactobacillus pentosus KCL032 균주, 이의 배양액 또는 균체 추출물은 조성물 총 중량에 대해 0.01~50 중량%로 포함될 수 있으며, 바람직하게는 0.1~30중량%를 포함할 수 있다.
다른 양태에서, 본 발명은 Lactobacillus pentosus KCL032 균주, 이의 배양액 또는 균체 추출물을 포함하는 비만 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.
본 발명에서 Lactobacillus pentosus KCL032 균주는 배양상태를 그대로 사용할 수 있고, 건조된 분말의 형태로 사용할 수 있다. 또한, 균체 추출물 역시 그대로 사용할 수 있고, 건조된 분말의 형태로 사용할 수 있다.
본 발명에서 사용하는 용어 "배양액"은 Lactobacillus pentosus KCL032 균주가 시험관 내에서 성장 및 생존할 수 있도록 영양분을 공급할 수 있는 공지의 액체 배지 또는 고체 배지에, Lactobacillus pentosus KCL032 균주를 일정기간 배양하여 얻는 배양된 균주, 이의 대사물, 여분의 영양분 등을 포함하는 전체 배지를 의미하며, 균주 배양 후 균주를 제거한 배양액도 이에 포함된다.
상기 배양액은 원심분리 또는 여과과정을 거친 것이거나, 농축된 것일 수 있으며, 이러한 단계는 당업자의 필요에 따라 수행할 수 있다.
상기 Lactobacillus pentosus KCL032 균주, 이의 배양액 및 균체 추출물은 조성물 총 중량에 대하여 0.01~50 중량%로 포함되고, 이를 바로 사용할 수도 있고, 농축하여 사용할 수도 있으며, 농축 또는 건조한 후 희석하여 사용할 수 있다.
상기 '유효성분으로 포함하는'이란 Lactobacillus pentosus KCL032 균주, 이의 배양액 및 균체 추출물의 비만 개선, 치료 또는 예방 효능 또는 활성을 달성하는 데 충분한 양을 포함하는 것을 의미한다.
상기 조성물의 투여로 비만의 발생, 확산 및 재발을 억제시키거나 지연시키는 모든 행위를 의미하고, 치료는 상기 조성물의 투여로 비만의 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.
상기 식품 조성물이란, 상기 조성물을 캡슐, 정제, 분말, 과립, 액상, 환, 편상, 페이스트상, 시럽, 겔, 젤리 또는 바(bar) 형태로 제제화 한 것일 수 있고, 또는 음료, 차류, 향신료, 껌, 과자류 등의 식품소재에 첨가하여 일반 식품 형태로 제조한 것으로, 이를 섭취할 경우 건강상 특정한 효과를 가져오는 것을 의미하나, 일반 약품과는 달리 식품을 원료로 하여 약품의 장기 복용시 발생할 수 있는 부작용 등이 없는 장점이 있다.
상기 식품 조성물은, 일상적으로 섭취하는 것이 가능하기 때문에 매우 유용하다. 이와 같은 식품 조성물에 있어서의 Lactobacillus pentosus KCL032 균주, 이의 배양액 및 균체 추출물의 첨가량은, 대상인 식품의 종류에 따라 달라 일률적으로 규정할 수 없지만, 식품 본래의 맛을 손상시키지 않는 범위에서 첨가하면 되며, 대상 식품에 대하여 통상 0.01 내지 50 중량%, 바람직하기로는 0.1 내지 20 중량%의 범위이다. 또한, 캡슐, 정제, 분말, 과립, 액상, 환, 편상, 페이스트상, 시럽, 겔, 젤리 또는 바(bar) 형태의 식품 조성물의 경우에는 통상 0.1 내지 100 중량% 바람직하기로는 0.5 내지 80 중량%의 범위에서 첨가하면 된다.
상기 식품 조성물은 유효성분으로서 Lactobacillus pentosus KCL032 균주, 이의 배양액 및 균체 추출물 뿐만 아니라, 식품 제조 시에 통상적으로 첨가되는 성분을 포함할 수 있으며, 예를 들어, 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소, 조미제 및 향미제를 포함한다. 상술한 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스, 올리고당 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 사이클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다.
향미제로서 천연 향미제 [타우마틴, 스테비아 추출물 (예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 사용할 수 있다.
예컨대, 본 발명의 식품 조성물이 드링크제와 음료류로 제조되는 경우에는 본 발명의 Lactobacillus pentosus KCL032 균주, 이의 배양액 및 균체 추출물 이외에 구연산, 액상과당, 설탕, 포도당, 초산, 사과산, 과즙, 및 각종 식물 추출액 등을 추가로 포함시킬 수 있다.
또한, Lactobacillus pentosus KCL032 균주, 이의 배양액 및 균체 추출물을 포함하는 비만 의 예방 또는 치료용 약학 조성물에서, Lactobacillus pentosus KCL032 균주의 생균수는 5×107CFU 미만, 바람직하게는 5×103 ~ 5×107CFU의 농도로 포함되도록 투여될 수 있으나, 이는 환자 및 상황에 따라 선택되어야 할 사항으로 상기 조성물 내 생균수에 의해서 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다.
또한 상기 조성물에서 배양액 또는 균체 추출물은 예를 들어, 0.001mg/kg 이상, 바람직하게는 0.1mg/kg 이상, 보다 바람직하게는 10mg/kg 이상, 보다 더 바람직하게는 100mg/kg 이상, 보다 더욱 더 바람직하게는 250mg/kg 이상, 가장 바람직하게는 0.1g/kg 이상 포함된다. Lactobacillus pentosus KCL032 균주의 배양액 또는 균체 추출물의 양적 상한은 당업자가 적절한 범위 내에서 선택하여 실시할 수 있다.
또 다른 양태에서 본 발명은 Lactobacillus pentosus KCL032 균주, 이의 배양액 또는 균체 추출물을 포함하는 비만 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
상기 약학 조성물은 상기 유효 성분 이외에 약제학적으로 적합하고 생리학적으로 허용되는 보조제를 사용하여 제조될 수 있으며, 상기 보조제로는 부형제, 붕해제, 감미제, 결합제, 피복제, 팽창제, 윤활제, 활택제 또는 향미제 등을 사용할 수 있다.
상기 약학 조성물은 투여를 위해서 상기 기재한 유효 성분 이외에 추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 제제화할 수 있다.
상기 약학 조성물의 제제 형태는 과립제, 산제, 정제, 피복정, 캡슐제, 좌제, 액제, 시럽, 즙, 현탁제, 유제, 점적제 또는 주사 가능한 액제 등이 될 수 있다. 예를 들어, 정제 또는 캡슐제의 형태로의 제제화를 위해, 유효 성분은 에탄올, 글리세롤, 물 등과 같은 경구, 무독성의 약제학적으로 허용 가능한 불활성 담체와 결합될 수 있다. 또한, 원하거나 필요한 경우, 적합한 결합제, 윤활제, 붕해제 및 발색제 또한 혼합물로 포함될 수 있다. 적합한 결합제는 이에 제한되는 것은 아니나, 녹말, 젤라틴, 글루코스 또는 베타-락토오스와 같은 천연 당, 옥수수 감미제, 아카시아, 트래커캔스 또는 소듐올레이트와 같은 천연 및 합성 검, 소듐 스테아레이트, 마그네슘 스테아레이트, 소듐 벤조에이트, 소듐 아세테이트, 소듐 클로라이드 등을 포함한다. 붕해제는 이에 제한되는 것은 아니나, 녹말, 메틸 셀룰로스, 아가, 벤토니트, 잔탄 검 등을 포함한다.
액상 용액으로 제제화되는 조성물에 있어서 허용 가능한 약학 담체로는, 멸균 및 생체에 적합한 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사용액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다.
더 나아가 해당분야의 적절한 방법으로 Remington's Pharmaceutical Science, Mack Publishing Company, Easton PA에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화 할 수 있다.
상기 약학 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있고, 비경구 투여인 경우에는 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 경피 투여 등으로 투여할 수 있으며, 바람직하게는 경구 투여이다.
상기 약학 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하며, 보통으로 숙련된 의사는 소망하는 치료 또는 예방에 효과적인 투여량을 용이하게 결정 및 처방할 수 있다. 바람직한 구현예에 따르면, 상기 약학 조성물의 1일 투여량은 0.001~10g/㎏이다.
상기 약학 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예 등을 들어 상세하게 설명하기로 한다. 그러나, 본 발명에 따른 실시예들은 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 하기 실시예들에 한정되는 것으로 해석되어서는 안 된다. 본 발명의 실시예들은 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.
<실시예>
1. 균주의 분리 동정
반려견의 침을 채취하여 냉장보관 상태로 실험실로 운반한 뒤, MRS 평판배지에 도말하고 37℃, 48시간 혐기 배양한 다음에 자라난 콜로니 중 유산균으로 판별되는 콜로니를 선택한 후 개별적으로 분리배양을 동일한 조건으로 7회 배양하였다.
다음으로, 혈액한천배지에서 용혈성을 보이지 않으며, 카탈라아제 반응을 보이지 않으며, 그람 염색에서 양성을 나타내는 콜로니를 최종 선발하였으며, 선별된 콜로니는 16s rRNA gene sequencing을 통하여 동정을 실시하였다.
2. 내산성 및 내담즙성 시험
1N HCl을 이용하여 pH2, 3 및 4로 조정된 MRS broth와 0.3% 및 0.4%의 bile salt가 함유된 MRS broth에 유산균을 1x106 CFU/mL로 접종한 뒤에 내산성 시험은 37℃, 3시간 동안 배양하고, 배양 전후의 생존율을 측정하였고, 내담즙성 시험은 동일한 조건에서 24시간 배양한 이후의 생존율을 측정하였다.
| (%) | 3h control | pH4 | pH3 | pH2 | 24h control |
0.3% bile | 0.5% bile |
Adhesion |
| KCL032 | 100.48±1.27 | 89.46 ±1.25 |
88.12 ±1.71 |
62.84 ±1.68 |
92.02 ±1.22 |
95.15 ±0.12 |
95.15 ±0.12 |
8.23 ±0.26 |
표 2를 참조하면, pH3과 pH4에서는 88% 이상의 생존율을 보였으며 pH2의 조건에서는 62%의 생존율을 나타내었다. 또한, 0.3%의 bile salt의 조건에서 95%의 생존율을 보였으며 0.5%의 bile salt의 조건에서 92%의 생존율을 나타내었다.
3. 장관 부착능 시험
장관 부착능 시험은 HT-29 cell(Human intestinal epithelial cells)에 유산균의 부착능력을 확인하였다.
HT-29 cell에 RPMI 1640배지(10% fetal bovine serum, 1% anti-anti)를 사용하여 배양하였고, 24-well plate에 배양된 HT-29 cell에 유산균을 희석하여 37℃, 5% CO2 incubator에서 2시간 배양하였다.
배양 이후에, well 내에 있는 부착되지 않은 유산균은 PBS을 이용하여 세척함으로써 제거하고 Trypsin-EDTA를 처리하여 HT-29 cell을 수거하였다.
장관 부착능은 수거한 HT-29 cell을 십진희석한 뒤 MRS agar에 도말하여 37℃에서 48시간 배양한 뒤 형성된 콜로니의 수를 통하여 CFU를 측정하였다.
그 결과, 대조구로 사용된 LGG는 2% 정도의 장관 부착능을 나타내었으며, Lactobacillus pentosus KCL032은 8% 이상의 장관 부착능을 나타내는 것을 확인할 수 있다.
4. 항균 시험
유산균을 MRS broth에 37℃, 48시간 배양 후 배양상등액을 수거하여 100 mg/mL로 농축하여 이를 디스크 확산법을 통하여 항균활성을 평가하였다.
항균시험에는 S. aureus ATCC 6538, P. aeruginosa ATCC 27853, S. typhimurium ATCC 13311, E. coli ATCC 25922을 이용하였으며, 그 결과를 하기의 표 3에 나타내었다.
| strain | S. aureus ATCC 6538 |
P. aeruginosa ATCC 27853 |
S. typhimurium ATCC 13311 |
E. coli ATCC 25922 |
| KCL032 | 20.33±0.29 | 19.33±0.27 | 18.67±0.27 | 13.33±0.36 |
표 3을 참조하면, Lactobacillus pentosus KCL032의 배양상등액은 시험균주로 사용된 4가지 병원균에 대하여 모두 항균활성을 나타내었으며, S.aureus에 대해 가장 항균활성이 높은 것을 확인할 수 있다.
5. 항생제 감수성 시험
유산균을 MRS broth에 37℃, 48시간 배양 후 Mcfarland standard 0.5로 현탁한 균주 현탁액을 MRA agar에 도말한 뒤, 항생제가 포함되어 있는 disk를 올리고 37℃, 24시간 배양 후 생성된 clear zone을 확인하였으며, 수거한 HT-29 cell을 희석하여 MRS agar plate에 도말 후 37℃에서 48시간 배양한 뒤, 생성된 colony를 통하여 균수를 측정하였으며, 그 결과를 하기의 표 4에 나타내었다. 대조구는 L. rhamnosus GG를 사용하였다.
| Group(mm) | Antibiotics | KCL032 |
| β-lactam | AMP | 18(I) |
| OXA | -(R) | |
| Cephalosporin | CTT | -(R) |
| CEF | 22(S) | |
| Aminoglycoside | GEN | 8(R) |
| STR | -(R) | |
| Quinolone | CIP | -(R) |
| NAL | -(R) | |
| Glycopeptide | VAN | -(R) |
| Tetracycline | TET | 16(I) |
| Carbapenem | IPM | 30(S) |
| Macrolide | ERY | 23(S) |
| TMP/SMX | -(R) | |
| Others | RIF | 20(S) |
6. DPPH 항산화 시험
유산균의 항산화 시험은 유산균 시료의 형태에 따라서, 유산균을 MRS broth에 37℃, 48시간 배양하고 원심분리한 뒤 0.45μm 필터로 필터링한 다음 상등액(metabolite)을 이용하였다.
0.2mM 2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl(DPPH) 1mL와 시료 800μL를 혼합한 후, 상온에서 30분 동안 반응시키고 반응완료 이후에 원심분리하여 그 상등액을 취해 흡광도(517nm)를 측정하였다. 대조구(control group)로 L. acidophilus KCTC 3164을 사용하였다.
도 1을 참조하면, DPPH의 항산화 활성이 대조구로 사용된 KCTC 3164보다 본 발명의 Lactobacillus pentosus KCL032의 metabolite가 항산화 활성이 우수한 것을 확인할 수 있다.
7. ABTS 항산화 시험
7.4mM ABTS와 2.45mM potassium persulfate(Sigma-Aldrich Co.)를 혼합하여 빛을 차단한 상온에서 24시간 반응시켜 ABTS reagent을 제조한 이후에 증류수를 가하여 732nm에서 흡광도가 0.706±0.003이 되게끔 희석하여 사용하였다.
시료 40μL를 ABTS reagent 960μL를 가하여 혼합 후 상온에서 15분간 반응시킨 다음 분광광도계를 이용하여 흡광도(732nm)를 측정하여 도 1에 나타내었다.
대조구(control group)로 L. acidophilus KCTC 3164을 사용하였다.
도 1을 참조하면, ABTS의 항산화 활성이 KCTC 3164보다 Lactobacillus pentosus KCL032의 대사산물(metabolite)의 항산화 활성이 우수한 것을 확인할 수 있다.
8. 세포독성시험
유산균 배양액을 3,500rpm에서 20분간 원심분리 후 상등액을 제거하여 얻어진 균체를 증류수를 이용하여 3회 세척하며 남아있는 배양상등액을 제거한 뒤 멸균된 증류수로 균체를 재현탁하였다.
재현택액을 10분 동안 초음파 처리한 이후에 13,000rpm으로 10분간 원심분리 후 상등액을 수거하여 균체 추출물을 수득하였다.
3T3-L1 cell은 high glucose DMEM 배지(10% fetal calf serum, 1% anti-anti)를 사용하여 배양하였으며, 3T3-L1 cell을 1×104cells/well로 96-well plate에 100μL씩 분주한 다음에 37℃, 5% CO2 조건에서 24시간 배양한 뒤, 일정 농도로 희석 균체 추출물을 첨가한 후 다시 24시간 배양하였다.
배양 완료 이후에 Cell couning kit-8을 이용하여 세포생존율을 측정하여 도 2에 나타내었다.
세포독성은 시료를 처리하지 않은 대조군(CON. 0)과 시료 처리군(100, 200, 400)의 비율로 계산하였으며 positive control로 L. gasseri KCTC 3163을 사용하였다.
도 2를 참조하면, Lactobacillus pentosus KCL032와 KCTC 3163의 균체 추출물(Cell free extract)은 400μg/mL의 농도에서 일부 세포 독성을 나타내었으며, 200μg/mL 이하의 농도에서는 세포독성을 나타내지 않는 것을 확인할 수 있다.
9. 3T3-L1 cell 분화 및 oil red O 염색
3T3-L1 cell은 10% fetal bovine serum(FBS) DMEM 배지에 DMI(0.5mM 3-Isobutyl-1-methylxanthine,(IBMX), 1μM dexamethasone, 1μg/mL insulin)를 2일 동안 처리하여 분화를 유도한 이후에 1μg/mL insulin이 함유된 10% FBS DMEM으로 배지를 교체하여 2일 동안 배양하였다. 2일마다 10% FBS DMEM 배양액으로 교체하여 8일 동안 분화를 유도하였으며, 지방세포 분화를 유도하는 동안 각 배양액에 CFE를 처리하였다. 8일 후 분화가 완료된 시점에 배지를 제거한 뒤 10% formaldehyde 용액으로 고정하고, PBS로 2회 세척하고 60% isopropanol을 상온에서 5분 처리하였다.
그 뒤 Oil red O 용액을 처리하여 염색을 실시하였으며, 염색된 세포를 현미경을 통하여 관찰한 후 100% isopropanol을 처리하여 흡광도(510nm)를 측정해 정량하였다. 지방축적 정도는 시료를 처리하지 않고 분화를 유도한 대조군과의 비율로 계산하여 도 2에 나타내었다.
도 3을 참조하면, Lactobacillus pentosus KCL032의 균체 추출물을 3T3-L1 cell의 분화과정에 처리함에 따라 지방의 축적이 감소하는 것을 확인하였으며, 대조구로 사용된 KCTC 3163보다 그 효과가 더욱 뛰어난 것을 확인할 수 있다.
10. PCR을 이용한 유전자 발현 측정
균체 추출물의 처리가 3T3-L1 cell에서 지방축적과 관련된 유전자인 PPARγ, C/EBPα, aP2, FAS의 발현에 미치는지를 확인하기 위하여 시료를 3T3-L1 cell의 분화과정 중에 처리한 뒤, total RNA를 추출하여 cDNA로 역전사하였다.
역전사된 cDNA를 각 target gene에 알맞은 primer를 이용하여 PCR를 수행하여 mRNA의 발현량을 분석하였으며, 유전자 발현의 정도는 β-actin의 발현량 대비 비율로 계산하였다.
도 4를 참조하면, 3T3-L1 cell의 분화과정에 Lactobacillus pentosus KCL032의 균체 추출물을 처리하였을 때, 지방축적과 관련된 유전자인 PPARγ, C/EBPα, aP2 및 FAS의 발현이 감소하는 것을 확인할 수 있다.
결과적으로, 본 발명에 따른 Lactobacillus pentosus KCL032의 균체 추출물은 PPARγ, C/EBPα, aP2 및 FAS의 발현을 억제시켜 지방세포의 지방축적을 억제함으로써, 다이어트 등에 효과가 있어, 식품 및 의약품 등에 적용할 수 있다.
서열목록 전자파일 첨부
Claims (6)
- 지방세포의 지방축적 억제능을 갖는 Lactobacillus pentosus KCL032 균주, 이의 배양액 또는 균체 추출물을 포함하는 조성물.
- 제1항에 있어서,
Lactobacillus pentosus KCL032 균주는 반려견의 침에서 분리한 것인, 조성물. - 제1항에 있어서,
상기 균체 추출물은 균체를 이용하여 현탁액을 제조한 다음에 5~15분 동안 초음파 추출한 것인, 조성물. - 제1항에 있어서,
상기 조성물은 PPARγ, C/EBPα, aP2, FAS의 발현을 억제하는 것인, 조성물. - 제1항의 Lactobacillus pentosus KCL032 균주, 이의 배양액 또는 균체 추출물을 포함하는 비만 예방 또는 개선용 식품 조성물.
- 제1항의 Lactobacillus pentosus KCL032 균주, 이의 배양액 또는 균체 추출물을 포함하는 비만 예방 또는 치료용 약학 조성물.
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